JP6478375B2 - 高発現プロモーター遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、高発現プロモーター遺伝子に関する。
現在、化石資源枯渇、地球温暖化の促進などの問題から、持続可能な社会の構築を目指し、化石資源由来の工業原料やエネルギーを再生可能資源由来へとシフトする試みが行われている。このような試みのうちの一つとして、再生可能資源由来の原料として農作物廃棄物やおがくず、廃紙、木屑などのリグノセルロース系バイオマスの利用が挙げられる。
リグノセルロース系バイオマスを有用物質に変換するプロセスとして、合成ガスプラットフォームがある。これは国内の生物廃棄物の約８割を占める糖化が難しいバイオマスを微生物によって発酵して乳酸、エタノールなどの有用物質に変換するプロセスである。
このような状況のなか、合成ガス資化性好熱性細菌であるモーレラ（Moorella）属細菌が注目されてきた（特許文献１）。これまで、モーレラ（Moorella）属細菌を用いた乳酸またはエタノール生産能の向上を目指し、遺伝子組換え技術の開発が行われてきた結果、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を破壊した、５−フルオロオロト酸耐性を示すウラシル要求性変異株（ｄｐｙｒＦ株）が作製され（特許文献２、３）、これを宿主として、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株が作製されている（特許文献４、５）。なお、ｄｐｙｒＦ株（ｐｙｒＦ破壊株）は、受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−１０５７」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。
しかしながら、より効率的な物質生産を行うため、合成ガス資化性好熱性細菌における外来遺伝子の高発現技術が求められている。
そこで、本発明は、合成ガス資化性好熱性細菌での外来遺伝子発現を強化することができる高発現プロモーターを提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく遺伝子プロモーターに着目して鋭意検討を重ね、ｍＲＮＡ相対発現量および遺伝子産物であるタンパク質の酵素活性を合わせて検討したところ、合成ガス資化性好熱性細菌において、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（ＣＯＤＨプロモーター）を外来遺伝子に付加して宿主細菌に導入した場合に、高い翻訳量を示すことを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）を提供する。
（１）合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（２）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、連続する少なくとも５ヌクレオチドによって表されるヌクレオチド配列を含む、（１）に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（３）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、第６５番目から第９０番目までのヌクレオチドによって表されるヌクレオチド配列を含む、（１）に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（４）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示される一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列に含まれる、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（５）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによって発現される外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによって発現される前記外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を基準にして評価する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（６）サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いる、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングする方法。
（７）前記レポーター遺伝子の転写量および翻訳産物の活性の両方を評価する、（６）に記載の方法。
（８）プロモーター本来の遺伝子の転写量および前記レポーター遺伝子の翻訳産物の活性の両方を評価する、（６）に記載の方法。
（９）クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子プロモーターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法によってスクリーニングされた、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーター。
（１０）β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌。
（１１）β−ガラクトシダーゼ遺伝子および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーターが染色体上に組み込まれた、（１０）に記載のモーレラ属細菌。
（１２）前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーターが、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つである、（１１）に記載のモーレラ属細菌。
（１３）前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子がサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株に由来するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子である、（１１）または（１２）に記載のモーレラ属細菌。
（１）合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（２）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、連続する少なくとも５ヌクレオチドによって表されるヌクレオチド配列を含む、（１）に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（３）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、第６５番目から第９０番目までのヌクレオチドによって表されるヌクレオチド配列を含む、（１）に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（４）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示される一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列に含まれる、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（５）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによって発現される外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによって発現される前記外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を基準にして評価する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（６）サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いる、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングする方法。
（７）前記レポーター遺伝子の転写量および翻訳産物の活性の両方を評価する、（６）に記載の方法。
（８）プロモーター本来の遺伝子の転写量および前記レポーター遺伝子の翻訳産物の活性の両方を評価する、（６）に記載の方法。
（９）クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子プロモーターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法によってスクリーニングされた、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーター。
（１０）β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌。
（１１）β−ガラクトシダーゼ遺伝子および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーターが染色体上に組み込まれた、（１０）に記載のモーレラ属細菌。
（１２）前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーターが、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つである、（１１）に記載のモーレラ属細菌。
（１３）前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子がサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株に由来するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子である、（１１）または（１２）に記載のモーレラ属細菌。
本発明によれば、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが提供される。
また、本発明によれば、合成ガス資化性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングする方法およびその方法によりスクリーニングされた合成ガス資化性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターが提供される。
さらに、本発明によれば、β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌が提供される。
また、本発明によれば、合成ガス資化性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングする方法およびその方法によりスクリーニングされた合成ガス資化性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターが提供される。
