JP6433888B2 - 画像取得装置、試料の合焦点情報を取得する方法及びシステム - Google Patents

Description

本発明は、画像取得装置、試料の合焦点情報を取得する方法及びシステムに関する。

組織細胞などの試料を観察するための画像取得装置において、ステージ上の試料と対物レンズとの距離を一定にすると、試料の表面の凹凸によって焦点の合わない領域が混在した画像になってしまうことがある。このため、合焦点情報を取得しながら試料の撮像を行うダイナミックフォーカス方式や、試料の撮像前に合焦点情報を取得するプレフォーカス方式といった各種のフォーカス方法を適用した画像取得装置が開発されている。

特開２０１２−１０８１８４号公報

上述した従来の装置では、撮像素子で撮像された画像のうち、焦点が合っている合焦領域と焦点が合っていない非合焦領域とを把握できる。したがって、合焦領域に対応する画素列が撮像を行った際のステージの位置から焦点位置情報を求めることが可能となっている。しかしながら、この手法では、画素列ごとに撮像される試料の位置（平面位置）が異なるため、実際には僅かに異なる部位の焦点位置情報が取得されることとなる。また、上記装置は、例えば２０倍〜４０倍といった高倍率で撮像を行う顕微鏡装置であるため、被写体深度が小さく、顕微鏡光学系の視野は試料に対して非常に小さい。このため、試料全体の焦点位置情報を取得するには顕微鏡光学系の視野を移動させて撮像を行う必要があるが、ステージを駆動させない当該装置では操作が煩雑になると考えられる。

本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、試料の合焦点情報を迅速かつ精度良く取得できる画像取得装置、試料の合焦点情報を取得する方法及びシステムを提供することを目的とする。

上記課題の解決のため、本発明の一側面に係る画像取得装置は、試料が載置されるステージと、試料に向けて光を照射する光源と、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、導光光学系によって導光された試料の光像を撮像する撮像素子と、撮像素子からの画像データに基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させる第１の駆動部と、試料に対する対物レンズの焦点位置を変更する第２の駆動部と、撮像素子、第１の駆動部、及び第２の駆動部を制御する制御部と、を備え、撮像素子は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子であり、制御部は、第２の駆動部によって試料に対する対物レンズの焦点位置を変更させながら、試料における所定部位の光像が撮像素子の各画素列で露光されるように、第１の駆動部による対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と撮像素子のローリング読み出しとを同期させる。

また、本発明の一側面に係る試料の合焦点情報を取得するシステムは、試料を保持するステージと、ステージの試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子によって構成され、導光光学系によって導光された試料の光像を撮像する撮像素子と、撮像素子からの画像データに基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、を備え、試料に対する対物レンズの焦点位置を変更させながら、試料の所定部位の光像が撮像素子の各画素列で露光されるように、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と撮像素子のローリング読み出しとを同期させる。

これらの画像取得装置及びシステムでは、撮像素子として、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いている。ローリング読み出し方式では、各画素列での画像データの読み出しのタイミングが異なり、移動する被写体に対して用いると画像に歪みが生じてしまうため、一般には静止した被写体に対して用いられる。これに対し、これらの画像取得装置及びシステムでは、ローリング読み出しにおける各画素列での画像データの読み出しタイミングの遅延を利用し、対物レンズの焦点位置を変更させつつ、試料における所定部位（同一部位）の光像が撮像素子の各画素列で露光されるように、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動とローリング読み出しとを同期させている。これにより、各画素列からの画像データには、試料の同一部位において対物レンズの焦点位置が変更されたときのコントラスト情報が含まれることとなり、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。

また、制御部は、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動が一定速度となるように第１の駆動部を制御してもよい。これにより、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動とローリング読み出しとの同期を容易に制御できる。

また、制御部は、第１の駆動部によって試料に対する対物レンズの視野位置の移動が開始されてから所定時間経過した後、撮像素子の各画素列の露光を開始してもよい。これにより、露光を好適に実施できる。

また、撮像素子によって撮像が行われる複数の分割領域が設定され、試料の所定部位は、分割領域の端部以外の領域に位置するように設定されてもよい。試料の所定部位を分割領域の端部に設定すると、第１の駆動部によって試料の所定部位を移動させる際に加速度の影響を受け易くなる。したがって、分割領域の端部以外の領域に試料の所定部位を設定することで、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動とローリング読み出しとの同期を一層容易に制御できる。

また、合焦点算出部は、第１の駆動部によって対物レンズの視野位置が分割領域間を移動する際に合焦点情報の算出を行ってもよい。これにより、対物レンズの視野位置の移動中に合焦点情報を取得でき、試料の撮像を迅速に実行できる。

