JP6446134B2 - 癌幹細胞治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、グルコース吸収抑制剤（ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）およびカルシウムポンプ抑制剤（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む癌幹細胞治療用組成物に関する。

最近活発に開発され抗癌治療に実質的に使用されている抗癌剤のほとんどは、速やかに増殖する癌細胞を標的とする薬物が大部分である。このような薬物を用いた抗癌治療の場合、初期には効果的に癌細胞が死滅して癌が治ると見られるが、結局、体内に残っている癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は除去できず癌の再発および／または転移が活発に起こり、結局、既存の抗癌療法に対する耐性を示す問題点がたびたび発生しているため、最近、癌幹細胞への関心が高まっている。癌幹細胞は、一般的な幹細胞と類似して、無制限の再生能力を有する癌細胞で、一般的な癌細胞とは異なってゆっくり増殖し、幹細胞特有の能力である自己再生や分化能力を有している癌細胞であって、従来知られている癌細胞と異なる機序（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を有することが知られているが、まだ癌幹細胞に対する研究は活発に行われておらず、特に癌幹細胞を標的とする癌幹細胞治療用薬物に対する研究はほぼ皆無であるのが現状である（韓国出願特許第１０−２０１１−００６６０３５号）。

このように、癌幹細胞に効果的な癌幹細胞治療用組成物の開発は、癌の治療効果を高められるだけでなく、癌の再発および／または転移を抑制できる効果的な治療方法になると期待される。

本発明は、上記の従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、グルコース吸収抑制剤（ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）およびカルシウムポンプ抑制剤（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む癌幹細胞治療用組成物を提供することを目的とする。

しかし、本発明がなそうとする技術的課題は、以上に言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。

以下、本願に記載された多様な具体例が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物、および工程などが記載されている。しかし、特定の具体例は、これらの特異的詳細事項の一つ以上なく、または他の公知の方法および形態とともに実行できる。他の例において、公知の工程および製造技術は、本発明を不必要に曖昧にしないようにするために、特定の詳細事項として記載されない。「一具体例」または「具体例」に対する本明細書全体にわたる参照は、具体例と結び付けて記載された特別な特徴、形態、組成または特性が本発明の一以上の具体例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一具体例において」または「具体例」の状況は、必ずしも本発明の同一の具体例を示すものではない。追加的に、特別な特徴、形態、組成、または特性は、一以上の具体例において、何らかの適した方法で組み合わされる。

本明細書において、「癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、幹細胞特有の能力である自己再生や分化能力を有している包括的な意味の癌細胞を意味する。前記癌幹細胞は、正常な腫瘍の生長条件（前記「正常な腫瘍の生長条件」とは、細胞の成長に必要な営養分（ブドウ糖）が十分で腫瘍微細環境の生長条件が豊かで細胞ストレスのない状態を指し示す。）で、一般的な癌細胞とは異なって遅い速度で増殖したり、休止期（ｄｏｒｍａｎｔ ｓｔａｔｅ）状態を維持して抗癌剤に対する抵抗性を有していることがあり、例えば、ＰＧＣ−１αなどの転写調節因子の発現が正常な腫瘍細胞と異なって統制され、主要代謝調節物質の機能が一般的な癌細胞と比較して異なることがある。このような異なる代謝調節能力とこれに機序的に連携された細胞信号伝達系の調節により、栄養欠乏状態で細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する抵抗性を獲得し、浸潤および／または転移能がある細胞を包括的に指し示す。しかし、一般的な癌細胞に分化できる細胞であれば、これに制限はない。

本発明は、グルコース吸収抑制剤（ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）およびカルシウムポンプ抑制剤（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を有効成分として含む、癌幹細胞成長抑制用組成物または癌幹細胞治療用薬学組成物を提供する。

本発明の一具体例において、前記グルコース吸収抑制剤は、好ましくは、グルコース誘導体（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）であり、より好ましくは、２−脱酸ブドウ糖（２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ、２ＤＧ）や、細胞のエネルギー源である糖の吸収を制限して栄養欠乏状態および／または代謝エネルギー枯渇関連の小胞体ストレス状態を誘導して細胞の成長を抑制し、癌幹細胞で原形質膜カルシウム−ＡＴＰアーゼ（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃａ^２＋ ＡＴＰａｓｅ、ＰＭＣＡ）の発現を誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）する化合物であれば、これに制限はない。前記誘導体とは、グルコースの一部を変化させて得られる類似の化合物であって、正常グルコースと競争的に作用して糖の吸収を抑制する化合物を意味する。

本発明の他の具体例において、前記カルシウムポンプ抑制剤は、好ましくは、原形質膜カルシウム−ＡＴＰアーゼ（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃａ^２＋ ＡＴＰａｓｅ、ＰＭＣＡ）の抑制剤、ＣａＭＫ−２α（Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ−２ａｌｐｈａ）の抑制剤などであり、より好ましくは、カロキシン（ｃａｌｏｘｉｎ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、ＫＮ６２（１−［Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｙｌ］−４−ｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、ＣａＭＫ−２αに特異的に結合するｓｉＲＮＡなどであってもよいが、癌幹細胞の細胞内カルシウム濃度を調節する能力を抑制できる物質であれば、これに制限はない。前記ＰＭＣＡの抑制剤とは、ＰＭＣＡの活性を抑制して細胞の外部にカルシウムを放出することを抑制できる物質を意味する。

