JP6449334B2 - ウィッカーハモマイセス属微生物培養物 - Google Patents

Description

本発明は、良好な香気を有する培養物及びその利用に関する。

従来、種々の香気成分を生産する酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ等を用いて、良好な香気を有する培養物を得る方法が知られており、その培養物は飲食品として利用されている（特許文献１〜３）。

香気成分の一つである安息香酸エチルは化学的には安息香酸とエタノールから合成することができる。この化合物はスターフルーツの香気成分の一つとして知られており、産業的には、果実の香りの人工香料として利用されている。香気成分として安息香酸エチルを含有するサッカロマイセス・セレビシエを用いた培養物も知られているが、その含有量は０．００６〜０．００９ppmと少ないものであった（非特許文献１）。

また、ウィッカーハモマイセス・ピジュペリ（Wickerhamomyces pijperi）は、Pichia pijperiから再分類された酵母の一種であり、非特許文献２にはこの酵母をyeast extract-mannitol培地、 yeast-peptone-dextrose(ＹＰＤ)培地で培養したことが記載されているが、得られた培養物の特性は不明であり、乳成分含有培地で培養できること及びその培養物の香気についても全く知られていなかった。

特開平５−４９４６５号公報 特開２００１−１０３９５９号公報 特開２０１２−５５２８６号公報

Journal of the institute of Brewing, 116, 190-196, 2010 Microbiology, 155, 3142-3148, 2009

上記の安息香酸エチル等の香気成分の化学合成品は香気が単調であり、香料用組成物として必ずしも満足できるものではなかった。このため、化粧品や飲食品、医薬品に利用可能であり、化学合成品よりも嗜好性に優れた香りを有し、香料用組成物として利用可能な組成物を提供することが求められていた。また、フルーツ様の香りを好む消費者も多く、フルーツ様の新規な香りを提供することが求められていた。

本発明の課題は、香料用組成物、化粧品、飲食品および医薬品等に利用することができる新規な組成物であって、安息香酸エチルを多量に含有し、安息香酸エチルの化学合成品よりも複雑でフレッシュなフルーツ様の香りを有する組成物及びその利用を提供することにある。

そこで本発明者は、良好な香気を有する組成物を開発すべく種々検討したところ、全く意外にも、ウィッカーハモマイセス属の微生物を、乳成分を含有する培地で培養した際に、香気成分として知られている安息香酸エチルを多量に含有し、安息香酸エチルの化学合成品よりも複雑でフレッシュなフルーツ様の香気を有する培養物が得られ、当該培養物は香料用組成物、化粧品、飲食品、医薬品等に用いることができる培養物として有用であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１０〕を提供するものである。

〔１〕ウィッカーハモマイセス属に属する微生物を乳成分含有培地で培養して得られる培養物。
〔２〕乳成分含有培地が、ホエイ含有培地である〔１〕記載の培養物。
〔３〕ウィッカーハモマイセス属に属する微生物が、ウィッカーハモマイセス・ピジュペリである〔１〕又は〔２〕記載の培養物。
〔４〕ウィッカーハモマイセス属に属する微生物が、ウィッカーハモマイセス・ピジュペリ ＮＢＲＣ１２９０及び／又はウィッカーハモマイセス・ピジュペリ ＮＢＲＣ１８８７である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の培養物。
〔５〕乳成分含有培地が、さらに安息香酸及び／又はその塩を含有するものである〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の培養物。
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の培養物を含有する香料用組成物。
〔７〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の培養物を含有する化粧品。
〔８〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の培養物を含有する飲食品。
〔９〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の培養物を含有する医薬品。
〔10〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の培養物を配合することを特徴とする化粧品、飲食品又は医薬品への香り付与方法。

本発明の培養物は、安息香酸エチルを多量に含有し、安息香酸エチルの化学合成品よりも複雑でフレッシュなフルーツ様の香りを有することから、香料用組成物や化粧品だけでなく、飲食品や医薬品に用いられる培養物として有用である。

