JP6481364B2 - 核酸除去法 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅法におけるコンタミナント核酸の除去方法に関する。本発明は、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。

ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。

しかしながら、ＰＣＲは非常に高感度な検出方法であるため、反応系に混入した核酸が非特異増幅や擬陽性の原因となる。特に、微生物同定において１６Ｓ ＲＮＡ領域やＩＴＳ領域など、微生物で高度に保存された領域を増幅するプライマーを用いると、鋳型ＤＮＡを添加しなくても増幅が見られることがある。これはＤＮＡポリメラーゼやｄＮＴＰｓに混入した核酸に由来するものであり、このようなコンタミ核酸があると誤った検査結果を出してしまう恐れがあった。
また、このようなコンタミ核酸が３０サイクルを超えるＰＣＲサイクルでは、原因不明の非特異的な増幅を生じる原因にもなっていた。

一般的にＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、バクテリアやアーキアなどの野生細胞から精製したもの、もしくは遺伝子組換え技術によって、大腸菌などの宿主で作られ精製したものを用いる。しかし、高度に精製されたＤＮＡポリメラーゼでも宿主のゲノムやＲＮＡ、遺伝子組み換えに用いたプラスミドといった核酸が残存する場合があることがわかっている。
また、ＰＣＲの反応には不可欠なｄＮＴＰｓは、高エネルギーのため環境菌がコンタミしやすいことや、サケの精子ゲノムから製造されるため、生物由来のコンタミ核酸を含む場合があることがわかっている。その他、ＰＣＲ反応の緩衝剤やＢＳＡなどのＰＣＲの促進因子についても、核酸のコンタミを規定した製品はなく、環境菌による汚染によってコンタミ核酸が含まれている場合があった。

これらのコンタミ核酸を反応系から除去するため、様々な核酸除去法が検討されており、ＤＮａｓｅを作用させて核酸を分解した後にＤＮａｓｅを加熱して変性させ不活性化する方法（非特許文献１）や紫外線を当て核酸を分解させる方法（非特許文献２）などが知られている。しかし、ＤＮａｓｅを用いる手法では、核酸除去後、ＤＮａｓｅが完全に熱変性しなかったために反応を阻害することがあったり、ＤＮＡがＤＮＡポリメラーゼと結合している場合はＤＮａｓｅがＤＮＡにうまく作用しなかったり、完全な核酸除去には至らない問題点があった。同様に、紫外線を用いる手法でも、紫外線がＤＮＡポリメラーゼにダメージを与えたり、完全に核酸を分解しきれなかったりする、といった問題が残っていた。

これらのことから、ＰＣＲの反応系において、反応性に影響せず、効率的にコンタミ核酸を除去する技術が求められていた。

ＷＯ２０１２−１０２２０８ ＥＰ２４９５３３８

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２００１ Ｄｅｃ；２２(２０)：４３１６−９. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ２１８， １９９３，３８１−３８８ Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００８， ７４(８)：２５３７. ＰＬＯＳ ＯＮＥ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ｉｓｓｕｅ ２，ｅ８２６２４

そこで、本発明はＰＣＲ反応液中の効率的な核酸除去法を提供する。より詳細には反応系に影響を及ぼすことなくコンタミ核酸を除去し、コンタミ核酸による擬陽性や非特異増幅を防ぐ方法を提供する。さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、ＰＣＲの擬陽性や非特異を防ぐＰＣＲ反応液中の核酸除去法および除去試薬を提供することにある。

前記目的を達成するための本発明の核酸除去法は、ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に光感受性架橋剤を作用させることを特徴とする核酸除去法である。

すなわち、本発明者はコンタミ核酸が含まれる（または、その可能性がある）ＰＣＲ反応液において、ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に光感受性架橋剤を作用させることで、コンタミ核酸を除去し、コンタミ核酸による増幅を防ぐことが可能になることを見いだし、本発明を成すに至った。