本発明のさらに他の具体例において、前記組成物は、ビグアナイド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系化合物を追加的に含んでもよい。前記ビグアナイド系化合物は、好ましくは、ビグアナイド系糖尿病治療剤であり、より好ましくは、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、フェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）、ブホルミン（ｂｕｆｏｒｍｉｎｅ）などであってもよいが、細胞内エネルギー生成を妨げて栄養欠乏類似状態を誘導するビグアナイド系化合物であれば、これに制限はない。

本発明のさらに他の具体例において、前記癌は、好ましくは、乳癌、子宮癌、胃癌、脳癌、直膓癌、大膓癌、肺癌、皮膚癌、卵巣癌、腎臓癌、血液癌、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌、肝臓癌などであってもよいし、より好ましくは、乳癌であってもよいが、腫瘍の分化および／または増殖などの癌の進行が本発明で記述する癌幹細胞に依存的な癌の種類であれば、これに制限はない。

前記癌幹細胞治療用薬学組成物は、追加的に他の抗癌剤と併用投与することができ、これにより、効果的に癌幹細胞だけでなく、一般的な癌細胞まで治療するのに使用可能であり、前記薬学組成物は、癌の再発または転移抑制用薬学組成物としても使用可能である。

本発明において、前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末、または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とすることができる。前記薬学組成物は、これらに限定されるものではないが、それぞれ、通常の方法により、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤、および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用可能である。本発明の薬学組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造される。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。

一方、製剤化に適した担体、賦形剤、および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、または鉱物油などが使用されてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含んでもよい。

本発明に係る薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、泄下、または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。本願に使用された用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内、および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与されてもよい。

本発明の薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合、および予防または治療される特定疾患の重症度を含む様々な要因により多様に変化可能であり、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路、および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択され、１日０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、または０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明に係る医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化されてもよい。

本発明に係るグルコース吸収抑制剤（ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）およびカルシウムポンプ抑制剤（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む癌幹細胞治療用組成物は、グルコース吸収抑制剤と、追加的にビグアナイド系薬物を用いて癌幹細胞に栄養欠乏および代謝エネルギー枯渇関連の小胞体ストレス状態を誘導し、これにより、癌幹細胞でＰＭＣＡの発現を誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）させ、カルシウムポンプ抑制剤を併用投与することによって、癌幹細胞が有するＣａ^２＋関連細胞死滅に対する抵抗性を低下させて癌幹細胞の死滅を誘導することで、効果的な癌幹細胞の治療剤として使用可能であり、これにより、多様な癌幹細胞を効果的に治療して癌の再発および／または転移を効果的に抑制できると期待される。

本発明の一実施例によるｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株のグルコース欠乏状態における生存率をクリスタルバイオレット染色法で確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株のグルコース欠乏状態における生存率をΜＴΤ ａｓｓａｙで確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ結果を示す図である。 本発明の一実施例による免疫学的分析結果を示す図である。 本発明の一実施例による細胞周期分析結果を示す図である。 本発明の一実施例による細胞内部のＣａ^２＋量を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＣａＭＫ−２αの発現量を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＣａＭＫ−２αの発現が抑制された細胞株の細胞内部のＣａ^２＋量を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＣａＭＫ−２αの発現が抑制された細胞株におけるＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＣａＭＫ−２αの発現が抑制された細胞株における免疫学的分析結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＣａＭＫ−２αの発現が抑制された細胞株における細胞周期分析結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＰＧＣ−１αとＣａＭＫ−２αとの関連関係を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＰＧＣ−１αの発現が抑制された細胞株における細胞内部のＣａ^２＋量を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＰＧＣ−１αとＰＭＣＡ１との結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）関係をＥＭＳＡで確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＰＧＣ−１αとＰＭＣＡ２との結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）関係をＥＭＳＡで確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による栄養欠乏状態におけるＰＭＣＡの発現量を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＣａＭＫ−２αの発現が抑制された細胞株におけるＰＭＣＡの発現量を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるカルシウムポンプ抑制剤の効果を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による乳癌動物モデルにおける蛋白質の発現を免疫化学染色で確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による乳癌動物モデルにおいて併用投与による抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による癌細胞と癌幹細胞との遺伝子発現の差を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による癌細胞と癌幹細胞のカルシウム調節関連蛋白質の発現をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による癌幹細胞のカルシウムイオン調節機序を簡略に示す模式図である。 本発明の一実施例による時間に応じたＣａＭＫ−２α信号伝達機序の変化を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるｐＮＦ−ｋＢの役割を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ結果を示す図である。 本発明の一実施例によるウェスタンブロッティングの結果を示す図である。 本発明の一実施例による細胞の生存率を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による癌幹細胞に基づく動物モデルの癌の生長を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による癌幹細胞に基づく動物モデルの蛋白質の発現量を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による癌幹細胞に基づく動物モデルの蛋白質の発現量を確認した結果を示す図である。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

〔実施例１〕癌幹細胞の作製
癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を調製するために、乳癌細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＣＦ−７細胞株のそれぞれの親細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ）であるｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とｐ−ＭＣＦ−７を長期間栄養欠乏状態を誘導して栄養欠乏状態で細胞死滅を回避し生存した細胞（ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびｓ−ＭＣＦ−７）を選別して、通常の癌幹細胞特異的生物学的特性の分析により検証後、癌幹細胞を作製した。癌幹細胞の機序究明および癌幹細胞を抑制できる治療剤の開発のために、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とｓ−ＭＣＦ−７細胞にそれぞれｓｈＰＧＣ−１αｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、ｓｈＰＧＣ−１αを安定的に発現する幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）であるｓｓｈＰＧＣ−１α−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とｓ−ｓｈＰＧＣ−１α−ＭＣＦ−７をそれぞれ作製して実験に使用した。それぞれの細胞株は、１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）が含まれたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。

