JP6482467B2 - ２５０未満の塩基対を含むｄｎａミニサークルのインビトロ産生 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡ湾曲タンパク質の存在下における直線状のニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドのワンポットリガーゼ媒介性環状化反応を介する、ＤＮＡミニサークルのインビトロの産生のための改善された方法に関する。本発明は、２５０未満の塩基対を有するスーパーコイルＤＮＡミニサークルおよび遺伝子療法適用におけるそれらの使用にも関する。

ＤＮＡミニサークルは、基礎調査研究のため、ならびにナノテクノロジーおよび核酸医薬品における複数の適用のために非常に興味深いナノ物体である。二本鎖または一本鎖のいずれかのＤＮＡミニサークルは、成長中の研究分野である構造ＤＮＡナノテクノロジーにおけるナノスケールの構成物体として使用することができる。例えば、ＤＮＡミニサークルをスキャフォールドとして使用して、Ｇ−四重鎖、ＲＮＡヘアピン、または広範囲の官能基を備えた分子素子を生成する可能性をもたらす化学的に官能化されたオリゴヌクレオチドの取り込み後に、ナノ構造を集合させる。構造材料中で制御された湾曲を生成する能力は、ナノマシン構成のために開拓された重要な特色である。ＤＮＡナノ構造のこの生物学的適用は、多量のＤＮＡミニサークル構成材料を必要とする非常に歴史の浅い研究分野である。

ＤＮＡミニサークルは、遺伝子療法アプローチにおける新規の生物学的に活性のある核酸分子としても有望な適用を有する。特に、ＤＮＡミニサークルは、他の遺伝子の機能を変化させることなく、転写調節におけるキープレーヤー（すなわち転写因子）の阻害を介して重要な遺伝子の発現をブロックするという面白い可能性を提供するので、特異的遺伝子発現の阻害剤として使用することができる。特に、生物学的液体中での環状核酸の送達は、直線状のオリゴヌクレオチドと比較して、複数の長所（エキソヌクレアーゼへの抵抗性による安定性の増加等）を提示することも公知である。ＤＮＡのサイズの減少が、細胞ＤＮＡトランスフェクションおよびトラフィッキングの改善によって、遺伝子療法アプローチにおいて有益であることもかなり認識されている（Ｌｕｋａｃｓ，Ｇ．Ｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１６２５−１６２９；Ｋｒｅｉｓｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７，３７９２−３７９８）。

さらに、ＤＮＡスーパーコイル化はＤＮＡ依存性細胞プロセスにおける関連の構造特徴である（Ｋａｎａａｒ，Ｒ．ａｎｄ Ｃｏｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｎ．Ｒ．，１９９２ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，３６９−３７９；Ｂａｒａｎｅｌｌｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １８１９，６３２−６３８）。ＤＮＡミニサークルは、基本的なＤＮＡ依存性トランザクション（転写、複製および組換え等）の間に形成されるＤＮＡループを模倣するという長所を提示する。したがって、スーパーコイルミニサークルの使用は、ＤＮＡ代謝に関与するタンパク質（例えば転写因子および修復タンパク質）の結合および活性に対する生物学的関連性の高次ＤＮＡ構造の調査を支援することができる。

インビボの部位特異的組換えのためにデザインされたプラスミドの使用は、ＤＮＡについてミリグラム量でスーパーコイルを含有するミニサークルの産生を可能にする（Ｆｏｇｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｎｄｅｎｓ．Ｍａｔｔｅｒ １８，Ｓ１４５− Ｓ１５９）が、化学的に官能化されたミニサークルの直接的な産生は細胞内でのミニサークル産生の結果として不可能である。さらに、カスタマイズされたＤＮＡ配列の導入のためのこのアプローチの多用性は、大きな労働力を要する方法および組換え効率に対する配列依存性の予測不能な負の効果の可能性ならびに２５０ｂｐ未満の短いＤＮＡ断片の産生が非能率的であることによって限定されている。Ｈｅｉｎｅ ｅｔ ａｌ．は、直線状の基質（制限酵素によるプラスミド消化および精製工程後に得られる）を、リガーゼ酵素を使用して環状化してリラックス環状ＤＮＡを産生する、ＤＮＡミニサークルの産生のための半合成方法を記述した（インターネットで検索可能なポスターで：ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ．ｄｅ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／Ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｐｏｓｔｅｒ／Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ−Ｐｏｓｔｅｒ−ｌｎ−Ｖｉｔｒｏ−２０１１ Ｈａｎｄｏｕｔ．ｐｄｆ）。ＤＮＡジャイレースはＤＮＡの誘導のために環状化工程後に使用することができる。しかしながら、この方法は、２５０塩基対までのミニサークルの産生を記述しない。

実際、かかるＤＮＡ長が、持続長（約１５０ｂｐ／５０ｎｍ、持続長は内因的なＤＮＡ柔軟性に関する剛性を特徴づける尺度である）の付近にあるので、２５０塩基対（ｂｐ）までの短い直線状ＤＮＡ断片からミニサークルを構築することおよびランダム配列を含有させることは、困難なままである。結果として、ＤＮＡの低濃度の範囲（１ｎＭ未満）でさえ、ＤＮＡ二重らせん間の競争的な二分子反応および多分子反応の収率と比較して、一分子反応（すなわち酵素によるライゲーションによる両方のＤＮＡ端部の閉鎖によるＤＮＡの環状化）の収率は劣る。結果的に、実際少数のインビトロの方法だけが、２５０ｐｂ未満の直線状ＤＮＡ断片のリガーゼ媒介性環状化について報告している。

湾曲タンパク質の非存在下において、内因的な湾曲性を賦与する特異的配列（いわゆるアデニントラクト）を使用して、環状化反応の効率のわずかな増加が達成されたが、対象となるＤＮＡ配列（タンパク質認識のためのコンセンサス配列等）を自由に取り込む可能性を失うという欠点があった（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ａｎｄ Ｃｒｏｔｈｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，３１６１−３１６６）。別のインビトロの戦略は、ミニサークル形成の全収率を増加させるために、一本鎖領域のハイブリダイゼーションを可能にする非常に長い付着端を備えたＤＮＡ基質を用いたが、環状化反応において使用されるＤＮＡが低濃度であること、および大きな労働力を要する調製工程は、ミニサークルの量的産生にとって重要な短所のままである（Ｄｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６，１１２０−１１２８）。

