JP6460100B2 - リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化された腸内細菌科の細菌を用いたｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物工業に関し、更に具体的には、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子（phosphate transporter-encoding gene）の発現が弱化されるように改変された腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌の発酵によりＬ−アミノ酸を製造する方法に関する。

従来、Ｌ−アミノ酸は自然源から得られた微生物株あるいはそれらの変異体を利用した発酵法によって工業的に製造されてきた。典型的には、そのような微生物はＬ−アミノ酸の生産収率が高まるように改変されている。

Ｌ−アミノ酸の生産収率を高めるための多くの技術が報告されており、組換えDNAによる微生物の形質転換（例えば、米国特許第4,278,765 A号参照）、プロモ−ター、リーダー配列、及び／又はアテニュエーター、あるいはその他の当業者に知られた制御領域の改変（例えば、米国特許出願公開第20060216796 A1号 及びWO9615246 A1参照）などがある。生産収率を高めるその他の技術としては、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は生成したＬ−アミノ酸による目的とする酵素のフィードバック阻害を解除すること（例えば、WO9516042 A1、EP0685555 A1又は米国特許第4,346,170 A号、第5,661,012 A号、及び第6,040,160号参照）が挙げられる。

Ｌ−アミノ酸の生産収率を高める別の方法としては、１種または数種の、目的とするＬ−アミノ酸の分解に関与する遺伝子、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路から該Ｌ−アミノ酸の前駆体を別の経路に逸らせる遺伝子、炭素、窒素、及びリン酸の流れの再分配に関与する遺伝子、および毒素をコードする遺伝子などの発現を減少させることが挙げられる。

例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. coli））等の細菌は、細菌の細胞膜を横切って無機リン酸（Pi）を輸送するタンパク質をコードする２つのpit遺伝子（pitA及びpitB）を有する（Harris R.M.ら, Characterization of PitA and PitB from Escherichia coli, J. Bacteriol., 2001, 183(17):5008-5014）。リン酸トランスポーターであるPitA及びPitBは、互いに対して81％のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質ホモログであり（Hoffer S.M.ら, Activation by gene amplification of pitB, encoding a third phosphate transporter of Escherichia coli K-12, J. Bacteriol., 2001, 183(15):4659-4663）、これらのトランスポーターは、無機リン酸トランスポーター（Inorganic Phosphate Transporter（PiT））ファミリーに属する。34種の完全に配列決定された細菌ゲノムの検索により（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）、例えば、Pseudomonas aeruginosa（Pseudomonadaceae）等の幾つかの細菌が、１つ以上のPitAホモログを有することが明らかにされた。

原核生物であるE. coli由来のPitA及びPitBは、無機リン酸を互いに独立して輸送することができる。無機リン酸トランスポーターのこのような重複する活性は、例えば、Saccharomyces cerevisiae（Martinez P.R.ら, Physiological regulation of the derepressible phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae, J. Bacteriol., 1998, 180:2253-2256）及びNeurospora crassa（Versaw W.K.とMetzenberg R.L., Repressible cation-phosphate symporters in Neurospora crassa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995,
92:3884-3887）等の真核生物種についても報告されている。原核生物に関する先の研究
により、PitA系（簡潔にするために、Pit系としても言及する）は、無機リン酸及び二価陽イオンの取り込みを媒介することが示されている。例えば、Pit系を利用することによるE. coli（Enterobacteriaceae）及びAcinetobacter johnsonii（Moraxellaceae）における無機リン酸の取り込みは、可溶性で中性の金属−リン酸複合体（輸送される化学種である）の形成を介した、Mg(II), Ca(II), Mn(II), 又はCo(II)等の二価金属陽イオンの共輸送（co-transport）に依存している（van Veen H.W.ら, Translocation of metal phosphate via the phosphate inorganic transport system of Escherichia coli, Biochemistry, 1994, 33（7）:1766-1770; van Veen H.W.ら, Mechanism and energetics of the secondary phosphate-transport system of Acinetobacter-johnsonii-210A, J. Biol. Chem., 1993, 268:19377-19383）。PitAは、おそらくZnHPO₄複合体の形成を介してZn(II)の取り込みに関与していることも報告されている。ただし、PitAは、亜鉛イオンの細胞内濃度が有毒なものとなった際には、Zn(II)の排出にも役割を果たしていることが示唆されている（Beard S.J.ら, Evidence for the transport of zinc（II） ions via the pit phosphate transport system in Escherichia coli, FEMS Microbiol. Lett., 2000, 184:231-235）。

しかし、腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌の発酵によるＬ−アミノ酸の生産に対するリン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現を弱化することの効果を示すデータはこれまで報告されていない。

本発明は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子、例えば、pitA遺伝子や、pitB遺伝子等のそのホモログ、の発現が弱化されるよう改変された腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属するＬ−アミノ酸生産菌（エシェリヒア（Escherichia）属に属するものであってもよく、より具体的にはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. coli））であってもよい）を提供することを課題とする。

本発明は、さらに、後述する腸内細菌科の細菌を使用した、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等のＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することを課題とする。

これらの課題は、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産菌（エシェリヒア属に属するものであってもよく、より具体的にはエシェリヒア・コリであってもよい）の染色体上のリン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現の弱化により、特に、pitA遺伝子の不活性化により、例えば、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジン等のＬ−アミノ酸のより高い生産性が該細菌に対して与えられることを見出したことによって達成された。

本発明の１つの側面は、Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、
（i）腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌を培養培地で培養し、培養培地若しくは細菌の細胞又はその両者中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させること、及び
（ii）培養培地若しくは細菌の細胞又はその両者からＬ−アミノ酸を回収することを含み、
前記細菌が、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化するように改変されている方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、前記細菌がエシェリヒア属に属するものである、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、前記細菌がパントエア（Pantoea）属に属するものである、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、前記細菌がパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の不活性化により弱化されている、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子が欠失している、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子が、下記（A）〜（G）からなる群から選択されるDNAである、前記方法を提供するものである：
（A）配列番号１の塩基配列を含むDNA、
（B）配列番号３の塩基配列を含むDNA、
（C）遺伝暗号の縮重による配列番号１又は配列番号３の変異体塩基配列を含むDNA、
（D）配列番号１又は配列番号３の塩基配列全体に対して75％以上の塩基配列の同一性を有し、無機リン酸輸送活性を有するタンパク質をコードするDNA、
（E）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（F）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、及び
（G）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、無機リン酸輸送活性を有するタンパク質をコードするDNA。

本発明の更なる側面は、前記Ｌ−アミノ酸が、芳香族Ｌ−アミノ酸及び非芳香族Ｌ−アミノ酸からなる群から選択される、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、前記芳香族Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンからなる群から選択される、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、前記非芳香族Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、及びＬ−バリンからなる群から選択される、前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンである、前記方法を提供するものである。

pMW118-λattL-Km^R-λattRプラスミドの概略を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

１．細菌
「Ｌ−アミノ酸生産菌」の用語は、当該細菌を培養培地で培養したときに、培地及び／又は菌体中にＬ−アミノ酸を生成し、排出もしくは分泌し、又は蓄積する能力を有する腸内細菌科の細菌を意味し得る。

また、「Ｌ−アミノ酸生産菌」の用語は、エシェリヒア・コリK-12株等の野生株または親株と比較して、より多い量でＬ−アミノ酸を培養培地中に生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積することができる細菌も意味し得る。また、「Ｌ−アミノ酸生産菌」の用語は、0.5g/l以上、あるいは1.0g/l以上の量で目的のＬ−アミノ酸を培地中に蓄積することができる細菌も意味し得る。細菌は、１種のアミノ酸を単独で生産してもよく、２種またはそれ以上のアミノ酸の混合物を生産してもよい。

「Ｌ−アミノ酸生産能」の用語は、当該細菌を培養培地で培養したときに、培地及び／又は菌体から回収できる程度に、培地又は菌体中に該Ｌ−アミノ酸を生成し、排出もしくは分泌し、又は蓄積する、細菌の能力を意味し得る。

「Ｌ−アミノ酸」の用語は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンを意味し得る。

「芳香族Ｌ−アミノ酸」の用語は、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンを包含する。Ｌ−ヒスチジンは芳香族部分（具体的にはイミダゾール環）を有するので、「芳香族Ｌ−アミノ酸」の用語は、上記芳香族Ｌ−アミノ酸に加えてＬ−ヒスチジンも包含し得る。

「非芳香族Ｌ−アミノ酸」の用語は、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、及びＬ−バリンを包含する。Ｌ−ヒスチジンの生合成経路はＬ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシン等の通常の芳香族アミノ酸の生合成経路とは異なるので、「非芳香族Ｌ−アミノ酸」の用語は、上記非芳香族Ｌ−アミノ酸に加えてＬ−ヒスチジンも包含し得る。

すなわち、Ｌ−ヒスチジンは、「芳香族Ｌ−アミノ酸」及び「非芳香族Ｌ−アミノ酸」のいずれか一方あるいは両方に包含され得る。

Ｌ−アミノ酸は、1種またはそれ以上のＬ−アミノ酸ファミリーに属し得る。例として、グルタミン酸ファミリーは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、及びＬ−プロリンを含み、セリンファミリーは、Ｌ−システイン、グリシン、及びＬ−セリンを含み、アスパラギン酸ファミリーは、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−スレオニンを含み、ピルビン酸ファミリーは、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、及びＬ−ロイシンを含み、芳香族ファミリーは、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンを含む。或るＬ−アミノ酸は別のＬ−アミノ酸の生合成経路の中間体になり得るので、上記アミノ酸ファミリーは、例えば非タンパク質性Ｌ−アミノ酸等の、その他のＬ−アミノ酸
を包含し得る。例えば、Ｌ−シトルリン及びＬ−オルニチンはＬ−アルギニンの生合成経路からのアミノ酸である。したがって、グルタミン酸ファミリーは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−オルニチン、及びＬ−プロリンを包含してもよい。

Ｌ−アミノ酸としては、特に、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンが挙げられる。Ｌ−アミノ酸として、具体的には、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、及びＬ−プロリンが挙げられる。Ｌ−アミノ酸として、より具体的には、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンが挙げられる。

