JP6469342B2 - カルボン酸エステルの転化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの細胞による転化方法であって、
ａ）前記細胞と前記カルボン酸エステルとを水溶液中で接触させる工程
を含み、前記の細胞が、配列番号２を有するポリペプチドまたはその変異体の活性が、該細胞の野生型に対して低減されている組み換え細胞である前記方法、ならびに前記方法に適した細胞および前記細胞の使用に関する。
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの細胞による転化方法であって、
ａ）前記細胞と前記カルボン酸エステルとを水溶液中で接触させる工程
を含み、前記の細胞が、配列番号２を有するポリペプチドまたはその変異体の活性が、該細胞の野生型に対して低減されている組み換え細胞である前記方法、ならびに前記方法に適した細胞および前記細胞の使用に関する。
生物工学は、関心の持たれた合成能力を有する種々の生物を使用して、とりわけ精化学薬品を製造することに取り組んでいる。従来の化学的な方法に対して、生物工学的な方法は、一連の複数の利点を有している。まず第一に、前記の方法は、一般に重金属系の触媒などの健康を害する物質および過度のｐＨ値、圧力値および温度値を有する反応条件を全く要しない。更に、生物工学的な方法に必要なインフラストラクチャーの構築に際してより少ない投資および安全措置でしばしば間に合う。生物工学的に関連した酵素の選択性および特異性は、化学的な触媒のそれをしばしば大きく上回るので、不所望かつ生成物からしばしば分離が困難な、有機合成的方法を使用した合成では必ず生ずるであろう副生成物の形成を低減することができる。最後に、生物工学的に関連した生物は、多くの場合に、再生原料から得られる複雑な炭水化物などの化合物を出発物質として受け入れる。従って、製造業の石油および天然ガスなどの化石原料による依存を低下させることができる。
しかしながら、生物工学的な方法の確立は、多大な困難を伴い、そのため、今日では非常にわずかな物質だけが工業的規模で生物工学的に製造されるに過ぎないことに導いている。主たる問題点は、所望の合成活性を有する細胞は、この合成活性を担う酵素を有するだけでなく、同じ細胞に同時に存在して互いに基質に関して競合するかまたは全く反対の反応を触媒する何千もの酵素を有することにある。ここで、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）のゲノムだけでも、生物情報学的手法をもってヒドロラーゼとして同定された約８０種のポリペプチド、すなわち所定の結合を水分子の消費のもとに分解する酵素がコードされている。どの条件下で酵素が細胞から製造されるのかと、どの基質とのどの反応を触媒するのかは、事実上僅かな事例でしか詳細には明らかにされていない。所定の反応の触媒反応のための酵素の狙い通りの選択は、そのため多くの場合に不可能である。
従って、化学的な触媒もしくは単離された生物学的な触媒の代わりに生体触媒として細胞を使用する際には、いつも所望の活性を備えた酵素により生産された産物もしくは中間産物または既に当初の出発物質は、別の酵素によって不所望な副生成物へと変換されるという危険性もある。それが生ずるかどうかと、この場合に数多くの酵素のうちのどれが不所望な活性を有するかは、技術的な発達にもかかわらず、生物情報学の分野では予見できない。
工業的により複雑な産物の製造のための反応性の出発物質として求められる化学的に反応性の物質の場合にまさに、それらが細胞内部で生物の必須成分と反応することで毒性に作用することも考えられなくもない。そうである場合に、生物の増殖能力と合成能力は、その細胞の死まで損なわれるため、開発者はその毒性を直接認識することができない。どの生物が化学的に反応性の物質のどの濃度に耐えるのかは、同様に予見できない。
それぞれある酵素によって触媒される複数の反応を伴う方法の場合には、その系の複雑さが、収率もしくは純度を制限する要因の調査を困難なものにする。生成物の収率が低すぎる場合には、それは、前記酵素の１つが低すぎる濃度で存在するため、該当する酵素がどれであるかが知られないこと、つまり、出発物質は、予定された時間枠でまたは競合する酵素による分解前に不十分な合成能力に基づき転化されないことにある場合がある。その一方で、酵素はたしかに明らかに細胞中でポリペプチドの形で存在するものの、この細胞において活性に必須のフォールディングを有さないか、もしくは今日まで知られていない活性にしかしながら必須の補因子を欠落していることも十分にありうる。同様に、既に述べたように、物質代謝産物が該細胞にとって毒性になりうるか、またはその物質代謝産物が分解されることがある。
生物工学的な方法の確立および改善を求める当業者は、従って数多くの考えられる出発点に直面していることに気づくものの、先行技術からは大抵の場合に、目標を達するために、この出発点のどこで始めねばならないかという具体的かつ実行可能な教示は得られない。
カルボン酸エステルは、工業的に大きな需要のある化合物のなかの１つのグループであり、前記化合物は、そのままでも更に加工された生成物の形でも医薬品、化粧品、プラスチックなどとして使用される。
しかしながら、しばしば加工のためには、まず最初に前駆物質へと導入されるべきエステル官能基が必要とされるだけでなく、該エステルで、そのエステル官能基がそのときにまたはその後にも加水分解されずに更なる誘導体化を実施せねばならない。そのことは、当然に実行できることではない。それというのも、多くのカルボン酸エステルは、特に水溶液中でかつ中性点から大きくはずれたｐＨ値で、かかる反応を触媒する酵素が存在しなくても加水分解傾向にあるからである。
カルボン酸エステルを更に誘導体化する重要な一つの手法は、そこに含まれるアルキル鎖の酸化にある。その際に、まずアルコールが生じ、それはそのまま使用されるか、または更に酸化されてアルデヒドもしくはケトンにすることができる。そのアルデヒドまたはケトンは、還元的アミノ化がなされるか、または更に酸化されてカルボン酸にすることができ、該カルボン酸は、必要に応じてそれ自体再びエステル化されてよい。
内因性の酵素、すなわち本来から生物中に存在している酵素によって多くが触媒される多岐にわたる転化手法は、制御されない副生成物形成または物質代謝の問題が、生物工学的な方法によるカルボン酸エステルの転化に際して特に重みがあることを示している。
工業的に大きな需要があり、石油に含まれる炭化水素から出発して従来製造されているカルボン酸エステルの一例は、１２−アミノラウリン酸メチルエステル（ＡＬＳＭＥ）である。ＡＬＳＭＥは、ポリマーの製造の場合の、例えばナイロンベースの導管系の製造のための重要な出発物質である。今まで、ＡＬＳＭＥは、低い収率のプロセスで化石原料から出発して製造されている。
ＡＬＳあるいはＡＬＳＭＥの生物工学的な製造のための将来性のある新たな手法は、特許文献１に記載されている。その際、ラウリン酸メチルエステルは、第一工程でモノオキシゲナーゼによって酸化され、そして生成したアルデヒドがトランスアミナーゼによってＡＬＳＭＥへと転化される。この方法の欠点は、副生成物、例えばジカルボン酸が生じ、それを所望の生成物であるＡＬＳＭＥから困難にのみ分離できるに過ぎないことにある。それは収率を下げ、そして生成物を水性反応混合物から分離するために特許文献２によれば使用できる疎水性溶剤および疎水性の液状カチオン交換体のリサイクルを、資源利用における費用対効果の点で困難にする。
この背景から、本発明の基礎となる課題は、収率、炭素収支および／または窒素収支および／または純度に関してできるだけ効率的な、カルボン酸エステルの転化のための生物工学的な方法を提供することである。
本発明の基礎となる更なる課題は、収率、炭素収支および／または窒素収支、使用される試薬の再利用可能性および／または生成物の純度に関してできるだけ効率的な、カルボン酸エステルの、アミノ化されたカルボン酸エステルへの転化のための生物工学的な方法を提供することである。この関連で、効率的な炭素収支および／または窒素収支とは、好ましくは、カルボン酸エステルの転化のために好適な基質の形で細胞へと供給される炭素および／または窒素のできるだけ高い割合が、例えば所望の生成物とは別の生成物へと転化されるのではなく、所望の最終生成物中にも見出されることを表す。
本発明の基礎となる更なる課題は、カルボン酸エステルの転化からの多相反応混合物の後処理可能性を改善すること、特に使用される疎水性溶剤および液状のカチオン交換体の後処理のための再利用可能性の点で、ならびにカルボン酸エステルの転化がその中で進行する水相と、有機溶剤および／または液状のカチオン交換体を有する有機相とを含む二相系の場合の相形成と相分離の点で改善することにある。
これらの課題と更なる課題は、本願の対象によって、特にまた独立形式請求項に記載の対象によって解決される。その際、実施形態は、従属形式請求項に示される。
第一の態様においては、本発明の基礎となる課題は、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの細胞による転化方法であって、
ａ）前記細胞と前記カルボン酸エステルとを水溶液中で接触させる工程
を含み、前記の細胞が、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が、該細胞の野生型に対して低減されている組み換え細胞である前記方法によって解決される。
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの細胞による転化方法であって、
ａ）前記細胞と前記カルボン酸エステルとを水溶液中で接触させる工程
を含み、前記の細胞が、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が、該細胞の野生型に対して低減されている組み換え細胞である前記方法によって解決される。
前記第一の態様の第一の実施形態においては、前記課題は、更に、
ｂ）前記水溶液と、カチオン交換体を含む疎水性の有機溶液とを接触させる工程
を含む方法によって解決される。
ｂ）前記水溶液と、カチオン交換体を含む疎水性の有機溶液とを接触させる工程
を含む方法によって解決される。
第二の態様においては、本発明の基礎となる課題は、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウトを、組み換え細胞の遺伝的特徴の一部として、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基、特に少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有するアルキレン基である］のカルボン酸エステルの、相応の細胞の野生型に対する生産向上のために用いる使用によって解決される。
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基、特に少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有するアルキレン基である］のカルボン酸エステルの、相応の細胞の野生型に対する生産向上のために用いる使用によって解決される。
第三の態様においては、本発明の基礎となる課題は、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性がその野生型に対して低減されている組み換え細胞を、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基、好ましくは少なくとも８つの炭素原子を有するアルキレン基である］のカルボン酸エステルの転化のために用いる使用によって解決される。
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基、好ましくは少なくとも８つの炭素原子を有するアルキレン基である］のカルボン酸エステルの転化のために用いる使用によって解決される。
前記の第一の、第二のもしくは第三の態様の更なる一実施形態においては、前記の課題は、Ａが、飽和のアルキレン基、好ましくは式−（ＣＨ2）nのアルキレン基であり、式中、ｎが少なくとも４である、方法もしくは使用によって解決される。
第一の態様の更なる一実施形態においては、前記の課題は、Ｒ1が、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯおよび−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択される、方法によって解決される。
第四の態様においては、本発明の基礎となる課題は、組み換えアルカンヒドロキシラーゼを発現する細胞であって、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が前記細胞の野生型に対して低減されている細胞によって解決される。
第四の態様の好ましい一実施形態においては、前記課題は、アルカンヒドロキシラーゼが、ＡｌｋＢ−モノオキシゲナーゼおよびＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼを含む群からのアルカンヒドロキシラーゼである、細胞によって解決される。
第五の態様においては、本発明の基礎となる課題は、水溶液中の、第四の態様またはその実施形態の一つによる細胞ならびに式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルを含む反応混合物によって解決される。
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルを含む反応混合物によって解決される。
第五の態様の更なる一実施形態においては、前記課題は、前記反応混合物であって、Ａが、少なくとも４つの炭素原子を有するアルキレン基、特に飽和アルキレン基、好ましくは式−（ＣＨ2）n−で示され、式中のｎが少なくとも４であるアルキレン基であり、その際、Ｒ1は、好ましくは、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯおよび−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択される前記反応混合物によって解決される。
第五の態様の一実施形態においては、前記課題は、更に、カチオン交換体を有する疎水性有機溶液を含む反応混合物によって解決される。
第一のないし第五の態様の好ましい一実施形態においては、前記課題は、前記細胞が更にトランスアミナーゼを発現する、方法、細胞または使用によって解決される。
第一のないし第五の態様の好ましい一実施形態においては、前記課題は、前記細胞が更にアラニンデヒドロゲナーゼを発現する、方法、細胞または使用によって解決される。
第一のないし第五の態様の好ましい一実施形態においては、前記課題は、前記細胞が更にＡｌｋＬ−ファミリーからのタンパク質を有する、方法、細胞または使用によって解決される。
第一のないし第五の態様の好ましい一実施形態においては、前記課題は、前記細胞が、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対して低減された活性を有し、その際、前記酵素が、好ましくは、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ、脂肪酸インポーターもしくはその変異体、特に好ましくはＦａｄＬもしくはその変異体を含む群からの酵素である、方法、細胞または使用によって解決される。
第一のないし第五の態様の好ましい一実施形態においては、前記課題は、前記細胞が、アルカンヒドロキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよびＡｌｋＬ−ファミリーからのタンパク質を含む群からの少なくとも１つの酵素を組み換え形で有し、かつ／または過剰発現する、方法、細胞または使用によって解決される。
第一のないし第五の態様の好ましい一実施形態においては、前記課題は、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が、細胞の野生型に対して、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウトによって低減されている、方法、細胞または使用によって解決される。
本発明は、特に配列番号２を含むポリペプチドまたはその変異体の活性がその野生型に対して低減されている組み換え細胞は、そこから生ずる生成物の収率、炭素収支および／または窒素収支および純度が、配列番号２を含むポリペプチドに関して細胞の野生型と同じ活性を有する細胞よりも意想外に高いという点で、カルボン酸エステルの転化のために適しているという本発明者の驚くべき知見に基づいている。それは、例えば、カルボン酸エステルが、少なくとも１種のアルカンヒドロキシラーゼと、任意に他の酵素とを使用して酸化される反応に当てはまる。
本発明は、配列番号２を含むポリペプチドまたはその変異体の活性がその野生型に対して低減されている組み換え細胞は、特に、カルボン酸エステルの転化からの反応生成物の後処理のために使用される有機溶剤および液状のカチオン交換体が、特に効率的におよび／または頻繁にリサイクルによって新たな使用のために回収でき、かつ水性反応混合物の、有機溶剤および／または液状のカチオン交換体を含む疎水性溶液からの分離が改善されているという点で、カルボン酸エステルの転化のために特に適しているという本発明者の驚くべき知見に基づいている。
本発明は、細胞によるカルボン酸エステルの転化のための方法であって、前記転化が、関心が持たれるカルボン酸エステルが出発物質として使用され、かつ該カルボン酸エステルまたはそれから生ずる化合物の加水分解または早期の加水分解が、そこから製造される生成物の収率、炭素収支および／または窒素収支および／または純度を損ないうるあらゆる化学反応であってよい前記方法に関する。特に、カルボン酸エステル基とは異なる化学的官能基、例えば末端位アルキル基が転化され、かつカルボン酸エステル基を得ることに該当する転化のための、本発明による細胞および本発明による方法が適している。しかしながら、本発明によれば、カルボン酸エステル基のエステル交換などの反応も本発明に従って行うことができ、その際、それは、カルボン酸エステル基の早期かつ非特異的な反応を回避することが重要である。同様に、本発明による教示は、カルボン酸エステル基を含む化合物自体が、転化されるべき出発物質ではなく、例えば前記化合物がプロセスに必須の活性を有する酵素のインデューサーもしくはアクチベーターである場合については、その存在とより長期にわたる安定性だけが必要である反応のために適している。
