JP6479368B2 - 培養容器、多光子励起顕微鏡、及び観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体標本を培養する培養容器、多光子励起顕微鏡、及び観察方法に関する。

生体標本を深部まで観察するための手段として、多光子励起顕微鏡が知られている。多光子励起顕微鏡では、蛍光は励起光が集光した標本中の１点から発生するが、生体標本内部で散乱して広範囲に拡散される。このため、発生した蛍光を効率よく検出するためには、高い開口数と広い検出視野を有する対物レンズの利用が効果的である。

しかしながら、そのような対物レンズを用いたとしても、対物レンズによって取り込むことができる蛍光は、標本から全方向（３６０度）に出射される蛍光の一部のみである。そこで、検出効率のさらなる向上を実現するための技術が提案されている。

特許文献１には、対物レンズに加えて、対物レンズの径方向外側に配置されて標本からの蛍光を取り込む付加光学系を備え、対物レンズと付加光学系により集光された標本からの蛍光を光検出器で検出するように構成された蛍光観察装置が記載されている。

特開２０１１−１９６８５２号公報

ところで、生体標本は培養容器に収容された状態で観察されることがあるが、この培養容器が蛍光の検出を妨げることがある。特に、マイクロプレートのように標本を収容する複数の収容部が近接して設けられた容器が用いられる場合には、対物レンズのＮＡ(Numerical Aperture)を超えた大きなＮＡの光は、各収容部の上壁や側壁によって容易に遮られてしまう。

このため、培養容器に収容された標本を観察する場合には、特許文献１に記載された装置のように、蛍光を取り込むことができる角度範囲（検出立体角）を単純に広げても、十分な検出効率を得ることは難しい。

以上のような実情を踏まえ、本発明は、培養容器に収容された標本を明るく観察する技術を提供することを課題とする。

本発明の第１の態様は、生体標本を培養液に浸して収容可能な培養容器であって、前記培養容器の内側面に入射した前記生体標本からの光を前記培養容器の上方又は下方に導く導光手段を備える培養容器を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の培養容器において、前記生体標本からの光は、多光子励起によって生じた蛍光である培養容器を提供する。
本発明の第３の態様は、第１の態様又は第２の態様に記載の培養容器において、前記培養容器は、複数の生体標本を個別に収容する構造を有するマイクロプレートである培養容器を提供する。
本発明の第４の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の培養容器において、前記培養容器は、前記導光手段として、前記内側面を透過した前記生体標本からの光を上方又は下方に反射させる反射面を有する培養容器を提供する。

本発明の第５の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の培養容器において、前記培養容器は、前記導光手段として、前記内側面に形成された、前記生体標本からの光を回折させる回折面を有する培養容器を提供する。

本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の培養容器において、前記培養容器は、前記導光手段として、前記内側面に形成された、前記生体標本からの光を反射させる反射面を有する培養容器を提供する。

本発明の第７の態様は、第１の態様乃至第６の態様のいずれか１つに記載の培養容器において、さらに、光が透過する底面と、前記内側面とを有し、前記生体標本を前記培養液に浸して収容可能な容器本体と、前記容器本体に重ねて配置される蓋であって、前記底面側に向けて形成された前記生体標本からの光を反射させる反射面を有する蓋と、を備える培養容器を提供する。

本発明の第８の態様は、第７の態様に記載の培養容器において、前記蓋は、開口、又は、前記生体標本からの光が透過する透過部を有し、前記蓋に形成された反射面は、前記開口又は前記透過部の周囲に形成される培養容器を提供する。

本発明の第９の態様は、第７の態様又は第８の態様に記載の培養容器において、前記蓋に形成された反射面は、凹面形状を有する培養容器を提供する。

本発明の第１０の態様は、生体標本が収容される第１の態様から第９の態様のいずれか１態様に記載の培養容器と、前記培養容器が配置されるステージと、前記生体標本に励起光を照射する対物レンズを有し、前記対物レンズを介して前記生体標本から生じた蛍光を検出する第１の検出手段と、前記ステージを挟んで前記対物レンズとは反対側に配置されたコンデンサを有し、前記コンデンサを介して前記生体標本から生じた蛍光を検出する第２の検出手段と、前記生体標本から生じた蛍光であって前記培養容器から前記ステージ側に出射した蛍光のうち前記対物レンズの外側に導かれた蛍光を検出する第３の検出手段と、を備える多光子励起顕微鏡を提供する。

