JP6460794B2 - イミノ糖のｎ−酸および／またはピペコリン酸類に富む桑抽出物 - Google Patents

Description

[0001] 本発明は、桑(mulberry)（クワ属(Morus)）植物の葉から得られるイミノ糖のＮ−酸（天然および塩基性イミノ糖ではなく）および／またはピペコリン酸類に富む抽出物に関する。

[0002] これらの抽出物は酵素活性をもつことが示され、これによりこれらの化合物に富む抽出物、およびこれらの抽出物から単離した化合物は、疾患、特に代謝障害、たとえば糖尿病（これがすべてではない）の処置に使用するための良い候補となった。

定義
[0003] イミノ糖は広く分布する一群の植物性および微生物性化合物であり、それらはヒトのグリコシダーゼ、他のタンパク質および糖受容体と相互作用する能力をもつ。本明細書においては、それらをポリヒドロキシル化第二級および第三級アミンとみなす；これらにおいて、分子は単糖に類似するが、この場合は環酸素が窒素で置き換えられている。この分類に当てはまる自然界で最も一般的な５種類の環構造がある：
ａ．ピロリジン、
ｂ．ピペリジン、
ｃ．ピロリジジン、
ｄ．インドリジジン、および
ｅ．ノル−トロパン。

[0004] 自然界では、これらの水溶性の副次的植物性化合物の大部分は、これらよりはるかに多量に存在する他の水溶性の主要化合物、たとえば一般的な糖類、ペプチドおよびアミノ酸の存在により隠されており、さらにイミノ糖酸(imino sugar acid)（ＩＳＡ）は広く存在する塩基性イミノ糖、たとえば下記のものにより隠されている：
ａ．１ デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、
ｂ．ファゴミン(Fagomine)、
ｃ．１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール（ＤＡＢ）、および
ｄ．カリステギン(calystegine)Ｂ２。

[0005] 本発明の新規な抽出物は前記イミノ糖のＮ−酸に富み、それにはイミノ糖のＮ−アルカン酸(alkyloic acid)、たとえばＮ−エタン酸、プロパン酸およびブタン酸ＤＡＢ、ならびにＮ−エタン酸、プロパン酸およびブタン酸ＤＮＪが含まれるが、それらに限定されない。それらはピペコリン酸類にも富む。

[0006] 富むとは、イミノ糖のＮ−酸および／またはピペコリン酸類が抽出物中に５％より多い、より好ましくは１０％より多い、より好ましくは１５％（ｗｔ／ｗｔ）よりさらに多い量（重量）で存在することを意味する。

[0007] 好ましくは、イミノ糖のＮ−酸およびピペコリン酸類の両方を含有する画分は、１０％より多量、２０％より多量、および３０％〜４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上（ｗｔ／ｗｔ）を構成する。

[0008] 抽出物中に存在する他の成分には、オリゴ糖成分およびアミノ酸成分が含まれる可能性がある。

[0009] 抽出物の一般的な質量バランスは下記のとおりであろう：
ａ．イミノ糖酸５〜２５重量％、一般に１５％；
ｂ．ピペコリン酸類５〜３５重量％、一般に２０％；
ｃ．オリゴ糖５〜２５重量％、一般に１５％；および
ｄ．アミノ酸（中性および酸性）２５〜７５重量％、一般に５０％。

[0010] しかし、オリゴ糖およびアミノ酸成分を減少させてイミノ糖酸およびピペコリン酸類の相対量を増加させ、したがってそれらが抽出物の主成分を構成するようにし、および／または個々の成分を抽出物から単離することができる。

[0011] １９７６年、桑植物の抗糖尿病活性を研究していたYagiらはＤＮＪを単離し、それがαおよびβグルコシダーゼ酵素ファミリーの有効な阻害剤であることを見出した。

[0012] 医療化学ではその後、ＤＮＪ骨格を利用してＮ−ヒドロキシエチルＤＮＪ（ミグリトール(Miglitol)）を製造し、それを抗糖尿病薬（Ｇｌｙｓｅｔ（登録商標））として開発するのに成功した。しかし、それの広域グリコシダーゼ活性は副作用を引き起こす。

[0013] 本発明は、WO2011/032502に開示された抽出物を発展させたものである；それには、桑植物の葉から得られた、グルコシダーゼを阻害し、血糖値の制御のために使用できる抽出物が記載されている。

[0014] その明細書は、その抽出物がイミノ糖に富み、最高４０重量％を含有すると教示している。その抽出物はさらに、最高７０％のアミノ酸を含有する。

[0015] 記載された抽出物は水に易溶性で、淡黄色またはほぼ白色であり、１％水溶液状で５．５〜６．５のｐＨをもち、２１８および２６３ｎｍに最大吸収ピークをもつ。

[0016] その抽出物は血糖値を制御するのに有用であると教示されている。

[0017] それらの例は、その組成物が抽出物の５．２％〜３９％（ｗ／ｗ）の量のイミノ糖を含み、主要イミノ糖であるＤＮＪは全抽出物の１．４％〜１８．６％（ｗ／ｗ）の量で存在するが、すべての場合にＤＮＪ含量はイミノ酸含量（それのＤＮＪ、Ｎ−メチルＤＮＪおよびファゴミン含量により測定）の少なくとも１９％（ｗ／ｗ）を構成することを示す。

[0018] その抽出物は下記により調製された：
ａ．水またはエタノール抽出を実施する；
ｂ．強酸性カチオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィーを実施し、結合した画分をアンモニアで溶離して採集する；
ｃ．溶出液にマクロ多孔質樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー処理を施し、溶出液を採集する；そして
ｄ．抽出物を濃縮および乾燥させる。

[0019] 例１（５．８％のＤＮＪ、２１％の総糖類）において、ＩＣ５０（αグルコシダーゼを阻害）は純ＤＮＪについての７０μｇ／ｍｌと比較して１３．６μｇ／ｍｌであることが観察された。

[0020] その抽出物において同定された他のイミノ糖には、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−アラビニトール（ＤＡＢ）、２−Ｏ α−Ｄ−ガラクトピラノシル−ＤＮＪ（ＧＡＬ−ＤＮＪ）およびカリステギンＢ２が含まれていた。

[0021] さらに、ＤＡＢがグリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤であることに注目してる。

[0022] 得られた画分は一般に出発材料（桑葉）の約０．０４〜１．４％（ｗ／ｗ）を構成していた。

[0023] 著しい量のＤＮＪ（一般に５〜１０重量％のＤＮＪ）を含有するこれらおよび他の桑抽出物についての問題点は、ＤＮＪがいずれか１種類のα−グルコシダーゼの選択的阻害剤ではなく、したがって著しい量のＤＮＪを含有する抽出物は二糖消化酵素を含めた多数のグルコシダーゼを阻害することにより副作用を生じることである。

[0024] 単剤方式での代謝性疾患の処置の追及についてのさらなる問題点は、これらが一般に単一機序により作動することである；大部分の代謝障害は多数の作用を特徴とし、それらは消化管からのグルコースの取込みを低下させるだけでなく多数の機序による処置から有益性を受けるであろう。

WO2011/032502

[0025] 本発明の目的は、多数のレベルで作動でき、またはより大きな特異性を提供し、したがって代謝障害などの疾患の処置に際してより有効および／またはより安全になる可能性があり、予防または治療効果をもつ可能性がある、組成物を開発することまたは化合物を単離することである。

[0026] 本発明の第１側面によれば、
ａ．水溶性である；
ｂ．α−グルコシダーゼを阻害する；ならびに
ｃ．抽出物の重量の５％（ｗ／ｗ）を超える、イミノ糖のＮ−酸、および／またはピペコリン酸類を含む
ことを特徴とする、桑葉から得られる精製した抽出物が提供される。

[0027] 好ましくは、イミノ糖のＮ−酸、および／またはピペコリン酸類は、抽出物の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、またはそれ以上を構成する。

[0028] 好ましくは、イミノ糖のＮ−酸は、ＤＡＢ、ＤＮＪ、ファゴミンまたはカリステギンＢ２のうち１種類以上のＣ１−Ｃ９アルカン酸を含む。これらは、エタン酸、プロパン酸およびブタン酸を含む。

[0029] 好ましくは、抽出物はさらにグリコーゲンホスホリラーゼを阻害する。この活性はＤＡＢの非存在下でみることができる。

[0030] 好ましくは、抽出物はコメのαグルコシダーゼを優先的かつ選択的に阻害する。

[0031] 精製した抽出物はさらにオリゴ糖およびアミノ酸を含む可能性がある。

[0032] 好ましい態様において、精製した抽出物は下記の質量バランスをもつ：
ａ．イミノ糖酸が抽出物の５〜２５重量％を構成し；
ｂ．ピペコリン酸類が抽出物の５〜３５重量％を構成し；
ｃ．オリゴ糖が抽出物の５〜２５重量％を構成し；
ｄ．アミノ酸が抽出物の２５〜７５重量％を構成する。

