JP6445971B2 - ヒト羊水由来細胞からの機能的かつ耐久性のある内皮細胞の生成 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2012年５月３０日に出願された米国仮出願第61/653,185号及び2012年１０月４日に出願された米国仮出願第61/709,431号（これら両方の内容全体が参照により本明細書に加入される）に基づく優先権の利益を主張する。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立心肺血液研究所（National Heart Lung and Blood Institute）に認められたR01HL097797の下での政府支援を受けて為されたものであった。政府は本発明に特定の権利を有する。

開示の分野
本発明は、機能的かつ耐久性のある内皮細胞を生成するための方法に関する。特に、本発明は、TGFβシグナル伝達経路の抑制と併せたETS-TFの強制発現により羊水細胞（AC）を再プログラムすることにより、ACから相当量の信頼できる内皮細胞を生成することに関する。

容易に入手可能な非血管性細胞源からのヒト内皮細胞(EC)の生成及び増殖は、虚血及び損傷した器官の血管再生に関して高い治療的可能性を有する。しかし、それらの血管新生の特徴を維持しながら、安定なECを臨床関連スケールまで培養し増殖させることは達成されていない。ヒト成体由来のECは、限られた増殖可能性を有し、数回の継代後に老化する。同様に、ヒト胚性幹細胞(hESC)由来EC及び誘導多能性幹細胞(iPSC)は、限られた増殖能を有し、そして表現型的に不安定であり、しばしば連続継代すると他の非血管性系統にドリフトする（drifting into）(非特許文献１)。内皮前駆細胞(EPC)から誘導されたヒトEC(非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５)及びそれらの後代である内皮コロニー形成細胞(ECFC)は、プールされた血小板濃縮血漿(非特許文献８)中で増殖された場合に顕著な増殖能を示した(非特許文献６；非特許文献７)。しかし、EPC及びECFCがそれらの血管安定性を維持してこれらの細胞の臨床スケールまでの増殖を可能にし得るかどうかは以前として未知のままである。成体及びhESCベースのストラテジーの欠点は、転写因子及び微小環境の合図（cues）、さらにはECアイデンティティの確立及び維持のために必要な培養条件の不十分な認識に起因するようである。

ETV2(非特許文献９；非特許文献１０)、FLI1(非特許文献１１)、及びERG(非特許文献１２)を含む転写因子(TF)のE-twenty six(ETS)ファミリーのいくつかのメンバーは、血管発生及び血管新生の調節に関与していた(非特許文献１３；非特許文献１４)。これらのTFは、ECの発生及び機能に関連する遺伝子の発現を直接的に調節する。成体ECは、FLI1、ERG(アイソフォーム1及び2)、ETS1、ETS2、Elf1、Elk1、VEZF及びETV6のようないくつかのETS因子を恒常的に発現するが、ETV2は胚発生の間に一過性に発現され、成体ECには存在しない(非特許文献１５；非特許文献１６)。これらのTFの多くは血管特異化において重要な役割を果たすが(非特許文献１７；非特許文献１８)、これらのEC特異的TFが非血管細胞において内皮遺伝子を作動させることもできるか否かは知られていない。

ヒト羊水由来細胞(AC)は、信頼できるECへの再プログラムを受けやすい非血管細胞の可能性のある供給源を代表する。広範な遺伝的及び民族的背景を有する個体から入手した新たに単離したACを、診断目的のために妊娠中期のヒト胎仔の羊水から通常通り培養した。これらは高い増殖能を有し得、HLA型であり得、凍結保存され得、そして臨床用途のため
に公開でバンクに保存される（banked）。ACは様々な細胞型を生じ得、これらとしては、上皮細胞、間葉細胞及び神経細胞が挙げられる(非特許文献１９；非特許文献２０)。AC集団の0.2〜2％を構成するc-Kit⁺(CD117⁺)ACの稀なサブセットは、上皮細胞、間葉細胞及び神経細胞を含む様々な細胞型を生じ得る多分化能羊水幹細胞(AFS)を代表する(非特許文献２１；非特許文献１９)。これらのc-Kit⁺細胞のいくつかは多能性Oct-4遺伝子を発現すると考えられているが(非特許文献１９；非特許文献２２)、これらの細胞が本当に多能性（pluripotent）であるか、又は一次的に多能性（multipotent）の細胞であるかは不明である。実際に、ACの大部分は系列特異的（lineage-committed）細胞であると考えられている。系列特異的ACの３つのサブクラスが同定されている：類上皮(E型)、羊水(AF型)及び線維芽細胞(F型)(非特許文献２３)。E型ACは胎仔皮膚が起源であると推測されるが、F型細胞は結合組織由来である(非特許文献２４)。

ACが血管細胞を生じ得るか否かが研究の対象とされてきた。ナイーブヒトAC又は予め選択されたc-Kit⁺ ACの血管新生培養条件でのインキュベーションは、少数のEC特異的マーカー（VE-カドヘリン、VEGFR2及びCD31を含む）を発現するEC様細胞の発生及び成長をもたらし、そして細管様構造へと再構築し得る(非特許文献２５；非特許文献１９；非特許文献２６；非特許文献２７)。しかし、これらのEC様細胞は低い増殖能を有し、成熟EC遺伝子の完全レパートリーを発現しないし、それらの元のAC特徴が消えることは実証されていない。そのため、これらの細胞を信頼できる血管内皮細胞として考えることはできない。

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開示の要旨
本発明に従って、羊水細胞(AC)におけるTGFβシグナル伝達経路の抑制と併せたETS-TFの強制発現が、インビボで灌流する脈管構造を形成して肝臓類洞内皮へ生着する能力を有するrAC-VEC(「血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞」)と呼ばれる安定な血管ECの増殖性集団にACを再プログラムするということが見出された。従って、本発明は、羊水細胞から相当量の内皮細胞を再現性良く生成するための方法を提供する。本発明の方法論に従って生成された内皮細胞、さらにはこれらの細胞を利用する治療方法もまた提供される。

一局面において、本発明は、転写因子ETV2、FLI1及びERG(例えばERG1又はERG2)がTGFβシグナル伝達阻害剤の存在下で羊水細胞において発現される条件下でACを培養することにより、ACから内皮細胞を生成する方法に関する。

一実施態様において、ACは、羊水細胞におけるETV2の発現が一過性であり、そしてFLI及びERGの発現が恒常的である条件下で培養される。転写因子の発現は、転写因子ETV2、FLI1及びERGをコードする核酸を有するベクターを用いた細胞の形質導入に基づいて、これら転写因子をコードするネイキッドDNA若しくはmRNAのACの送達に基づいて、又はこれら転写因子のポリペプチド形態のACへの送達に基づいて達成され得る。

いくつかの実施態様において、TGFβシグナル伝達阻害剤は、I型TGFβ受容体に特異的な阻害剤であり、これはI型TGFβ受容体の可溶性形態を含むポリペプチド、I型TGFβ受容体若しくはリガンドに特異的な抗体、又は小分子化合物であり得る。

特定の実施態様において、ACは、最初の20〜21日間TGFβシグナル伝達阻害剤の存在下で、最初の13〜15日間に羊水細胞においてETV2の一過性発現、並びに２１日間のFLI1及びERGの恒常的発現を伴って培養される。

別の局面において、本発明は、羊水細胞由来ECの実質的に純粋な集団に関し、ここで該ECは、表面マーカーVE-カドヘリン、CD31及びVEGFR2の発現を特徴とする。一実施態様において、羊水細胞由来ECの実質的に純粋な集団は、ECにおけるFLI1をコードする外因的に導入された核酸の存在を特徴とする。

さらなる局面において、本発明は、本明細書における生成されたECの実質的に純粋な集団及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を混合することにより製剤化される組成物を提供する。

さらなる局面において、本発明は、本明細書で生成されたECの実質的に純粋な集団を含有する組成物を被験体に投与して損傷組織における血管新生を促進することにより、被験体における該損傷組織を修復するための方法を提供する。

なお別の局面において、本発明は、本明細書において生成されたECの実質的に純粋な集団を含有する組成物を被験体に投与することにより被験体において腫瘍を処置するための方法を提供し、ここでECは抗腫瘍剤を送達するように操作されており、かつ投与されると、該ＥＣは該腫瘍中に血管を形成する。