なお、本発明において光感受性架橋剤とはＥＭＡやＰＭＡなど光を当てることでＤＮＡと強く結合することが知られている試薬を示す。
ＥＭＡやＰＭＡなどは死菌と生菌を区別するために使用されているが、このようなＤＮＡと強固に結合する試薬はＰＣＲを阻害すると考えられ、通常、ＰＣＲ前に除去する（非特許文献３）か、十分に希釈して使用している（特許文献１）。また、光感受性架橋剤を作用させたポリメラーゼの核酸除去を実施した例（非特許文献４）があるが、こちらについても、精製工程を追加し、光感受性架橋剤を除いた後にＰＣＲを行っている。
そのため、ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に光感受性架橋剤を添加し、前記溶液中で光を照射し光感受性架橋剤を作用させた例は報告されていない。

代表的な本願発明は以下の通りである。
［項１］
ＰＣＲ反応液に含まれるコンタミナント核酸の除去方法であって、前記ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液中で光感受性架橋剤を加え、光エネルギーを作用させる工程を含む方法。
［項２］
光エネルギーを作用させる手段が可視光線の照射である、項１に記載の方法。
［項３］
コンタミナント核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、項１または項２に記載の方法。
［項４］
光感受性架橋剤が、エリジウムモノアジド（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド(ＰＭＡ)、ＥＭＡ誘導体およびＰＭＡ誘導体からなる群から選ばれる１つ以上である、項１〜項３のいずれかに記載の方法。
［項５］
ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に含まれるＥＭＡおよびＥＭＡ誘導体を合計した濃度が２μｇ／ｍｌ以上である、項４に記載の方法。
［項６］
ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に含まれるＰＭＡおよびＰＭＡ誘導体を合計した濃度が１μＭ以上である、項４に記載の方法。
［項７］
項１〜項６のいずれかに記載の方法で核酸除去を実施するための試薬。
［項８］
項１〜項６のいずれかに記載の方法で核酸除去を実施したＰＣＲ反応液。
［項９］
項１〜項６のいずれかに記載の方法で得られたＰＣＲ反応液にプライマーを添加し、遺伝子増幅を行う方法。

本発明によって、ＰＣＲ反応液に存在するコンタミナント核酸を除去することができる。ＰＣＲ反応液への核酸のコンタミネーションは特に微生物同定において大きな問題となっていた。本発明は、正確な微生物同定を可能にし、特に臨床分野において非常に役立つ技術といえる。その他、生活用水や食品、化粧品などの品質管理分野においても広く利用することができる。

ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応への阻害効果（ＴａｑのＰＣＲ） ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応への阻害効果（ＫＯＤのＰＣＲ） ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応液中のコンタミ核酸除去（ＴａｑのＰＣＲ） ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応への阻害効果（ＫＯＤのＰＣＲ） ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応への阻害効果（ＴＴＨのＰＣＲ） ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるコンタミ核酸除去能の評価 ＰＣＲ因子へのコンタミ核酸の確認

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本発明の実施形態の一つは、ＰＣＲ反応液に含まれるコンタミナント核酸の除去方法であって、前記ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液中で光感受性架橋剤を加え、光エネルギーを作用させる工程を含む方法である。

本発明における光感受性架橋剤は特に限定されないが、例えば、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）、ソラーレン化合物（ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、４’−ＡＭＤＭＩＰ（４’−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−４，５’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、ＡＭＩＰ（５−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、５−ＭＩＰ（５−ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、８−メトキシソラーレンなど）、ヨウ化プロピジウム、ＥＭＡ誘導体（例えば特許文献２に記載されたもの）およびＰＭＡ誘導体（例えば特許文献２に記載されたもの）からなる群から選ばれる１つ以上である。好ましくはＥＭＡ、ＰＭＡまたはそれらの誘導体である。

本発明の核酸除去法において、光感受性架橋剤に光エネルギーを作用させる手段は、特に限定されない。光エネルギーとしては、可視光線、紫外線、赤外線が挙げられ、これらを光感受性架橋剤に照射することにより、光エネルギーを作用させることができる。
可視光線を照射する場合、光照射処理に使用される光の波長は特に限定されないが、例えば、３５０〜７００ｎｍの波長の単波長光、又は、３５０〜７００ｎｍの波長を含む多波長光が使用できる。光照射処理の光強度及び照射時間は、使用する光感受性架橋剤、光源に応じて適宜設定することが可能であるが、例えばＥＭＡを使用する場合、１〜１０００Ｗのランプを使用し、試料との距離を１〜５０ｃｍに設定し１〜２０分間照射する条件で光照射処理を実施できる。さらに消費電力が少なく強光度のＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）ランプが開発されており、本発明に使用できる。また、本発明の光照射処理は氷上で実施するなど低温で行うことが好ましい。

