JP6430917B2

JP6430917B2 - レバウディオサイド−モグロサイドｖ混合物

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Publication number: JP6430917B2
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Description

天然のカロリーを有する甘味料、例えばスクロース、グルコース及びフルクトースは、望ましい味を有することが特徴であるが、製品のカロリー量も増加させてしまう。よって、消費者の大きな関心は、より健康的な代替物と考えられる低カロリー又はノンカロリー甘味料にある。ノンカロリーの天然及び人工の高甘味度の甘味料（high potency sweetner）は既知であるが、それらの大半は風味について、消費者にとって砂糖ほど魅力的ではないとの統計データがある。実際、砂糖と置換可能で、より望ましい風味のプロファイルを有する、ノンカロリーの甘味料の開発が望まれている。

ステビアレバウディアナ（Stevia rebaudiana (“Stevia”)）種は、ある天然由来の甘味ステビオール配糖体の供給源である。ノンカロリー甘味料としてのステビアの甘味ステビオール配糖体の利用を評価するために多くの研究開発が行われてきた。ステビアから抽出される甘味ステビオール配糖体は、６種類のレバウディオサイド（具体的には、レバウディオサイドＡ〜Ｆ）、ステビオサイド（野生型ステビアからの抽出物中の主要配糖体）、ステビオールビオサイド、ルブソサイド及びダルコサイドを含む。

レバウディオサイドＡ及び他の甘味ステビオール配糖体を原料とする市販の低カロリー又はノンカロリー甘味料は、苦みや甘草の後味を有する傾向にある。当該特徴は特に３００ppmを超える濃度で目立つ。食品への応用においては、好適な使用レベル（８−１０％砂糖と同等の値）は典型的には約500〜約1000ppmであり、その範囲外を超えると最初に不快な味を感じてしまう。実際、ステビオール配糖体を含む、カロリー減の、低カロリーの又はノンカロリーの甘味料であって、苦み、望ましくない風味（例えば、甘草）、又はカロリーのある天然甘味料により近い甘味の性質、又はそのような性質の組合せを有する甘味料への要望は存在し続けている。

ある観点では、本発明は、モグロサイドＶ（Mogroside V）及びレバウディオサイド成分（Rebaudioside component）を、重量比1:1以上6:1以下の範囲で含む組成物であって、
ここで、レバウディオサイド成分は、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ及びレバウディオサイドＤから成る群より選ばれる１又はそれ以上の化合物を含む、組成物を提供する。

他の観点では、本発明は、ラカンカ（Luo Han Guo）抽出物の精製方法であって、ラカンカ抽出物を活性炭、並びにマクロ多孔性高分子吸着樹脂及びイオン交換樹脂又はその両方と接触させる工程を含む方法を提供する。

さらに他の観点では、本発明は、モグロサイドＶがラカンカ抽出物の50重量％〜75重量％を占めるとともに、組成物が更に、芳香族系配糖体を、モグロサイドＶに対し総量で０〜１３重量％含み、半揮発性有機化合物を、モグロサイドＶに対し総量で０〜１５ppm含む、組成物を提供する。

図１は乾燥ラカンカ抽出物のＨＰＬＣ分析例、及び本発明に従い炭素処理を施した同物質の分析を、それぞれ上段と下段のクロマトグラムに示す。

図２は、図１に示したクロマトグラムを拡大表示したものである。

図３はラカンカ試料中に存在する半揮発性有機化合物のガスクロマトグラムを示す。１つは活性炭の処理前、１つは本発明に相当する活性炭処理後に測定されたものである。

図４は、カビ臭を産生する成分を含むラカンカのフラクションについてのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

図５は、芳香族系配糖体の存在と一致する特徴的吸収帯を示す、ラカンカのフラクションのＡＴＲ-ＦＴＩＲスペクトルを示す。

図６は、図４に示す主成分についての、飛行時間型精密質量分析法スペクトル（ＴｏＦ accurate Mass Spectrum)を示す。

発明の詳細な説明
定義
本発明において、語句「甘味ステビオール配糖体」とは、１以上のサッカライド残基が環上に化学結合した通常のステビオールジテルペン環系構造を有する天然化合物を意味する。

本発明において、語句「レバウディオサイド成分」とは、存在するレバウディオサイドＡ，Ｂ及びＤの総体を意味する。但し、実際に存在するのはこれらのうち１種又は２種のみである場合もあることに留意すること。

レバウディオサイド-モグロサイドＶ混合物を含む甘味組成物
ここに開示されるのは、モグロサイドＶと、レバウディオサイドＡ、Ｂ及びＤのうち１又はそれ以上を含むレバウディオサイド成分との混合物は優れた風味特性を提供し、多くの場合、同程度の甘味料と比較して、レバウディオサイド成分又はモグロサイドＶの何れか単独でも優れた効果を示すことである。幾つかの系では、ｐＨ約２〜ｐＨ約８において最も明確に風味の向上が示される。

モグロサイドＶはラカンカ抽出物より得られ、多くの供給元から市販される。抽出等の産生方法の例は、米国特許第5,411,755号及び米国特許出願公開第2006/0003053号に記載され、ともに全ての有用な目的のために参照により組込まれる。ラカンカ（Luo Han Guo）は、中国南部又はタイ北部原産の多年生ツル植物であるラカンカ属ラカンカ種（Siraitia grosvenorii）の果実部分より抽出されたものである。ラカンカ属（Siraitia）の４種のうちの１つである。植物学上の同義語としてはMomordica grosvenorii 及びThladiantha grosvenoriiが挙げられる。その抽出物はショ糖の約200-300倍の甘味を有する。

