JP6440966B2 - グルコース製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、セルロース原料からのグルコース収集率を向上させることができるグルコース製造方法に関する。

近年、グルコースは、石油燃料の代替燃料としてのバイオエタノールや高分子素材の原材料として工業用用途への利用が増加してる。

従来、工業用のグルコースは、特許文献１に記載されているように、ジャガイモ類およびトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギまたは米などの穀類、もしくは、サトウキビやテンサイのような砂糖原料用の植物から製造されていたが、工業用用途への加速化により、食料用として取引される穀類や砂糖原料用の植物の取引価格が高騰し、家計の圧迫や発展途上国における飢餓への影響が懸念されている。

そこで、地球上の埋蔵量が膨大な木材、草、稲藁などの非食料品であるセルロース原料からグルコースを製造することが望まれており、特許文献２には、このようなセルロース原料からグルコースを製造することが記載されている。

特開２０１１−９１５５５０号公報 特開２０１２−０８５５４４号公報

しかしながら、セルロース原料は結晶質成分が非常に強固であるため、強酸を用いて強制的な糖化処理を施さずに、酵素分解によってグルコースを得るためには、特許文献２に記載されているように、前処理として、セルロース原料のペレット化工程やアルカリ溶液への浸漬工程などを施すことが一般的であり、これらの前処理を施してもグルコースの収集率を飛躍的に向上させることは困難であった。

そこで、本発明は、グルコースの収集率に優れたグルコース製造方法を提供することを目的とする。

ここで、ウシ、ロバ、ラクダ、ヒツジ、ヤギなどの反芻動物は、藁などのセルロース原料を体内で糖化することでエネルギーを得ている。本発明者等は、セルロース原料を食料としている反芻動物のセルロース分解機能に着目し、当該反芻動物の唾液が、酵素分解を補助する一要因となっていることを見出し、本発明を完成させるに到った。

上記の目的を達成するべく、本発明のグルコース製造方法は、セルロースを、セルロース分解酵素と、反芻を行う動物またはロバの唾液または３ｋＤ以上のタンパク質含有画分からなる生物唾液由来の活性助剤との混合物を用いて分解することを特徴とする。また、本発明のグルコース製造方法の第２の態様は、前記生物唾液由来の活性助剤が、反芻を行う動物の唾液から抽出されてなることを特徴とする。またさらに、本発明のグルコース製造方法の第３の態様は、前記反芻を行う動物の唾液が、ウシ、ロバ、ラクダ、ヒツジ、ヤギの唾液であることを特徴とする。

このような、本発明のグルコース製造方法においては、セルロース原料からのグルコースの収集率を飛躍的に向上させることを可能とする。

本発明のグルコース製造方法によれば、セルロース原料からのグルコースの収集率を飛躍的に向上させることを可能とする。

さらには、比較的に穏やかな酵素分解によってセルロース原料を糖化させるので、製造プラントの安全性管理へのコストの低兼化を図ることができ、結果的に、グルコースを低価格で提供することを可能とする。

本発明のグルコース製造方法の実施形態における製造工程を示すフローチャート 本発明のグルコース製造方法の実施例１における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ 本発明のグルコース製造方法の実施例２における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ 本発明のグルコース製造方法の実施例３における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ 本発明のグルコース製造方法の実施例４における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ 本発明のグルコース製造方法の実施例５における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ 本発明のグルコース製造方法の実施例６における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ 本発明のグルコース製造方法の実施例７における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ 本発明のグルコース製造方法の実施例８における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ 分子サイズ分画を施した各溶出液の銀染色像 本発明のグルコース製造方法の実施例９における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ

以下に、本発明のグルコース製造方法の具体的な実施形態を図１乃至図４を用いて詳しく説明する。

本発明のグルコース製造方法は、木材、草、稲藁などのセルロース原料を、セルロース分解酵素と、唾液または生物唾液由来の活性助剤との混合物を用いて分解してグルコースを得る方法である。

セルロース分解酵素は、セルロースの非結晶領域をランダムに切断し、セルロースの重合度を低下させるエンドグルカナーゼ、セルロースの結晶領域末端からセロビオース単位で分解するセロビオハイドロラーゼおよびセロビオースをグルコースに分解するβ−グルコシターゼの3種類の酵素を含むセルラーゼを用いることができる。

