JP6479571B2 - ラック色素中のタンパク質の分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ラック色素中のタンパク質の分析方法に関する。
従来、医薬品、化粧品、及び食品の着色料として、様々な色素が用いられている。
近代、合成色素の発達により天然色素の使用は減少する傾向にあったが、近年では、自然志向の高まりと共に、再び、天然色素が好まれるようになっている。
しかし、天然色素は、動植物等の天然物から抽出及び精製を行って得られるものであるので、天然物に含まれるタンパク質等の残存が問題になることがある。
近代、合成色素の発達により天然色素の使用は減少する傾向にあったが、近年では、自然志向の高まりと共に、再び、天然色素が好まれるようになっている。
しかし、天然色素は、動植物等の天然物から抽出及び精製を行って得られるものであるので、天然物に含まれるタンパク質等の残存が問題になることがある。
従来から化粧品、食品等の着色料として広く用いられているラック色素は、タイ及びインドの亜熱帯地域の樹木に寄生するカイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）が分泌する樹脂状物質より、室温水もしくは熱水で抽出して得られるものである。ラック色素の主要な色素成分はラッカイン酸である。
このようにラック色素は、節足動物であるカイガラムシ科ラックカイガラムシから得られる色素であるので、タンパク質を含有する可能性がある。
しかし、従来、ラック色素が含有するタンパク質の量を測定する方法は知られておらず、食品添加物公定書第８版においても、ラック色素中のタンパク質の量は規定されていない。
例えば、非特許文献１では、種々の天然着色料の分析が行われ、ラック色素製剤の分析も行われているが、その夾雑タンパク質の分析は行われていない。
しかし、従来、ラック色素が含有するタンパク質の量を測定する方法は知られておらず、食品添加物公定書第８版においても、ラック色素中のタンパク質の量は規定されていない。
例えば、非特許文献１では、種々の天然着色料の分析が行われ、ラック色素製剤の分析も行われているが、その夾雑タンパク質の分析は行われていない。
Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. Pub. Health, 60, 13-20, 2009
前述の通り、ラック色素については、従来、これが含有するタンパク質（夾雑タンパク質）の量は問題にされていない。また、ラック色素の夾雑タンパク質がアレルゲンとなるという報告は無い。
しかし、近年のアレルゲンに対する意識の高まりから、ラック色素が含有するタンパク質の精密な分析方法（本明細書中、用語「分析」は、検出、及び定量を包含する。）を確保することは、有意義である。
しかし、近年のアレルゲンに対する意識の高まりから、ラック色素が含有するタンパク質の精密な分析方法（本明細書中、用語「分析」は、検出、及び定量を包含する。）を確保することは、有意義である。
また、ラック色素の色素成分であるラッカイン酸はタンパク質と結合しやすい。このラッカイン酸へのタンパク質の結合は、ラッカイン酸の色調を赤色から紫色へと変化させる。従って、ラック色素の品質を確保する目的でも、ラック色素が含有するタンパク質の分析方法を確保することは、有意義である。
ラック色素が含有するタンパク質の分析方法が知られていなかった理由は、これまで、ラック色素が含有するタンパク質の分析の必要性が認識されていなかったことに加えて、ラック色素の色素成分の特殊性により、慣用のタンパク質の分析方法が適用できなかったことも原因であると考えられる。
例えば、慣用のタンパク質分析方法であるセミミクロケルダール法は、タンパク質そのものの量ではなく窒素の量の測定に基づく方法であり、構成原子として窒素原子を有さないコチニール色素等の夾雑タンパク質の分析に利用できる。
しかし、ラック色素の色素成分であるラッカイン酸は、その構成原子として窒素原子を有するので、セミミクロケルダール法をラック色素が含有するタンパク質の分析に適用することはできない。
また、一般に、タンパク質の精密な分析法においては、高精度の定量法であるブラッドフォード法(Bradford法)、及びタンパク質を分子量によって分離できるＳＤＳ−Ｐａｇｅ法が利用されている。
しかし、ラック色素の主要な色素成分であるラッカイン酸は、当該ブラッドフォード法及びＳＤＳ−Ｐａｇｅ法に原理的に干渉するので、従来、ラック色素中に含有されるアレルゲンタンパク質の分析に当該方法を利用することはできない。なお、このことから理解されるように、この問題は、色価が高いラック色素において顕著である。
例えば、慣用のタンパク質分析方法であるセミミクロケルダール法は、タンパク質そのものの量ではなく窒素の量の測定に基づく方法であり、構成原子として窒素原子を有さないコチニール色素等の夾雑タンパク質の分析に利用できる。
しかし、ラック色素の色素成分であるラッカイン酸は、その構成原子として窒素原子を有するので、セミミクロケルダール法をラック色素が含有するタンパク質の分析に適用することはできない。
また、一般に、タンパク質の精密な分析法においては、高精度の定量法であるブラッドフォード法(Bradford法)、及びタンパク質を分子量によって分離できるＳＤＳ−Ｐａｇｅ法が利用されている。
しかし、ラック色素の主要な色素成分であるラッカイン酸は、当該ブラッドフォード法及びＳＤＳ−Ｐａｇｅ法に原理的に干渉するので、従来、ラック色素中に含有されるアレルゲンタンパク質の分析に当該方法を利用することはできない。なお、このことから理解されるように、この問題は、色価が高いラック色素において顕著である。
一方、酵素免疫定量（ＥＬＩＳＡ）法によれば、ブラッドフォード法及びＳＤＳ−Ｐａｇｅ法等の方法を利用しなくても、単一又は複数のアレルゲンの精密な分析を行うことは可能であるが、当該方法は、各アレルゲンに特異的な抗体を用いる方法なので、複数の種類のアレルゲンタンパク質を総合的又は網羅的に簡便に分析することには適さない。
また、タンニン酸濁度法は色素中の夾雑タンパク質の量を正確に測定できる方法でない。
また、タンニン酸濁度法は色素中の夾雑タンパク質の量を正確に測定できる方法でない。
従って、本発明は、ラック色素中に含有されるタンパク質の分析方法（特に、精密な分析が可能な分析方法）を提供することを目的とする。また、本発明は、ラック色素中に含有されるタンパク質（すなわち、ラック色素中に含有される夾雑タンパク質）の総合的又は網羅的かつ簡便な分析が可能な分析方法を提供することを更なる目的とする。
前記のように、ラック色素の色素成分であるラッカイン酸は、タンパク質と結合しやいい。従って、ラック色素からのタンパク質の分離は容易ではない。
しかし、本発明者らは、鋭意検討の結果、所定の可溶化処理をしたラック色素試料を所定のゲル濾過処理に付すことによって、ラック色素中に含有されるタンパク質をラック色素の色素成分から分離できることを見出し、及びこのことにより、ラック色素試料から、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できること、言い方を換えれば、分析の対象であるタンパク質を選択的に集められることを見出した。
ここで、本発明者らの検討により、ラック色素の色価が高い場合は、前記所定の可溶化処理、及び所定のゲル濾過処理のみでは当該分離が不充分である問題が明らかになったが、本発明者らは、更に、このように特に色価が高いラック色素試料の場合でも、ゲル濾過処理の前に更に、所定の限外濾過処理を実施することによって、前記分離が可能になることを見出した。