さらに、本発明によれば、β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌が提供される。
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターである。
本発明の第一の態様は、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターである。
合成ガスとは、水素、一酸化炭素、二酸化炭素および不可避的不純物からなるガスをいう。水素、一酸化炭素および二酸化炭素の組成比は特に限定されない。
合成ガス資化性好熱性細菌とは、上記合成ガスを唯一の炭素源として増殖が可能な好熱性細菌をいい、好熱性細菌とは、至適生育温度が４５℃以上、あるいは生育限界温度が５５℃以上の細菌をいう。合成ガス資化性好熱性細菌としては、例えば、モーレラ（Moorella）属細菌を挙げることができ、中でもモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、とりわけ、ＡＴＣＣ ３９０７３株またはそれに由来する株が、技術的な観点および命名法上の観点から扱い易いため、好ましい。
合成ガス資化性好熱性細菌とは、上記合成ガスを唯一の炭素源として増殖が可能な好熱性細菌をいい、好熱性細菌とは、至適生育温度が４５℃以上、あるいは生育限界温度が５５℃以上の細菌をいう。合成ガス資化性好熱性細菌としては、例えば、モーレラ（Moorella）属細菌を挙げることができ、中でもモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、とりわけ、ＡＴＣＣ ３９０７３株またはそれに由来する株が、技術的な観点および命名法上の観点から扱い易いため、好ましい。
本発明において、高発現とは、遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を用いて外来遺伝子を発現させた場合に比べて高いことをいう。一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（ＣＯＤＨプロモーター）を用いて外来遺伝子を発現させた場合には、Ｇ３ＰＤプロモーターを用いて外来遺伝子を発現させた場合と比べて、遺伝子の翻訳産物であるタンパク質が、少なくとも１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上の高い比活性を示す。
上記ＣＯＤＨプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、連続する少なくとも５ヌクレオチドによって表されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
上記ＣＯＤＨプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、第６５番目のヌクレオチドから第９０番目のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含むことが好ましい。この部分は、ＣＯＤＨプロモーターにおいて、遺伝子を発現する上で重要な部分だからである。
また、上記ＣＯＤＨプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１により示されるヌクレオチド配列に含まれることが好ましい。
上記ＣＯＤＨプロモーターは、それによって発現される外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによって発現される前記外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を基準にして評価することが好ましい。ｍＲＮＡ発現量だけでは、真に、外来遺伝子を高発現するものであるか否かを確定できないからである。
ＣＯＤＨプロモーターにより外来遺伝子を発現する合成ガス資化性好熱性細菌を作製する方法としては、例えば、特開２０１３−９０６００号公報に記載の外来遺伝子導入方法において、Ｇ３ＰＤプロモーター領域の代わりにＣＯＤＨプロモーター領域を用い、さらに、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ）の代わりに、所望の外来遺伝子を用いることができる。外来遺伝子としては、例えば、後述する実施例にも記載した、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）などが挙げられる。
本発明の第二の態様は、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（以下「ｌａｃＺ」という。）をレポーター遺伝子として用いる、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングする方法である。
本発明のスクリーニング方法は、Ｇ３ＰＤプロモーターよりも遺伝子の転写量が少ないＣＯＤＨプロモーターの方が、遺伝子の翻訳産物の活性が高かったという驚くべき実験事実に基づくものである。これは、ＣＯＤＨプロモーターの配列の中にｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を特に活性化する仕組みがあるためと推察される。
本発明のスクリーニング方法においては、レポーター遺伝子またはプロモーター本来の遺伝子、好ましくはプロモーター本体の遺伝子の転写量、およびレポーター遺伝子の翻訳産物の活性の両方を評価することが好ましい。遺伝子の転写量によって予備的なスクリーニングを行い、高発現が予想されるものについてのみ翻訳産物の活性を評価して本スクリーニングすることで、工程数を省くことができるからである。
このスクリーニング方法は、次の（１）〜（４）の工程を含んでもよい。
（１）定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの転写量を測定して、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子以外の候補遺伝子について、転写量が多い方から５〜１０程度の遺伝子にまで絞り込む工程
（２）合成ガス資化性好熱性細菌において、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（以下「Ｇ３ＰＤプロモーター」という。）を付加したサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を染色体上に組み込んだ形質転換株（以下「対照株」という。）およびＧ３ＰＤプロモーター以外のプロモーターを付加したｌａｃＺを染色体上に組み込んだ形質転換株（以下「試験株」という。）を準備する工程
（３）対照株および試験株においてｌａｃＺを発現させ、ＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定する工程
（４）試験株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性と、対照株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性とを比較し、試験株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性が対照株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性よりも高い場合に、前記試験株に組み込んだ遺伝子プロモーターを、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターとして選択する工程
（１）定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの転写量を測定して、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子以外の候補遺伝子について、転写量が多い方から５〜１０程度の遺伝子にまで絞り込む工程
（２）合成ガス資化性好熱性細菌において、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（以下「Ｇ３ＰＤプロモーター」という。）を付加したサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を染色体上に組み込んだ形質転換株（以下「対照株」という。）およびＧ３ＰＤプロモーター以外のプロモーターを付加したｌａｃＺを染色体上に組み込んだ形質転換株（以下「試験株」という。）を準備する工程
（３）対照株および試験株においてｌａｃＺを発現させ、ＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定する工程
（４）試験株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性と、対照株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性とを比較し、試験株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性が対照株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性よりも高い場合に、前記試験株に組み込んだ遺伝子プロモーターを、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターとして選択する工程
本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされたプロモーターとしては、クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを挙げることができる。
本発明の第三の態様は、β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ（Moorella）属細菌である。モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３ 株のゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＰ０００２３２）を参照しても、染色体上にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は存在していないなど、野生型のモーレラ属細菌はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持たないため、β−ガラクトシダーゼを発現させるためには、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびそれを発現するためのプロモーターを導入する必要がある。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびそれを発現するためのプロモーターは、容易に脱落しないように、プラスミド上ではなく、染色体上に組み込まれることが好ましい。
前記プロモーターは、特に限定されるものではないが、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つであることが好ましく、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つであることがより好ましい。これらのプロモーターにより、比較的高い発現量が得られるからである。
