JP6480964B2 - 遊離酸形のβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）を含有する液体及び食品ならびにその製造法 - Google Patents

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本願は、２０１３年３月１４日出願の米国特許出願第６１／７８２，５６７号に基づく優先権を主張し、その全文を引用によって本明細書に援用する。
[0001]本発明は、一般的にβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）を含有する栄養補助食品（サプリメント）に関し、さらに詳しくは遊離酸形のＨＭＢを含有する栄養補助食品に関する。

[0002]ＨＭＢは、様々な用途の枠内において有用であることが見出されている。具体的には、米国特許第５，３６０，６１３号（Ｎｉｓｓｅｎ）に、ＨＭＢは血中の総コレステロール及び低密度リポタンパク質コレステロール濃度の低減に有用であると記載されている。米国特許第５，３４８，９７９号（Ｎｉｓｓｅｎら）には、ＨＭＢはヒトにおける窒素保持の促進に有用であると記載されている。米国特許第５，０２８，４４０号（Ｎｉｓｓｅｎ）では、動物における除脂肪組織(lean tissue)発達を増大するためのＨＭＢの有用性が検討されている。また、米国特許第４，９９２，４７０号（Ｎｉｓｓｅｎ）には、ＨＭＢが哺乳動物の免疫応答の増強に有効であると記載されている。米国特許第６，０３１，０００号（Ｎｉｓｓｅｎら）には、疾患関連の消耗（衰弱）の治療にＨＭＢと少なくとも一つのアミノ酸を使用することが記載されている。米国特許第６，１０３，７６４号には、ＨＭＢは筋肉量の実質的増加なしに動物の筋肉の有酸素能力を増大すると記載されている。さらに、ＨＭＢはヒトの感情状態の認識の改良に有用であることも米国特許第６，２９１，５２５号に記載されている。

[0003]ＨＭＢは、がん悪液質及びＡＩＤＳ消耗（衰弱）における除脂肪筋肉量の維持及び増大にプラスの効果を有することが示されている。さらに、運動によって引き起こされる筋損傷とその結果の炎症反応（筋肉痛、筋力低下及び炎症性サイトカインの増大をもたらす）に対するプラス効果もＨＭＢの使用で見られている。

[0004]以前より、ＨＭＢ単独又は他のアミノ酸との組合せは、若年アスリートの筋力及び筋機能回復のための効果的なサプリメントであることが観察されている。さらに、ＨＭＢと二つのアミノ酸、アルギニン及びリシンとの組合せは高齢者の筋肉量の増加にも効果的であることが観察されている。

[0005]伝統的栄養源を栄養補助食品（サプリメント）で補うのはめずらしいことではない。栄養補助食品は多種の剤形で提供されている。本発明の場合、非乳化の実質的に透明な液体形の栄養補助食品に焦点が当てられる。これらの実質的に透明な液体サプリメントは、多くの場合、ビタミン、炭水化物、可溶性タンパク質、アミノ酸、ミネラル及びその他の栄養素を含んでいる。ＨＭＢの摂取には利益があることが知られているため、これらの液体サプリメントにＨＭＢを含めるのは望ましいことである。

[0006]ＨＭＢは、水、スポーツドリンク、果汁、ソフトドリンク（清涼飲料）、ならびにその他の炭酸飲料及び非炭酸飲料などの他の液体に含めるのも望ましいであろう。
[0007]ＣａＨＭＢを、これらの液体、特に更なるカルシウムを含有する実質的に透明な液体製品にただ添加すると、不安定な製品がもたらされる。ＣａＨＭＢをこれらの液体に添加すると、時間と共に、凝集、凝固、分離及び沈降が生じることが観察されている。この凝集、凝固、分離及び沈降は、おそらく、少なくとも一部のＣａＨＭＢが時間と共に解離し、解離したカルシウム及び解離したＨＭＢが液体中の可溶性タンパク質及び／又はその他の成分（ビタミン、塩、及びミネラルを含む）と相互作用した結果として引き起こされ、観察された凝集、凝固、分離及び沈降となるのであろう。従って、ＣａＨＭＢを含有する透明液体サプリメントは、特に製品が標準の滅菌工程中に高熱に曝されねばならない場合、貯蔵安定性がなかった。

[0008]ＣａＨＭＢは、市販の可溶性タンパク質含有レディ・トゥ・ドリンク型(ready-to-drink)製品には、ＣａＨＭＢの添加により沈降及び凝集などといった物理的外観（外見）の変化を生じるため、うまく適合しないことが観察されている。