本発明者らは、かかる知見に基づき、更なる研究の結果本発明を完成するに至った。
しかし、本発明者らは、鋭意検討の結果、所定の可溶化処理をしたラック色素試料を所定のゲル濾過処理に付すことによって、ラック色素中に含有されるタンパク質をラック色素の色素成分から分離できることを見出し、及びこのことにより、ラック色素試料から、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できること、言い方を換えれば、分析の対象であるタンパク質を選択的に集められることを見出した。
ここで、本発明者らの検討により、ラック色素の色価が高い場合は、前記所定の可溶化処理、及び所定のゲル濾過処理のみでは当該分離が不充分である問題が明らかになったが、本発明者らは、更に、このように特に色価が高いラック色素試料の場合でも、ゲル濾過処理の前に更に、所定の限外濾過処理を実施することによって、前記分離が可能になることを見出した。
本発明者らは、かかる知見に基づき、更なる研究の結果本発明を完成するに至った。
本発明は、次の態様を含む。
項１． ラック色素中のタンパク質の分析方法であって、
（１）（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階、及び
（２）前記前処理段階（１）を経た前記ラック色素試料を分析する段階
を含む分析方法。
項２． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項１に記載の分析方法。
項３． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項２に記載の分析方法。
項４． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
項５． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項４に記載の分析方法。
項６． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。
項７． 前記段階（ｉｉｉ）の前に、更に、
（ｉｖ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、色素成分の少なくとも一部を除去する段階を含む
項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。
項８． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に段階（ｉｖ）を実施する
項７に記載の分析方法。
項９． タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法であって、
（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含む調製方法。
項１０． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項９に記載の調製方法。
項１１． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項１０に記載の調製方法。
項１２． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項９〜１１のいずれか１項に記載の調製方法。
項１３． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項１２に記載の調製方法。
項１４． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項９〜１３のいずれか１項に記載の調製方法。
項１５． 前記ゲル濾過段階の前に、更に、前記ラック色素試料を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素を除去する限外濾過段階を含む
項９〜１４のいずれか１項に記載の調製方法。
項１６． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前記限外濾過段階を実施する
項１５に記載の調製方法。
項１７． 項９〜１６のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタンパク質分析用のラック色素試料を分析することを含む
ラック色素試料中のタンパク質の調製方法。
項１８． ラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法であって、
（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収するゲル濾過段階
を含む前処理方法。
項１９． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項１８に記載の前処理方法。
項２０． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項１９に記載の前処理方法。
項２１． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項１８〜２０のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２２． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項２１に記載の前処理方法。
項２３． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項１８〜２２のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２４． 前記ゲル濾過段階の前に、更に、前記ラック色素試料を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素を除去する限外濾過段階を含む
項１８〜２３のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２５． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前記限外濾過段階を実施する
項２４に記載の前処理方法。
項２６． 項１９〜２５のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタンパク質分析用のラック色素試料を分析することを含む
ラック色素試料中のタンパク質の前処理方法。
（１）（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階、及び
（２）前記前処理段階（１）を経た前記ラック色素試料を分析する段階
を含む分析方法。
項２． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項１に記載の分析方法。
項３． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項２に記載の分析方法。
項４． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
項５． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項４に記載の分析方法。