〔実施例２〕癌幹細胞のグルコース欠乏状態における生存率の確認
グルコース欠乏状態（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）で癌細胞と癌幹細胞の生存率を比較するために、実施例１と同様の方法で用意したｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ｐ−ＭＣＦ−７、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株を、９６ウェルプレートに５Ｘ１０^３／１００ｕＬの濃度となるようにそれぞれ添加し、培養容器面積の７０％程度になるまで培養した後に、グルコースが欠乏している１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地に交換して、３日間追加培養した。そして、それぞれ０、１２、２４、３６、４８、６０、および７２時間に細胞の生存率を確認した。細胞の生存率は、クリスタルバイオレット染色（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ）およびＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）ａｓｓａｙにより確認した。クリスタルバイオレット染色結果は図１に示し、ΜＴΤ ａｓｓａｙ結果は図２に示した。

図１に示されているように、クリスタルバイオレットで染色して培養容器の表面に付着している細胞の数を確認した結果、癌幹細胞であるｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株の場合に、親細胞のｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびｐ−ＭＣＦ−７と比較して著しく高い生存率を示すことを確認した。

また、図２に示されているように、培養初期段階（１２時間培養後）では、癌幹細胞と一般的な癌細胞との生存率には有意な差を示していないが、培養後期段階（４８時間培養後）へいくほど癌幹細胞と一般的な癌細胞との生存率には著しい差を示すことを確認した。特に、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株の場合には、癌細胞と癌幹細胞との間の生存率が４０％以上差が生じることを確認した。

前記結果を通して、癌幹細胞の場合、グルコース不足状態、すなわち、栄養欠乏状態で一般的な癌細胞と比較して高い生存率を示すことを確認し、これにより、癌幹細胞は、栄養欠乏状態、すなわち、エネルギー不足状況に対する高い抵抗性を有していることを確認できた。

〔実施例３〕癌幹細胞の細胞死滅抵抗性の確認
（３．１．ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ）
癌幹細胞が栄養欠乏状態で高い生存率を示す原因が細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する抵抗性によるかを確認するために、実施例２と同様の方法により、グルコース欠乏状態で４０時間培養したｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ｐ−ＭＣＦ−７、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株をそれぞれ回収して、ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙを実施した。ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙは、回収された細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて４８時間固定させた後に、Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ ｅｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）ｋｉｔを用いてプロトコルに従って染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察しながら、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ Ｉｍａｇｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍを用いて蛍光イメージを分析した。その結果は図３に示した。

図３に示されているように、一般的な癌細胞であるｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびｐ−ＭＣＦ−７細胞株では、細胞死滅によるＤＮＡ断片化（ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）が多数の細胞で観察されたが、癌幹細胞のｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株では、ＤＮＡ断片化が生じた細胞の数が少ないことを確認した。これにより、癌幹細胞は、栄養欠乏状態で誘発される細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対して抵抗性を有していることを確認でき、これにより、栄養欠乏状態でも高い生存率を示すことを確認できた。

（３．２．免疫学的分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ））
癌幹細胞が栄養欠乏状態で高い生存率を示す原因である細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する抵抗性に細胞死滅関連の蛋白質が関与するかを確認するために、実施例２と同様の方法により、グルコース欠乏状態で４０時間培養したｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ｐ−ＭＣＦ−７、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株をそれぞれ回収して、免疫学的分析を実施した。回収された細胞は、冷たいＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）緩衝溶液を用いて２回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝溶液を用いて細胞を溶解させて蛋白質を分離し、分離された蛋白質は、後の実験のためにＢＣＡ ａｓｓａｙにより蛋白質の量を測定した。そして、それぞれの細胞株から獲得した蛋白質２０ｕｇを８−１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）を用いて分離し、電気を利用してＰＶＤＦ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移動させた。蛋白質の移動したＰＶＤＰ膜は、５％脱脂粉乳を用いて室温で１時間処理した後に、ｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−７、Ｂｃｌ−２、およびｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ（対照群、ｃｏｎｔｒｏｌ）に対するそれぞれの一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とともに４℃で１６時間反応させた。抗体と反応させたＰＶＤＰ膜は、ＴＢＳＴ溶液を用いて３回洗浄して結合していない一次抗体を除去し、ＨＰＲの結合されている二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と室温で１時間追加反応させた。反応が完了した後に、ＴＢＳＴ溶液を用いて洗浄して二次抗体をすべて除去し、ＥＣＬ溶液を処理し、３分間反応させた後に、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ Ｆｉｌｍで現像した。その結果は図４に示した。

図４に示されているように、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株では、活性化されたｃａｓｐａｓｅ（ｃｌｅａｖｅｄ ｆｏｒｍ）３および７の量がすべて減少し、ｓ−ＭＣＦ−７では、活性化されたｃａｓｐａｓｅ７および９の量がすべて減少することを確認し、前記結果を通して、栄養欠乏状態における癌幹細胞は、細胞死滅マーカーとして知られているｃａｓｐａｓｅの発現およびオートファジー細胞死滅（ａｕｔｏｐｈａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）関連物質であるｐ６２およびＬＣ３Ｂが減少することを確認し、逆に、抗細胞死滅マーカー（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｍａｒｋｅｒ）として知られているＢｃｌ−２の発現が増加して、栄養欠乏状態で生存能力が増加することを確認できた。

