JP6433119B2

JP6433119B2 - Cell culture scaffold substrate, microfluidic device, and high-throughput nanofiber screening method using the same

Info

Publication number: JP6433119B2
Application number: JP2013263585A
Authority: JP
Inventors: 謙一郎亀井; 泰正眞下; 劉　莉; 莉劉; 勇陳
Original assignee: Kyoto University NUC
Current assignee: Kyoto University NUC
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2018-12-05
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: JP2015116174A

Description

本発明は、細胞培養足場基材、マイクロ流体デバイス及びそれを用いたハイスループットナノファイバースクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a cell culture scaffold substrate, a microfluidic device, and a high-throughput nanofiber screening method using the same.

細胞は生体・組織内において、(i)成長因子や低分子などの可溶性因子、(ii) 細胞外マトリックスなどの不溶性因子、(iii)細胞間相互作用、などで構成される「細胞外微小環境」中にあり、その運命が制御されている。したがって、再生医療・細胞移植治療・薬剤開発・等に有望視されているヒト多能性幹細胞（ES/iPS細胞）の機能・運命制御にも、目的に応じた細胞外微小環境を整える必要がある。 Cells are composed of (i) soluble factors such as growth factors and small molecules, (ii) insoluble factors such as extracellular matrix, and (iii) intercellular interactions. ”And its fate is controlled. Therefore, it is necessary to prepare an extracellular microenvironment according to the purpose for the function and fate control of human pluripotent stem cells (ES / iPS cells) that are considered promising in regenerative medicine, cell transplantation treatment, drug development, etc. is there.

しかし、現在使用されている生体外細胞実験系では、この様に複雑な微小環境の人工的な作製は非常に困難である。これを克服する手段が、微小空間制御できるマイクロ流体デバイス（μFD）を用いた細胞培養・実験系である。 However, in the in vitro cell experiment system currently used, it is very difficult to artificially create such a complex microenvironment. A means to overcome this is a cell culture / experiment system using a microfluidic device (μFD) capable of controlling a microspace.

ナノファイバーは細胞培養足場基材の人工細胞外マトリクスとして有望視されてきたが、目的に応じたナノファイバーを得るためには様々なパラメータを考慮した条件検討を行う必要がある。そのためには、ナノファイバーをスクリーニングする必要があるが、これまではそのようなスクリーニングを行うデバイスが無かった。さらに、細胞の運命決定制御をナノファイバーのみで行う試みは数多く行われてきたが、同様に運命決定制御に関係する微小環境とナノファイバーによる細胞への相互作用の解析及び解析手法については、ほとんど報告がされていない。 Nanofibers have been regarded as promising as an artificial extracellular matrix for cell culture scaffolds. However, in order to obtain nanofibers according to the purpose, it is necessary to study conditions considering various parameters. To do so, it is necessary to screen nanofibers, but until now there has been no device for such screening. Furthermore, many attempts have been made to control the fate of cells using only nanofibers. Similarly, the analysis of microenvironments related to fate control and the interaction of cells with nanofibers and analysis methods are mostly used. No report has been made.

また、従来法によるナノファイバーのパターニング法では、多種類のナノファイバーを単一基板上に作製することは非常に困難であった(非特許文献1)。 In addition, in the conventional nanofiber patterning method, it has been very difficult to fabricate many types of nanofibers on a single substrate (Non-patent Document 1).

さらに、従来のマイクロ流体デバイスの作製にはフォトリソグラフィー法が使用されるが、この方法は、鋳型準備に時間がかかることが問題点であった。また、単一基板上に複数の高さ、またはなだらかな勾配を持つ鋳型を作製するためには、複数のマスク、リソグラフィープロセスを繰り返す必要があった。 Furthermore, a photolithography method is used for manufacturing a conventional microfluidic device. However, this method has a problem in that it takes time to prepare a mold. Further, in order to produce a template having a plurality of heights or gentle gradients on a single substrate, it has been necessary to repeat a plurality of masks and lithography processes.

マイクロ流体デバイス（μFD）は細胞生物学において、(i) nm〜μmスケールでの微小「 3次元」空間制御、(ii)単一空間内に二〜多液層・濃度勾配の作製、(iii)実験の自動化・High-Throughput（HT）化(非特許文献2)など様々な利点がある。 Microfluidic devices (μFD) are used in cell biology (i) micro “three-dimensional” spatial control from the nm to μm scale, (ii) creation of two to multiple liquid layers and concentration gradients in a single space, (iii) ) There are various advantages such as automation of experiments and high-throughput (HT) (Non-patent Document 2).

Jiang, L., Zhang, M., Li, J., Wen, W., & Qin, J. (2012). “Simple localization of nanofiber scaffolds via SU-8 photoresist and their use for parallel 3D cellular assays.” Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla.), 24(16), 2191.2195. doi:10.1002/adma.201103843Jiang, L., Zhang, M., Li, J., Wen, W., & Qin, J. (2012). “Simple localization of nanofiber scaffolds via SU-8 rigid and their use for parallel 3D cellular assays.” Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla.), 24 (16), 2191.2195.doi: 10.1002 / adma.201103843 Puccinelli, J. P., Su, X., & Beebe, D. J. (2010). “Automated high-throughput microchannel assays for cell biology: Operational optimization and characterization.” JALA (Charlottesville, Va), 15(1), 25.32. doi:10.1016/j.jala.2009.10.002Puccinelli, JP, Su, X., & Beebe, DJ (2010). “Automated high-throughput microchannel assays for cell biology: Operational optimization and characterization.” JALA (Charlottesville, Va), 15 (1), 25.32. Doi: 10.1016 / j.jala.2009.10.002

本発明は、細胞培養に適したナノファイバーをスクリーニングし、各々の細胞に適したナノファイバーを人工細胞外マトリクスとして細胞培養する技術を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a technique for screening nanofibers suitable for cell culture and culturing cells using the nanofibers suitable for each cell as an artificial extracellular matrix.

本発明は、以下の細胞培養足場基材、マイクロ流体デバイス及びハイスループットスクリーニング方法を提供するものである。
項１．ナノファイバーからなる複数の人工細胞外マトリクス部を基板上に所定の間隔で配置してなる細胞培養足場基材。
項２．ナノファイバーを金属コート上に形成してなる、項１に記載の細胞培養足場基材。
項３．金属コートが白金コートである、項２に記載の細胞培養足場基材。
項４．ナノファイバーからなる複数の人工細胞外マトリクス部を基板上に所定の間隔で配置してなる項１〜３のいずれかに記載の細胞培養足場基材と、各人工細胞外マトリクス部の対応する位置にマイクロ流体チャネルを形成するようにマイクロ流路構造体とを密着させ、前記マイクロ流体チャネルで細胞培養と培養液交換を可能にしてなるマイクロ流体デバイス。
項５．項４に記載のマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルで細胞を培養し、培養細胞の状態を評価することで、当該培養細胞に好適なナノファイバーを決定することを特徴とする、ナノファイバーのハイスループットスクリーニング方法。 The present invention provides the following cell culture scaffold substrate, microfluidic device and high-throughput screening method.
Item 1. A cell culture scaffold base material comprising a plurality of artificial extracellular matrix portions made of nanofibers arranged at predetermined intervals on a substrate.
Item 2. Item 2. The cell culture scaffold substrate according to Item 1, wherein the nanofiber is formed on a metal coat.
Item 3. Item 3. The cell culture scaffold substrate according to Item 2, wherein the metal coat is a platinum coat.
Item 4. Item 4. The cell culture scaffold base material according to any one of Items 1 to 3, wherein a plurality of artificial extracellular matrix portions made of nanofibers are arranged on a substrate at a predetermined interval, and corresponding positions of each artificial extracellular matrix portion. A microfluidic device in which a microchannel structure is closely attached to form a microfluidic channel so that cell culture and culture medium exchange can be performed in the microfluidic channel.
Item 5. A high-throughput nanofiber, characterized in that cells are cultured in the microfluidic channel of the microfluidic device according to item 4, and the state of the cultured cell is evaluated to determine a nanofiber suitable for the cultured cell. Screening method.