当該セルラーゼは、市販のセルラーゼや細菌もしくは植物などから抽出したものなど、特にその種類を限定するものではないが、セルロース分解に優れたトリコデルマ由来のセルラーゼを用いることにより、グルコースの収集率をより向上させることができる。

唾液または生物唾液由来の活性助剤は、反芻を行う動物の唾液、もしくは、当該唾液から抽出された活性助剤を用いることができる。反芻を行う動物としては、例えば、ウシ、ロバ、ラクダ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。特に、本発明のグルコース製造方法を工業的に実施する際には、ウシを適用することにより、安定的に所定量の唾液を供給することができる。

また、生物唾液由来の活性助剤としては、生物唾液中の有機化合物を用いることができる。

このような、本発明グルコース製造方法の具体的な実施形態においては、図１に示すように、セルロース原料Ｃを所定の粒子径まで粉砕する粉砕工程Ｓ１、粉砕した粉砕セルロースＣｆをセルロース分解酵素と唾液または生物唾液由来の活性助剤との混合物によって酵素分解を行う酵素分解工程Ｓ２、酵素分解工程Ｓ２において生成されたグルコースを精製するためのグルコース精製工程Ｓ３を行うようにされている。

特に、粉砕工程Ｓ１においては、得られる粉砕セルロース原料Ｃｆの粒子径が小さいほど好ましく、セルロース中の非結晶成分を露出させることで、セルロース分解酵素による酵素分解を容易にして、グルコースの収集率をより向上させることができる。

なお、粉砕工程Ｓ１は、セルロース原料Ｃの粒子径が十分に細かい場合には、省略することができる。

また以上の工程以外にも、例えば、イオン液体中に溶解させる、エチレンジアミンなどの塩基性溶媒に溶解させるなどしてセルロースに流動性を付与する液状化工程などを採用することができる。

このような、本発明のグルコース製造方法によれば、セルロース原料Ｃから酵素分解によってグルコースを製造する方法であって、酵素分解工程Ｓ２において、セルロース分解酵素と唾液または生物唾液由来の活性助剤との混合物を用いて酵素分解を行うようにすることで、セルロース分解酵素によるセルロース原料Ｃの分解を促進し、セルロース原料Ｃからのグルコースの収集率を飛躍的に向上させることを可能とする。

さらには、比較的に穏やかな酵素分解によってセルロース原料を糖化させるので、製造プラントの安全性管理へのコストの低兼化を図ることができ、結果的に、製造されたグルコースを低価格で提供することを可能とする。

以下に、本発明のグルコース製造方法の具体的な実施例を説明する。

＜実施例１＞
実施例１においては、生物の唾液としてウシの唾液を用いてグルコースの生成を行った。

本実施例においては、セルロース原料として微結晶性セルロースであるＡｖｉｃｅｌ（Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、１％濃度のＡｖｉｃｅｌを５０ｍＭの緩衝液に添加して１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液としている。セルロース分解酵素は、セルラーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｖｉｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用い、５０ｍＭの緩衝液１ｍＬ中当たりに５００μｇのセルラーゼを懸濁し、さらに当該緩衝液で５倍に希釈して１００μｇ／ｍＬ酵素溶液としている。ウシの唾液は、ウシの口内から採取した原液を緩衝液にて５０倍に希釈したものを用いる。なお、緩衝液としては、共に、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム水溶液を用いた。

本実施例におけるグルコース製造方法は、まず、セルロース原料Ｃとしての１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬに対して、１００μｇ／ｍＬ酵素溶液１５μＬおよびウシ唾液１５μＬを添加し、５０℃の条件下で２４時間のインキュベーションを行った（当該サンプルを以降、サンプルＡと称する）。

本発明のグルコース製造方法におけるグルコースの生成量を検討するべく、１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬに対して、１００μｇ／ｍＬ酵素溶液１５μＬのみを添加したものを、緩衝液にて総量１５０μＬとしたサンプルＢ、１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬに対して、ウシ唾液１５μＬのみを添加したものを、緩衝液にて総量１５０μＬとしたサンプルＣ、および１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬのみを緩衝液で総量１５０μＬとしたサンプルＤについても、それぞれ５０℃の条件下で２４時間インキュベーションを行った。