本発明の培養物は、ウィッカーハモマイセス属に属する微生物を乳成分含有培地で培養して得られる培養物である。

ウィッカーハモマイセス属に属する微生物としては、ウィッカーハモマイセス・ピジュペリ(Wickerhamomyces pijperi)、ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Wickerhamomyces anomalus）、ウィッカーハモマイセス・ボビス(Wickerhamomyces bovis)、ウィッカーハモマイセス・ラバウレンシス(Wickerhamomyces rabaulensis)、ウィッカーハモマイセス・ハンプシレンシス(Wickerhamomyces hampshirensis)、ウィッカーハモマイセス・ストラスブルジェンシス(Wickerhamomyces strasburgensis)、ウィッカーハモマイセス・シドウィオラム(Wickerhamomyces sydowiorum)、ウィッカーハモマイセス・リンフェルディ(Wickerhamomyces lynferdii)、ウィッカーハモマイセス・シフェリイ(Wickerhamomyces ciferrii)、ウィッカーハモマイセス・シャンバルディ(Wickerhamomyces chambardii)、ウィッカーハモマイセス・シルビコラ(Wickerhamomyces silvicola)、ウィッカーハモマイセス・ビスポラス (Wickerhamomyces bisporus)、ウィッカーハモマイセス・アルニ(Wickerhamomyces alni)、ウィッカーハモマイセス・カナデンシス(Wickerhamomyces canadensis)、ウィッカーハモマイセス・オニチス(Wickerhamomyces onychis)、ウィッカーハモマイセス・エダフィカス(Wickerhamomyces edaphicus)、ウィッカーハモマイセス・パタゴニクス(Wickerhamomyces patagonicus)等が挙げられる。このうち、ウィッカーハモマイセス・ピジュペリがより好ましい。さらに、ウィッカーハモマイセス・ピジュペリのうち、ＮＢＲＣ（NITE Biological Resource Center）に寄託されているＮＢＲＣ１２９０、ＮＢＲＣ１８８７がさらに好ましい。なお、これらの微生物は単独で用いても良いし、複数組み合わせて用いても良い。なお、旧分類においてピキア・ピジュペリ(Pichia pijperi)に分類されていたもので、新たにウィッカーハモマイセス・ピジュペリとして分類され得るものは、本願のウィッカーハモマイセス・ピジュペリに含まれる。

本明細書において「乳成分」とは、牛乳、山羊乳、羊乳などの獣乳の生乳、加熱乳、脱脂粉乳、全脂粉乳或いは生クリーム、ホエイ等の乳由来の成分を含有する物を意味する。

乳成分含有培地としては、乳成分を含有する培地であればよく、さらに他の成分を含有していてもよい。当該他の成分としては、特に限定されるものではないが、グルコース、ガラクトース、ラクトース、フルクトースなどの糖、安息香酸及び／又はその塩が好ましい。糖としては、微生物に資化される点でグルコースが好ましい。また、添加すると微生物の安息香酸エチルの産生量が向上する点で安息香酸及び／又はその塩が好ましく、安息香酸の塩としては、安息香酸ナトリウム及び安息香酸カリウム等の安息香酸アルカリ金属塩がより好ましく、安息香酸ナトリウムがさらに好ましい。したがって、安息香酸及び／又はその塩としては、安息香酸及び／又は安息香酸ナトリウムを添加することが好ましい。

乳成分としては、微生物の安息香酸エチルの産生量が向上するため、ホエイが特に好ましい。「ホエイ」とは、牛乳から乳脂肪分、カゼインを除いたものである。例えば、ホエイは乳成分を微生物で発酵した際の培養上清として得ることができ、ラクトース、ガラクトース等の糖、アミノ酸、乳酸、タンパク質等を含有するものが好ましい。また、ホエイとしては、特に乳成分を乳酸菌及び／又はビフィズス菌で培養して得られた培養上清が好ましい。ここで、乳酸菌及び／又はビフィズス菌としては、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・マリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・デルブルッキィサブスピーシーズ．ブルガリカス、ラクトバチルス・ヘルベティカス等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．ラクチス、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．クレモリス等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス等のエンテロコッカス属細菌、あるいは、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属細菌を挙げることができる。