項６． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。
項７． 前記段階（ｉｉｉ）の前に、更に、
（ｉｖ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、色素成分の少なくとも一部を除去する段階を含む
項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。
項８． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に段階（ｉｖ）を実施する
項７に記載の分析方法。
項９． タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法であって、
（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含む調製方法。
項１０． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項９に記載の調製方法。
項１１． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項１０に記載の調製方法。
項１２． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項９〜１１のいずれか１項に記載の調製方法。
項１３． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項１２に記載の調製方法。
項１４． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項９〜１３のいずれか１項に記載の調製方法。
項１５． 前記ゲル濾過段階の前に、更に、前記ラック色素試料を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素を除去する限外濾過段階を含む
項９〜１４のいずれか１項に記載の調製方法。
項１６． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前記限外濾過段階を実施する
項１５に記載の調製方法。
項１７． 項９〜１６のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタンパク質分析用のラック色素試料を分析することを含む
ラック色素試料中のタンパク質の調製方法。
項１８． ラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法であって、
（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収するゲル濾過段階
を含む前処理方法。
項１９． 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である項１８に記載の前処理方法。
項２０． 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である項１９に記載の前処理方法。
項２１． 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である項１８〜２０のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２２． 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である項２１に記載の前処理方法。
項２３． 前記水性溶液がリン酸緩衝液である項１８〜２２のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２４． 前記ゲル濾過段階の前に、更に、前記ラック色素試料を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素を除去する限外濾過段階を含む
項１８〜２３のいずれか１項に記載の前処理方法。
項２５． 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前記限外濾過段階を実施する
項２４に記載の前処理方法。
項２６． 項１９〜２５のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタンパク質分析用のラック色素試料を分析することを含む
ラック色素試料中のタンパク質の前処理方法。
本発明によれば、ラック色素中のタンパク質の精密な分析方法が提供される。更に、本発明によれば、ラック色素中のタンパク質の総合的又は網羅的かつ簡便な分析が可能な分析方法が提供される。
本明細書中、「ラック色素」は、カイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）が分泌する樹脂状物質から得られた色素である。
ラック色素の主要な色素成分はラッカイン酸である。
本明細書中、「ラック色素試料」とは、本発明の分析方法に供される当該色素の試料の他に、本発明の分析方法における各段階を経た試料を意味する場合がある。これらの意味は、その前後の文脈によって理解される。
ラック色素の主要な色素成分はラッカイン酸である。
本明細書中、「ラック色素試料」とは、本発明の分析方法に供される当該色素の試料の他に、本発明の分析方法における各段階を経た試料を意味する場合がある。これらの意味は、その前後の文脈によって理解される。
ラック色素試料中のタンパク質の分析方法
本発明のラック色素試料中のタンパク質の分析方法は、
（１）（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、７．５〜１１の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７〜１４の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階（本明細書中、前処理段階（１）と称する場合がある。）、及び
（２）前記前処理段階（１）を経た前記ラック色素試料を分析する段階（本明細書中、分析段階（２）と称する場合がある。）
を含む。
本発明のラック色素試料中のタンパク質の分析方法は、
（１）（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、７．５〜１１の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７〜１４の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階（本明細書中、前処理段階（１）と称する場合がある。）、及び
（２）前記前処理段階（１）を経た前記ラック色素試料を分析する段階（本明細書中、分析段階（２）と称する場合がある。）
を含む。
分析対象
本発明の分析方法の分析対象は、ラック色素試料中のタンパク質である。
当該分析対象であるタンパク質は、好ましくは、前記ラック色素に共有結合していないタンパク質である。
当該タンパク質は、通常、ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）由来のタンパク質である。
本発明の分析方法に供される試料は、通常、タンパク質を含有するラック色素試料であるが、本発明の分析方法は、ラック色素試料がタンパク質を含有しないこと（又は、タンパク質の含有量が検出限界以下であること）を確認する目的でも利用できる。