「Ｌ−アミノ酸」の用語は、遊離した形態のＬ−アミノ酸に限られず、後述するように、その塩もしくは水和物、又は他の有機もしくは無機の化合物と形成されるその付加物の形態をも包含し得る。

腸内細菌科に属する細菌は、エシェリヒア及び／又はパントエア等の属に属する細菌であり得、且つＬ−アミノ酸生産能を有し得る。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を使用することができる。改変することができる腸内細菌科の株の例としては、エシェリヒア、エンテロバクター、又はパントエア属の細菌が挙げられる。

改変することにより本発明のエシェリヒア属細菌を得ることができるエシェリヒア属細菌の株としては、特に限定されないが、具体的には、Neidhardtらの著書（Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, pp. 2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. (ed.), E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2^nd ed., ASM Press, Washington, D.C., 1996）に挙げられるものが使用できる。特にエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリの具体例としては、プロトタイプ野生株であるエシェリヒア・コリK-12株由来のエシェリヒア・コリW3110（ATCC 27325）やエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）等が挙げられる。これらの株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P.O. Box 1549, Manassas,
VA 20108, United States of America）から入手することができる。すなわち各菌株には対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して発注することができる（www.atcc.orgを参照）。各菌株の登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられ、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）等が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスのいくつかの株は、近年、16S rRNAの塩基配列解析などによりパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、またはパントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されている。腸内細菌科に分類される細菌であれば、エンテロバクター属またはパントエア属のいずれに属するものであっても使用することができる。パントエア・アナナティス株を遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、及びそれらの派生株を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり最近16S rRNAの塩基配列解析等によりパントエア・アナ
ナティスに再分類されている。

Ｌ−アミノ酸生産菌
腸内細菌科に属し、pitA又はそのホモログであるpitB等のリン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化するように改変された、Ｌ−アミノ酸を生産することのできる本発明の細菌を使用することができる。

細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本来的に有するものであってもよく、突然変異法又はDNA組換え技術によってＬ−アミノ酸生産能を有するよう改変されたものであってもよい。前記細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本来的に有する細菌においてリン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現を弱化させることによって取得することができる。あるいは、前記細菌は、既にリン酸トランスポーター遺伝子が弱化された細菌に対してＬ−アミノ酸生産能を付与することによっても取得することができる。また、前記細菌は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現を弱化させることによってＬ−アミノ酸生産能を獲得した細菌であってもよい。

細菌は、１種のＬ−アミノ酸を単独で生産してもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸の混合物を生産してもよい。また、後述するように、細菌は、アミノ酸を単独で生産してもよく、Ｌ−アミノ酸とその塩の混合物として生産してもよい。

以下に、Ｌ−アミノ酸生産菌を具体的に例示する。以下に例示するようなＬ−アミノ酸生産菌の性質、及びＬ−アミノ酸生産能を付与若しくは増強するための改変は、いずれも独立して、又はあらゆる適切な組合せで使用することができる。

Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌及びＬ−アルギニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリ237株（VKPM B-7925、米国特許出願公開2002058315 A1）及び変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼをコードする変異型argA遺伝子を保持するその誘導株（ロシア特許第2215783 C2号、EP1170361 A1）、エシェリヒア・コリ382株（VKPM B-7926、EP1170358 A1）、エシェリヒア・コリK-12からのilvA遺伝子の野生型アレルをエシェリヒア・コリ382株に導入することにより得たエシェリヒア・コリ382ilvA⁺株等のエシェリヒア属に属する株が挙げられる。変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼの例としては、例えば、野生型酵素の15〜19位に相当するアミノ酸残基が置換されることによりＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼが挙げられる（EP1170361 A1）。

Ｌ−アルギニン生産菌及びＬ−アルギニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする1種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼをコードする遺伝子（argA）に加えて、Ｎ−アセチル-γ-グルタミルホスフェートレダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（argB）、Ｎ−アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノスクシネートシンターゼ（argG）、アルギニノスクシネートリアーゼ（argH）、及びカルバモイルホスフェートシンテターゼ（carAB）をコードする遺伝子が挙げられる。argA遺伝子は、上記例示したような変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼをコードする変異型argA遺伝子であってもよい。

Ｌ−アルギニン生産菌及びＬ−アルギニン生産菌を誘導するために使用することができ
る親株の例としては、アミノ酸アナログなどに対する耐性を有する株も挙げられる。そのような株の例としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、またはスルファグアニジンに対して耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株が挙げられる（特開昭56-106598号参照）。

Ｌ−シトルリン生産菌
Ｌ−シトルリン生産菌及びＬ−シトルリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリの変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼ株である237/pMADS11株、237/pMADS12株、及び237/pMADS13株（RU2215783 C2、ヨーロッパ特許第1170361 B1号、米国特許第6,790,647 B2号）、フィードバック耐性カルバモイルホスフェートシンセターゼを保持するエシェリヒア・コリ333株（VKPM B-8084）及び374株（VKPM B-8086）（ロシア特許第2264459 C2号）、α−ケトグルタレートシンターゼ活性が増大し、フェレドキシンNADP⁺レダクターゼ、ピルベートシンターゼ、及び／又はα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性がさらに改変されたエシェリヒア・コリ株（EP2133417 A1）などのエシェリヒア属に属する株、スクシネートデヒドロゲナーゼ及びα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア・アナナティスNA1sucAsdhA株（米国特許出願公開2009286290 A1号）などが挙げられる。

Ｌ−シトルリンはＬ−アルギニン生合成経路の中間体であるので、Ｌ−シトルリン生産菌及びＬ−シトルリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする1種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。そのような遺伝子の例としては、限定するものではないが、Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（argB）、Ｎ−アセチルグルタミルホスフェートレダクターゼ（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF/I）、及びカルバモイルホスフェートシンセターゼ（carAB）をコードする遺伝子、並びにそれらの組合せが挙げられる。

また、Ｌ−シトルリン生産菌は、任意のＬ−アルギニン生産菌、例えばエシェリヒア・コリ382株（VKPM B-7926）から、argG遺伝子にコードされるアルギニノスクシネートシンターゼを不活性化することにより容易に得ることができる。

Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌及びＬ−システイン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする種々のcysEアレルで形質転換されたエシェリヒア・コリJM15（米国特許第6,218,168 B1号、ロシア特許第2279477 C2号）、細胞に対して毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するエシェリヒア・コリW3110（米国特許第5,972,663 A号）、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ株（JP11155571 A2）、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリW3110（WO0127307 A1）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリVL334thrC⁺（EP
1172433 A1）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。エシェリヒア・コリVL334（VKPM B-1641）は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である（米国特許第4,278,765号）。thrC遺伝子の野生型アレルは
、野生型エシェリヒア・コリK12株（VKPM B-7）の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。その結果、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するＬ−イソロイシン要求性のVL334thrC⁺株（VKPM B-8961）が得られた。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。そのような遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ（glnA）、グルタメートシンテターゼ（gltBD）、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（icdA）、アコニテートヒドラターゼ（acnA、acnB）、シトレートシンターゼ（gltA）、ホスホエノールピルベートカルボシラーゼ（ppc）、ピルベートカルボシラーゼ（pyc）、ピルベートデヒドロゲナーゼ（aceEF、lpdA）、ピルベートキナーゼ（pykA、pykF）、ホスホエノールピルベートシンターゼ（ppsA）、エノラーゼ（eno）、ホスホグリセロムターゼ（pgmA、pgmI）、ホスホグリセレートキナーゼ（pgk）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（gapA）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（tpiA）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（fbp）、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA、pfkB）、及びグルコースホスフェートイソメラーゼ（pgi）をコードする遺伝子が挙げられる。

シトレートシンテターゼ遺伝子、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989 A2、EP955368 A2、及びEP952221 A2に開示されたものが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。そのような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ（aceA）、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（sucA）、ホスホトランスアセチラーゼ（pta）、アセテートキナーゼ（ack）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ilvG）、アセトラクテートシンターゼ（ilvI）、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ（pfl）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ldh）、グルタメートデカルボキシラーゼ（gadAB）、スクシネートデヒドロゲナーゼ（sdhABCD）、及び１-ピロリン-５-カルボキシレートデヒドロゲナーゼ（putA）が挙げられる。α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性を欠損した、またはα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属細菌、及びそれらの取得方法は、米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。具体的には、そのような株として下記のものが挙げられる。
エシェリヒア・コリW3110sucA::Km^R
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）

エシェリヒア・コリW3110sucA::Km^R は、エシェリヒア・コリW3110のα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下「sucA遺伝子」という）を破壊することにより得られた株である。この株はα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性を完全に欠損している。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株のその他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に対して耐性を有する株が挙げられる。これらの株は、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、そのような例としては、例えば、エシェリヒア・コリAJ13
199（FERM BP-5807、米国特許第5,908,768号）、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したエシェリヒア・コリFFRM P-12379（米国特許第5,393,671号）、エシェリヒア・コリAJ13138（FERM BP-5565、米国特許第6,110,714号）などが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、パントエア・アナナティスSC17株（FERM BP-11091）、パントエア・アナナティスSC17（0）株（VKPM B-9246）などのパントエア属細菌も挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第6,596,517号）。SC17株は、2009年2月4日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（NITE IPOD）、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。AJ13355株は、1998年2月19日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（NITE IPOD）、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM P-16644が付与されている。その後、この寄託は1999年1月11日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、またはα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下した、上記のようにして得られるパントエア属に属する変異株も挙げられる。そのような株としては、パントエア・アナナティスAJ13356株（米国特許第6,331,419 B1号）が挙げられる。パントエア・アナナティスAJ13356株は、1998年2月19日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、NITE IPOD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。パントエア・アナナティスAJ13356株は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）が破壊されたことによりα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性を欠損している。この株は、単離された際にはエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13356株として寄託されたが、近年、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。AJ13356株は、上記寄託機関にエンテロバクター・アグロメランスとして寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスとして記載する。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、パントエア・アナナティスSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、パントエア・アナナティスAJ13601株、パントエア・アナナティスNP106株、及びパントエア・アナナティスNA1株などのパントエア属に属する株も挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のシトレートシンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ppc）、及びグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のシトレートシンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から、低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に対して耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG及びpSTVCBを脱落させることにより得た株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、NITE IPOD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM P-17516が付与された。その後、この寄託は、2000年7月6日にブダペスト条約の規定
に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、アスパラギン酸アナログに対して耐性を有する株も挙げられる。これらの株は、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性を欠損していてもよい。アスパラギン酸アナログに対して耐性を有し、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性を欠損した株の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリAJ13199（FERM BP-5807、米国特許第5.908,768号）、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したエシェリヒア・コリFFRM P-12379（米国特許第5,393,671号）、エシェリヒア・コリAJ13138（FERM BP-5565、米国特許第6,110,714号）が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌及びＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリ24株（VKPM B-5945、RU2003677 C1）、エシェリヒア・コリ80株（VKPM B-7270、RU2119536 C1）、エシェリヒア・コリNRRL B-12116〜B-12121（米国特許第4,388,405号）、エシェリヒア・コリH-9342（FERM BP-6675）及びH-9343（FERM BP-6676）（米国特許第6,344,347 B1号）、エシェリヒア・コリH-9341（FERM BP-6674、EP1085087 A2）、エシェリヒア・コリAI80/pFM201（米国特許第6,258,554 B1号）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌及びＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、ホスホリボシル-AMPサイクロヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシル-ATPサイクロヒドロラーゼ/ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ（hisIE）、ホスホリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（hisH）、ヒスチジノールホスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチジノールホスファターゼ（hisB）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（hisD）などをコードする遺伝子が挙げられる。