培地中の乳成分の含有量は、特に限定されないが、固形分換算で、１〜５０質量％（以下、単に「％」という）が好ましく、２〜１０％がより好ましい。また、安息香酸及び／又はその塩の含有量は、微生物の安息香酸エチルの産生量及び微生物の増殖能の点から、乳成分含有培地中、０．００１〜０．１％が好ましく、０．０１〜０．０５％がより好ましい。さらに、グルコースの含有量は、微生物の増殖能の点から、０．１〜１０％が好ましく、１〜５％がより好ましい。

ウィッカーハモマイセス属に属する微生物の培養温度は、特に限定されないが、培養物の香りの点から、１５〜３０℃が好ましく、２０〜３０℃がさらに好ましい。培養時間は、８時間以上が好ましく、２４〜３２時間がさらに好ましい。また、安息香酸及び／又はその塩を培地に添加した場合には、２４〜４８時間が好ましく、３２〜４８時間がさらに好ましい。培養方法としては、撹拌培養、静置培養、振盪培養、中和培養等が挙げられる。

本発明の培養物中には、安息香酸エチルが１．０ppm以上含まれ、安息香酸エチルの化学合成品よりも複雑でフレッシュなフルーツ様の香気を有する。安息香酸エチルの含有量は、１．０〜５０ppmが好ましく、１．０〜３０ppmがより好ましい。

また、本発明の培養物中には、安息香酸エチル以外の他の香気成分が含まれていても良い。他の香気成分としては、イソアミルアルコール等の香気成分が挙げられる。

本発明の培養物は、安息香酸エチルを多量に含有し、安息香酸エチルの化学合成品よりも複雑でフレッシュなフルーツ様の良好な香気を有するため、香料用組成物、化粧品、飲食品および医薬品等に利用することができる。化粧品分野では工業的に利用可能な生物由来の香料は少なく、合成香料よりも天然香料の需要が高いため、化粧品に好適に利用することができる。

本発明の培養物は、培養物をそのまま香料用組成物、化粧品、飲食品および医薬品等に配合しても良いが、ろ過したものを配合することが好ましい。また、培養物を凍結乾燥法あるいは蒸留法等で濃縮し、当該濃縮物を香料用組成物、化粧品、飲食品および医薬品等に配合することもできる。

化粧品としては、香水、オーデコロン、オードトワレ等の芳香化粧品、化粧水、乳液、ローション、クリーム、パック、美容液等の基礎化粧品、シャンプーやリンス等の頭髪用化粧品、入浴剤等の浴用化粧品、ファンデーション等のメイクアップ化粧料、日焼け止め等の特殊化粧品等が挙げられる。飲食品としては、各種清涼飲料、発泡酒、ビール、清酒、菓子類、氷菓類、アイスクリーム、はっ酵乳等の乳製品等が挙げられる。また医薬品としては、クリーム、軟膏、ゲル等の外用剤等が挙げられる。これらの化粧品、飲食品、医薬品中の本発明培養物の含有量は、固形分換算で、０．０１〜１０％が好ましく、０．１〜１％がより好ましい。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

実施例１
（１）菌株及び前々培養
（ｉ）使用菌株
Wickerhamomyces pijperi ＹＩＴ８０９５（ＮＢＲＣ １２９０）、Wickerhamomyces pijperi ＹＩＴ１２７７９（ＮＢＲＣ １８８７）
比較例：Kluyveromyces marxianus ＹＩＴ１２６１２（ＮＢＲＣ ０２６０）
（ii）前々培養
前々培養：２mlのYeast and Mold（ＹＭ）培地（１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス）に２０％グリセロール凍結保存株を２０μＬ接種し、３０℃、１６０rpmで２４時間振盪培養した。

（２）菌の産生する香気成分の分析
（ｉ）前培養
前培養：１％グルコースを含む２mlのホエイ含有培地に前々培養で得られた培養液を２０μＬ接種し、３０℃、１６０rpmで２４時間振盪培養した。
前記ホエイ含有培地としてはStreptococcus thermophilus ＹＩＴ２０８４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７９）を３％脱脂粉乳培地で培養して得られた培養物の上清を使用した。この上清を分析した結果、１．１％のラクトース、０．４％のガラクトース、０．４％の乳酸を含み、pHは４．０であった。