従来、ナノファイバーを細胞培養の足場もしくは細胞外マトリクスとして用いることは知られていたが、細胞の種類により適したナノファイバーが各々存在し、ナノファイバーをスクリーニングし、最適なナノファイバーからなる細胞外マトリクスを用いて細胞培養を行うことは行われていなかった。 Conventionally, it has been known to use nanofibers as a scaffold for cell culture or as an extracellular matrix. However, there are nanofibers that are suitable for each cell type, and nanofibers are screened for extracellular cells that are composed of optimal nanofibers. Cell culture using a matrix has not been performed.

本発明では、多種類のナノファイバーを基板上に備えた細胞培養足場基材とマイクロ流路構造体を効果的に用いることによって、時・空間制御した多様な細胞外微小環境を単一デバイス内に作製でき、それらの網羅的な解析を可能にする。 In the present invention, a cell culture scaffold base material and a microchannel structure having various types of nanofibers on a substrate are effectively used, so that various extracellular and microenvironments controlled in time and space can be formed in a single device. To enable comprehensive analysis of them.

本発明者は、一般的に平坦な基材上での培養法に比べ、ナノメーターレベルでの凹凸がある細胞外マトリクスの方がヒト多能性幹細胞の基材への細胞接着・細胞増殖が増加するとの知見を得ている。これは、基材の凹凸化により細胞接着因子であるインテグリン等がより効率的に活性化されることによるものである。 The present inventor found that the extracellular matrix with irregularities on the nanometer level is generally capable of cell adhesion / cell proliferation to the substrate of human pluripotent stem cells compared to the culture method on a flat substrate. We know that it will increase. This is because integrin, which is a cell adhesion factor, is more efficiently activated by making the substrate uneven.

本発明では、多種類のナノファイバーをアレイ状にパターニングし、更にマイクロ流路構造体と組み合わせることによって、微小空間化されたマイクロ流体チャネルにおいて人工細胞外マトリクス（ナノファイバー）をスクリーニングすることが可能になった。 In the present invention, it is possible to screen an artificial extracellular matrix (nanofiber) in a microfluidic channel that is microspaced by patterning various types of nanofibers in an array and combining them with a microchannel structure. Became.

３Ｄプリンターにより作製したマスク及び鋳型を用い、ナノファイバー（ＮＦ）アレイ及びマイクロ流路構造体を有する４８ウェル規格のプレート作製の手順を模式的に示す。A procedure for producing a 48-well standard plate having a nanofiber (NF) array and a microchannel structure using a mask and a template produced by a 3D printer is schematically shown. 本発明によるナノファイバー(NF)スクリーニング。作製したHTNS-μFDのマイクロ流体チャネルに細胞を播種し、３日間培養後、核、多能性マーカー、生細胞・死細胞、増殖マーカーを染色する。得られたサンプルから画像取得・解析を行い、NFに対する細胞応答をプロファイリングし、目的の機能を有するNFを同定する。Nanofiber (NF) screening according to the present invention. Cells are seeded in the prepared microfluidic channel of HTNS-μFD, and after culturing for 3 days, nuclei, pluripotency markers, live / dead cells, and proliferation markers are stained. Image acquisition / analysis is performed from the obtained samples, cell responses to NF are profiled, and NF having a target function is identified. マイクロ流路構造体の作製工程。3D-CADにより目的のデザインを作製し、3Dプリンタにより構造の鋳型を印刷した。印刷された鋳型には、ポリジメチルシロキサン(PDMS)ソリューション（BaseとCuring agentの混合液）を流し込み、HTS-μFD構造を有するPDMSを作製した。Production process of microchannel structure. The target design was made by 3D-CAD, and the mold of the structure was printed by 3D printer. A polydimethylsiloxane (PDMS) solution (mixture of Base and Curing agent) was poured into the printed mold to produce PDMS having an HTS-μFD structure. マイクロ流路構造体を細胞培養足場基材に載せたハイスループットスクリーニング(HTS)マイクロ流体デバイス（μFD）を示す。1 shows a high throughput screening (HTS) microfluidic device (μFD) with a microchannel structure mounted on a cell culture scaffold substrate. オートインジェクターによる送液。96穴(左図)及び384穴(右図)フォーマットにおいてチップとHTNS-μFDとの対応関係を確認した。Liquid feeding by auto injector. Correspondence between the chip and HTNS-μFD was confirmed in 96-hole (left figure) and 384-hole (right figure) formats. ナノファイバー(NF)用HTS-μFD(A,B)NFアレイ。96穴マイクロプレート規格のポリスチレンプレートに４８パターンのNFを作製(C,D)。NFアレイとHTS-μFDを統合したHTNS-μFD。HTS-μFD (A, B) NF array for nanofiber (NF). 48 patterns of NF were prepared on a 96-well microplate standard polystyrene plate (C, D). HTNS-μFD integrating NF array and HTS-μFD. NF用HTS-μFDの作製工程。ポリスチレンプレートを白金(Pt)コートし、これを３Dプリンタにより作製したプラスチックマスクで覆った。このプレートセットに対してエレクトロスピニングを行うと、このとき形成されるNFは電気を好むため、マスクのデザインパターンから露出した白金コート部分にNFが蓄積する。エレクトロスピニング後、マスクを取り除けば、NFがパターニングされたプレートが得られる。これに、HTS-μFD構造を有するPDMS構造体を接着させ、NF用HTS-μFDを作製した。Production process of HTS-μFD for NF. A polystyrene plate was coated with platinum (Pt) and covered with a plastic mask produced by a 3D printer. When electrospinning is performed on the plate set, the NF formed at this time prefers electricity, so that NF accumulates in the platinum coat portion exposed from the mask design pattern. If the mask is removed after electrospinning, a plate on which NF is patterned is obtained. To this, a PDMS structure having an HTS-μFD structure was adhered to prepare an HTS-μFD for NF. NFスクリーニング。(A)実験方法。ヒト多能性幹細胞(H9 ES細胞)をHTNS-μFDにおいて3日間培養し、各染色(DAPI)を行い、NF上における細胞接着評価を行った。HTNS-μFDには、ゼラチン、ポリメチルグルタルイミド(PMGI)、ポリスチレンの3種類のNFをファイバー密度を変えてパターニングしたものを用いた。コントロール（２D足場）として、マトリゲル、ビトロネクチン、0.1%ゼラチン、コロナ処理（ノンコート）を用意した。解析は、Cell profilerにより行った。(B)マイクロ流路中の任意の位置においてDAPI染色画像を取得し、Cell profilerにより核をカウントした。0.5, 1, 2 cell/cm²の3通りの細胞密度と、エレクトロスピニングの時間(10, 20, 40, 60sec)の条件を変え、各NFにおける細胞数を比較した。NF screening. (A) Experimental method. Human pluripotent stem cells (H9 ES cells) were cultured in HTNS-μFD for 3 days, stained (DAPI), and evaluated for cell adhesion on NF. For HTNS-μFD, three types of NF (gelatin, polymethylglutarimide (PMGI), and polystyrene) patterned at different fiber densities were used. As a control (2D scaffold), Matrigel, vitronectin, 0.1% gelatin, and corona treatment (non-coated) were prepared. Analysis was performed with Cell profiler. (B) A DAPI-stained image was acquired at an arbitrary position in the microchannel, and nuclei were counted using a cell profiler. The number of cells in each NF was compared by changing the conditions of three cell densities of 0.5, 1, 2 cell / cm ² and electrospinning time (10, 20, 40, 60 sec).