本発明における光感受性架橋剤の濃度は、例えば、ＥＭＡまたはＥＭＡ誘導体であればそれらを合計した濃度が２μｇ／ｕｌ以上であることが望ましい。またＰＭＡまたはＰＭＡ誘導体であればそれらを合計した濃度が１μＭ以上であることが望ましい。
一方、ＥＭＡおよびＥＭＡ誘導体を合計した濃度の上限は５０μｇ／ｕｌ以下であることが望ましい。またＰＭＡおよびＰＭＡ誘導体を合計した濃度の上限は１０μＭ以下であることが望ましい。好ましくは、ＥＭＡおよびＥＭＡ誘導体を合計した濃度の上限が２０μｇ／ｕｌ以下であることが望ましい。またＰＭＡおよびＰＭＡ誘導体を合計した濃度の上限は４μＭ以下であることが望ましい。

本発明の核酸除去法が適用されるＰＣＲ反応液には、ＲＴ−ＰＣＲ反応液も含まれる。
本発明の核酸除去法において、ＰＣＲ反応液またはＲＴ−ＰＣＲ反応液の組成は特に限定されない。例えば、以下の（ａ）から（ｅ）を含む組成が挙げられる。
（ａ）緩衝剤
（ｂ）金属塩
（ｃ）ｄＮＴＰｓ
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｅ）光感受性架橋材

前記組成において、（ａ）から（ｄ）はそれぞれ特に限定されない。
（ａ）緩衝剤としては、トリス（Ｔｒｉｓ）やビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。
（ｂ）金属塩としては、マグネシウム、マンガン、カリウムなどが挙げられる。
（ｃ）ｄＮＴＰｓとしては、例えばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰが適宜好ましいバランスで含まれていれば良いが、それ以外のものを含んでいてもかまわない。例えばｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含ませることもできる。
（ｄ）ＰＣＲのＤＮＡポリメラーゼとしては、α型、ＰｏｌＩ型のいずれでもよく、α型であればＫＯＤ、Ｐｆｕなど、ＰｏｌＩ型であればＴａｑ、ＴＴＨなどが挙げられる。前記のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列をさらに改変したものであってもよい。
ＲＴ−ＰＣＲのＤＮＡポリメラーゼとしては、上記のＤＮＡポリメラーゼとＭＭＬＶ由来のＲＴ酵素やＡＭＶ由来のＲＴ酵素などＲＴ（逆転写）活性をもつポリメラーゼを併用して用いても良い。またＴＴＨなどのＤＮＡ合成活性とＲＴ活性とを併せ持つＤＮＡポリメラーゼを用いても良い。

本発明の核酸除去法において、ＰＣＲ反応液またはＲＴ−ＰＣＲ反応液中で光感受性架橋剤を加えるタイミング、および、光エネルギーを作用させるタイミングは、前記の(ａ)〜（ｄ）の全てを含む組成に光感受性架橋剤を加え、光照射を行うことに限定されない。
例えば、前記の(ａ)〜（ｄ）のうちいずれか１つ以上を含む組成に光感受性架橋剤を加え、光照射を行った後に、欠けていたものを添加しても良い。この場合、光感受性架橋剤を加え、光照射を行った後に添加する成分は、コンタミがないことが予め確認されているものを用いることが好ましい。