本発明の実施に必須なことは、本発明による細胞または本発明による方法で使用される細胞が、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が、細胞の野生型に対して低減されている組み換え細胞であることである。前記の配列は、ＢｉｏＨ、つまりその、ビオチンの生合成の一部として更なる酵素ＢｉｏＣと一緒にアラニンおよび／またはアセテートをピメロイオール−ＣｏＡへと変換する能力について知られている酵素をコードしている（Barker, D. F., and Campbell, A. M. (1980) J. Bacteriol. 143, 789-800）。ＢｉｏＨは、エシェリキア・コリにおいては、配列番号１を含むヌクレオチド配列によってコードされる。好ましい一実施形態においては、配列番号２を含むポリペプチドの活性は、ノックアウト、例えば部分的な欠失によって、または配列番号１またはその変異体を含むヌクレオチド配列の発現の低減のための他の措置によって低減されている。
現在の遺伝的方法、微生物学的方法および分子生物学的方法の進歩をもって、当業者であれば、生きている細胞中に存在するポリペプチドの活性を決まった様式で測定しかつそれに影響を及ぼしうる数多くのツールを利用できる。懸濁液の形で、ペレットの形で存在するか、もしくは細胞培養の処理された形態で取り出されていてよい酵素の活性の測定のためには、酵素的な標準試験を使用できかつ評価できる。それは例えばCornish-Bowden, 1995などの教科書に記載されている。配列番号１またはその変異体を含むポリペプチドの活性の測定のためのアッセイは、X. Xie et al. (2007) Metabolic Engineering 9; 379-386に記載されている。
また、細胞中の酵素の活性の低減のための決まった様式で使用できる方法、例えば放射線に対する曝露による細胞のランダム突然変異誘発に続いて突然変異体を濃縮もしくはスクリーニングすることによる方法、点突然変異の部位特異的導入による方法または読み枠の遮断あるいは細胞の染色体に組み込まれた活性酵素をコードする遺伝子の読み枠の一部の欠失による方法は、先行技術に、例えばManiatis et al (1989)もしくはFuchs & Schlegl (2007)に記載されており、当業者であれば決まった様式で実施することができる。また、ＲＮＡ干渉（Tuschl, 2001）をベースとする活性低減または特定のインヒビターを用いた活性低減も可能である。好ましい一実施形態においては、本願で使用される、表現"細胞がその野生型に対して低減された（ポリペプチドの）活性"を有するとは、改変された細胞中のポリペプチドの活性が、野生型細胞中の同じ酵素の活性に対して低減されていることを意味する。好ましい一実施形態においては、その相対的な低減は、好ましさの程度が高まる順序において、活性の５％、１０％、２０％、４０％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％またはそれより高いパーセンテージである。特に好ましい一実施形態においては、酵素の活性は、バックグラウンドに対してもはや検出できない。
特に、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性を、ノックアウトによって低減させることが好ましい。好ましい一実施形態においては、本願で使用される概念"ノックアウト"とは、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性を、持続的かつ不可逆的に、特に相応の細胞の子孫（Nachkommen）の場合にも低減する、好ましくは配列番号２もしくはその変異体をコードする配列の読み枠の遮断によって、配列番号２をコードする配列またはその変異体の少なくとも一部であってコードされるポリペプチドの酵素活性の損失を引き起こすが、読み枠を遮断しない部分の欠失によって、または発現に必須のヌクレオチド配列の、例えばプロモーター、リボソーム結合部位などの突然変異誘発によって低減するあらゆる措置を表す。特定のポリペプチドの活性が低減された細胞の製造のための措置は、当業者の利用できる決まり切った方法であり、かつ先行技術において、例えばKamionka et. al. (2005) Appl Environ Microbiol. 2005 February; 71(2): 728-733、Geng et. al. (2009), Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2009, Article ID 646380, doi:10.1155/2009/646380、およびMurphy (2009) Methods Mol Biol. 2011;765:27-42において十分に記載されている。また、市販のキット、例えばSigma Aldrich社製のTargeTron（商標）Gene Knockout Systemも適している。
本発明は、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの転化に関する。アルキレン基Ａは、それが少なくとも４つの炭素原子を有するという条件では、任意の、特に直鎖状の、分枝鎖状のもしくは環状のアルキレン基であってよい。特に好ましい一実施形態においては、前記のＡは、式−（ＣＨ2）n−のアルキレン鎖であり、式中、ｎは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であってよい。最も好ましい一実施形態においては、前記のＡは、式−（ＣＨ2）n−のアルキレン基であり、式中、ｎは、４〜２４であり、好ましくは４〜２２であり、最も好ましくは４〜１０であり、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯもしくは−ＣＯＯＨであり、最も好ましくは水素であり、かつＲ2は、メチルもしくはエチルである。
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの転化に関する。アルキレン基Ａは、それが少なくとも４つの炭素原子を有するという条件では、任意の、特に直鎖状の、分枝鎖状のもしくは環状のアルキレン基であってよい。特に好ましい一実施形態においては、前記のＡは、式−（ＣＨ2）n−のアルキレン鎖であり、式中、ｎは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であってよい。最も好ましい一実施形態においては、前記のＡは、式−（ＣＨ2）n−のアルキレン基であり、式中、ｎは、４〜２４であり、好ましくは４〜２２であり、最も好ましくは４〜１０であり、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯもしくは−ＣＯＯＨであり、最も好ましくは水素であり、かつＲ2は、メチルもしくはエチルである。
本発明により転化されるカルボン酸エステルの出発物質ならびに本願に記載される全ての他の化合物に関連して、構造的特徴で、例えば化学式で表された化合物は、同様に、プロトン化された化合物も、脱プロトン化された化合物も、または別の解離された化合物も指すものと見なされる。例えば、概念"アセテート"とは、同様に、プロトン化された形、すなわち酢酸も、解離された形、すなわちＣＨ3−ＣＯＯ-も表す。
本発明により使用されるべき細胞は、好ましくは、物質代謝活性な細胞であって、カルボン酸エステルの転化のために必要な酵素活性を、特に好ましくは組み換え酵素の発現によって有する細胞の形の全細胞触媒（Ganzzellkatalysator）である。更なる好ましい一実施形態においては、前記の細胞は、少なくとも１つの酵素活性を有する細胞の溶解物、抽出物または別の調製物である。
生物の選択の点では、本発明により利用可能な細胞には、制限が課されないが、前記細胞は、培養可能であり、安定性であり、かつ酵素活性の減退のための方法、例えばノックアウトの方法が利用できるものに限る。このように、前記細胞は、同様に、原核細胞または真核細胞であってよい。真核細胞の場合には、単細胞の真核生物が特に好ましく、特に酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）およびピチア・パストリス（Pichia pastoris）が殊に好ましい。原核細胞の場合には、例えばマグネトコッカス（Magnetococcus）、マリプロフンドゥス（Mariprofundus）、アセトバクター（Acetobacter）、アセトバクテリウム（Acetobacterium）、アシジフィリウム（Acidiphilium）、アフィピア（Afipia）、アーレンシア（Ahrensia）、アスチッカコーリス（Asticcacaulis）、アウランチモナス（Aurantimonas）、アゾリゾビウム（Azorhizobium）、アゾスピリルム（Azospirillum）、バシラス（Bacillus）、バルトネラ（Bartonella）、トリボコルム（tribocorum）、ベイジェリンキア（Beijerinckia）、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブレブンジモナス（Brevundimonas）、スブビブリオイデス（subvibrioides）、ブルセラ（Brucella）、カウロバクター（Caulobacter）、ケラチボランス（Chelativorans）、シトレイセラ（Citreicella）、シトロミクロビウム（Citromicrobium）、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ディノロセオバクター（Dinoroseobacter）、エリスロバクター（Erythrobacter）、フルビマリーナ（Fulvimarina）、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）、グラニュリバクター（Granulibacter）、ヒルシア（Hirschia）、ホエフレア（Hoeflea）、ハイフォミクロビウム（Hyphomicrobium）、ハイフォモナス（Hyphomonas）、ケトグロニシゲニウム（Ketogulonicigenium）、ラブレンジア（Labrenzia）、ロクタネラ（Loktanella）、マグネトスピリルム（Magnetospirillum）、マリカウリス（Maricaulis）、マリチミバクター（Maritimibacter）、メソリゾビウム（Mesorhizobium）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、メチロシスティス（Methylocystis）、メチロシヌス（Methylosinus）、ニトロバクター（Nitrobacter）、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）、オセアニブルブス（Oceanibulbus）、オセアニカウリス（Oceanicaulis）、オセアニコラ（Oceanicola）、オクロバクトルム（Ochrobactrum）、オクタデカバクター（Octadecabacter）、オリゴトロファ（Oligotropha）、パラコッカス（Paracoccus）、パルビバキュルム（Parvibaculum）、パルブラルキュラ（Parvularcula）、ペラギバカ（Pelagibaca）、ファエオバクター（Phaeobacter）、フェニロバクテリウム（Phenylobacterium）、ポリモルフム（Polymorphum）、シュードビブリオ（Pseudovibrio）、ロドバクター（Rhodobacter）、ロドミクロビウム（Rhodomicrobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロセイビウム（Roseibium）、ロセオバクター（Roseobacter）、ロセオモナス（Roseomonas）、ロセオバリウス（Roseovarius）、ルエゲリア（Ruegeria）、サジツーラ（Sagittula）、シリシバクター（Silicibacter）、スフィンゴビウム（Sphingobium）、スフィンゴモナス（Sphingomonas）、スフィンゴフィキシス（Sphingopyxis）、スタルケヤ（Starkeya）、スルフィトバクター（Sulfitobacter）、タラシオビウム（Thalassiobium）、キサントバクター（Xanthobacter）、ザイモモナス（Zymomonas）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、リゾビウム（Rhizobium）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、アナプラズマ（Anaplasma）、エールリキア（Ehrlichia）、ネオリケッチア（Neorickettsia）、オリエンティア（Orientia）、リケッチア（Rickettsia）、ボルバキア（Wolbachia）、ボルデテラ（Bordetella）、ブルクホルデリア（Burkholderia）、クプリアビダス（Cupriavidus）、タイワネンシス（Taiwanensis）、ラウトロピア（Lautropia）、リムノバクター（Limnobacter）、ポリヌクレオバクター（Polynucleobacter）、ラルストニア（Ralstonia）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、エイケネラ（Eikenella）、コロデンス（corrodens）、バスフィア（Basfia）、キンゲラ（Kingella）、ラリバクター（Laribacter）、ルチエラ（Lutiella）、ネイセリア（Neisseria）、シモンシエラ（Simonsiella）、アクロモバクター（Achromobacter）、アシドボラックス（Acidovorax）、アリシクリフィルス（Alicycliphilus）、アロマトレウム（Aromatoleum）、アゾアルクス（Azoarcus）、コマモナス（Comamonas）、デクロロモナス（Dechloromonas）、デルフチア（Delftia）、ガリオネラ（Gallionella）ヘルバスピリルム（Herbaspirillum）、ヘルミニイモナス（Herminiimonas）、ヒレモネラ（Hylemonella）、ヤンチノバクテリウム（Janthinobacterium）、レプトトリックス（Leptothrix）、メチリビウム（Methylibium）、メチロバシラス（Methylobacillus）、メチロフィラレス（Methylophilales）、メチロベルサチリス（Methyloversatilis）、メチロボルス（Methylovorus）、ニトロソモナス（Nitrosomonas）、ニトロソスピラ（Nitrosospira）、オキサロバクター（Oxalobacter）、パラステレラ（Parasutterella）、ポラロモナス（Polaromonas）、ポラロモナス（Polaromonas）、プシリモナス（Pusillimonas）、ロドフェラックス（Rhodoferax）、ルブリビバックス（Rubrivivax）、シデロキシダンス（Sideroxydans）、ステレラ（Sutterella）、ワドスウォルテンシス（wadsworthensis）、テイロレラ（Taylorella）、タウエラ（Thauera）、チオバシラス（Thiobacillus）、チオモナス（Thiomonas）、バリオボラックス（Variovorax）、ベルミネフロバクター（Verminephrobacter）、アナエロミクソバクター（Anaeromyxobacter）、ブデロビブリオ（Bdellovibrio）、バクテリオボルス（bacteriovorus）、ビロフィラ（Bilophila）、デスルファルクルス（Desulfarculus）、デスルファチバシルム（Desulfatibacillum）、デスルフォバッカ（Desulfobacca）、デスルフォバクテリウム（Desulfobacterium）、デスルフォブルブス（Desulfobulbus）、デスルフォコッカス（Desulfococcus）、デスルフォハロビウム（Desulfohalobium）、デスルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、デスルフォミクロビウム（Desulfomicrobium）、デスルフォナトロノスピラ（Desulfonatronospira）、デスルフォタレア（Desulfotalea）、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）、デスルフロモナス（Desulfuromonas）、ゲオバクター（Geobacter）、ハリアンギウム（Haliangium）、ヒッペア（Hippea）、ローソニア（Lawsonia）、ミクソコッカス（Myxococcus）、ペロバクター（Pelobacter）、プレシオシスティス（Plesiocystis）、ソランギウム（Sorangium）、スティグマテラ（Stigmatella）、シントロフォバクター（Syntrophobacter）、シントロファス（Syntrophus）、アルコバクター（Arcobacter）、カミニバクター（Caminibacter）、カンピロバクター（Campylobacter）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ニトラチフラクター（Nitratifractor）、ニトラチルプター（Nitratiruptor）、スルフリクルブム（Sulfuricurvum）、スルフリモナス（Sulfurimonas）、スルフロスピリルム（Sulfurospirillum）、スルフロブム（Sulfurovum）、ウォリネラ（Wolinella）、ブフネラ（Buchnera）、ブロクマニア（Blochmannia）、ハミルトネラ（Hamiltonella）、レギエラ（Regiella）、リエシア（Riesia）、シトロバクター（Citrobacter）、クロノバクター（Cronobacter）、ディケヤ（Dickeya）、エドワードシエラ（Edwardsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、エルウィニア（Erwinia）、エシェリキア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、パントエア（Pantoea）、ペクトバクテリウム（Pectobacterium）、プロテウス（Proteus）、プロビデンシア（Providencia）、ラーネラ（Rahnella）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、シゲラ（Shigella）、ソダリス（Sodalis）、ウィグレスウォルチア（Wigglesworthia）、グロシナ（Glossina）、キセノラブダス（Xenorhabdus）、エルシニア（Yersinia）、アシジチオバシラス（Acidithiobacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アエロモナス（Aeromonas）、アルカニボラックス（Alcanivorax）、アルカリリムニコラ（Alkalilimnicola）、アロクロマチウム（Allochromatium）、アルテロモナダレス（Alteromonadales）、アルテロモナス（Alteromonas）、バウマニア（Baumannia）、ベギアトア（Beggiatoa）、ベルマネラ（Bermanella）、カルソネラ（Carsonella）、ルチア（Ruthia）、ベシコミソシウス（Vesicomyosocius）、カルジオバクテリウム（Cardiobacterium）、クロモハロバクター（Chromohalobacter）、コルウェリア（Colwellia）、コングレギバクター（Congregibacter）、コキシエラ（Coxiella）、ジケロバクター（Dichelobacter）、エンドリフチア（Endoriftia）、エンヒドロバクター（Enhydrobacter）、フェリモナス（Ferrimonas）、フランシセラ（Francisella）、グラシエコラ（Glaciecola）、ハヘラ（Hahella）、ハロモナス（Halomonas）、ハロロドスピラ（Halorhodospira）、ハロチオバシラス（Halothiobacillus）、イディオマリーナ（Idiomarina）、カンギエラ（Kangiella）、レジオネラ（Legionella）、マリノバクター（Marinobacter）、マリノモナス（Marinomonas）、メチロバクター（Methylobacter）、メチロコッカス（Methylococcus）、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）、メチロファガ（Methylophaga）、モラキセラ（Moraxella）、モリテラ（Moritella）、ネプツニイバクター（Neptuniibacter）、ニトロコッカス（Nitrococcus）、シュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）、サイクロバクター（Psychrobacter）、サイクロモナス（Psychromonas）、レイネケア（Reinekea）、リケッチエラ（Rickettsiella）、サッカロファグス（Saccharophagus）、シェワネラ（Shewanella）、スクシナチモナス（Succinatimonas）、テレジニバクター（Teredinibacter）、チオアルカリミクロビウム（Thioalkalimicrobium）、チオアルカリビブリオ（Thioalkalivibrio）、チオミクロスピラ（Thiomicrospira）、トルモナス（Tolumonas）、ビブリオナレス（Vibrionales）、アクチノバシラス（Actinobacillus）、アグレガチバクター（Aggregatibacter）、ガリバクテリウム（Gallibacterium）、ヘモフィルス（Haemophilus）、ヒストフィルス（Histophilus）、マンハイミア（Mannheimia）、パスツレラ（Pasteurella）、アゾトバクター（Azotobacter）、セルビブリオ（Cellvibrio）、シュードモナス（Pseudomonas）、アリイビブリオ（Aliivibrio）、グリモンチア（Grimontia）、フォトバクテリウム（Photobacterium）、フォトバクテリウム（Photobacterium）、ビブリオ（Vibrio）、シュードキサントモナス（Pseudoxanthomonas）、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）、キサントモナス（Xanthomonas）、キシレラ（Xylella）、ボレリア（Borrelia）、ブラキスピラ（Brachyspira）、レプトスピラ（Leptospira）、スピロヘータ（Spirochaeta）、トレポネマ（Treponema）、ホジキニア（Hodgkinia）、プニセイスピリルム（Puniceispirillum）、リベリバクター（Liberibacter）、ペラギバクター（Pelagibacter）、オデッセラ（Odyssella）、アキュムリバクター（Accumulibacter）、特にＢ．サチリス（B. subtilis）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｃ．グルタミクム（C. glutamicum）、Ｅ．コリ（E. coli）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、アシネトバクター・エスピー（Acinetobacter sp.）、ブルクホルデリア・エスピー（Burkholderia sp.
）、ブルクホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）、藍藻（Cyanobakterien）、クレブシエラ・エスピー（Klebsiella sp.）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、サルモネラ・エスピー（Salmonella sp.）、リゾビウム・エスピー（Rhizobium sp.）およびリゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）を含む群から選択される細菌であってよい。特に好ましい一実施形態においては、腸内細菌、最も好ましくはエシェリキア・コリである。
）、ブルクホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）、藍藻（Cyanobakterien）、クレブシエラ・エスピー（Klebsiella sp.）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、サルモネラ・エスピー（Salmonella sp.）、リゾビウム・エスピー（Rhizobium sp.）およびリゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）を含む群から選択される細菌であってよい。特に好ましい一実施形態においては、腸内細菌、最も好ましくはエシェリキア・コリである。
本発明による方法は、該細胞が、カルボン酸エステルと水溶液中で接触されることを必要とする。好ましい一実施形態においては、本願で使用される概念"接触する"とは、本発明による細胞が、その都度の剤、例えばカルボン酸エステルまたは液状のカチオン交換体と直接的な接触に至るが、特に多孔質膜などの物理的な障壁が介在されていないことを表す。その接触は、最も簡単には、前記の剤、例えばカルボン酸エステルまたは液状のカチオン交換体を、細胞が存在する水溶液へと加えることによって行われる。
水溶液としては、細胞の取得もしくは培養のために、および／またはカルボン酸エステルの転化のために必要なその活性の取得もしくは培養のために適したあらゆる水ベースの溶液を使用することができる。それには、同様に、微生物用の培養培地、なかでもＬＢ培地、最少培地、例えばＭ９培地などの完全培地、ならびに選択培地、例えば高い塩濃度を含むため好塩性もしくは少なくとも耐塩性の生物の成長のみを可能にする培地が含まれる。特に、最少培地であって、生成物の後処理を容易にするために、カルボン酸エステルの転化の生成物から容易に分離可能な成分を含有する最少培地が好ましい。
予定された転化の生成物が十分な疎水性と好適な電荷を有する限り、工程ｂ）において、水溶液と、カチオン交換体を含む疎水性有機溶液とを接触させることによって抽出するために適している。好適な方法は、国際特許出願PCT/EP2011/071491または欧州特許出願EP12181153.3に記載されている。簡単に言えば、前記水溶液は、転化の間または転化の後に、溶剤としての脂肪酸エステルと脂肪酸、好ましくは不飽和脂肪酸を含む疎水性溶液と接触させることができる。
工程ａ）における温度と条件の調整に際して、細胞と、転化反応と、必要な酵素の要求が顧慮されるべきである。生物工学的に重要な種々の細胞の温度要求は、微生物学的なおよび分子生物学的な教科書、例えばFuchs/Schlegl, Allgemeine Mikrobiologie, 2008に見ることができ、または日常作業の範囲内の増殖試験によって調べることができる。好ましい一実施形態においては、接触の時点での水性培養培地のｐＨ値は、４〜９、好ましくは４．５〜８．５、最も好ましくは６．５〜７．５である。更なる好ましい一実施形態においては、温度は、０〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、最も好ましくは２０〜３７℃である。
好ましくは、本発明による方法のためには、組み換えアルカンヒドロキシラーゼを発現する細胞であって、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が前記細胞の野生型に対して低減されている細胞が使用される。好ましい一実施形態においては、アルカンヒドロキシラーゼは、ＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼである。好ましい一実施形態においては、概念"ＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ"とは、細胞質ゾル性オキシダーゼであって、更にフェレドキシンとフェレドキシン−レダクターゼを含む３成分系の一部であり、アルカン結合部位とアルカンのヒドロキシル化能力とを有するオキシダーゼを表す。特に好ましい一実施形態においては、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２（Alcanivorax borkumensis SK2）由来のＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）に対して少なくとも８０％の、好ましくは９０％の、最も好ましくは９５％もしくは９９％の配列同一性を有する酵素であるか、またはアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）に対して少なくとも８０％の、好ましくは９０％の、最も好ましくは９５％もしくは９９％の配列同一性を有し、更にアルカンヒドロキシラーゼ活性を有する酵素である。上述のデータベースコードは、その際、本願で通して、ＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター、米国ベセズダ）データベースに対するものであり、より正確に言うと２０１２年１１月８日にオンラインで取得できるバージョンに対するものである。好ましい一実施形態においては、本願で使用される概念"アルカンヒドロキシラーゼ活性"とは、アルカンまたは少なくとも６個の、好ましくは１２個の炭素基を含む非置換の直鎖状のアルキル基のヒドロキシル化を触媒する能力を表す。更なる好ましい一実施形態においては、概念"ＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ"とは、非膜結合型のオキシダーゼであって、アルカン、少なくとも５個の、好ましくは１２個の炭素基を含む非置換の直鎖状のアルキル基または一回ヒドロキシル化されたアルカンのための結合部位とそのポリペプチド鎖が、モチーフLL(I/L)(V/I)GGNDTTRNを含む前記オキシダーゼを表す。好ましい一実施形態においては、本願で使用される"ＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ"は、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）または好ましくはアルカンヒドロキシラーゼ活性を有する変異体である。
本発明により使用される酵素は、好ましくは組み換え酵素である。好ましい一実施形態においては、本願で使用される概念"組み換え"とは、相応の核酸分子が本来の細胞には存在せず、かつ／または遺伝子工学的手法を用いて製造されたことを意味する。好ましい一実施形態においては、相応のポリペプチドが組み換え核酸によってコードされている場合には、それは組み換えタンパク質と呼ばれる。好ましい一実施形態においては、本願で使用される組み換え細胞とは、少なくとも１つの組み換え核酸または組み換えポリペプチドを有する細胞を表す。当業者には、組み換え分子または細胞の製造に適した方法は公知である。例えば該方法は、Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第二版に記載されている。組み換え酵素は、好ましくは、例えば当業者に公知のｐＥＴベクター系またはｐＧＥＸベクター系を使用して過剰発現される。
ＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼに還元剤、好ましくはＮＡＤＨから電子を最適に提供するためには、前記細胞が、モノオキシゲナーゼを、それと機能的に相互作用するフェレドキシン−レダクターゼおよびそれと機能的に相互作用するフェレドキシンと一緒に発現することが好ましい。それは、別個のポリペプチドであるか、または全細胞触媒が使用される場合には、同時発現されたポリペプチドであるか、またはＮ末端もしくはＣ末端でＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼと融合されたポリペプチドである。フェレドキシン−レダクターゼまたはフェレドキシンが所定のＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼと互いに機能的に相互作用するかどうかを、当業者は、該還元剤がアルカン基質とそ前記３種のポリペプチドの存在下で酸化されるかどうかによって容易に確認できる。その一方で、Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, und Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727によって記載された酵素試験を使用でき、その試験は、機能的に相互作用するポリペプチドの場合に反応速度の明らかな向上を示す。特に好ましい一実施形態においては、ＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ、フェレドキシンおよびフェレドキシン−レダクターゼは、同じ生物由来である。特に好ましい一実施形態においては、それは、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシン−レダクターゼ（データベースコードYP_691923）またはその変異体、アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のフェレドキシン（データベースコードYP_691920）またはその変異体およびアルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２由来のＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼ（データベースコードYP_691921）またはその変異体である。
更なる好ましい一実施形態においては、前記のアルカンヒドロキシラーゼは、ＡｌｋＢ−モノオキシゲナーゼである。ＡｌｋＢは、まずシュードモナス・プチダＧｐｏ１（Pseudomonas putida Gpo1）由来のＡｌｋＢＧＴ系から知られているオキシドレダクターゼであって、２種の更なるポリペプチドＡｌｋＧおよびＡｌｋＴに依存するオキシドレダクターゼである。ＡｌｋＴは、ＦＡＤ依存性ルブレドキシン−レダクターゼとして特徴付けられており、それは、電子をＮＡＤＨからＡｌｋＧへと伝える。ＡｌｋＧは、ルブレドキシンという含鉄のレドックスタンパク質であり、該タンパク質は、ＡｌｋＢのための直接的な電子供与体として機能する。好ましい一実施形態においては、概念"ＡｌｋＢ−モノオキシゲナーゼ"とは、好ましさの程度が高まる順序において示してシュードモナス・プチダＧｐｏ１のＡｌｋＢの配列（データベースコード：CAB54050.1；このデータベースコードは、本願で使用される他の全ても同様に、先行技術に由来する、すなわちＮＣＢＩデータベースに由来する、より正確に言うと２０１２年１０月１５日にオンラインで取得できるバージョンに由来するものである）に対して少なくとも７５％の、８０％の、８５％の、９０％の、９２％の、９４％の、９６％の、９８％のまたは９９％の配列ホモロジーを有する、アルカンを酸化させる能力を有するポリペプチドを表す。特に好ましい一実施形態においては、前記のＡｌｋＢ−モノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダＧｐｏ１由来のＡｌｋＧ（CAB54052.1）ポリペプチドおよびＡｌｋＴ（CAB54063.1）ポリペプチドと機能的に共同作用するアルカンを酸化させるオキシドレダクターゼである。ＡｌｋＢ−アルカンヒドロキシラーゼに電子を最適に供給するためには、前記細胞がモノオキシゲナーゼを、それと機能的に相互作用する補助タンパク質、好ましくはＡｌｋＧおよび／またはＡｌｋＴまたはそれぞれの変異体と一緒に発現することが好ましく、その際、特に好ましい一実施形態においては、改めて、シュードモナス・プチダＧｐｏ１由来のＡｌｋＧ（CAB54052.1）ポリペプチドおよびＡｌｋＴ（CAB54063.1）ポリペプチドである。