hisG及びhisBHAFIによりコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素は、Ｌ−ヒスチジンにより阻害されることが知られている。従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼにフィードバック阻害に対する耐性を付与する変異を導入することにより、効率的に増強することができる（ロシア特許第2003677 C1号及び第2119536 C1号）。

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを搭載するベクターで形質転換されたエシェリヒア・コリFERM-P 5038及び5048（特開昭56-005099号）、アミノ酸排出遺伝子であるrhtで形質転換されたエシェリヒア・コリ株（EP1016710 A2）、スルファグアニジン、ＤＬ−１，２，４−トリアゾール−３−アラニン、及びストレプトマイシンに対する耐性が付与されたエシェリヒア・コリ80株（VKPM B-7270, RU2119536 C1）、エシェリヒア・コリMG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR（RU2119536、Doroshenko V.G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149-154）などが挙げられる。

Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌及びＬ−イソロイシン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、6-ジメチルアミノプリンに対して耐性を有する変異株（特開平5-304969号）、チアイソロイシンやイソロイシンヒドロキサメ
ートなどのイソロイシンアナログに対して耐性を有する変異株、さらにＤＬ−エチオニン及び／又はアルギニンヒドロキサメートに対して耐性を有する変異株（特開平5-130882号）が挙げられる。さらに、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もＬ−イソロイシン生産菌または親株として使用できる（特開平2-458号、EP 0356739 A1及び米国特許第5,998,178号）。

Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌またはＬ−ロイシン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、ロイシン耐性のエシェリヒア・コリ株（例えば、57株（VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号））、β-2-チエニルアラニン、3-ヒドロキシロイシン、4-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログに耐性のエシェリヒア・コリ株（特公昭62-34397号及び特開平8-70879号）、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたエシェリヒア・コリ株、エシェリヒア・コリH-9068（特開平8-70879号）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

Ｌ−ロイシン生産菌及びＬ−ロイシン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−ロイシン生合成に関与する１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたα-イソプロピルマレートシンターゼをコードする変異型leuA遺伝子（米国特許第6,403,342 B1号）に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、Ｌ−ロイシン生産菌及びＬ−ロイシン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、細菌細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子（ygaZH遺伝子）が挙げられる（EP 1239041 A2）。

Ｌ−リジン生産菌
Ｌ−リジン生産菌及びＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア属に属し、Ｌ−リジンアナログに対して耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害はＬ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、限定するものではないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられる。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人為的変異誘発処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産に有用な細菌株の具体例としては、エシェリヒア・コリAJ11442（FERM BP-1543、NRRL B-12185、米国特許第4,346,170号参照）及びエシェリヒア・コリVL611が挙げられる。これらの株では、Ｌ−リジンによるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が解除されている。

Ｌ−リジン生産菌及びＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする1種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、限定するものではないが、ジヒドロジピコリネートシンターゼ（dapA）、アスパルトキナーゼIII（lysC）、ジヒドロジピコリネートレダクターゼ（dapB）、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ（lysA）、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ppc）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、及びアスパルターゼ（aspA）（EP1253195 A）をコードする遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP 1170376 A）、ニ
コチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（pntAB）（米国特許第5,830,716 A号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、またはこれらの組合せの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIIIはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するために、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子を使用してもよい（米国特許5,932,453号明細書）。また、ジヒドロジピコリネートシンターゼはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するために、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリネートシンターゼをコードする変異型dapA遺伝子を使用してもよい。

Ｌ−リジン生産菌またはＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株においては、Ｌ−アミノ酸の生合成経路から分岐してそれ以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。また、Ｌ−リジン生産菌またはＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株においては、Ｌ−リジンの合成または蓄積に負に作用する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。そのようなＬ−リジン生産に関与する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA、ldcC）、リンゴ酸酵素などが挙げられ、これらの酵素の活性を低下または欠損させた株はWO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175などに開示されている。

リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることができる。両遺伝子の発現は、例えば、WO2006/078039に記載の方法により低下させることができる。

Ｌ−リジン生産菌及びＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア・コリWC196株（米国特許第5,827,698号）、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldc株、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldc/pCABD2株（WO2006/078039）も挙げられる。

WC196株は、エシェリヒア・コリK-12に由来するW3110株から、W3110株にAEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、エシェリヒア・コリAJ13069と命名され、1994年12月6日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現、NITE IPOD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM P-14690が付与された。その後、1995年9月29日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。

WC196ΔcadAΔldc株は、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊することにより、WC196株から構築された。WC196ΔcadAΔldc株はAJ110692と命名され、2008年10月7日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、NITE IPOD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM BP-11027で国際寄託として寄託された。

WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株は、WC196ΔcadAΔldcC株に、リジン生合成遺伝子を含むプラスミドpCABD2を導入することにより構築された（米国特許第6,040,160号）。プラスミドpCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するジヒドロジピコリネートシンターゼ（DDPS）をコードするエシェリヒア・コリ由来の変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIをコードするエシェリヒア・コリ由来の変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリネートレダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼをコードするddh
遺伝子を含む。

Ｌ−リジン生産菌及びＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア・コリAJIK01（NITE BP-01520）も挙げられる。AJIK01株はエシェリヒア・コリAJ111046と命名され、2013年1月29日にNITE IPOD（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託されている。その後、2014年5月15日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管され、受託番号NITE BP-01520が付与されている。

Ｌ−メチオニン生産菌
Ｌ−メチオニン生産菌及びＬ−メチオニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリAJ11539（NRRL B-12399）、AJ11540（NRRL B-12400）、AJ11541（NRRL B-12401）、AJ11542（NRRL B-12402）（英国特許第2075055号）、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシンに対して耐性を有するエシェリヒア・コリ218株（VKPM B-8125、RU2209248 C2）及び73株（VKPM B-8126、RU2215782 C2）などが挙げられる。エシェリヒア・コリ73株は、2001年5月14日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^stDorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8126で寄託され、2002年2月1日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管された。さらに、メチオニンリプレッサー欠損株、及びホモセリントランスサクシニラーゼやシスタチオニンγ-シンターゼなどのメチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株（特開2000-139471号）もＬ−メチオニン生産菌または親株として使用できる。

Ｌ−オルニチン生産菌
Ｌ−オルニチンはＬ−アルギニン生合成経路の中間体であるので、Ｌ−オルニチン生産菌及びＬ−オルニチン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、上記したようなＬ−アルギニン生合成酵素をコードする1種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。

また、Ｌ−オルニチン生産菌は、任意のＬ−アルギニン生産菌、例えばエシェリヒア・コリ382株（VKPM B-7926）から、argF及びargI両遺伝子によりコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼを不活性化することにより容易に得ることができる。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼを不活性化する方法は本明細書に記載する。

Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌及びＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリAJ12739（tyrA::Tn10, tyrR）（VKPM B-8197）、変異型pheA34遺伝子を保持するエシェリヒア・コリHW1089（ATCC 55371、米国特許第5,354,672号）、エシェリヒア・コリMWEC101-b（KR8903681）、エシェリヒア・コリNRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146、及びNRRL B-12147（米国特許第4,407,952号）、エシェリヒア・コリK-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB]（FERM BP-3566）、エシェリヒア・コリK-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD]（FERM BP-12659）、エシェリヒア・コリK-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm]（FERM BP-12662）、並びにAJ12604と命名されたエシェリヒア・コリK-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB]（FERM BP-3579、EP488424 B1）が挙げられる。さらに、Ｌ−フェニルアラニン生産菌及びＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するために使用することができる親株としては、yedA遺伝子またはyddG遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も挙げられる（米国特許出願2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1）。

Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌及びＬ−プロリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、ilvA遺伝子を欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるエシェリヒア・コリ702ilvA（VKPM B-8012、EP1172433 A1）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。Ｌ−プロリン生産菌及びＬ−プロリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−プロリン生合成に関与する1種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。Ｌ−プロリン生産菌において使用することができるそのような遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子が挙げられる（DE3127361 A1）。さらに、Ｌ−プロリン生産菌及びＬ−プロリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、細菌の細胞からのＬ−アミノ酸の排出を担うタンパク質をコードする遺伝子の1種またはそれ以上遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子（ygaZH遺伝子）（EP1239041 A2）が挙げられる。

Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404（英国特許第2075056号）、VKPM B-8012（ロシア特許出願第2000124295号）、DE3127361 A1に記載のプラスミド変異株、Bloom F.R. et al “The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34”に記載のプラスミド変異株などのエシェリヒア・コリ株が挙げられる。

Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌及びＬ−スレオニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリTDH-6/pVIC40（VKPM
B-3996、米国特許第5,175,107号及び第5,705,371号）、エシェリヒア・コリ472T23/pYN7（ATCC 98081、米国特許第5,631,157号）、エシェリヒア・コリNRRL-21593（米国特許第5,939,307号）、エシェリヒア・コリFERM BP-3756（米国特許第5,474,918号）、エシェリヒア・コリFERM BP-3519及びFERM BP-3520（米国特許第5,376,538号）、エシェリヒア・コリMG442（Gusyatiner et al., Genetika (Russian), 1978, 14:947-956）、エシェリヒア・コリVL643及びVL2055（EP1149911 A2）、エシェリヒア・コリVKPM B-5318（EP0593792 A1）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

TDH-6株は、thrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、そのilvA遺伝子がリーキー（leaky）変異を有する。この株は、また、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。VKPM B-3996株は、プラスミドpVIC40を保持する株であり、TDH-6株にプラスミドpVIC40を導入することにより得られたものである。プラスミドpVIC40は、変異型thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンをRSF1010由来ベクターに挿入することにより得たものである。この変異型thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。VKPM B-3996株は、1987年11月19日にAll-Union Scientific Center of Antibiotics（Russian Federation, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street 3-A）に受託番号RIA 1867で寄託されている。VKPM B-3996株は、1987年4月7日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）にも受託番号B-3996で寄託されている。

B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターに置換されている。VKPM B-5318株は、1990年5月3日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）に受託番号VKPM B-5318で寄託されている。

Ｌ−スレオニン生産菌あるいはＬ−スレオニン生産菌を誘導するために使用することができる親株は、さらに下記の遺伝子の1種またはそれ以上の発現が増強されるように改変されていてもよい：
- スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異型thrA遺伝子、
- ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子、
- スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子;
- スレオニン及びホモセリン排出系の推定膜貫通型タンパク質をコードするrhtA遺伝子、
- アスパルテート-β-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子、
- アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子。

エシェリヒア・コリのアスパルトキナーゼI-ホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードするthrA遺伝子は明らかにされている（KEGG、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes、エントリーNo. b0002、GenBank accession No. NC_000913.2、ヌクレオチド位置337〜2,799、Gene ID 945803）。thrA遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12の染色体においてthrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。

エシェリヒア・コリのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b0003、GenBank accession No. NC_000913.2、ヌクレオチド位置2,801〜3,733、Gene ID 947498）。thrB遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12の染色体においてthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。

エシェリヒア・コリのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b0004、GenBank accession No. NC_000913.2、ヌクレオチド位置3,734〜5,020、Gene ID 945198）。thrC遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体においてthrB遺伝子とyaaX遺伝子との間に位置する。これらの３つの遺伝子全部が、単一のスレオニンオペロンthrABCとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増強するためには、転写に影響するアテニュエーター領域をオペロンから除去することが望ましい（WO2005/049808 A1、WO2003/097839 A1）。

スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性のアスパルトキナーゼI-ホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異型thrA遺伝子、ならびにthrB遺伝子及びthrC遺伝子は、エシェリヒア・コリスレオニン生産株VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から単一のオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。

エシェリヒア・コリのスレオニン及びホモセリン排出系（内膜輸送体）のタンパク質をコードするrhtA遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b0813、GenBank accession No. NC_000913.2、ヌクレオチド位置848,433〜849,320、相補鎖、Gene ID 947045）。rhtA遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体上、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQオペロン近くのdps及びompX遺伝子の間に位置する。rhtA遺伝子はybiF遺伝子（KEGG、エントリーNo. B0813）と同一である。

エシェリヒア・コリのアスパルテート-β-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b3433、GenBank accession No. NC_000913.2、ヌクレオチド位置3,571,798〜3,572,901、相補鎖、Gene ID947939）。asd遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体上、同じ鎖上に位置するglgB及びgntU遺伝子の間に位置する（yhgN遺伝子は反対鎖上）。

また、エシェリヒア・コリのアスパルテートアミノトランスフェラーゼをコードするaspC遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b0928、GenBank accession No. NC_000913.2、ヌクレオチド位置983,742〜984,932、相補鎖、Gene ID 945553）。aspC遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12の染色体上、反対鎖上のycbL遺伝子と同一鎖上のompF遺伝子との間に位置している。

Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌及びＬ−トリプトファン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、変異型trpS遺伝子にコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼを欠損したエシェリヒア・コリJP4735/pMU3028（DSM10122）及びJP6015/pMU91（DSM10123）（米国特許第5,756,345号）、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するエシェリヒア・コリSV164(pGH5)（米国特許第6,180,373
B1号）、酵素トリプトファナーゼを欠損するエシェリヒア・コリAGX17(pGX44)（NRRL B-12263）及びAGX6(pGX50)aroP（NRRL B-12264）（米国特許第4,371,614号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が増強されたエシェリヒア・コリAGX17/pGX50,pACKG4-pps（WO97/08333、米国特許第6,319,696 B1号）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。Ｌ−トリプトファン生産菌及びＬ−トリプトファン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、yedA遺伝子またはyddG遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も挙げられる（米国特許出願公開第20030148473 A1号及び第20030157667 A1号）。

Ｌ−トリプトファン生産菌及びＬ−トリプトファン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、アントラニレートシンターゼ、ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ、トリプトファンシンターゼから選ばれる１種またはそれ以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。そのような変異を有する株の具体例としては、フィードバック阻害が解除されたアントラニレートシンターゼを保持するエシェリヒア・コリSV164、及びフィードバック阻害が解除されたホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を含むプラスミドpGH5（WO94/08031 A1）をエシェリヒア・コリSV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

Ｌ−トリプトファン生産菌及びＬ−トリプトファン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株（特開昭57-71397号、特開昭62-244382号、米国特許第4,371,614号）も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン（trpBA）中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増強することによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増強することによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい（WO2005/103275）。

Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌及びＬ−バリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株（米国特許第5,998,178号）が挙げられる。ilvGMEDAオペロン中のアテニュエーショ
ンに必要な領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが望ましい。さらに、オペロン中のilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少していることが望ましい。

Ｌ−バリン生産菌及びＬ−バリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する変異株（米国特許第5,658,766号）も挙げられる。そのような株の例としては、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS遺伝子に変異を有するエシェリヒア・コリVL1970が挙げられる。エシェリヒア・コリVL1970は、1988年6月24日に、Russian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^stDorozhny Proezd, 1）に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。

さらに、増殖にリポ酸を要求し、且つ／又は、H⁺-ATPアーゼを欠損している変異株（WO96/06926 A1）もＬ−バリン生産菌または親株として用いることができる。

Ｌ−バリン生産菌及びＬ−バリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア・コリH81株（VKPM B-8066、例えばEP1942183 B1参照）、エシェリヒア・コリNRRL B-12287及びNRRL B-12288（米国特許第4,391,907号）、エシェリヒア・コリVKPM B-4411（米国特許5,658,766号）、エシェリヒア・コリVKPM B-7707（EP1016710 A2）なども挙げられる。

腸内細菌科に属する本発明の細菌は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化するように改変されている。

「リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化するように細菌が改変されている」との表現は、改変された該細菌においてリン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化されるような方法で該細菌が改変されていることを意味し得る。例えば、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の不活性化により弱化させることができる。

「リン酸トランスポーターをコードする遺伝子が不活性化される」との表現は、改変された遺伝子が、野生型又は非改変型のリン酸トランスポーターをコードする遺伝子を保持する細菌と比較して、完全に不活性であるか完全に機能しないタンパク質をコードしていることを意味し得る。さらに、遺伝子の一部の削除あるいは遺伝子の全体の削除、該遺伝子によりコードされるタンパク質中のアミノ酸置換（ミスセンス変異）を起こす1つまたはそれ以上の塩基の置換、終止コドンの導入（ナンセンス変異）、遺伝子のリーディングフレームをシフトさせる1つまたは2つの塩基の削除、薬剤耐性遺伝子及び／又は転写終結シグナルの挿入、あるいはプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等の遺伝子発現を制御する配列を含む該遺伝子の隣接領域の改変により、改変DNA領域が当該遺伝子を通常通りに発現することができなくてもよい。遺伝子の不活性化は、例えば、UV照射あるいはニトロソグアニジン（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）を使用する変異処理、部位特異的変異、相同組換えを使用した遺伝子破壊、及び／又は「Red/ET-ドリブンインテグレーション」または「λRed/ET-メディエーテッドインテグレーション」に基づいた挿入欠失変異（Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（11）:5978-5983; Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128）等の従来の方法によっても行うことができる。

「リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化されている」との表現は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化された改変された細菌における
リン酸トランスポータータンパク質の量が、非改変細菌、例えば、E. coli K-12等の野生型株又は親株、と比較して、低減されていることを意味してよい。

「リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化されている」との表現は、改変された細菌が、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現レベルが減少するように改変された、機能可能に同遺伝子に結合した領域（プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、転写終結シグナル等の遺伝子発現を制御する配列、リボソーム結合部位、及びその他の発現制御因子を含む）を含むこと、あるいはその他の例（例えばWO95/34672; Carrier T.A. and Keasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64を参照）を意味してもよい。「機能可能に遺伝子に結合する」との表現は、制御領域が、核酸分子または遺伝子の塩基配列に、該塩基配列の発現（例えば、増強された、増大した、構成的な、基底レベルの、抗終結化された、弱化された、脱制御化された、減少した、あるいは抑制された発現）、具体的には該塩基配列によりコードされた遺伝子産物の発現、を可能とするように結合していることを意味し得る。

「リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化されている」との表現は、具体的には、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現量、例えば該遺伝子のmRNAの量あるいは該遺伝子によりコードされるリン酸トランスポータータンパク質の量が、改変されていない細菌における量の、例えば50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、あるいは0%に低下していることも意味し得る。

リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現は、染色体DNA上のプロモーター等の遺伝子の発現制御配列をより弱いものに置換することにより弱化させることができる。プロモーターの強度はRNA合成の開始の頻度として定義される。プロモーターの強度を評価する方法及び強力なプロモーターの例はGoldstein M.A.らなどにより記載されている（Goldstein M.A. and Doi R.H., Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol.
Annu. Rev., 1995, 1:105-128）。さらに、WO0018935 A1に開示されるように、遺伝子のプロモーター領域に1つまたはそれ以上のヌクレオチド置換を導入し、それによりプロモーターを改変して弱化させることも可能である。さらに、シャイン・ダルガルノ（SD）配列、及び／又はSD配列と開始コドンの間のスペーサー、及び／又はリボソーム結合部位（RBS）中の開始コドンの直ぐ上流及び／又は下流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に大きく影響することが知られている。RBSの改変は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の転写を低下させることと組合せてもよい。

リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現は、トランスポゾンあるいは挿入配列（IS）を該遺伝子のコード領域（米国特許第5,175,107号）あるいは遺伝子発現を制御する領域に挿入することにより、あるいは紫外線（UV）の照射もしくはニトロソグアニジン（Ｎ-メチル-Ｎ’-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン、NGT）による変異処理などのような慣用の方法により、弱化することもできる。さらに、例えば、λRed/ET-メディエーテッドリコンビネーション（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2000, 97(12):6640-6645）に基づいた、公知の染色体改変方法により部位特異的な変異の導入を行うことができる。

リン酸トランスポーターをコードする遺伝子のコピー数、遺伝子の存在あるいは不在は、例えば、染色体DNAを制限処理した後、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッテイング、または蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）等を行うことにより、測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等の様々な周知の方法を使用して遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することにより決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEと、その後の免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）やタンパク質試料の質量分
析等の公知の方法により測定することができる。

プラスミドDNAの調製、DNAの切断、DNAの結合、DNAの形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、変異の導入等の、DNAの組換え分子の操作及び分子クローニングのための方法は、当業者に周知の通常の方法であってよい。そのような方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、あるいはGreen M.R. and Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （2012）、Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak and
Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4^th ed., Washington, DC, ASM Press（2009）に記載されている。

PitAトランスポーター又はPitB等のそのホモログ若しくは変異体タンパク質の無機リン酸輸送活性は、放射性のリン-33（33P）を用いて標識した無機リン酸の取り込みを評価することによって決定することができる（Harris R.M.ら、Characterization of PitA and PitB from Escherichia coli, J. Bacteriol., 2001, 183(17):5008-5014）。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質として使用し、ブラッドフォード（Bradford）のタンパク質アッセイによって決定することができる（Bradford M.M.、A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 1976, 72:248-254）。

「リン酸トランスポーターをコードする遺伝子（phosphate transporter-encoding gene）」との用語は、遺伝子であって、リン酸トランスポーターをコードするものを意味し得る。リン酸トランスポーターをコードする遺伝子は、pitA遺伝子、及び、例えばpitB遺伝子等のそのホモログ又は変異体塩基配列であってよい。pitA、pitB、並びにそのホモログ及び変異体塩基配列のより具体的な説明は以下に示す。

pitA遺伝子（同義語：pit）は、低親和性の無機リン酸トランスポーター１であるPitA（KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（京都遺伝子ゲノム百科事典）, エントリー番号b3493; Protein Knowledgebase（プロテイン・ナレッジベース）, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P0AFJ7）をコードする。pitA遺伝子（GenBank受託番号NC_ 000913.3; ヌクレオチド位置: 3637642〜3639141; 遺伝子ID: 948009）は、E. coli K-12株の染色体において反対鎖上のyhiN遺伝子とuspB遺伝子との間に存在している。E. coli K-12株のpitA遺伝子の塩基配列、及びE. coli K-12株のpitA遺伝子によってコードされるPitAタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示す。

pitB遺伝子は、低親和性の無機リン酸トランスポーター２であるPitB（KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（京都遺伝子ゲノム百科事典）, エントリー番号b2987; Protein Knowledgebase（プロテイン・ナレッジベース）, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P43676）をコードする。pitB遺伝子（GenBank受託番号NC_ 000913.3; ヌクレオチド位置: 3134872〜3136371, 相補体; 遺伝子ID: 947475）は、E. coli K-12株の染色体において、反対鎖上のyghT遺伝子と同一鎖上のgss遺伝子との間に存在している。E. coli K-12株のpitB遺伝子の塩基配列、及びE. coli K-12株のpitB遺伝子によってコードされるPitBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示す。

腸内細菌科の属、種、または株の間でDNA配列に幾分かの相違があり得ることから、pitA及びpitB遺伝子は、配列番号１及び３に示す遺伝子に限定されず、配列番号１及び３に対する変異体塩基配列又は相同塩基配列であって、変異体PitA及びPitBタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。

「変異体タンパク質」の用語は、配列番号２又は４と比較して、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加のいずれであるにせよ、1つまたは数個の変更を配列中に有するタンパク質であって、PitA又はPitBタンパク質のものに類似する活性または機能（例えば上記したようなγ−グルタメートシステインリガーゼの活性）を維持しているか、PitA又はPitBタンパク質の三次元構造が野生型又は非改変型のタンパク質に対して有意には変更されていないタンパク質を意味し得る。変異体タンパク質中の変異の数は、タンパク質の三次元構造中の位置あるいはアミノ酸残基の種類による。変異体タンパク質中の変更の数は、厳密に限定されるものではないが、配列番号２又は４において1〜30、別の例では1〜15、別の例では1〜10、あるいは別の例では1〜5であってよい。これは、アミノ酸には互いに高い相同性を有するものがあり、そのような変更によっても、活性あるいは機能が影響されないか、PitA又はPitBの三次元構造が野生型又は非改変型のタンパク質と比較して有意に変化しないからである。従って、pitA及びpitB遺伝子によってコードされる変異体タンパク質は、PitA又はPitBタンパク質の活性あるいは機能が維持されるか、PitA又はPitBの三次元構造が野生型又は非改変型のタンパク質と比較して有意に変更されない限り、配列番号２又は４のアミノ酸配列全体に対して80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、あるいは99%以上の、コンピュータプログラムBLASTを使用する際のパラメーター「同一性」として定義される、相同性を有するものであってよい。

１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例としては、保存的変異が挙げられる。保存的変異の代表的なものは保存的置換である。保存的置換は、限定するものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ala、Leu、Ile、Val間で、置換部位が親水性アミノ酸である場合にはGlu、Asp、Gln、Asn、Ser、His、Thr間で、置換部位が極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合にはLys、Arg、His間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、置換部位がヒドロキシル基を有するアミノ酸である場合には、Ser、Thr間で、互いに置換する置換である。保存的置換の例としては、AlaからSerまたはThrへの置換、ArgからGln、HisまたはLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、HisまたはAspへの置換、AspからAsn、GluまたはGlnへの置換、CysからSerまたはAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、AspまたはArgへの置換、GluからAsn、Gln、LysまたはAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、ArgまたはTyrへの置換、IleからLeu、Met、ValまたはPheへの置換、LeuからIle、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、MetからIle、Leu、ValまたはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、SerからThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへの置換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、及びValからMet、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。

１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例としては、非保存的変異も挙げられ、ただし、その変異は、アミノ酸配列の異なる位置の1つまたはそれ以上の第2の変異により、変異体タンパク質の活性または機能が維持され、PitA又はPitBタンパク質のものに類似しているか、あるいは野生型又は非改変型のタンパク質と比較してPitA又はPitBの三次元構造が有意に変更されないように、補償されるものである。

タンパク質またはDNAの相同性の程度を評価するためには、いくつかの計算方法、例えばBLAST検索、FASTA検索、及びClustalW法を使用することができる。BLAST（Basic Local
Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）検索は、プログラムblastp、blastn、blastx、megablast、tblastn、及びtblastxにより使用される発見的探索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlinらの統計学的方法（Karlin S.及びAltschul S.F. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87
:2264-2268; Karlin S.及びAltschul S.F. “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）を使用して、有意性を発見物に帰着させるものである。コンピュータプログラムBLASTは3つのパラメーター、すなわち、スコア、同一性、及び類似性、を計算する。FASTA検索法は、Pearson W.R.により記載されている（“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98）。ClustalW法は、Thompson J.D. et al.によって記載されている（“CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680）。

更に、pitA及びpitB遺伝子は、変異体塩基配列であってよい。「変異体塩基配列」の用語は、標準的な遺伝子コード表（例えば、Lewin B., Genes VIII, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458参照）に従ういずれかの同義アミノ酸コドンを使用して「変異体タンパク質」をコードする塩基配列を意味してよい。したがって、pitA及びpitB遺伝子は、遺伝子コードの縮重による変異体塩基配列であってよい。

また、「変異体塩基配列」の用語は、限定するものではないが、機能的なタンパク質をコードするものである限り、配列番号１又は３に示す配列に相補的な塩基配列と、または該塩基配列から調製し得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列も意味し得る。「ストリンジェントな条件」としては、特異的なハイブリッド、例えばコンピュータプログラムBLASTを使用する場合のパラメーター「同一性」として定義される相同性が75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、あるいは99%以上のハイブリッド、が形成され、非特異的なハイブリッド、例えば上記より相同性が低いハイブリッド、が形成されない条件が挙げられる。ストリンジェントな条件としては、例えば、1×SSC（標準クエン酸ナトリウムまたは標準塩化ナトリウム）、0.1% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、別の例においては0.1×SSC、0.1% SDSの塩濃度で60℃または65℃において１回以上、別の例において２または３回洗浄する条件が挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用されたメンブレンの種類に依存し、一般的には製造者により推奨されるものとすべきである。例えば、Amersham Hybond^TM-N+正荷電ナイロンメンブレン（GE Healthcare）のストリンジェントな条件下での推奨洗浄時間は15分である。洗浄工程は２または３回行うことができる。プローブとしては、配列番号１又は３に示す配列に相補的な配列の一部を使用してもよい。そのようなプローブは、配列番号１又は３に示す配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、該塩基配列を含むDNA断片を鋳型として使用するPCRによって調製することができる。プローブの長さは、50 bpを超えることが推奨されるが、ハイブリゼーション条件により適切に選択することができ、通常100 bp 〜1 kbpである。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件としては、50℃、60℃、あるいは65℃における2×SSC、0.1%SDSの条件が挙げられる。