[0009]しかしながら、ＣａＨＭＢとの貯蔵安定性を有する透明液体栄養補助食品の製品が記載されている例もある。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０５７９９号にはＣａＨＭＢを含有する透明液体飲料が記載されている。この透明液体栄養製品は２．８〜４．６の範囲のｐＨを有し、出願明細書中には、これらのｐＨ範囲内ではＣａＨＭＢは会合したままであるので、製剤中のカルシウム及びタンパク質との間の相互作用が最小限化されるか又は回避され、その結果、ゲル化、沈降及び凝固が最小限化されるか又は回避されて貯蔵安定性のある製品を提供できると述べられている。

[00010]ＣａＨＭＢは歴史的にはＨＭＢの好適な送達形であった。従来、遊離酸形のＨＭＢの広範な試験にも商業的利用にも多数の障害が存在していたのと、薬物動態的観点から二つの形態の間に差異はないと考えられていたため、カルシウム塩がＨＭＢの商業的供給源として採用されていた。最近まで、栄養補助食品の包装、特に流通は、粉末形の栄養素を取り扱うのに適していたため、カルシウム塩のＨＭＢが広く受け入れられていた。ＨＭＢ酸は液体であるので、送達又は製品への配合がはるかに困難である。

[00011]現在、ＨＭＢの製造工程は、ＨＭＢ遊離酸の経口摂取を可能にする純度でＨＭＢ遊離酸を製造することが可能である。経口摂取に十分な純度の商業的供給源を確保することのほか、ＨＭＢ酸は経口摂取のためには緩衝化される必要がある。これは、ＨＭＢ酸のそれまでの使用を阻んでいた上記要因のために、最近定められたばかりの工程である。

[00012]ＣａＨＭＢを摂取すると、カルシウム塩形からのＨＭＢの比較的迅速な解離がもたらされると推測されていた。しかしながら、最近の研究及び対応する特許出願（米国出願公開第２０１２００５３２４０号）によれば、遊離酸形のＨＭＢは、ＣａＨＭＢの摂取と比べた場合、かなり独特の薬物動態効果を有することが示された。ＨＭＢ遊離酸（ＨＭＢ酸とも呼ぶ）の使用は、組織へのＨＭＢの可用性（アベイラビリティ−）を改良するので、ＣａＨＭＢの投与よりもより迅速で効率的なＨＭＢを組織に届ける方法を提供することになる。多くの場合、ＨＭＢ遊離酸はＨＭＢのより良好な送達形であることが示された。

[00013]従って、遊離酸ＨＭＢの独特の薬物動態効果を活用するためには、ＣａＨＭＢの代わりに遊離酸形のＨＭＢを使用するのが望ましい。しかしながら、非乳化液体栄養補助食品へのＨＭＢ酸の添加は、ＣａＨＭＢを液体に添加した場合に観察される結果と同様の結果をもたらすであろうことが予測された。具体的には、ＨＭＢ酸の添加は液体の最上部にＨＭＢ酸の層の出現をもたらすであろうこと、ＨＭＢ酸は液体を浮遊して回るのが観察されるであろうこと、及び／又はＨＭＢ酸は液体中の他の成分と相互作用して、凝集、沈降、及び飲料の物理的外観の変化をもたらすであろうことが予測された。従って、ＨＭＢ酸の液体栄養補助食品への添加がほぼ直ちにＨＢＭ酸の消失と永久的な溶解状態をもたらしたことは、驚くべきことであり予期せぬことであった。

[00014]このように、遊離酸形のＨＭＢを含有する飲料及び非乳化の実質的に透明な液体栄養補助食品を求める需要は存在する。

米国特許第５，３６０，６１３号 米国特許第５，３４８，９７９号 米国特許第５，０２８，４４０号 米国特許第４，９９２，４７０号 米国特許第６，０３１，０００号 米国特許第６，１０３，７６４号 米国特許第６，２９１，５２５号 米国特許出願公開第２０１１／０３０５７９９号 米国出願公開第２０１２００５３２４０号

[00015]一態様において、本発明は、遊離酸形のＨＭＢを含有する液体栄養補助食品を提供する。
[00016]別の態様において、本発明は、遊離酸形のＨＭＢを含有する透明液体飲料を提供する。

[00017]栄養補助食品又は飲料はカルシウム及び可溶性タンパク質を含有していてもよい。
[00018]さらに別の態様において、本発明は、遊離酸ＨＭＢを液体栄養補助食品又は飲料に添加する方法を提供する。遊離酸ＨＭＢの添加は、液体又は飲料製品の製造工程中に行われても、その液体又は飲料を摂取する直前になされてもよい。