ETS-TF及びTGFβ阻害を用いて形質導入された羊水由来細胞(AC)は、安定な血管表現型を示し、かつヒト胚性幹細胞(hESC)由来の内皮細胞(EC)よりも高い増殖能を有する。a) 血管内皮細胞(rAC-VEC)再プログラムプラットフォームの概略図。ETS転写因子(ETS-TF)形質導入羊水細胞(AC)をTGFβ阻害(SB431542 - 5μM)の存在下で培養し、そして週に一度の間隔でECマーカーの発現についてアッセイした。b) ECマーカー(VE-カドヘリン、CD31、及びVEGFR2)のmRNAレベルを、TGFβ阻害の存在下にてETV2、ERG1、及びFLI1をコードするレンチウイルスを用いて又は用いずに形質導入されたACにおいて数週間にわたって測定した。[「+」＝ETV2、ERG1、及びFLI1レンチウイルスで形質導入された細胞；「-」＝等用量の空ベクターレンチウイルスで形質導入された細胞。この報告における全ての以後の対照(「ctrl」)サンプルは、別に示されていなければ空ベクターウイルスを用いて形質導入された]。エラーバー：三つ組の標準誤差(VE-カドヘリン、VEGFR2、及びCD31： 7日目〜28日目の間の対照ACと比較して^*p＜.01)。c) ETS-TF(ETV2、FLI1及び／又はERG1)を用いた（又は用いない）TGFβ阻害の存在下でのACのレンチウイルス形質導入後３週間にわたって細胞増殖を測定した(n＝3、全ての条件についてp＜0.05)。d) ETS-TF(ETV2/FLI1/ERG1)を用いた（又は用いない）TGFβ阻害の存在下でのACのレンチウイルス形質導入後７週間にわたって細胞増殖を測定した(n＝4の独立した実験)。７週目に行われた蛍光活性化細胞分類(FACS)は、これらの細胞の９５％超がVE-カドヘリンを発現することを明らかにする。e) ETV2/FLI1/ERG1因子(ETS-TF)を用いた（又は用いない）TGFβ阻害の存在下でのAC及びhESC由来VE-カドヘリン⁺CD31⁺VEGFR2⁺ECのレンチウイルス形質導入後３週間にわたって細胞増殖を測定した。エラーバー：三つ組の標準誤差(n＝3、p＜0.05)。f) FACSは、ETS-TFによるレンチウイルス形質導入後の７日間隔でのVE-カドヘリンの表面発現を明らかにする。エラーバー：三つ組の標準誤差。g) VE-カドヘリン及び平滑筋αアクチンに対する抗体で染色した免疫系項顕微鏡写真を、TGFβ阻害の存在下で２１日ETS-TFで形質導入されたAC(rAC-VEC)及びETS-TFで形質導入されたhESC由来VE-カドヘリン⁺CD31⁺VEGFR2⁺ECについて示す。ヒト臍血管内皮細胞(HUVEC)及び平滑筋細胞は対照として役立つ。VE-カドヘリン(緑色染色)、平滑筋αアクチン(赤色染色)、DAPI(青色染色)、白色矢印はVE-カドヘリンの接合部染色を示す。スケールバー - 25μm。 図１−１の続き。 図１−２の続き。 図１−３の続き。 系列特異的Tra1-81⁻c-Kit⁻成熟類上皮及び間葉/線維芽ACの大部分は、rAC-VECへと再プログラム可能である。a)ヒトESC(hESC) (i.)、HUVEC(ii.)、及び４つの独立したACサンプル(AC1〜AC4) (iii.〜vi.)をOCT4タンパク質について染色した(ピンク)。スケールバー - 100μm。b) OCT4 mRNA(上のグラフ)及びSOX2 mRNA(下のグラフ)の相対レベルを、hESC、HUVEC、及び３つの独立したACサンプル(AC1、AC5、AC6)で測定した。hESCのデータについては、赤色のバーはグラフの左側のy軸スケールを表す。AC及びHUVECデータについては、青色のバーはグラフの右側のy軸スケールを表す。エラーバー：三つ組の標準誤差(OCT4及びSOX2：ACと、及びHUVECと比較して^*p＜.002)。c)ACのFACSは、AC集団中の系列特異的細胞型及び非特異的（uncommitted）細胞型の両方の存在を示す。１つの代表的な細胞株を示す(i.〜iv.)。試験した特定のマーカーを「x」及び「y」軸に示し、対応するレベルを総細胞集団のパーセンテージとして記載する。表(右パネル)は、１５の独立したACサンプルにわたって指定されたマーカーを発現する細胞のパーセンテージの平均値を示す(SE：標準誤差)。 d)(上のグラフ)TGFβ阻害の存在下(SB431542)でETS-TF(ETV2/FLI1/ERG1)を用いたEpCAM⁺Tra1-81⁻c-Kit⁻及びEpCAM⁻Tra1-81⁻c-Kit⁻ACのレンチウイルス形質導入後4週間にわたって細胞増殖を測定した。（下のグラフ) FACSは、ETS-TFを用いて形質導入されたEpCAM⁺Tra1-81⁻c-Kit⁻及びEpCAM⁻Tra1-81⁻c-Kit⁻ ACについてのTGFβ阻害の存在下での２８日間のVE-カドヘリンの表面発現を明らかにする(n＝3、P＜0.05)。 e) TGFβ阻害の存在下で２８日間のETS-TFを用いて形質導入されたEpCAM⁺Tra1-81⁻c-Kit⁻ ACについての免疫蛍光顕微鏡写真を示す。EpCAM(赤い染色)、VE-カドヘリン(緑色染色)、DAPI(青い染色）。スケールバー - 25μm。 図２−１の続き。 図２−２の続き。 図２−３の続き。 ETS-TF形質導入AC(rAC-VEC)はEC特異的遺伝子の発現を活性化し、そしてクローン増殖を受けるrAC-VECは、成熟増殖性rAC-VECの生成についてのETV2、ERG1、及びFLI1の最適な化学量論量を記述する。FACS分析により、TGFβ阻害の存在下(SB431542)、示されたETS-TF(ETV2/FLI1/ERG1)を用いた形質導入の４日後(a：i.〜ii.)、12日後(a：iii.〜iv.)、21日後(a：v.〜vi.)、及び28日後(b：i.〜ii.)の新生のrAC-VECでのVE-カドヘリン(VE-cad)及びVEGFR2の表面発現が明らかとなった。 HUVECをポジティブコントロールとして使用した(b：iii.)。新生rAC-VECの形態(b：iv.〜vi.)及びサイズ(b：vii.〜ix.)はHUVECのようなECの形態及びサイズに近かった。スケールバー - 50μm。 c)単細胞クローン増殖プロトコルの概略図： TGFβ阻害の存在下でETS-TFを用いてACを形質導入し、そして３週間培養した。21日目に、VE-カドヘリン⁺VEGFR2⁺CD31⁺細胞をVE-カドヘリン、VEGFR2、及びCD31に対するモノクローナル抗体(mAb)を用いて単離した。VE-カドヘリン⁺VEGFR2⁺CD31⁺細胞の自動化単細胞プレーティングを、数週間のクローン増殖のために96-ウェルフォーマットに行った。個々のプレーティングされた細胞のうち平均で20〜25％がコロニーを形成した。 d)VE-カドヘリン⁺VEGFR2⁺CD31⁺単離後の３週間(21日〜42日)にわたるクローン単細胞増殖の代表例。スケールバー - 100μm。 e) 特定のrAC-VECクローン-1、クローン-2、及びクローン-3(枠ii.〜iv.)のFACS分析は、クローン増殖プロトコルの４２日目(すなわち、VE-カドヘリン⁺VEGFR2⁺CD31⁺単離の３週後)のVE-カドヘリン(VE-cad)、VEGFR2及びCD31の表面発現を明らかにした。rAC-VECクローンの細胞増殖を、その後５週にわたって単細胞プレーティング(クローン増殖プロトコルの「21日目」)の時間から測定した(枠v.)。クローン増殖プロトコルの４２日目のrAC-VECクローンのETS-TF(ETV2、FLI1、及びERG1)の発現レベルを示す(枠vi.〜viii.)。 ETS-TF形質導入は、成熟ECのトランスクリプトームに対応する遺伝子発現の大域的変化を示すが、その元のACアイデンティティの抹消を同時に示す再プログラムされたACを生じる。 a)対照(ctrl)AC、クローンrAC-VEC(クローン-3 - 42日)及びHUVECについての免疫蛍光顕微鏡写真を示す。VE-カドヘリン(緑色染色：i.、vi.、xi.)、CD31(赤色染色：ii.、vii.、xii.)、ESAM(赤色染色：iii.、viii.、xiii.)、JAM-A(赤色染色：iv.、ix.、xiv.)、EpCAM(赤色染色：v.、x.、xv.)、DAPI(青色染色)。スケールバー - 50μm。 b)RNA配列解析（RNA-seq）を、ETS-TFを用いて約２ヶ月間TGFβ阻害(SB431542)の存在下で形質導入されたAC(「rAC-VEC」)に対して行った。さらに、TGFβ阻害の存在下で約２ヶ月培養された２つのrAC-VECクローン(「rAC-VECクローン-3」及び「rAC-VECクローン-4」)にRNA配列解析を行った。rAC-VECクローン-4は、rAC-VECクローン-3と類似したETS-TF発現プロフィールを有する(データは示していない)。これらのrAC-VECサンプルを、ヒト臍帯血由来CD34⁺細胞(「CD34⁺」)、ヒト骨髄間質細胞(「BMS」)、ナイーブヒトAC(「Amni ctrl」)、ヒト肺小気道上皮細胞、HUVEC(「HUVEC」)及びLSEC(「LSEC」)と比較した。相対的転写レベルのヒートマップを示し、これは1)rAC-VECにおいて作動された血管発現遺伝子、2)rAC-VECにおいて発現停止された非血管発現遺伝子、及び3)前述の細胞型と比較した、rAC-VECにおけるTGFβファミリー遺伝子の発現パターンを示す。 c)三次元MDSプロット(3D MDS)：この解析のために、本発明者らは、本明細書に示されるサンプルのトランスクリプトーム全体のRNA配列解析プロフィール間の全ての対合距離を計算した。距離は、１から２つのプロフィール間のピアソン相関を引いたものとして定義された。次いで本発明者らは、点間の距離がサンプル間の真の距離にほぼ等しくなるように３D空間における点集合を同定するために多次元尺度構成法(MDS)を使用した。この解析は、rAC-VEC(クローン及び非クローン誘導)のHUVEC及びLSECとの緊密な共局在化を示し、従ってそれらのゲノム全般での発現プロフィールが高度に類似しているということを示す。他方で、BMS、上皮細胞、及びCD34⁺造血細胞のような他の非血管細胞型はより遠くに位置し、そしてrAC-VECとの類似性は示さない。この図面において調べられた異なるサンプル間の３Dの関係をよりよく捉えるために、２つの異なる画角を同じ3D-MDS解析について示した。重要な事には、この解析はいずれの遺伝子セット又はプロセスに対してもバイアスをかけられていなかった：その発現がRNA配列解析により定量された全て＞30,000 RefSeqの転写物を使用してサンプル間の距離を計算した。 TGFβ阻害は、ETV2/FLI1/ERG1形質転換ACにおいてVEGFR2を上方調節し、そしてVEGFR2に機能性を付与する。 a) TGFβリガンド中和モノクローナル抗体(β1、β2、及びβ3に対して特異的なTGFβリガンドmAb)、又はTGFβ小分子阻害剤(SB431542)を用いて又は用いずに処理された、２１日間ETV2/FLI1/ERG1を用いて又は用いずに形質導入されたACのウェスタンブロット分析。この実験は、TGFβ受容体活性の程度を説明するために、組換えTGFβリガンド(TGFβ1及びTGFβ3)の存在下及び不在下で行われた。ETV2/FLI1/ERG1での形質導入後、ACを、TGFβリガンド(10ng/ml)と共に及びTGFβリガンド無しで、２日ごとに(「一定」)、TGFβリガンドmAb(10μg/ml)又はTGFβ小分子阻害剤の存在下及び不在下でインキュベートした。さらに、21日目にETV2/FLI1/ERG1形質導入ACを４時間血清不足にし、次いで１用量のTGFβリガンド(10ng/ml)を用いて又は用いずに45分間(「パルス」)TGFβリガンドmAb又はTGFβ小分子阻害剤の存在下又は不在下で処理した。２１日目の処理後に、全ての細胞をリン酸化SMAD2(P-SMAD2)、総SMAD2、及びGAPDHについてアッセイした。 b)上記のように、ETV2/FLI1/ERG1を用いて又は用いずに21日間、「一定」のTGFβリガンド、TGFβリガンドmAb、及び／又はTGFβ小分子阻害剤の存在下又は不在下の両方で形質導入されたACのウェスタンブロット分析。さらに、21日目にETV2/FLI1/ERG1形質導入ACを４時間血清不足にし、次いでVEGF-Aリガンド(50ng/ml)を用いて又は用いずに５分間処理した。この２１日目の処理に続いて、細胞をリン酸化VEGFR2(P-VEGFR2)、総VEGFR2、及びGAPDHについてアッセイした。 c)対照ACの細胞形態(i.)、ETV2/FLI1/ERG1形質導入AC(ii.〜v.)及びHUVEC(vi.)を、TGFβリガンド、TGFβリガンドmAb、及び／又はTGFβ小分子阻害剤を用いた示された処理について示した。スケールバー- 100μm。 d)ETV2/FLI1/ERG1で21日間持続したTGFβ阻害の存在下（黒色バー）又は不在下（空白／白色バー）で形質導入されたACにおけるVEGFR2の表面発現がFACSにより明らかとなる。 e)ETV2/FLI1/ERG1で28日間形質導入されたACにおけるVEGFR2(左のグラフ)及びVE-カドヘリン(右のグラフ)の表面発現がFACSにより明らかとなる。赤色バー：持続するTGFβ阻害を受けた細胞 - ECマーカーを14日目、21日目及び28日目にアッセイした。白色バー：TGFβ阻害を１４日間受けた細胞 - ECマーカーを２１日目にアッセイした。灰色バー：TGFβ阻害を21日間受けた細胞 - ECマーカーを２８日目にアッセイした。誤差バー：三つ組の標準誤差。 図５−１の続き。 図５−２の続き。 rAC-VECはインビトロ及びインビボで機能的に灌流した血管を樹立する。 a)Matrigel/内皮成長培地 + TGFβ阻害(SB431542)で１２時間培養した対照AC、２１日目rAC-VEC、及びHUVECのインビトロ管形成アッセイ。様々な群の位相差顕微鏡画像を示す。スケールバー - 100μm。 b)対照AC、２１日目rAC-VEC、及びHUVECのインビトロアセチル化LDL(Ac-LDL)取り込みアッセイ。標識したAc-LDL(DiI標識)で細胞を４時間処理し、洗浄し、そして画像化した。スケールバー- 100μm。 c)GFP-標識対照AC(i.、v.、ix.)、GFP-標識42日目rAC-VEC(ii.、vi.、x.)、及び２１日目にTGFβ阻害を除去したGFP-標識42日目rAC-VECのインビボ管形成アッセイ(サンプルA - iii.、vii.、xi.；サンプルB- iv.、viii.、xii.)。対照細胞及びrAC-VECをMatrigelプラグに別々にロードし、そしてNOD-SCIDIL2Rγ^-/-(NSG)マウスに皮下移植した。移植の２週後に、機能性血管を同定するために、灌流脈管構造に結合するAlexa568-イソレクチン-B4をマウスに静脈内注射した。注射の１０分後に、プラグを除去して薄片にした。免疫蛍光顕微鏡画像は、対照AC及びrAC-VECを緑色(GFP)、灌流脈管の生体内標識を赤色(イソレクチン)、そして核対比染色(DAPI)を青色で示す。スケールバー- 50μm。白色矢印は、GFP標識血管及びイソレクチン標識(吻合)血管の共局在化を示す。橙色矢印はイソレクチン標識宿主マウス血管のみを示す。 d及びe)21日rAC-VECs(GFP標識)の２匹のマウスの肝臓洞様血管へのインビボ生着。NSGマウスに対して７０％部分肝切除を行った後、約5X10⁵個のGFP標識21日rAC-VECを脾臓内経路を介して移植し、これは門脈循環に流出し、そして肝臓脈管構造中に取り込まれる。移植の三ヶ月後に、灌流した血管を検出するためにマウスにAlexa568-イソレクチン-B4を注入し、そしてそれぞれの肝臓を取り出して凍結切片にした。免疫蛍光顕微鏡画像は、対照rAC-VECを緑色(GFP)、灌流脈管の生体内標識を赤色(イソレクチン)、ヒトCD31染色をシアン、そして核対比染色(DAPI)を青色で示す。肝臓サンプル#1(d)を低倍率で画像化した(i.〜iv.：スケールバー-50μm)。肝臓サンプル#2(e)を低倍率(i.〜iv.：スケールバー- 50μm)及び高倍率(v.〜viii.：スケールバー-25μm)で画像化した。白色矢印はGFP標識、CD31標識、及びイソレクチン標識(吻合)血管の共局在化を示す。橙色矢印はイソレクチン標識宿主マウス血管のみを示す。 図２−１の続き。 図２−２の続き。 TGFβ阻害を伴う一過性ETV2発現並びに恒常的FLI1及びERG1発現は、血管アイデンティティを失うことなく長続きするrAC-VECを生成する。 a) FACSは、iETV2/FLI1/ERG1で14(i.)、21(ii.〜iii.)、及び28(iv.〜v.)日間TGFβ阻害(SB431542)の存在下で形質導入されたACにおけるVE-カドヘリン及びCD31の表面発現を明らかにする。(「iETV2」：ドキシサイクリンでの処理により抑制される誘導性ETV2レンチウイルス)。これらの細胞のサブセット(iii.及びv.)を、ETV2タンパク質の抑制のために１４日目にドキシサイクリンで処理した。 b)FACSにより測定したVE-カドヘリン⁺CD31⁺細胞のパーセンテージを示す。空白のバー：ドキシサイクリン処理なし。黒色バー：１４日目のドキシサイクリン処理。 c)ドキシサイクリンによるiETV2抑制をウェスタンブロットにより確認した。GAPDHは対照として役立った。 d)iETV2発現が14日目に抑制されたGFP標識42日rAC-VECのインビボ管形成アッセイ。rAC-VECをMatrigelプラグにロードし、そしてNOD-SCIDIL2Rγ^-/-(NSG)マウスに皮下移植した。移植の２週後に、機能性血管を同定するために、還流した脈管構造に結合するAlexa568-イソレクチン-B4をマウスに静脈内注射した。注射の１０分後、プラグを取り出して薄片にした。免疫蛍光顕微鏡画像は、rAC-VECを緑色(GFP)、灌流脈管の生体内標識を赤色(イソレクチン)、ヒトCD31染色をシアン、そし核対比染色(DAPI)を青色で示す。サンプルAを低倍率で画像化した(i.〜iv.：スケールバー-100μm)。サンプルBを高倍率で画像化した(v.〜viii.：スケールバー-50μm)。白色矢印は、GFP標識、CD31標識及びイソレクチン標識(吻合)血管の共局在化を示す。橙色矢印はイソレクチン標識宿主マウス血管のみを示す。 e)ACの豊富な成熟rAC-VECへのモジュラーETS-TF媒介再プログラミング。「理想的な内皮細胞条件」を満たすにもかかわらず、形質導入されていない（untransduced）ACはrAC-VECに再プログラミングせず、増殖もしない(下のパネル)。TGFβの不在下では、ETS-TF形質導入ACはVE-カドヘリン表面発現を示すが、VEGFR2を含む他の不可欠なECマーカーを産生せず、「VEGF-A非反応性」内皮様前駆体の生成をもたらす（下の経路）。TGFβシグナル伝達の約３週間の一過性阻害はVEGFR2を上方調節及び機能化し、VEGF-A依存性シグナル伝達事象を進展させることを可能にする(中央及び上の経路）。ETV2はACの増殖及びEC特異化を促進するが、唯一のETS因子として使用される場合、成熟EC-マーカー（CD31を含む）を活性化せず、未成熟内皮前駆細胞の蓄積をもたらす(中央の経路)。TGFβ阻害と一緒のFLI1/ERG1のETV2との同時発現はCD31発現を作動するが；恒常的なETV2は最終的にこの成熟ECマーカーを下方調節し、不安定な血管内皮の産生をもたらす(上の経路 -下)。１４日目のETV2の抑制の際に、CD31の発現は持続され、成熟rAC-VECの生成を促進する(上の経路 - 上)。従って、恒常的FLI1/ERG1同時発現と一緒のモジュラーTGFβ阻害及びETV2発現は、系列特異的ACを持続性機能的rAC-VECに再プログラムするための新規なプラットフォームをもたらす。 図７−１の続き。 図７−２の続き。 図７−３の続き。

詳細な説明
本発明者らは、羊水細胞(AC)におけるTGFβシグナル伝達経路の抑制と関連するETS-TFの強制発現が、灌流された脈管構造を形成することができかつインビボで肝臓類洞内皮へと生着する能力を有する安定なrAC-VEC(「血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞」）の増殖性集団へとACを再プログラミングすることを実証した。例となる実施態様において、ACにおけるETV2の一過性発現及びTGFβ経路阻害と組み合わせたFLI1/ERG1の恒常的発現は、EC特異的遺伝子の大部分の発現を作動してロックするだけでなく、非血管遺伝子の発現も抑制するということが本明細書において開示される。TGFβシグナル伝達の減弱はVEGFR2シグナル伝達経路の機能化を可能にし、これはECアイデンティティを失うことなく多数のrAC-VECの増殖を生じる。本明細書において生成されたrAC-VECは、ゲノム全体での転写プロフィール解析により示されたように、成体ECに類似した完全血管新生レパートリーを表す。本明細書において生成されたrAC-VECはまた、連続継代の際にそれらの血管アイデンティティを維持することができ、そして免疫無防備状態のマウスにおいて機能的な開存性の持続性血管を樹立することができる。従って、本発明は、羊水細胞から相当量の機能的かつ安定な内皮細胞を再現可能に生成するための方法、生成された内皮細胞、及び生成された内皮細胞の治療上の使用を提供する。