また、制御部は、試料に対する対物レンズの視野位置の移動が、少なくとも３つの分割領域にわたるように第１の駆動部を制御してもよい。３つ以上の分割領域にわたる撮像ラインを対象とすることで、制御の簡単化を図りつつ、撮像に要する時間の短縮化を実現できる。

また、撮像素子は、ローリング読み出しの読み出し方向を切り替え可能となっていてもよい。これにより、試料の所定部位の移動方向の自由度を拡張することが可能となる。

また、撮像素子の各画素列は、互いに読み出し方向が異なる第１の画素列群及び第２の画素列群によって構成されていてもよい。このような構成により、対物レンズの視野位置の双方向スキャンを簡単な構成で実行できる。

また、制御部は、試料の所定部位の移動と撮像素子のローリング読み出しとの同期中に、試料に対する対物レンズの焦点位置が高くなる方向及び低くなる方向に往復動するように第２の駆動部を制御してもよい。この場合、対物レンズの焦点位置が変更されたときのコントラスト情報をより多く取得できるので、合焦点情報を一層精度良く算出できる。

また、合焦点算出部は、算出した合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成してもよい。これにより、フォーカスマップを精度良く作成することができる。

合焦点算出部は、分割領域ごとに合焦点情報を算出してもよい。この場合、試料の全体のフォーカスマップを精度良く作成できる。

また、本発明の一側面に係る画像取得装置のフォーカス方法は、試料が載置されるステージと、試料に向けて光を照射する光源と、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、導光光学系によって導光された試料の光像を撮像する撮像素子と、撮像素子からの画像データに基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させる第１の駆動部と、試料に対する対物レンズの焦点位置を変更する第２の駆動部と、撮像素子、第１の駆動部、及び第２の駆動部を制御する制御部と、を備えた画像取得装置のフォーカス方法であって、撮像素子として、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用い、制御部により、第２の駆動部によって試料に対する対物レンズの焦点位置を変更させながら、試料における所定部位の光像が撮像素子の各画素列で露光されるように、第１の駆動部による対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と撮像素子のローリング読み出しとを同期させる。

また、本発明の一側面に係る試料の合焦点情報を取得する方法は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いて試料の合焦点情報を取得する方法であって、試料に対する対物レンズの焦点位置を変更させながら、試料の所定部位の光像が撮像素子の各画素列で露光されるように、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と撮像素子のローリング読み出しとを同期させ、撮像素子からの画像データに基づいて試料の合焦点情報を取得する。

これらの画像取得装置のフォーカス方法及び試料の合焦点情報を取得する方法では、撮像素子として、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いている。ローリング読み出し方式では、各画素列での画像データの読み出しのタイミングが異なり、移動する被写体に対して用いると画像に歪みが生じてしまうため、一般には静止した被写体に対して用いられる。これに対し、これらの画像取得装置のフォーカス方法及び試料の合焦点情報を取得する方法では、ローリング読み出しにおける各画素列での画像データの読み出しタイミングの遅延を利用し、対物レンズの焦点位置を変更させつつ、試料における所定部位（同一部位）の光像が撮像素子の各画素列で露光されるように、対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動とローリング読み出しとを同期させている。これにより、各画素列からの画像データには、試料の同一部位において対物レンズの焦点位置が変更されたときのコントラスト情報が含まれることとなり、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。

本発明によれば、試料の合焦点情報を迅速かつ精度良く取得できる。

本発明に係る画像取得装置の一実施形態を示す図である。 撮像素子の一例を示す図であり、（ａ）は撮像素子の受光面、（ｂ）は撮像素子におけるローリング読み出しを示す。 試料に対する画像取得領域のスキャンの一例を示す図である。 対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と撮像素子６のローリング読み出しとの同期の様子を示す図であり、（ａ）は対物レンズの視野と分割領域との位置関係、（ｂ）各画素列に対する試料の所定部位と撮像素子の露光及び読み出しのタイミングを示す。 図４の後続の状態を示す図である。 図５の後続の状態を示す図である。 撮像素子における画素列の構成の一例を示す図である。 画像処理部で処理されるコントラスト情報の一例を示す図である。 図１に示した画像取得装置の動作を示すフローチャートである。 フォーカスマップを作成する場合の分割領域と試料の所定部位との関係を示す図である。 フォーカスマップを作成する場合の画像取得装置の動作を示すフローチャートである。

以下、図面を参照しながら、本発明に係る画像取得装置、試料の合焦点情報を取得する方法及びシステムの好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、本発明に係る画像取得装置の一実施形態を示す図である。同図に示すように、画像取得装置１は、試料Ｓが載置されるステージ２と、試料に向けて光を照射する光源３と、ステージ２上の試料Ｓと対峙するように配置された対物レンズ２５を含む導光光学系５と、導光光学系５によって導光された試料Ｓの光像を撮像する撮像素子６とを備えている。