（ii）培養
培養：１％グルコースを含む５mlのホエイ含有培地に、前培養液を５０μＬ接種し、３０℃、１６０rpmで２４時間振盪培養した。
（iii）香気成分の分析
培養終了後、試料は８０００rpmで５分間遠心分離し、２mlの上清を２０mlのバイアルにとり、培養物中の香気成分をHeadspace gas chromatography mass spectrometry（ＨＳ−ＧＣ−ＭＳ）によって同定した（表１、表２）。また、同定した香気成分の定量は、ＨＳ−ＧＣ-Flame Ionization Detector (FID)で行った（表３、表４）。結果を表５に示す。また、培養液の香りの官能検査を下記の基準で行った。その結果を表５に示す。

（官能検査の評価基準）
５：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りが強くする。
４：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがする。
３：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがわずかにする。
２：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがほとんどしない。
１：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りはしない。

ＮＢＲＣ１２９０株とＮＢＲＣ１８８７株の培養液から複雑でフレッシュなフルーツ様の香りが強く感じられ、香気成分を分析して各化合物の含有量を比較した結果、安息香酸エチルの含有量が多いことに特徴があった。これらの培養液との比較として、別種の酵母（Kluyveromyces marxianusＮＢＲＣ０２６０株）をホエイ含有培地で培養させて得た培養液の香気成分を分析・評価した結果、バラ様の香りは強いが、フルーツ様の香りはほとんどせず、安息香酸エチルは含有していなかった。

ＮＢＲＣ１２９０株およびＮＢＲＣ１８８７株の培養液と、培養液中と同量の安息香酸エチルの化学合成品単独の香りの官能検査を行ったところ、ＮＢＲＣ１２９０株およびＮＢＲＣ１８８７株の培養液では化学合成品には出せない香りの複雑さが感じられ、化学合成品よりも好ましい香りだった。

（３）培地による菌の香気成分産生量の違い
ＮＢＲＣ１２９０株およびＮＢＲＣ１８８７株を用いて実験を行った。
（ｉ）前培養
前培養：１％グルコースを含む２mlのホエイ含有培地、２mlのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）、２mlのＹＭ培地（１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス）に、前々培養で得られた培養液をそれぞれ２０μＬ接種し、３０℃、１６０rpmで２４時間振盪培養した。
（ii）培養
培養：１％グルコースを含む２mlのホエイ含有培地、２mlのＹＰＤ培地、２mlのＹＭ培地に、前培養で得られた培養液をそれぞれ５ml接種し、３０℃、１６０rpmで２４時間振盪培養した。
（iii）香気成分の含有量の分析
培養終了後、培養物中の香気成分の含有量をＨＳ−ＧＣ−ＦＩＤによって分析した（表３、表４）。結果を表６に示す。また、培養物の香りの官能検査を実施例１（２）と同様の基準で行った。その結果を表６に示す。

ホエイ含有培地でＮＢＲＣ１２９０株とＮＢＲＣ１８８７株を培養した培養液から複雑でフレッシュなフルーツ様の香りが強く感じられ、培養液は安息香酸エチルを多く含有していた。一方、ＹＭ培地、ＹＰＤ培地で上記菌株を培養した培養液においても安息香酸エチルを含有する場合があるが、その含有量は少なく、複雑でフレッシュなフルーツ様の香りはほとんどしなかった。

（４）培養条件による菌の香気成分産生量の違い
ＮＢＲＣ１８８７株を用いて実験を行った。
（ｉ）前培養
前培養：１％グルコースを含む２mlのホエイ含有培地に前々培養で得られた培養液を２０μＬ接種し、３０℃、１６０rpmで２４時間振盪培養した。
（ii）培養
培養：１％グルコースを含む１００mlのホエイ含有培地に前培養液を１ml接種し、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃の培養条件で、１６０rpmで振盪培養した。また、０、２４、３２、４８、５６時間培養した時にサンプルを回収した。
（iii）安息香酸エチルの含有量の分析
各培養物中の安息香酸エチルの含有量をＨＳ−ＧＣ−ＦＩＤによって分析した（表３、表４）。結果を表７に示す。また、培養物の香りの官能検査を下記の基準で行った。その結果を表７に示す。