エシェリヒア・コリのPitA及びPitBタンパク質をコードする遺伝子は既に解明されている（上記参照）ので、PitA及びPitBタンパク質の変異体タンパク質をコードする変異体塩基配列は、pitA又はpitB遺伝子の塩基配列に基づいて調製されたプライマーを利用するPCR（ポリメラーゼ連鎖反応、White T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189参照）により得ることができ、あるいは野生型のpitA又はpitB遺伝子を含むDNAをin vitroで例えばヒドロキシルアミンで処理することによる部位特異的変異法、あるいは野生型のpitA又はpitB遺伝子を保持する微生物、例えば腸内細菌科に属する細菌を紫外線（UV）照射もしくはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）及び亜硝酸等の突然変異誘発に通常使用される変異剤で処理する方法により得ることができ、あるいは完全長の遺伝子構造物として化学合成することができる。同様の方法によ
り、他の微生物のPitA及びPitBタンパク質並びにそれらの変異体タンパク質をコードする遺伝子を得ることができる。

「野生型タンパク質」の用語は、腸内細菌科の野生株または非改変株、例えば野生型であるエシェリヒア・コリMG1655株によって自然に生産される天然タンパク質を意味し得る。野生型タンパク質は、野生型細菌のゲノムに天然に生じる野生型又は非改変型の遺伝子によってコードされ得る。

ここに記載する細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本来的に有する細菌を、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化するように改変することによって取得することができる。あるいは、ここに記載する細菌は、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化するように既に改変された細菌に対してＬ−アミノ酸生産能を付与することにより取得することができる。

なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。

細菌は、本発明の範囲から逸脱することなく、上記のような性質に加えて、様々な栄養要求性、薬物耐性、薬物感受性、薬物依存性等の特定の性質を有することができる。

２．方法
本発明の方法は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリン等のＬ−アミノ酸、若しくはその塩、又はこれらの混合物を製造する方法を含む。具体的には、本発明の方法は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、及びＬ−プロリン、又はこれらの混合物を製造する方法を含む。更に詳しくは、本発明の方法は、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンを製造する方法を含む。

Ｌ−アミノ酸を製造する方法は、本明細書に記載した細菌を培養培地で培養してＬ−アミノ酸を培養培地又は菌体に生成、排出、及び／又は蓄積させる工程と、培養培地及び／又は菌体からＬ−アミノ酸を回収する工程を含み得る。回収されたアミノ酸はさらに精製してもよい。Ｌ−アミノ酸は遊離の形態、その塩もしくは水和物の形態、またはそれらと他の有機もしくは無機の化合物との付加物の形態、あるいはそれらの組合せとして生成されてもよい。例えば、Ｌ−アミノ酸のナトリウム、カリウム、アンモニウム等の塩を前記方法により製造することができる。具体的には、Ｌ−リジン塩酸塩（Ｌ−リジン・HCl）やＬ−アルギニン塩酸塩（Ｌ−アルギニン・HCl）等のＬ−アミノ酸の一塩酸塩を該方法により製造でき、また、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物（Ｌ−ヒスチジンHCl・H₂O）等のＬ−アミノ酸の一塩酸塩一水和物を前記方法により製造することができる。

細菌の培養、及び培地等からのＬ−アミノ酸の回収及び精製は、微生物を使用してＬ−アミノ酸製造する従来の発酵法と同様の方法で行うことができる。Ｌ−アミノ酸の製造のための培養培地は、炭素源、窒素源、硫黄源、無機イオン、並びにその他の有機及び無機成分を必要に応じて含む典型的な培地等の、合成培地あるいは天然培地でよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、シュクロース、澱粉加水分解物などの糖類、エタノール、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどのアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸などの有機酸、および脂肪酸などを使用す
ることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、およびアンモニア水などを使用することができる。培地は、これらの窒素源の1種またはそれ以上を含むことができる。硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンなどが挙げられる。培地は、炭素源、窒素源、及び硫黄源に加えて、リン源を含んでもよい。リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、ピロ燐酸などのリン酸ポリマーなどを使用することができる。ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチンアミド、ビタミンB12などのビタミンや、その他の必要物質、例えばアデニン、RNAなどの核酸、酵母エキスなどの有機栄養素などを、適当量（痕跡量であってもよい）存在させることができる。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオンなどを加えてもよい。

培養は、好気的条件下で16〜72時間、あるいは16〜65時間行うことができる。培養中の培養温度は、30〜45℃、あるいは30〜37℃の範囲内に制御することができる。pHは5〜8、あるいは6.0〜7.5の間に調節することができる。pHは、無機もしくは有機の酸またはアルカリ性物質、およびアンモニアガスを使用することにより調節することができる。

培養後、遠心分離や膜ろ過によって細胞や細胞デブリ等の固形分を液体培地から除去することができ、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、及び晶析などの慣用の技術の任意の組合せにより発酵液から目的のＬ−アミノ酸を回収することができる。

尚、回収される目的のＬ−アミノ酸組成物は、該Ｌ−アミノ酸以外に、例えば、菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物等を含んでいてもよい。Ｌ−アミノ酸は、所望の程度に精製されていてもよい。回収される目的物質の純度は、例えば50％（w/w）以上、好ましくは85％（w/w）以上、特に好ましくは95%（w/w）以上であってよい（U.S. Patent No. 5,431,933, Japanese Patent No. 1214636, U.S. Patent Nos. 4,956,471, 4,777,051, 4,946,654, 5,840,358, 6,238,714, U.S. Patent Published Application No. 2005/0025878）。

以下、下記の非限定的な実施例により本発明をより具体的に説明する。

実施例１ 不活性化されたpitA遺伝子を有するエシェリヒア・コリのＬ−ヒスチジン生産株の構築
１．１ エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の構築
「λRed/ETメディエーテッドインテグレーション」と呼ばれる、Datsenko K.A.及びWanner B.L.によって最初に開発された方法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）により、不活性化されたpitA遺伝子を有するエシェリヒア・コリ株を構築した。プライマーP1（配列番号：５）及びP2（配列番号：６）並びに鋳型としてpMW118-λattL-Km^R-λattRプラスミド（WO2005010175 A1）を使用するPCRにより、カナマイシン耐性マーカー（Km^R）を含むDNA断片を取得した（図１）。pMW118-λattL-Km^R-λattRプラスミドは、pMW118-attL-Tc^R-attRプラスミド（WO2005/010175）から、そのテトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をUC4Kプラスミド由来のカナマイシン耐性マーカー遺伝子（kan）で置換することにより構築した（Vieira J.とMessing J., Gene, 1982, 19（3）:259-268）。プライマーP1及びP2は、pitA遺伝子に隣接する領域及び鋳型プラスミド中のカナマイシン耐性を付与するkan遺伝子に隣接する両者に対して相同である。PCRの条件は次の通りとした：95℃で3分の変性；最初の2サイクルのプロフィール：95℃で1分、34℃で30秒、72℃で40秒；最後の30サイクルのプロフィール：95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で40秒；最後の伸長：72℃で5分。

得られたPCR産物1（配列番号７；1,613 bp）をアガロースゲルにおける電気泳動により精製し、温度感受性複製開始点を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリMG1655株のエレクトロポレーションに使用した。プラスミドpKD46（Datsenko K.A. and Wanner
B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）は、ラムダファージの2,154ヌクレオチドのDNA断片（ヌクレオチド位置31088〜33241、GenBank accession No. J02459）を含み、アラビノース誘導性P_araBプロモーターの制御下にあるλRed相同組換えシステムの遺伝子（γ、β、及びexo遺伝子）を含む。プラスミドpKD46は、前記PCR産物をエシェリヒア・コリMG1655株（ATCC 47076）の染色体に組込むために必要である。pKD46プラスミドを含むエシェリヒア・コリMG1655株は、E. coliGenetic Stock Center, Yale
University, New Haven, USA（Accession No. CGSC7669）から入手することができる。

エレクトロコンピテント細胞は以下のようにして調製した。エシェリヒア・コリMG1655/pKD46を、アンピシリン（100mg/L）を含むLB培地（Luria-Bertani培地、溶原性ブロスともいう、Sambrook, J. and Russell, D.W. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）において、30℃で一晩増殖させ、培養物をアンピシリン（100mg/L）及びＬ−アラビノース（1 mM）を含む5 mL のSOB培地（Sambrook J.ら, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2^nded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）で100倍に希釈した。得られた培養物を、通気（250rpm）しながら30℃でOD600が約0.6になるまで増殖させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水で3回洗浄することによりエレクトロコンピテント化した。エレクトロポレーションは、70μLの細胞及び約100ngのPCR産物を使用して行った。エレクトロポレーションを行った細胞を1 mL のSOC培地（Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2^nded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）において37℃で2.5時間培養し、溶原性ブロス（Sambrook, J. and Russell,
D.W. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）、アガー（1.5%）、及びカナマイシン（50 mg/L）を含むプレート上に植菌し、37℃で増殖させてKm^R組換体を選択した。pKD46プラスミドを脱落させるため、カナマイシン（50 mg/L）を含むＬ−アガーで42℃で2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン感受性を試験した。このようにしてKm^Rマーカーを有するエシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株を得た。

１．２． pitA遺伝子の欠失の確認
変異体エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株における、カナマイシン耐性遺伝子で標識されたpitA遺伝子の欠失をPCRにより確認した。遺伝子座特異的プライマーP3（配列番号８）及びP4（配列番号９）を確認に使用した。PCRの条件は次の通りとした：94℃で3分の変性；30サイクルのプロフィール：94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で2分；最後の伸長：72℃で6分。元のpitA遺伝子を有する親株であるエシェリヒア・コリMG1655の染色体DNAを鋳型として用いた反応で取得したPCR産物２は、長さが1,599 bpであった（配列番号10）。Km^Rマーカーを有する変異株であるエシェリヒア・コリMG1655ΔpitAの染色体DNAを鋳型として用いた反応で取得したPCR産物３は、長さが1,670 bpであった（配列番号11）。

実施例２ エシェリヒア・コリMG1655+hisG^r hisL'_Δ ΔpurRΔpitA株によるＬ−ヒスチジンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−ヒスチジン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株（実施例１）の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクション（Miller, J.H. (1972) ≪Experiments in Molecular Genetics≫, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）によりエシェリヒア・コリのＬ−ヒスチジン生産株MG1655+hisG^r hisL'_Δ ΔpurRに導入して、Km^Rマーカーを有するエシェリヒア・コリ1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurR ΔpitA株を得た。エシェリヒア・コリMG1655+hisG^r hisL'_Δ ΔpurR株は、Doroshenko V.G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG
1655 to obtain histidine-producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149-154に記載されている。カナマイシン耐性遺伝子で標識されたpitA遺伝子の欠失は、実施例１．２に記載したようにPCRによって検証した。