[00019]驚くべきことに、可溶性タンパク質を含有している透明液体栄養補助食品中の遊離酸ＨＭＢとカルシウム（存在する場合）は貯蔵安定性がなく、ＨＭＢ及び／又はカルシウム（存在する場合）と可溶性タンパク質との相互作用により沈降及び分離がもたらされるであろうと考えられていたにもかかわらず、本発明は、可溶性タンパク質と遊離酸ＨＭＢを含有するそのような栄養補助食品を含み、なお貯蔵安定性がある。さらに、可溶性タンパク質を含有していない液体への遊離酸ＨＭＢの添加も、驚くべきことに、遊離酸ＨＭＢの添加で予期されるような液体の沈降及び分離をもたらさない。
すなわち、本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチル酪酸（ＨＭＢ酸）を約０．５グラムのＨＭＢ酸〜約３０グラムのＨＭＢ酸の間で含む実質的に透明で非乳化の液体組成物。
［２］組成物がさらに可溶性タンパク質を含む、［１］に記載の組成物。
［３］組成物がさらにカルシウムを含む、［１］に記載の組成物。
［４］組成物がさらにビタミン及びミネラルを含む、［１］に記載の組成物。
［５］実質的に透明で非乳化の液体が貯蔵安定性を有する、［１］に記載の組成物。
［６］実質的に透明で非乳化の液体が、栄養液、スポーツドリンク、果汁、及び炭酸飲料からなる群から選ばれる、［１］に記載の組成物。
［７］実質的に透明で非乳化の液体が約２．０〜約４．７のｐＨを有する、［１］に記載の組成物。
［８］実質的に透明で非乳化の液体が約２．０〜約２．８のｐＨを有する、［１］に記載の組成物。
［９］実質的に透明で非乳化の液体が約２．０〜約２．７５のｐＨを有する、［８］に記載の組成物。
［１０］ＨＭＢ酸を含む実質的に透明で非乳化の液体組成物の製造法であって、ＨＭＢ酸が栄養組成物に製造工程中の任意の時点で添加される製造法。
［１１］約０．５グラムのＨＭＢ酸〜約３０グラムのＨＭＢ酸の間のＨＭＢ酸を含む濃縮物。
［１２］濃縮物が、レディ・トゥ・ドリンク型（ＲＴＤ）飲料又は食品に添加される、［１１］に記載の濃縮物。
［１３］濃縮物が、レディ・トゥ・ドリンク型（ＲＴＤ）飲料又は食品に、そのＲＴＤ飲料又は食品の消費者によって添加される、［１２］に記載の濃縮物。
［１４］ＨＭＢ酸が、レディ・トゥ・ドリンク型（ＲＴＤ）飲料に添加される、［１］に記載の栄養組成物の製造法。
［１５］ＨＭＢ酸が、液体に製造工程中の任意の時点で添加される、［１］に記載の栄養組成物の製造法。
［１６］ＨＭＢ酸を実質的に透明で非乳化の液体組成物に添加することを含む液体組成物の製造法であって、ＨＭＢ酸の液体組成物への添加が、物理的外観、食感又は質感（テクスチャー）からなる液体の特徴の少なくとも一つに悪影響を及ぼさない製造法。

図１は、実施例１で検査された液体サプリメントの１、４、１４及び２１日における物理的外観を示すボトルの写真を示す。 図１は、実施例１で検査された液体サプリメントの１、４、１４及び２１日における物理的外観を示すボトルの写真を示す。 図２ａは、実施例３で検査されたＩＳＯＰＵＲＥサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＩＳＯＰＵＲＥのボトルの写真を示す。 図２ａは、実施例３で検査されたＩＳＯＰＵＲＥサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＩＳＯＰＵＲＥのボトルの写真を示す。 図２ａは、実施例３で検査されたＩＳＯＰＵＲＥサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＩＳＯＰＵＲＥのボトルの写真を示す。 図２ｂは、実施例３で検査されたＧＮＣ−プロテインジュースサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＧＮＣ−プロテインジュースのボトルの写真を示す。 図２ｂは、実施例３で検査されたＧＮＣ−プロテインジュースサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＧＮＣ−プロテインジュースのボトルの写真を示す。 図２ｂは、実施例３で検査されたＧＮＣ−プロテインジュースサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＧＮＣ−プロテインジュースのボトルの写真を示す。 図２ｃは、実施例３で検査されたＧａｔｏｒａｄｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＧａｔｏｒａｄｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙのボトルの写真を示す。 図２ｃは、実施例３で検査されたＧａｔｏｒａｄｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＧａｔｏｒａｄｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙのボトルの写真を示す。 図２ｃは、実施例３で検査されたＧａｔｏｒａｄｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＧａｔｏｒａｄｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙのボトルの写真を示す。 図２ｄは、実施例３で検査されたＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーターサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーターのボトルの写真を示す。 図２ｄは、実施例３で検査されたＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーターサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーターのボトルの写真を示す。 図２ｄは、実施例３で検査されたＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーターサンプルの０、７、１４、２８及び４２日における物理的外観を示すＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーターのボトルの写真を示す。 図３は、１２０日間にわたる３００ｍｇのＨＭＢ酸の安定性結果を示すグラフである。 図４は、１２０日間にわたる１０００ｍｇのＨＭＢ酸の安定性結果を示すグラフである。 図５は、１２０日間にわたる３０００ｍｇのＨＭＢ酸の安定性結果を示すグラフである。