ＤＮＡ湾曲タンパク質の存在下において、ランダム配列ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼ依存性環状化反応において使用して、様々な構成上のタンパク質がＤＮＡの湾曲／柔軟性を誘導する能力を決定した。しかしながら、直線状ＤＮＡ基質のナノモル濃度の範囲はミニサークル産生の可能性に関して限定となる。最後に、本出願人の知る限りでは、上述の無細胞系の方法のどれも、スーパーコイル低分子ＤＮＡミニサークルをもたらす可能性を示さなかった。
したがって、制御されたスーパーコイルおよびカスタマイズされたＤＮＡ配列を備えた約２５０塩基対までの長さのＤＮＡミニサークルの定量的および効率的な産生を可能にする方法がまだ必要である。

Ｌｕｋａｃｓ，Ｇ．Ｌ他著「２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１６２５−１６２９」 Ｋｒｅｉｓｓ，Ｐ．他著「１９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７，３７９２−３７９８」 Ｋａｎａａｒ，Ｒ．及びＣｏｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｎ．Ｒ著「１９９２ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，３６９−３７９」 Ｂａｒａｎｅｌｌｏ，Ｌ．他著「２０１２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １８１９，６３２−６３８」 Ｆｏｇｇ，Ｊ．Ｍ．他著「２００６，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｎｄｅｎｓ．Ｍａｔｔｅｒ １８，Ｓ１４５− Ｓ１５９」 Ｚｈａｎｇ，Ｙ．及びＣｒｏｔｈｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．著「２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，３１６１−３１６６」 Ｄｕ，Ｑ．他著「２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６，１１２０−１１２８」 ｈｔｔｐ：／／ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ．ｄｅ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／Ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｐｏｓｔｅｒ／Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ−Ｐｏｓｔｅｒ−ｌｎ−Ｖｉｔｒｏ−２０１１ Ｈａｎｄｏｕｔ．ｐｄｆ

本出願人は、ＤＮＡ構造変動の導入によってデザインされそして湾曲タンパク質の存在下におけるリガーゼ媒介性環状化反応で使用されるＤＮＡ基質によって、上昇させたＤＮＡ濃度でのＤＮＡ環状化反応が初期のＤＮＡ構造的変動を欠いたミニサークルを最終的に産出することができることを、ここで見出した。これは、任意の塩基の組成および位置の配列を備えたＤＮＡミニサークルのワンポット産生を可能にする革新的な多用性のある方法である。本方法は、２５０未満の塩基対を含み、リラックスまたはスーパーコイルの状態を賦与され、多様な部位特異的配置の化学修飾を含有し、最終的には生物学的および生物化学的な適用のためのミニサークルの直接的官能化を可能にするＤＮＡミニサークルを調製する機会も与える。

したがって、本発明は、
ａ）少なくとも１つのリン酸化５’末端を有するニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質を提供する工程と、
ｂ）前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質およびＤＮＡ湾曲タンパク質を含む反応混合物上でリガーゼ媒介性環状化を実行する工程と、
ｃ）ＤＮＡミニサークルを得る工程と
を含む、ＤＮＡミニサークルのインビトロの産生のための方法に関する。

本発明に記載の方法の特定の実施形態において、工程ａ）で提供されたニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質は２つのリン酸化５’末端を有し、工程ｃ）で得られたかまたは回収されたＤＮＡミニサークルは二本鎖の閉鎖されたリラックスミニサークルである。

本発明の方法の別の特定の実施形態において、工程ａ）で提供されたニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質はただ１つのリン酸化５’末端を有し、工程ｃ）で得られたかまたは回収されたＤＮＡミニサークルは一本鎖ＤＮＡミニサークルである。

さらに別の特定の実施形態において、本発明の方法は、
ａ）ただ１つのリン酸化５’末端を有するニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質を提供する工程と、
ｂ）前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質およびＤＮＡ湾曲タンパク質を含む反応混合物上でリガーゼ媒介性環状化を実行する工程と、
ｃ）ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルを得る工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られたニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルへキナーゼを添加する工程と、
ｅ）ＤＮＡインターカレーターの存在下において前記ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルをライゲーションする工程と、
ｆ）スーパーコイルＤＮＡミニサークルを得る工程と
を含む。

本発明によれば、少なくとも１つのリン酸化５’末端を有するニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質は、１つもしくは複数のタンパク質推定結合部位および／またはＤＮＡ結合部位および／または１つもしくは複数の化学官能性および／または１つもしくは複数のＤＮＡ塩基ミスマッチを含み得る。

２５０未満の塩基対を含み、１つもしくは複数のタンパク質推定結合部位および／またはＤＮＡ結合部位および／または１つもしくは複数の化学官能性および／または１つもしくは複数のＤＮＡ塩基ミスマッチを恐らく示すスーパーコイルＤＮＡミニサークルも、本発明の目的である。

本発明の別の目的は、遺伝子療法適用におけるデコイ薬剤としての使用のための本発明に記載のＤＮＡミニサークルである。

本発明は、
ａ）ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質の産生のための一本鎖相補的重複オリゴデオキシヌクレオチドと、
ｂ）ＨＭＧボックスファミリーからのＤＮＡ湾曲タンパク質と、
ｃ）リガーゼと
を含む、ＤＮＡミニサークルのインビトロの産生のためのキットにも関する。