[0033] アミノ酸は主に酸性アミノ酸を含み、オリゴ糖はデオキシ糖、アリールグリコシドおよびウロン酸を含む通常みられない三糖以上の糖類を含む。

[0034] 大部分の非酸性イミノ糖、たとえばＤＮＪおよびＤＡＢは除去され、したがってイミノ糖はイミノ糖含量の１９％（ｗ／ｗ）未満のＤＮＪ、１５％（ｗ／ｗ）未満、１０％（ｗ／ｗ）未満、５％（ｗ／ｗ）未満、３％（ｗ／ｗ）未満、１％（ｗ／ｗ）未満のＤＮＪを含む。

[0035] 精製した抽出物は白色の半結晶質または非晶質材料であり、出発材料の重量と比較して少なくとも２００倍、しばしば１０００倍以上に精製されているであろう。

[0036] 精製した抽出物は、ナリンギナーゼ、グルコシダーゼ、もしくはマンノシダーゼ；グルクロニダーゼもしくはヘキソサミニダーゼ；またはαおよびβガラクトシダーゼもしくはＩ−ｄ−ウロニダーゼのうちの１以上の阻害剤としても作用することができる。

[0037] 抽出物は下記のものから得られる：
ａ．マグワ(Morus alba L.)
ｂ．ロソウ(Morus alba var. multicaulis L.)
ｃ．クロミグワ(Morus nigra)、または
ｄ．ヤマグワ(Morus australis Poir)。

[0038] 精製した抽出物は強酸性カチオン交換樹脂を用いて得られ、精製プロセスでさらに強塩基性アニオン交換樹脂および／または弱塩基性アニオン交換樹脂を使用できる。

[0039] ＤＮＪが主要なイミノ糖ではない抽出物の選択は一般的な考えに反する。

[0040] 桑（クワ属）植物の葉から得られるイミノ糖のＮ−酸（塩基性イミノ糖ではなく）および／またはピペコリン酸類に富む抽出物の使用は、これまで示唆されていない。

[0041] 本発明の抽出物は、酸性イミノ糖およびピペコリン酸類に富む（ＤＮＪまたはＤＡＢはごくわずかしか含まれない）、効力の高い桑葉抽出物である。

[0042] これに対し、大部分の市販の桑葉抽出物は、ＤＮＪが最も多量に存在するイミノ糖であって一般に桑葉イミノ糖の５０％を占めるイミノ糖含量をもつ(Asano et al. 2001 J. Agric. Food Chem. 49:4208-4213)。

[0043] 本発明の抽出物はイミノ糖酸（ＩＳＡ）および／またはピペコリン酸類が富化され、それらは他の成分、たとえばオリゴ糖およびアミノ酸と共に、またはそれらを含まずに存在することができる。

[0044] 存在するＩＳＡの代表的構造には、下記の一般式１〜５の化合物が含まれる。

[0045] 式１
Ｒ−ＤＡＢ

式中のＲは、Ｃ１−Ｃ９直鎖アルカン酸基(alkanoic group)、たとえばエタン酸、プロピオン酸またはブタン酸である。

[0046] 式２
Ｒ−ＤＮＪ

式中のＲは、Ｃ１−Ｃ９直鎖アルカン酸基、たとえばエタン酸、プロピオン酸またはブタン酸である。

[0047] 式３
Ｒ−ファゴミン

式中のＲは、Ｃ１−Ｃ９直鎖アルカン酸基、たとえばエタン酸、プロピオン酸またはブタン酸である。

[0048] 式４
Ｒ−５−ヒドロキシピペコリン酸

式中のＲは、Ｃ１−Ｃ９直鎖アルカン酸基、たとえばエタン酸、プロピオン酸またはブタン酸である。

[0049] 式５
Ｒ−カリステギンＢ２

式中のＲは、Ｃ１−Ｃ９直鎖アルカン酸基、たとえばエタン酸、プロピオン酸またはブタン酸である。

[0050] イミノ糖ＤＮＪについて選択的ではなく、代わりに実質的にＩＳＡ含有および／またはピペコリン酸類について選択的であって実質的にそれらに富む抽出物は、報告されているいずれの桑葉抽出物とも著しく異なる。より具体的には、それらは下記のように異なる。

[0051] （１）本発明の抽出物は、一般的な桑葉抽出物のものと全く異なる化学的プロフィールを備えた新規なものである。本発明の抽出物の最も顕著で重要な化学的特色のひとつは、多様なＮ−置換イミノ糖を含むことであり、それらはイミノ糖由来の有望な薬物候補の供給源とみられる。置換イミノ糖の好例には、Ｎ−アルキル化イミノ糖、すなわちわずか２つの承認されたイミノ糖ベースの薬物が含まれる：ミグリトール(Miglitol)（Ｇｌｙｓｅｔ）−ＩＩ型糖尿病に適応されるＮ−２−ヒドロキシエチルアルキル化イミノ糖、ならびにミグルスタット(Miglustat)（Ｚａｖｅｓｃａ）、すなわちＩ型ゴーシェ病およびＣ型ニーマン−ピック病に適応されるＮ−ブチル−ＤＮＪ；しかし、本発明はＮ−アルキロイック(alkyloic)置換を教示する。

[0052] （２）本発明の抽出物は一般的な桑葉抽出物のものと異なる、おそらく好ましい生物活性プロフィールをもつ；たとえば酵素阻害においてより大きな特異性をもち、療法効果を増強しかつ副作用を低減する。ＤＮＪにより起きる消化器副作用はそれの非選択的なグルコシダーゼ阻害によるものであり、ＤＮＪ含量の低下によって最小限に抑えることができる。さらに、Ｎ−アルキル置換ＩＳＡは活性分子の親水性／疎水性を変化させてそれらの生物学的利用能および膜透過性または結合親和性を改善することができた。また、ＩＳＡに富む組成物は活性化合物の立体構造の可変性（たとえば、キラリティー）を増大させて、シャペロン仲介活性機序がリソソーム貯蔵障害などの関連疾患の処置に関与するのを可能にした。

[0053] （３）本発明の抽出物は、前記に述べたそれらのユニークな特色のため、療法スペクトルをメタボリックシンドローム、ＩおよびＩＩ型糖尿病から抗ウイルス、抗炎症、またはＩ型ゴーシェ病のような希少疾患の範囲にまで拡大できた。

[0054] （４）本発明の抽出物は、より良い安全性プロフィールをもつはずである。桑葉はそれ自体がきわめて安全な薬草材料であり、カイコにとって唯一の食物であり、ヒトにおいて生の形態または水煎剤として伝承医療に数千年間用いられてきた。

[0055] （５）本発明の抽出物の調製方法は、有機溶媒を用いずに容易にスケールアップすることができる。一般的な植物化学研究および大部分の現在の商業的調製方法において、植物抽出物は通常は極性の異なる種々の有機溶媒、たとえばエタノール、メタノール、酢酸エチル、アセトン、ジクロロメタンなどの使用により採取され、濃縮される。水溶性成分は植物材料中に残るか、あるいは精製プロセスで廃棄される。多くの場合、この方法はスケールアップして反復するのが不可能ではないとしても困難であり、最終抽出物中の残留溶媒が問題となる可能性がある。

[0056] したがって、イミノ糖のＮ−酸およびピペコリン酸類に富む本発明の抽出物の調製は、WO2011/032502に教示されるものより優れた分画工程を伴なう。好ましい方法には、下記の使用を含む各種イオン交換法の使用が含まれる：
ａ．強酸性カチオン交換樹脂、たとえばＤｏｗｅｘ ５０またはＩＲ１２０；
ｂ．強塩基性アニオン交換樹脂、たとえばＤｏｗｅｘ １、Ｄｏｗｅｘ ２、またはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ４００；および
ｃ．弱塩基性アニオン交換樹脂、たとえばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ４５。

[0057] 本発明のさらなる側面によれば、本発明の抽出物を含む医薬製剤、栄養補助食品または食品成分が提供される。

[0058] 本発明のよりさらなる側面によれば、代謝障害を処置するための、本発明の精製した抽出物の使用が提供される。

[0059] この抽出物は下記のうちの１以上を提供することができる：
ａ．インスリン抵抗性の低下；
ｂ．体重減少；
ｃ．血中脂質管理；および
ｄ．ベータ細胞の保護。