本発明の第１１の態様は、多光子励起顕微鏡のステージ上に配置された第１の態様から第９の態様のいずれか１態様に記載の培養容器に収容された生体標本を観察する観察方法であって、前記多光子励起顕微鏡の対物レンズを介して、前記生体標本に励起光を照射し、前記多光子励起顕微鏡の検出手段で、前記導光手段により前記培養容器の上方又は下方に導かれて前記培養容器から出射された、前記生体標本から生じた蛍光を検出する観察方法を提供する。

本発明によれば、培養容器に収容された標本を明るく観察する技術を提供することができる。

本発明の実施例１に係る顕微鏡の構成を例示した図である。 本発明の実施例１に係る培養容器の構成を説明するための図である。 本発明の実施例２に係る培養容器の構成を説明するための図である。 本発明の実施例３に係る培養容器の構成を説明するための図である。 本発明の実施例４に係る培養容器の構成を説明するための図である。 本発明の実施例５に係る培養容器の構成を説明するための図である。 本発明の実施例６に係る培養容器の構成を説明するための図である。 従来の培養容器の構成を説明するための図である。 本発明の実施例７に係る培養容器の構成を説明するための図である。 本発明の実施例８に係る培養容器の構成を説明するための図であり、蓋と培養液が接触していない様子が示されている。 本発明の実施例８に係る培養容器の構成を説明するための図であり、蓋と培養液が接触している様子が示されている。 本発明の実施例９に係る培養容器の構成を説明するための図である。

図１は、本実施例に係る顕微鏡１の構成を例示した図である。顕微鏡１は、培養容器１００に収容された生体標本１０１からの蛍光を検出する２光子励起顕微鏡である。

培養容器１００は、複数の生体標本１０１を個別に収容する構造を有するマイクロプレート（マルチウェルプレートともいう）である。生体標本１０１は、培養液１０２に浸した状態で培養容器１００に収容される。培養容器１００の詳細な構成については、後述する。

顕微鏡１は、培養容器１００が配置されるステージ２を備え、培養容器１００は、容器保持部２ａによってステージ２上に保持される。ステージ２は、対物レンズ７の光軸と直交するＸＹ方向に移動可能に構成されたＸＹステージである。顕微鏡１の利用者は、複数の生体標本１０１の中から選択された観察対象である生体標本１０１が対物レンズ７の光軸上に位置するように、ステージ２を操作する。

顕微鏡１は、さらに、レーザ３と、ＸＹスキャナ４と、リレー光学系５と、ダイクロイックミラー６と、対物レンズ７を備えている。顕微鏡１では、これらが培養容器１００に収容された生体標本１０１に下方から励起光を照射する照明手段として機能する。

レーザ３は、例えば、チタンサファイアレーザである。レーザ３は、赤外域の波長を有するレーザ光を出射する。ＸＹスキャナ４は、例えば、ガルバノミラーである。レーザ３から出射したレーザ光は、ＸＹスキャナ４で偏向される。リレー光学系５は、対物レンズ７の瞳をＸＹスキャナ４に投影する光学系である。ＸＹスキャナ４がレーザ光の偏向方向を変化させることで、対物レンズ７の瞳位置に入射するレーザ光の入射角が変化し、これにより、対物レンズ７から出射されたレーザ光の集光位置が対物レンズ７の光軸と直交するＸＹ方向に移動する。ダイクロイックミラー６は、照明光路と検出光路とを分岐させる手段である。ダイクロイックミラー６は、励起光であるレーザ光を透過させ、且つ、生体標本１０１から生じた蛍光を反射させる波長特性を有している。対物レンズ７は、生体標本１０１にレーザ光を照射する対物レンズであって、可視域から赤外域までの光に対して高い透過率を有している。

顕微鏡１では、照明手段により、培養容器１００に収容された生体標本１０１が励起されて、生体標本１０１から蛍光が放射される。

顕微鏡１は、さらに、ダイクロイックミラー６で反射した蛍光の光路上に、リレーレンズ８と、赤外線（ＩＲ）カットフィルタ９と、光電子増倍管（ＰＭＴ）１０を備えている。顕微鏡１では、これらは、対物レンズ７及びダイクロイックミラー６とともに、蛍光を検出する第１の検出手段を構成する。なお、第１の検出手段は、生体標本１０１にレーザ光を照射する対物レンズ７を介して蛍光を検出する落射検出手段である。