本発明の別の実施形態は、前記の方法で核酸除去を実施するための試薬である。本発明の核酸除去法を実施するための試薬には光感受性架橋材とＰＣＲ試薬を含み、それ以外は特に限定されない。光感受性架橋剤としては、ＥＭＡ、ＰＭＡ、ソラーレン化合物、４’−ＡＭＤＭＩＰ、ＡＭＩＰ、５−ＭＩＰ、ヨウ化プロピジウム、ＥＭＡ誘導体およびＰＭＡ誘導体からなる群から選ばれる１つ以上が挙げられ、好ましくはＥＭＡ、ＰＭＡまたはそれらの誘導体である。その濃度は、特に限定されないが、ＥＭＡ、ＥＭＡ誘導体であれば、２μｇ／ｕｌ〜５０μｇ／ｕｌが好ましい。またＰＭＡまたはＰＭＡ誘導体であれば、１μＭ〜１０μＭが好ましい。
光架橋剤以外の成分については特に限定されない。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質やｄＵＴＰａｓｅ、ＰＣＮＡなどＰＣＲを促進する因子やＤＭＳＯ、グリセロールなどの特異性向上に関係する因子が含くまれていてもよい。
なお、本発明の試薬の形態は特に限定されず、いわゆるキットの形態も含まれる。

また、本発明の別の実施形態は、前記の方法で核酸除去を実施したＰＣＲ反応液であり、さらには、前記のＰＣＲ反応液にプライマーを添加し遺伝子増幅を行う方法である。本発明における核酸除去を実施したＰＣＲ反応液とは、光感受性架橋材を作用させ核酸除去を行ったＰＣＲ反応液であり、それ以外は特に限定されない。なお、本発明のＰＣＲ反応液の形態は特に限定されず、いわゆるキットの形態も含まれる。

以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載はいかなる面においても本発明を限定しない。
（実施例１）
ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応への阻害効果
Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｑ）、または、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＫＯＤ）を用いてＨｂｇ遺伝子７４６ｂｐを増幅するＰＣＲの反応系に、それぞれＥＭＡやＰＭＡを添加し、阻害が生じる濃度を確認した。

ＴａｑのＰＣＲ反応系にはｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）とＡｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）と混合したものを用いた。
ＰＣＲ反応液に光感受性架橋剤を加えて光エネルギーを作用させた光照射サンプルを、以下の手順で作製した。
（１）１×ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含むＰＣＲ反応液を作製した。
（２）前記（１）で作製した反応液に、滅菌水で溶解したＥＭＡ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を終濃度１００、５０、２０、１０、５、２、０μｇ／ｍｌになるように、またはＰＭＡ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を２０、１０、４、２、１、０．４、０μＭになるように加えた。
（３）その後、前記（２）で作製した液に対し、ハロゲンランプ（岩崎電気）を用い、照射距離２０ｃｍで５分間の光照射をした。
（４）前記で得られた光照射サンプル５０μｌに、１０ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１および２）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加することで５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
反応は９４℃、２分の前反応の後、９４℃、１０秒→６２℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。

ＫＯＤのＰＣＲ反応系にはＫＯＤ−ＰＬＵＳ−Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。
光照射サンプルは、ＰＣＲ反応液を以下の（１）の手順で作製する以外は、前記のＴａｑの場合と同様に行った。
（１）１×添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１Ｕの酵素を含むＰＣＲ反応液を作製した。
反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。

前記で作製したＴａｑまたはＫＯＤのＰＣＲ反応系を用いてそれぞれ反応終了後、ＭａｌｔｉＮＡ（島津製作所）をもちいて、ＤＮＡ−１０００のゲルで泳動を行い、７４６ｂｐ付近のＤＮＡ断片を確認した。
その結果、ＴａｑのＰＣＲではＥＭＡで２０μｇ／ｍｌ、ＰＭＡでは４μＭ以上で阻害により増幅が見られなかった（図１）。一方、ＫＯＤのＰＣＲでは、Ｔａｑより阻害に強く、ＥＭＡでは２０μｇ／ｍｌ、ＰＭＡでは４μＭまでは増幅が確認された。それ以上の濃度になるとＫＯＤでも阻害が生じる結果となった（図２）。これらの濃度以下であれば、Ｔａｑ、ＫＯＤそれぞれの反応系を阻害せずＰＣＲを実施できることが示された。