インキュベーション後、ソモギ・ネルソン法を用いて還元糖濃度を算出した結果を図２に示す。

本実施例においては、図２に示すように、本発明のグルコース製造方法を用いたサンプルＡについては０．３２ｍｇ／ｍＬ、セルロース原料Ｃにセルラーゼのみを添加したサンプルＢについては０．０６ｍｇ／ｍＬ、セルロース原料Ｃにウシ唾液のみを添加したサンプルＣについては０．０２ｍｇ／ｍＬ、セルロース原料ＣのみのサンプルＤについては０．０２ｍｇ／ｍＬの還元糖が検出された。なお、図２に示す値は、３つのサンプルの平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。

この結果から、本発明のグルコース製造方法を用いたサンプルＡは、セルロース原料Ｃにセルラーゼのみを添加したサンプルＢと比較して、約５倍の還元糖が検出されており、ウシ唾液を添加することでセルラーゼの酵素活性が飛躍的に向上することは明らかである。また、セルロース原料Ｃにウシ唾液のみを添加したサンプルＣおよびセルロース原料のみのサンプルＤは、同等の還元糖が検出されたことから、ウシ唾液のみではセルロース原料Ｃをグルコースへ分解していないことが分かる。

上記の実施例１から、本発明のグルコース製造方法を用いることによって、グルコース原料からのグルコースの収集率を約５倍に向上させることが可能であり、その結果、市場への安価でのグルコースの提供を実現することができる。

＜実施例２＞
実施例２においては、生物唾液由来の活性助剤としてウシ唾液から有機化合物を抽出した活性助剤溶液を用いてグルコースの生成を行った。

ここで、ウシ唾液からの有機化合物の抽出方法について説明する。

まず、ウシ唾液１０ｍｌに対し１０分間煮沸処理を施して、唾液中のタンパク質成分を熱変性させたものを固相抽出カラム（ＯａｓｉｓＨＬＢ１２ｃｃ（５００ｍｇ）ＬＰ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に吸着させる。そして、固相抽出カラムに１００％メタノール水溶液を添加し、有機化合物を含有する溶液を抽出するとともに窒素気流によって蒸発乾固させて固形物を得る。得られた固形物を１ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝液で溶解させて、助剤溶液を調製する。当該助剤溶液２００μＬを溶出溶媒としてメタノール水溶液を用いて、時間経過とともにメタノール濃度を０〜１００％まで増加させて高速液体クロマトグラフィー法により精製し、５分毎に４０分間フラクションを分取して、極性の異なる有機化合物を含む活性助剤溶液を計８種類得る。

ウシ唾液から精製した計８種類の活性助剤溶液を用いて、実施例１にて詳述した本発明のグルコース製造方法により、ウシ唾液の代わりに活性助剤溶液を用いてグルコースの生成を行った。なお、本実施例においては、サンプル１はメタノール濃度約５％、サンプル２はメタノール濃度約２１％、サンプル３はメタノール濃度約３７％、サンプル４はメタノール濃度約５３％、サンプル５はメタノール濃度約６８％、サンプル６はメタノール濃度約８４％、サンプル７はメタノール濃度約１００％、サンプル８はメタノール濃度１００％（水０％）の場合において分取した活性助剤溶液である。また、グルコース原料およびセルロース分解酵素についても、実施例１に記載のものを用いた。

サンプル１乃至サンプル８を用いてグルコースの生成を行った結果および比較として、実施例１におけるサンプルＢの手順で作成したサンプル９におけるグルコースの生成結果を図３に示す。