リレーレンズ８は、対物レンズ７の瞳をＰＭＴ１０に投影する光学系である。生体標本１０１から放射され対物レンズ７に取り込まれた蛍光は、ダイクロイックミラー６を反射し、リレーレンズ８によりＰＭＴ１０に導かれる。ＩＲカットフィルタ９は、赤外域の波長を有する光を遮断する光学フィルタであり、蛍光をレーザ光から分離する手段である。蛍光とともにＩＲカットフィルタ９に入射したレーザ光は、ＩＲカットフィルタ９で遮断される。ＰＭＴ１０は、蛍光を検出する光検出器である。ＰＭＴ１０には、ＩＲカットフィルタ９によりレーザ光から分離された蛍光が入射し検出される。

顕微鏡１では、落射検出手段により、生体標本１０１から放射された蛍光のうち対物レンズ７に取り込まれた蛍光が検出される。

顕微鏡１は、さらに、培養容器１００を挟んで対物レンズ７とは反対側の光路（透過検出光路）上に、コンデンサ１１と、リレーレンズ１２と、ミラー１３と、ＩＲカットフィルタ１４と、ＰＭＴ１５とを備えている。顕微鏡１では、これらは、蛍光を検出する第２の検出手段を構成する。なお、第２の検出手段は、ステージ２を挟んで対物レンズ７とは反対側に配置されたコンデンサ１１を介して蛍光を検出する透過検出手段である。

リレーレンズ１２は、コンデンサ１１の瞳をＰＭＴ１５に投影する光学系である。生体標本１０１から放射されコンデンサ１１に取り込まれた蛍光は、リレーレンズ１２により、ミラー１３及びＩＲカットフィルタ１４を介してＰＭＴ１５に導かれる。ＩＲカットフィルタ１４は、赤外域の波長を有する光を遮断する光学フィルタであり、蛍光をレーザ光から分離する手段である。蛍光とともにＩＲカットフィルタ１４に入射したレーザ光は、ＩＲカットフィルタ１４で遮断される。ＰＭＴ１５は、蛍光を検出する光検出器である。ＰＭＴ１５には、ＩＲカットフィルタ１４によりレーザ光から分離された蛍光が入射し検出される。

顕微鏡１では、透過検出手段により、生体標本１０１から放射された蛍光のうちコンデンサ１１に取り込まれた蛍光が検出される。

顕微鏡１は、対物レンズ７を取り囲むように対物レンズ７の外側に配置された複数の光学系１６と、複数の光ファイバー１７を備えている。これらは、ＩＲカットフィルタ９及びＰＭＴ１０とともに、第３の検出手段を構成する。

光学系１６は、培養容器１００により対物レンズ７の外側に導かれた蛍光を取り込む光学系である。光学系１６に取り込まれた蛍光は、光ファイバー１７及びＩＲカットフィルタ９を介して、ＰＭＴ１０に導かれる。

顕微鏡１では、第３の検出手段により、培養容器１００からステージ２側に出射した蛍光のうち対物レンズ７の外側に導かれた蛍光が検出される。

顕微鏡１は、培養容器１００から異なる方向に出射された蛍光を検出する３つの検出手段を備えることで、高い蛍光検出効率を実現することができる。これにより、顕微鏡１は、培養容器１００に収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。さらに、顕微鏡１は、後述する構成を有する培養容器１００を用いることで、より高い検出効率を実現することが可能となる。

以下、図２を参照しながら、培養容器１００の構成について詳細に説明する。図２には、周期構造を有する培養容器１００の一周期分の構成が示されている。なお、この点については、後に参照する図３から図１２についても同様である。

培養容器１００は、ステージ２に配置される容器本体１１０と、容器本体１１０に重ねて配置される蓋１２０と、を備えている。培養容器１００には、図２に示される容器本体１１０と蓋１２０の組み合わせが周期的に配列されている。容器本体１１０は、隣接する容器本体１１０と図示しない構造によって接続されていて、周期的に配列された複数の容器本体１１０全体で一つの大きな容器本体を構成している。また、蓋１２０は、図１に示されるように、後述する支持部材１２２が隣接する蓋１２０の支持部材１２２に接続されていて、周期的に配列された複数の蓋１２０全体で一つの大きな蓋を構成している。