本発明では、細胞培養足場基材とマイクロ流路構造体を重ね合わせて多数のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを形成し、該チャネルで細胞を培養する。このチャネルは、細胞の三次元培養を可能にする(図４)。チャネルは複数の(通常２個の)開口部と細胞培養可能な空間を有し、チャネルの一方の開口部から新しい培養液を供給すれば他方の開口部から古い培養液が排出され、それにより培養液の交換が可能である。 In the present invention, a cell culture scaffold base material and a microchannel structure are overlapped to form a microfluidic device having a number of microfluidic channels, and cells are cultured in the channels. This channel allows for three-dimensional culture of cells (FIG. 4). A channel has a plurality of (usually two) openings and a space where cells can be cultured, and if a new culture medium is supplied from one opening of the channel, the old culture medium is discharged from the other opening. The culture medium can be exchanged.

マイクロ流体デバイスの各チャネル内に異なるナノファイバーを配置すれば、どのナノファイバーがある培養細胞に適しているのかをスクリーニングにより決定することができる。 If different nanofibers are placed in each channel of the microfluidic device, it can be determined by screening which nanofibers are suitable for the cultured cells.

基板の材質は、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、ポリメチルグルタルイミド、アクリル系樹脂（ポリメチルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリエチルアクリレートなど）、ポリアミド、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、及びポリシリコンを含有するシリコンゴムなどのポリマー、ガラス、改質ガラス等が挙げられ、ポリマーが好ましい。基板表面のチャネルに対応する位置に金属コートを設けるのが好ましい。金属コートは基板全面に形成されてもよいが、チャネルに対応する位置にのみスポット状に形成されていてもよく、縦方向又は横方向に帯状に形成され、チャネルに対応する位置にナノファイバーからなる細胞外マトリクス部が形成されてもよい。金属としては、金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム、亜鉛、スズ、アルミニウム、マグネシウムなどが挙げられ、白金が好ましい。金属コートは層状であってもよく、不連続部分があってもよいが、層状であるのが好ましい。金属コートの厚みは１〜５ｎｍ程度である。金属コート層ができるだけ薄く光透過性を有する場合、細胞の染色後に画像処理で細胞を評価することができるので好ましい。 The material of the substrate is polystyrene, low density polyethylene, medium density polyethylene, high density polyethylene, polyurethane, polymethylglutarimide, acrylic resin (polymethyl methacrylate, polymethyl acrylate, polyethyl methacrylate, polyethyl acrylate, etc.), polyamide, Polymers such as polycarbonate, natural rubber having a conjugated bond, synthetic rubber having a conjugated bond, and silicon rubber containing polysilicon, glass, modified glass, and the like can be given. Polymers are preferred. A metal coat is preferably provided at a position corresponding to the channel on the substrate surface. The metal coat may be formed on the entire surface of the substrate, but it may be formed in a spot shape only at a position corresponding to the channel, formed in a strip shape in the vertical or horizontal direction, and from the nanofiber at a position corresponding to the channel. An extracellular matrix portion may be formed. Examples of the metal include gold, platinum, silver, copper, rhodium, palladium, zinc, tin, aluminum, and magnesium, and platinum is preferable. The metal coat may be layered or discontinuous, but is preferably layered. The thickness of the metal coat is about 1 to 5 nm. When the metal coat layer is as thin as possible and has light transmittance, it is preferable because the cells can be evaluated by image processing after the cells are stained.

ナノファイバーの材料、直径、密度などはチャネルごとに全て異なっていてもよいが、複数のチャネルを含む帯状の金属コートは同じナノファイバーとし、帯状の金属コートを複数設けて各々異なるナノファイバーを配置し、評価対象となる細胞を培養することで、どのナノファイバーが評価対象の細胞に適しているのかを評価することができる。 The material, diameter, density, etc. of the nanofibers may all be different for each channel, but the strip-shaped metal coat containing multiple channels is the same nanofiber, and multiple strip-shaped metal coats are provided to place different nanofibers. Then, by culturing the cells to be evaluated, it is possible to evaluate which nanofiber is suitable for the cells to be evaluated.

ナノファイバーはエレクトロスピニングなどの方法により基板上に形成することができる。ナノファイバーの形成は、例えば金属コートとマスクの一方又は両方の使用を組み合わせることでチャネルに対応する位置に部分的若しくはスポット的に形成することもでき、２以上のチャネル(例えば同じ行又は同じ列)に同じナノファイバーを形成し、複数のチャネル(例えば二重（duplicate）又は３重（triplicate）)での細胞培養の評価を平均することもできる。ナノファイバーの材質は、基板の上記ポリマー、ゼラチン、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリシアル酸、アルギン酸およびアルギン酸塩、アガロース、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニンなどのポリペプチド、ゼラチン、コラーゲン、これらのコポリマー、ならびにこれらの誘導体が挙げられ、これらを単独で或いは２種以上を混合して使用することができる。ナノファイバーの直径は１００〜５０００nm程度、好ましくは２００〜３００nm程度である。ナノファイバーは単層であっても複数のナノファイバーが重ねられた構造を有してもよく、ナノファイバー部分は平坦であっても凹凸を有していてもよく、勾配を有していてもよく、曲面であってもよい。ナノファイバー部分の構造は、規則正しく積み重ねられるよりもランダムな構造の方が細胞培養に適している。ナノファイバー部分(人工細胞外マトリクス)の高さは１００〜５００００nm程度、好ましくは２００〜３０００nm程度である。 Nanofibers can be formed on a substrate by a method such as electrospinning. The formation of nanofibers can also be partially or spotly formed at locations corresponding to the channels, for example by combining the use of one or both of a metal coat and a mask, and two or more channels (e.g. the same row or the same column). ) To form the same nanofibers and average the evaluation of the cell cultures in multiple channels (eg duplicate or triplicate). The material of the nanofiber is the above-mentioned polymer of the substrate, gelatin, collagen, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, polypropylene oxide, polyacrylate, polymethacrylate, polycaprolactone, polylactic acid, polyglycolic acid, polylactic acid-polyglycolic acid. Polymer, polysialic acid, alginic acid and alginate, agarose, chitin, chitosan, hyaluronic acid, pectin, poly-γ-glutamic acid, polyaspartic acid, poly-L-lysine, polyarginine and other polypeptides, gelatin, collagen, these And their derivatives, and these can be used alone or in admixture of two or more. The diameter of the nanofiber is about 100 to 5000 nm, preferably about 200 to 300 nm. The nanofiber may be a single layer or may have a structure in which a plurality of nanofibers are stacked, and the nanofiber portion may be flat or uneven, and may have a gradient. It may be a curved surface. As for the structure of the nanofiber portion, a random structure is more suitable for cell culture than a regular stacking. The height of the nanofiber portion (artificial extracellular matrix) is about 100 to 50000 nm, preferably about 200 to 3000 nm.