[0060] 好ましい態様において、抽出物を糖尿病の処置に使用する。

[0061] 本発明のよりさらなる側面によれば、下記の工程を含む、本発明の精製した抽出物を調製する方法が提供される：
ａ．桑葉から水溶性抽出物を採集する；
ｂ．目的画分を結合する強酸性カチオン交換樹脂を用いてイミノに富む画分を選択し、水で洗浄し、次いで目的画分をアンモニアで溶離する；そして
ｃ．下記のうち１以上を用いて酸性画分を選択する：
ｉ．第２の強酸性カチオン交換樹脂；
ｉｉ．強塩基性アニオン交換樹脂；および
ｉｉｉ．弱塩基性アニオン交換樹脂。

[0062] 好ましくは、工程ｃｉ）において保持されなかった画分を選択し、ｃｉｉ）およびｃｉｉｉ）のうちの１以上を用いてその画分をさらに精製する。

[0063] 本発明のよりさらなる側面によれば、本発明の抽出物から化合物を単離し、それらを酵素活性についてスクリーニングすることを含む、代謝障害の処置に使用するための化合物をスクリーニングする方法が提供される。

[0064] 例示にすぎないが、後記の実施例、ならびに実施例４および５に関連する添付の図面を参照して、本発明をさらに記載する。図面において、
図１は、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ粗抽出物のＧＣ ＭＳクロマトグラムである。 図２は、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍ粗抽出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムである。 図３は、９．５分目のイミノ糖の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。 図４は、ＩＲ１２０に保持されたＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ（イミノ糖画分）１．３８ｇのＧＣ ＭＳクロマトグラムである。 図５は、ＩＲ１２０に保持されたＩｍｉｎｏＮｏｒｍ（イミノ糖画分１）６．１４ｇのＧＣ−ＭＳクロマトグラムである。 図６ａおよびｂは、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍからの２つの未同定イミノ糖の質量スペクトルである。 図７ａおよびｂは、ＩＲ１２０に保持されたＩｍｉｎｏＮｏｒｍ（イミノ糖画分２）２３ｇのＧＣ−ＭＳクロマトグラム、およびファゴミンの質量スペクトルである。 図８ａ、ｂおよびｃは、ＩＲ１２０に保持されたＩｍｉｎｏＮｏｒｍ（イミノ糖画分３）２５．５ｇのＧＣ−ＭＳクロマトグラム、およびヒドロキシル化ピペコリン酸類の２つの質量スペクトルである。 図９は、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅからのＤＮＪのＮ−エタン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。 図１０は、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅからのＤＡＢ−Ｎ−エタン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。 図１１は、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍからのＤＮＪのＮ−エタン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。 図１２は、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍからのＤＡＢ−Ｎ−エタン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。 図１３は、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍからのＤＮＪのＮ−プロパン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。 図１４は、本発明の抽出物がマウスの血糖値に及ぼす効果を示すグラフである。

[0065] 以下に示す実施例は、特許請求の範囲に示す本発明の抽出物および単離した化合物を調製する方法、ならびに特許請求の範囲に示す状態の処置に使用する方法の例示を提供し、例示のために提示されるにすぎない。

[0066] 本発明を検討した出発点は、WO2011/032502に開示された抽出物である。

[0067] 一般的な理由付けに反して抽出物のαグリコシダーゼ活性が純ＤＮＪのものより大きいことに注目して、本出願人はＤＮＪを除去して種々の小画分の活性を調べることを決断した。これらの実験により、イミノ糖のＮ−酸およびピペコリン酸類に富む良好な活性を示す画分を同定した；この所見をもたらした実験の詳細を以下に示す。

実施例１
出発抽出物
[0068] マグワ（Morus alba）葉の乾燥抽出物バッチＭＬ０９１２１０
方法
[0069] 試料を水に溶解し、強酸性カチオン交換（２×３０ｃｍのカラム内のＩＲ１２０ Ｈ^＋形樹脂）クロマトグラフィーにより分画して、下記のものを得た：
ｉ．水により排除された保持されなかった試料（主に、糖類、フラボノイド類などを含有すると予想される）；
ｉｉ．２Ｍピリジン（通常は、残存する糖類、フェノール類、ならびに中性および酸性アミノ酸類を分離する）により排除された結合画分；ならびに
ｉｉｉ．２Ｍアンモニア溶液により排除された結合画分（アルカロイド類［イミノ糖類］、および塩基性アミノ酸を含有すると予想される）。

[0070] 保持されなかった材料中に若干のＤＮＪが検出された（おそらく試料の過剰装填またはｐＨによるものであろう）ので、これを第２のＩＲ１２０カラム（同じ寸法）に通して、新たな保持されなかった試料および第２のアンモニア画分を得た。第２の保持されなかった試料はＤＮＪを含有しなかった。

[0071] これらの画分を下記の表１に示す。

[0072] これらの画分を凍結乾燥し、秤量した。アリコートをＧＣ−ＭＳにより、および５００ＭＨｚ ＮＭＲ分光測光法（Ｄ_２Ｏ中）により分析した。ＤＮＪ量をＧＣ−ＭＳおよびＮＭＲデータの両方により測定した。

ＧＣ−ＭＳ
[0073] 誘導体化する前にすべての試料を凍結乾燥した。トリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体は、ピリジン中のヘキサメチルジシラザンおよびトリメチルクロロシランの混合物（Ｐｉｅｒｃｅ ‘Ｔｒｉ−Ｓｉｌ’シリル化試薬，比率２：１：１０のＨＭＤＳ：ＴＭＣＳ：ピリジン）を用いて製造された。試料を６０℃で１５分間加熱し、次いで室温に少なくとも６０分間放置した。不溶性の反応生成物を遠心により沈降させ、注射器を用いて上清を新たなバイアルへ移した。

[0074] 高極性融解シリカカラム（Ｖａｒｉａｎ ‘Ｆａｃｔｏｒ Ｆｏｕｒ’ ＶＦ−５ｍｓカラム，２５ｍ×０．２５ｍｍ内径，０．２５μｍの相厚）を備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ ＸＬガスクロマトグラフを用いるＧＣ−ＭＳにより分析を実施した。キャリヤーガス（ヘリウム）流速は１ｍｌ ｍｉｎ^−１であった。１６０℃で開始して５分間、続いて３００℃まで１０℃ ｍｉｎ^−１の速度で直線的に上昇する温度プログラムを用いて、トリメチルシリル−（ＴＭＳ）誘導体を分離した。温度を３００℃にさらに１０分間保持した；総分析時間は２９分間であった。四重極イオンフィルターシステムを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＴｕｒｂｏＭａｓｓ Ｇｏｌｄ質量分析計を用い、これを分析期間中２５０℃で定常作動させて、カラム溶出液の電子衝撃質量分析を実施した。検出器質量範囲を１００〜６５０ａｍｕに設定した。移行ライン（ＧＣからＭＳへ）の温度を２５０℃に保持した。スプリットベント（スプリット比５０：１）により、失活石英ウールを充填した融解シリカ−ナローボア注入ライナーを通して試料をカラムに注入した；注入口温度を２００℃に維持した。注入体積は１μｌであった。システムコントロール、データ収集、および質量スペクトル分析は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＴｕｒｂｏＭａｓｓソフトウェア（ＴｕｒｂｏＭａｓｓ ｖ． ４．４）を用いて行なわれた。試料（バイアル内に１ｍｇの各試料）のピーク面積を純ＤＮＪ（バイアル当たり０．０５〜０．３３ｍｇ）を用いた検量曲線と比較することにより、ＤＮＪの定量を行なった。ＮＭＲデータを用いて試料中のＤＮＪを推定することにより定量を確認した。

グリコシダーゼアッセイ
[0075] アッセイにはｐ−ニトロフェニル基質およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した市販酵素を用いた。酵素を、２７℃で、その酵素に最適なｐＨの０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液中においてアッセイした。インキュベーション混合物は、酵素溶液１０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌの抽出物水溶液１０μｌ、およびその酵素に最適なｐＨの緩衝液中に構成した適宜な５ｍＭ ｐ−ニトロフェニル基質５０μｌからなっていた。開始時に桑画分を水で置き換えた非阻害アッセイを用いて決定しておいた反応の対数期に、７０μｌの０．４Ｍグリシン（ｐＨ１０．４）を添加することにより反応を停止した。Ｖｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４０５ｎｍで最終吸収を読みとった。アッセイを三重に実施し、示した数値はアッセイ当たり３つの反復の平均である。結果を阻害率％で表わす。