容器本体１１０には、底面１１１と側面１１２で構成されるウェルが形成されている。生体標本１０１は培養液１０２に浸した状態で容器本体１１０のウェルに収容される。容器本体１１０は、対物レンズ７から出射されたレーザ光が底面１１１を透過して生体標本１０１に照射されるように、また、生体標本１０１から生じた蛍光が底面１１１を透過して対物レンズ７に入射するように、光を透過する素材によって作られている。

容器本体１１０の外側の側面（以降、外側面と記し、内側面である側面１１２と区別する）は、容器本体１１０下部において、光軸に対して傾斜した斜面であり、側面１１２を透過した蛍光を下方に反射させる反射面１１３である。詳細には、外側面である反射面１１３は、容器本体１１０と空気との屈折率差を利用した全反射面であり、側面１１２に浅い角度で入射した蛍光が全反射するように傾けられている。なお、反射面１１３の傾斜角度は、例えば、反射面１１３の最大高さに基づいて反射面１１３に入射する蛍光の入射角度範囲を特定し、特定した入射角度範囲の蛍光が全反射されるように、決定すればよい。

蓋１２０は、容器本体１１０に配置されたときに容器本体１１０の開口の少なくとも一部を覆うように形成された蓋部材１２１と、蓋部材１２１を支持する支持部材１２２と、を備えている。

蓋部材１２１は、中心に開口１２３が形成されたドーム形状を有する部材であり、蓋部材１２１には、底面１１１側に向けた反射面１２４が形成されている。開口１２３の周囲に形成された反射面１２４は、少なくとも生体標本１０１からの光である蛍光を反射させるように構成されればよい。反射面１２４は、例えば、蓋部材１２１の内側表面に生体標本１０１からの光（蛍光）の反射率を高めるコーティングを行うことによって形成される。開口１２３は、コンデンサ１１に入射する蛍光Ｌ１を遮らないように形成される。なお、開口１２３の代わりに生体標本１０１からの光（蛍光）が透過する透過部が形成されてもよい。その場合、透過部はガスを透過させる素材によって構成されていることが望ましい。

顕微鏡１では、培養容器１００に収容された生体標本１０１から上方に放射された蛍光のうち開口１２３を通過した蛍光Ｌ１は、コンデンサ１１に入射し、透過検出手段によって検出される。また、生体標本１０１から上方に放射された蛍光のうち開口１２３の外側に向かって出射した蛍光Ｌ２は、反射面１２４で反射し、その後、生体標本１０１から下方に放射された蛍光とともに対物レンズ７に入射し、落射検出手段によって検出される。また、生体標本１０１から側方に放射され側面１１２を透過した蛍光Ｌ３は、反射面１１３で反射し、第３の検出手段によって検出される。

このように、生体標本１０１を培養容器１００に収容して観察することで、生体標本１０１から生じた蛍光を高い検出効率で検出することが可能となる。このため、培養容器１００によれば、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。

なお、図２では、蓋部材１２１がドーム形状を有する例を示したが、蓋部材１２１の形状はドーム形状に限られない。蓋部材１２１に形成された反射面１２４で反射した光が対物レンズ７に導かれるような凹面形状であれば、蓋部材１２１の形状は任意の形状であってもよい。また、透過検出手段を有しない顕微鏡で用いられる場合には、開口１２３が形成されず蓋部材１２１全面に反射面１２４が形成されても良い。

図３は、本実施例に係る培養容器２００の構成を説明するための図である。図３に示す培養容器２００は、容器本体１１０の代わりに容器本体２１０を備える点が、図２に示す培養容器１００と異なっている。なお、図３では、蓋１２０の図示は省略されている。

容器本体２１０は、内側面に生体標本１０１からの光を回折させる回折面２１２が形成されている点が、容器本体１１０と異なっている。回折面２１２は、底面１１１からの高さ毎に異なる入射角で入射する蛍光Ｌ４を、外側面２１３に全反射角以上の角度で入射させるため、底面１１１からの高さに応じて異なる格子周期を有している。具体的には、回折面２１２は、底面１１１側から開口側に向かって格子周期が徐々に短くなるように構成されている。