ナノファイバーを有する細胞培養足場基材とマイクロ流路構造体を、プラズマ処理等の表面活性化処理後に重ね合わせ熱処理により密着させることにより、複数の細胞培養用のチャネルを形成する。マイクロ流路構造体には、各チャネルに対応する細胞培養部が形成されている。細胞培養部は、細胞培養可能な空間(凹部)と、該空間及び複数の開口部を連通する複数のマイクロ流路を備えている。前記空間と細胞培養足場基材のナノファイバー部分が対応するように細胞培養足場基材とマイクロ流路構造体を重ね合わせると、チャネルの底面のナノファイバー部分が人工細胞外マトリクスとなり、マイクロ流路構造体の前記空間が三次元培養を行う細胞培養空間になる。該細胞培養空間内への細胞の導入は、予めナノファイバー上に細胞を接着させ、その後にマイクロ流路構造体を重ね合わせてもよく、細胞培養足場基材とマイクロ流路構造体を重ね合わせた後に、前記開口部からマイクロ流路を通って細胞を前記空間内に導入してもよい。或いはマイクロ流路構造体の前記空間を上にして細胞を前記空間に導入し、細胞培養足場基材を上から載せて密着させ、全体の上下を逆にして前記空間に培養液を導入することで培養を行ってもよい。なお、細胞導入後にマイクロ流路構造体を重ね合わせる場合、熱処理は行わない。 A cell culture scaffold base material having nanofibers and a microchannel structure are adhered by superposition heat treatment after surface activation treatment such as plasma treatment, thereby forming a plurality of channels for cell culture. In the microchannel structure, a cell culture part corresponding to each channel is formed. The cell culture unit includes a space (concave portion) in which cells can be cultured, and a plurality of microchannels communicating the space and the plurality of openings. When the cell culture scaffold base material and the microchannel structure are overlapped so that the space and the nanofiber part of the cell culture scaffold base material correspond, the nanofiber part on the bottom surface of the channel becomes an artificial extracellular matrix, and the microchannel The space of the structure becomes a cell culture space for three-dimensional culture. The introduction of the cells into the cell culture space may be performed by pre-adhering the cells on the nanofibers and then superimposing the microchannel structure, or superimposing the cell culture scaffold substrate and the microchannel structure. After that, cells may be introduced into the space from the opening through the microchannel. Alternatively, the cells are introduced into the space with the space of the microchannel structure up, the cell culture scaffold base material is placed on top and brought into close contact, and the culture solution is introduced into the space upside down. You may culture | cultivate by. Note that heat treatment is not performed when the microchannel structure is overlaid after cell introduction.

チャネルの細胞培養空間の高さは１００〜１０００μm程度、幅は１００〜１０００μm程度、奥行きは１０００〜１００００μm程度である。マイクロ流路の長さは１０００〜１００００μm程度、マイクロ流路の径は１００〜１０００μm程度である。開口部の大きさは、マイクロ流路の径と同程度である。 The height of the channel cell culture space is about 100 to 1000 μm, the width is about 100 to 1000 μm, and the depth is about 1000 to 10,000 μm. The length of the microchannel is about 1000 to 10,000 μm, and the diameter of the microchannel is about 100 to 1000 μm. The size of the opening is about the same as the diameter of the microchannel.

チャネルは複数の(通常２個の)開口部を有し、チャネルの一方の開口部から新しい培養液を供給すればマイクロ流路を経由して他方の開口部から古い培養液が排出され、それにより培養液の交換が可能である。 The channel has a plurality of (usually two) openings. If a new culture medium is supplied from one opening of the channel, the old culture medium is discharged from the other opening via the microchannel, The culture medium can be exchanged by this.

マイクロ流路構造体の材質は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ジフェニルシロキサンなどのポリシロキサン系ポリマー、シリコーン樹脂／シリコーンゴム、天然ゴムないし合成ゴム、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリメチルアクリレート（ＰＭＡ）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリウレタン、ポリスチレン、フッ素化ポリマー（ＰＴＦＥ、ＰＶｄＦなど）、ポリ塩化ビニル、ポリメチルハイドロゲンシロキサン、ジメチルシロキサンとメチルハイドロジェンシロキサン単位のコポリマーなどのホモポリマー或いはコポリマー、さらにはこれらのブレンドが挙げられるが、ポリシロキサン系ポリマーが好ましく、ＰＤＭＳがより好ましい。マイクロ流路構造体は透明性が高いことが、細胞培養の評価を行いやすいので好ましい。また、マイクロ流路構造体は酸素、二酸化炭素などの気体透過性に優れているのが好ましい。 The material of the microchannel structure is polydimethylsiloxane (PDMS), polysiloxane polymer such as diphenylsiloxane, silicone resin / silicone rubber, natural rubber or synthetic rubber, polyethylene terephthalate (PET), polymethyl methacrylate (PMMA), Polymethyl acrylate (PMA), polyolefins such as polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polyurethane, polystyrene, fluorinated polymers (PTFE, PVdF, etc.), polyvinyl chloride, polymethylhydrogensiloxane, copolymers of dimethylsiloxane and methylhydrogensiloxane units, etc. Homopolymers or copolymers thereof, and blends thereof are preferred, polysiloxane polymers are preferred, and PDMS is more preferred. Arbitrariness. It is preferable that the microchannel structure is highly transparent because cell culture can be easily evaluated. The microchannel structure is preferably excellent in gas permeability such as oxygen and carbon dioxide.

マイクロ流路構造体は、対応する鋳型を製造し、その鋳型に上記の高分子或いはその原料を流し込んで製造することができる。鋳型の作製法は特に限定されないが、３Dプリンタを用いるのが好ましい。 The microchannel structure can be manufactured by manufacturing a corresponding mold and pouring the polymer or its raw material into the mold. The method for producing the mold is not particularly limited, but it is preferable to use a 3D printer.

本発明のマイクロ流体デバイスは、細胞培養足場基材とマイクロ流路構造体とを密着させて作製する。密着は圧着や加熱、接着剤の使用あるいはマイクロ流路構造体の表面処理により行ってもよく、両者の材質に親和性があれば単に重ね合わせるだけで密着することができる。細胞培養足場基材とマイクロ流路構造体の表面を水、培養液などの液体で濡らしておくことが密着性の向上、培養液の蒸発の防止に好ましい。 The microfluidic device of the present invention is produced by bringing a cell culture scaffold base material and a microchannel structure into close contact. The close contact may be performed by pressure bonding, heating, use of an adhesive, or surface treatment of the microchannel structure, and if both materials have affinity, they can be contacted simply by overlapping. It is preferable to wet the surfaces of the cell culture scaffold base and the microchannel structure with a liquid such as water or a culture solution in order to improve adhesion and prevent the culture solution from evaporating.

マイクロ流体デバイスは、多数のマイクロ流体チャネルを有し、該デバイスは好ましくはハイスループット用デバイスであるので、チャネルは1つのデバイスに、10〜400個程度、例えば16個、48個、96個、384個などの個数で有し得る。 Since the microfluidic device has a number of microfluidic channels, and the device is preferably a high-throughput device, there are as many as 10 to 400 channels, such as 16, 48, 96, in one device. It can have as many as 384.