本発明は、遺伝子療法適用におけるデコイ薬剤としての本発明に記載のＤＮＡミニサークルにも関する。

最後に、本発明は、ＤＮＡ結合試験のための基質としての本発明に記載のＤＮＡミニサークルの使用に関する。

（Ａ）ミニサークル産生のための重複平滑末端のニックの入ったＤＮＡ基質によるＤＮＡ環状化の方法を図示するスキーム。（Ｂ）一本鎖ミニサークル（経路１）またはリラックスもしくはスーパーコイルの二本鎖ＤＮＡミニサークル（経路２）のいずれかの産生のために順々に使用することができる単一ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルの産生を示すスキーム。 適切な相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成され、図１中に図示されるようなミニサークル産生のための本発明の環状化方法において使用される直線状のニックの入った平滑末端二重鎖Ｄ１〜Ｄ６。両鎖の糖−リン酸骨格は黒矢印によって示された位置でニックが入る。 図１中で図示されるように形成された直線状のニックの入った平滑末端二重鎖Ｄ９〜Ｄ１３。両鎖の糖−リン酸骨格は黒矢印によって示された位置でニックが入る。転写因子コンセンサス配列の存在は、太字（ＮＦ−κＢ：ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ；ＥＴＳ１：ＧＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣ；ＳＴＡＴ３：ＴＴＣＣＣＧＴＡＡ）で示され、ヒトテロメア配列に下線が引かれる。Ｇ／Ｔミスマッチの存在は大きいサイズの文字によって示される。 図１中で図示されるように形成された直線状のニックの入った平滑末端二重鎖Ｄ１４〜Ｄ２１。両鎖の糖−リン酸骨格は黒矢印によって示された位置でニックが入る。オリゴヌクレオチド内の化学塩基修飾の存在は以下の通り示される：ビオチンｄＴ（▲）；シアニン３ ｄＴ（図では、「クラブ」のマーク）；カルボキシフルオレセインｄＴ（■）；８−オキソグアニン（ｘ）。 １つ（Ａ）または２つ（Ｂ）のＮＦ−κＢ結合配列を含むようにデザインされた９５ｂｐのリラックスＤＮＡミニサークルは、ＥＭＳＡによって示されるようにそれぞれ１つまたは２つのＮＦ−κＢタンパク質と相互作用することが可能である。 ヒト血清中のミニサークル安定性。核酸は３７℃で時間の関数としてヒト血清と共にインキュベーションされた。各々のタイムポイントは、ゲル電気泳動によって分析される出発の核酸量に対応する。曲線は、単一指数関数へフィッティングさせたものを表わす。データーポイントおよびエラーバーは少なくとも３つの実験からの平均および標準偏差（それぞれ）を表わす（菱形：スーパーコイルプラスミド；正方形：直線状の二本鎖ＤＮＡ；三角形：リラックスミニサークル；円：スーパーコイルミニサークル）。 様々なＤＮＡサンプルの電気泳動の実行を提示する染色された未変性ポリアクリルアミドゲルのイメージ。レーン１：商業的な分子量（ＭＷ）マーカー；レーン２：９５ｂｐ直線状ＤＮＡ二重鎖；レーン３：２０℃でのＴ４ ＤＮＡリガーゼによる１時間のインキュベーション後の９５ｂｐのＤＮＡ二重鎖；レーン４：９５ｂｐのニックの入った直線状ＤＮＡ二重鎖；レーン５：Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび２０℃での湾曲タンパク質Ａｂｆ２ｐによる１時間インキュベーション後の９５ｂｐのニックの入ったＤＮＡ二重鎖。異なるバンドに対応する成分の性質は右側に示される。

ＤＮＡ持続長の範囲（２５０ｂｐ未満、特に１５０ｂｐ未満）において、出発の直線状ＤＮＡの内因的な湾曲性は酵素によるライゲーションによる効果的な環状化反応のためには弱すぎ、分子間反応（ＤＮＡ直線状マルチマー形成）が優勢であるので、非常に低いＤＮＡ濃度（ナノモル範囲中）で反応を実行する必要があり、したがってナノグラム量への生産の収率を限定する。本出願人は、以前に使用されたものよりも少なくとも２桁大きい規模のＤＮＡ濃度での酵素によるライゲーションによってＤＮＡの効果的な環状化（例えば高い収率で）を可能にする反応を本明細書でデザインした。本発明において、ＤＮＡ構造変動は、環状化反応の前に、環状化される直線状テンプレートＤＮＡ基質内に導入された。かかる構造はＤＮＡ湾曲タンパク質のＤＮＡ結合活性を増強し、それは次に初期のＤＮＡ構造変動が欠けたＤＮＡミニサークルの産生のために上昇させたＤＮＡ濃度で効果的なリガーゼ媒介性環状化反応を可能にする。したがって、この方法は、２５０未満の塩基対のＤＮＡミニサークル（リラックスまたはスーパーコイル）を、配列の限定なしに効率的に産生することを初めて可能にする。

１−本発明に記載の方法
本発明は、第一に
ａ）少なくとも１つのリン酸化５’末端を有するニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質を提供する工程と、
ｂ）前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質およびＤＮＡ湾曲タンパク質を含む反応混合物上でリガーゼ媒介性環状化を実行する工程と、
ｃ）ＤＮＡミニサークルを得る工程と
を含むＤＮＡミニサークルのインビトロの産生のための方法に関する。

言いかえれば、工程ｂ）において、少なくとも１つのリガーゼおよび少なくとも１つの湾曲タンパク質はニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質へ添加され、１工程でＤＮＡミニサークルを得ることを可能にする。実際、本発明に記載のリガーゼ媒介性環状化は酵素によるライゲーションである。本発明によれば、リガーゼは、１つの鎖の３’ヒドロキシル末端と他の鎖の５’ホスフェート末端との間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒することによって、ＤＮＡ鎖をともに連結することを促進する酵素である。ＤＮＡリガーゼ活性は広汎に研究されており、ニックの入ったＤＮＡ基質に結合されたヒストンタンパク質によって影響されないことが示され、これは、湾曲タンパク質がニックの入ったＤＮＡによるリガーゼ活性を損なわないだろうということを指摘する。２つの平滑末端、および相補的付着性配列のオーバーハングによって形成された重複領域を有するＤＮＡ断片をライゲーションすることができるＤＮＡリガーゼ酵素は、本発明に好都合である。本発明に記載の典型的なリガーゼはＡＴＰ依存性リガーゼである。特に、本発明に記載のリガーゼは、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼからなる群から選択することができる。例えば、付着末端または平滑末端をライゲーションすることができ、商業的に入手可能で安価なＴ４ ＤＮＡリガーゼは、本発明に良く適する。

本発明によれば、ＤＮＡミニサークルは、１ｋｂ未満のサイズの一本鎖または二本鎖の環状ＤＮＡ分子である。特に、本発明に記載のＤＮＡミニサークルは８０塩基対〜２５０塩基対（ｂｐ）未満の間からなる。２５０ｂｐ未満によって、本明細書において２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０ｂｐ未満が意図される。典型的には、本発明に記載のＤＮＡミニサークルは８０〜２００ｂｐの間、特に８０〜１５０ｂｐの間を含有する。