（３．３．細胞周期分析（Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ））
癌幹細胞の、栄養欠乏状態における細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が誘発されるかを確認するために、実施例２と同様の方法により、グルコース欠乏状態で１２時間（初期、ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ）および４０時間（後期、ｌａｔｅ ｐｈａｓｅ）培養したｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ｐ−ＭＣＦ−７、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株をそれぞれ回収して、細胞周期分析を実施した。回収された細胞は、７０％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）を用いて固定させた後に、４０ｕｇ／ｍＬ ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）と１００ｕｇ／ｍＬのＲＮａｓｅとが混合されているＰＢＳ緩衝溶液で３０分間反応させてｔｏｔａｌ ＤＮＡをすべて染色し、染色した細胞の細胞周期分析は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて観察した。Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期にある細胞の割合（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）は、ＦＡＣＳおよびＤＮＡ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ（ＦｌｏｗＪｏ）を用いて測定した。その結果は図５に示した。

図５に示されているように、初期段階（ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ）では、一般的な癌細胞と癌幹細胞とで細胞周期により有意な差を示していないのに対し、後期段階（ｌａｔｅ ｐｈａｓｅ）では、癌幹細胞でｓｕｂ−Ｇ０／Ｇｌ期の細胞数が著しく減少したことを確認した。前記結果を通して、栄養欠乏状態の後期段階で、一般的な癌細胞の場合には細胞死滅が増加したのに対し、癌幹細胞の場合には細胞死滅が減少したことを確認できた。

前記結果を通して、癌幹細胞は、栄養欠乏状態で一般的な癌細胞と比較して細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する抵抗性（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を有していて、栄養欠乏状態でも高い生存率を示すことを確認できた。

〔実施例４〕癌幹細胞の細胞死滅抵抗性の原因の確認
（４．１．細胞内部のＣａ^２＋量の確認）
細胞死滅が起こる多くの細胞の場合、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）から細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）にＣａ^２＋が分泌したり、原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して細胞の内部にＣａ^２＋が流入する現象が生じて細胞内部のカルシウム濃度が維持されないことから、癌幹細胞でもＣａ^２＋の移動現象が生じるかを確認するために、実施例３と同様の方法により、栄養欠乏状態の細胞株を用意した後に、カルシウム染色剤のｆｕｒａ−２−ＡＭを用いて細胞内部のＣａ^２＋量を確認した。その結果は図６に示した。

図６に示されているように、初期段階では、一般的な癌細胞と癌幹細胞との細胞内部のＣａ^２＋量は大きな差を示していないが、後期段階では、癌幹細胞の細胞内部のＣａ^２＋量が一般的な癌細胞と比較して高いことを確認した。

（４．２．ＣａＭＫ−２α（Ｃａ^２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ−２ａｌｐｈａ）の発現量の確認）
癌幹細胞の細胞内部のＣａ^２＋量が一般的な癌細胞と比較して高い理由を確認するために、ＣａＭＫ−２αの発現量をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を利用して確認した。ウェスタンブロッティングは、実施例３．２と同様の方法で実施した。その結果は図７に示した。

図７に示されているように、癌幹細胞では、初期および後期段階ともにおいてＣａＭＫ−２αの発現量が増加したことを確認し、前記結果を通して、癌幹細胞では、ＣａＭＫ−２αの発現量が増加し、栄養欠乏および代謝エネルギーストレス状態で小胞体から細胞の内部に遊離されたＣａ^２＋量を適正水準に調節して、細胞死滅に対する抵抗性を有することを確認できた。

（４．３．ＣａＭＫ−２α（Ｃａ^２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ−２ａｌｐｈａ）の発現抑制効果の確認）
癌幹細胞のＣａＭＫ−２αの発現を抑制する場合の効果を確認するために、それぞれの細胞株にバイオニアから購入したＣａＭＫ−２α ｓｉＲＮＡを形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、ＣａＭＫ−２αの発現が抑制された癌幹細胞株を作製した。そして、実施例４．１および４．２と同様の方法でＣａＭＫ−２αの発現量および細胞内部のＣａ^２＋量を測定した。その結果は図８に示した。

図８に示されているように、ＣａＭＫ−２αの発現が抑制された癌幹細胞では、細胞内部のＣａ^２＋量が減少しないことを確認し、前記結果を通して、癌幹細胞でのＣａＭＫ−２αの発現は、細胞内部のＣａ^２＋量を維持するのに重要な役割を果たすことを確認できた。

また、ＣａＭＫ−２αの発現が抑制された癌幹細胞株を用いて、実施例３と同様の方法でＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ、免疫学的分析、および細胞周期分析を実施した。その結果はそれぞれ図９〜図１１に示した。

図９に示されているように、栄養欠乏状態で癌幹細胞は一般的に細胞死滅に対する抵抗性を示すが、ｓｉＲＮＡを用いてＣａＭＫ−２αの発現を抑制させた癌幹細胞の場合には、一般的な癌細胞と同じく、細胞死滅が誘発されてＤＮＡ断片化が誘発されたことを確認した。