また、画像取得装置１は、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置を移動させるステージ駆動部（第１の駆動部）１１と、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置を変更させる対物レンズ駆動部（第２の駆動部）１２と、撮像素子６、ステージ駆動部１１、及び対物レンズ駆動部１２を制御する制御部１３と、画像処理部１４とを備えている。

画像取得装置１で観察する試料Ｓは、例えば組織細胞などの生体サンプルであり、スライドガラスに密封された状態でステージ２に載置される。光源３は、ステージ２の底面側に配置されている。光源３としては、例えばレーザダイオード（ＬＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）、ハロゲンランプといったランプ方式光源などが用いられる。

導光光学系５は、光源３とステージ２との間に配置される照明光学系２１と、ステージ２と撮像素子６との間に配置される顕微鏡光学系２２とによって構成されている。照明光学系２１は、例えば集光レンズ２３と投影レンズ２４とによって構成されるケーラー照明光学系を有し、光源３からの光を導光して試料Ｓに均一な光を照射するようになっている。一方、顕微鏡光学系２２は、対物レンズ２５と、対物レンズ２５の後段側（撮像素子６側）に配置された結像レンズ２６とを有し、試料Ｓの光像を撮像素子６に導光する。なお、試料Ｓの光像とは、明視野照明の場合は透過光、暗視野照明の場合は散乱光、発光計測の場合は発光（蛍光）による像である。また、試料Ｓからの反射光による像であってもよい。

撮像素子６は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子である。このような撮像素子６としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサが挙げられる。撮像素子６の受光面６ａには、図２（ａ）に示すように、読み出し方向に垂直な方向に複数の画素が配列されてなる画素列３１が読み出し方向に複数配列されている。

撮像素子６では、図２（ｂ）に示すように、駆動クロックの駆動周期に基づいて、リセット信号、読み出し開始信号、及び読み出し終了信号が出力されることで、画素列３１毎に露光及び読み出しが制御される。一の画素列３１の露光期間は、リセット信号に伴う電荷の排出から読み出し開始信号に伴う電荷の読み出しまでの期間である。また、一の画素列３１の読み出し期間は、読み出し開始信号に伴う電荷の読み出し開始から読み出し終了信号に伴う電荷の読み出し終了までの期間である。なお、次の画素列に対する読み出し開始信号を読み出し終了信号として用いることもできる。

ローリング読み出しでは、画素列３１毎に出力する読み出し開始信号が所定の時間差で順次出力される。このため、全ての画素列の読み出しを同時に行うグローバル読み出しとは異なり、画素列３１毎の読み出しが所定の時間差をもって順次行われる。ローリング読み出しにおける読み出し速度は、各画素列３１を読み出すための読み出し開始信号の時間間隔によって制御される。読み出し開始信号の時間間隔を短くすると読み出し速度は早くなり、読み出し開始信号の時間間隔を長くすると読み出し速度は遅くなる。隣接する画素列３１，３１間での読み出し間隔の調整は、例えば駆動クロックの周波数の調整、読み出し期間中の遅延期間の設定、読み出し開始信号を規定するクロック数の変更といった手法によって実施できる。

ステージ駆動部１１は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータといったモータやアクチュエータによって構成されている。ステージ駆動部１１は、制御部１３による制御に基づいて、ステージ２を対物レンズ２５の光軸の直交面に対して所定の角度（例えば９０度）を有する面についてＸＹ方向に移動させる。これにより、ステージ２に固定された試料Ｓが対物レンズの光軸に対して移動し、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置が移動することとなる。

画像取得装置１では、例えば２０倍〜４０倍といった高倍率で試料Ｓの撮像が行われる。このため、対物レンズ２５の視野Ｖは、試料Ｓに対して小さく、図３に示すように、一回の撮像で画像を取得できる領域も試料Ｓに対して小さくなる。したがって、試料Ｓの全体を撮像するためには、対物レンズ２５の視野Ｖを試料Ｓに対してスキャンする必要がある。

そこで、画像取得装置１では、試料Ｓを保持する試料容器（例えばスライドガラス）に対して試料Ｓを含むように画像取得領域３２を設定し、画像取得領域３２及び対物レンズ２５の試料Ｓ上の視野Ｖに基づいて複数の分割領域３３の位置を設定する。そして、分割領域３３に対応する試料Ｓの一部を撮像することで、分割領域３３に対応する部分画像データを取得した後、対物レンズ２５の視野Ｖが次に撮像する分割領域３３の位置となるようにステージ駆動部１１を駆動し、再び撮像を行って部分画像データを取得する。このとき、制御部１３は、ステージ駆動部１１を駆動し、試料Ｓ上の対物レンズ２５の視野Ｖを分割領域３３から次の分割領域３３へ移動する際にステージ２を加速・減速させ、試料Ｓ上の視野Ｖが次の分割領域３３となる位置でステージ２を停止させる。以降、画像取得装置１では、この動作が繰り返し実行され、画像処理部１４は、取得した部分画像データを結合して試料Ｓの全体の画像を作成する。