従って、本発明の分析方法は、タンパク質を含有する可能性がある、あらゆるラック色素試料に適用できる。
本発明の分析方法の分析対象は、ラック色素試料中のタンパク質である。
当該分析対象であるタンパク質は、好ましくは、前記ラック色素に共有結合していないタンパク質である。
当該タンパク質は、通常、ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）由来のタンパク質である。
本発明の分析方法に供される試料は、通常、タンパク質を含有するラック色素試料であるが、本発明の分析方法は、ラック色素試料がタンパク質を含有しないこと（又は、タンパク質の含有量が検出限界以下であること）を確認する目的でも利用できる。
従って、本発明の分析方法は、タンパク質を含有する可能性がある、あらゆるラック色素試料に適用できる。
前処理段階（１）
通常、ラック色素は、粉末、塊、液体又はペースト状である。その試料は、当該前処理段階（１）において、以下に詳細に説明する段階（ｉ）、及び段階（ｉｉ）を経て、後記で詳細に説明する段階（ｉｉｉ）のゲル濾過に付される。
通常、ラック色素は、粉末、塊、液体又はペースト状である。その試料は、当該前処理段階（１）において、以下に詳細に説明する段階（ｉ）、及び段階（ｉｉ）を経て、後記で詳細に説明する段階（ｉｉｉ）のゲル濾過に付される。
当該段階（ｉ）、及び（ｉｉ）によって、ラック色素試料を好適に可溶化できる。これにより、段階（ｉｉｉ）のゲル濾過の適切な実施が可能になる。本明細書中、当該段階（ｉ）、及び（ｉｉ）の処理をあわせて、可溶化処理と称する場合がある。
段階（ｉ）
段階（ｉ）では、ラック色素試料を水系溶媒に溶解させる。
段階（ｉ）においては、ラック色素試料の少なくとも一部が水系溶媒に溶解されればよいが、大部分のラック色素試料が溶解されることが好ましく、全てのラック色素試料が溶解されることがより好ましい。
当該水系溶媒のｐＨは、９〜１０の範囲内であり、好ましくは、９．２〜９．８の範囲内であり、より好ましくは、９．４〜９．６の範囲内であり、特に好ましくは、９．５である。
当該水系溶媒は、好適に、リン酸水素二ナトリウム水溶液であることができる。
当該リン酸水素二ナトリウム水溶液の濃度は、好ましくは、１〜１０００ｍＭの範囲内であり、より好ましくは、５〜１００ｍＭの範囲内であり、及び特に好ましくは、５０ｍＭである。
段階（ｉ）で用いられる当該水系溶媒の量は、例えば、ラック色素試料の色価８０に対し、１〜１０重量部の範囲内であることができる。
当該ラック色素試料は液状であってもよい。すなわち、ラック色素試料の「溶解」は、ラック色素試料の希釈であってもよい。
液状のラック色素試料として、具体的には、例えば、カイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）の樹脂状分泌物質の乾燥粉末１０ｇに対し、水１００ｍＬを加え、室温下で６０分間攪拌抽出し、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ａ（１１０ｍｍ）、東洋濾紙株式会社）で濾過した抽出液が例示される。
段階（ｉ）では、ラック色素試料を水系溶媒に溶解させる。
段階（ｉ）においては、ラック色素試料の少なくとも一部が水系溶媒に溶解されればよいが、大部分のラック色素試料が溶解されることが好ましく、全てのラック色素試料が溶解されることがより好ましい。
当該水系溶媒のｐＨは、９〜１０の範囲内であり、好ましくは、９．２〜９．８の範囲内であり、より好ましくは、９．４〜９．６の範囲内であり、特に好ましくは、９．５である。
当該水系溶媒は、好適に、リン酸水素二ナトリウム水溶液であることができる。
当該リン酸水素二ナトリウム水溶液の濃度は、好ましくは、１〜１０００ｍＭの範囲内であり、より好ましくは、５〜１００ｍＭの範囲内であり、及び特に好ましくは、５０ｍＭである。
段階（ｉ）で用いられる当該水系溶媒の量は、例えば、ラック色素試料の色価８０に対し、１〜１０重量部の範囲内であることができる。
当該ラック色素試料は液状であってもよい。すなわち、ラック色素試料の「溶解」は、ラック色素試料の希釈であってもよい。
液状のラック色素試料として、具体的には、例えば、カイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）の樹脂状分泌物質の乾燥粉末１０ｇに対し、水１００ｍＬを加え、室温下で６０分間攪拌抽出し、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ａ（１１０ｍｍ）、東洋濾紙株式会社）で濾過した抽出液が例示される。
段階（ｉｉ）
段階（ｉｉ）では、前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内、好ましくは、７．６〜８．５の範囲内、より好ましくは、７．８〜８．２の範囲内、特に好ましくは、８に調整する。
当該ｐＨの調整は、ｐＨ調整剤を使用して、行えばよい。
当該ｐＨ調整剤自体のｐＨは、１〜７の範囲内であり、好ましくは、３〜６の範囲内であり、より好ましくは、４〜５の範囲内であり、特に好ましくは、４．５である。
当該ｐＨ調整剤は、好適に、リン酸二水素ナトリウム水溶液であることができる。
当該リン酸二水素ナトリウム水溶液の濃度は、好ましくは、１〜１０００ｍＭの範囲内であり、より好ましくは、５〜１００ｍＭの範囲内であり、及び特に好ましくは、５０ｍＭである。
段階（ｉｉ）では、前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内、好ましくは、７．６〜８．５の範囲内、より好ましくは、７．８〜８．２の範囲内、特に好ましくは、８に調整する。
当該ｐＨの調整は、ｐＨ調整剤を使用して、行えばよい。
当該ｐＨ調整剤自体のｐＨは、１〜７の範囲内であり、好ましくは、３〜６の範囲内であり、より好ましくは、４〜５の範囲内であり、特に好ましくは、４．５である。
当該ｐＨ調整剤は、好適に、リン酸二水素ナトリウム水溶液であることができる。
当該リン酸二水素ナトリウム水溶液の濃度は、好ましくは、１〜１０００ｍＭの範囲内であり、より好ましくは、５〜１００ｍＭの範囲内であり、及び特に好ましくは、５０ｍＭである。
段階（ｉｉｉ）
段階（ｉｉｉ）では、前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する。
段階（ｉｉｉ）では、前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する。
段階（ｉｉｉ）のゲル濾過においては、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物が用いられる。すなわち、当該ゲル濾過におけるゲルは、当該架橋物のゲルである。
当該架橋物の好ましい例は、１−クロロ−２，３−エポキシ−プロパン架橋デキストランゲルを包含する。
当該架橋物の好ましい例は、１−クロロ−２，３−エポキシ−プロパン架橋デキストランゲルを包含する。
段階（ｉｉｉ）のゲル濾過においては、移動相として、５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液が用いられる。
当該移動相としての水性溶液のｐＨは、好ましくは７〜９の範囲内であり、より好ましくは７．５〜８．５の範囲内である。
当該ｐＨがこのような範囲内であることにより、段階（ｉｉｉ）のゲル濾過において、ラック色素試料中の色素成分とタンパク質とが充分に分離される。