I. 羊水細胞(「AC」)
本明細書で使用される用語「羊水細胞（amniotic cells）」(又は「AC」)は羊水から抽出された細胞であり、それ故、本明細書では「羊水細胞（amniotic fluid cells）」とも呼ばれる。

ACは好ましくはヒト羊水から単離されるが、他の哺乳動物種の羊水からも単離され得る。羊水を採取するための使用に適した哺乳動物種の例としては、限定されないが、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ゾウ、畜牛、ウマ、ブタ、マウス、ウサギなどである。所定の種のACから発達された内皮細胞は、同じ種の被験体に治療的に適用され得る。

本発明の目的のために、ACは、妊娠期間の任意の段階の妊娠した雌から採取された羊水から抽出され得る。いくつかの実施態様において、羊水は妊娠中期の間に採取される。特定の実施態様において、羊水は女性の妊娠期間の１０〜２５週の間に採取される。他の実施態様において、羊水は妊娠した女性の二番目の三半期、すなわち14〜26週の間に採取される。特定の実施態様において、羊水は女性の妊娠期間の16〜21週の間に採取される。

ACは、従来の手段、例えば遠心分離により羊水から抽出され得る。細胞ペレットは本明細書に開示される再プログラミングレジメンにおける即時の使用のために適切な媒体中に再懸濁され得るか、又は培地(例えば、本明細書以下で例示される市販の「Amniotic Media」)中に再懸濁されて、再プログラミングの前の一定期間の間培養される。あるいは、抽出されたACは、従来の技術を使用して、将来の使用のために冷凍保存され得る（そして例えば「バンクに保存される（banked）」)。例えば、凍結保存の準備ができたACは、例えば、Accutase(EBioscience #00-4555-56)を使用して培養物(例えば、フラスコ、プレートなど)から回収され得、次いで遠心沈殿され得る。次いで細胞ペレットを凍結保存に適した媒体(例えば、90％FBS(Omega Scientific #FB-11)及び10％DMSO(Cellgro #25-950-COC)からなる媒体）に再懸濁してクライオチューブに移し得る。細胞を-80℃で少なくとも３日保存し(初期凍結)、次いで液体窒素に移し得る(長期凍結)。

ACは典型的には細胞構成要素に関して不均一であり、多能性細胞(例えば、c-Kit⁺AC)及び成熟AC(c-Kit^-AC)の両方を含む。成熟ACは、系列特異的細胞及び系列非特異的細胞の両方を含む。本明細書に開示される再プログラミングアプローチは、複能性細胞及び成熟細胞の両方を含む抽出されたACからrAC-VECを生成する際に有効である。本明細書に開示される再プログラミングアプローチはまた、系列特異的EpCam⁺Tra1-81^-c-Kit^-類上皮及びEpCam^-Tra1-81^-c-Kit^-非類上皮(間葉/線維芽)ACの両方を含む成熟c-Kit^-ACからrAC-VECを生成する際に有効である。換言すると、抽出された不均一ACを直接再プログラムしても、ACのより成熟した分集団を再プログラムしてもよいが、rAC-VECを生成する目的のためにより成熟した分集団を単離するために抽出したACを処理する必要はない。

II. ACのrAC-VECへの再プログラミング
本明細書に開示されるように、ACは安定なrAC-VEC(「血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞」)の増殖性集団に再プログラムされ得る。再プログラミングは、TGFβシグナル伝達経路の抑制と関連したACにおけるETSファミリーからの転写因子(ETS-TF)の強制発現を含む。

II.1 ACにおけるETS-TFの発現
本発明に従って、再プログラミングに関与するETS-TFとしては、ETV2(ER71又はEstrpとしても知られるヒトETV2)、FLI1、及びERGが挙げられる。ERGの特定の有用なアイソフォームとしてはERG1及びERG2が挙げられるが、他のERG3及びERG4のような他のアイソフォームも適切であるかもしれない。これらのETS-TFは当該分野において記載されており(LEE et al., Cell stem cell, 2：497-507 (2008)； SUMANAS et al., Blood, 111：4500-4510 (2008))；LIU et al., Current Bio. 18：1234-1240 (2008)； MCLAUGHLIN et al., Blood, 98：3332-3339 (2001))、そしてそれらの核酸配列及びタンパク質配列もGenBankから入手可能である(ETV2：NCBI受入番号NM_014209.2, GI：153791177； ERG1：受入番号NM_182918.3； GI：209954798； ERG4：受入番号NM_001136155.1；GI：209954807)。

ETV2はECの運命の誘導の中心であるが、一方でERG及びFLIはEC成熟を促進するということが本明細書において開示される。例えば、ETV2は単独で血管マーカーVE-カドヘリン及びVEGFR2の発現を作動し得るが、CD31は作動しない。対照的に、ERG1又はFLI1はCD31発現を活性化し得るが、ETV2によって作動されるいくつかの他の鍵となるECマーカーを活性化できない。

従って、ACの再プログラミングの本発明のアプローチは、ACにおけるETV2、FLI1及びERGの組み合わせの強制発現を含む。いくつかの実施態様において、再プログラミングは、ETV2、FLI1及びERG1の組み合わせの強制発現を含む。

ACにおける転写因子の発現を達成するために、これらの転写因子をコードする核酸が、様々なベクターを使用してAC中に送達され得、これらとしては、相同組換えによるランダム組み込み又は標的化組み込みのいずれかにより宿主細胞ゲノムに組み込まれる組み込みベクター、及び染色体外に維持されるエピソームベクターが挙げられる。Yamamotoらにより記載されるように(Eur. J. Phar. Biophar 71：484-89 (2009)、ベクターによる送達に加えて、転写因子をコードする核酸もまたmRNAの形態でACに送達され得る。

送達ベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス)、及び人工染色体(例えばYAC)が挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター(例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNVなどに由来)、レンチウイルスベクター(例えば、HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIVなどに由来)、アデノウイルス(Ad)ベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、サルウイルス40(SV-40)ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスベクターが挙げられる。

特定の実施態様において、所望の転写因子をコードする核酸は、レンチウイルスベクターを介して送達される。レンチウイルスベクターは当該分野で周知であり(例えば、米国特許第6,013,516号及び同第5,994,136号)、数ヶ月間の間強く持続した発現をもたらし得る。

当業者は、利用可能な分子生物学の技術を使用して、転写因子をコードする核酸を適切なベクターにクローンすることができる。これらのベクターは、5’調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、又はそれらの組み合わせ)、3’転写終結配列、１つ若しくはそれ以上の複製起点、又は選択マーカーのようなさらなる適切な配列を含み得る。ベクター中のプロモーターは、天然で転写因子と結合しているものであり得、そしてACにおいて転写因子の有効な発現を達成する異種プロモーターであってもよい。本明細書での使用に適したプロモーターの例としては、限定されないが、SV40初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)初期プロモーター、ベータアクチンプロモーター、GADPHプロモーター、メタロチオネインプロモーター；サイクリックAMP応答エレメントプロモーター(cre)、血清応答エレメントプロモーター(sre)、ホルボールエステルプロモーター(TPA)及び応答エレメントプロモーター(tre)が挙げられる。

ベクター又はウイルスの形態でのDNA又はRNAのような転写因子をコードする核酸のACへの導入は、様々な適切な方法を使用して達成され得る。このような方法としては、限定されないが、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトポレーション、リン酸カルシウム沈降、DEAE-Detxanとそれに続くポリエチレングリコール、超音波処理ローディング、微粒子銃、及び上記の周知の技術のいずれかの任意の組み合わせが挙げられる。

核酸送達に加えて、いくつかの実施態様では、転写因子はポリペプチドの直接送達（タンパク質形質導入とも呼ばれる）を介してもたらされる。タンパク質形質導入において、所望の転写因子をタンパク質形質導入ドメイン(又は「PTD」)に融合させ、これが細胞膜を横切ってこの融合タンパク質をACに送達する。PTDの例は、とりわけHo et al., Cancer
Research 61(2)：474-7 (2001) (HIV Tat)、WO03/059940 (ヒトSIM-2)、WO03/059941(Mph)、Rothbard et al.(Nature Med. 6(11)：1253-7 (2000)に記載される。

II.2 ETV2の制御発現
FLI1及びERGに対するETV2の制御された発現が、成熟かつ増殖性のrAC-VECを生成するために重要であるということが本発明者により発見された。例えば、クローン分析は、FLI1及びERG1に対するETV2の化学量論比が成熟かつ増殖性のrAC-VECの生成のために重要であることを明らかにする。特定の実施例において、FLI1及びERG1の両方が、CD31のような成熟ECマーカーを発現する望ましいrAC-VECクローンで発現され、そしてETV2発現はCD31に反比例するようである。さらに、初期の一過性ETV2発現後のETV2発現の抑制は、成熟ECのパーセンテージを実際に増加させる。従って、成熟ECのより不均一な集団を得るようにETV2の発現を制御するように、再プログラミングアプローチを微調整し得る。

いくつかの実施態様において、ACの再プログラミングは、クローンにおけるFLI1及びERGに対するETV2の適切な化学量論比の結果として少なくとも１つの成熟ECマーカー(例えばCD31)を発現するクローンを同定するために、ACにおけるETV2、FLI1及びERGの組み合わせの強制発現の期間後にクローン選択工程を含む。例えば、ACをETV2、FLI1及びERG1をコードするウイルスベクターで形質導入した約21日後に、初期ECマーカー(例えばVE-カドヘリン及びVEGFR2)だけでなく成熟ECマーカー(例えば、CD31)も発現するクローンを同定するためにACをスクリーニングする。21日目はrAC-VECが最大の成熟度を達成し、従って高効率で望まれるクローンを生成し得ると考えられる時点であり得るが、16日ほどの短い間、又は好ましくは17若しくは18日間若しくはそれ以上、又は19若しくは20日間若しくはそれ以上の間培養されていたrAC-VECのクローン増殖もまた望まれるクローンを生成するために適切であると考えられる。

他の実施態様において、ACの再プログラミングは、レシピエントACにおいてFLI1及びERGに対するETV2の適切な化学量論比を達成するために、ETV2及びFLI1/ERGをそれぞれ送達及び発現する異なる発現プロフィール（例えば、持続期間及び強度）のベクター及び／又は５’調節配列の利用を含む。例えば、持続した強い発現を方向づけるレンチウイルスはFLI1及びERG1に使用され得、そして比較的一過性の発現を方向づけるアデノウイルスベクターはETV2に使用され得る。転写因子をコードするネイキッドDNAもまた適切であるかもしれない。

さらに他の実施態様において、ACの再プログラミングは、FLI1及びERGの恒常的発現と共に、ETV2の一過性発現を含む。特定の実施態様において、ETV2の一過性発現は、約10〜18日間、12〜16日間、13〜15日間、又は約14日間のETV2の発現を指す。一般的に言えば、最少の10日がETV2が羊水細胞を内皮細胞運命へと特異化するために十分な時間であると考えられる。rAC-VECが生成されていることを確認するためにVEGFR2及びVE-カドヘリンタンパク質発現を評価することができる。さらに、ETV2はrAC-VECにおいてCD31(PECAM)発現をネガティブに調節することが本明細書において示されるので、ETV2のシャットダウン後にCD31についてアッセイすることもできる。ETV2シャットダウン及びTGFβ阻害の除去の後に全ての３つのECタンパク質マーカー(VEGFR2、VE-カドヘリン及びCD31)についてポジティブなrAC-VECは確約された（comitted）rAC-VECである。

一過性発現は様々な手段により達成され得、これらとしては、限定されないが、誘導性又は条件付き発現系(誘導性プロモーターを含む)、リコンビナーゼ系、及びETV2 mRNAの産生又は活性を拮抗する核酸薬剤の使用が挙げられる。

１つの例示的な実施態様において、一過性発現は、CLONETECHから市販されているLenti-X^TM Tet-Off誘導性発現系を用いて達成される。手短には、この系は２つのレンチウイルスベクターを利用する：Tet-Off転写活性化因子を安定に発現する調節因子ベクター、及びETV2遺伝子の発現を制御する応答ベクター(pLVX-Tight-Puro)。レンチウイルス粒子はそれぞれのベクターから製造され、そしてACを同時形質導入する際に使用される。Tet-OFF転写活性化因子の調節因子ベクターからの発現は、ドキシサイクリンの不在下で応答ベクターからのETV2の発現を作動させる。ETV2発現のその後の抑制はドキシサイクリン処理により達成される。

別の例となる実施態様において、ETV2の一過性発現は、Cre/Lox又はFLP/FRTのようなリコンビナーゼベースの系の使用により達成される。FLPタンパク質は部位特異的組換え事象を触媒し、そしてFLP遺伝子は出芽酵母（S. cerevisiae）からクローンされた(Cox (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80：4223-4227（参照により本明細書に加入される）)。FLPタンパク質により認識される組換え部位はFRTと呼ばれ、これは非対称8-bpスペーサーを取り囲む２つの逆方向13塩基対(bp)反復を含む：FLPタンパク質は、反復とスペーサーとの接合部で部位を切断する。ETV2コード配列は、２つのFRT部位の間に直接反復配向で送達ベクターに配置され得る。このようなベクターのACへの導入及びETV2発現期間の後、FLPリコンビナーゼの細胞への供給はFRT反復とFRT反復の１つとの間にDNA配列の欠失をもたらし、残りのFRT配列に「傷跡」を残し、FLPによるさらなる組換えに関して判読不能にし得る。同様に、バクテリオファージリコンビナーゼCreは、２つのlox部位間の部位特異的組換えを触媒し、組換え部位間の配列の欠失をもたらし、適切に選択されたlox配列では、同様に「傷跡」配列が作製される。Creリコンビナーゼのさらなる詳細については、Hamilton et al., J. Mol. Biol. 178：481-486 (1984)、Sternberg et al. J. Mol. Biol. 187：197-212 (1986)、Sauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85.：5166-5170 (1988)、及びSauer et al., Nucleic Acids Res. 17：147-161 (1989)（これらは全て参照により本明細書に加入される）を参照のこと。

他の実施態様において、ETV2の一過性発現は、ETV2 mRNAの産生又は機能を効果的に抑制又は発現停止させる核酸分子を利用することにより達成される。これらとしては、アンチセンスRNA、siRNA、及びmiRNA(又は「マイクロRNA」)が挙げられ、これらは全て、ETV2の遺伝子配列に基づいて設計され得、そしてACに導入され得る。