典型的には、モグロサイドＶはラカンカ（Luo Han Guo）抽出物中に最も豊富に含まれる単一のモグロサイド成分であり、他のモグロサイド類、例えばモグロサイドＩ，ＩＩ，ＩＩＩ、ＩＶ及びＶＩを伴い、さらに他の抽出物質、例えばポリフェノール、フラボノイド、メラノイジン、テルペン、タンパク質、糖、芳香族系配糖体、及び半揮発性有機化合物を伴う。本発明の幾つかの実施形態において、モグロサイドＶはラカンカ抽出物（そのまま又は精製された、及び/又はモグロサイドＶ含有量増加のために濃縮された）の形態で提供される。幾つかの実施形態では、モグロサイドＶは抽出物の少なくとも40重量％、少なくとも４５重量％又は少なくとも５０重量％を占める。典型的には、抽出物の多くとも９５重量％、多くとも８５重量％、多くとも７５％、、多くとも７０％、多くとも６５％又は多くとも６０％を占める。

本発明の幾つかの甘味成分において、レバウディオサイド成分に対するモグロサイドＶの重量比は、少なくとも1:1,少なくとも1.3:1,又は少なくとも1.5:1である。典型的な重量比は、多くとも5:1,多くとも4:1、多くとも3.5:1、多くとも3:1、多くとも2.5:1、多くとも2:1、多くとも1.9:1、多くとも1.8:1, 又は多くとも1.7:1である。

レバウディオサイド成分は、１又はそれ以上のレバウディオサイドＡ，Ｂ及び/又はＤから成る。レバウディオサイド成分は、典型的には甘味ステビオール配糖体存在総量の少なくとも６５重量％、少なくとも70重量%、少なくとも75重量%,少なくとも80重量%.,少なくとも90重量%,又は少なくとも９７重量%を占める。甘味ステビオール配糖体の残りの分は、あるとすれば、１又はそれ以上のレバウディオサイドＣ，Ｅ及び/又はＦ、ステビオサイド、及びレバウディオサイド成分を構成しないその他の甘味ステビオール配糖体を含むことができる。典型的には、レバウディオサイドＡは甘味ステビオール配糖体存在量の少なくとも５０重量％、少なくとも60重量%,少なくとも70重量%,少なくとも80重量%,少なくとも90重量%,又は少なくとも95重量%を占める。レバウディオサイドＡ、Ｂ及びＤはステビアレバウディアナ（Stevia rebaudiana）の抽出物より得ることができ、多くの供給元から市販される。多くの異なる方法、例えば抽出等の産生方法、及びある程度純粋なレバウディオサイドＡ，Ｂ又はＤを抽出物から得る方法については、公知であり文献中に記載されている。ある典型的な工程では、ステビア植物を乾燥させ、水により抽出する工程に付す。当該粗抽出物は約５０％のレバウディオサイドＡを含む。抽出物中の様々な配糖体分子は、典型的にはエタノール又はメタノールを溶媒として用いる再結晶により分離され、純粋なレバウディオサイドＡ，Ｂ及びＤを単離することができる。個々の精製配糖体は、次いで本発明における有用なレバウディオサイド成分を供給するための組合せに用いられる。

本発明の甘味組成物は様々なタイプの甘味料混合物が様々な量で含まれるが、幾つかの実施形態では、組成物は、場合により精製且つ/又は濃縮されたルオハングオ（Luo Han Guo）抽出物を本質的に含み、また場合により精製且つ/又は濃縮されたステビア抽出物を含む。

ラカンカ（Luo Han Guo）の異臭成分除去
詳細な研究の結果、現在では、ラカンカ（Luo Han Guo）抽出物中にある程度不純物が存在することにより、結果的に味覚試験者が「カビ臭い」と称する異臭をもたらすことが見出された。さらなるカビ臭及び他の異臭成分も存在し得るものの、特に芳香族配糖体及び半揮発性有機化合物が、当該望ましくない臭いを産生することが同定されている。ある特定の芳香族系配糖体は分子量５０２ダルトンを有し、特定のカビ臭い風味を産生することが明らかとされている。当該化合物は分子式C₂₆H₃₀O₁₀に一致し、当該分子式を有する全ての化合物の全体が、幾つかの実施態様において本発明により限定される。当該化合物の十分に低濃度を達成させるための任意の手段は、本発明の目的のために適切である。ある１つの適切な方法は、モグロサイドＶ水溶液を、例えば、場合により精製且つ/又は濃縮されたラカンカ抽出物の形態で、粒状活性炭のカラムを通すものである。活性炭の他の形態として、例えば粉末を用いることができる。また炭素処理は、さらにカビ臭又はその他の異臭成分のほかに、残留農薬及び原材料において消費者にとって望ましくない物質も除去する。典型的には、炭素処理において水のみが担体として用いられ、有機溶媒は加えられない。幾つかの実施態様では、ラカンカ抽出物を、マクロ多孔性高分子吸着樹脂、イオン交換樹脂、及び活性炭素で処理される。典型的には当該処理はこの順番で行われるが、必ずしもそうでなくてもよい。あるマクロ多孔性高分子吸着樹脂の例として、商品名AMBERLITE^{（登録商標）} XAD1180N、Rohm and Haas（Philadelphia, PA）より市販されている。適切なイオン交換樹脂の例では、アニオン性樹脂であって商品名AMBERLITE^{（登録商標）} FPA90 CLとして、同じくRohm and Haasより市販されている。

１又はそれ以上の芳香族系配糖体及び半揮発性の有機化合物の不純物を許容濃度まで減らすためには、処理にあたり十分量の活性炭、及び十分な接触時間を要する。本発明の幾つかの実施例においては、甘味組成物中の芳香族系配糖体は、モグロサイドＶに対し総量で0-13重量%、又は0-11重量%,又は0-10重量%, 又は0-9重量%、含まれる。芳香族系配糖体はフェニルグリコシド、さらに特定のフェノール性グリコシド、クマリングリコシド又はさらに特定のフランクマリン系グリコシドであってもよい。また、当該同様の限定は、分子量502の化合物に対し、及びさらに特定の分子式C₂₆H₃₀O₁₀の化合物に対し、分子量502又は分子式C₂₆H₃₀O₁₀の全ての化合物の総量に対し言及するそれぞれの場合につき、幾つかの実施態様において適切である。