本発明による細胞または本発明による方法で使用される細胞の基質を酸化させる能力は、該細胞が、アルカンヒドロキシラーゼの代わりにまたはそれに加えてアルコールデヒドロゲナーゼを発現することによって高めることができる。好ましい一実施形態においては、本願で使用される概念"アルコールデヒドロゲナーゼ"とは、アルデヒドもしくはケトンを、相応の第一級もしくは第二級アルコールへと酸化させる酵素を表す。それらの例には、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来（ACB78191.1）の、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）由来（YP_795183.1）の、ラクトバシラス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）由来（ACF95832.1）の、ウマ肝臓由来の、パラコッカス・パントトロファス（Paracoccus pantotrophus）由来（ACB78182.1）のおよびスフィンゴビウム・ヤノイクヤエ（EU427523.1）由来のアルコールデヒドロゲナーゼならびにそれぞれの変異体が含まれる。
全細胞触媒が使用される場合には、基質を細胞内に局在された酵素と接触させて所望の反応を引き起こさねばならないという問題が生じうる。長鎖アルカンおよびその誘導体の場合には、全細胞触媒がＡｌｋＬ−ファミリーのポリペプチドを有することが好ましい。好ましい一実施形態においては、本願で使用される"ＡｌｋＬ−ファミリーのポリペプチド"は、２３０の連続したアミノ酸長にわたって、シュードモナス・プチダ由来のＡｌｋＬ（データベースコードCAB69081）もしくはシュードモナス・プチダ由来のＡｌｋＬの変異体に対して少なくとも８０％の、好ましくは９０％の、更により好ましくは９０％の配列同一性を有し、かつ好ましくは長鎖アルカンを細胞内部へとインポートすることを促す能力を有するポリペプチドである。更なる一実施形態においては、本願で使用される"ＡｌｋＬ−ファミリーのポリペプチド"は、グラム陰性細菌の外膜に局在化するポリペプチドであって、配列モチーフDXWAPAXQ(V/A)GXRを有し、そこでＸはタンパク質原性アミノ酸を表すポリペプチドであり、更にシュードモナス・プチダ由来のＡｌｋＬ（データベースコードCAB69081）またはその変異体が好ましい。ＡｌｋＬ−ファミリーの例示される構成員には、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来（データベースコードCAB69081）の、マリノバクター・アクアエオレイＶＴ８（Marinobacter aquaeolei VT8）由来（データベースコードYP_957722）の、オセアニカウリス・アレクサンドリイＨＴＣＣ２６３３（Oceanicaulis alexandrii HTCC2633）由来（データベースコードZP_00953584）の、マリノバクター・マンガンオキシダンスＭｎＩ７−９（Marinobacter manganoxydans MnI7-9）由来（データベースコードZP_09158756）の、カウロバクター・エスピーＫ３１（Caulobacter sp. K31）由来（データベースコードYP_001672217）の、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）由来（データベースコードQ00595）のＡｌｋＬおよびそれらの変異体が含まれる。
本発明の教示は、本願で引き合いに出される、正確なアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列を有する巨大分子を使用して説明されているか、あるいはその都度の野生型と比較して低減された、本願で引き合いに出される、正確なアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を有する細胞を使用して説明されているだけでなく、かかる巨大分子の変異体もしくはその都度の細胞のその都度の野生型と比較して低減された、１もしくはそれより多くのアミノ酸もしくは核酸の欠失、付加もしくは置換によって得ることができる該ポリペプチドの変異体の活性を有する細胞を使用して説明されていてよい。好ましい一実施形態においては、本願で使用される核酸配列もしくはアミノ酸配列の"変異体"という概念は、以下に概念"ホモロゴン（Homologon）"と同じ意味でもしくは交換可能に用いられ、それは、相応の本来の野生型の核酸配列もしくは野生型のアミノ酸配列に対して７０％の、７５％の、８０％の、８５％の、９０％の、９２％の、９４％の、９６％の、９８％の、９９％のまたはそれより高いパーセンテージのホモロジー（本願では同一性と同じ意味で使用される）を有する別の核酸配列もしくはアミノ酸配列を意味し、その際、好ましくは、触媒活性中心を形成するアミノ酸とは別のアミノ酸または構造もしくはフォールディングに必須のアミノ酸が欠失もしくは置換されているか、またはかかるアミノ酸が保存的に置換されているにすぎない、例えばアスパラギン酸の代わりにグルタミン酸にまたはバリンの代わりにロイシンに置き換えられている。先行技術では、例えばArthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第三版では、２つの配列のホモロジーの程度を計算するために使用することができるアルゴリズムが記載されている。本発明の更なる好ましい一実施形態においては、アミノ酸配列もしくは核酸配列の変異体は、好ましくは上述の配列ホモロジーに加えて、本質的に、野生型分子もしくは本来の分子の同じ酵素活性を有する。例えば、プロテアーゼとして酵素的に活性なポリペプチドの変異体は、前記ポリペプチド酵素と同じ、もしくは本質的に同じタンパク質分解活性を有し、すなわちペプチド結合の加水分解を触媒する能力を有する。具体的な一実施形態においては、概念"本質的に同じ酵素活性"は、野生型のポリペプチドの基質に対する活性であって、明らかにバックグラウンド活性を上回り、かつ／または三桁未満、好ましくは二桁、更に好ましくは一桁だけ、野生型ポリペプチドが同じ基質に対して有するＫM値および／またはｋcat値とは異なる活性を意味する。更なる好ましい一実施形態においては、核酸配列もしくはアミノ酸配列の"変異体"という概念には、核酸配列もしくはアミノ酸配列の少なくとも１つの活性部分もしくは活性断片が含まれる。更なる好ましい一実施形態においては、本願で使用される概念"活性部分"は、全長のアミノ酸配列よりも短い配列を有し、あるいは全長のアミノ酸配列より短い配列をコードしているアミノ酸配列もしくは核酸配列を意味し、その際、前記のアミノ酸配列またはコードされたアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列よりも短い長さをもって、本質的に、野生型ポリペプチドもしくはその変異体と同じ酵素活性、例えばプロテアーゼとしての活性を有する。具体的な一実施形態においては、核酸の"変異体"という概念には、その相補鎖が、好ましくはストリンジェントな条件下で野生型の核酸に結合する核酸が含まれる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者には簡単に決定でき、一般にプローブの長さ、洗浄時の温度および塩濃度に依存している。一般に、プローブがより長ければ、ハイブリダイゼーションのためにはより高い温度が必要となり、それに対してプローブ（Probe）がより短ければより低い温度でうまくいく。ハイブリダイゼーションが起こるか否かは、一般に変性されたＤＮＡが、その周囲に存在する相補鎖に、特に解離温度未満でアニーリングする能力に依存する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーおよび相応の条件は、F M Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.でより詳細に記載されている。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の同定の手引きは、当業者によれば、とりわけBoehringer Mannheim GmbH社のハンドブック"フィルターハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステムユーザーズガイド（The DIG System Users Guide for Filter Hybridization）"（ドイツ・マンハイム、１９９３年）およびLiebl et al.（International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)）に見出される。前記のハイブリダイゼーションは、好ましい一実施形態においては、ストリンジェントな条件下で行われる。すなわち、プローブと標的配列、すなわち該プローブで処理されるポリヌクレオチドとが少なくとも７０％同一である場合にのみハイブリッドが形成される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄工程を含めて、バッファー組成、温度および塩濃度のバリエーションによって影響を受けあるいは決定されることは公知である。ハイブリダイゼーション反応は、一般に、洗浄工程と比較して相対的に低いストリンジェンシーの場合に起こる（Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996）。ハイブリダイゼーション反応のためには、例えば５×ＳＳＣバッファーに相当するバッファーを、約５０℃〜６８℃の温度で使用できる。その際、プローブは、また、該プローブの配列に対して７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドともハイブリダイゼーションできる。かかるハイブリッドは、より安定性が低く、ストリンジェントな条件下での洗浄によって遠ざけられる。それは、例えば２×ＳＳＣへと塩濃度を下げ、任意に引き続き０．５×ＳＳＣへと下げることによって（フィルターハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステムユーザーズガイド、ドイツ・マンハイム、１９９５年）達成でき、その際、好ましさの程度が高まる順序において、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃の温度に調整される。約６４℃〜６８℃または約６６℃〜６８℃の温度範囲が好ましい。場合により、塩濃度を、０．２×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣに相当する濃度にまで下げることも可能である。約１〜２℃のステップで５０℃から６８℃までハイブリダイゼーション温度を段階的に高めることによって、例えば、好ましさの程度が高まる順序において、使用される核酸分子の配列に対して少なくとも７０％のもしくは少なくとも８０％のもしくは少なくとも９０％の、少なくとも９１％の、少なくとも９２％の、少なくとも９３％の、少なくとも９４％の、少なくとも９５％の、少なくとも９６％の、少なくとも９７％の、少なくとも９８％のまたは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチド断片を単離することができる。ハイブリダイゼーションのための更なる手引きは、いわゆるキットの形で市販されている（例えばRoche Diagnostics GmbH社、ドイツ・マンハイム社製のDIG Easy Hyb、カタログ番号1603558）。好ましい一実施形態においては、本願で使用される、核酸の"変異体"という概念には、本来の核酸と同じアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列の変異体を遺伝子コードの縮重の範囲内でコードする任意の核酸配列が含まれる。
好ましい一実施形態においては、本発明により使用される細胞は、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対して低減された活性を有し、その際、前記酵素は、好ましくは、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ、脂肪酸インポーターもしくはその変異体、特に好ましくはＦａｄＬもしくはその変異体を含む群からの酵素である。脂肪酸のβ−酸化は、原核生物および真核生物が、同様に、脂肪酸を酸化することを可能にし、かつそこに含まれる化学的エネルギーを前記物質代謝に利用可能にする広く知られた物質代謝経路である。更なる範囲においては、β−酸化は、脂肪酸の細胞への取り込みから始まり、Ｅ．コリの場合には、それをグラム陰性細菌細胞の外膜もしくは内膜に通過させるトランスポーターであるＦａｄＬと脂肪酸をＣｏＡエステルの形で細胞質ゾルに遊離するＦａｄＤ遺伝子産物とによる取り込みから始まる。そこでは、脂肪酸は、その条件を要する限りは、まずＣｏＡ−脂肪酸エステルのβ位でアシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＥ）によって酸化される。類似の分子は、その一方で、二重不飽和脂肪酸からも、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＨ）による還元によって形成されうる。多機能酵素であるエノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＢ）は、引き続き水化を触媒して第二級アルコールを形成し、それを引き続き酸化させてケトンにする。最終工程で３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ（Ｅ．コリの場合にはＦａｄＡ）は、ケトアシル−ＣｏＡの分解を触媒し、その結果として、アセチル−ＣｏＡおよび出発分子に比して２つの炭素原子だけ短縮された脂肪酸のＣｏＡ−エステルが遊離される。同様にそれがアセチル−ＣｏＡではない限り、それは新たにβ−酸化サイクルに供給され、酸化されつつ短縮されうる。脂肪酸のβ−酸化の調節には、脂肪酸の分解に必要な遺伝子を含むＦａｄオペロンのレギュレーターであるＦａｄＲも関与するものの、ＦａｄＲがβ−酸化の反応を触媒することなく関与する。好ましい一実施形態においては、概念"脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素"とは、脂肪酸基質ともしくはアセチル−ＣｏＡへの経路でそこから生ずる分子と直接的に相互作用する、好ましくは基質として認識し、かつそれをこの分解経路でよりアセチル−ＣｏＡの近くにある物質代謝産物へと変換することを触媒するあらゆる酵素を表し、好ましくは脂肪酸を細胞に取り込むことを行う脂肪酸インポーターを含む。アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼは、前出の定義による前記酵素に含まれる。それというのも、該酵素は、脂肪酸−ＣｏＡ−エステルと相互作用し、かつ該エステルを、β−酸化の物質代謝経路で脂肪酸−ＣｏＡ−エステルよりもアセチル−ＣｏＡの近くに位置するそのエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒するからである。特に好ましい一実施形態においては、本願で使用される、"脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する酵素"という概念は、Ｅ．コリ由来の遺伝子産物であるＦａｄＡ、ＦａｄＢ、ＦａｄＤ、ＦａｄＬおよびＦａｄＥおよび／または他の生物由来のその変異体もしくはホモロガ（Homologa）を含む群からのあらゆる酵素を表す。Ｅ．コリ由来の遺伝子産物であるＦａｄＡ、ＦａｄＢ、ＦａｄＤ、ＦａｄＬおよびＦａｄＥと同様に、数多くの他の生物工学的に利用可能な生物由来の変異体およびホモロガならびにそれらの核酸配列およびポリペプチド配列は、先行技術に記載されている。例えばＦａｄＡは、アクセッション番号AP009048.1として、ＦａｄＢは、アクセッション番号BAE77457.1として、ＦａｄＤは、アクセッション番号BAA15609.1として、ＦａｄＥは、アクセッション番号BAA77891.2として、かつＦａｄＬは、アクセッション番号BAA16205.1として示されている。