試料Ｓの全体を撮像するために、画像取得装置１では、制御部１３が複数の分割領域３３から構成される撮像ラインＬｎ（ｎは自然数）に沿ったスキャン方向に試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置を移動させるように制御する。このとき、制御部１３は、試料Ｓ上の対物レンズ２５の視野Ｖが次に撮像される分割領域３３に位置するようにスキャン方向に沿ってステージ２を移動させる。隣接する撮像ラインＬｎ間での試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置の移動は、例えば図３に示すように、隣り合う撮像ラインＬｎ間でスキャン方向が反転する双方向スキャンが採用される。また、スキャン方向が各撮像ラインＬｎで同方向となる一方向スキャンであってもよい。なお、対物レンズ２５の視野位置が分割領域３３間をランダムに移動するランダムスキャンであってもよい。

対物レンズ駆動部１２は、ステージ駆動部１１と同様に、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータといったモータやアクチュエータによって構成されている。対物レンズ駆動部１２は、制御部１３による制御に基づいて、対物レンズ２５を対物レンズ２５の光軸に沿ったＺ方向に移動させる。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置が移動する。

制御部１３は、撮像素子６、ステージ駆動部１１、及び対物レンズ駆動部１２の動作をそれぞれ制御する部分である。具体的には、制御部１３は、対物レンズ駆動部１２によって試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置（焦点面）を変更させる。このとき、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置は、一方向に沿って移動する。具体的には、制御部１３は、対物レンズ駆動部１２によってステージ２に対する対物レンズ２５のＺ方向の位置を変更させ、ステージ２と対物レンズ２５の間隔を変更させる。

なお、ステージ駆動部１１が、対物レンズ２５の光軸に沿ったＺ方向に沿ってステージ２を移動させることができる場合、制御部１３は、ステージ駆動部１１によって対物レンズ２５に対するステージ２のＺ方向の位置を変更させ、ステージ２と対物レンズ２５の間隔を変更させてもよい。この場合、ステージ駆動部１１は、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置を移動させる駆動部となるため、本実施形態と同等の機能を果たす。

また、制御部１３は、試料Ｓにおける所定部位の光像が撮像素子６の各画素列３１で露光（受光）されるように、ステージ駆動部１１による対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料の所定部位の移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させる。例えば、ステージ駆動部１１によるステージ２の移動と撮像素子６のローリング読出しとを同期させている。なお、対物レンズ駆動部１２が対物レンズ２５を含む導光光学系５をＸＹ方向に移動させることが可能な場合、制御部１３は、試料Ｓにおける所定部位の光像が撮像素子６の各画素列３１で露光（受光）されるように、対物レンズ駆動部１２による対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料の所定部位の移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させてもよい。この場合、対物レンズ駆動部１２は、試料Ｓに対する対物レンズの視野位置を移動させる駆動部となるため、本実施形態と同等の機能を果たす。

本実施形態では、次に撮像される分割領域３３における試料Ｓの合焦点情報の取得を撮像の直前に行うダイナミックプレフォーカス方式が採用されている。本実施形態では、次に撮像される分割領域３３への対物レンズ２５の視野位置の移動中に合焦点情報を取得できるため、次に撮像する分割領域３３に対物レンズ２５の視野Ｖが位置した時点で、合焦点位置に試料Ｓを位置させることが可能となる。したがって、試料Ｓの撮像を迅速に実行できる。

制御部１３は、図４（ａ）に示すように、対物レンズ２５の視野Ｖが一の分割領域３３ａから次の分割領域３３ｂに移動する際に、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動が一定速度となるようにステージ駆動部１１を制御する。また、制御部１３は、図４（ｂ）に示すように、撮像素子６の受光面６ａにおける試料Ｓの光像の結像Ｓｂの移動方向と、撮像素子６の各画素列３１の読み出し方向とが一致するようにステージ駆動部１１及び撮像素子６を制御する。なお、ローリング読出しの読出し速度を可変に設定できる撮像素子を用いる場合、制御部１３は、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動速度に基づいて、ローリング読出しの読出し速度を変更してもよい。