（実施例２）
ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応液中のコンタミ核酸除去（ＴａｑのＰＣＲ）
ＴａｑのＰＣＲにおいて、阻害の生じなかったＥＭＡ終濃度２μｇ／ｍｌ、および５μｇ／ｍｌ、ＰＭＡ終濃度１μＭ、および０．４μＭでＰＣＲ反応系にコンタミするバクテリア由来の核酸を除去できるか検討した。
通常、バクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ共通領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲを実施するとテンプレートを入れていないコントロール（ＮＴＣ）でも増幅が見られる。コンタミ核酸が除去されていればＮＴＣで増幅が確認できないはずである。
検討は実施例１と同様、ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）とＡｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）と混合したものを用いた。ＰＣＲ反応液に光感受性架橋剤を加えて光エネルギーを作用させた光照射サンプルは、１×ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含むＰＣＲ反応液に、滅菌水で溶解したＥＭＡ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を終濃度５、２μｇ／ｍｌになるように、またはＰＭＡ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を１、０．４μＭになるように加え光照射サンプルを調製した。その後、ハロゲンランプ（岩崎電気）を用い、照射距離２０ｃｍで５分間の光照射をし、１６Ｓ ｒＲＮＡ共通領域を増幅する１０ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３および４）を添加することで５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。光感受性架橋材を含まないコントロール、および光感受性架橋材による阻害を確認するため、光照射後、５ｎｇのＥ．ｃｏｌｉゲノムを添加したコントロールも同時に実施した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９４℃、１０秒→５０℃、１０秒→６８℃、１分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
それぞれ反応終了後、ＭａｌｔｉＮＡ（島津製作所）をもちいて、ＤＮＡ−１０００のゲルで泳動を行い、８００ｂｐ付近のＤＮＡ断片を確認した（図３）。

結果、光感受性架橋材を添加していないコントロールではＮＴＣでも増幅が確認された。これはＰＣＲ反応液中に含まれるコンタミ核酸によるものだと考えられる。またＥ．ｃｏｌｉゲノムを添加したコントロールではＥＭＡやＰＭＡを添加しても増幅が確認された。これはＥＭＡやＰＭＡによる阻害がないことが示される。一方、ＥＭＡを５、２μｇ／ｍｌ、ＰＭＡを１μＭ添加したものでは増幅が見られず、コンタミした核酸を除去できたことがわかった。ＰＭＡを０．４μＭ添加したものでは、薄く増幅が見られている。これは光感受性架橋材の作用が不十分でコンタミ核酸が完全に除去できなかったことが示唆される。

（実施例３）
ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応液中のコンタミ核酸除去（ＫＯＤのＰＣＲ）
Ｔａｑと同様、ＫＯＤのＰＣＲにおいても、阻害の生じなかったＥＭＡ終濃度２０μｇ／ｍｌ、ＰＭＡ終濃度４μＭでＰＣＲ反応系にコンタミするバクテリア由来の核酸を除去できるか検討した。
検討は、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）用いた。１×添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１Ｕの酵素を含むＰＣＲ反応液に滅菌水で溶解したＥＭＡ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように、またはＰＭＡ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を４μＭになるように加え光照射サンプルを調製した。その後、ハロゲンランプ（岩崎電気）を用い、照射距離２０ｃｍで５分間の光照射をし、１６Ｓ ｒＲＮＡ共通領域を増幅する１０ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３および４）を添加することで５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。光感受性架橋材を含まないコントロール、および光感受性架橋材による阻害を確認するため、光照射後、５ｎｇのＥ．ｃｏｌｉゲノムを添加したコントロールも同時に実施した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→５０℃、１０秒→６８℃、１分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
それぞれ反応終了後、ＭａｌｔｉＮＡ（島津製作所）をもちいて、ＤＮＡ−１０００のゲルで泳動を行い、８００ｂｐ付近のＤＮＡ断片を確認した（図４）。

結果、実施例２と同様、光感受性架橋材を添加していないコントロールではＮＴＣでも増幅が確認された。これはＰＣＲ反応液中に含まれるコンタミ核酸によるものだと考えられる。またＥ．ｃｏｌｉゲノムを添加したコントロールではＥＭＡやＰＭＡを添加しても増幅が確認された。これはＥＭＡやＰＭＡによる阻害がないことが示される。一方、ＥＭＡを２０μｇ／ｍｌ、ＰＭＡを４μＭ添加したものでは増幅が見られず、コンタミした核酸を除去できたことがわかった。