図１０に示されているように、ＣａＭＫ−２αの発現が抑制された癌幹細胞の場合には、一般的な癌細胞と同じく、栄養欠乏状態で活性化されたｃａｓｐａｓｅの量が再び増加し、Ｂｃｌ−２の発現量は減少することを確認した。また、リン酸化されたＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、リン酸化されたＩｋＢ（ｐＩｋＢ）、およびリン酸化されたＮＦ−ｋＢ（ｐＮＦ−ｋＢ）の量は減少することを確認し、カルシウムイオンの分泌通路であるＩＰ３Ｒは増加することを確認した。

前記結果を通して、癌幹細胞のＣａＭＫ−２αの発現を抑制させると、癌幹細胞の栄養欠乏状態における細胞死滅に対する抵抗性が減少して、一般的な癌細胞と類似の結果を示すことを確認できた。

図１１に示されているように、ＣａＭＫ−２αの発現が抑制された癌幹細胞の場合には、一般的な癌細胞と同じく、後期段階でｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期の細胞の割合が増加したことを確認し、これにより、栄養欠乏状態で癌幹細胞の細胞死滅が増加したことを確認できた。

前記結果を通して、癌幹細胞は、栄養欠乏状態でＣａＭＫ−２αの発現量を増加させて細胞内部のＣａ^２＋量を適正水準に調節することによって、Ｃａ^２＋関連細胞死滅（Ｃａ^２＋ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する抵抗性を有し、癌幹細胞のＣａＭＫ−２αの発現を抑制すると抵抗性を失うことを確認できた。

（４．４．ＰＧＣ−１α（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ１）とＣａＭＫ−２αとの関連関係の確認）
従来栄養欠乏状態で発現が調節されると知られているＰＧＣ−１αがＣａ^２＋関連細胞死滅に対する抵抗性と関係があるかを確認するために、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株にｓｈ−ＰＧＣ−１αベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、ＰＧＣ−１αの発現を抑制させた癌幹細胞株を作製し、実施例３．２と同様の方法で免疫学的分析を実施した。その結果は図１２に示した。

図１２に示されているように、ＰＧＣ−１αの発現が抑制された癌幹細胞では、初期および後期段階でＣａＭＫ−２αの発現も抑制され、一般的な癌細胞と同じく、栄養欠乏状態でＢｃｌ−２の発現およびｐＡＫＴおよびｐＮＦ−ｋＢの発現が減少することを確認できた。また、小胞体から分泌したＣａ^２＋を細胞の外部に排出させるのに関与すると知られているＰＭＣＡ（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃａ^２＋ ＡＴＰａｓｅ）蛋白質の発現も減少することを確認した。

前記結果を通して、ＰＧＣ−１αの発現が抑制された癌幹細胞では、ＣａＭＫ−２αの発現およびＰＭＣＡの発現が抑制されることを確認したため、細胞内部のＣａ^２＋量にはどのような変化があるかを確認するために、実施例４．１と同様の方法でＣａ^２＋量を確認した。その結果は図１３に示した。

図１３に示されているように、栄養欠乏状態の初期段階では有意な差を示していないが、後期段階では、ＰＧＣ−１αの発現が抑制された癌幹細胞では細胞内部のＣａ^２＋量が増加し、細胞死滅が起こることを確認した。

前記結果を通して、栄養欠乏状態の時、癌幹細胞ではＰＧＣ−１αの発現が増加してＣａＭＫ−２αの発現を誘導し、これにより、細胞内部のＣａ^２＋量を適正水準に維持させることによって、Ｃａ^２＋関連細胞死滅（Ｃａ^２＋ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する抵抗性を有することを確認でき、癌幹細胞が栄養欠乏状態で生存率が増加するのにはＰＧＣ−１αが重要な役割を担うことを確認できた。

〔実施例５〕癌幹細胞におけるＰＧＣ−１αの役割の確認
（５．１．ＰＧＣ−１αとＰＭＣＡ１との結合関係の確認）
ＰＧＣ−１αとＰＭＣＡ１との関連関係を確認するために、ＥＭＳＡ ｋｉｔを用いてプロトコルに従ってＥＭＳＡ ａｓｓａｙを実施した。結合配列（ｐｒｏｂｅ）としては、ＰＭＣＡ１のプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の結合部位配列である「ＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＣＡ」を使用した。その結果は図１４に示した。
図１４に示されているように、後期段階の癌幹細胞では、ＨＮＦ４α、ＰＧＣ−１α、およびＤＮＡ（ｐｒｏｂｅ）との結合が増加するのに対し、一般的な癌細胞や、ＰＧＣ−１αの発現が抑制された癌幹細胞では結合が減少することを確認した。前記結果を通して、栄養欠乏状態でＰＧＣ−１αがＨＮＦ４αと結合してＰＭＣＡ１のプロモーター部位に結合してＰＭＣＡ１の発現を調節することを確認できた。

（５．２．ＰＧＣ−１αとＰＭＣＡ２との結合関係の確認）
ＰＧＣ−１αとＰＭＣＡ２との関連関係を確認するために、ＥＭＳＡ ｋｉｔを用いてプロトコルに従ってＥＭＳＡ ａｓｓａｙを実施した。結合配列（ｐｒｏｂｅ）としては、ＰＭＣＡ２のプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の結合部位配列である「ＣＴＧＧＡＡＡＴＡＣＣＣＣ」を使用した。その結果は図１５に示した。