焦点情報の取得に用いられる試料Ｓの所定部位Ｓａの位置は、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野Ｖの移動の開始から画素列３１の露光の開始までの時間に基づいて設定することができる。分割領域３３における所定部位Ｓａの位置を任意の位置とする場合、制御部１３は、対物レンズ２５の視野Ｖが移動してから所定の時間だけ経ってから画素列３１の露光を開始するように、撮像素子６に露光開始のためのリセット信号を出力する。また、分割領域３３の特定の位置に所定部位Ｓａの位置を設定する場合、制御部１３は、分割領域３３おける所定部位Ｓａの位置と対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動速度（もしくは移動加速度）に基づいて、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野Ｖの移動の開始から画素列３１の露光の開始までの時間を算出する。そして、制御部１３は、視野Ｖの移動の開始から算出された時間を経ってから画素列３１の露光を開始させる。

例えば試料Ｓの所定部位Ｓａの位置は、分割領域３３の端部（分割領域３３の境界に接する領域）以外の領域に設定されることが好ましい場合がある。この場合、試料Ｓの所定部位Ｓａは、分割領域３３の境界を含まないように設定され、分割領域３３の端部（分割領域３３の境界に接する領域）以外の領域の位置と対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動速度（もしくは移動加速度）とに基づいて、画素列３１の露光の開始が制御される。

また、各画素列３１における露光時間は、少なくとも試料Ｓの所定部位Ｓａのスキャン方向における幅及び対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動速度に基づいて設定される。より好ましくは、導光光学系５の倍率も考慮するとよい。これにより、各画素列３１により、試料Ｓの所定部位Ｓａの光像を露光することができる。

ここで、時間Ｔ１において、図４（ｂ）に示すように、撮像素子６の受光面６ａにおける試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第１列目の画素列３１に到達すると、この第１列目の画素列３１の露光が開始される。

時間Ｔ２に移ると、図５（ａ）に示すように、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの位置が移動する。また、対物レンズ２５の焦点位置が、時間Ｔ１のときの焦点位置に比べて、例えば試料Ｓと対物レンズ２５との間の間隔が狭くなる方向に変化する。試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置は、一方向に沿って移動する。このとき、図５（ｂ）に示すように、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第２列目の画素列３１に到達し、第２列目の画素列３１の露光が開始される。また、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが第１列目の画素列３１を通過するタイミングで、第１列目の画素列３１の読み出しが開始される。

さらに、時間Ｔ３に移ると、図６（ａ）に示すように、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの位置がスキャン方向に更に移動する。また、対物レンズ２５の焦点位置が、時間Ｔ１のときの焦点位置に比べて、試料Ｓと対物レンズ２５との間の間隔が更に狭くなる方向に変化する。このとき、図６（ｂ）に示すように、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが撮像領域の第３列目の画素列３１に到達し、第３列目の画素列３１の露光が開始される。また、試料Ｓの所定部位Ｓａからの光の結像Ｓｂが第２列目の画素列３１を通過するタイミングで、第２列目の画素列３１の読み出しが開始される。さらに、第２列目の画素列３１の読み出しと同時に第１列目の画素列３１の読み出しが終了する。

以下、所定の画素列数に到達するまで、同様の手順で対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と、画素列３１でのローリング読み出しとが実施される。各画素列３１で読み出された画像データは、画像処理部１４に順次出力される。なお、撮像素子６は、ローリング読み出しの読み出し方向を切り替え可能であることが好ましい。こうすると、双方向スキャンやランダムスキャンのように、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置のスキャン方向が変わる場合でも試料Ｓからの光の結像Ｓｂの移動方向と、撮像素子６の各画素列３１の読み出し方向とを容易に一致させることができる。

撮像素子６の受光面６ａを構成する複数の画素列３１は、図７に示すように、複数の画素列によって構成される第１の画素列群３１ａと第２の画素列群３１ｂに分け、第１の画素列群３１ａと第２の画素列群３１ｂをそれぞれ読み出す構成にしてもよい。この場合、第１の画素列群３１ａの読み出し方向と第２の画素列群３１ｂの読み出し方向とを逆方向となるように設定し、スキャン方向に応じて焦点情報取得に用いる画素列群を選択してもよい。具体的には、第１の画素列群３１ａでは、端の画素群から中央の画素群へ順次読み出されるように制御され、第２の画素列群３１ｂでも端の画素群から中央の画素群へ順次読み出されるように制御される。もちろん、第１の画素列群３１ａでは、中央の画素列から端の画素列へ順次読み出されるように制御され、第１の画素列群３１ａでも中央の画素列から端の画素列へ順次読み出されるように制御されてもよい。これにより、双方向スキャンに対応させることができる。また、第１の画素列群３１ａを端の画素群から中央の画素群へ順次読み出されるように制御し、同時に、第２の画素列群３１ｂを、中央の画素群から端の画素群へ順次読み出されるように制御してもよい。この場合、第１の画素列群３１ａと第２の画素列群３１ｂで異なる試料位置の光像を露光（受光）するため、同時に２つの位置での合焦点情報を得ることができる。なお、双方向スキャンの際、第１の画素列群３１ａと第２の画素列群３１ｂとの読出し方向を反対にすればよい。