本発明の幾つかの実施態様において、甘味組成物は、半揮発性有機化合物を、モグロサイドＶに対し総量で0〜15重量ppm, 0〜11重量ppm, 0〜7重量ppm又は0〜3重量ppm含む。ここで、用語「半揮発性」とは分子量が120Da超であり、且つ1気圧での沸点が150℃より高く350℃未満である化合物を意味する。そのような半揮発性有機化合物は、限定されるものではないが、表７に列挙される化合物を含んでいてもよい。半揮発性有機化合物は、例えば脂肪族フラン、不飽和炭化水素、エステル、多環炭化水素及び/又はステロイドであってもよい。

市販のラカンカ果実抽出物粉末は、典型的には、少なくとも40％のモグロサイドＶ（乾燥固形ベース(d.s.b)）を含み、以下のように活性炭で処理されてもよい。乾燥抽出物は脱イオン水中に少なくとも約１重量％濃度で、典型的には、多くとも約７０重要％濃度で溶解される。水溶液は粉末物質が溶解しやすい十分な温度にまで加熱し、典型的には、室温から160°Ｆ（71.1℃）の範囲であり、場合により精密濾過膜（microfiltration membrane）又は濾紙とともに非反応性の濾過器を用いて濾過を行う。精密濾過は、製品を劣化させる可能性のある不溶性のタンパク質及び/又は微生物を除去するために行う。その結果得られる濾液は活性炭素（これもまた公知の活性炭）による吸着に付される。該炭素は入手可能な活性炭の任意の形態であってよく、例えば木材、瀝青炭、ココナッツ、骨炭、又は他の任意の原料由来であってもよい。一つの実施形態においては、使用される活性炭素は褐炭を水蒸気により活性化したものである。典型的には、該炭素は顆粒状であるが、他の物理学的形態、例えば粉末又はビーズ状の活性炭を採用してもよい。通常、活性炭は高い多孔質であり、高い表面積（例えば、100 m²/g以上, 200 m²/g以上,又は300 m²/g以上)を有するものが活用するのに有利であろう。風味劣化を引き起こす望ましくない成分（及び、殺虫剤のような他の望ましくない物質）は炭素に吸着されるが、風味を改善する物質は吸着されず連続的に溶出する。当該方法は50%から99.9%の回収率（乾燥物質ベース）を与える。活性炭の使用量は0.05% から150%（ラカンカ果実抽出物水溶液中に存在する乾燥物質のパーセント値）の様々な値が許容される。より典型的には、不快な風味の成分濃度を十分に低濃度とするために、ラカンカ果実抽出物に対し、固体ベースで少なくとも2重量％又は少なくとも5重量%の活性炭を用いる。ある実施形態では、少なくとも6重量%又は少なくとも10重量%の場合、最良の結果が得られる。典型的には、最大で15重量%が用いられる。

典型的な工程では、カラムには必要量の活性炭（典型的には顆粒状）が充填され、脱イオン水をカラムの頂部から底部、又は底部から頂部へ（下降又は上昇方向へ）、１時間当たり1〜10ベッド体積(bed volume）の範囲で流した。通す水量は2〜5ベッド体積であってもよい。水を活性炭と接触させる際、水温を上昇させてもよい（例えば135°Ｆ〜185°F）。これにより、ラカンカ果実抽出物水溶液が実質的にカラムを通過する際、炭素から重金属などの望ましくない物質の溶出を減らす助けとなる。一度、残留する気泡及び炭素由来の微細粒子を水で置換え、ラカンカ果実抽出物の水溶液を、１時間当たり1〜10 のベッド体積の流速でカラムへ供給する。該カラムはジャケットでカバーされ、ジャケット温度を送液(feed solution)と同温度に維持する。その温度範囲は典型的には室温〜71℃である。初めにカラム中の移動相を水で置換する。流出液中に物質の存在が示された時点ですぐ、風味向上物質の流出液として集める。ＲＩ（refractive index）測定により流出液中の固体物質の存在を確認することができる。ＲＩと乾燥物質との相関関係は、典型的にはこの目的のために構築される。

ラカンカ果実抽出物は目標とする処理濃度に達するまでカラムに供給される。供給が終了した時点で、カラム中に残存するラカンカ果実抽出物は、脱イオン水又は逆性浸透水を追加し、ラカンカ物質と置換させる。流出液のＲＩ値が水単独に近い状態とするまで、引き続き流出液を集める。

場合により、必要であれば、ＤＳ（乾燥物質）％を、後続の乾燥工程に適した任意の濃度にまで増加させるため、回収した風味向上物質を濃縮することができる。濃縮は、エバポレート濃縮又は膜濃縮、若しくは他の任意の好適な方法により完結される。膜濃縮はナノ濾過膜（200Da, M.W.C.O）の利用又は逆性浸透膜（>98%,脱塩測定より）により可能である。両方の膜は分離して用いられ、かなりの量のモグロサイド類が透過液へ失われないようにする。そして、当該物質は、従来のスプレー乾燥装置の使用又はスプレー凝集装置の使用又は他の手段により、乾燥される。又は該物質をそのまま用いてもよい。１つの実施形態では、回収した風味向上成分は、１又はそれ以上の他の成分、例えばレバウディオサイドＡ，Ｂ及び/又はＤ若しくは甘味ステビオール配糖体を含む精製ステビア抽出物と、乾燥の前に組合せられる。

レバウディオサイド-モグロサイドＶ混合物を含む甘味組成物の使用
レバウディオサイド-モグロサイドＶ混合物を含む甘味組成物は粒子系や物理学的形状を変更する公知の方法により生産されてもよい。凝集、スプレー乾燥、ドラム乾燥及びその他の物理学的製法のような方法を用い、より優れた流動性、吸湿性又は溶解性をもたらすために粒子径を調節してもよい。該組成物は液状で供給され、場合により１又はそれ以上
特定の用途において使い勝手の良い保存料及び/又は処理補助剤を含んでいてもよい。レバウディオサイド-モグロサイドＶ混合物を含む組成物は、甘味、用量、活性及び操作性が制御された製品を供給するために、マルトデキストリン及びその類似化合物のような、増量剤とともに製造されてもよい。