エシェリヒア・コリMG1655+hisG^r hisL'_Δ ΔpurR株及びMG1655+hisG^r hisL'_Δ ΔpurR ΔpitA株を、それぞれ、30℃で3時間、2 mLのLB培地中で培養した。その後、得られた培養物0.1 mLを20×200mmの試験管中の2 mLの発酵培地にそれぞれ接種し、グルコースが消費されるまで、回転式振盪機（250rpm）上、30℃で65時間振盪培養した。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとした。
グルコース 25.0
豆濃* 0.1（窒素量として）
Ｌ−アスパラギン酸 0.5
(NH₄)₂SO₄ 9.0
KCl 0.5
KH₂PO₄ 0.25
MgSO₄・7H₂O 0.2
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
ZnSO₄・7H₂O 0.01
アデノシン 0.1
チアミン-HCl 0.0005
ベタイン 1.0
CaCO₃ 30.0
*豆濃は大豆粕加水分解物（味の素）である。
グルコース、硫酸マグネシウム、ベタイン、及びCaCO₃は別々に殺菌した。pHは殺菌前に6M KOHにより6.0に調整した。

培養後、培地に蓄積したＬ−ヒスチジンの量を薄層クロマトグラフィー（TLC）により測定した。非蛍光性指示薬を含むSorbfilシリカゲル（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russian Federation）の0.11mmの層で被覆した10×20cm TLCプレートを使用した。Camag Linomatの５サンプルアプリケータを使用し、サンプルをプレート上にアプライした。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール:アセトン:25%アンモニア水:水（6:6:1.5:1、v/v）からなる移動相で展開した。ニンヒドリン溶液（1%、w/v；アセトン中）を可視化試薬として使用した。展開後、プレートを乾燥し、Camag TLCスキャナ3を用いて、winCATSソフトウェア（バージョン1.4.2）により520nmで検出する吸光度モードで走査した。

７つの独立した試験管発酵の結果（平均値）を表１に示す。表１から分かるように、改変株であるエシェリヒア・コリMG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurRΔpitA株は、親株であるエシェリヒア・コリMG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR株と比較して、より高い量のＬ−ヒスチジン（His）を生産することができた。

実施例３ エシェリヒア・コリ382 ilvA+ΔpitA株によるＬ−アルギニンの生産
エシェリヒア・コリ382 ilvA+株は、P1トランスダクション（Miller, J.H. (1972) ≪Experiments in Molecular Genetics≫, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）によりエシェリヒア・コリK-12株由来のilvA遺伝子の野生型アレルを導入することによって、エシェリヒア・コリのアルギニン生産株382（VKPM B-7926, EP1170358 A1）から取得した。エシェリヒア・コリ382株は、2000年4月10日にRussian National Collection of
Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-7926で寄託された、その後2001年5月18日にブダペスト条約に基づく寄託に移管された。

pitA遺伝子の不活性化のＬ−アルギニン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのアルギニン生産株382 ilvA+にP1トランスダクションにより導入し、Km^Rマーカーを有する382 ilvA+ΔpitA株を得た。

エシェリヒア・コリ382 ilvA+株及び382 ilvA+ΔpitA株を、それぞれ、32℃で5時間、2
mLのLB培地中で振盪培養した（220rpm）。その後、得られた培養物0.3 mLをそれぞれ20×200mm試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、回転式振盪機（220rpm）上、32℃で72時間培養した。

培養後、培地に蓄積したＬ−アルギニンの量を薄層クロマトグラフィー（TLC）により測定した。Sorbfilシリカゲル（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russian Federation）の0.11mmの層で被覆した10×20cm TLCプレートを使用した。Camag Linomatの５サンプルアプリケータを使用し、サンプルをプレート上にアプライした。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール:酢酸エチル:25%アンモニア水:水（4:2:1.25:2.5、v/v）からなる移動相で展開した。ニンヒドリン溶液（1%；アセトン中）を可視化試薬として使用した。展開後、プレートを乾燥し、Camag TLCスキャナ3を用いて、winCATSソフトウェア（バージョン1.4.2）により520nmで検出する吸光度モードで走査した。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとした。
グルコース 48.0
(NH₄)₂SO₄ 35.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 1.0
CaCO₃ 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に殺菌した。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌した。pHは7.0に調整した。

６つの独立した試験管発酵の結果（平均値）を表２に示す。表２から分かるように、改変株であるエシェリヒア・コリ382 ilvA+ΔpitA株は、親株であるエシェリヒア・コリ382
ilvA+株と比較して、より高い量のＬ−アルギニン（Arg）を生産することができた。

実施例４．エシェリヒア・コリ382ΔargGΔpitAによるＬ−シトルリンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−シトルリン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのシトルリン生産株382ΔargGにP1トランスダクションにより導入し、382ΔargGΔpitA株を得る。382ΔargG株は、「λRed/ET-メディエーテッドインテグレーション」と呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.により最初に開発された方法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）によりアルギニン生産株382（VKPM
B-7926、EP1170358 A1）の染色体上のargG遺伝子を削除することにより得られる。この方法に従い、argG遺伝子に隣接する領域と、鋳型プラスミド中の抗生物質耐性を与える遺伝子に隣接する領域の両領域に相同なPCRプライマーを構築する。プラスミドpMW118-λattL-cat-λattR（WO05/010175）をPCRの鋳型として使用する。

エシェリヒア・コリ382ΔargG株及び382ΔargGΔpitA株を、それぞれ、37℃で18時間、3 mLの栄養培地中で振盪培養する。得られた培養物0.3 mLをそれぞれ20×200mm試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、回転式振盪機上、32℃で48時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−シトルリンの量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。Ｌ−シトルリンを含むスポットを切り出し、0.5% CdCl₂水溶液でＬ−シトルリンを溶出させ、Ｌ−シトルリンの量を540nmで分光測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 48.0
(NH₄)₂SO₄ 35.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 1.0
Ｌ−イソロイシン 0.1
Ｌ−アルギニン 0.1
CaCO₃ 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。

実施例５．エシェリヒア・コリJM15（ydeD）ΔpitAによるＬ−システインの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−システイン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションによりエシェリヒア・コリのシステイン生産株JM15(ydeD)に導入してJM15(ydeD)ΔpitA株を得る。エシェリヒア・コリJM15(ydeD)株は、エシェリヒア・コリJM15（CGSC#5042、米国特許6,218,168 B1号）の派生株であり、ydeD遺伝子を含むDNAで形質転換されている（米国特許5,
972,663号）。ydeD遺伝子は膜タンパク質をコードし、いずれのＬ−アミノ酸の生合成経路にも関与しない。

Ｌ−システイン生産の評価のための発酵条件及び方法は、米国特許6,218,168 B1号の実施例６に詳細に記述されている。

実施例６．エシェリヒア・コリVL334thrC+ΔpitAによるＬ−グルタミン酸の生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−グルタミン酸生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのグルタミン酸生産株VL334thrC⁺（EP1172433 A1）に導入してVL334thrC⁺ΔpitA株を得る。VL334thrC⁺株は、2004年12月6日にRussian National Collection
of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^stDorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8961で寄託され、その後2004年12月8日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。

エシェリヒア・コリVL334thrC⁺株及びVL334thrC⁺ΔpitA株を、それぞれ、37℃で18〜24時間、Ｌ−アガープレートで培養する。その後、1白金耳分の細胞を20×200mmの試験管中の2 mLの発酵培地へ移し、30℃で3日間振盪培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−グルタミン酸の量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定し、ニンヒドリン（アセトン中の1%溶液）で染色し、0.5% CdCl₂を含む50%エタノールでＬ−グルタミン酸を溶出させ、Ｌ−グルタミン酸の量を540nmで測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 60.0
(NH₄)₂SO₄ 25.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.1
Ｌ−イソロイシン 0.07
CaCO₃ 25.0
グルコースとCaCO₃は別々に殺菌する。pHは7.2に調整する。

実施例７．エシェリヒア・コリ57ΔpitAによるＬ−ロイシンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−ロイシン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのロイシン生産株57（VKPM B-7386、米国特許6,124,121号）に導入して57ΔpitA株を得る。57株は、1997年5月19日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^stDorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-7386で寄託されている。

エシェリヒア・コリ57株及び57ΔpitA株を、それぞれ、37℃で18〜24時間、Ｌ−アガープレートで培養する。20×200mmの試験管中の4%シュクロースを含む2 mLのＬ−ブロス（Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）中、回転式振盪機（250rpm）上、32℃で18時間、各株を増殖させ、種培養物を得る。その後、発酵培地に0.2 mL（10%）の種材料を接種する。発酵は、20×200mmの試験管中の2 mLの最小発酵培地で行う。菌体は32℃で48〜72時間、250rpmで振盪して増殖させる。

培養後、培地に蓄積するＬ−ロイシンの量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 60.0
(NH₄)₂SO₄ 25.0
K₂HPO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.01
CaCO₃ 25.0
グルコースは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.2に調整する。

実施例８．エシェリヒア・コリAJ11442ΔpitAによるＬ−リジンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−リジン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのリジン生産株AJ11442にP1トランスダクションにより導入し、AJ11442ΔpitA株を得る。AJ11442株は、1981年5月1日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現NITE NPMD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託番号FERM P-5084で寄託され、FERM
BP-1543の受託番号を付与されている。pCABD2プラスミドは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するジヒドロジピコリネートシンターゼをコードするdapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIをコードするlysC遺伝子と、ジヒドロジピコリネートレダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含む（米国特許第6,040,160号）。

エシェリヒア・コリAJ11442株及びAJ11442ΔpitA株を、それぞれ、37℃で、ストレプトマイシン（20mg/L）を含むＬ−培地で培養する。得られた培養物0.3 mLをそれぞれ500-mLフラスコ中の必要な薬剤を含む20mLの発酵培地に接種し、攪拌速度115rpmの往復振盪機を使用して、37℃で16時間培養する。