[00020]好適な態様において、本発明は、遊離酸ＨＭＢを含有する非乳化の実質的に透明な液体栄養補助食品、最も典型的には飲料又はドリンクを提供する。本発明の液体は、水及び遊離酸ＨＭＢを含有しうる。さらなる成分は、可溶性タンパク質、アミノ酸、炭水化物、ビタミン及びカルシウムのようなミネラルなどでありうる。

[00021]本発明は、そのベースにＨＭＢ酸と液体を含む。ほとんどの場合、該液体の粗脂肪含量は１％未満である。当業者であれば、本発明はＤＨＡ又はＥＰＡのような遊離脂肪酸を含みうるが、それでもなお粗脂肪含量は１％未満であるとみなされることは分かるであろう。水、スポーツドリンク、ジュース、ソフトドリンク、液剤及び実質的に透明な栄養補助食品、例えばＥｎｓｕｒｅ Ｃｌｅａｒ、ＩｓｏＰｕｒｅプロテインドリンク、ＧＮＣプロテインジュース、Ｇａｔｏｒａｄｅ Ｒｅｃｏｖｅｒ、及びＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーターは、本発明の液体を含みうるが、本発明はこれらの液体に限定されない。

[00022]好適な形態は液体栄養補助食品中のＨＭＢ酸であるが、別の態様において、ＨＭＢ酸は、蜂蜜、アップルソース、フルーツリボン(fruit ribbons)及びその他の食品などの食品に、製造工程中に添加することも又は製造後消費者が摂取する前に添加することもできる。

[00023]本発明において、ＨＭＢ酸は有効量で存在する。有効量は、２４時間で体重１キログラムあたり約０．０１グラム〜約０．２グラムの範囲のＨＭＢ酸を含む。ＨＭＢ酸は、１日約０．５グラム〜約３０グラムのＨＭＢ酸という有効量でヒトに投与することもできる。従って、ＨＭＢ酸を含む既製(premade)製品は、実質的にこれらの範囲にあるＨＭＢ酸を有する。個人でＨＭＢ酸を液体又は食品に添加する個食用製品(individual servings)も、実質的にこれらの範囲内にあるＨＭＢ酸を有する。

[00024]任意の可溶性タンパク質源が本発明での使用に適切である。例えば、乳漿（ホエイ）タンパク質濃縮物、乳漿タンパク質分離物、カゼイン加水分解物、加水分解コラーゲン及びこれらの組合せなどであるが、これらに限定されない。

[00025]液体栄養補助食品はカルシウムも含みうる。最も好ましくは、サプリメントの他の成分（例えば遊離酸ＨＭＢ又は可溶性タンパク質（存在する場合））との相互作用を最小限にするために可溶形のカルシウムである。カルシウムの適切な形態の非制限的例は、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム及びパントテン酸カルシウムなどである。

[00026]本発明の液体栄養補助食品は、ビタミンＤなどのビタミンも含みうる。米国特許出願公開第２０１０／０１７９１１２号に記載されているように、ビタミンＤとＨＭＢの組合せは相乗効果を有するので、本発明の液体中にもビタミンＤを含めるのが望ましいであろう。ビタミンＤは任意の形態で含めることができる。最も好ましくはコレカルシフェロールとしても知られるビタミンＤ_３としての形態である。含められるビタミンＤの量は、毒性を生ずる量までの任意の量のビタミンＤでよい。典型的なビタミンＤの量は４０００ＩＵまでであるが、米国特許出願公開第２０１０／０１７９１１２号に記載されているように、これよりずっと多くの量を含めることもできる。