上記β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、特に限定されるものではないが、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株に由来するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であることが好ましい。モーレラ属細菌で遺伝子発現させた実績があるとともに、モーレラ属細菌の培養温度でも十分な活性を有する酵素をコードしているからである。
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
以下の実施例では、合成ガス資化性好熱性細菌であるモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株について、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡ相対発現量を測定し、発現量上位５位までの遺伝子について、そのプロモーター領域をサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）に付加してモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株に導入して、ＬａｃＺタンパク質を発現させ、そのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
１．モーレラ用基本培地
表１−１に示す成分をイオン交換水に溶解し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．９に調整し、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップし、培地の色が青から赤に変色するまで２０分間ボイルし、窒素ガス／炭酸ガス（８０：２０）を注入しながら氷中で２０分間冷却した後、予め炭酸ガスを注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に４５ｍＬずつ分注し、さらに３分間、炭酸ガスを注入し、ブチルゴム栓とアルミシールで密封し、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）してモーレラ用基本培地を調製した。
なお、完全合成培地調製時には酵母エキスを加えずに培地を調製した。
表１−１に示す成分をイオン交換水に溶解し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．９に調整し、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップし、培地の色が青から赤に変色するまで２０分間ボイルし、窒素ガス／炭酸ガス（８０：２０）を注入しながら氷中で２０分間冷却した後、予め炭酸ガスを注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に４５ｍＬずつ分注し、さらに３分間、炭酸ガスを注入し、ブチルゴム栓とアルミシールで密封し、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）してモーレラ用基本培地を調製した。
なお、完全合成培地調製時には酵母エキスを加えずに培地を調製した。
モーレラ用基本培地は、クロストリジウム・リュングダーリィ（Clostridium ljungdahlii）の培養に用いられるＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地を改変したものである。改変として、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物の最終濃度を０．３ｇ／Ｌに減らし、硫化ナトリウム九水和物（Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）を除いた。培地作製は、還元剤（システイン塩酸塩一水和物、６０ｇ／Ｌ）と基質（フルクトース等）とを別々に調製した。嫌気的に培地を調製する方法として、ハンゲートの方法（Hungate, R. E.: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol.; 3B: 117-32 (1969)）を改変したミラーらの方法（Miller, T. L. and Wolin, M. J.: A serum bottle modification of the Hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl. Microbiol.; 27 (5): 985-7 (1974)）を用いた。各成分の組成および調製手順は上記したとおりである。
２．定量的ＲＴ−ＰＣＲによるモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株のｍＲＮＡ相対発現量の測定
２−１）転写量を測定する遺伝子の選択
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株の全ゲノム情報から、発現量が多いと考えられる一次代謝関連遺伝子およびハウスキーピング遺伝子を中心に、表２−１に示す２３遺伝子を選択した。表２−１には、選択した２３遺伝子の産物のＯＲＦの開始位置および終端位置（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＰ０００２３２での位置）も示す。
２−１）転写量を測定する遺伝子の選択
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株の全ゲノム情報から、発現量が多いと考えられる一次代謝関連遺伝子およびハウスキーピング遺伝子を中心に、表２−１に示す２３遺伝子を選択した。表２−１には、選択した２３遺伝子の産物のＯＲＦの開始位置および終端位置（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＰ０００２３２での位置）も示す。
プロモーターの選択をするために定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、選択した２３遺伝子のｍＲＮＡ相対転写量を測定した。
表２−２には、選択した２３遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲで使用するプライマーの名称、配列、ゲノムの開始位置および終端位置（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＰ０００２３２での位置）、長さ（ｍｅｒ）を示す。
表２−２には、選択した２３遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲで使用するプライマーの名称、配列、ゲノムの開始位置および終端位置（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＰ０００２３２での位置）、長さ（ｍｅｒ）を示す。
２−２）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ） ＲＮＡ ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出方法は付属の標準プロトコルに従った。定量的ＲＴ−ＰＣＲの条件を以下に示す。
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ） ＲＮＡ ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出方法は付属の標準プロトコルに従った。定量的ＲＴ−ＰＣＲの条件を以下に示す。
２−３）結果
選択した２３遺伝子のｍＲＮＡ相対発現量を、ｇｙｒＢを基準として、図１に示す。
選択した２３遺伝子のｍＲＮＡ相対発現量を、ｇｙｒＢを基準として、図１に示す。
選択した２３遺伝子から高いｍＲＮＡ相対発現量を示した５遺伝子を選抜した（表２−４）。これらの遺伝子のプロポーターについて、さらに検討を行った。
３．レポーター遺伝子の選定
３−１）概要
レポーター遺伝子として、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来の耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）のモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株への導入を試みた。
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（本明細書において「Ｇ３ＰＤプロモーター」という場合がある。）およびＳＤ配列により転写および発現を制御し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用してオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）と共にモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株株の染色体上に組み込んだ（図２を参照）。
製作したｌａｃＺ（遺伝子）導入株（本明細書において「ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤ株」という場合がある。）からＨｉｓＴａｇを用いてＬａｃＺ（タンパク質）を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて発現を確認し、精製ＬａｃＺの活性測定によって、ｌａｃＺがレポーター遺伝子として使用可能か否かの検討を行った。
３−１）概要
レポーター遺伝子として、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来の耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）のモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株への導入を試みた。
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（本明細書において「Ｇ３ＰＤプロモーター」という場合がある。）およびＳＤ配列により転写および発現を制御し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用してオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）と共にモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株株の染色体上に組み込んだ（図２を参照）。
製作したｌａｃＺ（遺伝子）導入株（本明細書において「ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤ株」という場合がある。）からＨｉｓＴａｇを用いてＬａｃＺ（タンパク質）を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて発現を確認し、精製ＬａｃＺの活性測定によって、ｌａｃＺがレポーター遺伝子として使用可能か否かの検討を行った。