結果
[0076] ＩＲ１２０画分のＧＣ−ＭＳクロマトグラム（示していない）はすべてＤＮＪが優勢であった。

[0077] 保持されなかった物質は主に糖類であり、第２のＩＲ１２０カラムの後はＤＮＪまたは他のイミノ糖を含有していなかった。

[0078] 他のイミノ糖およびイミノ糖酸（ヒドロキシル化された非タンパク質イミノ酸）もそれらの特徴的な質量スペクトルにより検出された。

[0079] ３つの保持された画分ｂ）、ｃ）およびｄ）−表１−のＤＮＪレベルを測定し、表２に示す。

ＧＣ−ＭＳによる試料中のＤＮＪの定量
[0080] 表２

[0081] ファゴミン、ＤＡＢ、ピペコリン酸類（合計）、および１３．３５分目のイミノ糖の検出器応答が同じであると仮定して、１０ｇ中のこれらの化合物の量を下記のように推定する：
ａ．ファゴミン ５１ｍｇ
ｂ．ＤＡＢ ７．５ｍｇ
ｃ．ピペコリン酸類（合計） １６７ｍｇ
ｄ．１３．３５分目のイミノ糖 ７ｍｇ
[0082] ＮＭＲ分析（示していない）は、ＩＲ１２０に保持されなかった物質が主に糖類であることを示した；この画分はカチオン交換後の試料１０ｇの約５０％の重量であった。

[0083] ＤＮＪに伴なう主な窒素含有成分はアミノ酸であると判定された（厳密な同定は得られなかったが、フェニルアラニンおよびプロリンがＧＣ−ＭＳにより仮同定された）。

グリコシダーゼ活性
[0084] 社内でのグリコシダーゼアッセイ結果を表３に示す。

[0085] 有意量のＤＮＪが存在するとして、ＩＲ１２０に保持された画分についてのα−およびβ−グルコシダーゼ阻害を予測した。

[0086] 他のグリコシダーゼ、たとえばグルクロニダーゼおよびヘキソサミニダーゼの阻害をＤＮＪ、ＤＡＢまたはファゴミンに起因させることはできなかった。ピペコリン酸類と同定された主成分がこれら他のグリコシダーゼ阻害に関与している可能性はあった。

[0087] 糖尿病を含めた多数の疾患において、グルクロニダーゼおよびヘキソサミニダーゼ活性の血清レベルの上昇がみられる。

-gul :-グルコシダーゼ; -gal :-ガラクトシダーゼ; -fuc : -フコシダーゼ; -man :-マンノシダーゼ ; naringinase : ナリンギナーゼ ; N-acetyl-β-D-gulc : N-アセチル-β-D-グルコシダーゼ ; amyloglucosidase : アミログルコシダーゼ ; β-gulcuronidase :β-D-グルクロニダーゼ
Yeast : 酵母;:Bacillus : 桿菌 ; rice : コメ ; almond : アーモンド ; green coffee bean : 生コーヒー豆 ; bovine : ウシ ; Jack bean : タチナタマメ ; Cellulomonas : セルロモナス ; Penicillium : アオカビ ; Bovine kidney : ウシ腎臓 ; A. niger : 黒色こうじ菌 ; bovine liver : ウシ肝臓
mulberry fraction : 桑画分 ; IR120 unb : IR120に保持されなかった画分 ; ammonia : アンモニア画分 ; pyr : ピリジン画分
weak : 弱 ; potent : 強 ; moderate : 中
考察
[0088] ＩＲ１２０に保持された画分はすべてＤＮＪを含有するが、分析およびグリコシダーゼ結果はより広い範囲のグリコシダーゼ阻害があることを示す。

[0089] ＩＲ１２０に保持されなかった物質も若干のグリコシダーゼ阻害を示した；それは予想外であるが、これはこの画分の主成分であってグリコシダーゼアッセイを妨害する可能性がある糖類に起因すると思われる。

[0090] ＤＮＪ、ＤＡＢおよびファゴミンはすべてグルコシダーゼ阻害剤であり、ＩＲ１２０に保持された画分がＤＮＪにより影響されなかったグリコシダーゼを良好に阻害することは興味深い。

[0091] これらの酵素活性のうちの若干、たとえばヘキソサミニダーゼおよびグルクロニダーゼは、糖尿病を含めたさまざまな疾患において血清中または尿中に増加することが知られている。

[0092] 後続の実施例において、これらの画分をさらに分画して、これらの活性に関与する、より主要な成分をより決定的に同定した。

[0093] ピペコリン酸化合物は特に興味深い。

実施例２
[0094] 実施例１の抽出物を、カチオン交換クロマトグラフィー（ＩＲ１２０ Ｈ^＋形）を用いて４画分に分画した。

[0095] 保持されなかった画分は糖類を含有し、イミノ糖はピリジン、次いでアンモニアで排除された。

[0096] 保持された画分それぞれに若干のＤＮＪがみられたが、大部分は最初のアンモニア画分中にあった。他のイミノ糖も検出され、これには仮にファゴミン、ＤＡＢ、若干のヒドロキシル化イミノ酸、および新規な可能性がある他のイミノ糖とされるものが含まれていた。

[0097] 下記の表４は、実施例１の画分について認められた酵素阻害を示す。

[0098] 実施例２において、目的は下記のとおりであった：
ａ．４画分すべての成分をさらに分離する；
ｂ．ＧＣ−ＭＳおよび５００ＭＨｚ ＮＭＲにより化合物を分析して、可能な限り多数の成分を同定する；ならびに
ｃ．精製した化合物についてグリコシダーゼアッセイを実施して、異なる成分により生じる阻害をさらに区別する。

分析
[0099] この実施例は主に、実施例１で用いたマグワ葉抽出物１０ｇのさらなる分画を伴なう。

ＧＣ−ＭＳ
[00100] これは実施例１に従って実施された。

ＮＭＲ
[00101] これは実施例１に従って実施された。

グリコシダーゼアッセイ
[00102] これは実施例１に従って実施された。

精製方法
ａ）糖成分（ＩＲ１２０に保持されなかったもの）
[00103] 実施例１からのＩＲ１２０に保持されなかった画分は、ＧＣ−ＭＳにより主に糖類を含有することが示されたが、グリコシダーゼアッセイ（グリコーゲンホスホリラーゼを含む）においてかなり予想外の活性を示した。したがって、この試料をさらに分画して、一般的な糖類を通常みられない成分（おそらく活性を生じるもの）から分離し、若干の褐色の色（おそらくフェノール系）を除去した。

[00104] ５ｇを最小体積の蒸留水に溶解し、ＯＨ⁻形Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ４００アニオン交換樹脂のカラム（２×１０ｃｍ）に付与した。

[00105] １１の２ｍｌ水画分を採集した後、保持されている物質を１Ｍ ＨＯＡｃで分離した。試料を乾燥させ、ＧＣ−ＭＳ、ＮＭＲにより分析し、これらの分析に基づいて若干をグリコシダーゼアッセイおよびグリコーゲンホスホリラーゼアッセイに用いた。若干の褐色物質は永続的に樹脂に結合していた。

[00106] 得られた糖画分は無色またはわずかに黄色であった。若干を再混和してその後のさらなる分離に用いた。それらの画分を下記の表５に示す。

[00107] 若干の無機物質がＧＣまたはＮＭＲにより検出されない可能性はあるが、糖類の全重量はしたがって１０ｇの試料中３．７２８ｇの範囲にあると思われる。

ｂ）ピリジンおよびアンモニア画分
[00108] ＩＲ１２０のピリジンおよびアンモニア画分１および２をさらに分画して他の成分と共に存在するＤＮＪを減少させ、ＮＭＲによるそれらの構造推論が可能になるようにした。

[00109] これを達成するために、下記のものを用いて一連のカラムを操作した。

ａ．アニオン交換クロマトグラフィー（ＯＨ⁻およびＡｃ⁻形のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ４００）および
ｂ．弱酸性樹脂（アンモニウム形のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＣＧ５０）を用いるカチオン交換クロマトグラフィー
結果
ａ）糖分画
[00110] 糖類（実施例１からのＩＲ１２０に保持されなかった物質）のＣＧ４００分画は、初期画分中に糖アルコール類を示した。若干の一般的な単糖類（フラノースおよびピラノース）が画分全体に存在していた。二糖類が増加し、次いでさらに単糖類が主な酢酸画分中に示された（若干はおそらく酸加水分解によるものであろう）。興味深いことに、試験したすべての画分がグリコシダーゼおよびグリコーゲンホスホリラーゼ両方の阻害を示した。幾つかの通常みられない成分が検出された。

ｂ）イミノ糖画分（ＩＲ１２０のピリジンおよびアンモニア画分からのもの）
[00111] 実施例１で得たＩＲ１２０結合画分から、幾つかの化合物が部分精製されて、さらなる特性分析が可能になった。