生体標本１０１から回折面２１２に入射した蛍光Ｌ４のほとんどは、回折面２１２で回折する。その後、外側面２１３で全反射し、培養容器２００から下方へ出射される。これにより、上述した落射検出手段又は第３の検出手段によって検出される。また、回折面２１２を直進した０次回折光である蛍光Ｌ５のうちコンデンサ１１に入射したものは、透過検出手段によって検出される。

以上のように構成された培養容器２００によれば、容器本体２１０の側面（回折面２１２）に入射した光を検出手段に導くことができる。従って、培養容器１００と同様に、高い検出効率が実現され、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。

図４は、本実施例に係る培養容器３００の構成を説明するための図である。なお、本実施例に係る顕微鏡は、図１に示す顕微鏡１と同様である。ただし、透過検出手段は省略されてもよい。

培養容器３００は、ステージ２に配置される容器本体３１０と、容器本体３１０に重ねて配置される蓋３２０と、を備えている。容器本体３１０は、底面１１１と側面１１２で構成されるウェルが形成されている点については、図２に示す容器本体１１０と同様である。容器本体３１０が光を透過する素材によって作られている点についても同様である。

容器本体３１０は、容器本体３１０の外側面に、側面１１２を透過した生体標本１０１からの光（蛍光）を反射させる反射面３１３が形成されている。反射面３１３は、例えば、容器本体３１０の外側面に生体標本１０１からの光（蛍光）の反射率を高めるコーティングを行うことによって形成される。

蓋３２０には、底面１１１側に向けた反射面３２１が形成されている。蓋３２０は、蓋３２０が容器本体３１０に配置された状態で、反射面３２１が容器本体３１０の開口全体を覆うように構成されている。反射面３２１は、凹面形状を有している。反射面３２１は、容器本体３１０の外径に合せた大きさに形成されても良く、例えば、反射面３１３の延長線上に反射面３２１の端部が位置するように形成されてもよい。このような構成とすれば、生体標本１０１から生じた蛍光が培養容器３００の側面又は上面から出射することを防止することができる。

本実施例に係る顕微鏡では、生体標本１０１から上方または側方に放射された蛍光（蛍光Ｌ６及び蛍光Ｌ７）は、反射面３１３及び／または反射面３２１で反射して、培養容器３００の下方から出射され、落射検出手段又は第３の検出手段によって検出される。また、生体標本１０１から下方に放射された蛍光Ｌ８は、培養容器３００の下方へ出射され、落射検出手段によって検出される。

従って、培養容器３００によれば、培養容器１００と同様に、高い検出効率が実現され、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。

図５は、本実施例に係る培養容器４００の構成を説明するための図である。培養容器４００は、図２に示す培養容器１００の容器本体１１０と蓋１２０を一体に構成したものに相当する。なお、本実施例に係る顕微鏡は、コンデンサ１１の後方にミラー１８が配置されている点が、図１に示す顕微鏡１と異なっている。

培養容器４００は、開口近傍が内向きに湾曲していて、湾曲部分の底面１１１側に反射面４１５が形成されている点、及び、側面１１２の一部がレンズ面４１４として形成されている点が、培養容器１００の容器本体１１０と異なっている。反射面４１５は、図２に示す蓋１２０の反射面１２４に相当する。反射面４１５は、開口の周囲に底面１１１側に向けて形成されている点、少なくとも生体標本１０１からの光である蛍光を反射させるように構成される点は、反射面１２４と同様である。開口は、コンデンサ１１に入射する蛍光Ｌ１を反射面４１５が遮らないように、形成されている。

本実施例に係る顕微鏡では、生体標本１０１から上方に放射された蛍光のうち培養容器４００の開口を通過した蛍光Ｌ１は、コンデンサ１１でコリメートされてミラー１８に入射する。その後、ミラー１８を反射してコンデンサ１１を介して対物レンズ７に入射し、落射検出手段によって検出される。また、生体標本１０１から上方に放射された蛍光のうち開口の外側に向けて出射した蛍光Ｌ９は、反射面４１５で反射し、その後、生体標本１０１から下方に放射された蛍光とともに対物レンズ７に入射し、落射検出手段によって検出される。また、生体標本１０１から側方に放射されレンズ面４１４を透過した蛍光Ｌ１０は、反射面１１３を反射し、第３の検出手段によって検出される。なお、レンズ面４１４は、光学系１６を介して光ファイバー１７に入射する光束の広がりを抑える効果を有する。