３−２）使用菌株およびプラスミド
使用した菌株およびプラスミドを下記に示す。
使用した菌株およびプラスミドを下記に示す。
３−３）実験方法
３−３−１ 大腸菌の培養
大腸菌は２×ＹＴ培地およびＳＯＢ培地を使用し、３７℃で培養した。培地にはカナマイシンを２０μｇ／ｍＬを含み、カナマイシン耐性のスクリーニングを行った。
３−３−１ 大腸菌の培養
大腸菌は２×ＹＴ培地およびＳＯＢ培地を使用し、３７℃で培養した。培地にはカナマイシンを２０μｇ／ｍＬを含み、カナマイシン耐性のスクリーニングを行った。
３−３−２ コンピテントセルの作製
コンピテントセルの作製は、井上の方法（Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). Gene 96 (1): 23-28）を参考に以下の手順で行った。
まず、大腸菌を寒天末に塗布し、３７℃で１晩培養した。得られたシングルコロニーを２×ＹＴ培地 ５ｍＬに植菌し、６〜８時間振とう培養（３７℃、２８０ｒｐｍ）した。
さらに、得られた培養液を１００ｍＬのＳＯＢ培地に２ｍＬ植菌し、ＯＤ６００＝０．５５程度になるまで振とう培養（１８℃、１２０ｒｐｍ）した。
得られた培養液を５０ｍＬずつ分注し、１０分間氷上静置した。１０分後、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）し、上清を取り除いた後、氷冷した１６ｍＬのInoue Transformation Bufferで菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。懸濁後、氷上で１０分間静置し、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）した。遠心分離後、上清を取り除き、氷冷した４ｍＬのInoue Transformation Bufferで菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。３００μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）を添加し、混合した後、適当量分注し、液体窒素により急速冷凍した。作製したコンピテントセルは−８０℃で保存した。
コンピテントセルの作製は、井上の方法（Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). Gene 96 (1): 23-28）を参考に以下の手順で行った。
まず、大腸菌を寒天末に塗布し、３７℃で１晩培養した。得られたシングルコロニーを２×ＹＴ培地 ５ｍＬに植菌し、６〜８時間振とう培養（３７℃、２８０ｒｐｍ）した。
さらに、得られた培養液を１００ｍＬのＳＯＢ培地に２ｍＬ植菌し、ＯＤ６００＝０．５５程度になるまで振とう培養（１８℃、１２０ｒｐｍ）した。
得られた培養液を５０ｍＬずつ分注し、１０分間氷上静置した。１０分後、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）し、上清を取り除いた後、氷冷した１６ｍＬのInoue Transformation Bufferで菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。懸濁後、氷上で１０分間静置し、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）した。遠心分離後、上清を取り除き、氷冷した４ｍＬのInoue Transformation Bufferで菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。３００μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）を添加し、混合した後、適当量分注し、液体窒素により急速冷凍した。作製したコンピテントセルは−８０℃で保存した。
３−３−３ プラスミドの構築
まず、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺを、Ｇ３ＰＤプロモーターを連結したｌａｃＺを含むｐＫ１８ｍｏｂプラスミドを鋳型として、表３−２に示すプライマーセット「ｐｋ１８−Ｇ３ＰＤ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−Ｇ３ＰＤ−ｉｎ−Ｒ」およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡製）を用いてＰＣＲにより増幅した。
まず、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺを、Ｇ３ＰＤプロモーターを連結したｌａｃＺを含むｐＫ１８ｍｏｂプラスミドを鋳型として、表３−２に示すプライマーセット「ｐｋ１８−Ｇ３ＰＤ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−Ｇ３ＰＤ−ｉｎ−Ｒ」およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡製）を用いてＰＣＲにより増幅した。
上記Ｇ３ＰＤプロモーターを連結したｌａｃＺを含むｐＫ１８ｍｏｂ プラスミドの構築は、次のとおり行った。
サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３ 株の全ＤＮＡ、およびプライマーｐｙｒＦ−１７６５−ＦとｐｙｒＦ−１７６４−Ｒとを用いて、ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦを鋳型として、ｐｙｒＦ領域を含むベクター領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３ 株の全ＤＮＡ、およびプライマーｐｙｒＦ−１７６５−ＦとｐｙｒＦ−１７６４−Ｒとを用いて、ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦを鋳型として、ｐｙｒＦ領域を含むベクター領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
プライマーＧ３ＰＤ−Ｆ１１とＧ３ＰＤ−ＳＤ−Ｒ１２とを用いて、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＳＤ配列を含むプロモーター領域（Ｇ３ＰＤプロモーター領域）を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株のトータルＤＮＡ、およびプライマーｌａｃＺ−Ｆ−１とｌａｃＺ−Ｒ−１との組合せを用いて、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）領域を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。ＰＣＲ反応終了後、各ＰＣＲ産物をゲル抽出した。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
下記表に記載の反応溶液でＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲを行った。反応条件は、３７℃３０分→５０℃１５分とした。なお、５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒおよびＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｒ） Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に含まれるものを用いた。
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎサンプルに滅菌水を５０μＬ加えて希釈した。
希釈したサンプル１０μＬを形質転換に用いた。
ダイレクトＰＣＲによりコロニーを選択した。
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲおよび形質転換の結果、複数のコロニーを得た。
ｌａｃＺ−Ｆ−１およびｌａｃＺ−Ｒ−１をプライマーとしたコロニーダイレクトＰＣＲの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から３株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、またはＰｓｔＩ）処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてｌａｃＺの挿入が確認できた。
希釈したサンプル１０μＬを形質転換に用いた。
ダイレクトＰＣＲによりコロニーを選択した。
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲおよび形質転換の結果、複数のコロニーを得た。
ｌａｃＺ−Ｆ−１およびｌａｃＺ−Ｒ−１をプライマーとしたコロニーダイレクトＰＣＲの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から３株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、またはＰｓｔＩ）処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてｌａｃＺの挿入が確認できた。
なお、上記ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦは、次に記載する方法で作製した。
以下に示すプライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１との組み合わせを用いて、以下の条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子翻訳領域とその５’側の約１０００ｂｐ、３’側の約１０００ｂｐを含む約２．７ｋｂの遺伝子断片を増幅した。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
以下に示すプライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１との組み合わせを用いて、以下の条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子翻訳領域とその５’側の約１０００ｂｐ、３’側の約１０００ｂｐを含む約２．７ｋｂの遺伝子断片を増幅した。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
得られたＰＣＲ産物についてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った。
２μＬのＳｍａＩ処理をしたプラスミド ｐＫ１８ｍｏｂを、８μＬのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ コンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μＬを添加して軽く攪拌した。
氷中に１０分静置した。
４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
ＳＯＣ培地を１ｍＬ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫した。