本実施例においては、図３に示すように、メタノール濃度約５％のサンプル１については０．０５ｍｇ／ｍＬ、メタノール濃度約２１％のサンプル２については０．０６ｍｇ／ｍＬ、メタノール濃度約３７％のサンプル３については０．０４ｍｇ／ｍＬ、メタノール濃度約５３％のサンプル４については０．０５ｍｇ／ｍＬ、メタノール濃度約６８％のサンプル５については０．０７ｍｇ／ｍＬ、メタノール濃度約８４％のサンプル６については０．２８ｍｇ／ｍＬ、メタノール濃度約１００％のサンプル７については０．３１ｍｇ／ｍＬ、メタノール濃度１００％（水０％）のサンプル８については０．０９ｍｇ／ｍＬ、セルロース原料にセルラーゼのみを添加したサンプル９については０．０３ｍｇ／ｍＬの還元糖が検出された。なお、図３に示す値は、３つのサンプルの平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。

特に、メタノール濃度約８４％のサンプル６およびメタノール濃度約１００％のサンプル７は、極めて高い還元糖濃度を示しており、この結果から、メタノール濃度８４％以上で溶出した有機化合物を含む活性助剤溶液が酵素活性を促進することは明らかである。

＜実施例３＞
実施例３においては、生物の唾液としてロバの唾液を用いてグルコースの生成を行った。なお、比較として、同じ条件にてウシの唾液を用いたグルコースの生成も行った。

セルロース原料およびセルロース分解酵素は、実施例１に記載のものを用いた。なお、本実施例においては、５０ｍＭの緩衝液１ｍＬ中当たりに５００μｇのセルラーゼを懸濁し、さらに当該緩衝液で１０倍に希釈した５０μｇ／ｍＬ酵素溶液として用いている。

各サンプルの詳細は、１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬに対して５０μｇ／ｍＬ酵素溶液１５μＬおよびウシ唾液１５μＬを添加したサンプルａ１、１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬに対してウシ唾液１５μＬのみを添加し、緩衝液にて総量１５０μＬとしたサンプルａ２、１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬに対して５０μｇ／ｍＬ酵素溶液１５μＬおよびロバ唾液１５μＬを添加したサンプルｂ１、１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬに対してロバ唾液１５μＬのみを添加し、緩衝液にて総量１５０μＬとしたサンプルｂ２、および１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１２０μＬのみを緩衝液にて総量１５０μＬとしたサンプルｃであり、各サンプルについて、それぞれ５０℃の条件下で２４時間インキュベーションを行い、得られた還元糖の算出結果を図４に示す。

本実施例においては、図４に示すように、本発明のグルコース製造方法を用いた５０μｇ／ｍＬ酵素溶液およびウシ唾液１５μＬを添加したサンプルａ１については０．０９ｍｇ／ｍＬ、ウシ唾液１５μＬのみを添加したサンプルａ２については０．０３ｍｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ酵素溶液およびロバ唾液１５μＬを添加したサンプルｂ１については０．０９ｍｇ／ｍＬ、ロバ唾液１５μＬのみを添加したサンプルｂ２については０．０３ｍｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液のみのサンプルｃについては０．０２ｍｇ／ｍＬの還元糖が検出された。なお、図４に示す値は、３つのサンプルの平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。

この結果から、本発明のグルコース製造方法を用いたサンプルａ１およびサンプルｂ１は、セルロース原料Ｃにセルラーゼのみを添加したサンプルａ２およびサンプルｂ２と比較して、約３倍の還元糖が検出されており、ウシ唾液およびロバ唾液ともにセルラーゼの酵素活性を飛躍的に向上させることが明らかとなった。

＜実施例４＞
実施例４においては、ウシ唾液の濃度とグルコースの収集量の関係を検討するべく、ウシ唾液の原液を１００％とした０〜１０％の濃度のウシ唾液についてグルコースの生成を行った。

セルロース原料およびセルロース分解酵素は、実施例１に記載のものを用いた。ウシ唾液は、それぞれ０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％および１０％となるように前記緩衝液によって原液を希釈して用いた。

本実施例におけるグルコース製造方法は、まず、セルロース原料Ｃとしての１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１６０μＬに対して、１００μｇ／ｍＬ酵素溶液２０μＬおよびウシ唾液２０μＬを添加し、５０℃の条件下で２４時間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、ソモギ・ネルソン法を用いて還元糖濃度を算出した結果を図５に示す。