[00027]本発明で使用されるＨＭＢ酸は一般的には液体形である。本発明の範囲内の他の形態のＨＭＢ酸は、ゲル形又はゲル−マトリックス形のＨＭＢ酸を含む。任意の及びすべての形態のＨＭＢ酸が本発明で使用できる。

[00028]本発明では、遊離酸ＨＭＢを摂取前の任意の時点で液体に添加することができる。例えば、遊離酸ＨＭＢは、製造工程中の液体又は食品に、製造工程中の任意の時点で添加できる。適切な製造法は、特に制限されないが、液体製品の熱充填法(hot fill process)、レトルト又は無菌充填などであり、ＨＭＢ酸はこれらのいずれかの製造工程中の任意の時点で添加することができる。

[00029]当該液体又は食品を追加の加熱もしくは冷却工程、又は追加の混合もしくはスラリー形成などの何らかの標準外の製造工程に付する必要はない。ＨＭＢ酸は任意の製造工程中の任意の時点で添加することができ、製品は貯蔵安定性があり、液体又は食品の他の成分と相互作用したＨＭＢ酸の分離又は沈降は最小限である。

[00030]ＨＭＢ酸は、製造後、摂取前に液体又は食品に添加することもできる。例えば、ＨＭＢ酸は、消費者が自分の好みの液体又は食品に添加するために、液体又は食品とは分離して提供されてもよい。個々に計量されたＨＭＢ酸、最も典型的には濃縮物形、最も典型的にはゲル形のＨＭＢ酸の包み（パッケージ）が、規定量の水、スポーツ飲料、ジュース、実質的に透明な栄養液などに添加するために提供されうる。ＨＭＢ酸は１回量又は複数回量の包装で提供されうる。ＨＭＢ酸は任意の飲用液体又は食品に混合されることになるであろうが、前述の液体及び食品に可溶性である。

[00031]本発明は、ＨＭＢ酸が添加される液体基剤のｐＨに依存しない。液体基剤のｐＨは約２．０ほどの低さでもよい。
[00032]ＨＭＢ酸を液体及び食品に添加しても、その液体又は食品の他の成分と相互作用したＨＭＢ酸の沈降、ゲル化又は凝固がほとんどない液体及び食品が得られるという本発明の観察は、驚くべきことであり予期せぬことである。当該技術分野では、カルシウムＨＭＢを水などの液体又は可溶性タンパク質を含有する液体に添加すると、カルシウム及びＨＭＢが部分解離してイオン形になり、沈降、ゲル化及び凝固をもたらすことが知られている。米国特許出願第２０１１／０３０５７９９号に、実質的に透明な栄養液へのカルシウムＨＭＢの添加が記載されているが、カルシウムＨＭＢは会合したままなのでカルシウムとタンパク質間の相互作用が回避され、これらの望まざる作用が最小限化されるという事実が明らかにされている。ＨＭＢ酸は、定義により、解離形のＨＭＢであるので、遊離酸形だと液体の可溶性タンパク質及び他の成分と相互作用して、沈降などをもたらすであろうことが予測された。驚いたことに、遊離酸形のＨＭＢは他の成分のいずれとも相互作用せず、ゆえに、分離又は沈降がほとんど〜全くない安定な製品が提供される。ＨＭＢ酸は液体に添加されるとほとんど即座に溶解するという観察も予期せぬことであった。ＨＭＢ酸の液体への添加は、ＨＭＢ酸が液体の最上部に層を形成するか、又は液体全体を浮遊するか、又はＨＭＢ酸が液体中の他の成分と相互作用して、凝集、沈降を引き起こし、飲料の物理的外観に変化をもたらすであろうことが予測された。それどころか、ＨＭＢ酸の添加とその後軽く振り混ぜるだけで、ＨＭＢ酸は直ちに消失し、水晶のように透明な液体が得られる。

[00033]さらに、ＨＭＢ酸の添加は、液体ドリンクマトリックスのフレーバー、質感（テクスチャー）、食感及び安定性にほとんど〜全く影響を与えなかった。
[00034]当業者であれば、液体に添加と表示されたＨＭＢ酸を、ＨＭＢ酸（通常ゲルの形態）を添加せずに摂取することも本発明の範囲に含まれることは分かるはずである。

実験例
実施例１：ＨＭＢ（遊離酸形及びカルシウム塩形）を添加された製品組成物の安定性
プロトコル：
１．Ｎ＝２（２種類のフレーバーの市販のレディ・トゥ・ドリンク型可溶性タンパク質製品；透明保証、ｐＨ約２．７４）
２．ガラスボトルにＡ１〜Ａ３及びＢ１〜Ｂ３とラベル貼付した。ラベルは下記条件に対応する。