従って、培養容器４００によれば、培養容器１００と同様に、高い検出効率が実現されて、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。

図６は、本実施例に係る培養容器５００の構成を説明するための図である。なお、本実施例に係る顕微鏡は、図１に示す顕微鏡１と同様である。ただし、第３の検出手段は省略されてもよい。

培養容器５００は、外側面ではなく内側面に反射面５１２が形成されている点が、図４に示す培養容器３００の容器本体３１０と異なっている。その他の点は、容器本体３１０と同様である。反射面５１２は、例えば、培養容器５００の内側面に生体標本１０１からの光（蛍光）の反射率を高めるコーティングを行うことによって形成される。

本実施例に係る顕微鏡では、生体標本１０１から上方に放射された蛍光（蛍光Ｌ１及び蛍光Ｌ１１）は、直接に、又は、反射面５１２で反射した後に、コンデンサ１１に入射し、透過検出手段によって検出される。また、生体標本１０１から下方に放射された蛍光は、対物レンズ７に入射し、落射検出手段によって検出される。

従って、培養容器５００によれば、培養容器５００の側面（反射面５１２）に入射した光を検出手段に導くことができる。従って、培養容器１００と同様に、高い検出効率が実現され、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。

図７は、本実施例に係る培養容器６００の構成を説明するための図である。なお、本実施例に係る顕微鏡は、コンデンサ１１の後方にミラー１８が配置されている点が、図１に示す顕微鏡１と異なっている。また、第３の検出手段は省略されてもよい。

培養容器６００は、容器に形成されたウェルが底面１１１側から開口側に向かって広がったテーパー形状を有し、反射面６１２が対物レンズ７の光軸に対して傾斜している点が培養容器５００と異なっている。その他の点は、培養容器５００と同様である。反射面６１２は、例えば、培養容器６００の内側面に生体標本１０１からの光である蛍光の反射率を高めるコーティングを行うことによって形成される。

従って、培養容器６００によっても、培養容器５００と同様に、高い検出効率が実現されるため、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。なお、培養容器６００では、生体標本１０１から略水平方向に放射された蛍光Ｌ１３も、上方に向けて反射され、コンデンサ１１、ミラー１８及び対物レンズ７を介して検出手段によって検出される。このため、培養容器５００よりも高い検出効率を実現することができる。

上述した実施例１から実施例６に係る培養容器は、培養容器の内側面に入射した生体標本１０１からの光を培養容器の上方又は下方に導く導光手段を備える点が共通している。この導光手段が検出効率の向上に寄与するため、これらの培養容器を用いることで、収容した生体標本１０１を明るく観察することができる。

なお、実施例１では反射面１１３が、実施例２では回折面２１２が、実施例３では反射面３１３が、実施例４では反射面１１３及び反射面４１５が、実施例５では反射面５１２が、実施例６では反射面６１２が、導光手段として機能している。

図８は、従来の培養容器７００の構成を説明するための図である。図９は、本実施例に係る培養容器８００の構成を説明するための図である。

図８に示すように、蓋を有しない（又は蓋が培養液１０２と接触しない）従来の培養容器７００では、培養液１０２と空気との界面（以降、気液界面と記す）は、凹面を上方に向けた形状を有する。これは、培養液１０２と側面１１２の間にはらたく界面張力による影響である。

この様な形状の気液界面を有する培養液１０２は、生体標本１０１から放射された蛍光に対して、凹レンズとして作用し、コンデンサ１１で取り込むことができる蛍光の光量を減少させてしまう。換言すると、気液界面（培養液１０２）の存在により、コンデンサ１１で取り込みことができる蛍光のＮＡがコンデンサ１１のＮＡに比べて低下してしまう。本実施例に係る培養容器８００は、この点について改善したものである。

図９に示す培養容器８００は、生体標本１０１を培養液１０２に浸して収容可能な容器本体８１０と、容器本体８１０に配置される蓋８２０と、を備えている。なお、容器本体８１０は、図８に示す培養容器７００と同じものであり、光が透過する底面１１１と側面１１２とを有している。