３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
生育が見られたコロニーをカナマイシン添加ＬＢ寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーはｐｙｒＦｕｐ−Ｆ１およびｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を以下に示す。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
２μＬのＳｍａＩ処理をしたプラスミド ｐＫ１８ｍｏｂを、８μＬのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ コンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μＬを添加して軽く攪拌した。
氷中に１０分静置した。
４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
ＳＯＣ培地を１ｍＬ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫した。
３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
生育が見られたコロニーをカナマイシン添加ＬＢ寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーはｐｙｒＦｕｐ−Ｆ１およびｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を以下に示す。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
電気泳動によりバンドを確認した。
バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
吸光度による濃度測定、およびＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩ処理サンプルの電気泳動を行った。
さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦが構築できていることを確認した。
バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
吸光度による濃度測定、およびＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩ処理サンプルの電気泳動を行った。
さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦが構築できていることを確認した。
さらに、上流および下流配列を含むｐｙｒＦ、およびＧ３ＰＤプロモーターを連結した耐熱性カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎＲ）を含むｐｋ１８ｍｏｂプラスミドを鋳型に、表３−３に示すプライマーセット「ｐＫ１８−ｐｙｒＦ−ｉｎｖ−Ｆ／ｐｋ１８−ｐｙｒＦ−ｉｎｖ−Ｒ」およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）を用いてインバースＰＣＲにより線状ベクターを構築し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック）を用いてＧ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺと線状ベクターをつなげ、プラスミドを構築した。
３−３−４ 大腸菌の形質転換
大腸菌への遺伝子導入はコンピテントセルを用いて以下の手順でヒートショックにより行った。
まず、コンピテントセルを−８０℃から取り出し、氷上で１０分間静置し、解凍した。
コンピテントセル １００μＬに対して５μＬのＤＮＡ溶液を添加し、氷上で３０分間静置した。３０分後、４２℃で９０秒間インキュベートし、ヒートショックを行った。ヒートショック後、直ぐに氷上に移し、１〜２分間静置した。
その後、ＳＯＣ培地を８００ｍＬ添加し、３７℃で４５分間培養した。４５分後、抗生物質を含む２×ＹＴプレートに塗布し、３７℃で１２〜１６時間培養した。
形成されたコロニーを５ｍＬの２×ＹＴブロスに植菌し、プラスミド抽出を行った。
大腸菌への遺伝子導入はコンピテントセルを用いて以下の手順でヒートショックにより行った。
まず、コンピテントセルを−８０℃から取り出し、氷上で１０分間静置し、解凍した。
コンピテントセル １００μＬに対して５μＬのＤＮＡ溶液を添加し、氷上で３０分間静置した。３０分後、４２℃で９０秒間インキュベートし、ヒートショックを行った。ヒートショック後、直ぐに氷上に移し、１〜２分間静置した。
その後、ＳＯＣ培地を８００ｍＬ添加し、３７℃で４５分間培養した。４５分後、抗生物質を含む２×ＹＴプレートに塗布し、３７℃で１２〜１６時間培養した。
形成されたコロニーを５ｍＬの２×ＹＴブロスに植菌し、プラスミド抽出を行った。
３−３−５ 大腸菌からのプラスミド抽出
大腸菌からのプラスミド抽出はＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（バイオラッド）を用いて、付属のプロトコルに従って行った。抽出したプラスミドは制限酵素処理により目的のプラスミドが構築されていることを確認した。
大腸菌からのプラスミド抽出はＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（バイオラッド）を用いて、付属のプロトコルに従って行った。抽出したプラスミドは制限酵素処理により目的のプラスミドが構築されていることを確認した。
３−３−６ バイアルを用いた回分培養
バイアル瓶への還元剤の添加や植菌、サンプリングには２２Ｇ×１・１／４、あるいは２７Ｇ×１・１／４の注射針（ニプロ）を付けたプラスチック注射器（テルモ）を用いて嫌気的に行った。操作はクリーンベンチ内で行い、注射針を刺すブチルゴム栓の部分は、ガスバーナーであぶって滅菌した。フルクトースで培養する場合は、植菌直前にフルクトース水溶液（２００ｇ／Ｌ）を培地に対し１％（ｖ／ｖ）、還元剤（６０ｇ／Ｌ）を２％（ｖ／ｖ）、クエン酸チタン（ＩＩＩ）水溶液を１、２滴添加し、前培養液を５％（ｖ／ｖ）植菌した。培養は５５℃で、静置培養を行った。
バイアル瓶への還元剤の添加や植菌、サンプリングには２２Ｇ×１・１／４、あるいは２７Ｇ×１・１／４の注射針（ニプロ）を付けたプラスチック注射器（テルモ）を用いて嫌気的に行った。操作はクリーンベンチ内で行い、注射針を刺すブチルゴム栓の部分は、ガスバーナーであぶって滅菌した。フルクトースで培養する場合は、植菌直前にフルクトース水溶液（２００ｇ／Ｌ）を培地に対し１％（ｖ／ｖ）、還元剤（６０ｇ／Ｌ）を２％（ｖ／ｖ）、クエン酸チタン（ＩＩＩ）水溶液を１、２滴添加し、前培養液を５％（ｖ／ｖ）植菌した。培養は５５℃で、静置培養を行った。
３−３−７ ロールチューブ法によるコロニー形成
ロールチューブの作成はハンゲートの方法（Hungate, R. E.: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol.; 3B: 117-32 (1969)）に従った。ロールチューブ作成にはモーレラ用基本培地が１８ｍＬ入ったバイアルに、０．３７ｇの低温ゲル化用寒天末（ナカライテスク、ゲル化温度３０−３１℃）を添加し、オートクレーブ（１２５℃、１５分間）した培地を使用した。使用前に培地を湯煎により融解し、４０℃程度に保ちながら還元剤を０．４ｍＬ、フルクトース水溶液を０．２ｍＬ、クエン酸チタン（ＩＩＩ）溶液を１滴添加した後、菌体を気泡ができないように植菌した。植菌後、氷水を入れたロールチューブ作成装置で回転させながら寒天をバイアルビン側面に固めた。その後、５５℃で５〜７日間静置培養した。形成されたコロニーは、クリーンベンチ内で滅菌済みのパスツールピペットを用いて培地ごと取り出し、５ｍＬの培地に植菌し、フルクトースを基質として静置培養した。
ロールチューブの作成はハンゲートの方法（Hungate, R. E.: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol.; 3B: 117-32 (1969)）に従った。ロールチューブ作成にはモーレラ用基本培地が１８ｍＬ入ったバイアルに、０．３７ｇの低温ゲル化用寒天末（ナカライテスク、ゲル化温度３０−３１℃）を添加し、オートクレーブ（１２５℃、１５分間）した培地を使用した。使用前に培地を湯煎により融解し、４０℃程度に保ちながら還元剤を０．４ｍＬ、フルクトース水溶液を０．２ｍＬ、クエン酸チタン（ＩＩＩ）溶液を１滴添加した後、菌体を気泡ができないように植菌した。植菌後、氷水を入れたロールチューブ作成装置で回転させながら寒天をバイアルビン側面に固めた。その後、５５℃で５〜７日間静置培養した。形成されたコロニーは、クリーンベンチ内で滅菌済みのパスツールピペットを用いて培地ごと取り出し、５ｍＬの培地に植菌し、フルクトースを基質として静置培養した。
３−３−８ エレクトロポレーションを用いたモーレラ・サーモアセティカへの遺伝子導入
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株への遺伝子の導入はエレクトロポレーションを用いた。
まず、ｄｐｙｒＦ株をＨ２−ＣＯ２でＯＤ６００＝０．１程度まで培養し、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心して上清を除去した。残った菌体にエレクトロポレーション緩衝液を１０ｍＬ加え、再懸濁後、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心して上清を除去した。
この操作をもう一度繰り返した後、ＯＤ６００＝１．０程度になるように菌体をエレクトロポレーション緩衝液により再懸濁した。
プラスミド（ｐＫ１８−ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤ）のＤＮＡ ２μｇを含む溶液を加えた菌体懸濁液 ４００μＬをエレクトロポレーション用キュベット（２ｍｍギャップ）に移し、１５００Ｖ、５００Ω、５０μＦの条件でパルスをかけた。パルス後、すぐにキュベットを氷中に移し、３〜５分間静置して冷却した。冷却後、菌体懸濁液を、ウラシルを１μｇ／ｍＬ含む培地に植菌し、フルクトースにより５５℃で４８時間静置培養した。培養後、ロールチューブ法（ウラシルを含まない培地を使用）により形質転換体の単離を行った。
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株への遺伝子の導入はエレクトロポレーションを用いた。
まず、ｄｐｙｒＦ株をＨ２−ＣＯ２でＯＤ６００＝０．１程度まで培養し、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心して上清を除去した。残った菌体にエレクトロポレーション緩衝液を１０ｍＬ加え、再懸濁後、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心して上清を除去した。
この操作をもう一度繰り返した後、ＯＤ６００＝１．０程度になるように菌体をエレクトロポレーション緩衝液により再懸濁した。