ETV2の一過性発現はまた、細胞に送達されるETV2をコードするネイキッドDNAを用いて達成され得る。

II.3 TGFβシグナル伝達の阻害
本発明の再プログラミングアプローチは、ETS-TFの強制発現と関連したTGFβシグナル伝達の阻害を含む。少なくとも短期間のTGFβシグナル伝達の阻害は、VEGFR2シグナル伝達を機能化し、そしてrAC-VECへのACの特異化を増強する。「短期間」は、再プログラミングの開始後少なくとも2週間；特定の実施態様では少なくとも18〜19日；そして他の実施態様では少なくとも20〜21日、例えば20〜24日、又は約21日の期間を意味する。TGFβ阻害のタイミングは、広範なTGFβ阻害剤分子又はTGFβリガンドに対して特異的な抗体のいずれかを培地に添加することにより容易に制御される。細胞表面でのVEGFR2及びVE-カドヘリンタンパク質発現(FACSにより測定可能)は、rAC-VEC生成を同定するために調べることができる２つの主な細胞の特徴である。rAC-VECの運命が確立されると(例えば約２１日目に)、TGFβ阻害はもはや必要ない。

TGFβシグナル伝達の阻害は、TGFβシグナル伝達阻害剤をACの細胞培養に添加することにより達成され得る。TGFβスーパーファミリーシグナル伝達は２つのクラスの受容体I型又はアクチビン様キナーゼ(ALK)受容体、及びII型受容体により媒介される。I型受容体は、ALK4(アクチビン又はインヒビンのI型受容体)、ALK5(TGFβのI型受容体）及びALK7(nodalのI型受容体)を含む。

特定の実施態様において、本明細書で使用されるTGFβシグナル伝達阻害剤は、I型受容体の選択的阻害剤、すなわち、II型受容体と比較してI型受容体に差異（すなわち、選択性）を有する阻害剤である。選択性は、標準的アッセイにおいて各アッセイでの阻害のIC₅₀比として測定され得る。阻害剤は１つのI型受容体(すなわち、ALK4、ALK5又はALK7のうちの１つ)の特異的阻害剤でも、いくつかのI型受容体(例えば、ALK4、ALK5及びALK7の全て)のシグナル伝達を阻害する阻害剤でもよい。

特定の実施態様において、阻害剤は少なくともALK5媒介シグナル伝達を阻害する。ALK5は、活性化すると、細胞質タンパク質smad2及びsmad3をリン酸化する。リン酸化されたsmadタンパク質は核に移行し、そして特定の遺伝子発現を活性化する。ALK5媒介シグナル伝達の阻害剤は、ALK5のキナーゼ活性を阻害し、かつsmadタンパク質のリン酸化を遮断する化合物であり得る。例えば、Yinglingらによる概説、Nature Reviews (Drug Discovery) 3：1011-1022 (2004)を参照のこと。

阻害剤は、ポリペプチド、例えばTGFβ受容体の可溶性形態(例えば、受容体の細胞外セグメントから構成されるポリペプチド)、特にI型受容体の可溶性形態、又はTGFβ受容体特にI型受容体若しくはそのリガンドに特異的な抗体、例えば、R&D：#MAB1835から市販されているTGFβリガンドに特異的なモノクローナル抗体であり得る。

阻害剤は小分子化合物でもよい。「少分子化合物」は、一般に1200、1000又は800ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物を意味する。 TGFβシグナル伝達の小分子阻害剤は当該分野で十分に裏付けられており、これらとしては、米国特許第6,465,493号及びUS 20030149277 A1に開示されるピリジル置換トリアリールイミダゾール類、US 20030166633
A1及びUS 20040220230 A1に開示されるピリジル置換イミダゾール類、US 20040152738 A1に開示されるピリジル置換トリアゾール類、US 20040266842 A1に開示されるチアゾリル置換トリアゾール類、US 20040063745 A1に開示される2-アミノ-4-(ピリジン-2-イル)-チアゾール誘導体、US 20040039198 A1に開示される2-ピリジン置換ジアリールイミダゾール類、US 20050014938 A1に開示されるフェニル置換トリアゾール類、US 20050165011 A1に開示されるベンゾオキサジン及びベンゾオキサジノン置換トリアゾール類、US 20070072901 A1に開示されるイソキノリン誘導体、US 20070154428 A1に開示されるチアゾリルイミダゾール誘導体、米国特許第7,417,041号に開示される少なくとも１つの2-ピリジル部分で置換されたヘテロ芳香族化合物ヘテロ芳香族化合物、さらには、Yingling et al., Nature Reviews (Drug Discovery) 3：1011-1022 (2004)により概説されるものが挙げられ、これらの刊行物の全ての内容は参照により本明細書に加入される。小分子阻害剤は様々な商業的供給源を通して入手可能である。例えば、以下の表に列挙される化合物はTocris Bioscience (Missouri, USA)から入手可能であり、そして本発明の方法における使用に適した阻害剤である。さらなる小分子阻害剤はEMD4Bisciences (New Jersey, USA)を通して入手可能である。

一実施態様において、化合物SB-431542はTGFβシグナル伝達阻害剤として使用される。この化合物は、この化合物は、約1μM〜約15μM、又は約2μM〜約10μMの範囲の濃度で培地に添加される。特定の実施態様において、この化合物は約5μMで培地に添加される。他の小分子阻害剤の適切な濃度は、特定の阻害剤の構造又は機能機構に依存し得、そしてマイクロモル濃度範囲であり得、これは（例えば適切なインビトロアッセイにおいて決定されたIC50値に基づいて）当業者により決定され得る。

II.4 細胞培養
ACは、羊水から新たに抽出されたものであろうと、凍結保存ストックから解凍したものであろうと、再プログラミング前に培養で例えば３〜４週間維持され得る。ACを培養するために適した培地としては、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、DMEM/F-15、Liebovitz L-15、RPMI 1640、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、及びOpti-MEM SFM (Invitrogen Inc.)が挙げられる。

転写再プログラミングのためにACを処理(例えば形質導入)した後、細胞を内皮細胞増殖に適している培地で、TGFβ阻害剤の存在下で培養し得る。適切な培地としては、Medium 199(Thermo Scientific：#FB-01)、15％ウシ胎仔血清(Omega Scientific)、20μg/ml内皮細胞補助剤(Biomedical Technologies：#BT-203)、1X Pen/Strep、20単位/mlヘパリン(Sigma：# H3149-100KU)から構成される内皮増殖培地(EM)が挙げられる。

ETV2、FLI1及びERGの強制発現並びにTGFβの同時の抑制が達成される条件下で細胞を培養する。特定の実施態様において、ETV2、FLI1及びERG1の発現と共にTGFβ阻害剤の存在下12〜16日間、又は約14日間ACを培養し、この時点で、ETV2発現を止めるが、一方でFLI1及びERG1の強制発現はTGFβ阻害剤の存在下で、細胞が合計18〜24日間、又は約21日間、TGFβ阻害剤の存在下で培養された時点まで継続する。この時点からTGFβ阻害剤はもはや必要ではなく、そして細胞を、阻害剤を含まない培地に切り替えて、FLI1及びERG1の発現を継続させながら、さらに、例えば数日間から数週間又はそれ以上必要に応じて培養する。

III. 血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞(「rAC-VEC」)
用語「血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞」又は「rAC-VEC」は、rAC-VECと成体ECが類似した形態学的特徴、細胞表面表現型、及び転写プロフィールを共有するという事実にも関わらず、哺乳動物被験体から単離された成体血管内皮細胞、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)及び成体肝臓類洞EC(「LSEC」)と区別される、本明細書に開示される再プログラミングスキームを使用してACから生成された血管内皮細胞を指すために使用される。例えば、rAC-VECは、HUVECのように、長さ約10μmであり、「目玉焼き」又は敷石形状である。rAC-VECに特徴的な細胞表面マーカーとしては、少なくともVE-カドヘリン⁺、VEGFR2⁺、及びCD31⁺が挙げられ、そしてまた場合により、EC-選択的接着分子(ESAM)及び接合部接着分子A(JAM-A)も挙げられ、これらは全て成体ECで発現される。rAC-VECの転写プロフィールは、VE-カドヘリン、VEGFR2、CD31⁺の発現、BMP、Notch-リガンド、IGF、CSF、Kit-リガンド、セマフォリン、及びEGFL7を含むアンジオクライン因子の発現；平滑筋アクチン、筋肉、カルポニン-1、及びナトリウム利尿ペプチドBの発現の欠如；並びにCD45、CD15、Pu.1、TPO-受容体、Flt3受容体又はLhx2を含む造血（hemapoietic）マーカーに対してネガティブであることにより特徴づけられる。

AC培養におけるrAC-VECの出現は、増殖特徴、形態学的特徴、細胞表面表現型、転写プロフィール、又はこれらの特徴のいずれかの組み合わせに基づいて決定され得る。ETV2/FLI1/ERG1でのACの形質導入が血管特徴の完全な誘導を生じるだけでなく、ACにおける非血管プログラムを止めるということが本明細書において示される。rAC-VECは高度に増殖性かつ安定であり、それらの完全な血管新生レパートリーを維持しながら、５０日で6x10⁴倍の増殖を取り消すことができる。必要ならば、磁気又は蛍光活性化細胞分類(MACS又はFACS)における使用のための磁気ビーズ又はフルオロフォアに結合された、VE-カドヘリン、CD31又はVEGFR2のようなEC表面マーカーに特異的な抗体を使用して、rAC-VECを細胞培養液から単離することができる。

従って、本発明はまた、安定なrAC-VECの実質的に純粋な集団を提供する。「実質的に純粋な」は、細胞集団においてrAC-VECが、細胞の少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％又はそれ以上のパーセンテージを占めることを意味する。「安定な」は、長期間の間、例えば少なくとも５継代、少なくとも１０継代、少なくとも15継代又はそれ以上、rAC-VECの特徴を失うことなく培養され得るということを意味する。

rAC-VECは治療適用において直接使用されても、従来の凍結保存方法を使用して将来の使用のために凍結保存されてもよい。

IV. 医薬組成物及び治療方法
本明細書に開示される再プログラミングアプローチは、多数の機能的かつ安定なrAC-VECの再現可能な製造を可能にし、このrAC-VECはバンク保存可能（bankable）であり、そしてHLA型で有り得、従って損傷した組織の治療的血管新生に有用であるだろう。

従って、さらなる局面において、本開示はrAC-VECを含有する組成物を提供する。本組成物は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる担体及び希釈剤を含み得る。本組成物はまた、生着を促進する成分を含み得る。

なおさらなる局面において、本開示は、本明細書に提供される内皮細胞の治療上の使用に関する。例えば、インスタント（instant）内皮細胞は、虚血組織の修復のための細胞治療、血管及び心臓弁の形成、人工血管の操作、損傷した血管の修復、並びに操作された組織における血管の形成の誘導(例えば移植の前に)において使用され得る。さらに、インスタント内皮細胞は、薬剤を標的に送達するため、及び腫瘍を処置するためにさらに改変され得る。

特定の実施態様において、本開示は、血管細胞又は血管新生を必要とする組織のための修復又は置換の方法を提供する。本方法は、このような処置を必要とするヒト被験体に、このような組織における血管新生を促進するために単離されたrAC-VECを含有する組成物を投与することを含む。

血管細胞又は血管新生を必要とする組織は、とりわけ、心臓組織、肝臓組織、膵臓組織、腎臓組織、筋組織、神経組織、骨組織であり得、これらは損傷し、そして過剰な細胞死により特徴づけられる組織、損傷の危険性がある組織、又は人工的に操作された組織であり得る。

組織における血管新生を促進することは、虚血状態、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、及び末梢血管閉塞性疾患、脳卒中、再灌流傷害、四肢虚血；神経障害(例えば、末梢神経障害、又は糖尿病性神経障害)、臓器不全(例えば、肝不全、腎不全など)、糖尿病、関節リウマチ、及び骨粗しょう症を含む状態を有するか又はこれらの状態を発症する危険性がある個体にとって有益であり得る。

本発明のrAC-VECはまたはこのような細胞を含有する組成物は、修復又は血管新生を必要とする組織へ、又はこれらの組織の付近への送達又は移動を生じるやり方で投与され得る。いくつかの実施態様において、細胞は全身投与されてそれを必要とする組織まで循環するか；またあるいは、局所投与され、例えば組織に直接投与されるか(注射、移植又はいずれかの適切な手段により)、又はこれらの細胞を必要とする組織の付近に投与される。他の実施態様において、細胞は移植前に人工的に操作された組織に組み込まれる。

別の実施態様において、本開示は、特定の薬剤の送達のために操作された内皮細胞を被験体に投与することにより、該被験体においてこのような薬剤が腫瘍を標的とするようにする方法を提供する。腫瘍は新しい血管の腫瘍への内植をしばしば刺激する（腫瘍血管新生を刺激する）ので、被験体に送達される内皮細胞は、新しい腫瘍脈管構造に寄与し得る。従って、細胞は、薬剤を直接腫瘍部位へ送達するために使用され得る。内皮細胞を使用して腫瘍を標的とし得る薬剤の例としては、限定されないが、細胞傷害性薬物、他の毒素、放射性核種、及び遺伝子発現産物が挙げられる。例えば、内皮細胞は、それらが抗腫瘍活性を有するタンパク質も発現するように、又はそれらが化学療法剤若しくは放射性核種のような毒性薬剤を分泌するか、放出するか、それらで被覆されるように操作され得る。例えば、放射性核種薬又は化学療法薬は、内皮細胞の表面に結合する抗体に結合され得、そしてそれにより放射性核種又は化学療法薬を腫瘍に送達するために使用され得る。

本明細書は以下の実施例によりさらに説明され、これら実施例は、いかなるようにも限定と解釈されるべきではない。全ての引用される参考文献（本出願全体にわたって引用される文献参照、交付済み特許、及び公開された特許出願を含む)は、参照により本明細書に明示的に加入される。

実施例１. 材料及び方法
細胞培養
本研究において使用されたヒト胚性幹細胞(hESC)は、主にRUES1 hESC(Dr. Ali Brivanlou, Rockefeller Universityにより提供された)であった。これらの細胞株の使用許可を、コーネル・ロックフェラー・スローンケタリングESCRO委員会（Cornell-Rockefeller-Sloan Kettering Institute ESCRO committee）による包括的レビューの後に得た。これらの研究の実行のための財源は、認証された非連邦資金源から確保された。ヒトESC培地(KOSR)は、20％ノックアウト血清代替物(Invitrogen：#10828-028)を補われたAdvanced DMEM/F12(Invitrogen：#12634-028)、1X非必須アミノ酸(Gibco：#11140050)、1X L-グルタミン(Invitrogen：#25030-081)、1Xペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen：# 15240-062)、1X β-メルカプトエタノール(Gibco：#21985023)、及び4ng/ml FGF-2(Invitrogen)からなるものであった。ヒトESCを、37℃及び5％CO₂でマウス胚線維芽細胞(MEF、Chemicon)で馴化したhESC培地を使用してMatrigel^TM上で維持した。