ｐＨの調整は、酸性物質、塩基性物質、及び緩衝剤（例、リン酸緩衝剤）等の添加のような慣用の用法により行えばよい。これらの物質は、１種単独で、又は２種以上の組み合わせで用いることができる。
当該移動相としての水性溶液の塩濃度は、好ましくは５〜５５ｍＭの範囲内であり、より好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲内である。
当該塩濃度がこのような範囲内であることにより、段階（ｉｉｉ）のゲル濾過において、ラック色素試料中の色素成分とタンパク質とが充分に分離される。
塩濃度の調整は、塩の添加のような慣用の用法により行えばよい。当該塩の例は、ＮａＣｌ、及び緩衝剤（例、リン酸緩衝剤）を含む。これらの物質は、１種単独で、又は２種以上の組み合わせで用いることができる。
当該移動相としての水性溶液のｐＨは、好ましくは７〜９の範囲内であり、より好ましくは７．５〜８．５の範囲内である。
当該ｐＨがこのような範囲内であることにより、段階（ｉｉｉ）のゲル濾過において、ラック色素試料中の色素成分とタンパク質とが充分に分離される。
ｐＨの調整は、酸性物質、塩基性物質、及び緩衝剤（例、リン酸緩衝剤）等の添加のような慣用の用法により行えばよい。これらの物質は、１種単独で、又は２種以上の組み合わせで用いることができる。
当該移動相としての水性溶液の塩濃度は、好ましくは５〜５５ｍＭの範囲内であり、より好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲内である。
当該塩濃度がこのような範囲内であることにより、段階（ｉｉｉ）のゲル濾過において、ラック色素試料中の色素成分とタンパク質とが充分に分離される。
塩濃度の調整は、塩の添加のような慣用の用法により行えばよい。当該塩の例は、ＮａＣｌ、及び緩衝剤（例、リン酸緩衝剤）を含む。これらの物質は、１種単独で、又は２種以上の組み合わせで用いることができる。
前記水性溶液は、好ましくは、リン酸緩衝液である。これにより、塩濃度とｐＨとを同時に好適な範囲内に調整できる。リン酸緩衝液は、リン酸緩衝剤を含有する。リン酸緩衝液は、塩濃度の調整のため、更に塩（例、塩化ナトリウム）を含有してもよい。
段階（ｉｉｉ）のゲル濾過は、一般的なゲル濾過の方法と同様に実施すればよい。
具体的には、ラック色素試料を固定相であるゲルに負荷し、当該ゲルに移動相を通して、溶出液を回収する。
前記固定相は、好ましくは、ラック色素の負荷の前に、前記移動相に用いられる水性溶液と同じ組成の水性溶液を用いて平衡化される。
具体的には、ラック色素試料を固定相であるゲルに負荷し、当該ゲルに移動相を通して、溶出液を回収する。
前記固定相は、好ましくは、ラック色素の負荷の前に、前記移動相に用いられる水性溶液と同じ組成の水性溶液を用いて平衡化される。
当該ゲル濾過において、ラック色素に含有されるタンパク質は、ラック色素の色素成分よりも先に溶出する傾向がある。
この傾向に基づき、タンパク質を含有する画分（又はタンパク質を含有する可能性がある画分）を選択して集めることにより、ラック色素試料から、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できる。
すなわち、前処理段階（１）を経たラック色素試料は、元のラック色素試料に比べて、タンパク質含有量に対する色素成分含有量が減少している。
この傾向に基づき、タンパク質を含有する画分（又はタンパク質を含有する可能性がある画分）を選択して集めることにより、ラック色素試料から、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できる。
すなわち、前処理段階（１）を経たラック色素試料は、元のラック色素試料に比べて、タンパク質含有量に対する色素成分含有量が減少している。
段階（ｉｖ）
ラック色素試料の色価が高い場合、段階（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のみでは、ラック色素試料から、ラック色素中のタンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できない場合がある。
ここで、「ラック色素試料の色価が高い場合」とは、例えば、色価が２０以上の場合、又は色価が４０以上の場合であることができる。
この場合、前記段階（ｉｉｉ）の前（前記可溶化処理の後）に、更に、前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素試料中の色素成分の少なくとも一部（言い換えると、一部又は全部）を除去すること（段階（ｉｖ））を好適に実施できる。当該段階（ｉｖ）を経たラック色素試料は、元のラック色素試料に比べて、タンパク質含有量に対する色素成分含有量が減少している。これにより、その後の段階（ｉｉｉ）で、ラック色素中のタンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できるようになる。なお、段階（ｉｖ）においてラック色素の色素成分の全部が除去された場合、段階（ｉｉｉ）を行う必要は無いが、その場合でも、段階（ｉｉｉ）を行う場合は、本発明の範囲内である。
当該限外濾過は、限外濾過膜を用いて実施できる。
当該限外濾過においては、遠心等により、ラック色素を含有する液の限外濾過膜の通過を促進させられる。当該遠心の条件は、技術常識により適当に設定できるが、例えば、４０００×ｇ、４０分間程度である。
ラック色素が含有するタンパク質は、限外濾過膜を通過せずに、当該限外濾過膜の上のラック色素試料中に残る。
好ましくは、ラック色素試料にリン酸緩衝液を加えて限外濾過を繰り返すことにより、ラック色素試料を洗浄すること、言い換えれば、色素成分を更に除去することができる。当該洗浄は、例えば、色価が高くなくなるまで（すなわち、例えば、色価が４０未満になるまで、又は色価が２０未満になるまで）繰り返すことが好ましく、具体的には、例えば、４〜５回繰り返される。
当該限外濾過は、例えば、限外濾過膜を備え、限外濾過に使用できる市販の遠心式濾過ユニット（例、Ａｍｉｃｏｎ−１５（商品名、ミリポア社））を用いて、その説明書の記載に従って実施できる。
ラック色素試料の色価が高い場合、段階（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のみでは、ラック色素試料から、ラック色素中のタンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できない場合がある。
ここで、「ラック色素試料の色価が高い場合」とは、例えば、色価が２０以上の場合、又は色価が４０以上の場合であることができる。
この場合、前記段階（ｉｉｉ）の前（前記可溶化処理の後）に、更に、前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、ラック色素試料中の色素成分の少なくとも一部（言い換えると、一部又は全部）を除去すること（段階（ｉｖ））を好適に実施できる。当該段階（ｉｖ）を経たラック色素試料は、元のラック色素試料に比べて、タンパク質含有量に対する色素成分含有量が減少している。これにより、その後の段階（ｉｉｉ）で、ラック色素中のタンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できるようになる。なお、段階（ｉｖ）においてラック色素の色素成分の全部が除去された場合、段階（ｉｉｉ）を行う必要は無いが、その場合でも、段階（ｉｉｉ）を行う場合は、本発明の範囲内である。