図１５に示されているように、栄養欠乏状態の癌幹細胞では、ＮＦ−ｋＢ、ＰＧＣ−１α、およびＤＮＡ（ｐｒｏｂｅ）の結合が増加し、ＮＦ−ｋＢに対する抗体であるａｎｔｉ−ｐ６５またはａｎｔｉ−ｐ５０を追加的に入れた場合には、抗体が追加的に結合してｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔが起こることを確認した。前記結果を通して、栄養欠乏状態でＰＧＣ−１αがＮＦ−ｋＢと結合し、ＰＭＣＡ２のプロモーター部位に結合してＰＭＣＡ２の発現を調節することを確認できた。

（５．３．ＰＭＣＡと栄養欠乏状態との関連関係の確認）
栄養欠乏状態でＰＭＣＡの発現量の変化を確認するために、実施例２と同様の方法により、栄養欠乏状態でそれぞれの細胞株を培養し、培養時間に応じてｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。それぞれの時間に回収した細胞は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてプロトコルに従ってＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡ１ｕｇを用いて、ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。使用したプライマー配列を表１に記載した。その結果は図１６に示した。また、ＣａＭＫ−２αの発現を抑制させた細胞株を用いて同様の実験を実施した結果は図１７に示した。

図１６に示されているように、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株では、培養時間が増加するに伴ってＰＭＣＡ１およびＰＭＣＡ２の発現が増加し、ｓ−ＭＣＦ−７細胞株では、ＰＭＣＡ１、ＰＭＣＡ２、およびＰＭＣＡ４の発現が増加することを確認した。また、図１７に示されているように、ＣａＭＫ−２αの発現が抑制された細胞株の場合には、癌幹細胞とは異なって、栄養欠乏状態でＰＭＣＡの発現量が増加しないことを確認した。

（５．４．ＰＭＣＡ抑制効果の確認）
栄養欠乏状態でＰＭＣＡを抑制した時、癌幹細胞のカルシウム濃度調節能力が変化するかを確認するために、原形質膜でＣａ^２＋−ＡＴＰアーゼ（ｃａｌｃｉｕｍ ＡＴＰａｓｅ）として作用するＰＭＣＡの抑制剤でカルシウムポンプ抑制剤（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるカロキシン（ｃａｌｏｘｉｎ）を使用し、小胞体でＣａ^２＋−ＡＴＰアーゼ（ｃａｌｃｉｕｍ ＡＴＰａｓｅ）として作用するＳＥＲＣＡ（ｓａｒｃｏ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ）の抑制剤であるタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）を用いてＰＭＣＡまたはＳＥＲＣＡの活性を抑制させた後に、癌幹細胞における細胞外Ｃａ^２＋量の変化を測定した。その結果は図１８に示した。

図１８に示されているように、カルシウムポンプ抑制剤のカロキシンを処理すると、癌幹細胞の細胞外カルシウム濃度が低くなることを確認し、細胞の生存率も一般的な癌細胞と同じく減少することを確認した。反面、ＳＥＲＣＡの抑制剤であるタプシガルギンを処理した場合には、癌幹細胞の細胞外カルシウム濃度が高く維持され、細胞の生存率も高いことを確認した。前記結果を通して、カルシウムポンプ抑制剤を処理してＰＭＣＡの活性を抑制させると、栄養欠乏状態における癌幹細胞の生存率を低下させられることを確認できた。

前記結果を通して、栄養欠乏状態および代謝エネルギー枯渇関連の小胞体ストレス状態で、癌幹細胞は、ＰＧＣ−１αの発現を増加させてＣａＭＫ−２αの発現を促進し、また、ＰＭＣＡ１およびＰＭＣＡ２のｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒとして作用してＰＭＣＡ蛋白質の発現を増加させて、栄養欠乏状態で小胞体から細胞質に分泌したＣａ^２＋を細胞の外部に排出させる作用により、Ｃａ^２＋がミトコンドリアに蓄積されて細胞死滅が誘導されるＣａ^２＋関連細胞死滅（Ｃａ^２＋ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に対する抵抗性を示すことを確認できた。また、前記結果を通して、一般的な癌治療に使用される栄養欠乏状態を誘導する方法に、追加的にカルシウムポンプ抑制剤を組み合わせると、癌幹細胞に効果的な治療方法として使用可能であることを予想できた。

〔実施例６〕癌幹細胞に効果的な治療方法の確認
（６．１．動物モデルの作製）
癌幹細胞に効果的な治療方法を確認するために、乳癌動物モデルを作製した。乳癌動物モデルの作製のために、乳癌細胞であるｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とｐ−ＭＣＦ−７細胞株と、乳癌幹細胞であるｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とｓ−ＭＣＦ−７細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ培養した後に、１．０Ｘ１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅとなるように５−６週目ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅのｕｐｐｅｒ ｌｅｆｔ ｆｌａｎｋ部位に注入し、７日間水と飼料を提供し、２２℃で１２時間の周期で光を調節して、乳癌動物モデルを作製した。

（６．２．免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））
実施例６．１と同様の方法で作製した乳癌動物モデルにおいてＰＭＣＡ１、ＰＭＣＡ２、ＰＧＣ−１α、およびＣａＭＫ−２αの発現が増加するかを確認するために、免疫化学染色法を利用して確認した。Ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに従ってマウスの癌組織を回収して、１０％ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎを用いて固定化させ、再びパラフィンに固定させて５ｕｍの間隔で組織を切った後、パラフィンを除去した。そして、ｐＨ６のクエン酸塩緩衝溶液（ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）中で抗原復旧（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を実施し、３％過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）を５分間処理した後に、ＰＭＣＡ１、ＰＭＣＡ２、ＰＧＣ−１α、およびＣａＭＫ−２αに対する１：１００の濃度で希釈したそれぞれの一次単クローン抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理した。そして、ヘマトキシリン（ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）を用いて逆染色した後に、乾燥させて観察した。染色された部位は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ４．６ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量した。その結果は図１９に示した。