ＤＮＡ湾曲タンパク質によって、本明細書において、ＤＮＡの異なる立体配座状態と相互作用し、ＤＮＡ湾曲を誘導するタンパク質が意図される。本発明において使用されるような湾曲タンパク質は、実質的な配列特異性なし（非特異的配列結合）に、およびＤＮＡ化学結合（ＤＮＡ骨格）の開裂またはＤＮＡ鎖のライゲーションの誘導なしに、ＤＮＡに結合する。したがって、それらの機能的な活性のためにＤＮＡ鎖の切断を誘導する湾曲タンパク質（ジャイレース、トポイソメラーゼ、リコンビナーゼ、レゾルバーゼ）は、本発明に適さない。本発明に特に良く適するものは、容易かつ確実に産生され、異なる修飾（さらに詳述されるような化学基によって誘導されたものが含まれる）を含有するＤＮＡ基質上で活性能力を有するタンパク質である。典型的には、高移動度群（ＨＭＧ）からの配列非特異的タンパク質（ＮＳＳタンパク質）および原核生物タンパク質ＨＵを含む群から選択されるか、またはそれらからなる群からのＤＮＡ湾曲タンパク質が、本発明のために好適である。これには、ＨＭＧＢ１、ＮＨＰ６Ａおよびタンパク質Ａｂｆ２ｐ、特にタンパク質Ａｂｆ２ｐを含む群から選択されるか、またはそれらからなる群からのタンパク質が特に含まれる。

ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質は、それらが重複領域を形成するように１つの鎖あたりの少なくとも１つの内部ニックを有する二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。本発明に記載のかかるニックは図１で特に図示される。各々の鎖上の内部ニックによって形成される内部５’末端もリン酸化されることが指摘されるべきである。

ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質は、本出願の以下において重複二重鎖とも命名される。各々の鎖上の２つのニック間の重複領域（重複ニック間領域）は、典型的には１０〜２０ｂｐの間（より詳細には１２〜２０ｂｐの間）である。かかる重複サイズは安定的ハイブリダイゼーション領域を得ることを可能にする。ＤＮＡ二重鎖中のニックの存在は、二重らせんの若干の柔軟性の誘導を支援するＤＮＡ構造変動を導入し（Ｆｕｒｒｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＤＮＡ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６６，７１１−７２１；Ｐｒｏｔｏｚａｎｏｖａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２，７７５−７８５．）、したがって、それはＤＮＡ湾曲タンパク質の存在下における効果的なリガーゼ媒介性ＤＮＡ環状化のための本発明に記載の必要条件である。本発明によれば、少なくとも１つの内部ニックによって、重複二重鎖が１つの鎖あたり少なくとも１、２または３のニックを含有し得ることが意図される。典型的には、本発明に記載の重複二重鎖は、１つの鎖あたりおよび５０〜９５ヌクレオチドの部分あたり１つのニックを含有する。例えば、９５未満のヌクレオチドの重複二重鎖は１つの鎖あたり１つのニックを含有することができ、９５〜１８０ヌクレオチドを有する重複二重鎖は１つの鎖あたり１または２つのニックを含有することができ、９５〜１８０ヌクレオチドを有する重複二重鎖は１つの鎖あたり２または３つのニックを含有することができる。

本発明の特定の実施形態において、重複二重鎖は８０ｂｐを超え２５０ｂｐ未満を含有する。本明細書において、２５０ｂｐ未満によって、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０ｂｐ未満が意図される。典型的には、本発明に記載の重複基質は８０〜２５０ｂｐの間、より正確には８０〜２００ｂｐの間を含有する。いくつかの実例において、本発明に記載の重複基質は８４〜２００ｂｐの間を含有する。

本発明に記載のニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質は平滑末端を有する。本発明に記載のニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質は、例えば上述のように内部ニックを含有する対象となる出発平滑末端ＤＮＡ基質を形成するために、適切な重複一本鎖オリゴヌクレオチドを集合させることによって、商業的に入手可能なオリゴヌクレオチドで達成することができる。この文脈において、例えばオリゴヌクレオチド合成の古典的な化学的アプローチ（固相ホスホアミダイト方法等）によって得られるような４０〜６０ヌクレオチド長を含む商業的な一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明に良く適する。実際、本方法において合成オリゴヌクレオチドを使用する可能性は以下の複数の利点を有する。合成オリゴヌクレオチドは、大スケールおよび低価格で容易に製造され、化学修飾の有無にかかわらず配列情報の無限の組み合わせを保有する能力を示す。

本発明に記載の方法の工程ｃ）はＤＮＡミニサークルを得る（または回収する）ことである。

いくつかの実例において、得られるＤＮＡミニサークルは組成物の一部を形成する。典型的には、前記組成物はＤＮＡミニサークルを含有する反応混合物を含む。本方法の特定の実施形態において、前記組成物は得られたＤＮＡミニサークルを含有する反応混合物である。

他の実例において、本発明の単離されたＤＮＡミニサークルは、それが生じる複合反応混合物についても回収することができる。「単離された」核酸分子（例えば本明細書において使用される本発明に記載の単離されたＤＮＡミニサークル）とは、異なるトポロジー（直線状オリゴマー等）、サイズおよび／もしくは配列を含む他の核酸ならびに／またはワンポット反応混合物中に存在するタンパク質から分離されたものである。かかる単離された分子は、これらの他の核酸およびタンパク質から完全にまたは部分的に精製されている。本発明の単離された核酸分子は、存在するすべての巨大分子種およびタンパク質のうちの少なくとも約５０、８０または９０％（モルベースで）を構成することができる。単離されたＤＮＡミニサークルの回収は、当該技術分野の古典的技法に従って達成することができる。例えば、回収は、ＤＮＡ精製についてはエタノール沈殿によってまたはシリカビーズを使用して行なうことができる。

本方法の特定の実施形態において、ＤＮＡミニサークルを得る工程ｃ）は、少なくともプロテアーゼおよびヌクレアーゼからなる群、およびより詳しくはプロテアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群から選択される酵素の添加を含むことができる。典型的には、エキソヌクレアーゼの添加は、一本鎖ＤＮＡミニサークルを得るために、ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルのニックの入った鎖の排除を可能にする。

単離されたＤＮＡミニサークルが工程ｃ）で回収される場合、前記工程ｃ）は、反応混入物（典型的には反応からの核酸およびタンパク質である）を排除する補充のサブ工程も含み得る。ＤＮＡ混入物とは、典型的には異なるトポロジー（効果のない直線状ＤＮＡ、直線状オリゴマーおよびいくつかの実例においてニックの入った環状ＤＮＡミニサークルの鎖等）を含む核酸である。タンパク質混入物は、特にワンポット反応の間に使用される様々な酵素（リガーゼ、消化酵素およびキナーゼ等）に加えて、湾曲タンパク質である。したがって、反応混入物の排除は、少なくともプロテアーゼおよびヌクレアーゼからなる群から選択される酵素の添加を優先的に含む。いくつかの実例において、反応混入物の排除は、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つのヌクレアーゼの添加を含むことができる。前記少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つのヌクレアーゼは、同時にまたは連続して添加することができる。典型的には、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。他の実例において、反応混入物の排除はプロテアーゼの添加を含み、より特定の事例において、反応混入物の排除はプロテアーゼの添加である。