３．Ａ２とＢ２のボトルに１ｇのＣａＨＭＢ ＭＴＩ １２０８−１００−０２ ＴＳＩ １２０７０６３０を添加した。
４．Ａ３とＢ３のボトルに０．８ｇのＨＭＢ遊離酸 ＭＴＩ １１０３−１００−０９ ロット番号１１０１００８４を添加した。

５．４０ｍｌのピーチフレーバー付き製品をＡ１〜Ａ３と標識されたボトルに添加した。
６．４０ｍｌのブルーベリー・ザクロ(Blueberry Pomegranate)フレーバー付き製品をＢ１〜Ｂ３と標識されたボトルに添加した。

７．ボトルをゴムキャップで密封し、クリンプ閉鎖した。次いでそれらをよく混合し、棚に置いた。
８．外観を記録し、毎日写真撮影した（ボトルは撹乱せず）。

結果：
表２に、レディ・トゥ・ドリンク型可溶性タンパク質製品（ｎ＝２）の、ＣａＨＭＢ又はＨＭＢ遊離酸の添加及び混合後の物理的外観を報告する。ＨＭＢは対照ボトルには添加しなかった。第１日の記録は最初の混合後の記録である。

物理的外観の記録に加えて、上記の時点で写真も撮影した。
これらの写真は図１に示す。
実施例２：
検査：ＨＭＢ（遊離酸形及びＣａ塩形）を添加された製品の味
プロトコル：
１．Ｎ＝２（２種類のフレーバーの市販のレディ・トゥ・ドリンク型可溶性タンパク質製品；透明保証、ｐＨ約２．７４）
２．ガラスボトルにＡ１〜Ａ３及びＢ１〜Ｂ３とラベル貼付した。ラベルは下記条件に対応する。

３．Ａ２とＢ２のボトルに１ｇのＣａＨＭＢ ＭＴＩ １２０８−１００−０２ ＴＳＩ １２０７０６３０を添加し混合した。
４．Ａ３とＢ３のボトルに１．０ｇのＨＭＢ遊離酸、ロット番号１１０１００８６を添加し混合した。

５．調査者によりボトルの味見をした。
６．各サンプルの味見の合間に水で口をすすぎ、１分間待った。
結果：
表４に、レディ・トゥ・ドリンク型可溶性タンパク質製品（ｎ＝２）の、ＣａＨＭＢ又はＨＭＢ遊離酸の添加及び混合後の味を報告する。ＨＭＢは対照ボトルには添加しなかった。

結論：
ＨＭＢ遊離酸を含有する可溶性タンパク質のレディ・トゥ・ドリンク型製品は、ＣａＨＭＢを含有する製品に比べて驚くほど安定であった。さらに、ＨＭＢ遊離酸の添加は、対照と比べた場合に製品の物理的外観、食感又は質感（テクスチャー）には何の影響も及ぼさず、後味にわずかな変化があっただけであった（酸味が強かったが、これはおそらくＨＭＢ遊離酸の低ｐＨのためである）。

実施例３
実験室検査＃２１ 長期安定性
１．１２個のガラスボトルをエタノールで濯ぎ、一晩風乾した。

２．ガラスボトルにＡ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３、Ｃ１〜Ｃ３及びＤ１〜Ｄ３とラベル貼付した。ラベルは下記条件に対応する。

３．Ａ２〜Ｄ２のボトルにＣａＨＭＢ ＭＴＩ １２０８−１００−０２ ＴＳＩ １２０７０６３０を使用した。
４．Ａ３〜Ｄ３のボトルにＨＭＢ遊離酸 ＭＴＩ １１０３−１００−０９ ロット番号１１０１００８４を使用した。

５．４０ｍｌのＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンクをＡ１〜Ａ３に、４０ｍｌのＧＮＣプロテインジュースをＢ１〜Ｂ３に、４０ｍｌのＧａｔｏｒａｄｅ ＲｅｃｏｖｅをＣ１〜Ｃ３に、そして４０ｍｌのＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーターをＤ１〜Ｄ３に添加した。

６．窒素でフラッシュ洗浄し、ボトルをゴムキャップ及び金属製のクランプキャップで密封した。
７．よく混合した。

８．毎週金曜日にボトルＡ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３、Ｃ１〜Ｃ３、及びＤ１〜Ｄ３の写真撮影をした。写真は図２ａ〜２ｄに示す。
以下の表６〜９に、試験した各液体（ＩＳＯＰＵＲＥ、ＧＮＣプロテインジュース、Ｇａｔｏｒａｄｅ Ｇ３−Ｒｅｃｏｖｅｒ、及びＳｐａｒｔｏｓプロテインウォーター）の栄養成分を提供する。