本実施例においては、図５に示すように、唾液濃度２％まではグルコースの収集量が急激に増加し、唾液濃度２％〜１０％ではほぼ同等のグルコースの収集量となった。

この結果から、ウシ唾液濃度を２％以上とすることにより、同量のセルロース原料からより多くのグルコースを収集することができる。

＜実施例５＞
実施例５においては、インキュベーション時間とグルコースの収集量との関係を検討するべく、インキュベーション時間を０〜７２時間の間で変化させてグルコースの生成を行った。

セルロース原料、セルロース分解酵素およびウシ唾液は、実施例１に記載のものを用いた。そして、比較用のサンプルとして、基質としてのセルロース原料にセルロース分解酵素のみを添加してグルコースの生成を行った。

本実施例におけるグルコース製造方法は、まず、セルロース原料Ｃとしての１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１６０μＬに対して、１００μｇ／ｍＬ酵素溶液２０μＬおよびウシ唾液２０μＬを添加し、５０℃の条件下で０時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間のインキュベーション時間にてそれぞれインキュベーションを行った。インキュベーション後、ソモギ・ネルソン法を用いて還元糖濃度を算出した結果を図６に示す。なお、セルロース原料にセルロース分解酵素のみを添加した場合のサンプルについても同様に、０時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間のインキュベーション時間にてそれぞれインキュベーションを行い、グルコースの生成を行った。

本実施例においては、図６に示すように、四角印で示す本発明のグルコース製造方法を用いたサンプルについては、インキュベーション時間の増加に伴ってグルコースの収集量が増加した。一方、ひし形印で示すセルロース分解酵素のみを添加したサンプルについては、グルコースの収集量のインキュベーション時間依存性は認められなかった。特に、インキュベーション時間７２時間においては、セルロース分解酵素のみを添加したサンプルに比べて、本発明のグルコース製造方法を用いたサンプルのグルコース収集量は約３０倍となった。

この結果から、本発明のグルコース製造方法においては、セルロース分解酵素に加えて、ウシ唾液を添加するとともにインキュベーション時間を増加させることにより、グルコースの生成量を飛躍的に増加させることが可能であることが分かる。

＜実施例６＞
実施例６においては、水溶性のセルロース原料に対して、本発明のグルコース製造方法を適用した場合のグルコースの生成量を検討するべく、セルロース原料としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、ナカライテクス社製）を用いてグルコースの生成を行った。

セルロース分解酵素およびウシ唾液は、実施例１に記載のものを用いた。そして、比較用のサンプルとして、基質としてのセルロース原料にセルロース分解酵素のみを添加してグルコースの生成を行った。

本実施例におけるグルコース製造方法は、まず、セルロース原料Ｃとしての１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１６０μＬに対して、１００μｇ／ｍＬ酵素溶液２０μＬおよびウシ唾液２０μＬを添加し、５０℃の条件下で３０分間インキュベーションを行った。インキュベーション後、ソモギ・ネルソン法を用いて還元糖濃度を算出した結果を図７に示す。なお、セルロース原料にセルロース分解酵素のみを添加した場合のサンプルについても同様の生成方法にてグルコースの生成を行った。

本実施例においては、図７に示すように、本発明のグルコース製造方法を適用し、ウシ唾液を添加したサンプルについては０．１７ｍｇ／ｍＬ、セルロース分解酵素のみを添加し、ウシ唾液を添加しなかったサンプルについては、０．００７５ｍｇ／ｍＬのグルコースが得られた。

この結果から、水溶性のセルロース原料についても、本発明のグルコース製造方法を適用することにより、グルコースの生成量を増加させることができることは明らかである。

＜実施例７＞
実施例７においては、ウシ唾液の具体的な作用効果について説明する。なお、本発明者等は予備的な実験として、ウシ唾液のセルロース原料の結晶形への影響を検討したところ、ウシ唾液はセルロース原料の結晶形には影響を与えないことが明らかとなった。さらに、ウシ唾液の静的表面張力を測定して、ウシ唾液が界面活性作用を有していることが明らかとなった。