画像処理部１４は、撮像素子６で撮像された部分画像データを合成して試料Ｓの観察画像を生成する部分である。画像処理部１４は、撮像素子６から出力される各分割領域３３の部分画像データを順次受け取り、これらを合成して試料Ｓの全体の観察画像を生成する。

また、画像処理部１４は、撮像素子６からの画像データに基づいて試料Ｓの合焦点情報を算出する合焦点算出部として機能する。具体的には、画像処理部１４は、撮像素子６の各画素列３１からの画像データに基づいて試料Ｓの合焦点情報を算出する。合焦点情報としては、例えば対物レンズ２５の焦点位置に試料Ｓが一致する対物レンズ２５もしくはステージ２のＺ方向の位置情報が挙げられる。このような情報としては、例えば対物レンズ２５のＺ方向における位置や試料Ｓ（ステージ２）に対する対物レンズ２５の高さ（間隔）、ステージ２のＺ方向における位置、対物レンズ２５に対する試料Ｓ（ステージ２）の高さ（間隔）などが挙げられる。

上述したように、制御部１３は、対物レンズ駆動部１２によって対物レンズ２５の焦点位置を変更させながら、試料Ｓにおける所定部位Ｓａの光像が撮像素子６の各画素列３１で露光されるように、ステージ駆動部１１による対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させている。したがって、各画素列３１は、試料Ｓの所定部位Ｓａの光像を露光するため、上記焦点位置の取得を実行した際の撮像素子６からの画像データには、試料Ｓの所定部位Ｓａ（同一部位）において対物レンズ２５の焦点位置が変更したときのコントラスト情報が含まれる。

図８は、画像処理部で処理されるコントラスト情報の一例を示す図である。同図に示す例では、撮像領域の第１列目の画素列３１から第ｎ列目の画素列３１までの画像データのコントラスト値が示されており、第ｉ列目の画素列３１における画像データのコントラスト値がピーク値となっている。この場合、画像処理部１４は、第ｉ列目の画素列３１で試料Ｓの所定部位Ｓａの露光を行ったときの対物レンズ２５の焦点位置が合焦点位置であるとして合焦点情報を生成する。なお、コントラスト値は、各画素列３１に含まれる画素のうちの特定の画素におけるコントラスト値を用いてもよく、各画素列３１に含まれる画素の全体又は一部のコントラスト値の平均値を用いてもよい。

続いて、上述した画像取得装置１の動作について説明する。図９は、画像取得装置の動作を示すフローチャートである。

ダイナミックプレフォーカス方式を採用した画像取得装置１では、一の分割領域３３での試料Ｓの撮像が行われると（ステップＳ０１）、次の分割領域３３に向けて対物レンズ２５の視野Ｖが移動する（ステップＳ０２）。次に、対物レンズ２５の視野Ｖの移動中に、対物レンズ２５の焦点位置を変更させた状態で、所定の時間が経過した後、試料Ｓにおける所定部位Ｓａの光像が撮像素子６の各画素列３１で露光されるように、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料の所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させる（ステップＳ０３）。

所定の画素列３１での画像データの読み出しを終えた後、各画素列の画像データのコントラスト値に基づいて合焦点情報の算出がなされる（ステップＳ０４）。そして、算出された合焦点情報に基づいて試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置が調整され、次の分割領域３３に対物レンズ２５の視野Ｖが位置した後、次の分割領域３３での試料Ｓの撮像が行われる（ステップＳ０５）。ステップＳ０１〜Ｓ０５の処理を繰り返し、すべての分割領域３３において試料Ｓの撮像が終了すると、各分割領域３３の画像が合成され、試料Ｓの全体の観察画像が生成される。

以上説明したように、画像取得装置１では、撮像素子６として、複数の画素列３１を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いている。ローリング読み出し方式では、各画素列３１での画像データの読み出しのタイミングが異なり、移動する被写体に対して用いると画像に歪みが生じてしまうため、一般には静止した被写体に対して用いられる。これに対し、画像取得装置１では、ローリング読み出しにおける各画素列３１での画像データの読み出しタイミングの遅延を利用し、対物レンズ２５の焦点位置を変更させつつ、試料Ｓにおける所定部位Ｓａ（同一部位）の光像が撮像素子６の各画素列３１で露光されるように、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動とローリング読み出しとを同期させている。これにより、各画素列３１からの画像データには、試料Ｓの同一部位において対物レンズ２５の焦点位置が変更したときのコントラスト情報が含まれることとなり、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。