[00112] 保持時間１０．３７分をもつ化合物は、ＧＣ−ＭＳによりＤＡＢ由来の構造体との良好な一致を示した。

[00113] 保持時間１２．９１分および１３．３１分をもつ化合物は、ＤＮＪに由来すると思われるピペリジンＮ−酸タイプの化合物との良好な一致を示した。

[00114] ＧＣ保持時間１９．３６分をもつ成分を精製した−３．３ｍｇ。この成分はグリコシドと一致する質量スペクトルデータを示したが、グリコシド類がＩＲ１２０樹脂に結合したのは異例である。

[00115] ファゴミンおよびＤＡＢタイプの化合物をさらに精製する試みを行なった。これらのうち若干は最終的に２．０ｍｇの単一画中に得られた。

[00116] ピペコリン酸類は画分ＪＨ０８０６／１０１／２３中に同定された。

[00117] 糖画分、ならびにトリゴネリン(trigonelline)（ＮＭＲスペクトルにみられたもの，式６）および６−ヒドロキシトリゴネリン（式７）（おそらくＮＭＲスペクトルにみられたが、きわめて微少な成分）のほかに、５つの画分すべてにつき酵素アッセイを行なった。

[00118] 式６
[00119] トリゴネリン

[00120] 式７
６−ヒドロキシトリゴネリン

化合物および画分についてのグリコシダーゼアッセイ
[00121] これらの画分についてのアッセイ結果を表６に示す。

gulcosidase :グルコシダーゼ; galactosidase :ガラクトシダーゼ; fucosidase : フコシダーゼ; mannosidase :マンノシダーゼ ; naringinase : ナリンギナーゼ ; N-acetyl-β-D-gulc : N-アセチル-β-D-グルコシダーゼ ; β-gulcuronidase :β-D-グルクロニダーゼ ;amyloglucosidase : アミログルコシダーゼ
Yeast : 酵母;:Bacillus : 桿菌 ; rice : コメ ; almond : アーモンド ; coffee bean : コーヒー豆 ; bovine : ウシ ; Jack bean : タチナタマメ ; Cellulomonas fini: セルロモナス・フィニ ; P. decumbens : ペニシリウム・デクンベンス ; Bovine kidney : ウシ腎臓 ; A. oryzae : 米こうじ菌 ; bovine liver : ウシ肝臓
compound : 化合物 ; PQ code : PQコード
19.4 min disacch comp : 19.5分目の二糖化合物 ; Calliandra pipecolic acid : マメ科ピペコリン酸 ; DAB N-acid tentative : DAB N-酸(仮) ; DAB and fagomine : DABおよびファゴミン
type : タイプ ; number : 番号
commertial : 市販品 ; trig : トリグリセリド ; sugar : 糖類
trigonellin : トリゴネリン
グリコーゲンホスホリラーゼアッセイ結果
[00122] これらのアッセイ結果を下記の表７に示す。

考察および結論
[00123] ＤＡＢおよびＤＮＪのＮ−酸として仮同定された若干の新規な天然化合物を含むイミノ糖を同定することができた。

[00124] 試料の糖画分は、グリコシダーゼおよびグリコーゲンホスホリラーゼ両方の阻害をも示す。

[00125] グルコースおよびスクロースなどの糖類はグリコーゲンホスホリラーゼまたはグリコシダーゼを阻害しない。

[00126] 若干の通常みられない成分が糖画分中に存在するとＧＣ−ＭＳにより同定され、これらがグリコシダーゼおよびグリコーゲンホスホリラーゼの阻害に関与すると推論される。これらの糖画分は分画されなかった抽出物のうち高い割合であり、したがって試料の活性に有意に寄与する可能性がある。

[00127] ＤＡＢはグリコーゲンホスホリラーゼ阻害を示すと報告されているが、分画されなかった抽出物は明らかにこの阻害を示す幾つかのイミノ糖成分を含む。

[00128] 抽出物中に同定されたピペコリン酸類およびトリゴネリンは、グリコーゲンホスホリラーゼに対する阻害性が大きくはなかった。ＤＮＪおよびファゴミンはこの酵素を阻害しない。ＤＡＢおよびＤＮＪのＮ−酸が活性成分である可能性は十分にある。

[00129] ＤＮＪ、ＤＡＢおよびファゴミンを除去した後、抽出物中の多数の成分が同様にグルコシダーゼを阻害した。

実施例３
[00130] 実施例２に記載した画分について実施した分析により、試料のイミノ糖類および糖類についてさらなる情報が得られた。

[00131] 糖画分は試料のほとんど半分を構成し、多様なグリコシダーゼおよびグリコーゲンホスホリラーゼに対して有効な活性を示した。

[00132] スクロース、トレハロースおよびグルコースなどの糖類はこれらの酵素を有意には阻害しない。

[00133] この実施例では、糖画分の活性成分を解明し、それの活性をさらに調べる試みを行なった。

[00134] これに関して、一連のイオン交換カラムを用いてそれをさらに分画した。

方法
[00135] 実施例１からのＩＲ１２０に保持されなかった画分につきアニオン交換樹脂ＣＧ４００（ＯＨ⁻形）でのクロマトグラフィーを行なって、水画分（１〜１１）および２つの酢酸画分を得た（表５−実施例２）。これらをこの実施例でさらに分画し、それらの画分の活性をさらに調べた。

分析
ＧＣ−ＭＳ
[00136] これは実施例１に従って実施された。

ＮＭＲ
[00137] これは実施例１に従って実施された。

グリコシダーゼアッセイ
[00138] これは実施例１に従って実施された。

精製方法
[00139] 糖試料のさらなる分画は、強塩基性アニオン交換樹脂ＣＧ４００の使用を伴ない、これはＯＨ⁻形で、およびアセテート形でも用いられた。

[00140] 画分を水中に採集し、凍結乾燥した。保持された物質を１Ｍ酢酸により分離し、これらの画分を回転蒸発によりほぼ乾固するまで蒸発させ、次いで凍結乾燥した。

結果
[00141] 糖試料をさらに精製し、可能性があるいずれかの無機物質を除去するために、すべての試料をＣＧ４００ ＯＨ⁻形により再クロマトグラフィー処理した。糖画分１〜１１を混和して試料１−１１にし、２つの酢酸試料を同様に混和した。

[00142] 両試料をＣＧ４００ ＯＨ⁻ ２×２０ｃｍカラムに装填し、水画分を採集した後、１Ｍ ＨＯＡｃで最終洗浄して、保持された物質を分離した。

[00143] 画分重量を下記の表８に示す。

[00144] 予想外に、第１のＣＧ４００ ＯＨ⁻カラムに保持されなかった試料１−１１が、今回は保持されたかなりの重量になった。これは、ｐＨ効果、または第１カラムの過剰装填の可能性を示唆する。

[00145] 試料１−１１の保持されなかった画分は、前記と同様に白色半結晶質物質であった。

[00146] 予想どおり酸試料は保持された画分中の最大重量を示したが、少量の物質が保持されず、試料３〜７が大部分のグリコシダーゼ阻害活性をもっていた。

[00147] 初期の１〜１１画分はＧＣピークを示さない白色半結晶質物質を含み、これは二糖類より大きな糖類であったことを示唆する。

[00148] 後の画分は若干の糖アルコール類を示したが、低い量であった。

[00149] 表８中のＡ〜Ｆとコードを付けた試料につきＮＭＲ分析を行なった。

[00150] Ａ、Ｂ、ＥおよびＦについてはグリコシダーゼアッセイも行ない、その結果を下記の表９にまとめる。

[00151] ＣＧ４００ ＯＨ⁻に保持された物質の試料（ＣおよびＤ）を、アセテート形ＣＧ４００を用いてさらに分画した。

[00152] 試料Ｃ（ＨＳ０８０４／１１９）は試料Ｄ（ＨＳ０８０４／１２０）と同様に良好な分離を示した。

[00153] Ｃ中の化合物は単糖類および二糖類に似ていたが、一般的な糖類であればＣＧ４００に保持されなかったであろう。

[00154] 試料Ｄは若干の類似する化合物を示したが、２４〜２５分の保持時間付近に若干のより大きな分子も示した。

[00155] 画分ＣおよびＤの量および活性を下記の表に示す。

表１０−ＣＧ４００アセテート形で分画した酸試料Ｃからの画分の重量

表１１−ＣＧ４００アセテート形で分画した酸試料Ｄからの画分の重量

[00156] 試料ＣおよびＤはアセテートカラムで良好に分画された。

[00157] 試料ＨＳ１２０／２を、ＣＧ４００アセテート形樹脂の２×１０ｃｍカラムで、５ｍｌの水画分、続いて１Ｍ ＨＯＡｃを用いてさらに分画して、試料ＨＳ０８０４／１２２を得た。