チャネルは、培養液及び細胞数が少なくなるのが好ましい。１つのチャネル内の空間には、例えば１００〜２０００μｌの液体を保持することができる。この空間に細胞と培養液を供給することにより細胞培養を行うことができる。１つのチャネル内で培養される細胞数は、通常５×１０^５〜０．５×１０^５個/cm²程度である。チャネルの培養空間の形状は、特に限定されないが、例えば円筒状、角筒状、楕円筒状などの形状が挙げられる。培養細胞は、前記培養空間の底面のナノファイバー上に接着して培養されるため、三次元培養が可能である。 The channel preferably has a reduced number of media and cells. For example, 100 to 2000 μl of liquid can be held in the space in one channel. Cell culture can be performed by supplying cells and a culture solution to this space. The number of cells cultured in one channel is usually about 5 × 10 ^{5 to} 0.5 × 10 ⁵ cells / cm ² . The shape of the channel culture space is not particularly limited, and examples thereof include a cylindrical shape, a rectangular tube shape, and an elliptical cylinder shape. Since the cultured cells are cultured while being adhered onto the nanofibers on the bottom surface of the culture space, three-dimensional culture is possible.

特に好ましい実施形態において、本発明は、以下の(a)〜(c)の開発により支えられている。 In a particularly preferred embodiment, the present invention is supported by the following developments (a) to (c).

(a)多種のナノファイバーを単一プレート上に作製する技術の開発
多種類のナノファイバーを単一基板上に作製する方法として、発明者はエレクトロスピニング法を基にした方法を開発した。エレクトロスピニング法はゼラチン・コラーゲン・セルロースなど様々な生体材料やポリスチレン、ポリ乳酸などのポリマー材料を原料としてナノファイバーを簡便に作製できる方法である。しかし、従来のエレクトロスピニング法では、一つの基板上に対して一種類のナノファイバーを作製するだけであった。 (a) Development of technology for producing various types of nanofibers on a single plate As a method for producing various types of nanofibers on a single substrate, the inventor has developed a method based on the electrospinning method. The electrospinning method is a method by which nanofibers can be easily produced using various biomaterials such as gelatin, collagen, and cellulose, and polymer materials such as polystyrene and polylactic acid as raw materials. However, in the conventional electrospinning method, only one type of nanofiber is produced on one substrate.

そこで、本発明では、エレクトロスピニングの際に、穴が空いているマスクを用いることによって、ナノファイバーのパターニングに成功した。マスクの作製には３ Dプリンタを使用したが、これに限定されない。このマスクを用いることで、目的の場所にのみナノファイバーを噴出することができ、一つの基板上にナノファイバーをアレイ状に作製することを可能にした。 Therefore, in the present invention, nanofiber patterning was successful by using a mask with holes in electrospinning. Although a 3D printer was used for manufacturing the mask, the present invention is not limited to this. By using this mask, nanofibers can be ejected only to the target location, and nanofibers can be fabricated in an array on one substrate.

(b) 3Dプリンタを用いたマイクロ流体デバイス鋳型作成技術の開発
μFDは細胞生物学において様々な利点を持つ反面、作製過程において、鋳型準備に時間がかかることが問題点であった。また、単一基板上に複数の高さ、またはなだらかな勾配を持つ鋳型を作製するためには、複数のマスク、リソグラフィープロセスを繰り返す必要があり、効率的な新規作製法の開発が必要であった。 (b) Development of microfluidic device mold making technology using 3D printer
While μFD has various advantages in cell biology, it takes a long time to prepare the template during the production process. In addition, in order to produce a template having multiple heights or gentle gradients on a single substrate, it is necessary to repeat multiple masks and lithography processes, and development of an efficient new production method is necessary. It was.

本発明では、鋳型作製のために 3Dプリンタを使用することを発明した。 3Dプリンタは複雑な 3次元構造をプリントすることが可能であり、近年では家庭用の 3Dプリンタも市販されるようになった。本発明で使用した 3Dプリンタは XY解像度が 50 μm、 Z解像度が 15 μmであり、細胞培養用のマイクロ流体デバイス作製には十分な性能である。鋳型として使用する材料はプラスチック製樹脂であり、熱耐性が 70℃と比較的低温であるため、マイクロ流体デバイスの材料である polydimetylsiloxane (PDMS)に転写する際には、温度を 65℃に保って行った。 In the present invention, it was invented to use a 3D printer for mold production. 3D printers can print complex 3D structures, and in recent years, 3D printers for home use have become commercially available. The 3D printer used in the present invention has an XY resolution of 50 μm and a Z resolution of 15 μm, which is sufficient for manufacturing a microfluidic device for cell culture. The material used as a mold is a plastic resin and its heat resistance is relatively low at 70 ° C. Therefore, when transferring to polydimetylsiloxane (PDMS), a material for microfluidic devices, keep the temperature at 65 ° C. went.

(c) マイクロ流路構造体と組み合わせたマイクロ流体デバイスの開発
最適なナノファイバーを効率よく同定するために、本発明では、マイクロ流体デバイスと組み合わせたハイスループットスクリーニングシステムを開発した。マイクロ流体デバイスは、実験条件を厳密に制御できるため再現性が良くなり、かつ実験のハイスループット化を可能にするため、ナノファイバー・スクリーニングにおいても非常に効果的に応用することが可能である。しかし、これまではマイクロ流体デバイス中にナノファイバーを作製する技術はなかった。本発明では、まず始めにナノファイバーを基板とマイクロ流体デバイスでサンドイッチのように挟むことによって、それを可能にした。 (c) Development of microfluidic devices combined with microchannel structures
In order to efficiently identify the optimal nanofiber, the present invention has developed a high-throughput screening system combined with a microfluidic device. Microfluidic devices can be applied to nanofiber screening in an extremely effective manner because the experimental conditions can be precisely controlled, thereby improving reproducibility and enabling high throughput of experiments. However, until now there has been no technique for producing nanofibers in microfluidic devices. In the present invention, this is made possible by first sandwiching nanofibers between a substrate and a microfluidic device like a sandwich.

以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例1：ナノファイバーのパターニング作製方法
（１）材料
Gelatin Solution
・ Gelatin (SIGMA G2625 MW: 30kDa)
・ Acetic acid glacial (AA; SIGMA P-338826)
・ Ethyl acetate anhydrous (EA; SIGMA P270989)
Polystyrene Solution
・Polystyrene (PS; SIGMA 182435 Fluka, Mw: 290,000, Mn: 130,000)
・Tetrahydrofuran (THF; Wako, 206-05106)
・N,N-Dimethylformamide (DMF; Wako, 047-29191)
Polydimethylglutarimide SF 11 (PMGI; MicroChem, 02464)
Crosslink buffer
・ Water-soluble carbodiimide (WSC; DOJINDO Catalog344-03633)
・ N-Hydroxysuccinimide (NHS; SIGMA Catalog56480)
・ 99.5％ ethanol (Wako)
Nuncオムニトレイ（Thermo scientific）
Gauze BEMCOTTM S-2 Asahi Kasei
High voltage supply (TECHDEMPAZ Japan)
真空ポンプ(Vacuum Pump)
ニプロブランド針 23Gｘ1 1/4” 刃先なし Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples.
Example 1: Nanofiber patterning fabrication method (1) Material
Gelatin Solution
・ Gelatin (SIGMA G2625 MW: 30kDa)
・ Acetic acid glacial (AA; SIGMA P-338826)
・ Ethyl acetate anhydrous (EA; SIGMA P270989)
Polystyrene Solution
・ Polystyrene (PS; SIGMA 182435 Fluka, Mw: 290,000, Mn: 130,000)
・ Tetrahydrofuran (THF; Wako, 206-05106)
・ N, N-Dimethylformamide (DMF; Wako, 047-29191)
Polydimethylglutarimide SF 11 (PMGI; MicroChem, 02464)
Crosslink buffer
・ Water-soluble carbodiimide (WSC; DOJINDO Catalog344-03633)
・ N-Hydroxysuccinimide (NHS; SIGMA Catalog56480)
・ 99.5% ethanol (Wako)
Nunc omni tray (Thermo scientific)
Gauze BEMCOTTM S-2 Asahi Kasei
High voltage supply (TECHDEMPAZ Japan)
Vacuum pump
Nipro brand needle 23Gx1 1/4 ”without cutting edge