本発明によれば、ＤＮＡ混入物は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のリン酸ジエステル結合を切断できるヌクレアーゼ酵素によって除去することができる。本発明に従って良く適したヌクレアーゼは、５’端もしくは３’端からの、または直線状もしくは環状二本鎖ＤＮＡのギャップおよびニックでの、ヌクレオチド除去を開始できるヌクレアーゼである。本発明の実施形態に依存して、エキソヌクレアーゼ活性（すなわち、ポリヌクレオチド鎖の末端（エキソ）からひとつずつヌクレオチドを切断することによって作用する）のみを有するヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、またはエキソヌクレアーゼ活性および弱い一本鎖エンドヌクレアーゼ活性のみ（すなわち、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断する）を有するヌクレアーゼ（Ｔ５エキソヌクレアーゼ等）を使用することができる。本発明の特定の実施形態において、スーパーコイル二本鎖ＤＮＡを分解しないエキソヌクレアーゼ（Ｔ５エキソヌクレアーゼ）が好ましい。

本発明によれば、タンパク質混入物は、タンパク質分解（すなわち、タンパク質を形成するポリペプチド鎖中のアミノ酸をともに連結するペプチド結合の加水分解によるタンパク異化を開始する）を行うプロテアーゼの群からの酵素（セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等）によって除去することができる。タンパク質を消化し、核酸の調製物から混入を除去するために分子生物学において一般的には使用されるプロテアーゼ（広域スペクトラムセリンプロテアーゼ等）は、本発明に特に良く適する。自己消化活性を有する広域スペクトラムセリンプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ等であるが、これらに限定されない）は、本発明のために好都合である。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓの細胞外液から単離されたプロテイナーゼの商業的に入手可能な混合物であるプロナーゼ（登録商標）も、本発明に良好に好都合である。少なくとも１０のプロテアーゼがプロナーゼ混合物中にあり、５つのセリンタイププロテアーゼ、２つの亜鉛エンドペプチターゼ、２つの亜鉛ロイシンアミノペプチダーゼおよび１つの亜鉛カルボキシペプチダーゼである。プロナーゼによる消化は、タンパク質の大規模または完全な分解が要求される場合に有用であることが公知である。

優先的には、タンパク質およびＤＮＡ混入物の除去は、少なくともプロテアーゼおよび少なくともエキソヌクレアーゼの連続的な添加によって行なわれる。

本発明に記載の方法は、試薬濃度、インキュベーション時間および温度に関する具体的な特徴の決定が当業者の技能内で適切であるように、分子生物学の古典的技法において周知の酵素反応を含む。特に、本方法の異なる工程についての様々な成分の量は当業者によって適合されるだろう。典型的には、ＤＮＡ対湾曲タンパク質の比は０．５〜２であり、ＤＮＡ対リガーゼの比は２〜８である。より詳細には、ＤＮＡ／Ａｂｆ２ｐの比は０．５〜２の範囲であり、ＤＮＡ／Ｔ４リガーゼの比は２〜８の範囲である。

本発明に記載の方法の特定の実施形態において、本方法の工程ａ）で提供されたニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質は２つのリン酸化５’末端を有し、工程ｃ）で得られたＤＮＡミニサークルは二本鎖の閉鎖されたＤＮＡミニサークルである。かかるミニサークル産生のための１つの戦略は図１Ａ中で特に略述される。この戦略において、工程ｃ）は単離されたＤＮＡミニサークルの回収のための反応混入物の排除を含む。優先的には、反応混入物の排除は、少なくともプロテアーゼの連続的な添加、続いて少なくともエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の添加によって得ることができる。プロテアーゼの最終的な添加もエキソヌクレアーゼの排除のために必要とされ得る。

本発明の方法の別の特定の実施形態において、本方法の工程ａ）で提供されたニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質はただ１つのリン酸化５’末端を有し、工程ｃ）で得られたＤＮＡミニサークルは一本鎖のＤＮＡミニサークルである。

かかる事例において、環状化反応は、１つの鎖のＤＮＡ末端をシールして、他の鎖中に単一のニックを含有する二本鎖ＤＮＡミニサークルを形成することによって起こる。

かかる実施形態において、工程ｃ）は反応混入物の排除を含む。実際、エキソヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼの添加は、ＤＮＡミニサークルのニックの入った鎖の排除および一本鎖ＤＮＡミニサークルの回収のために必要とされる。プロテアーゼの添加は、タンパク質混入物の消化のためにさらに使用することができる。

例えば、反応混入物の排除は、少なくともプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ等）の連続的な添加、続いて少なくともエキソヌクレアーゼ（エキソヌクレアーゼＩＩＩ等）の添加によって実行することができる。プロテアーゼの最終的な添加もエキソヌクレアーゼの排除のために必要とされ得る。本発明のこの実施形態は、さらなるＤＮＡ分子集合体のために使用することができる純粋な一本鎖ＤＮＡミニサークルを得ることを可能にする。

いくつかの実例において、方法のこの実施形態は、工程ａ）のニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質鎖の非リン酸化５’末端を有する鎖に相補的な直線状オリゴヌクレオチドの添加からなる工程ｄ）、およびニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルを得る（または回収する）ことである工程ｅ）を含む。

本発明に記載の方法のこの実施形態は、純粋なニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルを得ることを可能にする。

本発明によれば、一本鎖ＤＮＡミニサークルのハイブリダイゼーションは、１つのニックを備えた二本鎖ＤＮＡを得るために相補的直線状オリゴヌクレオチドにより、または（ｎ−１）のニックを備えた二本鎖ＤＮＡミニサークルを得るためにｎの相補的オリゴヌクレオチドにより、実行することができる。