当該限外濾過は、限外濾過膜を用いて実施できる。
当該限外濾過においては、遠心等により、ラック色素を含有する液の限外濾過膜の通過を促進させられる。当該遠心の条件は、技術常識により適当に設定できるが、例えば、４０００×ｇ、４０分間程度である。
ラック色素が含有するタンパク質は、限外濾過膜を通過せずに、当該限外濾過膜の上のラック色素試料中に残る。
好ましくは、ラック色素試料にリン酸緩衝液を加えて限外濾過を繰り返すことにより、ラック色素試料を洗浄すること、言い換えれば、色素成分を更に除去することができる。当該洗浄は、例えば、色価が高くなくなるまで（すなわち、例えば、色価が４０未満になるまで、又は色価が２０未満になるまで）繰り返すことが好ましく、具体的には、例えば、４〜５回繰り返される。
当該限外濾過は、例えば、限外濾過膜を備え、限外濾過に使用できる市販の遠心式濾過ユニット（例、Ａｍｉｃｏｎ−１５（商品名、ミリポア社））を用いて、その説明書の記載に従って実施できる。
段階（ｉｖ）は、例えば、ラック色素試料の色価が高い場合（例、色価が４０以上である場合、色価が２０以上である場合）に実施するように分析のスキームを定めてもよいが、ラック色素試料の色価に限らず実施してもよい。
なお、本明細書中、色価とは、着色料溶液の可視部での極大吸収波長における吸光度を測定し、１０ｗ／ｖ％溶液の吸光度に換算した数値であり、色価は、好適には、第８版食品添加物公定書に記載の方法に従って、測定される。
なお、本明細書中、色価とは、着色料溶液の可視部での極大吸収波長における吸光度を測定し、１０ｗ／ｖ％溶液の吸光度に換算した数値であり、色価は、好適には、第８版食品添加物公定書に記載の方法に従って、測定される。
タンパク質の分析段階（分析段階（２））
必要に応じて、所望により、タンパク質の分析段階の前の適当な段階、好ましくは、前処理段階（１）（すなわち、前処理段階（１）における段階（ｉｉｉ）の後に、タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を濃縮してもよい。当該濃縮は、限外濾過等の慣用の方法により実施すればよい。当該限外濾過は、例えば、限外濾過に使用できる市販の遠心式濾過ユニット（例、Ａｍｉｃｏｎ−４（商品名、ミリポア社））を用いて、その説明書の記載に従って実施できる。
必要に応じて、所望により、タンパク質の分析段階の前の適当な段階、好ましくは、前処理段階（１）（すなわち、前処理段階（１）における段階（ｉｉｉ）の後に、タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を濃縮してもよい。当該濃縮は、限外濾過等の慣用の方法により実施すればよい。当該限外濾過は、例えば、限外濾過に使用できる市販の遠心式濾過ユニット（例、Ａｍｉｃｏｎ−４（商品名、ミリポア社））を用いて、その説明書の記載に従って実施できる。
タンパク質の分析は、その目的に応じて、適当な方法を選択して実施すればよい。例えば、前記前処理（１）後のラック色素試料は、高精度の定量法であるブラッドフォード法(Ｂｒａｄｆｏｒｄ法)、及びタンパク質を分子量によって分離できるＳＤＳ−Ｐａｇｅ法に干渉する色素成分が低減されているので、これら方法を包含する、タンパク質の分析に利用される任意の方法の１種以上を用いて、ラック色素中のタンパク質の高精度の分析が可能である。本発明の分析方法には、好ましくは、ブラッドフォード法(Ｂｒａｄｆｏｒｄ法)、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法、又はその両方が用いられる。
タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法、及びラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法
本発明は、別の側面では、タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法、又はラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法であることができる。これらの方法は、前記分析方法において説明した前処理方法と同様に実施できる。
本発明は、別の側面では、タンパク質分析用のラック色素試料の調製方法、又はラック色素中のタンパク質の分析のためのラック色素試料の前処理方法であることができる。これらの方法は、前記分析方法において説明した前処理方法と同様に実施できる。
以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
１）ラック色素抽出液の調製および色価の測定
カイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）の樹脂状分泌物質の乾燥粉末１０ｇに対し、水１００ｍＬを加え、室温下で６０分間攪拌抽出し、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ａ（１１０ｍｍ）、東洋濾紙株式会社）で濾過した抽出液をラック色素抽出液とした。本抽出液の主色素成分はアントラキノン系ラッカイン酸である。
ラック色素抽出液を０．５％無水炭酸ナトリウムに溶解させた後、０．１Ｎ塩酸水で適度に希釈し、可視部での最大吸収波長（４１０ｎｍ）における吸光度を測定した。当該吸光度を１０ｗ／ｖ％溶液の吸光度に換算した値を色価とした。
カイガラムシ科ラックカイガラムシ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ Ｌａｃｃａ Ｋｅｒｒ）の樹脂状分泌物質の乾燥粉末１０ｇに対し、水１００ｍＬを加え、室温下で６０分間攪拌抽出し、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ５Ａ（１１０ｍｍ）、東洋濾紙株式会社）で濾過した抽出液をラック色素抽出液とした。本抽出液の主色素成分はアントラキノン系ラッカイン酸である。
ラック色素抽出液を０．５％無水炭酸ナトリウムに溶解させた後、０．１Ｎ塩酸水で適度に希釈し、可視部での最大吸収波長（４１０ｎｍ）における吸光度を測定した。当該吸光度を１０ｗ／ｖ％溶液の吸光度に換算した値を色価とした。
２）前処理段階（１）
段階（ｉ）、及び（ｉｉ）（可溶化処理）
タンパク質分析用のラック色素試料は、ラック色素抽出液を５０ｍＭリン酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ９．５）に溶解させた後、５０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．５）を加え、ｐＨを８に調整した。
段階（ｉ）、及び（ｉｉ）（可溶化処理）
タンパク質分析用のラック色素試料は、ラック色素抽出液を５０ｍＭリン酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ９．５）に溶解させた後、５０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．５）を加え、ｐＨを８に調整した。
様々な色価（０．３１、０．６３、１．２５、２．５、５、１０、２０、又は４０）のラック色素抽出液の色価が２．５を超える場合、その色素成分によってタンパク定量（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）が干渉を受けることを確認した（表１参照）。