更なる好ましい一実施形態においては、本発明による細胞または本発明による方法で使用される細胞は、トランスアミナーゼを発現する。好ましい一実施形態においては、本願で使用される概念"トランスアミナーゼ"とは、α−アミノ基を、ドナー分子から、好ましくはアミノ酸から、アクセプター分子へと、好ましくはα−ケトカルボン酸へと転移させることを触媒する酵素を表す。例えば、3HMU_A、AAD41041.1、AAK15486.1、ABE03917.1、ADR60699.1、ADR61066.1、ADR62525.1、AEL07495.1、CAZ86955.1、EFW82310.1、EFW87681.1、EGC99983.1、EGD03176.1、EGE58369.1、EGH06681.1、EGH08331.1、EGH24301.1、EGH32343.1、EGH46412.1、EGH55033.1、EGH62152.1、EGH67339.1、EGH70821.1、EGH71404.1、EGH78772.1、EGH85312.1、EGH97105.1、EGP57596.1、NP_102850.1、NP_106560.1、NP_248912.1、NP_248990.1、NP_354026.2、NP_421926.1、NP_637699.1、NP_642792.1、NP_744329.1、NP_744732.1、NP_747283.1、NP_795039.1、NP_901695.1、XP_002943905.1、YP_001021095.1、YP_001059677.1、YP_001061726.1、YP_001066961.1、YP_001074671.1、YP_001120907.1、YP_001140117.1、YP_001170616.1、YP_001185848.1、YP_001188121.1、YP_001233688.1、YP_001268866.1、YP_001270391.1、YP_001345703.1、YP_001412573.1、YP_001417624.1、YP_001526058.1、YP_001579295.1、YP_001581170.1、YP_001668026.1、YP_001669478.1、YP_001671460.1、YP_001685569.1、YP_001747156.1、YP_001749732.1、YP_001765463.1、YP_001766294.1、YP_001790770.1、YP_001808775.1、YP_001809596.1、YP_001859758.1、YP_001888405.1、YP_001903233.1、YP_001977571.1、YP_002229759.1、YP_002231363.1、YP_002280472.1、YP_002297678.1、YP_002543874.1、YP_002549011.1、YP_002796201.1、YP_002801960.1、YP_002875335.1、YP_002897523.1、YP_002912290.1、YP_002974935.1、YP_003060891.1、YP_003264235.1、YP_003552364.1、YP_003578319.1、YP_003591946.1、YP_003607814.1、YP_003641922.1、YP_003674025.1、YP_003692877.1、YP_003755112.1、YP_003896973.1、YP_003907026.1、YP_003912421.1、YP_004086766.1、YP_004142571.1、YP_004147141.1、YP_004228105.1、YP_004278247.1、YP_004305252.1、YP_004356916.1、YP_004361407.1、YP_004378186.1、YP_004379856.1、YP_004390782.1、YP_004472442.1、YP_004590892.1、YP_004612414.1、YP_004676537.1、YP_004693233.1、YP_004701580.1、YP_004701637.1、YP_004704442.1、YP_108931.1、YP_110490.1、YP_168667.1、YP_237931.1、YP_260624.1、YP_262985.1、YP_271307.1、YP_276987.1、YP_334171.1、YP_337172.1、YP_350660.1、YP_351134.1、YP_364386.1、YP_366340.1、YP_369710.1、YP_370582.1、YP_426342.1、YP_440141.1、YP_442361.1、YP_468848.1、YP_521636.1、YP_554363.1、YP_608454.1、YP_610700.1、YP_614980.1、YP_622254.1、YP_625753.1、YP_680590.1、YP_751687.1、YP_767071.1、YP_774090.1、YP_774932.1、YP_788372.1、YP_858562.1、YP_928515.1、YP_983084.1、YP_995622.1、ZP_00948889.1、ZP_00954344.1、ZP_00959736.1、ZP_00998881.1、ZP_01011725.1、ZP_01037109.1、ZP_01058030.1、ZP_01076707.1、ZP_01103959.1、ZP_01167926.1、ZP_01224713.1、ZP_01442907.1、ZP_01446892.1、ZP_01550953.1、ZP_01625518.1、ZP_01745731.1、ZP_01750280.1、ZP_01754305.1、ZP_01763880.1、ZP_01769626.1、ZP_01865961.1、ZP_01881393.1、ZP_01901558.1、ZP_02145337.1、ZP_02151268.1、ZP_02152332.1、ZP_02167267.1、ZP_02190082.1、ZP_02242934.1、ZP_02360937.1、ZP_02367056.1、ZP_02385477.1、ZP_02456487.1、ZP_02883670.1、ZP_03263915.1、ZP_03263990.1、ZP_03400081.1、ZP_03452573.1、ZP_03456092.1、ZP_03517291.1、ZP_03529055.1、ZP_03571515.1、ZP_03572809.1、ZP_03587785.1、ZP_03588560.1、ZP_03697266.1、ZP_03697962.1、ZP_04521092.1、ZP_04590693.1、ZP_04890914.1、ZP_04891982.1、ZP_04893793.1、ZP_04902131.1、ZP_04905327.1、ZP_04941068.1、ZP_04944536.1、ZP_04945255.1、ZP_04959332.1、ZP_04964181.1、ZP_05053721.1、ZP_05063588.1、ZP_05073059.1、ZP_05077806.1、ZP_05082750.1、ZP_05091128.1、ZP_05095488.1、ZP_05101701.1、ZP_05116783.1、ZP_05121836.1、ZP_05127756.1、ZP_05637806.1、ZP_05742087.1、ZP_05783548.1、ZP_05786246.1、ZP_05843149.1、ZP_05945960.1、ZP_06459045.1、ZP_06487195.1、ZP_06492453.1、ZP_06493162.1、ZP_06703644.1、ZP_06731146.1、ZP_06839371.1、ZP_07007312.1、ZP_07266194.1、ZP_07374050.1、ZP_07662787.1、ZP_07778196.1、ZP_07797983.1、ZP_08099459.1、ZP_08138203.1、ZP_08141719.1、ZP_08142973.1、ZP_08177102.1、ZP_08185821.1、ZP_08186468.1、ZP_08208888.1、ZP_08266590.1、ZP_08402041.1、ZP_08406891.1、ZP_08522175.1、ZP_08527488.1、ZP_08631252.1、ZP_08636687を含む群からのトランスアミナーゼを使用することができる。
更なる好ましい一実施形態においては、本発明による細胞または本発明による方法で使用される細胞は、アラニンデヒドロゲナーゼを発現する。好ましい一実施形態においては、本願で使用される概念"アラニンデヒドロゲナーゼ"とは、Ｌ−アラニンを水とＮＡＤ+とを消費してピルベート、アンモニアおよびＮＡＤＨに変換することを触媒する酵素を表す。例えば、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来（データベースコードL20916）の、リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）由来（CP001622）の、ビブリオ・プロテオリティクス（Vibrio proteolyticus）由来（AF070716）の、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）由来（X63069）の、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）由来（AB013821）のアラニンデヒドロゲナーゼ、EGR93259.1、YP_003654745.1、YP_003651439.1、YP_003637111.1、YP_003631815.1、YP_001327051.1、YP_001262560.1、YP_886996.1、YP_882850.1、YP_704410.1、YP_703508.1、ZP_08624689.1、YP_001230376.1、P17557.1、P17556.1、CCB94892.1、CCB73698.1、YP_001168635.1、YP_004668736.1、YP_004569425.1、YP_003513168.1、YP_004561169.1、ZP_08554945.1、YP_400777.1、ZP_08311476.1、ZP_08310170.1、ZP_08267322.1、ZP_08263846.1、ZP_07898723.1、YP_149301.1、YP_148605.1、YP_004340432.1、EFT09946.1、EFS80513.1、EFS51332.1、EFS42459.1、YP_003060895.1、YP_003059033.1、ZP_03305373.1、YP_847214.1、YP_004095847.1、YP_003338282.1、YP_003337256.1、YP_355846.1、YP_253131.1、ZP_08197563.1、ZP_08196283.1、ADW06447.1、YP_734091.1、NP_372233.1、NP_102173.1、ZP_08170259.1、EGD36706.1、EGD32748.1、ZP_08155540.1、YP_004142849.1、YP_002417649.1、YP_001301040.1、YP_002992892.1、YP_081348.1、YP_080482.1、YP_002476349.1、ZP_08115025.1、ZP_08114403.1、YP_003552869.1、YP_002358112.1、YP_575010.1、YP_477594.1、YP_474564.1、YP_130399.1、YP_129373.1、YP_123314.1、NP_810467.1、NP_646469.1、NP_626044.1、NP_391071.1、ZP_08086822.1、ZP_08084776.1、ZP_08083119.1、ZP_08020768.1、ZP_08013590.1、ZP_08011832.1、YP_003783744.1、YP_002781576.1、YP_002780533.1、ZP_02195873.1、NP_797482.1、ZP_07645051.1、ZP_07643260.1、ZP_06611917.1、AAT40119.1、ZP_07864946.1、YP_004068409.1、YP_002796203.1、YP_002774420.1、YP_003600348.1、YP_003599946.1、YP_003565624.1、YP_003565223.1、YP_335198.1、YP_423850.1、YP_155059.1、ZP_07843538.1、ZP_07841226.1、ZP_06928932.1、ZP_05692073.1、ZP_05687006.1、ZP_04867480.1、YP_775531.1、CBE70214.1、ZP_07721182.1、ZP_04302850.1、ZP_04298961.1、ZP_04287684.1、ZP_04277177.1、ZP_04248389.1、ZP_04235899.1、ZP_02159718.1、ZP_02152178.1、YP_003974610.1、YP_003546595.1、YP_002317127.1、ZP_07313778.1、ZP_07302778.1、ZP_07298850.1、CBK69442.1、YP_003413835.1、YP_003595089.1、ZP_06807811.1、YP_003582455.1、YP_003464731.1、YP_003496397.1、YP_003421918.1、CBL07274.1、CBK64956.1、YP_003508515.1、AAL87460.1、AAC23579.1、AAC23578.1、AAC23577.1、ACU78652.1、YP_003471439.1、YP_003452777.1、ZP_06384971.1、ACY25368.1、ABC26869.1、AAP44334.1、EEZ80018.1、ZP_05110458.1、1PJB_A、ZP_04717201.1、ZP_04689103.1、CAO90307.1、CAM75354.1、CAA44791.1、BAA77513.1、EGR96638.1、EGL90046.1、YP_004510847.1、ZP_08450330.1、YP_003387804.1、YP_003058152.1、EFS74272.1、EFS67128.1、ZP_06844564.1、YP_826658.1、YP_001195249.1、YP_003095978.1、YP_469292.1、YP_004442054.1、YP_004461174.1、YP_004055616.1、YP_003576656.1、YP_003094537.1、YP_001295973.1、AEE71143.1、YP_004447480.1、YP_003761844.1、YP_040853.1、YP_003154888.1、YP_003142045.1、YP_002280953.1、NP_371963.1、NP_422368.1、EGC98966.1、EGC76398.1、YP_004263661.1、YP_004252039.1、YP_679036.1、YP_499973.1、ZP_08054972.1、ZP_08053009.1、ZP_04067276.1、ZP_03968868.1、ZP_03963857.1、ZP_03933079.1、ZP_03497046.1、ZP_06668924.1、ZP_06667106.1、ZP_06324464.1、ZP_06196777.1、ZP_05114159.1、ZP_05083968.1、ZP_05070370.1、ZP_05030022.1、ZP_04673064.1、ZP_03517011.1、ZP_03505783.1、XP_001310698.1、ABK27691.1またはCAB59281.2を含む群からのアラニンデヒドロゲナーゼを使用することができる。細胞がアラニンデヒドロゲナーゼを発現する場合については、無機の窒素源、好ましくは塩化アンモニウムもしくは硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を十分な量で水溶液に加えることが好ましい。アラニン濃度を高める方法は、EP12162846.5に記載されている。
本発明の一態様は、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウトを、式（Ｉ）のカルボン酸エステルの生産性向上のための組み換え細胞の遺伝的特徴の一部として用いる使用を想定している。それは、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウトが細胞の特徴として、式（Ｉ）のカルボン酸エステルの転化の生成物の収率、炭素収支および／または窒素収支および／または純度を高める目的で行われたことを意味する。
好ましい一実施形態においては、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドまたは変異体のならびにポリペプチドＦａｄＬのノックアウトを細胞のゲノム中に有する細胞であって、更にアルカンヒドロキシラーゼ、好ましくはシュードモナス・プチダ由来のＡｌｋＢと、トランスアミナーゼ、好ましくはクロモバクテリウム・ビオラセウムＡＴＣＣ１２４７２（Chromobacterium violaceum ATCC 12472）由来のトランスアミナーゼと、アラニンデヒドロゲナーゼ、好ましくはバシラス・サチリス由来のアラニンデヒドロゲナーゼと、シュードモナス・プチダ由来のＡｌｋＬとを発現する前記細胞が想定される。前記細胞は、更なる最も好ましい一実施形態においては、水溶液中で、脂肪酸エステルと、好ましくはラウリン酸メチルエステルと接触される。
例１
Ｅ．コリＷ３１１０およびＢＷ２５１１３におけるｂｉｏＨの不活性化
基礎ベクターpKO3_E933によるｂｉｏＨ遺伝子（b3412、配列番号１）の狙い通りのノックアウトのために、新たなプラスミドが必要となった。ベクターpKO3_E933（配列番号１４）を基礎とし、ｂｉｏＨ遺伝子の５００ｂｐ上流（配列番号３）あるいは５００ｂｐ下流（配列番号４）が組み込まれ、それらはＰｓｐＸＩ切断部位（CCTCGAGG）によって隔てられて存在する。完成されたプラスミドは、内部名称AHp-LL-42（配列番号５）を有する。その完成のためには以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
o-LL-314（配列番号６）
5’-CCGGGGATCGCGGCCCGGCTTCGCTATCCCATTGGCAGT-3’
o-LL-315（配列番号７）
5’-CCTCTGCTTCAACGCCCTCGAGGCATCCGCTATTGTTCTCTTTTGACTTACAAGGATG-3’
o-LL-316（配列番号８）
5’-GCGTTGAAGCAGAGGGTGTAGGTG-3’
o-LL-317（配列番号９）
5’-TAGAGGATCGCGGCCCAAACTGGCAAGGCAGCTTTATGC-3’