図１９に示されているように、癌幹細胞を注入した乳癌動物モデルにおいてＰＭＣＡ１、ＰＭＣＡ２、ＰＧＣ−１α、およびＣａＭＫ−２αはすべて発現が増加したことを確認した。

（６．３．癌幹細胞のための治療方法の確認）
実施例６．１と同様の方法で作製した乳癌動物モデルを９匹ずつ１つの実験群に分類し、グルコース吸収抑制剤（ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の２−脱酸ブドウ糖（２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ、２ＤＧ）を５００ｍｇ／ｋｇ、ビグアナイド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系薬物のメトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）を２５０ｍｇ／ｋｇ、そしてカルシウムポンプ抑制剤のカロキシン２ａｌ（ｃａｌｏｘｉｎ２ａｌ）を２００ｍｇ／ｋｇとなるように薬物を組み合わせて、４５日間、１日１回腹腔注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、毎日、カリパス（ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて癌の横（ａ）および縦（ｂ）の直径を測定し、「４／３ＸπＸ（ａｃｍＸｂｃｍ）^３Ｘ１／２」式を用いて癌の大きさ（ｖｏｌｕｍｅ）を測定した。その結果は表２および図２０に示した。

表２および図２０に示されているように、一般的な癌細胞と癌幹細胞の癌の大きさ（ｖｏｌｕｍｅ）を比較すると、癌幹細胞の場合に、癌の成長が著しく速いことを確認した。また、癌幹細胞の場合、２−脱酸ブドウ糖のみを処理した場合には対照群と比較して癌の大きさがやや減少したことを確認でき、２−脱酸ブドウ糖とメトホルミンを併用投与した場合にも癌の大きさがやや減少するが、２−脱酸ブドウ糖とカロキシンを併用投与する場合に癌の大きさが５倍以上減少することを確認した。また、２−脱酸ブドウ糖、カロキシン、およびメトホルミンを併用投与した場合には癌幹細胞がほとんど成長しないことを確認した。

前記結果を通して、グルコース吸収抑制剤とビグアナイド系薬物を用いて癌幹細胞に栄養欠乏状態および代謝エネルギー枯渇関連の小胞体ストレス状態を誘導し、これにより、癌幹細胞でＰＭＣＡの発現を誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）させ、カルシウムポンプ抑制剤を併用投与することによって、癌幹細胞が有するＣａ^２＋関連細胞死滅に対する抵抗性を低下させて癌幹細胞の死滅を誘導し、効果的な癌幹細胞特異的な治療方法として使用可能であることを確認でき、これにより、既存の抗癌剤の限界である癌幹細胞による再発および／または転移を効果的に抑制可能であることを確認できた。

〔実施例７〕癌幹細胞の生存機序の確認
（７．１．癌細胞と癌幹細胞との遺伝子発現の差の確認）
癌幹細胞の生存機序を確認するために、実施例２と同様の方法により、グルコース欠乏状態で４０時間培養したｐ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ｐ−ＭＣＦ−７、ｓ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびｓ−ＭＣＦ−７細胞株をそれぞれ回収し、実施例５．３と同様の方法でＲＮＡを抽出してマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を実施した。その結果は図２１に示した。

図２１に示されているように、Ｃａ^２＋−ＡＴＰアーゼ（ｃａｌｃｉｕｍ ＡＴＰａｓｅ）として作用するＳＥＲＣＡ２遺伝子が癌幹細胞で有意に増加することを確認した。

また、カルシウムを調節する遺伝子の発現の差を確認するために、実施例３．２と同様の方法でウェスタンブロッティングを実施した。その結果は図２２に示した。

図２２に示されているように、癌幹細胞では、ＳＥＲＣＡ２の発現は増加し、逆にＩＰ３Ｒの発現は減少することを確認した。一般的に、グルコースが不足する状況になると、細胞ではＩＰ３Ｒという通路を通してカルシウムイオンが細胞質に分泌し、カルシウムの分泌が急激に増加すると、最終的には細胞死滅が誘導されるが、この時、ＳＥＲＣＡ２を通して再びカルシウムイオンが再吸収されて細胞死滅を抑制させられることが知られている。

前記結果を通して、癌幹細胞では、ＳＥＲＣＡ２の発現が増加してカルシウムの再吸収を促進させるだけでなく、ＩＰ３Ｒの発現を阻害してカルシウムイオンが細胞質に分泌することを同時に抑制することを確認できた。

前記結果を通して、図２３に示されているように、ＣａＭＫ−２αの調節によって、癌幹細胞は、一次的にはＩＰ３Ｒの発現を抑制してカルシウムイオンの分泌を抑制し、二次的には分泌したカルシウムイオンをＳＥＲＣＡを通して再び細胞の内部に吸収して細胞死滅を抑制して、営養分が枯渇した状態でも生存能力が増加することを確認できた。

（７．２．ＣａＭＫ−２α信号伝達機序の変化の確認）
栄養欠乏状態で時間に応じたＣａＭＫ−２α信号伝達機序の変化を確認するために、実施例３．２と同様の方法でウェスタンブロッティングを実施し、ｐＮＦ−ｋＢを用いて実施例５．１と同様の方法でＥＭＳＡ ａｓｓａｙを実施した。その結果は図２４および図２５に示した。