表１２−ＨＳ０８０４／１２０／２からの画分の重量

[00158] これらの試料のＧＣ−ＭＳ分析により、良好な分離および幾つかの興味深い成分が明らかになった。

[00159] 画分５、８、１０および１８につきアッセイを行なった。

[00160] これらの試料はコメのグルコシダーゼに対して興味深い選択性を示し、それは実施例２で調製した第１のＨＯＡｃ試料においても顕著であった。

[00161] 試料１−１１からの画分は、コメのグルコシダーゼだけでなく酵母および桿菌の酵素の良好な阻害をも示す傾向があった。

[00162] ＨＳ０８０４／１２２画分のＧＣ−ＭＳ分析は、新規な可能性がある幾つかの化合物を示した。１２２／１８中の１成分は、イミノ糖のかなり典型的な質量スペクトルを示し、他の若干の化合物は断片的にイミノ糖に対する若干の類似性をもっていた。

考察および結論
[00163] １０ｇのＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ試料から５．０２６ｇの糖画分を得た。アニオン交換クロマトグラフィーの後、これはおそらく無機または芳香族の物質の除去により、３．７２８ｇに減少した。ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ試料の３７％を構成するこの画分は、有意のグリコーゲンホスホリラーゼ阻害活性をもち、３種類のアルファ−グルコシダーゼも有効に阻害した。この実施例により、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅの糖類の活性が確認され、活性を備えた若干のより大きな糖類があり、またコメのアルファ−グルコシダーゼに対してより選択的な阻害を示す若干の糖酸の可能性（イミノ糖酸）があると判定された。

[00164] 哺乳動物系において活性な多数のグルコシダーゼがあり、すべてのグルコシダーゼの一斉阻害は何らかのオフターゲット作用を引き起こす可能性があるので、グルコシダーゼ間の活性の選択性はある障害を処置するために重要であることが示されている。グルコシダーゼの阻害剤は、欠陥のある糖タンパク質を産生する細胞に対してもシャペロニング活性によって有益な作用をもつ可能性があることも留意すべきである；そのような作用はアンチエージング特性に関係する可能性があると推測されている(Best et al., 2010)。

[00165] 実施例２からの元の糖画分のグリコシダーゼアッセイを拡張し、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ糖画分は特にある範囲のアルファ−グルコシダーゼの良好な阻害を示すことが示されたが、他の広範なグリコシダーゼのセットについては実施されていなかった。この阻害プロフィールはＤＮＪのものにある程度類似するが、ただしＤＮＪはグリコーゲンホスホリラーゼをも阻害することはない。この糖分画およびアッセイは、保持された成分は特にコメのグルコシダーゼを阻害するのに対し保持されなかった成分は試験した３種類すべてのアルファ−グルコシダーゼを阻害することを示す傾向がある。グリコーゲンホスホリラーゼ阻害は、ＣＧ４００ ＯＨ⁻に保持された画分および保持されなかった画分の両方にみられた。

[00166] 試料１−１１からのＣＧ４００ ＯＨ⁻に保持されなかった画分のＧＣ−ＭＳ分析はさほど情報価値がなかったが、ＮＭＲはかなり純粋に見える糖類が二糖類より大きいと推測されることを明らかにした。ＣＧ４００に保持された成分は良好なＧＣ−ＭＳデータを示し、かなり複雑であると思われる；若干の二糖類が存在する（スクロースではない）が、通常みられない糖類またはイミノ糖類も存在する（おそらく、カルボキシル基または芳香族単位がＣＧ４００に最初に保持されたと思われる）。糖画分は、有効なグリコシダーゼ活性およびグリコーゲンホスホリラーゼ活性を備えた若干の新規な糖類を含有すると結論された。その可能性は、ＣＧ４００ ＯＨ⁻に保持されなかった画分中にみられるこれらのより大きな糖類は新規であり、それらにコンジュゲートしたイミノ糖が活性を与えているということである。ＣＧ４００ ＯＨ⁻に保持された化合物は、より大きな糖類から離脱したより小さな単位の可能性があり、あるいは新規な糖酸である。

[00167] 試料Ａ（試料１−１１からのＣＧ４００ ＯＨ⁻に保持されなかった高活性画分）から取得したＮＭＲデータは良好な純度を示したが、そのようなより大きな糖類について得られた情報はきわめて少ない。

実施例４
[00168] 実施例４では抽出物の非イミノ糖画分の活性を確認することを試みた。

まとめ
[00169] この実施例により、桑抽出物中に存在するＤＮＪおよびＤＡＢのＮ−酸はＤＮＪおよびＤＡＢより選択的なアルファ−グルコシダーゼ阻害を示し、これらの化合物は哺乳動物β−グルクロニダーゼ、ヘキソサミニダーゼおよびa−Ｌ−イズロニダーゼの良好な阻害も示すことが確認された。

[00170] 血清中のβ−グルクロニダーゼおよびヘキソサミニダーゼは、糖尿病を含めた幾つかの疾患において増加する。

[00171] β−グルクロニダーゼが増加するとグルクロニドとしての毒素排出が低下する可能性があり、したがってこの酵素の阻害は健康に有益な可能性がある。

[00172] イミノ糖はグリコシダーゼに対して阻害剤とシャペロニング分子の両方として作用することができ、したがってそれらが阻害するグリコシダーゼの活性を阻害濃度下では増大させる可能性もあると報告されている。

[00173] ＤＮＪおよびＤＡＢのＮ−酸は新規な単離された天然産物である。

[00174] デオキシ糖およびアリール−グリコシドを含む通常みられない三糖類も仮同定された。

被験材料
[00175] ＩｍｉｎｏＮｏｒｍ ２００ｍｌ粗抽出物；および
[00176] ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ ５０ｇバッチ；表１３に示す
[00177] 表１３

分析
ＧＣ−ＭＳ
[00178] これは実施例１に従って実施された。

ＮＭＲ
[00179] これは実施例１に従って実施された。

グリコシダーゼアッセイ
[00180] これは実施例１に従って実施された。

精製方法
[00181] 糖試料のさらなる分画は、ＯＨ⁻形およびアセテート形の強塩基性アニオン交換樹脂ＣＧ４００の使用を伴なった。

[00182] 実施例３の記載に従って画分を水中に採集し、凍結乾燥した。

[00183] 保持された物質を１Ｍ酢酸により分離し、これらの画分を回転蒸発によりほぼ乾固するまで蒸発させ、次いで凍結乾燥した。

結果
[00184] 下記の表１４は、アニオン交換樹脂（ＣＧ４００）に保持されなかったＩｍｉｎｏＮｏｒｍおよびＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅの画分および保持された画分についてのa−グリコシダーゼ結果（２ｍｇ／ｍｌでの阻害率％）を提示する。

[00185] 試料ＩｍｉｎｏＮｏｒｍおよびＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ（WO2011/032502に記載される希釈抽出物）につき、さらに下記の操作を行なった：
１）カチオン交換クロマトグラフィー；および
２）アニオン交換クロマトグラフィー；先の実施例の記載に従った。

[00186] アニオン交換で保持された物質は、コメのα−グルコシダーゼのより特異的な阻害を示した。

[00187] アニオン交換樹脂に保持されなかった両試料の物質は、より広域のα−グルコシダーゼ阻害を示した。

[00188] イミノ糖ＤＡＢおよびＤＮＪのＮ−酸は、コメのα−グルコシダーゼの特異的阻害に関与すると思われる（グリコシダーゼの表１６を参照）。

[00189] アニオン交換樹脂には、比例してより多い重量の物質がＩｍｉｎｏＮｏｒｍから保持された（７１％）（表１５）；これは、おそらく糖類についてのそれの希釈度がより大きいことによるものであろう。

[00190] したがって、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅに添加された糖類は、その試料のアニオン交換により保持されなかった画分の重量に寄与した可能性がある。

[00191] しかし、両試料とも阻害活性をもっており、したがってＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅに添加した糖類が必ずしも活性をもつわけではなく、これは桑自体から生じたと思われる。

[00192] 表１５

[00193] ＤＮＪは両方の分画前抽出物の主成分であった。

[00194] ＧＣ−ＭＳクロマトグラム（および質量スペクトル）を図１〜１３に提示する。

[00195] 図面について下記のことが認められる：
[00196] 図１および２は、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅおよびＩｍｉｎｏＮｏｒｍの粗抽出物のＧＣ ＭＳクロマトグラムである。ＩｍｉｎｏＮｏｒｍクロマトグラムにおいて若干のイミノ糖が比較的高い濃度でみられることが認められるであろう。１つは図３に示す質量スペクトルをもつ化合物である（９．５分目）。