（２）操作手順
10%w/v gelatin solution (AA:EA = 3:2) 1 mL調製
1．2 mLチューブに gelatin 0.1 g（最終濃度 10%w/v）、DDW 0.2 mLを入れる。
2．次にドラフト内で Acetic acid glacial 0.42 mL（最終濃度 42%w/v）、Ethyl acetate anhydrous 0.31 mL（最終濃度 28%w/v）を加える。
3．チューブをボルテックスしよく攪拌する。
4．Gelatinが十分に溶けたらチューブをローターにセットし、一昼夜転倒混和。（室温度：20℃以上） (2) Operation procedure
10% w / v gelatin solution (AA: EA = 3: 2) 1 mL preparation
1. Place 0.1 g gelatin (final concentration 10% w / v) and 0.2 mL DDW in a 2 mL tube.
2． Next, add 0.42 mL of Acetic acid glacial (final concentration 42% w / v) and 0.31 mL of Ethyl acetate anhydrous (final concentration 28% w / v) in a fume hood.
3． Vortex the tube and mix well.
Four. When Gelatin is fully dissolved, set the tube on the rotor and mix by inverting for a whole day. (Room temperature: 20 ℃ or more)

8.5%w/v polystyrene solution (THF:DMF = 1:1) 1 mL調製
1. 2 mLチューブに polystyrene 0.085 g（最終濃度 8.5%w/v）を入れる。
2. 次にドラフト内で Tetrahydrofuran 0.4575 mL、N,N-Dimethylformamide 0.4575 mLを加える。
3. チューブをボルテックスしよく攪拌する。
4. PSが十分に溶けたらチューブをローターにセットし、一昼夜転倒混和。（室温度：20.C以上） 8.5% w / v polystyrene solution (THF: DMF = 1: 1) 1 mL preparation
1. Add 0.085 g polystyrene (final concentration 8.5% w / v) to a 2 mL tube.
2. Next, add 0.4575 mL of Tetrahydrofuran and 0.4575 mL of N, N-Dimethylformamide in the fume hood.
3. Vortex the tube and mix well.
4. When the PS is sufficiently dissolved, set the tube on the rotor and mix by inverting overnight. (Room temperature: 20C or higher)

マスクの作製
1. 3次元画像描画ソフトウェア（ 3D-CAD）により、ナノファイバー・アレイのデザインを有するマスクを作製する（本実験では各々 3箇所のホールを有する 8種類のマスクを作製）。
2. マスクデザインを stfファイルに変換する。
3. Stfファイルを 3Dプリンタに転送し、印刷する。 Mask production
1. Fabricate a mask with nanofiber array design using 3D image drawing software (3D-CAD) (in this experiment, create 8 types of masks with 3 holes each).
2. Convert mask design to stf file.
3. Transfer the Stf file to the 3D printer and print it.

エレクトロスピニング法によるナノファイバー (gelatin, PS, PMGI)・アレイの作製
1. Nuncオムニトレイの蓋をマグネトロンスパッタリング（ 100 mA、12 sec x 2（両側））により白金コーティングする（白金プレート）。
2. Nanofiber solutionを 23Gのブラント針（ニプロ）を付けたシリンジに入れ、気泡を抜く。
3. マイクロシリンジポンプの流速をセットする（gelatin: 0.2 mL/h, PS: 0.16 mL/h, PMGI: 0.6 mL/h）。
4. 白金プレートを万力で垂直に固定し、マイクロシリンジポンプにセットするシリンジの針から 10 cmほどの距離に置く。
5. ブラント針に＋電極（赤線）、シリコンウェハーに−電極（緑線）を取り付ける。
6. 白金プレートにマスクを装着し、クリップで固定する。
7. マイクロシリンジポンプのスイッチを入れ、電圧（gelatin: 11kV, PS: 13kV, PMGI: 8kV）をかけ、白金プレートにファイバーを噴出する。
8. ファイバー噴出後、白金プレート上のマスクを静かに外す。
9. 6-8のステップを繰り返し、ナノファイバー・アレイを作製する。
10. プレートをデシケーターに入れ、真空ポンプをかけながら一昼夜乾燥させる。 Fabrication of nanofiber (gelatin, PS, PMGI) array by electrospinning method
1. Plating Nunc omni tray lid with magnetron sputtering (100 mA, 12 sec x 2 (both sides)) (platinum plate).
2. Put the Nanofiber solution into a syringe with a 23G blunt needle (Nipro) and remove the bubbles.
3. Set the flow rate of the micro syringe pump (gelatin: 0.2 mL / h, PS: 0.16 mL / h, PMGI: 0.6 mL / h).
4. Fix the platinum plate vertically with a vise and place it at a distance of about 10 cm from the needle of the syringe set in the micro syringe pump.
5. Attach the + electrode (red line) to the brandt needle and the-electrode (green line) to the silicon wafer.
6. Attach the mask to the platinum plate and fix it with clips.
7. Switch on the micro syringe pump, apply voltage (gelatin: 11kV, PS: 13kV, PMGI: 8kV), and spout the fiber onto the platinum plate.
8. After fiber ejection, gently remove the mask on the platinum plate.
9. Repeat steps 6-8 to create a nanofiber array.
10. Place the plate in a desiccator and dry overnight with a vacuum pump.

実施例2：３Dプリンタを用いたマイクロ流体デバイス作製方法
（１）材料
SYLGARDR 184 Silicone Elastomer kit （base, curing agent）（Dow corning）
Nuncオムニトレイ（ Thermo scientific 165218）
3Dプリンタ AGILISTA（Keyence）
デシケーター
コロナフィット CFG-500（信光電気計装株式会社）
3D-CAD（AutoCAD、Blender等） Example 2: Microfluidic device fabrication method using a 3D printer (1) Material
SYLGARDR 184 Silicone Elastomer kit (base, curing agent) (Dow corning)
Nunc omni tray (Thermo scientific 165218)
3D printer AGILISTA (Keyence)
Desiccator Corona Fit CFG-500 (Shinko Electric Instrumentation Co., Ltd.)
3D-CAD (AutoCAD, Blender, etc.)

（２）操作手順
鋳型の作製
4. 3次元画像描画ソフトウェア（3D-CAD）により、マイクロ流路構造の型となる鋳型デザインを有するマスクを作製する。
5. 鋳型デザインをstfファイルに変換する。
6. Stfファイルを 3Dプリンタに転送し、印刷する。 (2) Operation procedure
Mold making
4. Using 3D image drawing software (3D-CAD), create a mask with a mold design that will be the mold of the microchannel structure.
5. Convert mold design to stf file.
6. Transfer the Stf file to the 3D printer and print it.