図２ａ〜２ｄから分かるように、カルシウムＨＭＢを添加した液体は、４２日までに混濁し、沈殿物を含有している。カルシウムＨＭＢボトルは、Ａ２、Ｂ２、Ｃ２及びＤ２のボトルである。液体とＨＭＢ酸を含有しているボトル（Ａ３、Ｂ３、Ｃ３及びＤ３）は、４２日時点で透明で沈殿物がなく、対照ボトル（ＨＭＢなし）（Ａ１、Ｂ１、Ｃ１及びＤ１）と同じに見える。

実施例４
この実験は、可溶性タンパク質中の様々な濃度のＨＭＢ酸の１２０日間にわたる安定性を観察するために設計された。

可溶性タンパク質（ＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンク、Ｎａｔｕｒｅｓ Ｂｅｓｔ（登録商標）、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ社、ニューヨーク）中のＨＭＢ遊離酸の安定性を分析するために、様々な濃度のＨＭＢ遊離酸を推奨される一人前分量（一食分）(serving size)のＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンクに添加した。３種類の濃度は、３００ｍｇ／２４０ｍｌ、１０００ｍｇ／２４０ｍｌ、及び３０００ｍｇ／２４０ｍｌであった。各溶液について、ＨＭＢ遊離酸を５つの異なる時点、すなわち、０、３０、６０、９０、及び１２０日に、ＨＰＬＣを用いて測定した。使用したＨＭＢ遊離酸は、ＭＴＩ １３０１−１００−０３（ロット番号１２０１１１０３６）であった。使用したＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンクはロット番号１２１２１１１１３２３１０であった。ＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンクは約２．５４のｐＨを有していた。使用したすべてのガラス器具及び消耗品（補給品）は、５つの異なる時点用に３種類の異なる濃度のＨＭＢ遊離酸をＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンク中に調製するに際し、オートクレーブにかけた。オートクレーブにかけられた材料は次の通りであった。すなわち、ガラスボトル、ゴム及び金属シール（封止材）、ピペットチップ、及びメスシリンダー。ＩＳＵリサーチパークの３号館 (Building 3 of ISU Research Park)にて、物品乾燥のためのオートクレーブ法＃１を使用した。

表１０にボトルのラベル付けを示す。

グループＡのボトルについては、５個のボトルのそれぞれに６０ｍｇのＨＭＢＦＡを加え、次いで４８ｍｌのＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンクを加えた。ＨＭＢＦＡの濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌであった。

グループＢのボトルについては、５個のボトルのそれぞれに２００ｍｇのＨＭＢＦＡを加え、次いで４８ｍｌのＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンクを加えた。ＨＭＢＦＡの濃度は４．１６ｍｇ／ｍｌであった。

グループＣのボトルについては、５個のボトルのそれぞれに６００ｍｇのＨＭＢＦＡを加え、次いで４８ｍｌのＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンクを加えた。ＨＭＢＦＡの濃度は１２．５ｍｇ／ｍｌであった。

ＩＳＯＰＵＲＥプロテインドリンクは０．０６７７ｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有している。各サンプル中のタンパク質の量は３．２５ｇであった。
表１１に、サンプルの実際の重量（ｍｇ）及び濃度（ｍｇ／４８ｍｌ）を示す。

各サンプルボトルは窒素でフラッシュ洗浄した後、ボトル頂部をゴムキャップで密封し、クリンプ閉鎖してよく混合した。
各濃度のボトル１個を、０、３０、６０、９０、及び１２０日の時点で、ＳＯＰ １１３−０４ ＨＭＢ（修正標準曲線）を用い、ＨＭＢについて試験した。

表１２に、使用されるＨＭＢ標準曲線を示す。

試験用サンプルを調製するために、０．５ｍｌのサンプルを４個組の微量遠心管に移した。次に、０．２５ｍｌのＫＩＶ内部標準を、標準と各サンプルセットのうち３個に加えた。最後に、０．２５ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液を、ＫＩＶ内部標準入りの３個のサンプルに加え、０．５ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液を、ＫＩＶを含有していないサンプルに加えた。