純粋なニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルに加えて、一本鎖ミニサークルを得るための１つの戦略は、図１Ｂ、経路１中で略述される。本発明に記載のＤＮＡミニサークルを得る方法の最後の実施形態において、以下の工程：
ａ）ただ１つのリン酸化５’末端を有するニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質を提供する工程と、
ｂ）前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質およびＤＮＡ湾曲タンパク質を含む反応混合物上でリガーゼ媒介性環状化を実行する工程と、
ｃ）ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルを得る工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られたニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルへキナーゼを添加する工程と、
ｅ）ＤＮＡインターカレーターの存在下において前記ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルをライゲーションする工程と、
ｆ）二本鎖スーパーコイルＤＮＡミニサークルを得る工程と
が含まれる。

かかる実施形態において、工程ｃ）は、反応混入物および特にＤＮＡ湾曲タンパク質の排除のために少なくともプロテアーゼの添加を含む。優先的には、工程ｃ）は、反応混合物からタンパク質混入物を排除するためにプロテアーゼの添加を含む。いくつかの実例において、工程ｃ）のプロテアーゼは、湾曲タンパク質およびリガーゼタンパク質の両方に加えて、自己消化活性のおかげでプロテアーゼが消化されるような量で添加することができる。かかる事例において、二本鎖ＤＮＡミニサークルのニックの入った鎖の消化を回避するために、エキソヌクレアーゼは添加されない。

インターカレート剤（エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）等）の存在下におけるニックの入った環状ＤＮＡプラスミドの再ライゲーションは、ジヌクレオチド工程のツイスト（Ｔ_ｗ）値を３４°から２６°へ減少させることによって、巻き戻しを導入することが公知である（Ｂａｔｅｓ，ＡＤ ａｎｄ Ｍａｘｗｅｌｌ，Ａ，２００５，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ２ｎｄ ｅｄ．，２５−８１）。酵素によるライゲーションによるニックのシーリングは巻き戻しを固定し、インターカレート剤の除去は、ツイスト値したがってらせん回転あたりの塩基対の数の増加を誘導するだろう。結果として、二本鎖ＤＮＡミニサークルはねじり応力により少なく巻かれ、ミニサークルのリンキング数Ｌ_ｋは減少される（Ｌ_ｋは各々のＤＮＡ鎖が環状ＤＮＡ中で他のＤＮＡ鎖の周囲で巻く回数である）。リンキング数の変化（ΔＬ_ｋ）はＬ_ｋとＬ_ｋ０との間の差である（もとの直線状分子中の二重らせんの回転の数はＮ／ｈに等しく、Ｎは塩基対でのＤＮＡ長であり、ｈは１０．５４ｂｐ／回転の値のらせんの反復である）。リンキング数における変動は一般的にはスーパーコイルまたはライズ（Ｗ_ｒ）（例えばそれ自体でコイルするらせん）の出現を誘導し、通常はトポイソマー（同じ分子の各々のトポイソマーはゲル電気泳動上で別々に移動する）と呼ばれる、１つのエネルギー的に最低の円の形状の形成を可能にする。環状ＤＮＡのかかる幾何学的変動は以下の等式によって要約される。ΔＬ_ｋ＝ΔＴ_ｗ＋ΔＷ_ｒ（式中、リンキング数の任意の変化はライズおよび／またはツイストの変化に関連しその逆も成立する）。本状況において、Ｌ_ｋの減少は、分子が少なく巻かれた状況に対応するΔＬ_ｋについては負の値をもたらし、負のスーパーコイル形成の可能性がある。例えば、リンキング数がライゲーションおよびＥｔＢｒの除去後にミニサークル内で１だけ減少するならば、そのときΔＬ_ｋ＝−１であり；巻き戻し値Ｔ_ｗがＥｔＢｒの非存在下における正常ＤＮＡ内と同じであるので、ΔＴ_ｗは０に等しく、そのときΔＷ_ｒが−１に等しいと推定することができる（１つの超らせんの回転を備えたミニサークルトポイソマー）。これは、ΔＬ_ｋの値が示される９５ｂｐのミニサークルにより例示される。

本発明に記載の適切なＤＮＡインターカレーターには、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）およびクロロキンが含まれるが、これらに限定されない。インターカレーションを介して作用する多くの薬剤（例えばｍ−ＡＭＳＡ、ダウノルビシンおよびドキソルビシン等）が開発されているので、当技術分野において公知の可能性のあるインターカレーターのリストは広範囲である。加えて、インターカレーションを介して結合する多数の蛍光ＤＮＡ染色がある。これらには、例えばＥｔＢｒ、アクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウムが含まれる。

優先的に、工程ｃ）で得られたニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルを含む反応混合物へのキナーゼの添加からなる工程ｄ）は、ＤＮＡインターカレーターの存在下におけるニックの入ったＤＮＡミニサークルの再ライゲーションの工程ｅ）に先行する。キナーゼの添加は、ＡＴＰからニックの入った鎖の５’末へのリン酸の移行を可能にする。この実施形態に記載の適切なキナーゼには、ポリヌクレオチド５’ヒドロキシルキナーゼおよび典型的にはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡインターカレーターの除去は典型的にはブタノール抽出によって達成することができる。

工程ｆ）において、スーパーコイルＤＮＡミニサークルは、反応混合物を含む組成物の一部として回収、または当該技術分野の周知の方法に従って（上述のもの等、例えばエタノール沈殿またはシリカビーズＤＮＡ抽出の使用によって）単離することができる。いくつかの実例において、工程ｆ）は、少なくともプロテアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群から選択される酵素の添加を含む。有利には、工程ｅ）は、核酸混入物（直線状オリゴマー）を排除するために少なくともエキソヌクレアーゼの添加を含む。より詳細には、工程ｆ）は少なくともエキソヌクレアーゼの添加である。

本発明に記載のスーパーコイルＤＮＡミニサークルを得るための戦略は、図１Ｂ、経路２において特に略述される。

本出願人の知る限りでは、スーパーコイルが９５ｂｐの小さなミニサークルにおいて観察されるのは初めてである。さらに、本発明の方法は、１つのポット中でスーパーコイルＤＮＡミニサークルの産生を可能にする。第１のトポイソマー（ΔＬ_ｋ＝−１）は、０．１の負の超らせんの密度を有しており、それは、生理的条件において予想される密度（約０．０８）（Ｚｅｃｈｉｅｄｒｉｃｈ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，８１０３−８１１３）よりもわずかに上昇し、したがって、タンパク質のＤＮＡ結合活性に対する湾曲ＤＮＡ分子におけるスーパーコイルの効果の研究に使用することができる。