また、画像取得装置１では、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動が一定速度となるようにステージ駆動部１１が制御される。これにより、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動とローリング読み出しとの同期を容易に制御できる。

また、試料Ｓの所定部位Ｓａは、撮像素子６の画像取得領域３２において、分割領域３３の端部以外の領域に位置するように設定される。試料Ｓの所定部位Ｓａを分割領域３３の端部に設定すると、ステージ駆動部１１によって試料Ｓの所定部位Ｓａを移動させる際に加速度の影響を受け易くなる。したがって、分割領域３３の端部以外の領域に試料Ｓの所定部位Ｓａを設定することで、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動とローリング読み出しとの同期を一層容易に制御できる。

本発明は、上記実施形態に限られるものではない。例えば上記実施形態では、試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとの同期中に、対物レンズ２５の焦点位置が高くなる方向及び低くなる方向のいずれか一方に移動するように対物レンズ駆動部１２を制御することを想定しているが、対物レンズ２５の焦点位置が高くなる方向及び低くなる方向に往復動するように対物レンズ駆動部１２の制御を行ってもよい。この場合、対物レンズ２５とステージ２との間のＺ方向における距離（間隔）が拡大及び縮小を繰り返すように制御される。

試料Ｓが組織細胞である場合、その厚みは例えば１０μｍ程度である。したがって、画素列３１ごとの対物レンズ２５の焦点位置の移動距離を０．１μｍ程度に設定すると、１００画素列程度で試料Ｓの全体の厚みに対してコントラスト情報を取得できる。これに対し、ＣＭＯＳイメージセンサといった二次元撮像素子は、例えば数千程度の画素列を有しているため、１フレームの間に複数回のコントラスト情報の取得が可能である。したがって、対物レンズ２５を高さ方向に往復動させることによって試料Ｓの複数の所定領域について合焦点情報を算出することができ、合焦点情報を一層精度良く算出できる。

また、上記実施形態では、ダイナミックプレフォーカス方式を採用していたが、フォーカスマップ方式を採用することもできる。ダイナミックプレフォーカス方式では、一の分割領域３３の撮像と次の分割領域３３の撮像との合間に合焦点情報の取得を行っていたが、フォーカスマップ方式では、試料Ｓの撮像を行う前に、画像取得領域３２或いは撮像ラインＬｎについて、各分割領域３３における合焦点情報を取得する。

この場合、制御部１３は、複数の分割領域３３にわたって対物レンズ２５の視野Ｖが一定速度で移動するようにステージ駆動部１１を制御する。このとき、撮像素子６の受光面６ａにおいて、試料Ｓの所定の位置からの光の結像Ｓｂの移動方向と撮像素子６の読み出し方向とを一致させる。また、試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させる。そして、一のフレームの読み出しが終了したタイミングで次のフレームの読み出しを開始させることで、図１０に示すように、合焦点情報の算出に用いられる試料Ｓの所定部位Ｓａが一定間隔で出現し、各分割領域３３において少なくとも一つの合焦点情報を取得できる。各分割領域３３での合焦点情報を元に最小二乗法等を適用することにより、撮像ラインＬｎ或いは試料Ｓの全体のフォーカスマップを精度良く作成できる。

図１１は、フォーカスマップを作成する場合の画像取得装置の動作を示すフローチャートである。同図に示すように、フォーカスマップ方式を採用した画像取得装置１では、ステージ駆動部１１によるステージ２の移動が開始すると、複数の分割領域３３にわたって対物レンズ２５の視野Ｖが移動する（ステップＳ１１）。また、対物レンズ２５の焦点位置をＺ方向に沿って往復動するように変更させながら、試料Ｓにおける所定部位Ｓａの光の結像Ｓｂが撮像素子６の各画素列３１で露光されるように、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させ（ステップＳ１２）、各分割領域３３における合焦点情報を算出する（ステップＳ１３）。

その後、所望の撮像ラインＬｎについて合焦点情報の算出の取得が完了したか否かが判断され（ステップＳ１４）、合焦点情報の算出の取得が完了していない場合には、次の撮像ラインＬｎに対物レンズ２５の視野Ｖを移動させ（ステップＳ１５）、ステップＳ０１〜Ｓ０３の処理を繰り返し実行する。合焦点情報の算出の取得が完了した場合には、合焦点情報に基づいて試料Ｓのフォーカスマップを作成する（ステップＳ１６）。そして、作成されたフォーカスマップに基づいて、対物レンズ２５の焦点位置を試料Ｓに合わせながら各分割領域３３の画像データを取得する。