Ｅ．コリＷ３１１０およびＢＷ２５１１３におけるｂｉｏＨの不活性化
基礎ベクターpKO3_E933によるｂｉｏＨ遺伝子（b3412、配列番号１）の狙い通りのノックアウトのために、新たなプラスミドが必要となった。ベクターpKO3_E933（配列番号１４）を基礎とし、ｂｉｏＨ遺伝子の５００ｂｐ上流（配列番号３）あるいは５００ｂｐ下流（配列番号４）が組み込まれ、それらはＰｓｐＸＩ切断部位（CCTCGAGG）によって隔てられて存在する。完成されたプラスミドは、内部名称AHp-LL-42（配列番号５）を有する。その完成のためには以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
o-LL-314（配列番号６）
5’-CCGGGGATCGCGGCCCGGCTTCGCTATCCCATTGGCAGT-3’
o-LL-315（配列番号７）
5’-CCTCTGCTTCAACGCCCTCGAGGCATCCGCTATTGTTCTCTTTTGACTTACAAGGATG-3’
o-LL-316（配列番号８）
5’-GCGTTGAAGCAGAGGGTGTAGGTG-3’
o-LL-317（配列番号９）
5’-TAGAGGATCGCGGCCCAAACTGGCAAGGCAGCTTTATGC-3’
それらの５００ｂｐ領域は、Ｅ．コリＷ３１１０の存在する染色体ＤＮＡからの上述のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって取得した。上流領域（配列番号３）のためにはo-LL-314とo-LL-315を使用し、下流領域（配列番号４）のためにはo-LL-316とo-LL-317を使用した。そのＰＣＲのためには以下のパラメータを使用した：
初期変性：９８℃で１０秒
３０回の変性：９８℃で１０秒
３０回のアニーリング：５７．９℃／５８．８℃／５９．７℃／６０．６℃／６１．４℃／６２．３℃／６３．２℃／６４．１℃（温度勾配）
３０回の伸長：７２℃で２０秒
最終伸長：７２℃で４分間
初期変性：９８℃で１０秒
３０回の変性：９８℃で１０秒
３０回のアニーリング：５７．９℃／５８．８℃／５９．７℃／６０．６℃／６１．４℃／６２．３℃／６３．２℃／６４．１℃（温度勾配）
３０回の伸長：７２℃で２０秒
最終伸長：７２℃で４分間
増幅のために、New England Biolabs社製の2x Phusion HF Master Mix（NEB, M0531S）を製造元の指示に従って使用した。ＰＣＲ産物を、純度に応じて直接的にカラム精製（QiaQuick PCR Purification Kit、Qiagen、Hilden）するか、またはアガロースゲルを介して精製および抽出（QiaQuick Gel Extraction Kit、Qiagen、Hilden）した。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色およびＰＣＲ断片サイズの測定の実施は、当業者に公知の様式および方法で行った。両方の場合に、予想されたサイズのＰＣＲ断片が提供できた。
精製されたＰＣＲ産物を、NotIで切断されたpKO3_E933ベクター（配列番号１４）中にIn-Fusion HD Cloning Kitを用いた組み換えによって製造元（Clontech Laboratories Inc.、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）の指示に従ってクローニングした。化学的にコンピテントにされたＥ．コリＤＨ１０β（New England Biolabs、フランクフルト）の形質転換は、当業者に公知の様式および方法に従って行った。標的配列の正確な挿入は、制限分析によって調べ、導入された配列の信頼性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。生成したベクターをAHp-LL-42（配列番号５）と名付けた。
菌株Ｅ．コリＷ３１１０ΔｂｉｏＨの構築は、ベクターAHp-LL-42（配列番号５）を用いて当業者に公知の方法で行った（Link AJ, Phillips D, Church GM. J.Bacteriol. 1997. 179(20)を参照のこと）。実験で使用した菌株ＢＷ２５１１３ならびにＢＷ２５１１３ΔｂｉｏＨ（ＪＷ３３７５）は、Ｋｅｉｏコレクションの一部として商業的に取得した（Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection, Tomoya Baba, Takeshi Ara, Miki Hasegawa, Yuki Takai, Yoshiko Okumura, Miki Baba, Kirill A Datsenko, Masaru Tomita, Barry L Wanner and Hirotada Mori, Molecular Systems Biology (2006), 2006 EMBO and Nature Publishing Groupを参照のこと）。構築された菌株は、以下の名称で更に続けた：
Ｗ３１１０における欠失後のｂｉｏＨのＤＮＡ配列は、配列番号１０に示されている。
例２
遺伝子ｂｉｏＨ中に欠失を有するＥ．コリＷ３１１０による、バシラス・サチリス由来の遺伝子aldとクロモバクテリウム・ビオラセウム由来のCv_2025についての発現ベクターを、シュードモナス・プチダのａｌｋオペロンからの遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＴおよびａｌｋＬについての発現ベクターと組み合わせて使用することによるアミノラウリン酸メチルエステルの生産
バシラス・サチリス由来の遺伝子ald（アラニン−デヒドロゲナーゼをコードする、Ｅ．コリ用にコドン最適化された）と、クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のCv_2025（トランスアミナーゼをコードする、Ｅ．コリ用にコドン最適化された）についての発現ベクターを、シュードモナス・プチダのａｌｋオペロンからの遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＴ（アルカン−モノオキシゲナーゼ、ルブレドキシンおよびルブレドキシン−レダクターゼをコードする）およびａｌｋＬ（膜タンパク質／トランスポータータンパク質をコードする）についての発現ベクターと組み合わせて有するＥ．コリ菌株の作成のために、電気的にコンピテントにされたＥ．コリＷ３１１０ΔｂｉｏＨと、相応の対照菌株Ｅ．コリＷ３１１０を製造した。それは、当業者に公知の様式および方法で行った。それらの菌株は、例１に記載されるように製造した。これらの菌株を、プラスミドpBT10_alkL（配列番号１１もしくはWO/2011/131420およびそこに挙げられるSeq ID NR: 8）およびpJ294[alaDH_Bs(co)TA_Cv(co)]（配列番号１２もしくはWO/2013/024114の例１およびそこに挙げられるSEQ ID Nr. 17）で形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＬＢアガープレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製と分析的な制限分析によって正確なプラスミドの存在について調べた。このようにして以下の菌株を作成した：
遺伝子ｂｉｏＨ中に欠失を有するＥ．コリＷ３１１０による、バシラス・サチリス由来の遺伝子aldとクロモバクテリウム・ビオラセウム由来のCv_2025についての発現ベクターを、シュードモナス・プチダのａｌｋオペロンからの遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＴおよびａｌｋＬについての発現ベクターと組み合わせて使用することによるアミノラウリン酸メチルエステルの生産
バシラス・サチリス由来の遺伝子ald（アラニン−デヒドロゲナーゼをコードする、Ｅ．コリ用にコドン最適化された）と、クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のCv_2025（トランスアミナーゼをコードする、Ｅ．コリ用にコドン最適化された）についての発現ベクターを、シュードモナス・プチダのａｌｋオペロンからの遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＴ（アルカン−モノオキシゲナーゼ、ルブレドキシンおよびルブレドキシン−レダクターゼをコードする）およびａｌｋＬ（膜タンパク質／トランスポータータンパク質をコードする）についての発現ベクターと組み合わせて有するＥ．コリ菌株の作成のために、電気的にコンピテントにされたＥ．コリＷ３１１０ΔｂｉｏＨと、相応の対照菌株Ｅ．コリＷ３１１０を製造した。それは、当業者に公知の様式および方法で行った。それらの菌株は、例１に記載されるように製造した。これらの菌株を、プラスミドpBT10_alkL（配列番号１１もしくはWO/2011/131420およびそこに挙げられるSeq ID NR: 8）およびpJ294[alaDH_Bs(co)TA_Cv(co)]（配列番号１２もしくはWO/2013/024114の例１およびそこに挙げられるSEQ ID Nr. 17）で形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＬＢアガープレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製と分析的な制限分析によって正確なプラスミドの存在について調べた。このようにして以下の菌株を作成した：
それらの菌株に流加培養を行って、ラウリン酸メチルエステルからの、ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステル、オキソ−ラウリン酸メチルエステル、カルボキシ−ラウリン酸メチルエステルおよびアミノ−ラウリン酸メチルエステルの生産能力を分析した。それは、ＤＡＳＧＩＰ社製の８連の並列発酵システム（8-fach Parallelfermentationssystem）において行った。
発酵のために、１Ｌのリアクターを使用した。ｐＨプローブを、ｐＨ４．０とｐＨ７．０の基準溶液で二点校正法によって校正した。前記リアクターに、３００ｍＬの飲料水を満たし、滅菌性を保証するために１２１℃で２０分にわたりオートクレーブにかけた。引き続き、ｐＯ2プローブを、一晩（少なくとも６時間長）にわたりＤＡＳＧＩＰシステムで分極させた。翌朝に、水をクリーンベンチのもとで取り除き、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを有する３００ｍＬの高細胞密度培地に置き換えた。次に、ｐＯ2プローブを一点校正法（撹拌機：４００ｒｐｍ／給気：１０ｓＬ／ｈ空気）により校正し、供給区間、校正剤区間および誘導剤区間を定置洗浄（Clean-in-Place）で洗浄した。そのために、それらのチューブを、７０％エタノールで、引き続き１ＭのＮａＯＨで、次いで滅菌完全脱塩水ですすぎ、最後にその都度の培地で満たした。
ＡＬＳおよびＡＬＳＭＥを産生するＥ．コリ菌株を、まず、その都度の凍結培養物（Cryokultur）から１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを有するＬＢ培地（１００ｍＬのバッフル付フラスコ中２５ｍＬ）中で３７℃および２００ｒｐｍで一晩にわたり約１８時間にわたり増殖させた。引き続き、前記培養それぞれ２ｍＬを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを有する高細胞密度培地（グルコース １５ｇ／Ｌ（１％ＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏおよび２．２％ＮＨ4Ｃｌを有する個別にオートクレーブにかけた５００ｇ／Ｌのストック溶液を３０ｍＬ／Ｌで）、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １．７６ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １９．０８ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス ６．６６ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物 ２．２４ｇ／Ｌ、クエン酸鉄アンモニウム溶液 個別にオートクレーブにかけた１％ストック溶液を１７ｍＬ／Ｌで、微量元素溶液 個別にオートクレーブにかけたストック溶液（ＨＣｌ（３７％） ３６．５０ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ2*４Ｈ2Ｏ １．９１ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4*７Ｈ2Ｏ １．８７ｇ／Ｌ、エチレンジアミン四酢酸二水和物 ０．８４ｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3 ０．３０ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4*２Ｈ2Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2*２Ｈ2Ｏ ４．７０ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4*７Ｈ2Ｏ １７．８０ｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ2*２Ｈ2Ｏ ０．１５ｇ／Ｌ）を５ｍＬ／Ｌで）（それぞれの菌株は、１００ｍＬのバッフル付フラスコ中２５ｍＬ）に接種し、３７℃／２００ｒｐｍで更に５．５時間にわたりインキュベートした。
相応の容量の前培養を５ｍＬの注射器（滅菌条件下）に吸い上げ、そして前記リアクターにカニューレを介して７０％エタノールを被せた隔膜を介して接種することでリアクターに光学密度０．１で接種した。
以下の標準プログラムを使用した：
実施した実験は、細胞を規定の光学密度に達すべく培養するフェーズと、基質であるラウリン酸メチルエステルの添加後に発現で形成された酵素によるアミノラウリン酸エステルへの転化が行われるべき引き続いての生体内変換のフェーズの２つのフェーズに分けることができる。それらのｐＨ値は、一方だけアンモニア（１２．５％）でｐＨ６．８に調節した。培養と生体内変換の間に、培養物中の溶解された酸素（ＤＯ、溶解酸素）は撹拌機回転数とガス供給速度により３０％に調節した。発酵は流過培養法として行った。その際、５ｇ／Ｌｈのグルコースフィード（５００ｇ／Ｌのグルコース、１％のＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏおよび２．２％のＮＨ4Ｃｌを含む）の供給開始はＤＯピークをトリガとした。供給開始とともに、事前の３７℃の温度も３０℃に下げた。トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよび脂肪酸レダクターゼの発現は、供給開始２時間後にＩＰＴＧ（１ｍＭ）の自動添加によって誘導した。ａｌｋ遺伝子の誘導は、ＤＣＰＫ（０．０２５％（v/v））の手動添加により供給開始１０時間後に行った。生体内変換の開始前に培養ブロスの光学密度を測定した。
生体内変換フェーズの開始は、供給開始１４時間後に行った。そのために、ラウリン酸メチルエステルおよびイオン交換体のオレイン酸（工業用９０％）からなる混合物１５０ｍＬをバッチとして発酵ブロスへと添加した。トランスアミナーゼのためのアミノ基ドナーを提供するために、生体内変換開始３０分前に３Ｍの硫酸アンモニウム溶液５ｍＬを発酵ブロスに添加した。試料採取のために、２ｍＬの発酵ブロスをタンクから取り出し、その一部をアセトン−ＨＣｌ混合物（ｃ（ＨＣｌ）＝０．１モル／Ｌ）中で１／２０希釈し、抽出した。試料を、生体内変換開始の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、７．５時間後、１０．５時間後、１９．５時間後および２１時間後に全てのリアクターから取り出した。酸素についての転化率（ＯＴＲ＝酸素転移率（oxygen transfer rate））および炭素についての転化率（ＣＴＲ＝炭素転移率（carbon transfer rate）を、発酵の間にＤＡＳＧＩＰ−システムでのオフガス分析によって測定した。発酵は、生体内変換開始の２１時間後に終了した。撹拌機、ガス供給、温度調節およびｐＨ調節を止め、タンクを５〜１０分間にわたり静置させた。
発酵試料における、ＤＤＳ（Ｃ１２−ジカルボン酸）、ＤＤＳＭＥ（Ｃ１２−ジカルボン酸メチルエステル）、ＬＳ（ラウリン酸）、ＬＳＭＥ（ラウリン酸メチルエステル）、ＨＬＳ（ω−ヒドロキシラウリン酸）、ＨＬＳＭＥ（ω−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル）、ＯＬＳ（ω−オキソラウリン酸）、ＯＬＳＭＥ（ω−オキソラウリン酸メチルエステル）、ＡＬＳ（ω−アミノラウリン酸）およびＡＬＳＭＥ（ω−アミノラウリン酸メチルエステル）の定量化のために、培養の間に試料を取り出した。これらの試料を、分析のために準備した（ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2ベースの生成物の定量化を参照のこと）。
ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2ベースの生成物の定量化
発酵試料におけるＡＬＳ、ＡＬＳＭＥ、ＤＤＳ、ＤＤＳＭＥ、ＬＳ、ＬＳＭＥ、ＨＬＳ、ＨＬＳＭＥ、ＯＬＳおよびＯＬＳＭＥの定量化は、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2によって、全ての分析物についての外部校正（０．１〜５０ｍｇ／Ｌ）をもとに、かつアミノウンデカン酸（ＡＵＤ、これは、ＨＬＳ、ＤＤＳ、ＯＬＳ、ＨＬＳＭＥ、ＯＬＳＭＥのため）、ｄ４−ＡＬＳＭＥ（ＡＬＳＭＥのため）、13Ｃ−ＤＤＳＭＥ（ＤＤＳＭＥのため）、ｄ３−ＬＳ（ＬＳのため）およびｄ３−ＬＳＭＥ（ＬＳＭＥのため）といった内部標準を用いて行った。