（実施例４）
ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるＰＣＲ反応液中のコンタミ核酸除去（ＴＴＨのＰＣＲ）
ＴＴＨ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＴＨ）はマンガン存在下で逆転写活性を保持しており、ＲＮＡからの増幅が可能である。コンタミ核酸がＲＮＡでも除去できるのか、ＴＴＨを用いて検討した。
検討は、ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。２×のＭａｓｔｅｒＭｉｘに滅菌水で溶解したＥＭＡ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を終濃度１０、５μｇ／ｍｌになるように、またはＰＭＡ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を２、１μＭになるように加え光照射サンプルを調製した。その後、ハロゲンランプ（岩崎電気）を用い、照射距離２０ｃｍで５分間の光照射をし、１６Ｓ ｒＲＮＡ共通領域を増幅する１０ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３および４）を添加することで５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。光感受性架橋材を含まないコントロール、および光感受性架橋材による阻害を確認するため、光照射後、５ｎｇのＥ．ｃｏｌｉゲノムを添加したコントロールも同時に実施した。反応は９０℃、１５秒、５０℃、２０分の逆転写反応の後、９５℃、３０秒の前反応、９５℃、１０秒→５０℃、１０秒→７６℃、１分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＲＴ−ＰＣＲを行った。
それぞれ反応終了後、ＭａｌｔｉＮＡ（島津製作所）をもちいて、ＤＮＡ−１０００のゲルで泳動を行い、８００ｂｐ付近のＤＮＡ断片を確認した（図５）。

結果、光感受性架橋材を添加していないコントロールではＮＴＣでも増幅が確認された。これはＰＣＲ反応液中に含まれるコンタミ核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）によるものだと考えられる。またＥ．ｃｏｌｉゲノムを添加したコントロールではＥＭＡやＰＭＡを添加しても増幅が確認された。これはＥＭＡやＰＭＡによる阻害がないことが示される。一方、ＥＭＡを１０、５μｇ／ｍｌ、ＰＭＡを２、１μＭ添加したものでは増幅が見られず、コンタミした核酸を除去できたことがわかった。今回の結果で反応系に含まれるＲＮＡにも光感受性架橋材が作用することが示された。

（実施例５）
ＥＭＡ、ＰＭＡにおけるコンタミ核酸除去能の評価
ＥＭＡ、ＰＭＡでどの程度の核酸が除去できるかを確認した。
検討にはＫＯＤ ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、１×添付のＢｕｆｆｅｒ、４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｕの酵素を含むＰＣＲ反応液にヒトゲノム（Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ１０、１、０．１ｎｇ加え、滅菌水で溶解したＥＭＡ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように、またはＰＭＡ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を４μＭになるように添加し光照射サンプルを調製した。その後、ハロゲンランプ（岩崎電気）を用い、照射距離２０ｃｍで５分間の光照射をし、Ｈｂｇ領域４８１ｂｐを増幅する１０ｐｍｏｌのプライマー（配列番号５および６）を添加することで５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。光感受性架橋材を含まないコントロールも同時に実施し、光照射をせずにＰＣＲするコントロールも実施した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
それぞれ反応終了後、ＭａｌｔｉＮＡ（島津製作所）をもちいて、ＤＮＡ−１０００のゲルで泳動を行い、４８１ｂｐ付近のＤＮＡ断片を確認した（図６）。

結果、光照射をせずにＰＣＲしたコントロールでは、ＥＭＡやＰＭＡが含まれていても１０、１、０．１ｎｇのヒトゲノムからそれぞれＨｂｇの４８１ｂｐの増幅が確認できた。これはこの濃度ではＥＭＡやＰＭＡによるＰＣＲの阻害がないことが示される。一方、光照射した方では、光感受性架橋材が含まれていないコントロールは１０、１、０．１ｎｇのヒトゲノムからそれぞれＨｂｇの４８１ｂｐの増幅が確認できるのに対し、ＥＭＡ、ＰＭＡが含まれたサンプルでは増幅が確認できなかった。これはＥＭＡ、ＰＭＡによって核酸が除去されたことを示す。通常、１０ｎｇを超えるゲノムがコンタミすることは考えにくいが、本発明を使えば１０ｎｇ程度のコンタミであれば完全に除去できることが示された。