本実施例においては、ウシ唾液が作用する対象を明らかとするべく、ウシ唾液を添加するタイミングが異なるサンプル（イ）〜（ハ）について検討した。まず、サンプル（イ）においては、セルロース原料にウシ唾液を添加し、５０℃の条件下において１時間インキュベーションした後、セルロース分解酵素を添加して５０℃の条件下において２４時間インキュベーションを行いグルコースの生成を行った。サンプル（ロ）においては、セルロース原料にセルロース分解酵素を添加し、５０℃の条件下において１時間インキュベーションした後、ウシ唾液を添加して５０℃の条件下において２４時間インキュベーションを行いグルコースの生成を行った。そして、サンプル（ハ）においては、セルロース分解酵素にウシ唾液を添加し、５０℃の条件下において１時間インキュベーションした後、セルロース原料を添加して５０℃の条件下において２４時間インキュベーションを行いグルコースの生成を行った。なお、本実施例においては、セルロース原料Ｃとしての１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１６０μＬ、１００μｇ／ｍＬ酵素溶液２０μＬおよびウシ唾液２０μＬの分量にてグルコースの生成を行った。インキュベーション後、ソモギ・ネルソン法を用いて還元糖濃度を算出した結果を図８に示す。

本実施例においては、図８に示すように、セルロース原料にウシ唾液を添加した後セルロース分解酵素を添加したサンプル（イ）については０．２４ｍｇ／ｍＬ、セルロース原料にセルロース分解酵素を添加した後ウシ唾液を添加したサンプル（ロ）については０．０６７ｍｇ／ｍＬ、セルロース分解酵素にウシ唾液を添加した後セルロース原料を添加したサンプル（ハ）については０．０００７１ｍｇ／ｍＬのグルコースが得られた。

この結果から、ウシ唾液は、セルロース原料の結晶形には影響を与えないものの、サンプル（イ）のグルコース収集量が最も多かったことから、セルロース原料の表面に吸着して、その後工程にて添加されたセルロース分解酵素のセルロース原料への働きを向上させていることが分かる。従って、本発明のグルコース製造方法においては、セルロース原料にウシ唾液を添加してセルロース原料の表面にウシ唾液を吸着させる工程を経たのち、セルロース分解酵素を添加してセルロースを分解してグルコースを生成する工程とした製造方法とすることが好ましいことが明らかである。

＜実施例８＞
実施例８においては、生物唾液由来の活性助剤の特性をより詳細に検討するべく、ウシ唾液の変性および分子量分画を行ったものを活性助剤溶液として用いグルコースの生成を行った。

本実施例においては、まず、ウシ唾液中における活性を有する酵素を変性させて不活性化させるために、ウシ唾液５ｍＬに９９．５％濃度のエタノール１５ｍＬを添加した後、２０分間、１５０００ ｒｐｍ、４℃の条件下にて高速遠心分離を行い、得られた上清液についてエバポレーターを用いて溶媒除去を行ったものにミリポア社製の超純水装置を用いて作製した超純水５ｍＬを添加してエタノール変性活性助剤溶液（サンプルＡ）を得た。

また、ウシ唾液の分子量分画を行うために、分画分子量カット値が１００Ｋの限外ろ過膜を用いた遠心式フィルター（ＵＦＣ９１００２４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて２ｍＬのサンプルＡについて３０００ ｒｐｍ、４℃の条件下にて１５分間高速遠心分離を行って分子量分画を行い、分子量１００Ｋ以下の活性助剤溶液（サンプルＢ）を得た。

同様に、分画分子量カット値が３０Ｋの限外ろ過膜を用いた遠心式フィルター（ＵＦＣ９０３００８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて２ｍＬのサンプルＢについて３０００ ｒｐｍ、４℃の条件下にて１５分間高速遠心分離を行って分子量分画を行い、分子量３０Ｋ以下の活性助剤溶液（サンプルＣ）を得た。さらに、分画分子量カット値が３Ｋの限外ろ過膜を用いた遠心式フィルター（ＵＦＣ９００３０８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて２ｍＬのサンプルＣについて３０００ ｒｐｍ、４℃の条件下にて１５分間高速遠心分離を行って分子量分画を行い、分子量３Ｋ以下の活性助剤溶液（サンプルＤ）を得た。