本発明はＤＮＡミニサークルのＤＮＡ配列の性質および位置を選択することをさらに可能にする。実際、本発明のリガーゼ媒介性環状化が任意の配列の重複二重鎖により得ることができることが本出願人によって実証された。上記のように、本方法における合成オリゴヌクレオチドの使用は以下の複数の利点を有する。合成オリゴヌクレオチドは、大スケールおよび低価格で容易に製造され、特異的結合部位、ＤＮＡ塩基ミスマッチまたは化学官能性が含まれるが、これらに限定されない無制限の配列官能化（または修飾）を保有する能力を示す。

したがって、本発明の方法において、少なくとも１つのリン酸化５’末端を有するニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質は、タンパク質推定結合部位、ＤＮＡ結合部位、化学官能性、ＤＮＡ塩基ミスマッチからなる群から選択される少なくとも１つの配列官能化を含む。本発明によれば、典型的なタンパク質推定結合部位はＤＮＡ結合タンパク質のための結合部位である。

対象となるＤＮＡ結合タンパク質には、トポイソメラーゼ、制限酵素、転写因子、リモデリング因子、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、テロメアタンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡメチル化酵素および構成上のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、転写因子には、Ｅ２Ｆ、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ ３、ＴＡＲ、ＥＴＳ１、ＡＴＦ４、ＡＰ１、ＴＷＩＳＴ、ＳＮＡＩＬ、ＮＲＦ２、ＨＩＦおよびＯＣＴ４が含まれるが、これらに限定されない。

例えば、本発明に記載の重複二重鎖は、少なくとも１つ、典型的には１〜１０、およびより詳細には、１〜６のタンパク質推定結合部位を含有することができる。

前記重複二重鎖は、さらに同じまたは異なり得る、少なくとも１つおよび優先的には複数（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の化学官能性を含有することができる。

典型的な化学官能性には、部位特異的に配置された塩基修飾および部位特異的に配置されたリンカーまたは部位特異的に配置された標識が含まれるが、これらに限定されない。実際、様々な塩基類似体および修飾により官能化された本発明に記載の重複二重鎖は、例えば固体支持体合成の過程において商業的に入手可能な合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドから容易に得ることができ、本出願人は、本発明に記載の環状化反応が化学的に修飾したオリゴヌクレオチドを許容することを実証した。

本発明に記載の典型的な塩基修飾は、例えばＤＮＡ修復タンパク質およびＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）を含む群から選択されるタンパク質の基質であるものである。ＤＮＡ修復タンパク質には、塩基除去修復に関与するタンパク質（ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、末端プロセッシング酵素およびＤＮＡリガーゼ等であるが、これらに限定されない）、ヌクレオチド除去修復に関与するタンパク質（色素性乾皮症に由来するＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＥ、ＸＰＦおよびＸＰＧ、またはＣｏｃｋａｙｎｅ症候群に関連づけられたタンパク質を表わすＣＳＡおよびＣＳＢ、またはタンパク質、ＥＲＣＣ１、ＲＡＤ２３Ａ、ＲＡＤ２３Ｂ等であるが、これらに限定されない）、およびミスマッチ修復システムに関与するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

本発明に記載の塩基修飾は、ＤＮＡが酸化条件、イオン化照射または日光へさらされる場合に天然で形成することができるものでもある。本発明に記載の塩基修飾の実施例は、酸化塩基（８−オキソグアニン、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧ）、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ）、チミングリコール、チミジングリコール、シクロ−ｄＡおよびシクロ−ｄＧに加えて、ピリミジンダイマー等であるが、これらに限定されない）、アルキル化塩基（Ｏ^６メチルグアニン等であるが、これらに限定されない）、脱アミノ化塩基（アデニンの脱アミノ反応から形成されるヒポキサンチン、グアニンの脱アミノ反応から形成されるキサンチン等であるが、これらに限定されない）、および他の加水分解された塩基（脱プリン反応および脱ピリミジン反応等）、およびＤＮＡ中に不適当で取り込まれたウラシル、またはシトシンの脱アミノ反応によって形成されたものである。

本発明に記載の典型的な塩基修飾は、８−オキソグアニン、チミングリコール塩基修飾（塩基除去修復のための基質である）、チミンダイマーおよび塩基シクロ−ｄＡ（ヌクレオチド除去修復のための基質である）である。

塩基修飾には、様々な配列も含まれ、それらは、第３の鎖のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対のために典型的には使用される、少なくとも１つ、優先的に１〜１０のプリンリッチ配列もしくはピリミジンリッチ配列、四重鎖形成を可能にするグアニンリッチ配列、またはヒトテロメア配列等である。

典型的な部位特異的に配置されたリンカーには、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標）、アデニル化、ＩＤＴのアジド修飾、ジゴキシゲニン修飾、コレステリル−ＴＥＧ、アミノ修飾剤、蛍光色素、アルキン、ビオチン化、チオール修飾が含まれるが、これらに限定されない。

前記リンカーおよび典型的にはアミノ修飾剤（アミノ修飾剤ｄＴ等）は、分子標識、ペプチドポリマー（例えば周知のＮ−ヒドロスクシンイミドカップリング反応を介する）が含まれるがこれらに限定されない様々な化学物質によって、さらなる部位特異的官能化を可能にする。

本発明に記載の典型的な部位特異的に配置された標識には、ハプテン（ビオチンまたはジゴキシゲニン等）、放射性同位体（^３Ｈまたは^３２Ｐ等）、蛍光色素（シアニン３またはカルボキシフルオレセイン等）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の別の目的は、
−２５０ｂｐ未満で、本発明に記載の少なくとも１つの推定タンパク質結合性部位を含むスーパーコイルＤＮＡミニサークルを単離する工程と；
−ＤＮＡ結合のために好適な条件下で対象となるタンパク質と前記ＤＮＡミニサークルを接触させる工程と；
−ＤＮＡ結合についてアッセイする工程と、
を含み、
ＤＮＡ結合がＤＮＡ結合タンパク質を暗示する、
ＤＮＡ結合タンパク質を同定する方法に関する。

さらに、本発明の別の実施形態は、
−試験薬剤の存在および非存在下においてＤＮＡ結合のために好適な条件下で本発明に記載のＤＮＡミニサークルと対象となるＤＮＡ結合タンパク質を接触させる工程と；
−試験薬剤の存在および非存在下においてＤＮＡ結合の量を定量化する工程と、
を含み、
変更されたＤＮＡ結合が試験薬剤がＤＮＡ結合のモジュレーターであることを暗示する、
ＤＮＡ結合タンパク質のモジュレーターのためのスクリーニング方法に関する。