本発明の甘味組成物は、食品原料、例えば食品、飲料、医薬、キャンディー、チュウイングガム及びそれらに類するもののような、食用の又はチュアブル組成物において、カロリー減の、低カロリーの又はカロリーゼロの甘味料として用いられる。本発明の甘味組成物は、甘味ステビオール配糖体のみを有する甘味料と比べて、より砂糖らしく、後味の苦み及び不快な風味（例; 甘草）が低減された甘味プロファイルを有する。試験の結果、殆どの場合、同等の甘味を呈する濃度で味わった場合、本発明の甘味組成物は97％レバウディオサイドＡを含む組成物が被験者に好まれることが示された。特に、甘味組成物は速効性の甘味と遅延性の甘味の両方を提供し、より満足いく風味であるとの結果を得た。本発明の甘味組成物を食料及び飲料に添加することは、公知の甘味ステビオール配糖体を含む甘味組成物、例えば甘味料として97%レバウディオサイドＡを有する組成物を甘味料として用いた場合と比べて、味の良い食品又は飲料をもたらすことが期待される。

本発明による甘味組成物はレバウディオサイド-モグロサイドＶ混合物に加え、他の高活性の甘味料を含んでいても良い。例えば、甘味ステビオール配糖体が含んでも良い。好適な高活性の甘味料の特定の例は天然の高活性甘味料を含み、例えば：
ダルコサイドＡ（dulcoside Ａ），ダルコサイドＢ（dulcoside Ｂ）（ともにレバウディオサイドＣとしても知られる）、ルブソサイド（rubusoside）、モグロサイドＩＩＩ（mogroside III）、モグロサイドＩＶ（mogroside IV），モグロサイドＶＩ（mogroside VI）、シアメノサイド（siamenoside）、モナチン（monatin）及びその塩（monatinＳＳ，ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ）、クルクリン（curculin）、グリチルリチン酸（glycyrrhizic acid）及びその塩、ソーマチン（thaumatin）、モネリン（monellin）、マビンリン（mabinlin）、ブラゼイン（brazzein）、ハーナンダルシン（hernandulcin）、フィロダルシン（phyllodulcin）、グリシフィリン（glycyphyllin）及びフロリジン（phloridzin）；
及び人工の高活性甘味料を含み、例えば：
サッカリン、アスパルテーム、スクラロース、ネオテーム、シクラメート及びアセスルフェームカルシウム、
が挙げられる。

また、本発明によれば、レバウディオサイド-モグロサイドＶ混合物は、糖類（例えば、高濃度フルクトーストウモロコシシロップ、スクロース、フルクトース等）のようなカロリーのある甘味料、及びポリオール（例；ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、等）及び/又は、他の低カロリー甘味量とを、カロリー値を低減させた甘味組成物を製造するために組合せても良い。

幾つかの実施態様では、本発明は、レバウディオサイド-モグロサイドＶ混合物を高濃度で含む甘味組成物を含む食品原料を提供する。特に任意の食用の又はチュアブルの組成物は、本発明に従って甘味を与えることができる実施例は限定されないが、例えば食品原料（例;焼物、スープ、ソース、加工肉、缶詰果実、缶詰野菜、乳製品、氷菓子）;飲料（例;炭酸ソフトドリンク、茶飲料への用途、スポーツ飲料、乳飲料、アルコール飲料、エネルギー飲料、味つき飲料(flavored water)、ビタミン飲料、フルーツ飲料及びフルーツジュース、粉末ソフトドリンク）;医薬又は薬学製品（例；錠剤、トローチ剤、懸濁剤、等）；栄養食品（例；サプリメント、ビタミン、等）；キャンディー又は砂糖菓子（コンフェクション）、チューイングガム、タバコ製品（例；噛みタバコ）；及びそれらに類似するものを含む。甘味組成物は甘味を与えられる製品に対し、甘さを与えるのに必要な量を授けるのに十分な量を含む。幾つかの実施例では、甘味を与えられた製品のｐＨは少なくとも約２であり約８を超えない。

幾つかの具体的態様においては、ここで説明されるように、食品原料はレバウディオサイド-モグロサイドＶ混合物及び１又はそれ以上のさらなる甘味ステビオール配糖体を含む甘味組成物を含む。幾つかの具体的態様においては、レバウディオサイド成分、さらなるステビオール配糖体成分及びモグロサイドＶ成分を含めた包括的な甘味組成物の、食品原料における存在量は、濃度の総計が少なくとも約５０ｐｐｍ、又は少なくとも約２００ｐｐｍ、又は少なくとも約５００ｐｐｍ、又は少なくとも約１０００ｐｐｍ、又は少なくとも約１５００ｐｐｍ、又は少なくとも約３５００ｐｐｍ、又は少なくとも約５０００ｐｐｍである。

実施例１ステビア-モグロサイドＶ混合物対レバウディオサイドＡの嗜好試験

大部分レバウディオサイドＡを含むステビアの混合物ともに50重量％モグロサイドＶを含むラカンカ抽出物の固形混合物を、97重量％レバウディオサイドＡに対し、甘味及び嗜好パネル試験により比較した。精製ラカンカ抽出物は、バイオビットリア社（Biovittoria）(桂林,中華人民共和) より商品名「Fruit Sweetness^TM」として市販されるものを用い、ここで他に述べるように、異臭産生の原因となる芳香族系配糖体及び半揮発性有機化合物を除去するため活性炭処理により精製された。当該精製物は以下、Sample Aと定義する。ステビア生成物はGLG Life Tech Corporation社（バンクーバーＢ．Ｃ．カナダ）より商品名「BlendSure^TM 7.5」として購入可能であり、約７５重量％のレバウディオサイドＡ及び２５重量％のステビオサイドから成る。
嗜好試験