プラスミド（ｐＫ１８−ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤ）のＤＮＡ ２μｇを含む溶液を加えた菌体懸濁液 ４００μＬをエレクトロポレーション用キュベット（２ｍｍギャップ）に移し、１５００Ｖ、５００Ω、５０μＦの条件でパルスをかけた。パルス後、すぐにキュベットを氷中に移し、３〜５分間静置して冷却した。冷却後、菌体懸濁液を、ウラシルを１μｇ／ｍＬ含む培地に植菌し、フルクトースにより５５℃で４８時間静置培養した。培養後、ロールチューブ法（ウラシルを含まない培地を使用）により形質転換体の単離を行った。
３−３−９ モーレラ・サーモアセティカからのゲノムＤＮＡの抽出
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）からのゲノムＤＮＡの抽出は、定常期まで培養した菌体を使用して行った。ゲノムＤＮＡ抽出は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ） Ｔｉｓｓｕｅ キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて行った。抽出プロトコルは一部添付のマニュアルを改変して行った。改変としては、Ｐｒｅ−ｌｙｓｅの段階で、１８０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｔ１で再懸濁するところを、リゾチーム（東京化成工業）とアクロモペプチダーゼ（和光純薬）を、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解させたＴＥ緩衝液 １８０μＬに菌体ペレットを懸濁し、３７℃で１０分間反応させた。その後、２５μＬのプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１５分間反応させた。このあとの操作は添付のマニュアルに従った。抽出したゲノムは−２０℃で保存し、必要なときに適宜解凍して使用した。
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）からのゲノムＤＮＡの抽出は、定常期まで培養した菌体を使用して行った。ゲノムＤＮＡ抽出は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ） Ｔｉｓｓｕｅ キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて行った。抽出プロトコルは一部添付のマニュアルを改変して行った。改変としては、Ｐｒｅ−ｌｙｓｅの段階で、１８０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｔ１で再懸濁するところを、リゾチーム（東京化成工業）とアクロモペプチダーゼ（和光純薬）を、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解させたＴＥ緩衝液 １８０μＬに菌体ペレットを懸濁し、３７℃で１０分間反応させた。その後、２５μＬのプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１５分間反応させた。このあとの操作は添付のマニュアルに従った。抽出したゲノムは−２０℃で保存し、必要なときに適宜解凍して使用した。
３−３−１０ ＰＣＲによる形質転換体の確認
形質転換体の確認は、抽出したゲノムを鋳型にＰＣＲすることにより行った。ＰＣＲに使用したプライマーを表３−４に示す。ＰＣＲ反応用酵素は、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）を用いた。
形質転換体の確認は、抽出したゲノムを鋳型にＰＣＲすることにより行った。ＰＣＲに使用したプライマーを表３−４に示す。ＰＣＲ反応用酵素は、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）を用いた。
３−３−１１ 超音波破砕機による粗酵素液の抽出
粗酵素液の抽出にはＨ２−ＣＯ２でＯＤ６００＝０．１〜０．１５、フルクトースでＯＤ６００＝０．４〜０．８まで培養した菌体を使用した。
培養液を、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を取り除いた。その後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） １０ｍＬで菌体ペレットを再懸濁し、５８００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を取り除いた。
この洗浄操作を再度行った後、ソニケーション緩衝液 ３〜５ｍＬに菌体ペレットを再懸濁し、超音波破砕機（デジタルソニファイアー、ブランソン）により破砕した。
破砕液を、２０４００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。
回収した粗酵素液を用いて、その後のタンパク質濃度測定や、酵素活性測定に用いた。
粗酵素液の抽出にはＨ２−ＣＯ２でＯＤ６００＝０．１〜０．１５、フルクトースでＯＤ６００＝０．４〜０．８まで培養した菌体を使用した。
培養液を、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を取り除いた。その後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） １０ｍＬで菌体ペレットを再懸濁し、５８００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を取り除いた。
この洗浄操作を再度行った後、ソニケーション緩衝液 ３〜５ｍＬに菌体ペレットを再懸濁し、超音波破砕機（デジタルソニファイアー、ブランソン）により破砕した。
破砕液を、２０４００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。
回収した粗酵素液を用いて、その後のタンパク質濃度測定や、酵素活性測定に用いた。
３−３−１２ ＨｉｓＴａｇを用いたＬａｃＺ精製
ＬａｃＺ精製はｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓ−Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ（ロシュ・アプライド・サイエンス）のプロトコル、また、回収した精製ＬａｃＺを脱塩するために、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（ミリポア）のプロトコルに従って行った。まず、レジン（１５０μＬ）をマイクロ試験管に移し、分取したレジンの２０倍容の結合バッファーＡを添加し、十分に撹拌した。次に、５００×ｇで１０秒間遠心し、上清を取り除き、レジンを平衡化し、そこにＨｉｓＴａｇタンパク質を含む溶液を平衡化したレジンに加え、１ｈ転倒混和での穏やかな撹拌を実施した。その後、５００×ｇで１０秒間遠心し、上清を取り除いた。次に、レジン量の５倍容の洗浄バッファーを加え、十分に混和し、穏やかに遠心し、上清を取り除いた。本操作を５回繰り返した。レジン量と同量の溶出バッファーを添加し、１０分間撹拌し、遠心上清を回収した。次に、脱塩するため、回収した上清をフィルターに入れて、１４０００×ｇで１０分間遠心した。次にフィルターを逆にして１０００×ｇで２ｍｉｎ遠心を行い、バッファー５００μＬで洗浄を２回行った。ＬａｃＺを精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて、発現の確認を行った。
ＬａｃＺ精製はｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓ−Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ（ロシュ・アプライド・サイエンス）のプロトコル、また、回収した精製ＬａｃＺを脱塩するために、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（ミリポア）のプロトコルに従って行った。まず、レジン（１５０μＬ）をマイクロ試験管に移し、分取したレジンの２０倍容の結合バッファーＡを添加し、十分に撹拌した。次に、５００×ｇで１０秒間遠心し、上清を取り除き、レジンを平衡化し、そこにＨｉｓＴａｇタンパク質を含む溶液を平衡化したレジンに加え、１ｈ転倒混和での穏やかな撹拌を実施した。その後、５００×ｇで１０秒間遠心し、上清を取り除いた。次に、レジン量の５倍容の洗浄バッファーを加え、十分に混和し、穏やかに遠心し、上清を取り除いた。本操作を５回繰り返した。レジン量と同量の溶出バッファーを添加し、１０分間撹拌し、遠心上清を回収した。次に、脱塩するため、回収した上清をフィルターに入れて、１４０００×ｇで１０分間遠心した。次にフィルターを逆にして１０００×ｇで２ｍｉｎ遠心を行い、バッファー５００μＬで洗浄を２回行った。ＬａｃＺを精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて、発現の確認を行った。
３−３−１３ タンパク質濃度の測定
粗酵素液のタンパク濃度の測定は、サンプルをソニケーション緩衝液で適宜希釈したうえで、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）を用いて行った。定量のための標準タンパク溶液にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を用い、検量線を求めた。
粗酵素液のタンパク濃度の測定は、サンプルをソニケーション緩衝液で適宜希釈したうえで、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）を用いて行った。定量のための標準タンパク溶液にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を用い、検量線を求めた。
３−３−１４ 精製ＬａｃＺ活性測定
精製ＬａｃＺ、試薬および滅菌水を混合して試料を調製し、５５℃でインキュベートした後、ＯＤ４０５を測定した。精製ＬａｃＺ活性測定用試料の組成を表３−５に示す。
精製ＬａｃＺ、試薬および滅菌水を混合して試料を調製し、５５℃でインキュベートした後、ＯＤ４０５を測定した。精製ＬａｃＺ活性測定用試料の組成を表３−５に示す。
３−４）結果および考察
３−４−１ Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株の作成
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株由来のＧ３ＰＤプロモーターおよびＳＤ配列により転写および発現を制御し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用して、ｐｙｒＦと共にｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。
作製した変異株をＰＣＲにより確認した結果、レーン１の野生株（約４．８ｋｂ）と比べて、約２．５ｋｂ長いバンドが検出された。Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺの長さが２．５ｋｂであることから、正しく組換えが行われたことが確認出来た（図３）。図３は、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株のＰＣＲ結果を示す電気泳動像である。また、ＰＣＲ産物のシーケンスによっても、正しいＤＮＡ配列であることが確認出来た。