発酵試料におけるＡＬＳ、ＡＬＳＭＥ、ＤＤＳ、ＤＤＳＭＥ、ＬＳ、ＬＳＭＥ、ＨＬＳ、ＨＬＳＭＥ、ＯＬＳおよびＯＬＳＭＥの定量化は、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ2によって、全ての分析物についての外部校正（０．１〜５０ｍｇ／Ｌ）をもとに、かつアミノウンデカン酸（ＡＵＤ、これは、ＨＬＳ、ＤＤＳ、ＯＬＳ、ＨＬＳＭＥ、ＯＬＳＭＥのため）、ｄ４−ＡＬＳＭＥ（ＡＬＳＭＥのため）、13Ｃ−ＤＤＳＭＥ（ＤＤＳＭＥのため）、ｄ３−ＬＳ（ＬＳのため）およびｄ３−ＬＳＭＥ（ＬＳＭＥのため）といった内部標準を用いて行った。
その際に以下の機器を使用する：
・ オートサンプラー（G1367E）と、バイナリポンプ（G1312B）と、カラムオーブン（G1316A）とを備えたＨＰＬＣシステム１２６０（Agilent；Boeblingen）
・ ＥＳＩ源を備えた質量分析計TripelQuad 6410（Agilent；Boeblingen）
・ ＨＰＬＣカラム：Kinetex C18、１００×２．１ｍｍ、粒度：２．６μｍ、細孔サイズ１００Å（Phenomenex；Aschaffenburg）
・ プレカラム：KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter；０．５μｍの濾層厚および０．００４ｍｍの内径（Phenomenex；Aschaffenburg）
・ オートサンプラー（G1367E）と、バイナリポンプ（G1312B）と、カラムオーブン（G1316A）とを備えたＨＰＬＣシステム１２６０（Agilent；Boeblingen）
・ ＥＳＩ源を備えた質量分析計TripelQuad 6410（Agilent；Boeblingen）
・ ＨＰＬＣカラム：Kinetex C18、１００×２．１ｍｍ、粒度：２．６μｍ、細孔サイズ１００Å（Phenomenex；Aschaffenburg）
・ プレカラム：KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter；０．５μｍの濾層厚および０．００４ｍｍの内径（Phenomenex；Aschaffenburg）
試料を、１９００μＬの溶剤（８０％（v/v）のＡＣＮ、２０％の二回蒸留Ｈ2Ｏ（v/v）＋０．１％のギ酸）および１００μＬの試料を２ｍＬの反応容器にピペット導入することによって準備した。その混合物を、約１０秒間にわたりボルテックスにかけ、引き続き約１３０００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離した。澄明な上清を、ピペットで取り出し、希釈剤（８０％（v/v）のＡＣＮ、２０％の二回蒸留Ｈ2Ｏ（v/v）＋０．１％のギ酸）での相応の希釈の後に分析した。それぞれ９００μＬの試料に対して１００μＬのＩＳＴＤを更にピペット導入した（試料容量９０μＬの場合に１０μＬ）。
ＨＰＬＣ分離は、上述のカラムもしくはプレカラムで行った。注入容量は０．７μＬであり、カラム温度は５０℃であり、流速は０．６ｍＬ／分である。移動相は、溶出剤Ａ（０．１％（v/v）の水性ギ酸）と溶出剤Ｂ（アセトニトリルと０．１％（v/v）のギ酸）とからなる。以下のグラジエントプロフィールを用いた：
ＥＳＩ−ＭＳ2分析は、ポジティブモードで以下のＥＳＩ源のパラメータをもって行った：
・ ガス温度 ２８０℃
・ ガス流速 １１Ｌ／分
・ ネブライザー圧力 ５０ｐｓｉ
・ キャピラリー電圧 ４０００Ｖ
・ ガス温度 ２８０℃
・ ガス流速 １１Ｌ／分
・ ネブライザー圧力 ５０ｐｓｉ
・ キャピラリー電圧 ４０００Ｖ
化合物ＡＬＳ、ＡＬＳＭＥ、ＤＤＳ、ＤＤＳＭＥ、ＨＬＳ、ＨＬＳＭＥ、ＯＬＳ、ＯＬＳＭＥの検出および定量化は、以下のＭＲＭパラメータをもって行った。その際、それぞれ１つのプロダクトイオンをクオリファイアとして用い、１つをクオンティファイアとして用いた：
分析物ＬＳおよびＬＳＭＥは、ＳＩＭモードで検出した（ｍ／ｚ ２０１および２１５）。
結果
Ｅ．コリＷ３１１０におけるｂｉｏＨのノックアウト後の遊離酸であるアミノラウリン酸、ドデカン二酸およびラウリン酸の形成の減少
ｂｉｏＨ−ノックアウトを有する菌株は、インタクトなｂｉｏＨを有する対照菌株と比較して明らかに低減された、遊離酸であるアミノラウリン酸、ドデカン二酸およびラウリン酸の形成を示した。ドデカン二酸（ＤＤＳ）とドデカン二酸メチルエステル（ＤＤＳＭＥ）の、アミノラウリン酸（ＡＬＳ）とアミノラウリン酸メチルエステル（ＡＬＳＭＥ）の、ならびにラウリン酸（ＬＳ）とラウリン酸メチルエステル（ＬＳＭＥ）の絶対最終滴定濃度（Absolut-Endtiter）の比率を計算してパーセンテージで表した。
Ｅ．コリＷ３１１０におけるｂｉｏＨのノックアウト後の遊離酸であるアミノラウリン酸、ドデカン二酸およびラウリン酸の形成の減少
ｂｉｏＨ−ノックアウトを有する菌株は、インタクトなｂｉｏＨを有する対照菌株と比較して明らかに低減された、遊離酸であるアミノラウリン酸、ドデカン二酸およびラウリン酸の形成を示した。ドデカン二酸（ＤＤＳ）とドデカン二酸メチルエステル（ＤＤＳＭＥ）の、アミノラウリン酸（ＡＬＳ）とアミノラウリン酸メチルエステル（ＡＬＳＭＥ）の、ならびにラウリン酸（ＬＳ）とラウリン酸メチルエステル（ＬＳＭＥ）の絶対最終滴定濃度（Absolut-Endtiter）の比率を計算してパーセンテージで表した。
遊離酸の形成に対するｂｉｏＨ−ノックアウトの効果は明らかに見られ、７．１０倍（ＤＤＳ／ＤＤＳＭＥ）の低下から９．７５倍（ＡＬＳ／ＡＬＳＭＥ）の低下までの間で変動した。
Ｅ．コリＷ３１１０におけるｂｉｏＨのノックアウト後の生成物対副生成物の比率の改善
一定時間（＝生体内変換の終わり）後に達成された絶対滴定濃度を評価した。ここでは、菌株バックグラウンド（Stammhintergrund）Ｗ３１１０ΔｂｉｏＨにおいて、同じ最終生成物滴定濃度を保ったままで、明らかに改善された生成物（ＡＬＳおよびＡＬＳＭＥ）対主要副生成物（ＤＤＳおよびＤＤＳＭＥ）の比率が示された。その比率は、４９．１７％のＡＬＳ（ＭＥ）から８２．１０％のＡＬＳ（ＭＥ）まで高まる。
一定時間（＝生体内変換の終わり）後に達成された絶対滴定濃度を評価した。ここでは、菌株バックグラウンド（Stammhintergrund）Ｗ３１１０ΔｂｉｏＨにおいて、同じ最終生成物滴定濃度を保ったままで、明らかに改善された生成物（ＡＬＳおよびＡＬＳＭＥ）対主要副生成物（ＤＤＳおよびＤＤＳＭＥ）の比率が示された。その比率は、４９．１７％のＡＬＳ（ＭＥ）から８２．１０％のＡＬＳ（ＭＥ）まで高まる。
例３
遺伝子ｂｉｏＨ中に欠失を有するＥ．コリ菌株による、バシラス・サチリス由来の遺伝子aldとクロモバクテリウム・ビオラセウム由来のCv_2025とシュードモナス・プチダのａｌｋオペロンからの遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＴおよびａｌｋＬについての発現ベクターを使用することによるアミノラウリン酸メチルエステルの生産
バシラス・サチリス由来の遺伝子ald（アラニン−デヒドロゲナーゼをコードする、Ｅ．コリ用にコドン最適化された）と、クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のCv_2025（トランスアミナーゼをコードする、Ｃ．トロピカリス（C.tropicalis）用にコドン最適化された）、シュードモナス・プチダのａｌｋオペロンからの遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＴ（アルカン−モノオキシゲナーゼ、ルブレドキシンおよびルブレドキシン−レダクターゼをコードする）およびａｌｋＬ（膜タンパク質／トランスポータータンパク質をコードする）についての発現ベクターを有するＥ．コリ菌株の作成のために、電気的にコンピテントにされたＥ．コリＢＷ２５１１３ΔｂｉｏＨと、相応の対照菌株Ｅ．コリＢＷ２５１１３を製造した。それは、当業者に公知の様式および方法で行った。それらの菌株は、商業的に入手可能なＫｅｉｏコレクションに由来するものである。これらの菌株を、プラスミドpACYC184{MCS2.0}[alkST_BFGL][alaDH_Bs(co) {PspXI} TAcv(ct)]（配列番号１３もしくはWO/2013/024114の例１およびそこに挙げられるSEQ ID Nr. 17）で形質転換し、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢアガープレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製と分析的な制限分析によって正確なプラスミドの存在について調べた。このようにして以下の菌株を作成した：
遺伝子ｂｉｏＨ中に欠失を有するＥ．コリ菌株による、バシラス・サチリス由来の遺伝子aldとクロモバクテリウム・ビオラセウム由来のCv_2025とシュードモナス・プチダのａｌｋオペロンからの遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＴおよびａｌｋＬについての発現ベクターを使用することによるアミノラウリン酸メチルエステルの生産
バシラス・サチリス由来の遺伝子ald（アラニン−デヒドロゲナーゼをコードする、Ｅ．コリ用にコドン最適化された）と、クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のCv_2025（トランスアミナーゼをコードする、Ｃ．トロピカリス（C.tropicalis）用にコドン最適化された）、シュードモナス・プチダのａｌｋオペロンからの遺伝子ａｌｋＢ、ａｌｋＧ、ａｌｋＴ（アルカン−モノオキシゲナーゼ、ルブレドキシンおよびルブレドキシン−レダクターゼをコードする）およびａｌｋＬ（膜タンパク質／トランスポータータンパク質をコードする）についての発現ベクターを有するＥ．コリ菌株の作成のために、電気的にコンピテントにされたＥ．コリＢＷ２５１１３ΔｂｉｏＨと、相応の対照菌株Ｅ．コリＢＷ２５１１３を製造した。それは、当業者に公知の様式および方法で行った。それらの菌株は、商業的に入手可能なＫｅｉｏコレクションに由来するものである。これらの菌株を、プラスミドpACYC184{MCS2.0}[alkST_BFGL][alaDH_Bs(co) {PspXI} TAcv(ct)]（配列番号１３もしくはWO/2013/024114の例１およびそこに挙げられるSEQ ID Nr. 17）で形質転換し、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢアガープレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製と分析的な制限分析によって正確なプラスミドの存在について調べた。このようにして以下の菌株を作成した：
それらの菌株に流加培養を行って、ラウリン酸メチルエステルからの、ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステル、オキソ−ラウリン酸メチルエステル、カルボキシ−ラウリン酸メチルエステルおよびアミノ−ラウリン酸メチルエステルの生産能力を分析した。それは、ＤＡＳＧＩＰ社製の８連の並列発酵システムにおいて行った。更なる実験操作は、例２に記載したのと全く同じく行った。
結果
Ｅ．コリＢＷ２５１１３におけるｂｉｏＨのノックアウト後の遊離酸であるアミノラウリン酸、ドデカン二酸、ラウリン酸およびヒドロキシラウリン酸の形成の減少
ｂｉｏＨ−ノックアウトを有する菌株は、インタクトなｂｉｏＨを有する対照菌株と比較して明らかに低減された、部分的に検出限界未満の、遊離酸であるアミノラウリン酸、ドデカン二酸、ラウリン酸およびヒドロキシラウリン酸の形成を示した。ドデカン二酸（ＤＤＳ）とドデカン二酸メチルエステル（ＤＤＳＭＥ）の、アミノラウリン酸（ＡＬＳ）とアミノラウリン酸メチルエステル（ＡＬＳＭＥ）の、ヒドロキシラウリン酸（ＨＬＳ）とヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＳＭＥ）の、ならびにラウリン酸（ＬＳ）とラウリン酸メチルエステル（ＬＳＭＥ）の絶対最終滴定濃度の比率を計算してパーセンテージで表した。
Ｅ．コリＢＷ２５１１３におけるｂｉｏＨのノックアウト後の遊離酸であるアミノラウリン酸、ドデカン二酸、ラウリン酸およびヒドロキシラウリン酸の形成の減少
ｂｉｏＨ−ノックアウトを有する菌株は、インタクトなｂｉｏＨを有する対照菌株と比較して明らかに低減された、部分的に検出限界未満の、遊離酸であるアミノラウリン酸、ドデカン二酸、ラウリン酸およびヒドロキシラウリン酸の形成を示した。ドデカン二酸（ＤＤＳ）とドデカン二酸メチルエステル（ＤＤＳＭＥ）の、アミノラウリン酸（ＡＬＳ）とアミノラウリン酸メチルエステル（ＡＬＳＭＥ）の、ヒドロキシラウリン酸（ＨＬＳ）とヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＳＭＥ）の、ならびにラウリン酸（ＬＳ）とラウリン酸メチルエステル（ＬＳＭＥ）の絶対最終滴定濃度の比率を計算してパーセンテージで表した。
唯一数学的に表すことができる比率はＤＤＳ対ＤＤＳＭＥである：
ｂｉｏＨ−ノックアウトは、ＤＤＳの形成を３３．５倍だけ低減させ、全ての他の遊離酸は、検出下限値未満にあった。
Ｅ．コリＢＷ２５１１３におけるｂｉｏＨのノックアウト後の酸化フェーズの延長
対照菌株と比較して、ｂｉｏＨ−ノックアウト菌株における初期酸化能力は勾配を落とさず、プロセスの経過にわたるＡＬＳＭＥ形成の点ではほぼ一定に保たれることが示された。
対照菌株と比較して、ｂｉｏＨ−ノックアウト菌株における初期酸化能力は勾配を落とさず、プロセスの経過にわたるＡＬＳＭＥ形成の点ではほぼ一定に保たれることが示された。
図１は、ｂｉｏＨのノックアウトが、最終滴定濃度に関して、同じに保った条件で４７％だけ高められた生産率をもたらすことを示している。
Ｅ．コリＢＷ２５１１３におけるｂｉｏＨのノックアウト後のアミノラウリン酸メチルエステルの形成速度の向上
一定時間（＝生体内変換の終わり）後に達成された絶対滴定濃度を評価した。ここでは、ノックアウト菌株において、１リットルおよび１時間当たり０．７５ｇのＡＬＳＭＥという、野生型菌株における１リットルおよび１時間当たり０．５１ｇのＡＬＳＭＥに比して明らかに高い生成物形成速度が示された。
一定時間（＝生体内変換の終わり）後に達成された絶対滴定濃度を評価した。ここでは、ノックアウト菌株において、１リットルおよび１時間当たり０．７５ｇのＡＬＳＭＥという、野生型菌株における１リットルおよび１時間当たり０．５１ｇのＡＬＳＭＥに比して明らかに高い生成物形成速度が示された。
Ｅ．コリＢＷ２５１１３におけるｂｉｏＨのノックアウト後の生成物対副生成物の比率の改善
一定時間（＝生体内変換の終わり）後に達成された絶対滴定濃度を評価した。ここでは、ノックアウト−菌株バックグラウンドにおいて、明らかに改善された生成物（ＡＬＳおよびＡＬＳＭＥ）対主要副生成物（ＤＤＳおよびＤＤＳＭＥ）の比率が示された。
一定時間（＝生体内変換の終わり）後に達成された絶対滴定濃度を評価した。ここでは、ノックアウト−菌株バックグラウンドにおいて、明らかに改善された生成物（ＡＬＳおよびＡＬＳＭＥ）対主要副生成物（ＤＤＳおよびＤＤＳＭＥ）の比率が示された。
その比率は、ｂｉｏＨ−ノックアウトによって４３．９％だけ高まった。生成物滴定濃度は、副生成物滴定濃度を同じに保ったままで４３．９％だけ高まった。
Ｅ．コリＢＷ２５１１３におけるｂｉｏＨのノックアウト後のアミノラウリン酸およびアミノラウリン酸メチルエステルの生産に際してのグルコース収率係数（Glucose-Ausbeutekoeffizient）（ＹP/S）の向上
アミノラウリン酸とアミノラウリン酸メチルエステルの最終累積絶対滴定濃度を、グルコースの使用量と比較して考察した。
アミノラウリン酸とアミノラウリン酸メチルエステルの最終累積絶対滴定濃度を、グルコースの使用量と比較して考察した。
グルコース収率係数は、ｂｉｏＨ−ノックアウトを要因として、１グラムのグルコース当たり０．２１ｇ／ＬのＡＬＳ（ＭＥ）から、１グラムのグルコース当たり０．３０ｇ／ＬのＡＬＳ（ＭＥ）へと４６％だけ高まった。
［本発明の態様］
１． 式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの細胞による転化方法であって、
ａ）前記細胞と前記カルボン酸エステルとを水溶液中で接触させる工程
を含み、前記の細胞が、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が、該細胞の野生型に対して低減されている組み換え細胞である、前記方法。
２． １に記載の方法であって、更に、
ｂ）前記水溶液と、カチオン交換体を含む疎水性の有機溶液とを接触させる工程
を含む、前記方法。
３． 配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウトを、組み換え細胞の遺伝的特徴の一部として、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの、相応の細胞の野生型に対する生産向上のために用いる使用。
４． 配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性がその野生型に対して低減されている組み換え細胞を、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの転化のために用いる使用。
５． １から４までのいずれかに記載の方法または使用であって、Ａが、飽和アルキレン基であり、好ましくは式−（ＣＨ2）n−で示され、式中、ｎが少なくとも４であるアルキレン基である、前記方法または使用。
６． １または２に記載の方法であって、Ｒ1が、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯおよび−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択される、前記方法。