BlendSure 7.5及びｐＨ３クエン酸緩衝液（0.045% クエン酸及び0.013%クエン酸ナトリウム）における９７％レバウディオサイドＡと同等の甘味を有するSample Aとの混合物の、甘味及び嗜好の一対比較テストを、味覚パネル試験者により行った。該試験は24から46の間の評価による完全なブロック計画に従って行われた。発表順は交代した。溶液は３桁コードで標識された2オンスのスフレカップにより室温で供された。パネリストは各サンプルにつき少なくとも半量を消費するよう指示された。パネリストの味覚を初期化するために、各試験の間には強制的に１分間の待機時間を設けた。パネリストはいずれがより甘く好ましい味がするか特定するよう依頼された。試験前及び試験中、パネリストの味覚を初期化するために、ボトル水、２％スクロース溶液及び無塩クラッカーが用意された。甘味に関する結果は、以下に示すように、危険率αが0.05の二項検定である両側検定で解析した。

当該甘味及び嗜好の問いに関する試験結果は、二項検定及びサーストン型モデル（Thurstonian d’ calculated）により解析した。片側検定の二項検定についてのｐ値は以下式

により算出し、ここで、cは成功の数、nは試行の数、そしてｐ0は偶然の確率を示す。試験は、ｐ値がα値を下回る場合は、統計的に有意であるとみなされる。両側検定のｐ値は、上記で計算した片側検定のｐ値の２倍である。

サーストン型モデル（Thurstonian d’）は、心理物理学的差異の尺度である。ｄ’＝１の場合、通常、丁度可知差異（just-noticeable difference、（ＪＮＤ））とみなされ、試行の７５％において要因がより強力であると判断される。サーストン型計算式（Thurstonian d’）は独立した試験方法であり、一対比較テストについては下式

により算出し、ここで、ｐｃは成功の比率、Φ(・)は標準正規分布の累積分布関数を示す。これらの統計解析計算の完全な処理に関しては、標準テキスト(Bi J., “Sensory Discrimination Tests and Measurements,” Blackwell Publishing, 2006, Chapters 2 and 9)で確認することができる。

併せて複製した試験結果を以下の表１に示す。

上記データは、ｐＨ３クエン酸緩衝液中、顕著な相違がない（両側検定のｐ値＞0.05）甘味レベルで得られたデータであって、モグロサイドＶのレバウディオサイドＡに対する含有比率が特定の範囲内にある混合物の嗜好性を示す。具体的には以下に示す。

675 ppmのSample A 及び225 BlendSure 7.5 (75% Sample A,計900 ppm)の混合物は、900 ppmの97% レバウディオサイドAの場合に比べ顕著に嗜好性が高かった。

825 ppmのSample A 及び275 BlendSure 7.5 (75% Sample A,計1100 ppm)の混合物は、1000 ppmの97% レバウディオサイドAの場合に比べ顕著に嗜好性が高かった。

444 ppmのSample A及び296 BlendSure 7.5 (75% Sample A,計740 ppm)の混合物は、705 ppmの97% レバウディオサイドAの場合に比べ顕著な相違はみられなかった。

547ppmのSample A 及び365 BlendSure 7.5 (75% Sample A,計912 ppm)の混合物は、900 ppmの97% レバウディオサイドAの場合に比べ顕著に嗜好性が高かった。

660 ppmのSample A及び440 BlendSure 7.5 (75% Sample A,計1100 ppm)の混合物は、1000 ppmの97% レバウディオサイドAの場合に比べ嗜好性に顕著な相違はみられなかった。

Sample A 及びBlendSure 7.5の混合物は、75％のSample A を含む方が、６０％のSample Aの含むものよりも、97% レバウディオサイドAに対してより良い性質を示した。

Sample A 及びBlendSure 7.5の混合物は、甘味の程度が増加するにしたがい、97% レバウディオサイドAに対して嗜好性がより高まった。

実施例２ -ステビア-モグロサイドＶ混合物対ステビアの嗜好試験

ｐＨ３クエン酸緩衝液（0.045%クエン酸及び0.013%クエン酸ナトリウム）における、50重量％モグロサイドＶを含むラカンカ抽出物及びレバウディオサイドＡを大部分含むステビア製品の混合物を、ステビア製品に対し、甘味及び嗜好パネル試験により比較した。混合物及びステビア製品は実施例１に述べたとおりである。相乗効果はアイソボール（アイソ効果曲線isoboles (iso-effect curves)）の構築により検出することができ、ここでは等価な効力、この事例では甘味、を有する２物質の濃度について、物質の濃度を軸にプロットを行った。直線型のイソボールは２物質の間に相乗効果はないとの結果を示す。２物質の間に相乗効果がある場合イソボールは下降曲線を示す。イソボールと相乗効果についての完全な考察はBerenbaum, “What is Synergy”, Pharmacological Reviews, Vol. 1989, No. 41 pages 93 -129に見ることができる。BlendSure、及び500 ppm, 700 ppm, 及び900 ppmのBlendSure 7.5と同等の甘味を有するSample Aの混合物は、直線型アイソボールの仮定により甘味の相乗効果はないものと予測された。

BlendSure、及び500 ppm, 700 ppm, 及び900 ppmのBlendSure 7.5と同等の甘味を有するSample Aの混合物の、甘味及び嗜好の一対比較テストを、味覚パネル試験者により行った。該試験は44から46の間の評価による完全なブロック計画に従って行われた。発表順はち交代した。溶液は３桁コードで標識された2オンスのスフレカップにより室温で供された。パネリストは各サンプルにつき少なくとも半量を消費するよう指示された。パネリストの味覚を初期化するために、各試験の間には強制的に１分間の待機時間を設けた。パネリストはいずれがより甘く好ましい味がするか特定するよう依頼された。試験前及び試験中、パネリストの味覚を初期化するために、ボトル水、２％スクロース溶液及び無塩クラッカーが用意された。結果は実施例１と同様に解析し、表２に纏めた。

上記データより示されるように、BlendSure 7.5及びSample Aとの間の甘味の相乗効果のエビデンスはない。しかし、Sample AのBlendSure 7.5に対する割合を増加されるにつれ、混合物BlendSure 7.5及びSample Aの混合物は、BlendSure 7.5単独よりも嗜好性が増加し、また甘味も増加した。