[00197] 図４および５は、それぞれＩＲ１２０に保持されたＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ（イミノ糖画分）１．３８ｇおよびＩＲ１２０に保持されたＩｍｉｎｏＮｏｒｍ（イミノ糖画分１）６．１４ｇのＧＣ−ＭＳクロマトグラムである。

[00198] ＩｍｉｎｏＮｏｒｍ試料は、高いイミノ糖含量のためカチオン交換樹脂（ＩＲ１２０）に２倍過剰装填された。

[00199] 結合した画分（２および３）を図７および８に示す；イミノ糖の若干優先的な排除が明らかである。塩基性イミノ糖はより中性または酸性のイミノ糖を排除する傾向がある。

[00200] ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅではわずかに見えるだけの２つの関連するイミノ糖が、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍのＩＲ１２０結合画分１ではかなり主要であり、これを利用してそれらのイミノ糖類（８．７２分目および９．４９分目）を精製および同定することができる。

[00201] 選択的排除により、新規な天然産物である３つのＤＡＢおよびＤＮＪのＮ−酸をさらに解明することもできた。これらのＮ−酸はＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅにも存在する。

[00202] 図６ａおよびｂは、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍからの２つの未同定イミノ糖の質量スペクトルである。

[00203] 図７ａはＩＲ１２０に保持されたＩｍｉｎｏＮｏｒｍ（イミノ糖画分２）２３ｇのＧＣ−ＭＳクロマトグラムであり、図７ｂはファゴミンの質量スペクトルである。

[00204] ＤＮＪは第２のＩＲ１２０に保持されたＩｍｉｎｏＮｏｒｍ画分中のはるかに主要なイミノ糖である。７．４分目のイミノ糖はファゴミンである。

[00205] 図８ａは、ＩＲ１２０に保持されたＩｍｉｎｏＮｏｒｍ（イミノ糖画分３）２５．５ｇのＧＣ−ＭＳクロマトグラムである。図８ＢおよびＣは、ヒドロキシル化ピペコリン酸類の２つの質量スペクトルである。

[00206] ヒドロキシル化ピペコリン酸類は第３のＩＲ１２０に保持されたＩｍｉｎｏＮｏｒｍ画分においてＤＮＪより主要である。それらの質量スペクトルおよび実施例２で同定したものを下記に示す。３．５９分目の主成分はフェニルアラニンの可能性がある。

[00207] 図９は、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ中のＤＮＪのＮ−エタン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。

[00208] 図１０は、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅからのＤＡＢ−Ｎ−エタン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。

[00209] 図１１は、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍ中のＤＮＪのＮ−エタン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。

[00210] 図１２は、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍからのＤＡＢ−Ｎ−エタン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。

[00211] 図１３は、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍ中のＤＮＪのＮ−プロパン酸の質量スペクトル（ｔｍｓ）である。

[00212] これらの酸の式を下記の式８〜１０に示す。

[00213] 式８
[00214] ＤＡＢのＮ−エタン酸

[00215] 式９
[00216] ＤＮＪのＮ−エタン酸

[00217] 式１０
[00218] ＤＮＪのＮ−プロパン酸

[00219] ＤＡＢおよびＤＮＪのＮ−酸は、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅ抽出物中では濃縮せずに見ることができるが、ＩｍｉｎｏＮｏｒｍ中ではより見えにくい。しかし、それらは両試料中に存在する。

[00220] これらの新規な単離した酸の活性を下記の表１４に示す。

イミノ糖Ｎ−酸についてのグリコシダーゼ結果（０．８ｍＭにおける阻害率％）

[00221] ＤＮＪ−Ｎ−プロパン酸は、ウシ肝臓β−グルクロニダーゼに対して３４０ｕＭ、ヒト組換えa−Ｌ−イズロニダーゼに対して３８３ｕＭのＩＣ_５０をもつ。

[00222] ＤＡＢ−Ｎ−エタン酸は、β−グルクロニダーゼに対して５２３ｕＭ、上記イズロニダーゼに対して１９６ｕＭのＩＣ_５０をもつ。

[00223] ＤＮＪ−エタン酸は、ウシβ−グルクロニダーゼに対して２０８ｕＭのＩＣ_５０をもつが、上記イズロニダーゼを０．８ｍＭでわずかしか阻害しない。

考察および結論
[00224] 実施例４は、ＤＮＪが除去されるとＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅとＩｍｉｎｏＮｏｒｍのグリコシダーゼ阻害プロフィールには大幅な類似性があることを立証する。

[00225] 両試料中にＤＮＪおよびＤＡＢのＮ−酸があり、これらはＤＮＪおよびＤＡＢよりより選択的なa−グルコシダーゼ阻害を示すが、これらの化合物は哺乳動物β−グルクロニダーゼ、ヘキソサミニダーゼおよびa−Ｌ−イズロニダーゼの良好な阻害も示す。

[00226] これらの化合物を含有する選択的画分は、明らかに医薬および食品成分として適用できる。

[00227] 血清中のβ−グルクロニダーゼおよびヘキソサミニダーゼは、糖尿病およびアルツハイマー病を含めた幾つかの疾患において増加する。β−グルクロニダーゼが上昇するとグルクロニドとしての毒素排出が低下する可能性があり、したがってこの酵素の阻害は健康に有益な可能性がある。イミノ糖はグリコシダーゼに対して阻害剤とシャペロニング分子の両方として作用することができ、したがってそれらが阻害するグリコシダーゼの活性を阻害濃度下では増大させる可能性もあると報告されている。

[00228] ＤＮＪおよびＤＡＢのＮ−酸は新規な天然産物である。

[00229] これらの実施例から、ＰｈｙｎｏＲａｄｉａｎｃｅとＩｍｉｎｏＮｏｒｍの両方にグリコシダーゼ阻害に寄与する幾つかの化合物があると結論できる。これらには、ＤＮＪ、ＤＡＢ、ファゴミン、ヒドロキシル化ピペコリン酸類、ＤＮＪおよびＤＡＢのＮ−酸、ならびにまだ解明されていない他のイミノ糖類が含まれる。アリール−グリコシド、および三糖類を含む糖類も、グリコシダーゼおよびグリコーゲンホスホリラーゼの阻害を示すことができる。

[00230] したがって、ヒドロキシル化ピペコリン酸類、ＤＮＪおよびＤＡＢのＮ−酸に富み、含有するイミノ酸ＤＮＪ、ＤＡＢおよびファゴミンのレベルが有意に低下した、選択的な水溶性の桑抽出物、または実質的に純粋なヒドロキシル化ピペコリン酸類、ＤＮＪおよびＤＡＢのＮ−酸を、医療に使用できる。これらの酸には、Ｎ−エタン酸ＤＡＢ及びＮ−エタン酸ＤＮＪが含まれる。

[00231] 実施例５
方法：
[00232] 本発明の抽出物（ＰＹＮ ８）が食後血糖スパイクを低下させる効力を、短期糖攻撃ｄｄｙマウスモデルにおいて評価した。１０匹のマウスを２グループ、すなわち処置グループおよびプラセボグループに分けた。動物に２．５ｇ／体重ｋｇのマルトースを５００ｍｇ／ｋｇのＰＹＮ８（有効アーム）または食塩水（対照）のいずれかと共に経口投与した。血糖濃度を０、１５分、３０分、６０分および１２０分の時点で測定して、マルトース摂取後の血糖値の低下に対する何らかの効果を評価した。