７． １から６までのいずれかに記載の方法であって、Ａが、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状の、分枝鎖状の、および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である、前記方法。
８． 組み換えアルカンヒドロキシラーゼを発現する細胞であって、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が前記細胞の野生型に対して低減されている、前記細胞。
９． ７に記載の細胞であって、アルカンヒドロキシラーゼが、ＡｌｋＢ−モノオキシゲナーゼおよびＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼを含む群からのアルカンヒドロキシラーゼである、前記細胞。
１０． ８または９に記載の水溶液中の細胞と、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルとを含む反応混合物。
１１． １０に記載の反応混合物であって、更に、カチオン交換体を有する疎水性の有機溶液を含む、前記反応混合物。
１２． １から１１までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、更にトランスアミナーゼを発現する、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１３． １から１２までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、更にアラニンデヒドロゲナーゼを発現する、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１４． １から１３までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、更にＡｌｋＬ−ファミリーからのタンパク質を有する、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１５． １から１４までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対して低減された活性を有し、その際、前記酵素が、好ましくは、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ、脂肪酸インポーターもしくはその変異体、特に好ましくはＦａｄＬもしくはその変異体を含む群からの酵素である、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１６． １から１５までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、アルカンヒドロキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよびＡｌｋＬ−ファミリーからのタンパク質を含む群からの少なくとも１つの酵素を組み換え形で有し、かつ／または過剰発現する、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１７． １から１６までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が、細胞の野生型に対して、配列番号２もしくは変異体を含むポリペプチドもまたはその変異体をコードする遺伝子のノックアウトによって低減されている、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１． 式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの細胞による転化方法であって、
ａ）前記細胞と前記カルボン酸エステルとを水溶液中で接触させる工程
を含み、前記の細胞が、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が、該細胞の野生型に対して低減されている組み換え細胞である、前記方法。
２． １に記載の方法であって、更に、
ｂ）前記水溶液と、カチオン交換体を含む疎水性の有機溶液とを接触させる工程
を含む、前記方法。
３． 配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウトを、組み換え細胞の遺伝的特徴の一部として、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの、相応の細胞の野生型に対する生産向上のために用いる使用。
４． 配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性がその野生型に対して低減されている組み換え細胞を、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの転化のために用いる使用。
５． １から４までのいずれかに記載の方法または使用であって、Ａが、飽和アルキレン基であり、好ましくは式−（ＣＨ2）n−で示され、式中、ｎが少なくとも４であるアルキレン基である、前記方法または使用。
６． １または２に記載の方法であって、Ｒ1が、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯおよび−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択される、前記方法。
７． １から６までのいずれかに記載の方法であって、Ａが、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状の、分枝鎖状の、および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である、前記方法。
８． 組み換えアルカンヒドロキシラーゼを発現する細胞であって、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が前記細胞の野生型に対して低減されている、前記細胞。
９． ７に記載の細胞であって、アルカンヒドロキシラーゼが、ＡｌｋＢ−モノオキシゲナーゼおよびＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼを含む群からのアルカンヒドロキシラーゼである、前記細胞。
１０． ８または９に記載の水溶液中の細胞と、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、Ｒ3は、水素およびアルキル、好ましくはメチル、エチルおよびプロピルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも４つの、好ましくは６つの、更に好ましくは８つの炭素原子を有する、置換された、非置換の、直鎖状、分枝鎖状および／または環状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルとを含む反応混合物。
１１． １０に記載の反応混合物であって、更に、カチオン交換体を有する疎水性の有機溶液を含む、前記反応混合物。
１２． １から１１までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、更にトランスアミナーゼを発現する、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１３． １から１２までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、更にアラニンデヒドロゲナーゼを発現する、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１４． １から１３までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、更にＡｌｋＬ−ファミリーからのタンパク質を有する、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１５． １から１４までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対して低減された活性を有し、その際、前記酵素が、好ましくは、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ、脂肪酸インポーターもしくはその変異体、特に好ましくはＦａｄＬもしくはその変異体を含む群からの酵素である、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１６． １から１５までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、前記細胞が、アルカンヒドロキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよびＡｌｋＬ−ファミリーからのタンパク質を含む群からの少なくとも１つの酵素を組み換え形で有し、かつ／または過剰発現する、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
１７． １から１６までのいずれかに記載の方法、細胞、反応混合物または使用であって、配列番号２もしくはその変異体を含むポリペプチドの活性が、細胞の野生型に対して、配列番号２もしくは変異体を含むポリペプチドもまたはその変異体をコードする遺伝子のノックアウトによって低減されている、前記方法、細胞、反応混合物または使用。
Claims (11)
- 式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキルであり、Ｒ3は、水素およびアルキルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも１０個の炭素原子を有する、非置換の、直鎖状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの細胞による更なるカルボン酸エステルへの転化方法であって、
ａ）前記細胞と前記カルボン酸エステルとを水溶液中で接触させる工程
を含み、前記細胞が、配列番号２のアミノ酸配列もしくはその変異体からなるポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも部分的な欠失を有し、それによって該細胞の野生型に対して低減された活性を有する組み換え細胞であって、ここで、前記変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同じ活性を有し、ここで、前記細胞は、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよびＡｌｋＬ−ファミリーのタンパク質を組み換え体の形で有するか、および／または過剰発現し、かつ、前記細胞は、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ、脂肪酸インポーターもしくはその変異体を含む群から選択された、脂肪酸β−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対する低減された活性を有する、前記方法。 - 請求項１に記載の方法であって、更に、
ｂ）前記水溶液と、カチオン交換体を含む疎水性の有機溶液とを接触させる工程
を含む、前記方法。 - 請求項１または２に記載の方法であって、前記細胞が、ＦａｄＬもしくはその変異体を含む群から選択された、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対する低減された活性を有する、前記方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列もしくはその変異体を含むポリペプチド（ここで、前記変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドと同じ活性を有する）をコードする遺伝子のノックアウトを、組み換え細胞の遺伝的特徴の一部として、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキルであり、Ｒ3は、水素およびアルキルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも１０個の炭素原子を有する、非置換の、直鎖状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの、相応の細胞の野生型に対する生産向上のために用いる使用であって、ここで、前記細胞は、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよびＡｌｋＬ−ファミリーのタンパク質を組み換え体の形で有するか、および／または過剰発現し、かつ、前記細胞は、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ、脂肪酸インポーターもしくはその変異体を含む群から選択された、脂肪酸β−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対する低減された活性を有する、前記使用。 - 配列番号２のアミノ酸配列もしくはその変異体からなるポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも部分的な欠失を有し、それによって野生型に対して低減された活性を有する組み換え細胞であって、ここで、前記変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドと同じ活性を有する、組み換え細胞の、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキルであり、Ｒ3は、水素およびアルキルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも１０個の炭素原子を有する、非置換の、直鎖状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルの転化のために用いる使用であって、ここで、前記細胞は、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよびＡｌｋＬ−ファミリーのタンパク質を組み換え体の形で有するか、および／または過剰発現し、かつ、前記細胞は、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ、脂肪酸インポーターもしくはその変異体を含む群から選択された、脂肪酸β−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対する低減された活性を有する、前記使用。 - 請求項４または５に記載の使用であって、前記組み換え細胞が、ＦａｄＬもしくはその変異体を含む群から選択された、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対する低減された活性を有する、前記使用。
- 組み換えアルカンヒドロキシラーゼを発現する細胞であって、配列番号２のアミノ酸配列もしくはその変異体からなるポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも部分的な欠失を有し、それによって野生型に対して低減された活性を有し、ここで、前記変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドと同じ活性を有し、ここで、前記細胞は、トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよびＡｌｋＬ−ファミリーのタンパク質を組み換え体の形で有するか、および／または過剰発現し、かつ、前記細胞は、脂肪酸−ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡ−レダクターゼ、エノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼおよび３−ケトアシル−ＣｏＡ−チオラーゼ、脂肪酸インポーターもしくはその変異体を含む群から選択された、脂肪酸β−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対する低減された活性を有する、前記細胞。
- 請求項７に記載の細胞であって、アルカンヒドロキシラーゼが、ＡｌｋＢ−モノオキシゲナーゼおよびＣＹＰ１５３−ファミリーのシトクロムＰ４５０−モノオキシゲナーゼを含む群からのアルカンヒドロキシラーゼである、前記細胞。
- 請求項７または８に記載の細胞であって、ＦａｄＬもしくはその変異体を含む群から選択された、脂肪酸のβ−酸化の反応の一つを触媒する少なくとも１つの酵素の、その野生型に対する低減された活性を有する、前記細胞。
- 水溶液中の請求項７から９までのいずれか１項に記載の細胞と、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2 （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、水素、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ3、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＲ3および−ＣＨ2ＮＨ2を含む群から選択され、Ｒ2は、アルキルであり、Ｒ3は、水素およびアルキルを含む群から選択され、かつＡは、少なくとも１０個の炭素原子を有する、非置換の、直鎖状のアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基もしくはアラルキレン基である］のカルボン酸エステルとを含む反応混合物。 - 請求項１０に記載の反応混合物であって、更に、カチオン交換体を有する疎水性の有機溶液を含む、前記反応混合物。
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