実施例３-ラカンカ抽出物からの芳香族系配糖体及び半揮発性有機化合物の除去

3’ x 1/2” IDジャケット装着された、容積約150ｍｌのガラスカラム(Ace glass incorporated製)に、新たに沸騰水で洗浄した約57ｇの未使用の活性炭顆粒(CAL 12x40 from Calgon Corporation)を充填した。カラムジャケットを60℃に加温し、実験期間中は一定の温度に保った。カラムを充填した後、炭素微粒子を置換及び除去するため、約500ｍＬの脱イオン水を、流速2.5ｍＬ/分で炭素層に通した。Biovittoria Fruit Sweetness^TM（乾燥固体ベース(dsb)で約50重量％のモグロサイドＶ）の 27重量％溶液を調製するため、3.318 kgのMilli-Q 水（当該水は、Milli-Q reverse osmosis water 精製システム（Millipore Corp.より入手可能）より供給される）に、1.241ｋｇのBiovittoria Fruit Sweetness^TMを溶解させた。次に、溶液を60℃に加温し、Millipore Optiseal Durapore 0.22 μm親水性プレートカートリッジフィルターを通して無菌の供給瓶に入れ、稼働中は温度を60℃に保った。

当該溶液を2.6 g/分(１時間当たり1.25 Bed体積に相当）の速度で、MASTERFLEX^{（登録商標）} tubing 13 及び蠕動式ポンプ(MASTERFLEX^{（登録商標）}pump)を用いてカラムに通した。流出液を90分間のフラクション、１フラクション当たりの平均重量234グラムで集めた。19フラクション目（経過時間28.5分)以降、流出液の風味を確認し、供給した物質よりも顕著に優れた風味であることを参考として確認した。これにより、さらに355.5ｇのBiovittoria Fruit Sweetness^TM を945.3 g of Milli-Q水に溶解させ、60℃に昇温し、親水性のひだ付カートリッジ濾過器Millipore Optiseal Durapore 0.22 μmを通した後、供給瓶に追加した。37.5時間後、無甘味状態にするためカラムをMilli-Q水（６０℃）で置換を開始した（「無甘味状態」とはFruit Sweetness^TMの残留溶液が洗浄により完全に置換されたことを意味する）。カラムは流出液のＲＩ値（reactive index)が水と同様になるまで、６時間無甘味状態のままとした。全てのフラクション中の物質を収集し、その重量は装置に供給した乾燥物質の約98重量％に相当する総収率に相当した。装置に供給した物質の総重量（1241ｇ＋335ｇ）のうち、処置量は計算値で3.61重量％であった。8人の経験ある味見試験者は、減少した無甘味状態に関し、Fruit Sweetness^TMの水溶液、フラクション1〜5混合物, フラクション1〜10混合物, フラクション1〜15混合物, フラクション1〜20混合物、フラクション1〜25混合物との判定比較を行った。フラクション1〜5混合物, フラクション1〜10混合物, フラクション1〜15混合物は供給物質Fruit Sweetness^TMを超える顕著なレベルの味の向上を記録した。フラクション１〜１５の組成物の乾燥重量は947ｇであった。これは処理量の6.0重量％に相当する。以降、フラクション１〜１５の組成物はSAMPLE A (286683)と定義した。

ＨＰＬＣを用いてBiovittoria Fruit Sweetness^TM供給物の芳香族系配糖体組成物及び炭素処理後のより良い風味のラカンカ流出物を決定した。分離モジュールWaters 2695 Separations Moduleに対し、吸収検出器Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector、及びカラムPhenomenex Gemini C18 Column, 5 μm, 150 x 4.6 mm にセキュリティーガードカートリッジPhenomenex Gemini C18 Security Guard cartridge, 4 x 3 mmを備えたもの、を装着した。以下に列挙したアセトニトリル/水の勾配は移動相として用いられ, 流速1.0 mL/分、カラム温度40°C、203 nmでのＵＶ検知機を使用し、体積40μＭで投与した。

移動相:アセトニトリル/水体積% 線形分割勾配
時間[分] アセトニトリル水
0 20 80
15 30 70
20 50 50
25 50 50
30 20 80

純品のモグロサイドＶ標準物質(ChomaDex, Inc.)を内部標準として使用し、全ての成分を203nmで検知し定量を行った。表３は、モグロサイドＶとしての乾燥固体ベース（d.s.b)での成分の重量％を纏めたものである。芳香族系配糖体の流出の顕著な減少が、上記に定義された条件下、ＨＰＬＣカラムより3.5〜4.5分間の範囲で、Biovittoria Fruit Sweetness^TM供給物と、活性炭からの流出物との間において観察され、当該減少は顕著な風味の向上に相当していた。

以下の条件により定義される、フレームイオン化検出(FID)を伴うヘッドスペース法によるＧＣ解析は、ラカンカ抽出物の供給物、及び活性炭処理後に回収されたラカンカ抽出物のより良い風味のする部分の半揮発性有機化合物の組成を決定するために用いられた。
Combi PAL Autosampler
モード: Headspace
シリンジ容積: 1 mL
シリンジ温度: 85°C
振動温度（Agitator Temperature）: 80°C
プレインキュベーション時間（Pre-incubation Time）: 30 分
プレインキュベーション振動速度
（Pre-incubation Agitator Speed）: 500 rpm (5 秒 on, 2 秒 off)
吸引パイプ充填速度（Plunger Fill Speed）: 200 ・L/秒
粘性遅延（Viscosity Delay）: 12 秒
注入前遅延（Pre-injection Delay）: 0 sec
吸引パイプ注入速度（Plunger Inject Speed）: 100 ・L/秒
注入後遅延（Post-injection Delay）: 10 秒
シリンジ充填時間（Syringe Flush Time）: 3 min
GC 回転時間（GC Cycle Time）: 54 min

Varian 3800 GC
オーブン:
初期温度: 40°C
初期保持時間: 5 分
Ramp: 7.5°C/min
最終温度: 235°C
最終保持時間: 14 分
前部流入(1177):
温度: 250°C
モード: Splitless
カラム:
型: Rtx-624 (30 m x 0.25 mm x 1.4 ・m) - Restek Cat # 10968
モード: Constant Flow
流速: 1.0 mL/分(Helium)
中間バルブオーブン:
温度: 250°C