３−４−１ Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株の作成
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株由来のＧ３ＰＤプロモーターおよびＳＤ配列により転写および発現を制御し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用して、ｐｙｒＦと共にｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。
作製した変異株をＰＣＲにより確認した結果、レーン１の野生株（約４．８ｋｂ）と比べて、約２．５ｋｂ長いバンドが検出された。Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺの長さが２．５ｋｂであることから、正しく組換えが行われたことが確認出来た（図３）。図３は、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株のＰＣＲ結果を示す電気泳動像である。また、ＰＣＲ産物のシーケンスによっても、正しいＤＮＡ配列であることが確認出来た。
３−４−２ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＬａｃＺ発現の確認
ＨｉｓＴａｇを利用してＬａｃＺ（タンパク質）の精製を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＬａｃＺ発現の確認を行った。ＬａｃＺは分子量約８７ｋＤａのタンパク質であり、レーン５のバンドが約８７ｋＤａの位置に検出されたため、ＬａｃＺの発現が確認出来た（図４）。
ＨｉｓＴａｇを利用してＬａｃＺ（タンパク質）の精製を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＬａｃＺ発現の確認を行った。ＬａｃＺは分子量約８７ｋＤａのタンパク質であり、レーン５のバンドが約８７ｋＤａの位置に検出されたため、ＬａｃＺの発現が確認出来た（図４）。
３−４−３ ＬａｃＺ活性測定
３−３−１４に示したプロトコルと組成によってＬａｃＺの活性測定を行った。図５から、精製ＬａｃＺの活性を確認することが出来た。下記表にその結果を示した。
３−３−１４に示したプロトコルと組成によってＬａｃＺの活性測定を行った。図５から、精製ＬａｃＺの活性を確認することが出来た。下記表にその結果を示した。
３−４−４ 考察
３−４−２および３−４−３の結果によれば、ＬａｃＺの発現が確認でき、活性が見られた。これにより、ｌａｃＺをレポーター遺伝子として利用出来ることが確認された。そこで、以下では、ｌａｃＺの転写量および翻訳量に及ぼすプロモーターの影響を調べた。
３−４−２および３−４−３の結果によれば、ＬａｃＺの発現が確認でき、活性が見られた。これにより、ｌａｃＺをレポーター遺伝子として利用出来ることが確認された。そこで、以下では、ｌａｃＺの転写量および翻訳量に及ぼすプロモーターの影響を調べた。
４．ｌａｃＺ転写量に及ぼすプロモーターの影響
４−１）概要
３の結果からｌａｃＺをレポーター遺伝子として使用できることが確認できたため、３で選択したプロモーターおよびそのＳＤ配列を付加したｌａｃＺをダブルクロスオーバーの相同組換えを利用して、ｐｙｒＦとともにｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。
次に、プロモーターを付加したｌａｃＺ導入株のｍＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてｌａｃＺ転写量を測定した。
４−１）概要
３の結果からｌａｃＺをレポーター遺伝子として使用できることが確認できたため、３で選択したプロモーターおよびそのＳＤ配列を付加したｌａｃＺをダブルクロスオーバーの相同組換えを利用して、ｐｙｒＦとともにｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。
次に、プロモーターを付加したｌａｃＺ導入株のｍＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてｌａｃＺ転写量を測定した。
４−２）実験方法
４−２−１ 使用菌株およびプラスミド
４−２−１ 使用菌株およびプラスミド
４−２−２ プラスミドの構築
プラスミドの構築は３−３−３と同様に行った。２の結果からｌａｃＺに５つのプロモーターとプロモーター由来のＳＤ配列を付加したプラスミドの構築を行った。選択した転写量の高かった遺伝子を下記表に示す。
プラスミドの構築は３−３−３と同様に行った。２の結果からｌａｃＺに５つのプロモーターとプロモーター由来のＳＤ配列を付加したプラスミドの構築を行った。選択した転写量の高かった遺伝子を下記表に示す。
各プロモーターを付加したｌａｃＺを作成するために、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤ株のゲノムを鋳型として、表４−３に示すプライマーセット「ｐｋ１８−ｃｉｓ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−ｃｉｓ−ｉｎ−Ｒ」、「ｐｋ１８−ｐｒｉｍａｓｅ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−ｐｒｉｍａｓｅ−ｉｎ−Ｒ」、「ｐｋ１８−Ｍ１７３７−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−Ｍ１７３７−ｉｎ−Ｒ」、「ｐｋ１８−ＣＯＤＨ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−ＣＯＤＨ−ｉｎ−Ｒ」を用いてＰＣＲにより各プロモーターを増幅した。さらにｐｋ１８−ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤを鋳型にプライマーセット「ｐｋ１８−ｐｙｒＦ−ｉｎｖ−Ｆ／ｐｋ１８−ｐｙｒＦ−ｉｎｖ−Ｒ」を用いてインバースＰＣＲにより線状ベクターを構築し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて各プロモーターと線状ベクターをつなげ、プラスミドを構築した。
４−２−３ 各プロモーターを付加したｌａｃＺのモーレラ・サーモアセティカへの遺伝子導入
構築したプラスミドを３−３−１と同様に大腸菌の形質転換を行い、３−３−２から３−３−１０までの同様の工程を経て、各プロモーターを付加したｌａｃＺのモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）への遺伝子導入を行い、ｌａｃＺ導入株を構築した。
形質転換体の確認は、抽出したゲノムを鋳型にＰＣＲすることにより行った。ＰＣＲに使用したプライマーを表４−４に示す。ＰＣＲ反応用酵素はＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）を用いた。
構築したプラスミドを３−３−１と同様に大腸菌の形質転換を行い、３−３−２から３−３−１０までの同様の工程を経て、各プロモーターを付加したｌａｃＺのモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）への遺伝子導入を行い、ｌａｃＺ導入株を構築した。
形質転換体の確認は、抽出したゲノムを鋳型にＰＣＲすることにより行った。ＰＣＲに使用したプライマーを表４−４に示す。ＰＣＲ反応用酵素はＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）を用いた。
４−２−４ プロモーターを付加したｌａｃＺ導入株のｍＲＮＡ抽出
製作したプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株をバイアルを用いてフルクトースを基質として回分培養を行い（３−３−６参照）、ＯＤ６００＝０．５〜０．６５でｍＲＮＡ抽出を行った。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩを用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出方法は付属の標準プロトコルに従った。一部改変した点は、抽出の前処理としてリゾチームとアクロモペプチダーゼをそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解したＴＥ緩衝液 １００μＬに菌体ペレットを懸濁し、３７℃で１０分間反応させた。抽出したトータルＲＮＡは−２０℃で保存した。
製作したプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株をバイアルを用いてフルクトースを基質として回分培養を行い（３−３−６参照）、ＯＤ６００＝０．５〜０．６５でｍＲＮＡ抽出を行った。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩを用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出方法は付属の標準プロトコルに従った。一部改変した点は、抽出の前処理としてリゾチームとアクロモペプチダーゼをそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解したＴＥ緩衝液 １００μＬに菌体ペレットを懸濁し、３７℃で１０分間反応させた。抽出したトータルＲＮＡは−２０℃で保存した。
４−２−５ 定量的ＲＴ−ＰＣＲ
まず、抽出したｍＲＮＡを鋳型として、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＰＬＵＳ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、ｃＤＮＡへの逆転写反応を行った。逆転写反応はＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を用いて行った。逆転写に用いた反応液の組成と反応条件を表４−５に示す。
まず、抽出したｍＲＮＡを鋳型として、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＰＬＵＳ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、ｃＤＮＡへの逆転写反応を行った。逆転写反応はＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を用いて行った。逆転写に用いた反応液の組成と反応条件を表４−５に示す。
ｃＤＮＡへの逆転写の後、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＰＬＵＳ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲで転写量測定を行った。使用したプライマーを表４−６に、定量的ＲＴ−ＰＣＲの条件を表４−７および表４−８に、それぞれ示す。また、ハウスキーピング遺伝子であるＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ（ｇｙｒＢ）のｍＲＮＡ量を内部標準として各遺伝子の相対転写量を測定した。
４−３）実験結果・考察
４−３−１ 各プロモーターを付加したｌａｃＺのモーレラ・サーモアセティカへの遺伝子導入