羊水細胞(AC)をワイルコーネル大学医学部（Weill Cornell Medical College）の病理細胞遺伝学的検査部（Cytogenetic Laboratory Department of Pathology）から入手した。廃棄されたAC(すなわち、前培養された（pre-cultured）ACを我々の使用前に３〜４週間遺伝学的検査室においてAmino-Max plus Supplementで増殖させた)をワイルコーネル大学医学部の治験審査委員会から入手した。ACを37℃及び5％CO₂で羊水培地（Amniotic Media）(AM)：Amnio-Max (GIBCO：#17001-074) + 1Xペニシリン/ストレプトマイシンを含むサプリメント(GIBCO：#12556-023)中で３〜４週間培養した後、転写再プログラミングのために処理した。再プログラミング実験のために、ACを、内皮成長培地(EM)（Medium 199(Thermo Scientific：#FB-01)、15％ウシ胎仔血清(Omega Scientific)、20μg/ml内皮細胞サプリメント(Biomedical Technologies：#BT-203)、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、20単位/mlヘパリン(Sigma：# H3149-100KU)、及び示されている場合は、5μM TGFβ阻害剤(SB431542)又はTGFβリガンド中和mAb(R&D)）中で培養した。Medium 199アール液体培地は、一連の無機塩、アミノ酸、及びビタミン類を含有し、これらは全てThermoScientificウェブサイトの製品データーシートに見出され得る。内皮細胞サプリメント(内皮マイトジェン（Endothelial Mitogen）-ECGSとしても知られる)は、ウシ視床下部から部分的に精製された製剤であり、インビトロで培養される血管内皮細胞の増殖を改善するために使用される。

肝臓類洞内皮細胞(LSEC、ScienCell)を、20％ウシ胎児血清を含むEM中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、以前に記載されたように得て(RAFII et al., Blood, 86：3353-3363 (1995)； RAFII et al., Blood, 84：10-19 (1994))、20％ウシ胎児血清を含むEM中で培養した。再プログラミングを受けているACについては、プレートを1μg/mlフィブロネクチン(Sigma：#F0895-5MG)でコーティングし、そして細胞を37℃で5％CO₂及び5％O₂にて増殖させた。

サイトカイン/小分子処理
小分子SB431542(Tocris：#SB431542)を5μMの最終濃度で使用した。ETV2の誘導性発現/抑制(図7)については、ドキシサイクリン(Clonetech：#631311)を2μg/mlの最終濃度で使用した。TGFβ実験(図5)については、TGFβリガンドβ1(R&D：#8915)及びβ3(R&D：#8425)を示された時間の間10ng/mlの最終濃度で使用した。TGFβリガンド中和モノクローナル抗体(TGFβmAb-R&D：#MAB1835)を10μg/mlの最終濃度で使用した。VEGFR2リン酸化実験(図5)については、細胞を５分間50ng/ml VEGF-A(Peprotech)で処理した。アセチル化-LDL取り込みアッセイ(図6)については、DiI-標識Ac-LDL(Biomedical Technical Inc.：#BT-902)を10μg/mlの最終濃度で使用した。

レンチウイルスベクター及び形質導入ストラテジー
ETV2、ERG1、及びFLI1をコードするcDNAを、pCCL-PGKレンチウイルスベクターに個々にクローンした。三連Flag-タグをETV2構築物にアミノ末端にQuick-Change部位特異的変異誘発キット(Stratagene：#200521)によりサブクローンした。条件付き発現/抑制実験のために、Flag-タグETV2をpLVX-Tight-Puroベクター(Clontech：#632163)に再サブクローンし、そしてpLVX-Tet-Offベクターで同時形質導入した。Flag-タグETV2の抑制を、ドキシサイクリン(2μg/ml)処理により達成した。スクランブルshRNA構築物を、対照としての使用のためにpLKOベクターにクローンした。レンチウイルスを、我々の目的の遺伝子レンチウイルスベクター15μg、pENV/VSV-G 3μg、pRRE 5μg、及びpRSV-REV 2.5μgを293T細胞において(8〜10継代；サブコンフルエント（subconfluent）、100mmディッシュ)カルシウム沈降法による同時形質導入により生成した。上清を、以前に記載されたように(NALDINI et al., Science, 272：263-267 (1996))トランスフェクションの４０時間後及び64時間後に採取した。ウイルス上清をLenti-X濃縮試薬(Clontech：#631232)により濃縮し、そしてウイルス力価を、Lenti-X p24 Rapid Titerキット(Clontech：#632200)を使用して決定した。他に示されていなければ、感染多重度(MOI)5をAC、さらには未分化RUES1及びWMC-2 hESCを形質導入するために使用した。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー(FACS)をBecton Dickenson LSRII SORPで行い、そして流動選別をAria II SORPで行った。使用した抗体はヒトVEGFR2(R&D：FAB357P)、CD31 (eBiosciences：#11-0319-42)、VE-カドヘリン(eBiosciences：#17-1449-42)、c-Kit(BD：#339206)、EpCam(BD：#347198)、E-カドヘリン(BD：#612130)、Tra1-60(BD：#560071)、Tra1-81(BD：#560793)、CD24(eBiosciences：#14-0247-82)及びSSEA3 (BD：#560237)に特異的であった。全ての電圧及び補償をCompBeads(BD Pharmingen)を用いて行い、そしてゲーティングはフルオロフォアマイナスワン(FMO)対照で行った。

定量的PCR
総RNAを、RNeasy抽出キット(Qiagen：#74106)を使用して培養した細胞から製造し、そしてQuantiTect逆転写キット(Qiagen：#205313)を使用して製造者の指示書に従って逆転写した。相対定量的PCRを、SYBR Green PCRミックス(Applied Biosystems)を使用して7500 FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で行った。サイクル条件は：50℃で2分間１サイクルの後、95℃で１０分間１サイクル、その後95℃15秒そして60℃１分間を４０サイクルであった。プライマーを線形範囲で増幅及びプライマー解離についてチェックし、確認した。プライマープローブの閾値サイクルを、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンに対して正規化し、そして相対値に変換した。(プライマー配列については表1を参照のこと)。

インビトロMatrigel^TM管形成及びインビボ血管新生アッセイ
rAC-VECがインビボで管形成を受ける能力を試験するために、ETS-TFに感染したACを、GFP-レンチウイルスで形質導入し、そしてMatrigel(BD：#354234)、VEGF-A 100ng/ml、及びFGF-2 50ng/mlと混合し、そしてNOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG)マウス(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)の側腹部に皮下移植した。rAC-VECが再生肝臓類洞脈管構造を機能的に組み入れる能力を試験するために、GFP-標識rAC-VECを、以前に記載されたように(Ding et al.,2010)、70％部分的肝切除術を受けた２日後にNSGマウスに脾臓内注射した。rAC-VEC注射の２週後(Matrigelプラグ)又は３ヶ月後(脾臓内)に、マウスにAlexa568(Invitrogen：#I21412)と結合体化したイソレクチン-B4(2mg/kg)を静脈内注射し、そして１０分後に屠殺した。次いでMatrigelプラグ又は肝臓を4％パラホルムアルデヒド中で固定し、続いて３０％スクロース中で48時間飽和させた。20μm凍結切片を作製し、そしてHoechst 33342で対比染色した。GFP-標識rAC-VECの取り込みを確認し、そして宿主血管への機能的生着がイソレクチン-B4蛍光との共染色により明らかとなった。rAC-VECと宿主マウスECとを区別するために抗ヒトCD31(BD)染色も行った。蛍光シグナルを共焦点顕微鏡(710 META Zeiss)により分析した。GFP陽性領域の面積をImageJにより定量し、そしてイソレクチン陽性機能性血管の数を、無作為に取った３つの視界に存在する細胞を計数することにより決定した。インビトロアッセイについては、200μl Matrigelを12ウェルTCプレート上にコーティングし、そして200,000 rAC-VECをMatrigel上に播種し、そして管形成を以前に記載されたように決定した(KOBAYASHI et al., Nature cell biology, 12：1046-1056 (2010))。

免疫蛍光/ウェスタンブロット分析
サンプルを以前に記載されたように(James et al., 2010)染色した。手短には、サンプルをPBST中で透過性にし、そして5％ロバ血清中でブロックした。サンプルを1時間ブロッキング溶液中で結合体化抗体と共にインキュベートし、洗浄し、そして共焦点顕微鏡による画像化のために核酸についてDAPI又はToPro3(Invitrogen)により対比染色した。免疫染色のために使用した一次抗体は、VE-カドヘリン(R&D：#AF938)、CD31(eBiosciences：#11-0319-42)、VEGFR1(R&D：#AF321)、VEGFR2(R&D：#FAB357P)、ESAM(R&D：#AF2688)、JAM-A(R&D：AF1103)、EpCam(BD：#347198)、平滑筋アクチン(R&D：# MAB1420)及びOct4(R&D：#AF1759)であった。使用した全ての抗体はヒト抗原に対して特異的であった。全ての画像化を、Zeiss 510又は共焦点顕微鏡のいずれかを使用して行った。ウェスタンブロット分析を、以前に記載されたように(Kobayashi et al., 2010)行った。ウェスタンブロットアッセイにおいて使用した抗体：Flag(Sigma：#F1804-5MG-1：1000)、VEGFR2(細胞シグナル伝達：#2479S - 1：2000)、pVEGFR2(細胞シグナル伝達：#4991 - 1：300)、SMAD2(細胞シグナル伝達：#3102S-1：1000)、pSMAD2(細胞シグナル伝達：#3108S - 1：300)、GAPDH(細胞シグナル伝達：#2118L-1：5000)、ERG(BioCare Medical：#CM421C-1：1000)、及びFLI1(Epitomics：#3645-1 - 1：3000)。

RNA配列ライブラリ構築、配列決定、及び解析
総RNAを、Qiagen RNeasy抽出キットを使用して培養した細胞から調製し、そして品質をAgilent Technologies 2100 Bioanalyzerでチェックした。高品質総RNA 1μgを、提供された試薬を使用してIllumina TruSeq RNAサンプル調製キット(San Diego, CA)で、その後のクラスター生成及び配列決定のためのテンプレート分子のライブラリへとmRNAを変換するためのインプットとして使用した。ポリ-Tオリゴ結合磁気ビーズを使用したポリ-A含有mRNA分子の精製後、mRNAを、高温下で二価カチオンを使用して小塊に断片化した。切断されたRNAフラグメントを、逆転写酵素及びランダムプライマーを使用して第一鎖cDNAにコピーした。この後、DNAポリメラーゼI及びRNase Hを使用して第二鎖cDNAを合成した。次いでこれらのcDNAフラグメントに、末端修復プロセスを経て、単一「A」塩基を加え、次いでアダプターを連結した。次いで生成物を精製して、最終cDNAライブラリを作製するためにPCRで濃縮した。生成物のサイズ及び純度を定量しチェックした後、多重DNAライブラリを、10nMに対して正規化し、次いで２つのサンプルライブラリを等体積で一緒にプールした。7pMの各々のプールしたDNAライブラリテンプレートを、固定化及び３’伸長、ブリッジ増幅、直線化及びハイブリダイゼーションを含めてIllumina cBot機器で増幅、次いでIllumina HiSeq2000配列決定装置の１つのレーンで、ペアドエンド（pair end）モジュールを使用して2x58bp長リードを生成して配列決定した。Illuminaパイプラインを使用したQCの後に、リードをTopHat(TRAPNELL et al., Bioinformatics, 25：1105-1111 (2009))をデフォルトパラメータと共に使用してヒトゲノム(hg18)に位置づけた。次いで、RefSeq (June 2010)転写レベル(FPKMs)を、CuffLinks (TRAPNELL et al., Nat Biotechnol, 28：511-515 (2010))を使用して、上位四分位数正規化及び配列特異的バイアス補正を用いて定量した。ヒートマップ生成のために、示されたサンプルにわたる各転写の最大FPKMを決定した；次いでFPKMをこの数で割って、スケーリングした（scaled）発現値を生じた。次いで、ヒートマップを、緑〜赤のカラースケールを使用してプロットした。多次元尺度構成法(MDS)を、R統計ソフトウエアにおいて利用可能なcmdscale関数を使用して行った。階層的クラスタリングを、平均連結法アプローチを使用して、hclust R関数を使用して行った。MDS及び階層的クラスタリングの両方のために、１−ピアソン相関を、ゲノム全体でのトランスクリプトームプロフィール間の相違点尺度として使用した。

Agilent 1M CGHアレイでのDNAプロファイリング
ゲノムDNAを、DNeasy回収キット(Qiagen：#69506)を使用してサンプルから抽出した。DNA完全性を1％アガロースゲルでチェックした。次いでDNA 3μgを消化し、ランダムプライミングによりBioprimeキット(Invitrogen)及びCy3又はCy5-dUTPを使用して標識した。標識したDNAをAgilent 1M CGHアレイに40時間60℃でハイブリダイズさせた。製造者の指示に従って洗浄した後、スライドをAgilent DNAマイクロアレイスキャナーでスキャンし、そして画像をFeature Extraction 10.7(Agilent)を使用して定量した。

実施例２. ETV2、FLI1及びERG1の上方調節はヒト胚性幹細胞(HESC)のECへの分化を増大する
ECの血管性特異化に必須なETS-TFを同定するために、本発明者らは、胚性ECへのhESC分化の確立されたモデル(JAMES et al., Nat Biotechnol, 28：161-166 (2010))を使用した。マイクロアレイプロファイリングを使用して、本発明者らは、ETV2、FLI1及びERGが、hESCのECへの分化の間に発現される鍵となるETS-TFであることを見出した。ERG1アイソフォームは、ERG2アイソフォームと比較してプロトタイプのECにおいて一貫した発現を示したので、ERG1をhESCからのECの生成のためのプロトコルにおいて使用した。

hESCをBMP2及びVEGF-Aと共に10日間インキュベートして、初期胚性ECの血管前駆体であるVEGFR2⁺VE-カドヘリン細胞を生成した。続いて、VEGFR2⁺CD31^- VE-カドヘリン^-細胞を単離し、そしてETV2、FLI1、及びERG1(ETV2/FLI1/ERG1)のためのcDNAを発現するレンチウイルスベクター又は対照ウイルスで形質導入した。VEGF-A、FGF-2、及びTGFβ阻害剤SB431542を用いて細胞を増殖させた後、対照細胞と比較してETS-TF形質導入細胞の中でVEGFR2⁺CD31⁺VE^-カドヘリン⁺ ECにおいて最も少ない増加が観察された。しかし、ETS-TF形質導入及び非形質導入VEGFR2⁺CD31⁺VE-カドヘリン⁺ ECの両方が、3週を越えて増殖せず、そして最終的には平滑筋細胞のような非EC細胞型へと分化転換した。従って、ETS-TFの強制発現にも関わらず、hESC由来ECはそれらの増殖能及びECアイデンティティを維持することができなかった。