培養後、培地中のＬ−リジンの量及び残存グルコースの量を公知の方法（Biotech-analyzer AS210、サクラ精器）で測定する。その後、各株の消費グルコースに対するＬ−リジンの収率を計算する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 40.0
(NH₄)₂SO₄ 24.0
K₂HPO₄ 1.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
酵母エキス 2.0
pHはKOHにより7.0に調製する。培地は115℃で10分間オートクレーブする。グルコースと硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃を180℃で2時間乾熱滅菌し、終濃度30g/lで培地に添加する。

実施例９：エシェリヒア・コリ382ΔargFΔargI,ΔpitAによるＬ−オルニチンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−オルニチン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのオルニチ
ン生産株382ΔargFΔargIにP1トランスダクションにより導入し、382ΔargFΔargI,ΔpitA株を得る。382ΔargFΔargI株は、「λRed/ ETメディエーテッドインテグレーション」と呼ばれる、Datsenko K.A.及びWanner B.L.によって最初に開発された方法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）により、Ｌ−アルギニン生産株382（VKPM B-7926、EP1170358 A1）の染色体上のargF及びargI遺伝子を順次削除することにより得られる。この方法に従い、argFまたはargI遺伝子に隣接する領域と、鋳型プラスミド中の抗生物質耐性を付与する遺伝子に隣接する領域の両領域に相同な2対のPCRプライマーが構築される。プラスミドpMW118-λattL-cat-λattR（WO05/010175）をPCRの鋳型として使用する。

エシェリヒア・コリ382ΔargFΔargI株及び382ΔargFΔargI,ΔpitA株を、それぞれ、37℃で18時間、3 mLの栄養培地中で振盪培養する。得られた培養物0.3 mLをそれぞれ20×200mm試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、回転式振盪機上で、32℃で48時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−オルニチンの量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。オルニチンを含むスポットを切り出し、0.5% CdCl₂水溶液でオルニチンを溶出させ、オルニチンの量を540nmで分光測定する。

発酵培地の組成（g/l）は以下のとおりとする。
グルコース 48.0
(NH₄)₂SO₄ 35.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 1.0
Ｌ−イソロイシン 0.1
Ｌ−アルギニン 0.1
CaCO₃ 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。

実施例１０：エシェリヒア・コリAJ12739ΔpitAによるＬ−フェニルアラニンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−フェニルアラニン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのＬ−フェニルアラニン生産株AJ12739に導入してエシェリヒア・コリAJ12739ΔpitA株を得る。AJ12739株は、2001年11月6日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^stDorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8197で寄託され、その後2002年8月23日にブダペスト条約に基づく寄託に移管された。

エシェリヒア・コリAJ12739株及びAJ12739ΔpitA株を、それぞれ、37℃で18時間栄養培地中で培養する。得られた培養物0.3mLを20×200mmの試験管中の3 mLの発酵培地にそれぞれ接種し、回転式振盪機上、37℃で48時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−フェニルアラニンの量を薄層クロマトグラフィー（TLC）により測定する。非蛍光性指示薬（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russian Federation）を含むSorbfilシリカゲルの0.11mmの層で被覆した10×15cm TLCプレートを使用する。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール:酢酸エチル:25%アンモニア水:水（40:40:7:16、v/v）からなる移動相で展開する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視
化試薬として使用する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 40.0
(NH₄)₂SO₄ 16.0
K₂HPO₄ 0.1
MgSO₄・7H₂O 1.0
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 2.0
Ｌ−チロシン 0.125
CaCO₃ 20.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。

実施例１１：エシェリヒア・コリ702ilvAΔpitAによるＬ−プロリンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−プロリン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのプロリン生産株702ilvAに導入して702ilvAΔpitA株を得る。702ilvA株は、2000年7月18日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^stDorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8012で寄託され、その後2001年5月18日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。

エシェリヒア・コリ702ilvA株及び702ilvAΔpitA株を、それぞれ、37℃で18〜24時間、Ｌ−アガープレートで培養する。その後、これらの株を実施例７（Ｌ−グルタミン酸の生産）と同様の条件下で培養する。

実施例１２：エシェリヒア・コリB3996ΔpitAによるＬ−スレオニンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−スレオニン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのスレオニン生産株VKPM B-3996に導入してB-3996ΔpitA株を得る。VKPM B-3996株は、1987年11月19日にAll-Union Scientific Center of Antibiotics（Russian Federation, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street, 3-A）に受託番号RIA 1867で寄託されている。該株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^stDorozhny proezd, 1）にも受託番号VKPM
B-3996で寄託されている。

エシェリヒア・コリVKPM B-3996株及びB-3996ΔpitA株を、それぞれ、37℃で18〜24時間、Ｌ−アガープレートで培養する。20×200mmの試験管中のグルコース（4%）を含む2 mLのＬ−ブロス（Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）中、回転式振盪機（250rpm）上、32℃で18時間、各株を増殖させ、種培養物を得る。その後、発酵培地に0.2 mL（10%）の種培養物を接種する。発酵は、20×200mmの試験管中の2 mLの最小培地で行う。菌体は32℃で65時間、250rpmで振盪して増殖させる。

培養後、培地に蓄積するＬ−スレオニンの量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。Ｌ−スレオニンを含むスポットを切り
出し、0.5% CdCl₂水溶液でＬ−スレオニンを溶出させ、Ｌ−スレオニンの量を540nmで分光測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 80.0
(NH₄)₂SO₄ 22.0
NaCl 0.8
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 0.8
FeSO₄・7H₂O 0.02
MnSO₄・5H₂O 0.02
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 1.0
CaCO₃ 30.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。抗生物質は殺菌後培地に添加する。

実施例１３．エシェリヒア・コリSV164(pGH5)ΔpitAによるＬ−トリプトファンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−トリプトファン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのトリプトファン生産株SV164(pGH5)に導入してSV164(pGH5)ΔpitA株を得る。SV164(pGH5)株は、エシェリヒア・コリSV164株にプラスミドpGH5を導入することにより得られる。SV164株（JP 3032013 B）は、エシェリヒア・コリKB862株（DSM7196）から得られ、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有する。プラスミドpGH5は、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を含む。SV164(pGH5)株については、米国特許第6,180,373 B1号あるいはEP0662143 B1に詳細に記載されている。

エシェリヒア・コリSV164(pGH5)株及びSV164(pGH5)ΔpitA株を、それぞれ、37℃で18時間、テトラサイクリン（20mg/L、pGH5プラスミドのマーカー）を含む3 mLの栄養培地中で振盪培養する。その後、得られた培養物0.3mLを20×200mmの試験管中のテトラサイクリン（20mg/L）を含む3 mLの発酵培地にそれぞれ接種し、250rpmの回転式振盪機上、37℃で48時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−トリプトファンの量をTLCにより測定する。非蛍光性指示薬（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russian Federation）を含むSorbfilシリカゲルの0.11mmの層で被覆した10×15cm TLCプレートを使用する。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール:酢酸エチル:25%アンモニア水:水（40:40:7:16、v/v）からなる移動相で展開する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。発酵培地成分を表３に示す。発酵培地成分は表に示すそれぞれの群（A、B、C、D、E、F、G及びH）で別々に殺菌し、殺菌中の好ましくない相互作用を回避する。

実施例１４．エシェリヒア・コリH81ΔpitA株によるＬ−バリンの生産
pitA遺伝子の不活性化のＬ−バリン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔpitA株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのバリン生産株H81にP1トランスダクションにより導入し、H81ΔpitA株を得る。H81株は、2001年1月30日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8066で寄託され、その後2002年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。

エシェリヒア・コリH81株及びH81ΔpitA株を、それぞれ、37℃で18時間、栄養培地中で培養する。得られた培養物（それぞれ0.1 mL）を、20×200 mmの試験管中の2mLの発酵培地にそれぞれ接種し、250rpmの回転式振盪機上、32℃で72時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−バリンの量をTLCにより測定する。非蛍光性指示薬（Stock
Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russian Federation）を含むSorbfilシリカゲルの0.11mmの層で被覆した10×15cm TLCプレートを使用する。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール:酢酸エチル:25%アンモニア水:水（40:40:7:16、v/v）からなる移動相で展開する
。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。

発酵培地組成（g/L）：
グルコース 60.0
(NH₄)₂SO₄ 15.0
KH₂PO₄ 1.5
MgSO₄・7H₂O 1.0
豆濃*（全窒素） 0.4
CaCO₃ 25.0
CaCO₃は、180℃で２時間乾熱殺菌する。pHは7.0に調整する。

本発明をその好ましい態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更や等価物の採用が可能であることは当業者に明らかであろう。本明細書中に引用した文献はすべて参照により本明細書に組み込まれる。

本発明によれば、腸内細菌科の細菌によるＬ−アルギニン及びＬ−ヒスチジン等のＬ−アミノ酸の生産を改善することができる。

Claims (5)

1. Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、
   （i）腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌を培養培地で培養し、培養培地若しくは細菌の細胞又はその両者中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させること、及び
   （ii）培養培地若しくは細菌の細胞又はその両者からＬ−アミノ酸を回収することを含み、
   前記細菌が、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が弱化するように改変されており、
   前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属に属するものであり、
   前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アルギニンまたはＬ−ヒスチジンであり、
   前記リン酸トランスポーターをコードする遺伝子が、pitA遺伝子またはpitB遺伝子である、方法。
2. 前記細菌がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１に記載の方法。
3. 前記リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の発現が、リン酸トランスポーターをコードする遺伝子の不活性化により弱化されている、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記リン酸トランスポーターをコードする遺伝子が欠失している、請求項３に記載の方法。
5. 前記リン酸トランスポーターをコードする遺伝子が、下記（A）〜（G）からなる群から選択されるDNAである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
   （A）配列番号１の塩基配列を含むDNA、
   （B）配列番号３の塩基配列を含むDNA、
   （C）遺伝暗号の縮重による配列番号１又は配列番号３の変異体塩基配列を含むDNA、
   （D）配列番号１又は配列番号３の塩基配列全体に対して90％以上の塩基配列の同一性を有し、無機リン酸輸送活性を有するタンパク質をコードするDNA、
   （E）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
   （F）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、及び
   （G）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置
   換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、無機リン酸輸送活性を有するタンパク質をコードするDNA。
   

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