マイクロ流路構造を有するPDMSの作製
1. Silicone Elastomer Baseと Curing agentを 10：1の重量比で撹拌ミキサーを用いて混合する（PDMS混合液）。
2. PDMS混合液を、3Dプリンタにより印刷された鋳型に流し込む。
3. デシケーターで30分間脱気を行う。
4. 65℃のオーブンで加熱、オーバーナイト。
5. 鋳型からPDMSを回収する。 Fabrication of PDMS with microchannel structure
1. Mix Silicone Elastomer Base and Curing agent at a weight ratio of 10: 1 using a stirring mixer (PDMS mixture).
2. Pour the PDMS mixture into the mold printed by the 3D printer.
3. Degas for 30 minutes with a desiccator.
4. Heat in an oven at 65 ° C, overnight.
5. Collect PDMS from the mold.

マイクロ流体デバイス（ HTS-μFD、HTNS-μFD）の作製
1. オムニトレイまたはナノファイバーがアレイ状に作製されたオムニトレイの表面をコロナ処理する（コロナフィット CFG-500等を用いる）。
2. PDMSの表面をコロナ処理する。
3. オムニトレイとPDMSを貼り合わせる。
4. 65℃のオーブンで加熱、オーバーナイト。
5. 使用するまでデシケーター内で保存する。 Fabrication of microfluidic devices (HTS-μFD, HTNS-μFD)
1. Corona-treat the surface of the omni tray on which the omni tray or nanofibers are formed in an array (using Coronafit CFG-500, etc.).
2. Corona-treated PDMS surface.
3. Paste the omni tray and PDMS.
4. Heat in an oven at 65 ° C, overnight.
5. Store in desiccator until use.

実施例3：ヒト多能性幹細胞のナノファイバー上への継代方法
（１）材料
Crosslink buffer
・Water-soluble carbodiimide (WSC; DOJINDO Catalog344-03633)
・N-Hydroxysuccinimide (NHS; SIGMA Catalog56480)
・99.5％ ethanol (Wako)
TeSR .E8 STEM CELL ペリタス ST-05940
Y−27632 Wako 257-00511（1 mg）253-00513（5 mg）
Cell Dissociation Buffer enzyme-free, Hanks’-based GIBCO 13150-016
TrypLE Express GIBCO 12605-010 Example 3: Passage method of human pluripotent stem cells onto nanofibers (1) Material
Crosslink buffer
・ Water-soluble carbodiimide (WSC; DOJINDO Catalog 344-03633)
・ N-Hydroxysuccinimide (NHS; SIGMA Catalog56480)
・ 99.5% ethanol (Wako)
TeSR .E8 STEM CELL Peritas ST-05940
Y-27632 Wako 257-00511 (1 mg) 255-200513 (5 mg)
Cell Dissociation Buffer enzyme-free, Hanks'-based GIBCO 13150-016
TrypLE Express GIBCO 12605-010

（２）操作手順
ＮＦの前準備
1. HTNS-μFDのナノファイバーを架橋処理する必要がある場合はここで行う。（ゼラチンナノファイバーの架橋処理）
1-1.デシケーターで乾燥させた gelatin nanofiberを表面が浸る程度の量の Crosslink bufferに浸ける。 (4時間)
1-2. Crosslink bufferに浸けていた nanofiberを取り出し 99.5％ ethanolに 5〜10分浸けて洗浄する。 (2回繰り返す)
1-3.洗浄後キムワイプを敷いたシャーレの上で風乾する。
1-4.風乾後デシケーターに入れ一昼夜乾燥させる。
2. 99.5％エタノールで 3回洗浄 1 mLｘ３（滅菌処理）
3. 3回目は丁寧に吸引しクリーンベンチ内で乾燥
4. HTNS-μFDの流路を TeSR-E8培地で満たし、 37℃でインキュベートしておくTeSR-E8 2〜7 μL/channel in HTNS-μFD (2) Operation procedure
Preparation for NF
1. If you need to cross-link HTNS-μFD nanofibers, do so now. (Crosslinking of gelatin nanofibers)
1-1. Soak gelatin nanofiber dried in a desiccator in an amount of crosslink buffer that is enough to immerse the surface. (4 hours)
1-2. Remove the nanofiber from the Crosslink buffer and soak it in 99.5% ethanol for 5-10 minutes. (Repeat twice)
1-3. Air-dry on a petri dish with Kimwipe after washing.
1-4. After air drying, place in a desiccator and dry overnight.
2. Wash 3 times with 99.5% ethanol 1 mL x 3 (sterilization)
3. The third time, suck carefully and dry in a clean bench
4. Fill the HTNS-μFD channel with TeSR-E8 medium and incubate at 37 ° C. TeSR-E8 2-7 μL / channel in HTNS-μFD

MEFまたはマトリゲルから NFへの継代
1. Ｙ-27632(最終濃度 10 μM)入り TeSR-E8を用意
2. PBSで 2回細胞をリンス
3. TrypLE Express 2mlを加えたらそのままインキュベート
4. 2分くらいでdishをゆすって顕微鏡下でチェック（チェックポイント：コロニーが丸くなっている（MEF上の細胞を用いる場合は MEFが剥がれてくる））
5. TrypLE Expressを吸引除去秘密資料 11
6. 必要な時はTeSR-E8 1〜2 mlでリンス
7. TeSR-E8（+Y27632）4 mlで回収して、10回ぐらいピペッティングし、シングルセルにする
8. 細胞数をカウントする
9. 1000 rpm 3分間遠心し上清吸引除去し、TeSR-E8（+Y-27632）で必要な細胞濃度に再懸濁
10. 細胞懸濁液を播種する
2〜7 μL TeSR-E8培地
細胞の濃度は 0.5〜2 X 10⁵cells/cm²
翌日以降の培地 TeSR-E8（+Y-27632）を毎日2回交換する Passage from MEF or Matrigel to NF
1. Prepare TeSR-E8 with Y-27632 (final concentration 10 μM)
2. Rinse cells twice with PBS
3. Add 2 ml of TrypLE Express and incubate
4. Shake the dish in about 2 minutes and check under the microscope (Checkpoint: the colony is rounded (if the cells on the MEF are used, the MEF will come off))
5. TrypLE Express suction removal secret material 11
6. When necessary, rinse with 1-2 ml of TeSR-E8
7. Recover with 4 ml of TeSR-E8 (+ Y27632) and pipette 10 times to make a single cell.
8. Count the number of cells
9. Centrifuge at 1000 rpm for 3 minutes, remove the supernatant, and resuspend to the required cell concentration with TeSR-E8 (+ Y-27632)
10. Seed cell suspension
2-7 μL TeSR-E8 medium Cell concentration is 0.5-2 X 10 ⁵ cells / cm ²
The medium after the next day TeSR-E8 (+ Y-27632) is changed twice a day

実施例4：スクリーニング方法
（１）材料
・4% formaldehyde PBS solution
・PBS
・PBS-0.5% Triton X-100
・ブロッキング液(5% normal goat serum, 5% normal donkey serum, 3% BSA ,0.1% Tween20 in PBS(add 0.1% of n-dodecyl-beta-D-maltoside (DDM) in blocking solution for prevent nonspecific binding onto PDMS))
・3% BSA in PBS
・PBS-T
・300 nM DAPI in PBS
・蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse Ti）
・Cell profiler（http://www.cellprofiler.org/） Example 4: Screening method (1) Materials · 4% formaldehyde PBS solution
・ PBS
・ PBS-0.5% Triton X-100
・ Blocking solution (5% normal goat serum, 5% normal donkey serum, 3% BSA, 0.1% Tween20 in PBS (add 0.1% of n-dodecyl-beta-D-maltoside (DDM) in blocking solution for prevent nonspecific binding onto PDMS))
・ 3% BSA in PBS
・ PBS-T
・ 300 nM DAPI in PBS
・ Fluorescence microscope (Nikon Eclipse Ti)
・ Cell profiler (http://www.cellprofiler.org/)