（官能検査の評価基準）
◎：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りが強くする。
○：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがする。
△：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがわずかにするが、複雑さが弱い。
▲：他の香気成分の香りが強く、香りの特徴が変化し、日本酒様の香りがする。
×：複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがしない。

培養温度が１５℃の場合、微生物の発酵によって安息香酸エチルは産生されるものの、他の香気成分の香りが弱く、培養物の香りの複雑さが弱かった。一方、２０〜３０℃で培養した培養物は複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがし、香りが良好であった。また、培養時間が４８時間以上になると、微生物の発酵によって、安息香酸エチル以外の香気成分の産生量が上昇するため、他の香気成分の香りが強くなり、香りの特徴が変化し、日本酒様の香りがした。このため、培養時間としては、２４〜３２時間が良好であった。

（５）安息香酸又はその塩を培地に配合したときの安息香酸エチル含有量の違い
ＮＢＲＣ１８８７株を用いて実験を行った。
（ｉ）前培養
前培養：１％グルコースを含む２mlのホエイ含有培地に前々培養で得られた培養液を２０μl接種し、３０℃、１６０rpmで２４時間振盪培養した。
（ii）培養
培養：１％グルコースを含む１００mlのホエイ含有培地に、安息香酸ナトリウムを０．０１％となるように配合した。また同様にして、１％グルコースを含む１００mlのホエイ含有培地に、安息香酸が０．０１％、フェニルアラニンが０．０１％、０．０５％、０．１％、パラヒドロキシメチルベンゼンが０．０１％、０．０５％となるようにそれぞれ配合した。さらに、コントロールとして、添加物を配合しない１％グルコースを含む１００mlのホエイ含有培地も用意した。各培地に、前培養液を１ml接種し、３０℃、１６０rpmで振盪培養した。また、０、２４、３２、４８時間培養した時にサンプルを回収した。
（iii）安息香酸エチルの含有量の分析
各培養物中の安息香酸エチルの含有量をＨＳ−ＧＣ−ＦＩＤによって分析した（表３、表４）。結果を表８に示す。

安息香酸又は安息香酸ナトリウムを配合した場合には、３２〜４８時間培養したときに、培養物中の安息香酸エチルの含有量が顕著に増加した。その他の物質を配合した場合には、培養物中の安息香酸エチルの含有量はほとんど増加しなかった。

製造例１
表９の組成で、（５）と（６）を混合して、これに（１）〜（４）を加えて十分に攪拌して化粧水を調製した。この化粧水は複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがした。なお、培養液としては、１％グルコースを含むホエイ含有培地１００mlに、実施例１(４)の前培養で得た前培養液を１ml接種し、２０℃、２４時間、１６０rpmで振盪培養して得られた培養液をろ過したものを使用した。

製造例２
表１０の組成で、（１０）に（７）〜（９）を加えて加温し、８０℃で（１）〜（６）を加えて乳化し、室温まで冷却して乳液を調製した。この乳液は複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがした。なお、培養液は製造例１と同じものを使用した。

製造例３
表１１の組成で、（１２）に（９）〜（１１）を加えて加温し、８０℃で（１）〜（８）を加えて乳化し、室温まで冷却してクリームを調製した。このクリームは複雑でフレッシュなフルーツ様の香りがした。なお、培養液は製造例１と同じものを使用した。

Claims (7)

1. ウィッカーハモマイセス・ピジュペリ ＮＢＲＣ１２９０及び／又はウィッカーハモマイセス・ピジュペリ ＮＢＲＣ１８８７をホエイ含有培地で１５〜３０℃で２４〜３２時間又は１５℃で３２〜５４時間培養して得られる培養物。
2. ホエイ含有培地が、さらに安息香酸及び／又はその塩を含有するものである請求項１記載の培養物。
3. 請求項１又は２記載の培養物を含有する香料用組成物。
4. 請求項１又は２記載の培養物を含有する化粧品。
5. 請求項１又は２記載の培養物を含有する飲食品。
6. 請求項１又は２記載の培養物を含有する医薬品。
7. 請求項１又は２記載の培養物を配合することを特徴とする化粧品、飲食品又は医薬品への香り付与方法。