実施例３. 血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞(rAC-VEC)は、ETS形質導入hESC由来のECよりも高い増殖能及び血管安定性を示す
hESC由来胚性ECは、限定された増殖能を有し、そして継代の際には非血管細胞に「ドリフトする（drift）」ので、本発明者らは、血管細胞へと再プログラムされ得る容易に入手しうるヒト細胞の供給源を探した。成体ヒト線維芽細胞及び間葉細胞を再プログラムする試みは成功しなかった（データは示していない）。多数のヒト胎仔及び成体組織をスクリーニングした後、本発明者らは、妊娠中期の羊水細胞(AC)由来の間葉細胞及び上皮細胞が予想外に高い効率で血管内皮細胞への再プログラミング(rAC-VEC)に適しているということを観察した。この目的のために、AC(「前培養されたAC」-方法を参照のこと)をレンチウイルスETS-TF(ETV2、FLI1、ERG1)で単独で、及び組み合わせて形質導入し、これらの細胞がrAC-VECに再プログラムされ得るかどうかを決定した(図1a)。TGFβ阻害は、hESC由来の胚性ECの間葉移行(Endo-MT)がECに起きるのを防ぐ際に重大であるので(JAMES et al., Nat Biotechnol, 28：161-166 (2010))、ACはまた、TGFβ受容体阻害剤SB431542又はTGFβリガンドに対する中和モノクローナル抗体(mAb)の存在下でも培養された。

ETV2、FLI1又はERG1をコードするレンチウイルスを用いたACの形質導入は、数ヶ月の間の測定可能なレベルの対応するmRNA及びタンパク質の発現をもたらした。血管マーカーVE-カドヘリン、VEGFR2、及びCD31の発現レベルを評価して、形質導入されたACの再プログラミング有効性を評価した。ETV2は単独で血管マーカーVE-カドヘリン及びVEGFR2の発現を作動させたが、CD31を活性化しなかった。対照的に、ERG1又はFLI1はCD31発現を活性化したが、ETV2により作動された他の鍵となるECマーカーを誘導しなかった。従って、ETV2はECの運命の誘導に関して中心となるものであるが、一方ERG1及びFLI1はEC成熟度を促進する。特に、３つのETS-TF全てで同時に形質導入されたACは、７日以内に各ECマーカーの強い誘導を示し、そしてそれはその後１ヶ月を越えて持続し(図1b)、３つの因子の組み合わせがECアイデンティティ及び成熟度に関連する遺伝子の完全な賛辞（full-compliment）を活性化するために必要であるということを示唆した。 ETV2の形質導入のみが最も高い増殖率をもたらすが、FLI1又はERG1形質導入細胞は不十分に増殖するので、ETS-TFの発現はまた形質導入されたACの増殖も促進する(図1c)。３つのETS-TF全てでの強制発現は、強固な増殖をするrAC-VECをもたらす。ETV2、FLI1及びERG1(ETV2/FLI1/ERG1)で形質導入された10⁵個のACで開始して、約3000万個の細胞が3週までに生じ、そして7週で60億個を超す細胞にまで増加した(図1d)。特に、VE-カドヘリン表面発現は、この期間全体を通してETV2/FLI1/ERG1形質導入ACの９８％超において保持された。

ETS-TFでの形質導入及びTGFβ阻害の後、ACは、ETS-TF形質導入又は非形質導入hESC--->ECよりも約３０倍高い数まで増殖した(図1e)。さらに、VE-カドヘリン⁺細胞の顕著な減少が、ETS-TFで形質導入されたACと比較して、ETS-TF形質導入又は非形質導入hESC由来ECの連続的な継代の間に見られる(図1f)。hESC由来EC集団内でのこのEC表現型からの「ドリフト（drift）」は、平滑筋α-アクチン(SMA)抗体での染色により確認された(図1g-枠iii.、iv.、及びvi.)。ETS因子で形質導入されたACはこの非ECマーカーに関してネガティブであり(図1g-枠ii.)；むしろこれらは、他の成体EC型、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC：図1g-枠v.)及び肝臓類洞ECで見られる典型的なVE-カドヘリン発現パターンを示す。従って、ACは、安定なECへの転写再プログラミングに対してhESCよりも適切な独特の後成的構成に恵まれている。

実施例４. ACはEC前駆体細胞を欠いている
AC由来rAC-VECが既存のEC前駆体細胞から生じたか否かを評価するために、本発明者らは、ETS-TFの不在下でEC増殖に十分な条件でACを培養することによりrAC-VECが生成され得るかどうかを試験した。ACを、TGFβ阻害剤SB431542の存在下及び不在下で、正常酸素圧条件下にて、VEFG-A、FGF-2、EGF、及びIGFを含有する最適EC増殖培地(EM)中で成長させた(SIMON et al., Nature reviews Molecular cell biology, 9：285-296 (2008))。１４日まで、VE-カドヘリン及びCD31発現はこれらの非形質導入ACにおいてまだ存在していなかった。EC増殖を助長する培養条件での２１日間及びそれを超すさらなる処理は細胞死をもたらした(データは示していない)。従って、rAC-VECは既存のEC前駆細胞の産物ではない。AC集団の約0.2〜2％を構成する、c-Kit⁺細胞のようなACのサブセットは、多能性であることが示されている(DE COPPI et al., Nature biotechnology, 25：100-106 (2007))。rAC-VECがACの多能性亜集団からのみ裏付けられるという可能性を排除するために、本発明者らは、ACにおける多能性（pluripotency）マーカーOCT4の存在を評価した。AC集団の圧倒的多数はOCT4タンパク質に関してネガティブであり(図2a)、他のグループからの同様の結果を裏付けた(JEZIERSKI et al., Stem cell reviews, 6：199-214 (2010))。OCT4(図2b-上パネル)及びSOX2(図2b-下パネル)に加えてNANOG(データは示していない)についてのほとんど検出不可能なmRNA発現レベルは、c-Kit⁺細胞の可能性のある小さなサブセットを除いて、少数のACが多能性であることをさらに示唆する。従って、ACの大多数は、ETS-TFでの形質導入なしに豊富な信頼のおける血管細胞に自然に分化し得るEC前駆体又は多能性細胞を欠いている。

実施例５. 系列特異的類上皮及び間葉/線維芽ACはrAC-VECへの再プログラミングを促す
ACは、表現型的にはE-カドヘリン⁺(E-Cad、CD324)、EpCAM⁺(CD326)、及びCD24⁺細胞と示される系列特異的細胞に加えて、c-Kit、Tra1-60、Tra1-81、SSEA-3及びSSEA-4を発現する未分化細胞の両方から構成される(図2c)。特に、c-Kit⁺はACの＜1％を構成するが(DE COPPI et al., Nature biotechnology, 25：100-106 (2007))、CD31⁺細胞は存在しなかった。

c-Kit⁺細胞の数は非常に少ないので、本発明者らは、非多能性系列特異的ACがrAC-VECを生成するための主な供給源であるという仮説を立てた。ACプールからc-Kit⁺細胞を枯渇させた後、EpCAM⁺Tra1-81^-c-Kit^-細胞及びEpCAM^-Tra1-81^-c-Kit^-細胞を精製し、ETS-TFで形質導入し、そしてTGFβ阻害の存在下で増殖させた。両方のETS-TF形質導入亜集団が４週の培養にわたって十分に増殖した(図2d-上グラフ)。さらに、ETS-TF形質導入EpCAM⁺Tra1-81^-c-Kit^-及びEpCAM^-Tra1-81^-cKit^-亜集団の中で、VE-カドヘリン⁺細胞の有意な増加が観察された(図2d-下グラフ)。EpCAM及びVE-カドヘリンタンパク質についての免疫細胞染色（Immunocytostaining）は、ETS-TF形質導入及びTGFβ阻害の結果としての類上皮型ACからrAC-VECへの移行を裏付ける(図2e)。従って、rAC-VECへの再プログラミングに適しているのは系列特異的ACである。

実施例６. ETS-TFはACにおける血管特徴の発現を活性化する
rAC-VECが血管特徴を獲得する程度を評価するために、本発明者らは、新たに生じるrAC-VECでのVE-カドヘリン及びVEGFR2の表面発現を測定した(図3a)。TGF-β阻害ACをETS-TFで形質導入した４日後に、VE-カドヘリン⁺細胞、及びより少ない程度でVEGFR2⁺細胞が生成された(図3a-枠ii.)。これらのマーカーを発現している細胞のパーセンテージは、数週間にわたって有意に増加し(図3a-枠iv.及びvi.)、その結果再プログラミングの４週後に、形質導入されたACの集団全体(約99％)がVE-カドヘリン⁺(図3b-枠ii.)であり、そのほぼ３分の２はVEGFR2発現も示した。さらに、これらの切り替わった細胞は今や形態的にHUVECに類似している(図3b-枠iv.〜ix.)。再プログラミングアプローチはcDNAの宿主ゲノムへのレンチウイルス依存性組み込みを利用したので、本発明者らは、28日rAC-VECのゲノム完全性を評価するために比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)分析を行った。この分析によりゲノム異常が無いことが明らかとなり、増殖するrAC-VECが遺伝的に安定であることを実証した。

実施例７. ETS-TF発現の最適化学量論は成熟rAC-VECを生成するために必要である
d21 rAC-VECの大部分はVE-カドヘリン⁺であるが、これらの細胞が成熟及び未成熟rAC-VECのクローン集団から構成されるか又は不均一集団から構成されるかは不明であった。完全ECプログラムを発現する成熟rAC-VECの均一な集団を生成するために、本発明者らは、再プログラミングプロセスの開始時にクローン分析を行った。ETV2/ERG1/FLI1での形質導入及びTGFβ阻害によりACからrAC-VECを生成し、そして２１日間培養した。次いでVE-カドヘリン、VEGFR2及びCD31を発現した単細胞(VE-cad⁺VEGFR2⁺CD31⁺)を単離し、そしてクローン増殖のために９６ウェルプレートに１ウェルあたり１細胞の密度でプレーティングした(図3c)。21日以内に、単細胞クローンの20〜25％が増殖能を示し(図3d)、個々のクローンは非同一表現型で後代を生じた(図3e-枠i.〜iv.)。クローン-1、クローン-2、及びクローン-3は全てほぼ99％ VE-カドヘリン⁺であったが、CD31発現は大きく変化した。特に、クローン-3細胞はCD31を発現したが、一方でクローン-1はCD31⁺細胞を生じず、そしてクローン-2はCD31⁺(18％)及びCD31^-細胞の両方を産生した。CD31発現にもかかわらず、３つの全てのクローンが４週を越えて増殖することができた(図3e-枠v.)。

様々なクローン間でのECマーカー誘導におけるこれらの差異は、ETS-TF発現の化学量論に起因するものであり得るので、ETV2、ERG1、及びFLI1 mRNAのmRNAレベルを評価した(図3e-枠vi.-viii.及び要旨)。ERG1及びFLI1の両方がクローン-3で発現され、これらの因子が、CD31発現を誘導するために重要であることを示唆した。さらに、ETV2発現はCD31に反比例し、ETV2がCD31を負に調節するということを示した。従って、クローン-3はVE-カドヘリン、VEGFR2及びCD31を作動するためのETS-TF発現の適切な組み合わせを有するようであった。従って、これまでに記載された再プログラミングプラットフォームは、その不均一性がETS-TFの多様な発現レベルに起因するrAC-VECの集団を生成した。

rAC-VECクローンが成熟血管特異的（committed）ECとしての類似した血管新生プロフィールを表すかどうかを評価するために、本発明者らは、成熟ECマーカーに特異的な一連の抗体を用いた免疫染色を行った。VE-カドヘリン及びCD31に加えて、クローン-3はまた、EC-選択的接着分子(ESAM)及び接合部接着分子-A(JAM-A)について陽染された(図4a)。rAC-VECにおけるEpCamの消失(図4a)は、これらの細胞の元の非血管特徴がはがれているということを示す。従って、ETS-TFの差異発現レベルは、それらが成熟するにつれてECアイデンティティを維持することができるrAC-VECを生成する際に決定的であった。

実施例８. クローン由来rAC-VECは成熟ECと同様のトランスクリプトームプロフィールを示す
rAC-VECが、非血管遺伝子の発現の抹消を同時に示しながら、EC特異的遺伝子のレパートリー全体を発現したか否かを評価するために、本発明者らは、AC由来のrAC-VEC(クローン及び非クローンの両方)に対してトランスクリプトーム配列解析(RNA-seq)を行った。次いで、rAC-VECのこれらのゲノム全体での解析を、プロトタイプ成熟EC、例えばヒト臍帯静脈EC(「HUVEC」)及び成体肝臓類洞EC(「LSEC」)のトランスクリプトーム、さらにはCD34⁺造血細胞(「CD34⁺」)、骨髄間質細胞(「BMS」)、肺由来小気道上皮細胞(Hackett et al., 2012)及びナイーブ対照AC(「Amni ctrl」)を含む非内皮細胞型と比較した。相当数の血管遺伝子が、ナイーブACと比較して、非クローン(「rAC-VEC」)及びクローン(「rAC-VECクローン-3’及び「rAC-VECクローン-4」)由来rAC-VECにおいて上方調節された(図4b)。さらに、これらの誘導されたEC遺伝子の発現レベルは、インビトロで培養されたHUVEC及びLSECにおいて見られる発現レベルに匹敵するものであり、rAC-VECが完全ECアイデンティティを獲得したという考えを実証した。BMP、Notchリガンド、IGF、CSF、Kitリガンド、及びセマフォリンを含む、EC駆動器官再生(BUTLER et al., Cell Stem Cell, 6：251-264 (2010b)； DING et al., Nature, 468：310-315 (2010)； DING et al., Cell, 147：539-553 (2011)； KOBAYASHI et al., Nature cell biology, 12：1046-1056 (2010))及び腫瘍成(BUTLER et al., Nat Rev Cancer, 10：138-146 (2010a))を調節するアンジオクライン（Angiocrine）因子も全て同様にrAC-VECにおいて切り替わった。重要な事には、ACにおいて通常発現される非EC遺伝子の一群、例えば平滑筋アクチン、ムスクリン（musclin）、及びカルポニン-1はrAC-VECにおいて発現停止された。

次いで本発明者らは、3D多次元尺度構成法(3D-MDS)(図4c)及び階層的クラスター分析を行うことによりRNA配列解析から得たrAC-VECと成体ECトランスクリプトームとを比較した。これらの解析は、クローン及び非クローン由来rAC-VECとHUVEC及びLSECとの緊密な関連を示すが、BMS、上皮細胞、及びCD34⁺造血細胞はrAC-VECに対する類似性を全く示さない(図4c)。特に、rAC-VECは、CD45及びCD15を含む造血マーカーを発現せず、FLI1及びERG1が造血アイデンティティを誘導したかもしれないという可能性を除外した。従って、ゲノム全体での解析は、TGFβ阻害と共にETV2、FLI1及びERG1発現の適切な化学量論レベルが、信頼のおける成熟ECと類似した成熟rAC-VECの集団のみへとACを再プログラムすることを実証した。