２．５を超える様々な色価（色価：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０）のラック色素抽出液について、以下に示す段階（ｉｉｉ）を実施した。
段階（ｉｉｉ）（限外濾過）
ゲル濾過カラムとして、１−クロロ−２，３−エポキシ−プロパン架橋デキストランゲル８．３ｍＬをカラム１．４５×５．０ｃｍに充填した市販のゲル濾過クロマトグラフィーカラム（ＰＤ−１０カラム／ＧＥヘルスケア社、商品名）を用いた。
同カラムを予め５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、ラック色素抽出液１ｍＬを負荷した。
次いで、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を当該カラムに注入し、溶出液を１ｍＬずつ１３画分、分取した。
各タンパク溶出画分を、それぞれ、分子量３ｋＤでの分画性能をもつ再生セルロースメンブレン限外濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ／Ｍｅｒｃｋ社、商品名を用いて１ｍＬに濃縮した。
当該濃縮溶液の一部をＢｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質定量に供し、各画分におけるタンパク質の有無を評価した。その結果、タンパク質溶出画分はＮｏ．４〜８の画分であった。一方、タンパク質定量を妨害する色素成分の溶出は、Ｎｏ．９以降の画分であった。色素成分の溶出は、吸光度（６２０ｎｍ）（有効数字２桁）によって検出した（吸光度測定のブランクとしては、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた）。
表１中、色価について、表中の記号は、以下のことを示す。
− ：吸光度が０．００
± ：吸光度が０．０１以上０．１０未満
＋ ：吸光度が０．１０以上０．４０未満
＋＋：吸光度が０．４０以上
ここで、画分の吸光度が０．０１以上０．１０未満の場合、当該画分はラック色素を含有するが、この程度の小量であれば、タンパク質の分析へのラック色素の干渉は無視できる。
すなわち、表１から理解されるように、ラック色素抽出液の色価の上限が１０〜４０の場合、当該前処理により、ラック色素抽出液中のタンパク質を、その分析に干渉する色素成分から分離できること、及び、このことにより、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できること、が確認された。
このことは、逆に言えば、当該処理でラック色素成分からタンパク質を分離可能なラック色素抽出液の色価の上限は４０であったことを意味する。
ゲル濾過カラムとして、１−クロロ−２，３−エポキシ−プロパン架橋デキストランゲル８．３ｍＬをカラム１．４５×５．０ｃｍに充填した市販のゲル濾過クロマトグラフィーカラム（ＰＤ−１０カラム／ＧＥヘルスケア社、商品名）を用いた。
同カラムを予め５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、ラック色素抽出液１ｍＬを負荷した。
次いで、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を当該カラムに注入し、溶出液を１ｍＬずつ１３画分、分取した。
各タンパク溶出画分を、それぞれ、分子量３ｋＤでの分画性能をもつ再生セルロースメンブレン限外濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ／Ｍｅｒｃｋ社、商品名を用いて１ｍＬに濃縮した。
当該濃縮溶液の一部をＢｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質定量に供し、各画分におけるタンパク質の有無を評価した。その結果、タンパク質溶出画分はＮｏ．４〜８の画分であった。一方、タンパク質定量を妨害する色素成分の溶出は、Ｎｏ．９以降の画分であった。色素成分の溶出は、吸光度（６２０ｎｍ）（有効数字２桁）によって検出した（吸光度測定のブランクとしては、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた）。
表１中、色価について、表中の記号は、以下のことを示す。
− ：吸光度が０．００
± ：吸光度が０．０１以上０．１０未満
＋ ：吸光度が０．１０以上０．４０未満
＋＋：吸光度が０．４０以上
ここで、画分の吸光度が０．０１以上０．１０未満の場合、当該画分はラック色素を含有するが、この程度の小量であれば、タンパク質の分析へのラック色素の干渉は無視できる。
すなわち、表１から理解されるように、ラック色素抽出液の色価の上限が１０〜４０の場合、当該前処理により、ラック色素抽出液中のタンパク質を、その分析に干渉する色素成分から分離できること、及び、このことにより、当該タンパク質の分析に干渉する色素成分を、当該タンパク質の精密な分析が可能になる程度まで除去できること、が確認された。
このことは、逆に言えば、当該処理でラック色素成分からタンパク質を分離可能なラック色素抽出液の色価の上限は４０であったことを意味する。
ここで、可溶化処理後の溶液の色価が４０を超えたラック色素抽出液については、段階（ｉｉｉ）の前に、更に、以下の段階（ｉｖ）を実施した。
３）段階（ｉｖ）［限外濾過］
分画分子量３ｋＤの限外濾過ユニット（商品名：Ａｍｉｃｏｎ−１５、ミリポア社）を用いて、色価が４０を超えるラック色素抽出液を、色価が４０以下となるように限外濾過（４，０００×ｇ、４０分間を４〜５回）した。
３）段階（ｉｖ）［限外濾過］
分画分子量３ｋＤの限外濾過ユニット（商品名：Ａｍｉｃｏｎ−１５、ミリポア社）を用いて、色価が４０を超えるラック色素抽出液を、色価が４０以下となるように限外濾過（４，０００×ｇ、４０分間を４〜５回）した。
なお、段階（ｉｖ）を含まない前処理段階（１）と、段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）と、において、市販の標準タンパク混合品（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ／ＢｉｏＲａｄ社：商標）を用いて、添加回収試験を行なった結果、当該タンパク質の回収率は８４％以上であり、充分に高かった。（段階（ｉｖ）を含まない前処理段階（１）で９０％、段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）で８４％）
３）タンパク質の定量
段階（ｉｖ）を含まない前記前処理段階（１）を経た試料、及び段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を経た試料を、それぞれ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適度に希釈し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ７２, ２４８ (１９７６).）に従い、タンパク質の定量を行った。検量線作成には、標準タンパクに牛血清アルブミン水溶液を用いた。
その結果、ラック色素抽出液中のタンパク質の量は、３５０μｇ／ｍＬであった。