なお、１つの撮像ラインＬｎについての合焦点情報を取得後、その撮像ラインＬｎに対するフォーカスマップを作成し、作成したフォーカスマップに基づいて、対物レンズ２５の焦点位置を試料Ｓに合わせながらその撮像ラインＬｎを構成する各分割領域３３の画像データを取得してもよい。また、フォーカスマップの作成は、各分割領域３３での合焦点情報を元に最小二乗法等を適用する以外にも、各分割領域３３での合焦点情報自体をフォーカスマップとしてもよい。

１…画像取得装置、２…ステージ、３…光源、５…導光光学系、６…撮像素子、１１…ステージ駆動部（第１の駆動部）、１２…対物レンズ駆動部（第２の駆動部）、１３…制御部、１４…画像処理部（合焦点算出部）、２５…対物レンズ、３１…画素列、３２…画像取得領域、３３…分割領域、Ｓ…試料、Ｓａ…試料の所定部位、Ｖ…対物レンズの視野。

Claims (13)

1. 試料が載置されるステージと、
   前記試料に向けて光を照射する光源と、
   前記ステージ上の前記試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、
   前記導光光学系によって導光された前記試料の光像を撮像する撮像素子と、
   前記撮像素子からの画像データに基づいて前記試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、
   前記試料に対する前記対物レンズの視野位置を移動させる第１の駆動部と、
   前記試料に対する前記対物レンズの焦点位置を変更する第２の駆動部と、
   前記撮像素子、前記第１の駆動部、及び前記第２の駆動部を制御する制御部と、を備え、
   前記撮像素子は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子であり、
   前記制御部は、前記第２の駆動部によって前記試料に対する前記対物レンズの前記焦点位置を変更させながら、前記試料における所定部位の光像が前記撮像素子の各画素列で露光されるように、前記第１の駆動部による前記対物レンズの視野内での前記試料の所定部位の移動と前記撮像素子のローリング読み出しとを同期させる、画像取得装置。
2. 前記制御部は、前記対物レンズの視野内での前記試料の所定部位の移動が一定速度となるように前記第１の駆動部を制御する、請求項１記載の画像取得装置。
3. 前記制御部は、前記第１の駆動部によって前記試料に対する前記対物レンズの前記視野位置の移動が開始されてから所定時間経過した後、前記撮像素子の各画素列の露光を開始する、請求項１又は２記載の画像取得装置。
4. 前記撮像素子によって撮像が行われる複数の分割領域が設定され、
   前記試料の前記所定部位は、前記分割領域の端部以外の領域に位置するように設定される、請求項１〜３のいずれか一項記載の画像取得装置。
5. 前記合焦点算出部は、前記第１の駆動部によって前記対物レンズの視野位置が前記分割領域間を移動する際に前記合焦点情報の算出を行う、請求項４記載の画像取得装置。
6. 前記制御部は、前記試料に対する前記対物レンズの前記視野位置の移動が、少なくとも３つの分割領域にわたるように前記第１の駆動部を制御する、請求項４又は５記載の画像取得装置。
7. 前記撮像素子は、前記ローリング読み出しの読み出し方向を切り替え可能となっている、請求項１〜６のいずれか一項記載の画像取得装置。
8. 前記撮像素子の各画素列は、互いに読み出し方向が異なる第１の画素列群及び第２の画素列群によって構成されている、請求項１〜６のいずれか一項記載の画像取得装置。
9. 前記制御部は、前記試料の所定部位の移動と前記撮像素子のローリング読み出しとの同期中に、前記試料に対する前記対物レンズの前記焦点位置が高くなる方向及び低くなる方向に往復動するように前記第２の駆動部を制御する、請求項１〜８のいずれか一項記載の画像取得装置。
10. 前記合焦点算出部は、算出した合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する、請求項１〜９のいずれか一項記載の画像取得装置。
11. 前記合焦点算出部は、前記分割領域ごとに前記合焦点情報を算出する、請求項４記載の画像取得装置。
12. 複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いて試料の合焦点情報を取得する方法であって、
    前記試料に対する対物レンズの焦点位置を変更させながら、前記試料の所定部位の光像が前記撮像素子の各画素列で露光されるように、前記対物レンズの視野内での前記試料の所定部位の移動と前記撮像素子のローリング読み出しとを同期させ、
    前記撮像素子からの画像データに基づいて前記試料の合焦点情報を取得する、方法。
13. 試料の合焦点情報を取得するシステムであって、
    前記試料を保持するステージと、
    前記ステージ上の前記試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、
    複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子によって構成され、前記導光光学系によって導光された前記試料の光像を撮像する撮像素子と、
    前記撮像素子からの画像データに基づいて前記試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、を備え、
    前記試料に対する前記対物レンズの焦点位置を変更させながら、前記試料の所定部位の光像が前記撮像素子の各画素列で露光されるように、前記対物レンズの視野内での前記試料の所定部位の移動と前記撮像素子のローリング読み出しとを同期させる、システム。

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