Varian 4000 FID
温度: 250°C
補給ガス: 2 mL/分 (He)
H₂流速: 40 mL/分
空気流速: 450 mL/分

Varian 4000 Ion Trap MS
スキャン型: Full
質量範囲: 25〜275 m/z
スキャン時間: 0.00 〜45.00 時間
イオン化の型: EI
標的TIC: 20000 カウント
最大イオン時間: 25000 ・秒
排出流量: 10 ・amps
平均スキャン: 3 ・scans (0.60 秒/scan)
データ転送速度: 1.67 Hz
乗数補正: 0 V

Ｄ-リモネン純品(Sigma-Aldrich)を内部標準として使用し、図３に示すように全ての半揮発性有機化合物成分を定量した。表４は、乾燥固体ベース（dsb)での成分中の半揮発性有機化合物総量の重量ppmをＤ−リモネンとして値を纏めたものである。Biovittoria Fruit Sweetness^TM 供給物 (284178)から活性炭処理したラカンカ(Sample A 286683)の間で、半揮発性有機化合物の顕著な減少が見られ、これはラカンカの風味の顕著な改善に相当する。

実施例４-ラカンカ抽出物中の無風味成分の同定

官能評価において、水溶液を活性炭に通した場合のラカンカ物質の方が、供給ラカンカ物質より優れた、より許容される風味であることが見出された。典型的な乾燥ラカンカ抽出物でモグロサイドＶを内容量で約50重量％含むもの(Biovittoria Fruit Sweetness^TM)のＨＰＬＣ分析結果、及び同物質を活性炭処理しスプレー乾燥したものの分析結果を、図１で上下に対比して示した。ＨＰＬＣメソッドのパラメーターは実施例３と同様、以下のように線形分割勾配を修正したものである。
移動相:アセトニトリル/水体積 % 直線的勾配（linear gradient）
時間[分] アセトニトリル水
0 10 90
10 10 90
20 20 80
25 20 80
30 30 70
35 30 70
55 95 5
65 95 5
75 10 90

ＨＰＬＣ分析の結果は、モグロサイドの異性体のプロファイルは、活性炭処理後、本質的に未変化のままであることを示した。図１のクロマトグラムについてより極性の高い範囲を拡大表示したのが図２であり、下段のクロマトグラムに処理済の物質を示し、上段のクロマトグラムに示す未処理物質の場合と比較して、21分付近のピーク（矢印で示す）が著しく減少していることを示す。２１分付近に溶出する成分と、「かび臭い」異臭の減少との関連性を決定するため、実施例３と同様の方法においてラカンカを処理する活性炭の使用について、一連の抽出及び精製工程を適用した。Fruit Sweetness^TMの特徴的な「かび臭い」異臭を示すサンプルを同定するため、当該研究全体の、それぞれの抽出精製工程の後、炭素処理したラカンカサンプルであって、回収した成分の当初の固有の濃度の５〜１０倍に調製されたサンプルについて、熟練した味覚パネル試験者が評価を行った。

ラカンカ溶液の炭素処理により除去された成分を回収するため、ラカンカの精製に用いられた約500ｇの使用済活性炭を、水洗後、連続して350ｍＬ単位で分割した溶媒で繰り返し洗浄した。エタノールに続きアセトンを用いて活性炭を洗浄した。抽出液は0.45μｍのナイロンフィルターを通し、室温で窒素気流下、蒸発乾固させ、約2.0ｇの固体を回収した。アセトン抽出物からの残渣を前記の熟練した味覚パネル試験者（expert panel of tasters）により顕著に「かび臭い」Fruit Sweetness^TMに特徴的な異臭が含まれることが確認された。また、ＨＰＬＣで21分（図１及び２）に検出される成分は、アセトンフラクション中及び、以降すべての連続した「かび臭い」異臭のフラクション中にも含まれることも確認された。

当初のアセトン抽出されたフラクションを完全に乾固した後、水50ｍＬ及びクロロホルム50ｍＬで液-液抽出を行った。「かび臭い」異臭は水溶性のフラクションに残留していた（約1.8ｇの固体を回収した）。続いて、Waters Sep-Pak C18 SPE カートリッジ(Waters Corp., WAT020515)４つを用いて固相抽出（ＳＰＥ）を適用し、さらなる異臭のする残渣を分画した。メタノール5ｍＬ及びof Milli-Q水10ｍＬで処理後、約10ｍｇ/ｍＬの残渣の水溶液を一度に10ｍＬをカートリッジにロードした。そして、以下; 100%水, 2%アセトニトリル(MeCN)/98%水, 5% MeCN, 10% MeCN, 20% MeCN, 25% MeCN, 30% MeCN, 40% MeCN, 50% MeCN, 及び 100% MeCNの一連の洗浄により回収されたフラクションを得た。全ての抽出物を窒素気流下で乾燥させ、パネル官能試験者により評価を行った。当該単離の手順の活性炭使用からＳＰＥによる分画を通して全体を３回繰り返し、同じ官能試験結果を得た。

特徴的な「かび臭い」異臭は、顕著に濃縮された約250ｍｇの固体で、該固体は、炭素処理したラカンカの水溶液に混合した場合に熟練した味覚パネル試験者により確認されたように、ＳＰＥのフラクション（288054）20％ＭｅＣＮ/80％水の溶出液から回収されたものと決定された。図４のように、ＨＰＬＣの当該フラクションは再度２１分に溶離される成分のピークを示した。当該単離物の一次成分の化学的分析は、SPEのブランク (10 mL 水 + 10 mL 50% MeCN + 10 mL 100% MeCN)に対して、Antek総窒素濃度, Folin-Ciocalteu法によるフェノール発現量試験, ニンヒドリンタンパク質呈色試験, 酸分解法によるイオンクロマトグラフィーアミノ酸分析（digests), ATR-FTIR固体乾燥法,液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）及びNMRを用いて行われた。表５及び６に纏められた結果は、芳香族配糖体系の化合物と一致した。