段階（ｉｖ）を含まない前記前処理段階（１）を経た試料、及び段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を経た試料を、それぞれ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適度に希釈し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ７２, ２４８ (１９７６).）に従い、タンパク質の定量を行った。検量線作成には、標準タンパクに牛血清アルブミン水溶液を用いた。
その結果、ラック色素抽出液中のタンパク質の量は、３５０μｇ／ｍＬであった。
４）タンパク質の検出
段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を経た試料、及びラック色素抽出液（前処理段階（１）を経ていない試料）について、次のようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。
試料１００μｌに、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）９５μｌ、及び２−メルカプトエタノール５μｌを加え、及び５分間煮沸して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷する試料を得た。電気泳動の条件はＬａｅｍｍｌｉ法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））に従った（当該条件を後記した。）。電気泳動後のゲルの染色は、慣用の方法であるＣＢＢ染色法によって実施した。
ラック色素の泳動ゲルのＣＢＢ染色結果を図１に示す（図１左：前処理段階（１）を行わなかった試料。図１右：段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を行った試料）。前処理段階（１）を行わなかった試料の場合、バンドがスメアになり、各タンパク質の検出が行えなかったが、段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を行った試料の場合、タンパク質のバンドが明瞭に観察された。
＜電気泳動条件＞
・ゲル：１０〜２０％ポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ社、商品名）
・泳動条件：２００Ｖ定圧、約４０分
・電気泳動用緩衝液：１０×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳプレミックスバッファー（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）を超純水で１０倍希釈した。
・分子量マーカー：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）
・試料負荷量： ３μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／１０μｌ／ｗｅｌｌ
段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を経た試料、及びラック色素抽出液（前処理段階（１）を経ていない試料）について、次のようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。
試料１００μｌに、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）９５μｌ、及び２−メルカプトエタノール５μｌを加え、及び５分間煮沸して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷する試料を得た。電気泳動の条件はＬａｅｍｍｌｉ法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））に従った（当該条件を後記した。）。電気泳動後のゲルの染色は、慣用の方法であるＣＢＢ染色法によって実施した。
ラック色素の泳動ゲルのＣＢＢ染色結果を図１に示す（図１左：前処理段階（１）を行わなかった試料。図１右：段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を行った試料）。前処理段階（１）を行わなかった試料の場合、バンドがスメアになり、各タンパク質の検出が行えなかったが、段階（ｉｖ）を含む前処理段階（１）を行った試料の場合、タンパク質のバンドが明瞭に観察された。
＜電気泳動条件＞
・ゲル：１０〜２０％ポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ社、商品名）
・泳動条件：２００Ｖ定圧、約４０分
・電気泳動用緩衝液：１０×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳプレミックスバッファー（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）を超純水で１０倍希釈した。
・分子量マーカー：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢｉｏＲａｄ社、商品名）
・試料負荷量： ３μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／１０μｌ／ｗｅｌｌ
本発明は、ラック色素中のタンパク質の分析に利用できる。
Claims (8)
- ラック色素中のタンパク質の分析方法であって、
（１）（ｉ）タンパク質を含有する可能性があるラック色素試料を、９〜１０の範囲内のｐＨを有する水系溶媒に溶解させてラック色素水溶液を調製する段階、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）で調製したラック色素水溶液のｐＨを７．５〜９未満の範囲内に調整する段階、及び
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を、固定相としてデキストラン及びその誘導体、並びにアガロース及びその誘導体から選択される１種以上の多糖類の架橋物を用い、かつ移動相として５ｍＭ以上の塩濃度及び１．５〜９の範囲内のｐＨを有する水性溶液を用いるゲル濾過に付し、タンパク質を含有する可能性がある溶離液を回収する段階
を含むラック色素試料の前処理段階、及び
（２）前記前処理段階（１）を経た前記ラック色素試料を分析する段階
を含む分析方法。 - 前記水性溶液のｐＨが７〜９の範囲内である請求項１に記載の分析方法。
- 前記水性溶液のｐＨが７．５〜８．５の範囲内である請求項２に記載の分析方法。
- 前記水性溶液の塩濃度が５〜５５ｍＭの範囲内である請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
- 前記水性溶液の塩濃度が１０〜５０ｍＭの範囲内である請求項４に記載の分析方法。
- 前記水性溶液がリン酸緩衝液である請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。
- 前記段階（ｉｉｉ）の前に、更に、
（ｉｖ）前記段階（ｉｉ）でｐＨを調整したラック色素水溶液を分画分子量３ｋＤ以上の限外濾過に付して、色素成分の少なくとも一部を除去する段階を含む
請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。 - 前記ラック色素試料が高い色価を有する場合に前処理段階（ｉｖ）を実施する
請求項７に記載の分析方法。
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