本実施例におけるグルコースの製造方法は、まず、セルロース原料Ｃとしての１０μｇ／ｍＬ基質懸濁液１６０μＬに対して、セルロース分解酵素としての１００μｇ／ｍＬ酵素溶液２０μＬおよびサンプルＡとしてのエタノール変性活性助剤溶液２０μＬを添加し、５０℃の条件下で２４時間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、ソモギ・ネルソン方を用いて還元糖濃度を算出した。なお、セルロース原料Ｃおよびセルロース分解酵素は、実施例１に記載のものを用いた。

同様に、サンプルＡをそれぞれサンプルＢ〜Ｄに変更し、得られた結果を図９に示す。なお、図９においては、各サンプルＡ〜Ｄの効果を検討するべく、未処理のウシ唾液を用いて同様にグルコースの生成を行って還元糖濃度を算出した結果を「ウシ唾液」として示し、ウシ唾液を用いずにグルコースの生成を行って還元糖濃度を算出した結果を「ウシ唾液なし」として示す。

本実施例においては、図９に示すように、未処理ウシ唾液を用いたものについては０．２６ｍｇ／ｍＬ、エタノール変性活性助剤としてのサンプルＡを用いたものについては０．２７ｍｇ／ｍＬ、分子量１００Ｋ以下の活性助剤溶液としてのサンプルＢを用いたものについては０．２５ｍｇ／ｍＬ、分子量３０Ｋ以下の活性助剤溶液としてのサンプルＣを用いたものについては０．０８ｍｇ／ｍＬ、分子量３Ｋ以下の活性助剤溶液としてのサンプルＤを用いたものについては０．０１ｍｇ／ｍＬ、そして、ウシ唾液なしのものについては０．０２ｍｇ／ｍＬの還元糖が検出された。なお、図９に示す値は、３つの試料の平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。

この結果から、エタノール変性活性助剤溶液としてのサンプルＡを用いた場合の還元糖濃度が、未処理ウシ唾液を用いた場合の還元糖濃度と比較してほぼ同等の値を示していることから、ウシ唾液に含まれる活性を有する酵素は、セルロース分解酵素の酵素活性を促進させる原因物質ではないことが分かる。また、分子量３Ｋ以下の活性助剤溶液としてのサンプルＤを用いた場合の還元糖濃度が、ウシ唾液なしの場合の還元糖濃度と比較して低下していることから、ウシ唾液に含まれる分子量３Ｋ以下の有機高分子についてもセルロース分解酵素の酵素活性を促進させる原因物質ではないことが分かる。以上の結果から、ウシ唾液に由来する活性助剤は、変性したタンパク質を含む分子量３Ｋ以上の有機高分子であることが明らかとなった。

＜実施例９＞
実施例９においては、生物唾液由来の活性助剤の成分を特定するべく、ウシ唾液に対してゲル濾過クロマトグラフィーによる分子サイズ分画を行ったものを活性助剤溶液として用いグルコースの生成を行った。

本実施例においては、４ｍＬのウシ唾液に対して液体クロマトグラフィー装置（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて分子サイズ分画を行った。クロマトグラフィー条件は、下記の通りである。
試料：ウシ唾液
試料注入量：４ｍＬ
カラム：ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）
溶離液：１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
溶出液分取：５ｍＬ×２４本（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．１〜２４）
なお、以降、分取した２４本の溶出液は、それぞれＦｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．１〜２４と称する。

次に、得られたＦｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．１〜２４の溶出液について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％ゲル）を行った後、ＳｉｌｖｅｒＳｔａｉｎＫＡＮＴＯＩＩＩ（関東化学株式会社製）を用いてタンパク質に銀染色を施した結果を図１０に示す。

図１０に示すように、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．１〜２４の溶出液うち、Ｎｏ．９〜２０の溶出液についてタンパク質の存在が認められた。

そして、Ｎｏ．９およびＮｏ．２０の溶出液を除くＮｏ．１０〜Ｎｏ．１９の溶出液について、順当に２つずつ各２ｍＬ分取してサンプルＡ〜Ｅとするとともに、Ｎｏ．１０〜Ｎｏ．１９の溶出液を各０．４ｍＬずつ分取して混合したものをサンプルＭｉｘとし、分画分子量カット値が３Ｋの限外ろ過膜を用いた遠心式フィルター（ＵＦＣ９００３０８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮を行い溶出濃縮液を得た。