図５はフラクション288054の、ベースライン補正後のATR-FTIRスペクトルを示す。ＯＨ，炭化水素ＣＨ、ＣＯ及び弱いフェニルの特徴的吸収帯が確認され、全て芳香族系配糖体の存在と一致する。Ｃ＝Ｏの吸収は確認されない。図６は、図４で21.0分の保持時間（retention time）を示すサンプル2888054に相当する主成分について、飛行時間精密質量分析（Time-of-Flight (ToF)）の結果を示す。図６に挿入された表は、質量イオン503ダルトンの最も可能性の高い化学量論的な式を示す。1.6ｐｐｍの質量確度を伴う最も可能性の高い精密質量は、分子式C₂₆H₃₀O₁₀の中性電荷の化合物であることを示す。

種々の半揮発性成分の分布及び示唆される性質は、実施例３で明確にされるように、ヘッドスペースの5％水溶液をガスクロマトグラフ質量分析(GC-MS）で検知することを用いて評価された。図３はFruit Sweetness^TM 供給サンプル(284178)の半揮発性成分プロファイルと、Sample Ａとの比較を示す。表７は、図３で分類されたものに対応する28の半揮発性有機化合物に大部分が合致する質量分析ライブラリのリストを示す。当該化合物について既に知られるの風味及び臭いの官能反応が、比較として列挙される（例えば、Mosciano, G., Perfumer and Flavorist 25, No. 6, 26, (2000)を参照）。

実施例５

500ｍＬのビーカー中、40ｇのFruit Sweetness^TMを200ｇのMilli-Q 水に溶解し、３０ｇの活性炭(BG-HHM、Calgon Carbon Corporation製)を該Fruit Sweetness^TM溶液に加えた。活性炭のスラリーを２時間撹拌し、0, 5, 15, 30, 60, 90,及び120分後において50μＬの無菌濾過サンプルを抜取りした。サンプルはMilli-Q 水で２０倍希釈し、モグロサイド類の時間ごとの相対存在量をＨＰＬＣにより解析した。２時間後、活性炭スラリーをWhatman #2濾紙を通して濾過し、濾液を無菌濾過し風袋計量済の凍結乾燥用瓶へ入れた。１回無菌濾過した濾液を凍結乾燥し、重量を記録し、ＨＰＬＣによりモグロサイドＶの含有量を解析した。凍結乾燥した物質はSample Bと定義した。次いで、Sample Bの550ｐｐｍ中性ｐＨ水溶液（Fruit Sweetness^TMを活性炭懸濁処理したもの）について、レバウディオサイドＡ97％（Reb A 97）の500ｐｐｍ中性ｐＨ水溶液に対し、48から50のパネリストによる嗜好試験を行った。また、比較のため、Fruit Sweetness^TMについてもレバウディオサイドA 97の500ｐｐｍ中性ｐＨ水溶液に対する嗜好試験を行った。当該試験は完全なブロック計画として行われた。発表順は交代した。パネリストは各サンプルにつき全量を消費するよう指示された。パネリストはサンプルを再度味わうこと不可とした。パネリストにはいずれがより甘く好ましい味がするか特定するよう依頼した。試験前及び試験中、パネリストの味覚を初期化するために、パネリストのボトル水、２％スクロース溶液及び無塩クラッカーが用意された。

データは、甘味については危険率αが0.05の二項検定である両側検定で、嗜好については片側検定により解析された。

表８は、等価の甘味において市販のFruit Sweetness^TMはReb Aよりも顕著に好まれることはなかったことを示す。しかし、活性炭処理したFruit Sweetness^TMであるSampleBは、等価の甘味においてBlendSure 7.5よりも顕著に好まれた（表９）。

ここに本発明は特定の実施形態の参照とともに解説及び説明されるが、本発明は詳細な開示に限定されるものではない。むしろ、詳細には、請求の範囲の均等の範囲内において当該発明から分離されることなく、種々の修飾が許容され得る。

Claims

ラカンカ抽出物を精製する方法であって、ラカンカ抽出物を活性炭と接触させることを含み、ここでモグロサイドＶが乾燥固体基準でラカンカ抽出物の少なくとも４０％を占め、活性炭との接触時にラカンカ抽出物が水溶液の形態であり、前記水溶液を、１３５〜１８５°Ｆの表面積１００ｍ^２／ｇ以上の粒状活性炭に一時間当たり流速１〜１０床体積で通過させる、方法。
前記ラカンカ抽出物は予めマクロ多孔性高分子吸着樹脂と接触させたものである、請求項１に記載の方法。
前記ラカンカ抽出物は予めマクロ多孔性高分子吸着樹脂及びイオン交換樹脂の双方と接触させたものである、請求項１に記載の方法。
前記ラカンカ抽出物は予め、最初にマクロ多孔性高分子吸着樹脂と、次にイオン交換樹脂と接触させたものである、請求項１に記載の方法。
前記ラカンカ抽出物は予めアニオン性樹脂であるイオン交換樹脂と接触させたものである、請求項１に記載の方法。
活性炭と接触させる前記ラカンカ抽出物は水溶液の形態である、請求項１に記載の方法。
活性炭と接触させる前記ラカンカ抽出物の水溶液は予め、ラカンカ果物の粉末化乾燥抽出物を水に溶解させることにより、水溶液として調製されたものである、請求項１に記載の方法。
前記水溶液を精密濾過する、請求項７に記載の方法。
前記水溶液を前記の粒状活性炭のカラムに通過させて流出液を取得し、続いて前記流出液を濃縮する、請求項１に記載の方法。
前記流出液をエバポレーション又は膜濃縮により濃縮する、請求項９に記載の方法。
ナノ濾過膜又は逆浸透膜を用いて前記流出液を膜濃縮する、請求項９に記載の方法。
濃縮に続いて前記流出液を乾燥させる、請求項９に記載の方法。
噴霧乾燥器又は噴霧凝集器を用いて前記流出液を乾燥させる、請求項１２に記載の方法。
濃縮に続いて前記流出液を、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＤ、ステビオール配糖体、及び精製ステビア抽出物からなる群より選択される１又は２以上の成分と混合し、次いで乾燥させる、請求項９に記載の方法。