これで各ＨＭＢＦＡサンプルの濃度はそれぞれ０．６２５ｍｇ／ｍｌ、２．０８ｍｇ／ｍｌ、及び６．２５ｍｇ／ｍｌとなった。
サンプルは、許容可能な±３％の分析上の変動で、４ヶ月間にわたり予測されるＨＭＢ濃度の変化が±５％であり、安定と見なされた。安定性の二次的尺度として、線形回帰をデータに対して実施した。

結果
ＩＳＯＰＵＲＥスポーツドリンクを用いて調製された３種類の濃度のＨＭＢ遊離酸を、ＨＰＬＣを用い、ＨＭＢ濃度を０、３０、６０、９０、及び１２０日時点で分析した。ＩＳＯＰＵＲＥスポーツドリンク中の成分が我々のＫＩＶ内部標準ピークを妨害したので、外部標準をベースにした計算を使用し、各サンプル中のＨＭＢを定量した。定量したＨＭＢの量を各試験時点における各サンプルのＨＭＢの予測量と比較し、予測量のパーセントで表した。結果を図３〜５に示す。一般に、スポーツドリンク中のＨＭＢ−ＦＡの３種類の異なる濃度は、時間と共に数値的に減少傾向であったが、有意の直線的減少は検出されなかった（ｐ＞０．０５）。変化は８．０％未満であった。ＨＭＢ−ＦＡサンプルの３００、１０００、及び３０００ｍｇ／一食分は、それぞれ予測量の９８．６％〜９１．８４％、９８．１％〜９４．９６％、及び９７．２８％〜９３．５７％の変動であった。

図３に、［ＨＭＢ遊離酸３００ｍｇ］／［可溶性タンパク質一食分］を含有するサンプルの１２０日間の安定性の評価を示す。ＨＭＢ遊離酸の減少はＨＭＢ遊離酸の予測量の８％未満で、有意の直線的減少はなかった（ｐ＜０．０５）。

図４に、［ＨＭＢ遊離酸１０００ｍｇ］／［可溶性タンパク質一食分］を含有するサンプルの１２０日間の安定性の評価を示す。ＨＭＢ遊離酸の減少はＨＭＢ遊離酸の予測量の８％未満で、有意の直線的減少はなかった（ｐ＜０．０５）。

図５に、［ＨＭＢ遊離酸３０００ｍｇ］／［可溶性タンパク質一食分］を含有するサンプルの１２０日間の安定性の評価を示す。ＨＭＢ遊離酸の減少はＨＭＢ遊離酸の予測量の８％未満で、有意の直線的減少はなかった（ｐ＜０．０５）。

この実験例は、可溶性タンパク質を含有しているドリンクにＨＭＢ酸を添加しても、ＨＭＢ酸は室温で１２０日間安定を保っていたことを実証している。

Claims (12)

1. ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチル酪酸（ＨＭＢ酸）を１．２５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で約０．５グラムのＨＭＢ酸〜約３０グラムのＨＭＢ酸の間で含み、約２．０〜約４．７のｐＨを有する、経口投与のための、実質的に透明で非乳化の液体栄養組成物であって、さらに可溶性タンパク質を含む、前記組成物。
2. 組成物がさらにカルシウムを含む、請求項１に記載の液体栄養組成物。
3. 組成物がさらにビタミン及びミネラルを含む、請求項１または２に記載の液体栄養組成物。
4. 実質的に透明で非乳化の液体が貯蔵安定性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体栄養組成物。
5. 実質的に透明で非乳化の液体が、栄養液、スポーツドリンク、果汁、及び炭酸飲料からなる群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体栄養組成物。
6. 実質的に透明で非乳化の液体が約２．０〜約２．８のｐＨを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体栄養組成物。
7. 実質的に透明で非乳化の液体が約２．０〜約２．７５のｐＨを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の液体栄養組成物。
8. 約０．５グラムのＨＭＢ酸〜約３０グラムのＨＭＢ酸の間のＨＭＢ酸を含む濃縮物を用いることによる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体栄養組成物を調製するための方法。
9. 濃縮物が、レディ・トゥ・ドリンク型（ＲＴＤ）飲料又は食品に添加される、請求項８に記載の方法。
10. ＨＭＢ酸が、レディ・トゥ・ドリンク型（ＲＴＤ）飲料に添加される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体栄養組成物の製造法。
11. ＨＭＢ酸が、液体に製造工程中の任意の時点で添加される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体栄養組成物の製造法。
12. ＨＭＢ酸を実質的に透明で非乳化の液体組成物に添加することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体栄養組成物の製造法であって、ＨＭＢ酸の液体栄養組成物への添加が、物理的外観、食感又は質感（テクスチャー）からなる液体の特徴の少なくとも一つに悪影響を及ぼさない製造法。