ｃｉｓ、ＣＯＤＨまたはｐｒｉｍａｓｅの各遺伝子のプロモーターを付加したｌａｃＺを導入したプラスミドを構築し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用してｐｙｒＦとともにモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。作成した変異株をＰＣＲにより確認した結果（図６〜８）、レーン１の野生株（約４．８ｋｂ）と比べて、約２．５ｋｂ長いバンドが検出された。プロモーターを付加したｌａｃＺの長さが２．５ｋｂであることから、正しく組換えが行われたことが確認出来た。また、シーケンスでも正しいＤＮＡ配列であることが確認出来た。
４−３−１ 各プロモーターを付加したｌａｃＺのモーレラ・サーモアセティカへの遺伝子導入
ｃｉｓ、ＣＯＤＨまたはｐｒｉｍａｓｅの各遺伝子のプロモーターを付加したｌａｃＺを導入したプラスミドを構築し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用してｐｙｒＦとともにモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。作成した変異株をＰＣＲにより確認した結果（図６〜８）、レーン１の野生株（約４．８ｋｂ）と比べて、約２．５ｋｂ長いバンドが検出された。プロモーターを付加したｌａｃＺの長さが２．５ｋｂであることから、正しく組換えが行われたことが確認出来た。また、シーケンスでも正しいＤＮＡ配列であることが確認出来た。
４−３−２ 定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた転写量測定
定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて製作したｌａｃＺ導入株の転写量測定を行った。
図９に各プロモーターが及ぼす転写量の影響のグラフを示した。
定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて製作したｌａｃＺ導入株の転写量測定を行った。
図９に各プロモーターが及ぼす転写量の影響のグラフを示した。
４−３−３ 考察
図９からＧ３ＰＤプロモーターが最もｌａｃＺのｍＲＮＡ転写量に及ぼす影響が大きいことが分かった。他のプロモーターと比較して約３倍もの転写量を示し、他のプロモーターはほぼ同等の値を示した。モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株（Ｃｏｎｔｒｏｌ−１）の遺伝子転写量測定と比較すると双方ともＧ３ＰＤプロモーターが最も転写活性が高いことが確認できた。
図９からＧ３ＰＤプロモーターが最もｌａｃＺのｍＲＮＡ転写量に及ぼす影響が大きいことが分かった。他のプロモーターと比較して約３倍もの転写量を示し、他のプロモーターはほぼ同等の値を示した。モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株（Ｃｏｎｔｒｏｌ−１）の遺伝子転写量測定と比較すると双方ともＧ３ＰＤプロモーターが最も転写活性が高いことが確認できた。
５．ＬａｃＺ（タンパク質）の活性測定
５−１）概要
３、４で製作した株を用いて超音波破砕機による粗酵素液の抽出を行い、タンパク質濃度測定、活性測定を行った。
５−１）概要
３、４で製作した株を用いて超音波破砕機による粗酵素液の抽出を行い、タンパク質濃度測定、活性測定を行った。
５−２）実験方法
３−３−１１のプロトコルと同様に超音波破砕機による粗酵素液の抽出を行い、３−３−１３、１４のプロトコルと同様にタンパク質濃度を測定し、活性測定を行った。その際、基質：フルクトース、ＯＤ４０５＝０．５〜０．６５で粗酵素液の抽出を行った。
３−３−１１のプロトコルと同様に超音波破砕機による粗酵素液の抽出を行い、３−３−１３、１４のプロトコルと同様にタンパク質濃度を測定し、活性測定を行った。その際、基質：フルクトース、ＯＤ４０５＝０．５〜０．６５で粗酵素液の抽出を行った。
５−３）実験結果・考察
驚くべきことに、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合に、最もＬａｃＺ活性が高く、他のプロモーターを付加した場合と比較して、約２倍もの活性値の差が得られた（図１０を参照）。一方、ｍＲＮＡ転写量が最も高かったＧ３ＰＤプロモーターを付加した場合には、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合の約１／２に止まり、高い活性値は得られなかった。これは、ＣＯＤＨプロモーターの配列の中にｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を特に活性化する仕組みがあるためと推察される。
驚くべきことに、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合に、最もＬａｃＺ活性が高く、他のプロモーターを付加した場合と比較して、約２倍もの活性値の差が得られた（図１０を参照）。一方、ｍＲＮＡ転写量が最も高かったＧ３ＰＤプロモーターを付加した場合には、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合の約１／２に止まり、高い活性値は得られなかった。これは、ＣＯＤＨプロモーターの配列の中にｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を特に活性化する仕組みがあるためと推察される。
６．総括
ｌａｃＺをレポーター遺伝子として利用可能であることが確認出来た。
転写活性はＧ３ＰＤプロモーターを付加した場合に最も高く、他のプロモーターを付加した場合に比べて約３倍以上の転写活性を示した。しかし、産物であるＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性は、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合が最も高く、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加した場合に比べて約２倍の比活性を示した。このことから、外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングするためには、遺伝子産物のタンパク質の活性を測定することが必須であり、ｍＲＮＡ転写活性は予備的スクリーニングのために有用であることがわかった。
なお、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＬａｃＺ−Ｇ３ＰＤ株は、Ｍ−Ｇ３ＰＤ−ｌａｃＺ株と名付け、独立行政法人評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託を申請した（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１９０４）。
ｌａｃＺをレポーター遺伝子として利用可能であることが確認出来た。
転写活性はＧ３ＰＤプロモーターを付加した場合に最も高く、他のプロモーターを付加した場合に比べて約３倍以上の転写活性を示した。しかし、産物であるＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性は、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合が最も高く、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加した場合に比べて約２倍の比活性を示した。このことから、外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングするためには、遺伝子産物のタンパク質の活性を測定することが必須であり、ｍＲＮＡ転写活性は予備的スクリーニングのために有用であることがわかった。
なお、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＬａｃＺ−Ｇ３ＰＤ株は、Ｍ−Ｇ３ＰＤ−ｌａｃＺ株と名付け、独立行政法人評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託を申請した（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１９０４）。
識別の表示：Ｍ−Ｇ３ＰＤ−ＬａｃＺ
受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１９０４
受領日：平成２６年７月２９日
受託機関：独立行政法人評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１９０４
受領日：平成２６年７月２９日
受託機関：独立行政法人評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
Claims (3)
- 合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子をグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターよりも高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域であって、
ヌクレオチド配列が以下により表される、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域。
5'- accagattaccggggtatacggcggggggaaccggagttctctccggaaaaaaatgggtaataacacctgttaacccaacgggtgtaggattaaatgtaccaaggaggtaagcagt -3' - β−ガラクトシダーゼ遺伝子および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーター領域が染色体上に組み込まれた、β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌であって、
前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーター領域が、以下のヌクレオチド配列で表される一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域である、β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌。
5'- accagattaccggggtatacggcggggggaaccggagttctctccggaaaaaaatgggtaataacacctgttaacccaacgggtgtaggattaaatgtaccaaggaggtaagcagt -3' - 前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子がサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株に由来するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子である、請求項２に記載のβ−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌。
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