実施例９. TGFβ阻害はrAC-VECにおける機能的VEGFR2シグナル伝達を維持する
ETS-TF形質導入ACはTGFβ及びその受容体の両方を産生し（図4b)、自己分泌/接触分泌ループが、Endo-MTを支持しそしてrAC-VEC生成を妨げることによりTGFβ依存性細胞運命移行を調節し得るという可能性を生じさせた(MEDICI et al., Nat Med 16：1400-1406 (2011)； ZEISBERG et al., Nat Med, 13：952-961 (2007))。従って、ETV2/FLI1/ERG1形質導入ACを、TGFβリガンドに対する中和mAb、又はTGFβ小分子阻害剤(SB431542)の存在下及び不在下で21日間培養した。外因性TGFβリガンドの不在下でさえ、TGFβシグナル伝達についての読み出しとしてのリン酸化SMAD2(P-SMAD2)の基礎レベルが対照及びETV2/FLI1/ERG1形質導入ACの両方でなお活性であるということが観察された(図5a-レーン1、2)。これは、これらのTGFβ活性化対照及びETV2/FLI1/ERG1形質導入ACにおいて全及びリン酸化VEGFR2タンパク質が存在しないこととと相関性があった(図5b-レーン1、2、3、4)。しかし、TGFβリガンドに対するmAbの添加は、rAC-VECにおけるP-SMAD2発現を抑制し(図5a-レーン7、8)、VEGFR2タンパク質を上方調節した(図5b-レーン11、12)。重要なことには、TGFβリガンドに対するmAbで処理されたrAC-VECは、VEGFR2のリン酸化により示されるように、VEGF-A刺激の原因であった(図5b-レーン12)。TGFβリガンドの補充(図5a-レーン3〜6)又はパルス化TGFβリガンド刺激(図5a-レーン11〜16)を用いても、TGFβ阻害剤の存在はSMAD-2リン酸化を妨げ、VEGFR2タンパク質(図5b-レーン7、8、9、10)及びVEGF-A依存性リン酸化(図5b-レーン8、10)の上方調節を可能にした。特に、TGFβ活性化rAC-VECはEC形態を獲得しなかったが(図5c-枠ii. 対 枠vi.)、TGFβシグナル伝達の阻害(図5c-枠iii.、iv.、v.)はEC単層の典型的な敷石形態をrAC-VECにもたらした(図5c-枠vi.)。従って、TGFβシグナル伝達の阻害は、VEGFR2を機能させてrAC-VECの血管アイデンティティを維持する。

実施例10. ３週間の一過性TGFβ阻害は長期VEGFR2シグナル伝達及びrAC-VECアイデンティティを持続させる
rAC-VECにおいて機能性VEGFR2タンパク質を生成するために、ACのETS-TF形質導入の開始からTGFβシグナル伝達を阻害することが必須であった(図5d)。TGFβシグナル伝達の持続的な抑制が長期rAC-VEC安定性を持続するために必要かどうかを決定するために、本発明者らは、ETS-TF形質導入後のいくつかの時点でTGFβ阻害を逐次除いた(図5e-左パネル)。ETV2/FLI1/ERG1での形質導入後１４日目にTGFβ阻害を除くと、VEGFR2⁺細胞の減少が細胞増殖の次の７日間の間に観察された(図5e-左パネル、白色バー)。しかし、TGFβ阻害をETV2/FLI1/ERG1での形質導入の２１日後に除いた場合、VEGFR2⁺細胞のパーセンテージは維持された(図5e-左パネル、灰色バー)。特に、TGFβ経路の操作はrAC-VECにおけるVE-カドヘリン発現に対する効果を有していなかった(図5e-右グラフ)。従って、３週間のTGFβシグナル伝達の抑止は、VEGFR2シグナル伝達を機能させるために十分であり、安定かつ増殖性のrAC-VECの長期血管アイデンティティを維持した。

実施例11. AC由来rAC-VECは生着可能であり、かつ機能性灌流血管を形成する
次に、本発明者らは、rAC-VECが完全な血管新生能を獲得したかどうかを評価するためにインビトロ及びインビボモデルを使用した。Matrigelを支持体として使用する管形成アッセイを、TGFβ阻害剤で処理された２１日rAC-VECに対して行った(図6a)。rAC-VECはHUVEC管形成と同程度にインビトロで管を形成することができたが、ナイーブACはできなかった。別のECがアセチル化-LDL(Ac-LDL)取り込みの原因であると実証するために、第二のインビトロアッセイをrAC-VECに対して行った(図6b)。21日rAC-VECのAc-LDLとのインキュベーションは、HUVECにおいて見られたAc-LDL取り込みと同様のこのリポタンパク質の有意な蓄積を示した。

次いで本発明者らは、２つのインビボモデルにおいて機能性脈管構造を樹立するrAC-VECの能力について試験した。１つのモデルにおいて、GFP標識42日rAC-VEC(及び対照細胞)をVEGF-A及びFGF-2を補充したMatrigelプラグにロードし、そして免疫無防備状態のNOD-SCIDIL2Rγ^-/-(NSG)マウスに2週間の期間の間注射した(図6c)。開存血管を同定するためにAlexa568-イソレクチン-B4の静脈内(IV)注射により脈管構造の生体内標識（マウスを屠殺する１０分前)をした後、Matrigelプラグを分析のために取り出した。ナイーブACはいずれの毛細血管も形成しなかったが(図6c-枠ix.)、rAC-VECは、宿主脈管構造に吻合した様々な径の多数の機能性血管を形成した。これは、「結合（merge）」画像(図6c-枠x.)において見られるように、GFPシグナルのイソレクチンマーカーとの共局在により確認された。

TGFβシグナル伝達の短期抑制で処理されたrAC-VECがそれらの血管アイデンティティを維持するかどうかを決定するために、21日間の再プログラミングを経てrAC-VECを生成し、次いでTGFβ阻害なしでさらに21日間EC培地中で続けて培養した。次いでこれらのrAC-VECをMatrigelプラグにロードし、そしてマウスに注射した(図6c-枠xi.、xii.)。2週後の回収の際、これらのプラグの分析は、宿主血管に吻合した様々な径及びサイズの豊富な灌流血管を示し、それらのインビボでの機能性を強調した。

ECの脾臓内移植は、70％部分的肝切除を受けたNSGマウスの肝臓類洞血管へのこれらの細胞の生着をもたらした(BENTEN et al., Hepatology, 42：140-148 (2005)； DING et al., Nature, 468：310-315 (2010))。このインビボモデルを使用してrAC-VECが長期間NSGマウス脈管構造へと組み込まれる能力を調べた。5x10⁵ GFP標識21日rAC-VECの脾臓内移植の3ヶ月後、機能性血管を同定するためにマウスにAlexa568-イソレクチン-B4を静脈内注射した。ヒトGFP⁺ rAC-VECが吻合した灌流血管の数を、ヒトCD31(hCD31)に特異的なmAbで染色することにより決定した。特に、本発明者らは、再生した血管の5〜10％内にGFP⁺イソレクチン⁺hCD31⁺ ECの存在を検出した(図6d及び6e)。従ってrAC-VECは、肝臓を再生する際に生着しかつ持続性の開存類洞血を形成し得、そしてMatrigelプラグにおいて機能性灌流血管を樹立し得る耐久性のある成熟ECを含んでいた。

実施例12. rAC-VECの血管アイデンティティはETV2の抑制後にインタクトなままであった
ETV2は血管発生の初期において一時的に発現し、そしてその発現はおそらく成体ECにおいて止まる(KATAOKA et al., Blood, 118：6975-6986 (2011))。これは、低いETV2レベル及び適切なERG1及びFLI1レベルを有するrAC-VECクローンが成熟血管運命を達成したrAC-VECの集団に相当し得るという本明細書における観察と一致する。従って、FLI1及びERG1の持続した発現と併せたETV2の一過性発現は、ACの再プログラミングを開始し、次いで最適rAC-VECアイデンティティを確定するために十分であり得る。ETV2産生を制御するためにドキシサイクリン依存性誘導性(「Tet-off」)発現システムを使用して(誘導性ETV2：「iETV2」)、iETV2/FLI1/ERG1をACにおいて形質導入し、そしてTGFβ阻害と共に14日間培養してECアイデンティティへの移行を可能にした(図7a)。次に、FLI1及びERG1の発現を妨害することなく、iETV2発現を抑制するために、細胞をドキシサイクリンで処理した。iETV2/FLI1/ERG1で形質導入されたACは、ドキシサイクリン（Doxy）処理(iETV2抑制)及び未処理細胞の両方において４週を超えてVE-カドヘリン及びCD31の存在を示した。特に、iETV2の発現が停止されたドキシサイクリンでの処理の7日後及び14日後に、未処理のrAC-VECと比較してより高いパーセンテージのVE-カドヘリン⁺CD31⁺ rAC-VECが存在した(図7b)。ウェスタンブロット分析により、iETV2がドキシサイクリン処理細胞において発現停止されていたことが確認され(図7c)、ETV2がrAC-VECにおけるVE-カドヘリン発現を維持するためにもはや必要ではないということを示した。

実施例13. ETV2の抑制及び恒常的FLI/ERG1発現は持続性の安定な成熟rAC-VECを生成する
ERG1は、rAC-VECの成熟化の際にFLI1と相乗作用してCD31発現を増強及び持続し、さらには他の血管特異的遺伝子とも相乗作用することが示された(図3c及び図7b)。従って、再プログラミングにおけるその重要性を、ERG1が存在しない場合にTGFβ阻害ACをiETV2/FLI1で形質導入することによりアッセイした。次いでこれらの細胞を１４日目に２つのフラクションに分け、そのうちの１つをドキシサイクリンで処理して、FLI1発現を撹乱することなくiETV2発現を抑制した。有意な増加が、ERG1形質導入を欠いたACと比較して、iETV2/FLI1/ERG1で形質導入されたACから生成されたVE-カドヘリン⁺CD31⁺ rAC-VECにおいて観察された。iETV2発現が２週間抑制されていた28日目のiETV2/FLI1/ERG1形質導入ACの免疫細胞染色（Immunocytostaining）は、VE-カドヘリン及びCD31の細胞膜における共局在を示したが、これらの細胞のqPCR分析は成熟EC表現型を示す多数のマーカーの発現を示した。これらの細胞の機能性は、インビボ管形成アッセイにより実証された。GFP標識iETV2/FLI1/ERG1形質導入ACを１４日間培養し、その時点でiETV2発現を抑制した。その後、これらの細胞をさらに28日間増殖させ(d42 rAC-VEC)、次いでMatrigelプラグにロードした。プラグをNSGマウスに２週間注入した。Alexa568-イソレクチン-B4の静脈内注射による脈管構造の生体内標識後に、Matrigelプラグを分析のために取り出した(図7d)。免疫蛍光研究は、GFP、ヒトCD31(hCD31)、及びイソレクチン標識細胞が共局在化していることを示し、もはやiETV2を発現しないrAC-VECがなお宿主脈管構造に吻合することができるということが確認された。従って、ECアイデンティティを獲得すると、rAC-VECの血管表現型は、胎仔発生の間のその生理的発現パターンを模倣する調節機構である、ETV2の抑制と併用されるFLI1及びERG1の持続性発現により永久に樹立される。

実施例14. 実施例１〜13に記載される結果の考察
新規ETS-TF駆動プラットフォームはACを耐久性で高度に増殖可能なrAC-VECへと再プログラムする
脈管構造の機能不全は、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、虚血四肢及び糖尿病を含む無数の病理的異常を生じ得る。従って、豊富な生着可能なヒトECの誘導及び増殖は、虚血性疾患及び損傷した器官を有する患者の利益になり得る。しかし、成体ECの精製及び増殖は技術的に煩雑である。さらに、hESCからECを誘導するための現在のストラテジーは、ETS-TFでの形質導入の後でさえ、後生的に不安定であり、かつ限定された増殖能を有するECの生成を生じる(図1e〜1g)。本発明者らは、本明細書において、本明細書ではrAC-VECと呼ばれる高度に増殖性の機能性ECへと再プログラムされ得るヒト系列特異的ACの多用途の代替供給源を同定した。本発明者らは、ETV2の一過性発現及びTGFβ阻害を併用したFLI1/ERG1の強制発現がACをrAC-VECに再プログラムし、このrAC-VECが成熟ECの形態及び持続性の血管新生レパートリーを有していることを示す(図7e)。

ETV2/FLI1/ERG1でのACの形質導入は、血管特徴の完全な誘導を生じるだけでなく、ACにおける非血管プログラムを停止させる。ETS-TFは、接着分子、ECM(細胞外マトリックス)、及びアンジオクライン因子を含む血管機能を確立する鍵となる因子の発現を作動させた
。rAC-VECは高度に増殖性で安定であり、それらの完全な血管新生レパートリーを維持しながら、５０日で6x10⁴倍の増殖を受けることができる。世界中で行われている羊水穿刺の数が増えるにつれて、遺伝的に適合するACが同種適合性rAC-VECを生成するために入手可能になるだろう。従って、HLA型の凍結保存された公開でバンクに保存され得るACは、耐久性があり増殖性かつ生着可能なECへと再プログラムされ得る非血管細胞の理想的な供給源である。

系列特異的類上皮及び間葉ACは、rAC-VECへの再プログラミングを受けやすい
ACの細胞不均一性は特異的細胞マーカーを用いた染色により主に研究されてきた(JEZIERSKI et al., Stem cell reviews, 6：199-214 (2010)； ZHANG et al., Stem cells and development, 18：1299-1308 (2009))。c-Kit⁺細胞は多能性である希少なACの亜集団(1％〜2％)を占めると考えられる(DE COPPI et al., Nature biotechnology, 25：100-106 (2007))。完全ACプールの本明細書での分析は、希少c-Kit⁺亜集団(＜0.5％)の所見を支持するが、ACの大部分(すなわちc-Kit^-細胞)は、系列特異的及び非特異的細胞型の両方を示す様々なマーカーを発現する(図2c)。さらに、本発明者らは、多能性遺伝子OCT4、NANOG、及びSOX2のいずれの機能性発現も観察しなかった。