結果：
[00233] 本発明の抽出物は、図１４に示すようにマルトース攻撃後の血糖値を有意に低下させることが示された。

結論：
[00234] 本発明の抽出物は食後血糖値を有意に低下させるというインビトロ所見が、インビボ試験により確認された。この抽出物はグルコース代謝に関与する多数のグルコシダーゼ酵素を阻害する。インビボ試験は、抽出物を生物が利用できること、胃酸、胃の酵素により、または能動代謝により不活性化されないことを示す。
本発明の態様
態様１
ａ．水溶性である；
ｂ．αグルコシダーゼを阻害する；ならびに
ｃ．抽出物の重量の５％（ｗ／ｗ）を超える、イミノ糖のＮ−酸、および／またはピペコリン酸類を含む
ことを特徴とする、桑葉から得られる精製した抽出物。
態様２
イミノ糖のＮ−酸、および／またはピペコリン酸類が、抽出物の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、またはそれ以上を構成する、態様１に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様３
イミノ糖のＮ−酸が、ＤＡＢ、ＤＮＪ、ファゴミンまたはカリステギンＢ２のうち１種類以上のＣ１−Ｃ９アルカン酸を含む、態様１または２に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様４
Ｃ１−Ｃ９アルカン酸が、エタン酸、プロパン酸およびブタン酸のうち１種類以上を含む、態様３に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様５
さらに、グリコーゲンホスホリラーゼを阻害する、前記態様のいずれかに記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様６
コメのαグルコシダーゼを優先的かつ選択的に阻害する、前記態様のいずれかに記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様７
抽出物がさらにオリゴ糖およびアミノ酸を含む、前記態様のいずれかに記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様８
ａ．イミノ糖酸が抽出物の５〜２５重量％を構成し；
ｂ．ピペコリン酸類が抽出物の５〜３５重量％を構成し；
ｃ．オリゴ糖が抽出物の５〜２５重量％を構成し；
ｄ．アミノ酸が抽出物の２５〜７５重量％を構成する
質量バランスを有する、態様７に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様９
アミノ酸が主に酸性アミノ酸を含む、態様８に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様１０
デオキシ糖、アリールグリコシドおよびウロン酸を含む通常みられない三糖以上の糖類を含むオリゴ糖が１５〜５０重量％を構成する、態様９に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様１１
イミノ糖がイミノ糖含量の１９％（ｗ／ｗ）未満のＤＮＪを含む、前記態様のいずれかに記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様１２
イミノ糖が、イミノ糖含量の１５％（ｗ／ｗ）未満、１０％（ｗ／ｗ）未満、５％（ｗ／ｗ）未満、３％（ｗ／ｗ）未満、１％（ｗ／ｗ）未満のＤＮＪを含む、態様１１に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
態様１３
白色の半結晶質または非晶質の材料である、桑葉から得られる精製した抽出物。
態様１４
出発材料の重量と比較して少なくとも２００倍精製されている、前記態様のいずれかに記載の精製した抽出物。
態様１５
さらに、ナリンギナーゼ、グルコシダーゼ、またはマンノシダーゼの阻害剤のうちの１以上として作用する、前記態様のいずれかに記載の精製した抽出物。
態様１６
さらに、グルクロニダーゼまたはヘキソサミニダーゼの阻害剤のうちの１以上として作用する、前記態様のいずれかに記載の精製した抽出物。
態様１７
さらに、αおよびβガラクトシダーゼまたはＩｄ ウロニダーゼの阻害剤のうちの１以上として作用する、前記態様のいずれかに記載の精製した抽出物。
態様１８
ａ．マグワ(Morus alba L.)
ｂ．ロソウ(Morus alba var. multicaulis L.)
ｃ．クロミグワ(Morus nigra)、または
ｄ．ヤマグワ(Morus australis Poir)
から得られる、前記態様のいずれかに記載の精製した抽出物。
態様１９
強酸性カチオン交換樹脂を用いて得られる、前記態様のいずれかに記載の精製した抽出物。
態様２０
精製プロセスでさらに強塩基性アニオン交換樹脂および／または弱塩基性アニオン交換樹脂を使用する、態様１９に記載の精製した抽出物。
態様２１
態様１〜２０のいずれかに記載の精製した抽出物を含む、医薬製剤、栄養補助食品または食品成分。
態様２２
代謝障害を処置するための、態様１〜２０のいずれかに記載の精製した抽出物の使用。
態様２３
抽出物が
ａ．食後血糖値の低下；
ｂ．糖新生の低下；
ｃ．インスリン抵抗性の低下；
ｄ．体重減少；
ｅ．血中脂質管理；および
ｆ．ベータ細胞の保護および再生
のうちの１以上を提供する、態様１〜２０のいずれかに記載の精製した抽出物の使用。
態様２４
抽出物を糖尿病の処置に使用する、態様２０に記載の精製した抽出物の使用。
態様２５
下記の工程を含む、態様１〜２０のいずれかに記載の精製した抽出物を調製する方法：
ａ．桑葉から水溶性抽出物を採取する；
ｂ．目的画分を結合する強酸性カチオン交換樹脂を用いてイミノに富む画分を選択し、水で洗浄し、次いで目的画分をアンモニアで溶離する；そして
ｃ．下記のうち１以上を用いて酸性画分を選択する：
ｉ．第２の強酸性カチオン交換樹脂；
ｉｉ．強塩基性アニオン交換樹脂；および
ｉｉｉ．弱塩基性イオン交換樹脂。
態様２６
工程ｃｉ）において保持されなかった画分を選択し、ｃｉｉ）およびｃｉｉｉ）のうちの１以上を用いてその画分をさらに精製する、態様２５に記載の精製した抽出物を調製する方法。
態様２７
態様１〜２０のいずれかに記載の抽出物から化合物を単離し、それらを酵素活性についてスクリーニングすることを含む、代謝障害の処置に使用するための化合物をスクリーニングする方法。

Claims (13)

1. ａ．水溶性である；
   ｂ．コメのα−Ｄ−グルコシダーゼを酵母または桿菌のα−Ｄ−グルコシダーゼに対して優先的かつ選択的に阻害する；ならびに
   ｃ．抽出物の重量の５％（ｗ／ｗ）を超えるイミノ糖のＮ−酸（ここで、イミノ糖は、ＤＡＢ、ＤＮＪ、ファゴミンまたはカリステギンＢ２であり、Ｎ−酸は、Ｎ−エタン酸、Ｎ−プロパン酸、およびＮ−ブタン酸のうち１種類以上である）を含み、
   ｄ．イミノ糖含量の５％（ｗ／ｗ）未満のＤＮＪを含む
   ことを特徴とする、桑葉から得られる精製した抽出物。
2. さらにピペコリン酸類を含む、請求項１に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
3. ピペコリン酸類がヒドロキシル化ピペコリン酸類である、請求項２に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
4. イミノ糖のＮ−酸、および／またはピペコリン酸類が、抽出物の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、またはそれ以上を構成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
5. さらに、グリコーゲンホスホリラーゼを阻害する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
6. ａ．イミノ糖のＮ−酸が抽出物の５〜２５重量％を構成し；
   ｂ．ピペコリン酸類が抽出物の５〜３５重量％を構成し；
   ｃ．オリゴ糖が抽出物の５〜２５重量％を構成し；
   ｄ．アミノ酸が抽出物の２５〜７５重量％を構成する
   質量バランスを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の桑葉から得られる精製した抽出物。
7. 白色の半結晶質または非晶質の材料であり、出発材料の桑葉の重量と比較して少なくとも２００倍精製されている、桑葉から得られた、請求項１〜６のいずれか１項に記載の精製した抽出物。
8. さらに、i）ナリンギナーゼ、他のグルコシダーゼ、またはマンノシダーゼの阻害剤、ii)グルクロニダーゼまたはヘキソサミニダーゼの阻害剤、またはiii) αおよびβガラクトシダーゼまたはＩｄ ウロニダーゼの阻害剤のうちの１以上として作用する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の精製した抽出物。
9. ａ．マグワ(Morus alba L.)
   ｂ．ロソウ(Morus alba var. multicaulis L.)
   ｃ．クロミグワ(Morus nigra)、または
   ｄ．ヤマグワ(Morus australis Poir)
   から得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製した抽出物。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製した抽出物を含む、医薬製剤、栄養補助食品または食品成分。
11. 糖尿病を包含する代謝障害を処置するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製した抽出物。
12. ａ．食後血糖値の低下；
    ｂ．糖新生の低下；
    ｃ．インスリン抵抗性の低下；
    ｄ．体重減少；
    ｅ．血中脂質管理；および
    ｆ．ベータ細胞の保護および再生
    のうちの１以上を提供するために使用する、請求項１１に記載の精製した抽出物。
13. 下記の工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製した抽出物を調製する方法：
    ａ．桑葉から水溶性抽出物を採取する；
    ｂ．目的画分を結合する強酸性カチオン交換樹脂を用いて、５％（ｗ／ｗ）を超えるＤＡＢ、ＤＮＪ、ファゴミンまたはカリステギンＢ２のＮ−酸（ここで、Ｎ−酸は、Ｎ−エタン酸、Ｎ−プロパン酸、およびＮ−ブタン酸のうち１種類以上である）を含むイミノに富む画分を選択し、水で洗浄し、次いで目的画分をアンモニアで溶離する；そして
    ｃ．下記のうち１以上を用いて酸性画分を選択する：
    ｉ．第２の強酸性カチオン交換樹脂；
    ｉｉ．強塩基性アニオン交換樹脂；および
    ｉｉｉ．弱塩基性イオン交換樹脂。

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