蓋８２０は、少なくとも生体標本１０１からの光（蛍光）を透過する素材から作られていて、容器本体８１０の開口の径と略同径の凸部を有している。蓋８２０は、凸部の位置を容器本体８１０の開口の位置に合わせた状態で、容器本体８１０に重ねて配置される。これにより、凸部が開口に挿入されて、凸部の先端が培養液１０２と接触する。凸部の先端は、平面形状を有する面８２１で構成されているため、面８２１と培養液１０２の界面（以降、固液界面と記す）は平面形状を有する。これにより、培養液１０２が凹レンズとして作用することを防止することができる。

従って、培養容器８００によれば、従来の培養容器７００に比べて、コンデンサ１１で取り込むことができる蛍光の光量を増加させることができる。これにより、高い検出効率が実現されるため、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。

図１０及び図１１は、本実施例に係る培養容器９００の構成を説明するための図である。図１０には、蓋９２０と培養液１０２が接触していない様子が、図１１には、蓋９２０と培養液１０２が接触している様子が示されている。培養容器９００は、蓋８２０の代わりに蓋９２０を備える点が、培養容器８００と異なっている。その他の点は、培養容器８００と同様である。

蓋９２０は、容器本体８１０に重ねて配置される点、少なくとも生体標本１０１からの光を透過する素材から作られている点は、蓋８２０と同様である。蓋９２０は、上下に突出した凸部を有している。凸部は、それぞれレンズ面として機能する、底面１１１側に向けられた凸面９２１と、凸面９２１とは反対方向に向けられた凸面９２２とを有している。これにより、蓋９２０は、容器本体８１０に重ねて配置された状態で、生体標本１０１から生じた生体標本１０１からの光である蛍光に対して正レンズとして機能する。

培養容器９００は、図１０に示すように、凹面形状を有する気液界面で広がった蛍光を蓋９２０で収斂させることができるため、従来の培養容器７００に比べて、コンデンサ１１で取り込むことができる蛍光の光量を増加させることができる。また、図１１に示すように、蓋９２０の面９２１を培養液１０２と接触させて気液界面をなくすことで、気液界面での蛍光の屈折を防止することができる。これにより、さらに、より多くの蛍光をコンデンサ１１に取り込むことが可能となる。このように、培養容器９００によれば、高い検出効率が実現されるため、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。

図１２は、本実施例に係る培養容器１０００の構成を説明するための図である。培養容器１０００は、蓋８２０の代わりに蓋１０２０を備える点が、培養容器８００と異なっている。その他の点は、培養容器８００と同様である。

蓋１０２０は、少なくとも生体標本１０１からの光を透過する素材から作られていて、容器本体８１０の開口の径と略同径の凸部を有している点は、蓋８２０と同様である。蓋１０２０は、凸部の先端にフレネルレンズ１０２１が配置されている点が、蓋８２０とは異なっている。フレネルレンズ１０２１は、底面１１１側に向けられたフレネルレンズ面１０２２を有している。フレネルレンズ面１０２２は正のパワーを有している。このため、蓋１０２０は、容器本体８１０に重ねて配置された状態で、生体標本１０１から生じた可視光である蛍光に対して正レンズとして機能する。

培養容器１０００でも、培養容器９００と同様に、凹面形状を有する気液界面で広がった蛍光を蓋１０２０で収斂させることができるため、従来の培養容器７００に比べて、コンデンサ１１で取り込むことができる蛍光の光量を増加させることができる。従って、培養容器１０００によれば、高い検出効率が実現されるため、収容された生体標本１０１を明るく観察することができる。また、フレネルレンズ構造を採用することで、正レンズとして機能する蓋１０２０の厚さを薄くすることができる。

上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。培養容器及び多光子励起顕微鏡は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。例えば、この明細書で説明される個別の実施例の文脈におけるいくつかの特徴を組み合わせて単一の実施例としてもよい。

例えば、実施例１から実施例４に係る培養容器は蓋を有しているが、これらの蓋は省略されてもよい。また、各実施例に係る顕微鏡は、２光子励起顕微鏡として構成されているが、蛍光が標本中の１点から発生するその他の多光子励起顕微鏡であってもよい。

図１では、第３の検出手段として、対物レンズ７の周囲に光学系１６を配置した例を示したが、光学系１６の代わりに光電変換素子そのものを対物レンズ７の周囲に配置してもよい。また、第３の検出手段は、コンデンサ１１の周囲に光学系１６を配置して構成されてもよい。この場合、例えば、図２に示す培養容器１００は、蛍光を下方に向けて反射する反射面１１３の代わりに、蛍光を上方に向けて反射する反射面を有するように構成してもよい。