（実施例６）
ＰＣＲ因子へのコンタミ核酸の確認
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）におけるコンタミが、どの因子からの持込みか確認した。
［１］２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１Ｕの酵素を含むＰＣＲ反応液
［２］１×添付のＢｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１Ｕの酵素を含むＰＣＲ反応液
［３］１×添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｕの酵素を含むＰＣＲ反応液
［４］１×添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含むＰＣＲ反応液
の、それぞれに滅菌水で溶解したＥＭＡ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように加え光照射サンプルを調製した。その後、ハロゲンランプ（岩崎電気）を用い、照射距離２０ｃｍで５分間の光照射をし、［１］には添付のＢｕｆｆｅｒを１×になるように、［２］には２ｍＭ ｄＮＴＰを、［３］には１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４を、［４］には１Ｕの酵素を加え、さらに１６Ｓ ｒＲＮＡ共通領域を増幅する１０ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３および４）を添加することで５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。光感受性架橋材を含まないコントロールも同時に実施した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→５０℃、１０秒→６８℃、１分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
それぞれ反応終了後、ＭａｌｔｉＮＡ（島津製作所）をもちいて、ＤＮＡ−１０００のゲルで泳動を行い、８００ｂｐ付近のＤＮＡ断片を確認した（図７）。

結果、ＥＭＡを含まないコントロールでは実施例３と同様、増幅が確認された。一方、ＥＭＡを添加し核酸を除去したものでは、ｄＮＴＰを後入れした［２］と、酵素を後入れした［４］とでのみ増幅が確認された。これはｄＮＴＰｓと酵素にコンタミ核酸が存在していたことを示す。
今回のようにポリメラーゼだけでなく、ｄＮＴＰｓなどのＰＣＲ因子にコンタミがある場合、ポリメラーゼをいくら精製してもＮＴＣで増幅が生じることになる。本発明はＰＣＲ反応系に存在する核酸を除去できる面で非常に有効だといえる。

本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、特にＤＮＡ合成に関わる技術関連において有用である。

Claims (11)

1. ＰＣＲ反応液に含まれるコンタミナントＲＮＡ核酸の除去方法であって、前記ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液中（但し、該溶液がＥＡ１プロテイナーゼを含む場合を除く）に光感受性架橋剤を加え、光エネルギーを作用させる工程を含む方法。
2. 光エネルギーを作用させる手段が可視光線の照射である、請求項１に記載の方法。
3. 光感受性架橋剤が、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド(ＰＭＡ)、ＥＭＡ誘導体およびＰＭＡ誘導体からなる群から選ばれる１つ以上である、請求項１又は２に記載の方法。
4. ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に含まれるＥＭＡおよびＥＭＡ誘導体を合計した濃度が２μｇ／ｍｌ以上である、請求項３に記載の方法。
5. ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に含まれるＥＭＡおよびＥＭＡ誘導体を合計した濃度が２０μｇ／ｍｌ以下である、請求項３又は４に記載の方法。
6. ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に含まれるＰＭＡおよびＰＭＡ誘導体を合計した濃度が１μＭ以上である、請求項３に記載の方法。
7. ＰＣＲ反応液を構成する少なくとも１つ以上の成分を含む溶液に含まれるＰＭＡおよびＰＭＡ誘導体を合計した濃度が４μＭ以下である、請求項３又は６に記載の方法。
8. ＰＣＲ反応液が、α型ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを更に含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. ＰＣＲ反応液が、好熱性プロテイナーゼを含む場合を除く、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 請求項１〜請求項９のいずれかに記載の方法でコンタミナントＲＮＡ核酸除去を実施するための光感受性架橋剤を含む試薬。
11. 請求項１〜請求項９のいずれかに記載の方法で得られたＰＣＲ反応液にプライマーを添加し、遺伝子増幅を行う方法。