得られたサンプルＡ〜ＥおよびＭｉｘの溶出濃縮液さらに唾液原液のタンパク質濃度を測定したところ、各サンプルのタンパク質濃度は、サンプルＡが２０１．８μｇ／ｍＬ、サンプルＢが１７４．５μｇ／ｍＬ、サンプルＣが１０８．６μｇ／ｍＬ、サンプルＤが７９５．７μｇ／ｍＬ、サンプルＥが２７６．９μｇ／ｍＬ、サンプルＭｉｘが３６６．２μｇ／ｍＬ、唾液原液が１２１４．２μｇ／ｍＬであった。これらの各サンプルの溶出濃縮液および唾液原液を超純水にてタンパク質濃度４０μｇ／ｍＬとなるように調製した溶出希釈液および唾液溶液を用いてセルロース分解酵素の活性測定試験を行った。

セルロース分解酵素の活性促進試験は、下記の条件にて行った。
基質：２ｗｔ％基質／１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．０）
セルロース分解酵素：１００μｇ／ｍＬのＣｅｌｌｕｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ Ｖｉｒｉｄｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｈ社製）
唾液溶液：４０μｇ／ｍＬ
溶出希釈液：タンパク質濃度４０μｇ／ｍＬのサンプルＡ〜ＥおよびサンプルＭｉｘ

基質８０μＬ（最終基質濃度０．８ｗｔ％）、唾液溶液または溶出希釈液１００μＬ（最終タンパク質濃度２０μｇ／ｍＬ）およびセルロース分解酵素２０μＬ（最終酵素濃度１０μｇ／ｍＬ）を１．５ｍＬのプラスチックチューブに取り、５０℃の条件下において２４時間インキュベーションを行った後、１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた上清液について、ラボアッセイグルコースキット（Ｗａｋｏ社製）を用いてグルコース濃度の定量を行い、得られた結果を図１１に示す。

図１１に示すように、サンプルＡ〜ＥおよびサンプルＭｉｘの溶出希釈液および唾液溶液を用いてグルコースの生成を行ったものは、酵素のみを用いてグルコースの生成を行ったものと比較して高いグルコース濃度を示しており、各溶出希釈液および唾液を添加することによってセルロース分解酵素の活性が促進されることが確認された。このことから、セルロース分解酵素の酵素活性を促進させる生物唾液由来の活性助剤は、タンパク質であることが明らかとなった。また、各溶出希釈液において得られたグルコース濃度には大きな差が認められないことから、当該生物唾液に含まれるタンパク質であればその種類は問わず、活性促進効果が得られることが明らかとなった。

上記説明から、本発明のグルコース製造方法は、セルロース原料Ｃを酵素分解することによりグルコースを生成する方法に係り、セルロース分解酵素に加えて、生物の唾液または生物唾液由来の活性助剤を添加して酵素分解を行うことにより、飛躍的にグルコースの収集量を向上させることを可能とする。また、その結果、製造されたグルコースを市場に安価で提供することを可能とする。

本発明のグルコース製造方法は、上記の実施形態に限定されるものではなく、発明の特徴を損なわない範囲において種々の変更、例えば、セルロース分解酵素と、反芻動物の唾液と、生物唾液由来の活性助剤とを全て混合したものを用いてセルロースを酵素分解するようにしてもよく、唾液と生物唾液由来の活性助剤とを組み合わせることにより、セルロース分解酵素の活性をさらに向上させることができる。

Ｓ１ 粉砕工程
Ｓ２ 酵素分解工程
Ｓ３ グルコース精製工程
Ｃ セルロース原料

Claims (3)

1. セルロースを、セルロース分解酵素と、反芻を行う動物またはロバの唾液または３ｋＤ以上のタンパク質含有画分からなる生物唾液由来の活性助剤との混合物を用いて分解することを特徴とするグルコース製造方法。
2. 前記生物唾液由来の活性助剤が、反芻を行う動物の唾液から抽出されてなることを特徴とする請求項１に記載のグルコース製造方法。
3. 前記反芻を行う動物の唾液が、ウシ、ラクダ、ヒツジ、ヤギの唾液であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のグルコース製造方法。