１ 顕微鏡
２ ステージ
２ａ 容器保持部
３ レーザ
４ ＸＹスキャナ
５ リレー光学系
６ ダイクロイックミラー
７ 対物レンズ
８、１２ リレーレンズ
９、１４ ＩＲカットフィルタ
１０、１５ ＰＭＴ
１１ コンデンサ
１３、１８ ミラー
１６ 光学系
１７ 光ファイバー
１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ 培養容器
１０１ 生体標本
１０２ 培養液
１１０、２１０、３１０、８１０ 容器本体
１１１ 底面
１１２ 側面
１１３、１２４、３１３、３２１、４１５、５１２、６１２ 反射面
１２０、３２０、８２０、９２０、１０２０ 蓋
１２１ 蓋部材
１２２ 支持部材
１２３ 開口
２１２ 回折面
２１３ 外側面
４１４ レンズ面
８２１、９２１、９２２ 面
１０２１ フレネルレンズ
１０２２ フレネルレンズ面

Claims (11)

1. 生体標本を培養液に浸して収容可能な培養容器であって、
   前記培養容器の内側面に入射した前記生体標本からの光を前記培養容器の上方又は下方に導く導光手段を備える
   ことを特徴とする培養容器。
2. 請求項１に記載の培養容器において、
   前記生体標本からの光は、多光子励起によって生じた蛍光である
   ことを特徴とする培養容器。
3. 請求項１又は請求項２に記載の培養容器において、
   前記培養容器は、複数の生体標本を個別に収容する構造を有するマイクロプレートである
   ことを特徴とする培養容器。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の培養容器において、
   前記培養容器は、前記導光手段として、前記内側面を透過した前記生体標本からの光を上方又は下方に反射させる反射面を有する
   ことを特徴とする培養容器。
5. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の培養容器において、
   前記培養容器は、前記導光手段として、前記内側面に形成された、前記生体標本からの光を回折させる回折面を有する
   ことを特徴とする培養容器。
6. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の培養容器において、
   前記培養容器は、前記導光手段として、前記内側面に形成された、前記生体標本からの光を反射させる反射面を有する
   ことを特徴とする培養容器。
7. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の培養容器において、さらに、
   光が透過する底面と、前記内側面とを有し、前記生体標本を前記培養液に浸して収容可能な容器本体と、
   前記容器本体に重ねて配置される蓋であって、前記底面側に向けて形成された前記生体標本からの光を反射させる反射面を有する蓋と、を備える
   ことを特徴とする培養容器。
8. 請求項７に記載の培養容器において、
   前記蓋は、開口、又は、前記生体標本からの光が透過する透過部を有し、
   前記蓋に形成された反射面は、前記開口又は前記透過部の周囲に形成される
   ことを特徴とする培養容器。
9. 請求項７又は請求項８に記載の培養容器において、
   前記蓋に形成された反射面は、凹面形状を有する
   ことを特徴とする培養容器。
10. 生体標本が収容される請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の培養容器と、
    前記培養容器が配置されるステージと、
    前記生体標本に励起光を照射する対物レンズを有し、前記対物レンズを介して前記生体標本から生じた蛍光を検出する第１の検出手段と、
    前記ステージを挟んで前記対物レンズとは反対側に配置されたコンデンサを有し、前記コンデンサを介して前記生体標本から生じた蛍光を検出する第２の検出手段と、
    前記生体標本から生じた蛍光であって前記培養容器から前記ステージ側に出射した蛍光のうち前記対物レンズの外側に導かれた蛍光を検出する第３の検出手段と、を備える
    ことを特徴とする多光子励起顕微鏡。
11. 多光子励起顕微鏡のステージ上に配置された請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の培養容器に収容された生体標本を観察する観察方法であって、
    前記多光子励起顕微鏡の対物レンズを介して、前記生体標本に励起光を照射し、
    前記多光子励起顕微鏡の検出手段で、前記導光手段により前記培養容器の上方又は下方に導かれて前記培養容器から出射された、前記生体標本から生じた蛍光を検出する
    ことを特徴とする観察方法。