（２）操作手順
固定処理・透過処理・ブロッキング
1. 培地を除去し、1X Wash bufferで 1回細胞を洗浄する。
2. 1X Wash bufferを除去し、4% formaldehyde PBS solutionを用いて、遮光、室温下で 15分間細胞の固定処理を行う。
3. 4% formaldehyde PBS solutionを除去し、PBSで 2回洗浄し、PBSを完全に除去する。
4. PBS-0.5% Triton X-100で 30分間、透過処理を行う（室温）（OCT3/4, Nanog, Sox2等の染色では４℃でオーバーナイト）。
5. PBS-0.5% Triton X-100を除去し、細胞をブロッキング液に漬ける（４℃、オーバーナイト）。 (2) Operation procedure
Fixed processing / Transparent processing / Blocking
1. Remove the medium and wash the cells once with 1X Wash buffer.
2. Remove 1X Wash buffer, and fix the cells with 4% formaldehyde PBS solution for 15 minutes at room temperature in the dark.
3. Remove 4% formaldehyde PBS solution and wash twice with PBS to remove PBS completely.
4. Permeabilize with PBS-0.5% Triton X-100 for 30 minutes (room temperature) (overnight at 4 ° C for staining with OCT3 / 4, Nanog, Sox2, etc.).
5. Remove PBS-0.5% Triton X-100 and soak the cells in blocking solution (4 ° C, overnight).

免疫染色
6. 3% BSA in PBSで２回洗浄。
7. 1次抗体液に細胞を漬けて、 4℃、オーバーナイト。
8. PBS-Tで 2回洗浄。
9. 2次抗体液に細胞を漬けて、遮光下、室温、1時間インキュベート。
10. PBS-Tで 2回洗浄。
11. 300 nM DAPI in PBSで核染色（室温、30分間インキュベーション）。
12. PBSで 1回洗浄後、観察まで新鮮な PBSを保ちながら遮光下、4℃保存。 Immunostaining
6. Wash twice with 3% BSA in PBS.
7. Immerse the cells in the primary antibody solution at 4 ° C overnight.
8. Wash twice with PBS-T.
9. Dip the cells in the secondary antibody solution and incubate for 1 hour at room temperature in the dark.
10. Wash twice with PBS-T.
11. Nuclear staining with 300 nM DAPI in PBS (room temperature, 30 min incubation).
12. After washing once with PBS, keep fresh PBS until observation and store at 4 ° C in the dark.

観察・解析
13.蛍光顕微鏡を用いて、各流路において画像を取得。
14.取得した画像を Cell profilerを用いて解析。 Observation / analysis
13. Acquire images in each channel using a fluorescence microscope.
14. Analyze the acquired image using Cell profiler.

ヒト多能性幹細胞の医療や創薬への実用化に不可欠な、大量培養装置、特に自動化培養装置の設計と組み込みにとって、従来や既知方法に比較して、極めてシンプルで有効であり、これら培養装置の開発に活用できる。また、ヒト多能性幹細胞の細胞移植治療や再生医療などへの応用展開を考慮した時、３次元培養を可能にするナノファイバーは非常に重要な役割を果たすことになる。 Compared to conventional and known methods, these cultures are extremely simple and effective for the design and integration of mass culture devices, especially automated culture devices, which are indispensable for the practical application of human pluripotent stem cells to medicine and drug discovery. It can be used for the development of equipment. In addition, when considering application deployment of human pluripotent stem cells to cell transplantation therapy and regenerative medicine, nanofibers that enable three-dimensional culture will play a very important role.

本発明では、マイクロ流体デバイスを効果的に使用することにより、細胞足場基材としてのナノファイバーを微小環境下で高効率にスクリーニングできるシステムを開発することができた。細胞足場基材は、細胞の機能制御には非常に重要であり、ヒト ES/iPS細胞を含む幹細胞の分化制御に必要である。しかし、それぞれの組織細胞はそれに対応する細胞足場基材を必要とする。これまでは、ナノファイバーはその細胞足場基材として有望視されてきたが、そのパラメータの多さから実用化にはなかなか至らなかった。そこで本発明のようなナノファイバーのスクリーニングシステムは、多種類のナノファイバーから目的組織細胞に必要な物を同定するためには欠かせないものとなり、実用化へと加速化することができる。 In the present invention, by effectively using a microfluidic device, a system capable of screening nanofibers as a cell scaffold substrate with high efficiency in a microenvironment could be developed. Cell scaffolds are very important for cell function control and are necessary for the differentiation control of stem cells including human ES / iPS cells. However, each tissue cell requires a corresponding cell scaffold substrate. Until now, nanofibers have been regarded as promising as the cell scaffold base material, but due to the large number of parameters, they have not been put into practical use. Therefore, the nanofiber screening system as in the present invention is indispensable for identifying necessary substances for target tissue cells from various types of nanofibers, and can be accelerated to practical use.

ナノファイバーのスクリーニング法はこれまで開発されておらず、本発明は非常に重要な位置づけとなる。本発明で開発したナノファイバーのマイクロパターニング、アレイ化法はエレクトロスピニング法が適用出来る材料であれば全て（ポリマー材料、生体材料、ともに）に応用出来るので、非常に汎用性が高い。実用化に向けては、より多くの材料を基板上に集積・ナノファイバー化・アレイ化する必要であるが、技術的に困難ではない。 The screening method of nanofiber has not been developed so far, and the present invention is very important. The nanofiber micropatterning and arraying method developed in the present invention can be applied to all materials (both polymer materials and biomaterials) to which the electrospinning method can be applied. For practical application, more materials need to be integrated, nanofibered, and arrayed on the substrate, but this is not technically difficult.

マイクロ流体デバイスとナノファイバーを組み合わせた本発明は、幹細胞を用いた組織工学への応用も可能であり、幹細胞の実用化への足がかりとなる技術である。 The present invention that combines a microfluidic device and nanofibers can be applied to tissue engineering using stem cells, and is a technology that provides a basis for the practical application of stem cells.

Claims

After covering the platinum-coated polystyrene plate with a plastic mask, electrospinning is performed to accumulate nanofibers on the platinum-coated portion exposed from the design pattern of the plastic mask, and the plastic mask is removed to remove the plastic mask. Characterized in that various types of nanofibers are patterned into an array, and an artificial extracellular matrix portion composed of 10 to 400 nanofibers patterned into an array is arranged on the substrate at a predetermined interval. A method for producing a cell culture scaffold substrate.

Cell culture formed by arranging artificial extracellular matrix parts composed of various types of nanofibers patterned on a single substrate of platinum-coated polystyrene plate in an array of 10 to 400 on the substrate at a predetermined interval Scaffold base material.

The microfluidic structure and the cell culture scaffold base material are brought into close contact with each other so as to form a microfluidic channel at a corresponding position of each artificial extracellular matrix portion of the cell culture scaffold base material according to claim 2, A microfluidic device that enables cell culture and medium exchange in a channel.

4. The microfluidic device according to claim 3, wherein different types of nanofibers are arranged in each microfluidic channel of the microfluidic device.

A cell is cultured in the microfluidic channel of the microfluidic device according to claim 3 or 4, and a nanofiber suitable for the cultured cell is determined by evaluating the state of the cultured cell based on cell adhesion. A high-throughput screening method for nanofibers.