ACにおける強制ETV2/FLI1/ERG1発現は、AC集団におけるそれらの欠乏のために、そしてETS-TF形質導入なしにrAC-VECを生成しようとする本発明者らの試みは不成功であったので、c-Kit⁺多能性細胞からのみrAC-VECを生成するのではないようである。それにもかかわらず、本明細書に記載される再プログラミングストラテジーは、成熟c-Kit^- ACからrAC-VECを生成する際に有効である。c-Kit欠乏ACのETS-TFの形質導入の４日以内に、移行しているACのほぼ20％がVE-カドヘリンを発現し、これらの全てが最終的にはrAC-VECに転換した。本発明者らはまた、系列特異的EpCAM⁺Tra1-81^-c-Kit^-類上皮AC及びEpCAM^-Tra1-81^-c-Kit^-間葉/線維芽ACの両方がrAC-VECへと転写再プログラムされ得ることを示し、rAC-VECが主にこれらの系列特異的成熟AC集団に由来するものであるという結論を支持した。

いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、非血管遺伝子を発現停止させながら血管特異的遺伝子を作動させるためにETV2、FLI1、及びERG1が他のTFとの相互作用を必要とするということが妥当と思われる。例えば、ETS-TFが胚性組織においてEC特異的遺伝子を作動させる機構は、フォークヘッド転写因子との相互作用を通して媒介される(DE VAL et al., Cell, 135：1053-1064 (2008))。ETV2及びFoxC2の特異的エンハンサーFOX：ETS領域への結合は、EC特定化遺伝子の発現を増加させる。特に、FoxC2はACにおいて恒常的に発現され、そしてその発現はrAC-VECへのETV2/FLI1/ERG1媒介再プログラミングにより維持される。それ故、AC形質導入の４日以内に多数のEC特異的遺伝子を作動させるETV2の顕著な能力は、FoxC2のような優遇（complimentary）転写因子がACにおいて発現されるという事実に起因するのかもしれない。

ETV2/FLI1/ERG1 TFは、非血管遺伝子の発現を停止しながら血管特異的遺伝子を作動させる
ETV2/FLI1/ERG1での形質導入がEC特異的遺伝子の完全な補体（complement）の発現を生じるだけでなく、再プログラミングが非血管AC発現遺伝子を発現停止させるということが本明細書において示された。ゲノム全体の規模では、rAC-VECのトランスクリプトームはプロトタイプの胎仔(HUVEC)及び成体(LSEC)成熟ECと高度に類似しており、そして非血管細胞とは大きく異なるということが、3D-MDS及び階層的樹状図クラスタリング解析により本明細書において示された。

非血管遺伝子の継続的発現はrAC-VECの機能不全を生じ得るので、非血管転写プログラムの永続的発現停止は臨床的に関連性がある。例えば、rAC-VECにおけるカルポニン-1又はケラチン-7のようなAC発現遺伝子の持続発現は、インビボで生着したrAC-VECを血管変
形及び血栓形成しやすくし得る。これに関して、Matrigelプラグ又は再生マウス肝臓類洞血管へのrAC-VECの３ヶ月間の生着は、明らかな血栓症のない開存血管の生成をもたらすことが示された。従って、生着可能なrAC-VECは、凝固促進（pro-coagulation）及び炎症メディエーターを発現停止させ、耐久性のある血管の生成を可能にした。

ACのETS-TF媒介再プログラミングは、VEGFR2を機能させるためにTGFβ阻害を必要とする
TGFβ阻害を伴わないETV2/FLI1/ERG1のACへの形質導入は、機能的な増殖性rAC-VECを生成しなかった。LSECのような特定の型の臓器特異的成体ECと同様に、rAC-VECはTGFβ1、β2、β3及びLTBPだけでなく、TGFβRII及びTGFβRIも発現して恒常的SMAD2リン酸化を生じる。TGFβ受容体シグナル伝達経路の活性化は、rAC-VEC生成を拮抗し得る。TGFβ受容体シグナル伝達はEndo-MTを引き起こし(MEDICI et al., Nat Med 16：1400-1406 (2011)； ZEISBERG et al., Nat Med, 13：952-961 (2007))、それによりrAC-VECの形成を妨害する。TGFβはまたFLI1タンパク質のアセチル化を調節し、FLI1の安定性及びDNAに結合するその能力の減少をもたらす(ASANO et al., Mol Cell Biol 29：1882-1894 (2009))。特に、TGFβシグナル伝達は、成体ECにおけるVEGFR2発現を抑制し(MANDRIOTA et al., J Biol Chem, 271：11500-11505 (1996))、増殖及び血管原性の機能を損なう。従って、rAC-VECの生成は、VEGFR2及びおそらくFLI1、さらには他の未知のEC特異的標的を機能させるためにTGFβ阻害を最初に必要とする(図5)。

ETV2の一過性発現及びTGFβ経路の阻害は、ACのrAC-VECへの長期血管原性再プログラミングを維持するために十分である
大部分の成体ECはETV2を発現しないが、FLI1、ERG1を恒常的に発現する(DE VAL et al., Dev Cell, 16：180-195 (2009))。同様に、２週間のACにおける一過性ETV2発現は、FLI1及びERG1を除いてこれらの下流EC特異的ETS転写の全てを作動させるために十分であった。従って、ETV2は、血管原性遺伝子の完全な誘導を生じるEC特異化の主要制御因子である。１４日間のETV2の一過性発現がACにおけるEC特異的遺伝子の永久的特異化を生じる不可逆的な後生的機構は興味深く、成体線維芽細胞の他の再プログラミングアプローチにより報告されていない。ETV2の発現停止の際に、FLI1／ERG1の強制同時発現及び他のEC特異的ETS転写因子の恒常的発現がEC特異的遺伝子の長期発現を維持するということが妥当と思われる。

ETV2/Fil1/ERG1で形質導入されたACにおいて、２１日間のTGFβシグナル伝達の抑制は、その後VEGFR2の発現及び活性化を維持するために十分である。従って、ACは再プログラミングを受けやすいだけでなく、rAC-VECへの変換後に安定な後成的状態を取り入れる。

ETV2抑制後に、FLI1及びERG1はrAC-VECの長期血管成熟及び静止状態を維持する
ETV2により作動された遺伝子は、VEGFR2、VE-カドヘリン、TIE1、TIE2、EDG-1、VEGFR1及びNotchシグナル伝達経路遺伝子を含む機能的ECへのACの特異化のために必須の因子であった。しかし、ETV2単独では全てのEC遺伝子を作動させるために不十分であった。一方で、FLI1及びERG1は、CD31、ECM、及びアンジオクライン因子のような成熟度と関連するEC遺伝子を作動させる。それ故、FLI1がERG1と共同してこれらの前駆細胞を成熟機能性ECにする遺伝子を誘導する一方で、ETV2は未成熟内皮前駆細胞へとACを特異化する(図7e)。

rAC-VECにおけるETV2の発現停止の際に、FLI1及びERG1はECアイデンティティを保つ。実際に、成体ECにおけるFLI1遺伝子の欠失は、ECアイデンティティを調節する血管特異的遺伝子の下方調節を生じる(Asano et al., Am J Pathol 176：1983-1998, 2010)。従って、本明細書において実証されるように、FLI1の恒常的発現はRAC-VECの安定化において影響力の大きい役割を果たす。同様に、ERGはまた、NF-kBの活性を抑制することにより(DRYDEN et al., J Biol Chem, 287：12331-12342 (2012)； YUAN et al., Circ Res, 104：1049-1057 (2009))、そしてクローディン5(YUAN et al., J Biol Chem, 287：6582-6591 (2012))及びVE-カドヘリン((BIRDSEY et al., Blood, 111：3498-3506 (2008))の発現を強制することにより血管透過性を保護することにより、ECの静止状態を維持し得る。

FLI1及びERGは造血細胞の特異化に関与していた(De Val and Black, Dev Cell 16：180-195, 2009； Lee et al., Cell stem cell 2：497-507, 2008)。しかし、本明細書において示されるように、(TGFβ阻害と共に)FLI1/ERG1と併せたETV2の組み合わせの形質導入は、造血特異的遺伝子(すなわち、CD45、トロンボポエチン受容体)をrAC-VECにおいて誘導しなかった。特に、EC及び造血細胞の両方において同時発現されるSCL/TAL1、VAV3、及びLMO2遺伝子は、ETV2/FLI1/ERG1により誘導された。さらに、真の造血細胞の誘導は、他のTF(すなわち、RUNX1、PU.1)の導入を必要とするかもしれず、これらはACでは発現されない。従って、ETV2の一過性発現は、新生rAC-VECの移行を血管運命に向ける造血特異化のFLI1/ERG1偏向を変更し得る。

本発明者らは、成熟ECにおいて、ERG1がERG2転写物より５倍多くまで発現されながら、ERGが少なくとも２つのアイソフォーム(ERG1及びERG2)で発現されるということを見出した。さらに、初期のスクリーニングによりERG1がERG2と比較してCD31の発現を加速するということが実証されたので、本発明者らは、ACを成熟rAC-VECへと駆り立てるためにERG1に重点を置いた。ERG1に加えてERG2の同時発現がrAC-VECに対する血管アイデンティティの強制において生理的役割を果たすかどうかは未知である。

FLI1及びERG1の恒常的発現は悪性変換と関連しない
FLI1の異常な発現は白血病(CUI et al., Leukemia, 23：1311-1319 (2009))及びユーイング肉腫(ZHANG et al., Oncogene, 8：1621-1630 (1993))を誘導し得る。ERG過剰発現及び融合タンパク質はまた、白血病を含む様々な悪性疾患と関連があった(MARTENS et al.,
Int J Biochem Cell Biol, 43：1413-1416 (2012))。しかし、本明細書において示されるように、Matrigelプラグにおける14日間又は再生肝臓における３ヶ月間のFLI1及びERG1を発現するrAC-VECのインビボ移植は、悪性疾患の発生と関連していなかった。CGHを使用して、我々はまた、28日を超えるrAC-VECの増殖がいずれの染色体異常とも関連がないということを示した。８０日を超えるrAC-VECの長期増殖は、悪性変換、血管腫又は血管肉腫の発生のいずれの証拠も示さなかった。従って、rAC-VECは、治療的介入のための血管細胞の安全な供給源を提供する安定かつ増殖可能な細胞集団を表す。

AC内のETS-TFの比の最適化は増殖性成熟rAC-VECクローンの収量を増加させる
FLI1及び／又はERG1での１つだけの形質導入は、ECアイデンティティをACに付与しないだけでなく、これらの細胞の増殖の支持において効果がない。クローン分析に基づいて(図3c〜3e)、Fil1及びERG1に対するETV2の適切な化学量論比が、培養において８０日間増殖する能力に恵まれた成熟かつ増殖性のrAC-VECの生成に対する鍵であることが見出された。

21日までのrAC-VECがそれらの最大成熟度を達成した時点で、クローン-3のような理想的なrAC-VECのクローン効率は約20％である。この効率は、様々なETS-TFでのAC形質導入に使用される技術がさらに最適化されるにつれて改善され得る。全ゲノム3D-MDS解析は、クローン-3及び他の類似したクローン(すなわちクローン-4)のトランスクリプトームがHUVEC及びLSECのトランスクリプトームと一致するということを実証した。特定のrAC-VECクローンの顕著な増殖能は、AC内のこれらのETS-TFの最適な組み合わせ比が十分な成熟かつ安定なrAC-VECを生成する重要な決定因子であるということを示唆する。

治療的血管新生のためのrAC-VECの潜在的使用
臓器特異的ECは独特の分子及び表現型特徴に恵まれている。微小環境の合図は、ECに臓器特異性を付与するための主要な役割を果たし得るが、TFもまたこのプロセスにおいて役割を果たし得る。ACから生成された再プログラムされたrAC-VECは、成熟成体ECの分子プロフィールを有する。再プログラムされたrAC-VECの遺伝子レパートリーは、HUVEC及LSECのような一般的なインビトロ培養ECの遺伝子レパートリーに近い。実際に、静的培養条件でのいずれかの臓器特異的ECのインビトロ増殖は、内因性臓器特異的血管表現型の部分的抹消を生じる。そのため、他の成体ECと同様に、再プログラムされたrAC-VECは、所定の臓器の微小環境中に再導入されるとさらなる組織特異的特異化を受けるかもしれない。最終的に、ECに組織特異的特徴を付与する特定の転写因子の同定は、その特定の臓器の生理的必要性に適合するrAC-VECの生成を可能にするだろう。本発明者らは、HLA型及び同種適合の可能性を有し、豊富な機能性rAC-VECへの再プログラミングを受けやすいヒト系列特異的増殖性細胞の容易に入手可能な供給源を同定した。rAC-VECの生成は、虚血組織の血管新生に門戸を開く。米国のみで毎年何千件もの羊水穿刺が行われ、このことは、十分な遺伝的に適合するACが、民族的に多様性の集団の広範な断面に利益になり得るrAC-VECへの再プログラミングに利用可能であることを確実にする。HLA適合ACの公開バンク保存の可能性を考えると、これらの細胞は、血管障害を有する患者の遺伝的に多様な集団の処置のための豊富な血管細胞を生成するための細胞目録を確立し得る。

Claims (12)

1. ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の存在下で少なくとも２０〜２１日間羊水細胞を培養し、ここで羊水細胞は、転写因子ＥＴＶ２、ＦＬＩ１及びＥＲＧの発現を達成するように該転写因子をコードする核酸を含むベクターを用いて形質導入され、羊水細胞は、最初の１３〜１５日間ＥＴＶ２を発現し、そしてＦＬＩ１及びＥＲＧは、恒常的に発現し、それにより内皮細胞を得ることを含む、内皮細胞を生成する方法。
2. ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤が、Ｉ型ＴＧＦβ受容体に特異的な阻害剤である、請求項１に記載の方法。
3. 前記阻害剤が、Ｉ型ＴＧＦβ受容体の可溶性形態を含むポリペプチド、Ｉ型ＴＧＦβ受容体若しくはリガンドに特異的な抗体、又は小分子化合物である、請求項２に記載の方法。
4. 前記阻害剤が、ＳＢ−４３１５４２、Ａ ８３−０１、Ｄ ４４７６、ＬＹ ３６４９４７、ＳＢ ５２５３３４、ＳＤ ２０８、及びＳＪＮ ２５１１から選択される小分子化合物である、請求項３に記載の方法。
5. 前記阻害剤がＳＢ−４３１５４２である、請求項４に記載の方法。
6. 羊水細胞が少なくとも２８日間の総期間の間培養される、請求項１に記載の方法。
7. 羊水細胞が少なくとも４２日間の総期間の間培養される、請求項１に記載の方法。
8. ＥＲＧがＥＲＧ１である、請求項１に記載の方法。
9. 表面マーカーＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１及びＶＥＧＦＲ２の発現を特徴とする内皮細胞が単離される、請求項１に記載の方法。
10. 表面マーカーＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１及びＶＥＧＦＲ２の発現を特徴とし、ＦＬＩ
    １、ＥＴＶ２及びＥＲＧをコードする外因的に導入された核酸を含む、羊水細胞由来内皮細胞の集団。
11. ヒト被験体において損傷した組織を修復するための請求項１０に記載の羊水細胞由来内皮細胞の集団及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む組成物。
12. ヒト被験体において腫瘍を処置するための請求項１０に記載の羊水細胞由来内皮細胞の集団及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む組成物。