図２４に示されているように、癌幹細胞では、一般的な癌細胞とは異なって、栄養欠乏状態が進行するに伴ってＣａＭＫ−２α信号伝達機序の信号伝達物質が活性化されることを確認した。

また、図２５に示されているように、ｐＮＦ−ｋＢは、ＩＰ３Ｒの抑制子であるＢｃｌ−２とＳＥＲＣＡ２の発現を増加させる転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）として作用することを確認した。前記結果を通して、ＣａＭＫ−２α信号伝達が活性化されると、ＮＦ−ｋＢがリン酸化されて活性化され、活性化されたＮＦ−ｋＢによってＢｃｌ−２およびＣＥＲＣＡ２の発現が増加してカルシウムイオンの再吸収が増加するだけでなく、ＩＰ３Ｒの発現が抑制されてカルシウムイオンの分泌が抑制されることを確認できた。

（７．３．ＣａＭＫ−２α信号伝達機序の抑制効果の確認）
ＣａＭＫ−２α信号伝達を抑制した時の効果を確認するために、ＣａＭＫ−２αの抑制剤としてよく知られているＫＮ６２（１−［Ν，Ｏ−ｂｉｓ（５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｙｌ］−４−ｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）を癌幹細胞に１０ｕＭの濃度で処理した後、実施例３．１と同様の方法でＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙを実施して細胞死滅およびＤＮＡ断片化を確認し、実施例３．２と同様の方法でウェスタンブロッティングを実施して遺伝子の発現を確認し、実施例２と同様の方法で細胞の生存率を確認した。その結果は図２６〜図２８に示した。

図２６〜図２８に示されているように、栄養欠乏状態の癌幹細胞でＣａＭＫ−２α信号伝達が抑制されると、ＮＦ−ｋＢのリン酸化が行われず、これによってＩＰ３Ｒの発現が阻害され、逆にＳＥＲＣＡ２の発現は増加してカルシウムイオンの分泌が増加し、最終的には細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が誘導されることを確認し、前記結果を通して、ＣａＭＫ−２αの抑制剤は、癌幹細胞が有するＣａ^２＋関連細胞死滅に対する抵抗性を低下させて癌幹細胞の死滅を誘導し、効果的な癌幹細胞特異的な治療方法として使用可能であることを確認できた。

〔実施例８〕癌幹細胞動物モデルの特徴の確認
実施例６と同様の方法で作製した動物モデルの特徴を確認するために、生成された乳癌組織を抽出して癌の大きさを測定した。その結果は図２９に示した。また、乳癌組織の蛋白質の発現程度をウェスタンブロッティングと免疫化学染色法を実施して確認した。ウェスタンブロッティングは、実施例３．２と同様の方法で実施し、免疫化学染色法は、実施例６．２と同様の方法で実施した。その結果は図３０および図３１に示した。

図２９に示されているように、癌幹細胞に基づく動物モデルの場合、一般的な癌細胞に基づく動物モデルより癌の成長速度が速いことを確認した。また、図３０および図３１に示されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験と同じく、癌幹細胞に基づく動物モデルの場合、一般的な癌細胞に基づく動物モデルと比較してＩＰ３Ｒの発現は減少し、ＳＥＲＣＡ２の発現は増加していることを確認した。

前記結果を通して、癌幹細胞の場合、体内の劣悪な状況でＣａＭＫ−２α信号伝達機序を活性化させ、最終的にはＩＰ３Ｒの発現は抑制し、ＳＥＲＣＡ２の発現は増加させてカルシウムイオンの分泌による細胞死滅を抑制して体内で癌の生存能力を増加させ、再発および／または転移を促進可能であることを確認できた。これにより、癌幹細胞に効果的な癌幹細胞治療用組成物は、既存の癌治療の限界を克服して癌の治療効果を極大化できるだけでなく、癌の再発および／または転移を抑制できる効果的な治療方法として使用可能であることを確認できた。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるわけではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物によって定義されるというべきである。

本発明の組成物は、効果的に癌幹細胞の死滅を誘導することで、癌幹細胞の治療剤として使用可能であり、これにより、多様な癌幹細胞を効果的に治療して癌の再発および／または転移を効果的に抑制できる薬学組成物として使用可能である。

Claims (5)

1. ２−脱酸ブドウ糖（２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ、２ＤＧ）、ならびに、カロキシン（ｃａｌｏｘｉｎ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、ＫＮ６２（１−［Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｙｌ］−４−ｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、および、ＳｉＣａＭＫ−２αからなる群から選択される１つ以上を、有効成分として含む、癌幹細胞成長抑制用組成物。
2. 前記組成物は、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、フェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）、または、ブホルミン（ｂｕｆｏｒｍｉｎｅ）を追加的に含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. ２−脱酸ブドウ糖（２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ、２ＤＧ）、ならびに、カロキシン（ｃａｌｏｘｉｎ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、ＫＮ６２（１−［Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｙｌ］−４−ｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、および、ＳｉＣａＭＫ−２αからなる群から選択される１つ以上を、有効成分として含む、癌幹細胞治療用薬学組成物。
4. 前記組成物は、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、フェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）、または、ブホルミン（ｂｕｆｏｒｍｉｎｅ）を追加的に含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
5. 前記癌は、乳癌、子宮癌、胃癌、脳癌、直膓癌、大膓癌、肺癌、皮膚癌、血液癌、および肝臓癌からなる群より選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。