本発明によれば、ＤＮＡミニサークルは、例えば固体支持体（カラムクロマトグラフィーマトリックス、プレートの壁、マイクロタイターウェル、孔のあるガラスカラム、溶液中に沈められたピン、ビーズなど）に付加することができる。したがって、ＤＮＡミニサークルは、例えばリンカーまたは他の分子によって固相に直接または間接的に固定することができる。かかる固体支持体の実施例には、プラスチック（ポリカーボネート等）、複合炭水化物（アガロースおよびセファロース等）およびアクリル樹脂（ポリアクリルアミドおよびラテックスのビーズ等）が含まれるが、これらに限定されない。かかる固体支持体への核酸プローブのカップリングのための技法は当技術分野において周知である。

典型的には、本発明のＤＮＡミニサークルは様々な材料に連結することができ、それらは、ｉ）無細胞抽出液内でのタンパク質結合の探索のためのアガロースビーズ、ｉｉ）マイクロプレートまたはセンサーチップ、ｉｉｉ）量子ドットまたは抗体、ｉｉｉｉ）分子生物学および遺伝子療法の適用のための磁気粒子等である。

例えば、ビオチン化ミニサークルは様々なストレプトアビジンコート材料に連結することができ、それらは、ｉ）ストレプトアビジンアガロースビーズ、ｉｉ）ストレプトアビジンコート表面（マイクロプレートまたはセンサーチップ等）、ｉｉｉ）ストレプトアビジン相互作用を介する量子ドットまたは抗体、ｉｉｉｉ）ストレプトアビジンコート磁気粒子等である。

２−本発明に記載のＤＮＡミニサークルおよびキット
本発明の別の目的は、本発明の方法によって得ることができるＤＮＡミニサークルに関する。

本発明に記載のミニサークルの以下の実施形態は、個別におよび組み合わせで採用することができる。

一実施形態において、ＤＮＡミニサークルは、本発明の方法において上記のように７０ｂｐを超え２５０ｂｐ未満を含む。典型的には、本発明に記載のミニサークルは、８０〜２００ｂｐの間、より詳細には８４〜２００ｂｐの間を含む。

本発明の別の実施形態において、本発明のミニサークルは、ＤＮＡミニサークルの長さに依存して、複数のトポイソマー（例示されるように９５ｂｐミニサークルで３つのトポイソマー）を形成するスーパーコイルの状態を賦与される。

本発明のさらなる実施形態において、本発明のＤＮＡミニサークルは、上記のようなタンパク質推定結合部位、ＤＮＡ結合部位、化学官能性およびＤＮＡ塩基ミスマッチ等の様々な配列官能化（または修飾）も含むことができる。典型的な化学官能性には、上記のような部位特異的に配置された塩基修飾および部位特異的に配置されたリンカーまたは部位特異的に配置された標識が含まれるが、これらに限定されない。

本発明によれば、ＤＮＡミニサークルは、タンパク質推定結合部位、ＤＮＡ結合部位、化学官能性（または修飾）およびＤＮＡ塩基ミスマッチからなる群から選択される少なくとも１つの配列修飾を含む。

典型的には、本発明に記載のＤＮＡミニサークルは１〜１０の推定タンパク質結合性部位を含有し、少なくとも１つおよびより優先的には複数の化学修飾および／またはＤＮＡ塩基ミスマッチをさらに含有することができ、化学修飾は同じまたは異なる。

本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡミニサークルは、したがって、様々なＤＮＡ結合タンパク質（ＤＮＡ修復タンパク質、トポイソメラーゼ、制限酵素、転写因子、リモデリング因子、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、テロメアタンパク質、ＤＮＡメチル化酵素および構成上のタンパク質等）のための基質である。

本発明の一実施形態において、本発明に記載のＤＮＡミニサークルは少なくとも１〜６のκＢ結合部位を含有する。本発明のより特定の実施形態において、前記ミニサークルは、少なくとも１つのさらなる対象となるタンパク質のための少なくとも１つのさらなるタンパク質推定結合部位を含むことができる。前記対象となるタンパク質は、ＤＮＡ修復タンパク質または転写因子（Ｅ２Ｆ、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ３、ＴＡＲ、ＥＴＳ１、ＡＴＦ４、ＡＰ１、ＴＷＩＳＴ、ＳＮＡＩＬ、ＮＲＦ２、ＨＩＦ、Ｏｃｔ４および特にＥＴＳ１および／またはＳＴＡＴ３等）であり得る。

複数のタンパク質結合性部位の存在は、複数のタンパク質相互作用を備えた核酸プラットフォームの構成を可能にする。

いくつかの実例において、前記ＤＮＡミニサークルは少なくとも１つの化学修飾をさらに含むことができる。

化学官能性は、部位特異的に配置された塩基修飾および部位特異的に配置されたリンカーまたは部位特異的に配置された標識を含む。

アミノ修飾剤（例えばアミノ修飾剤ｄＴ等）を含有するＤＮＡミニサークルは、周知のＮ−ヒドロキシスクシンイミドカップリング反応での様々な化学物質（分子的標識、ペプチド、ポリマー）による部位特異的なミニサークルの官能化（または修飾）をさらに可能にすることができる。かかる官能化は、生物学的適用（細胞標的化、細胞送達および細胞トラフィッキング等）のための新規の重要な特性をミニサークルに賦与することができた。

蛍光標識を備えたミニサークルは様々な研究において使用することができ、それらは、ｉ）適切に配置された発色団によるＦｏｒｓｔｅｒの共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介するタンパク質の存在または非存在下におけるミニサークルの構造研究、ｉｉ）生物学的適用のためのミニサークルの細胞取り込みおよびトラフィッキング等である。

本発明の別の目的は、遺伝子療法適用におけるデコイ薬剤としての使用のための本発明に記載のＤＮＡミニサークルに関する。

本発明によれば、デコイ薬剤はＤＮＡ結合タンパク質（優先的に転写因子）のための少なくとも１つの推定結合部位を含むＤＮＡミニサークルであり、したがって、それは前記ＤＮＡ結合タンパク質の結合を標的遺伝子中のコンセンサス配列と競合することができる。転写因子は、次いでそれらが発現を調節する（スイッチを入れたり切る）遺伝子（標的遺伝子）のプロモーター領域中で見出される特異的配列に結合する。これらの結合配列は一般的には６〜１０塩基対の長さであり、時には標的遺伝子のプロモーター領域内で複数のコピーで見出される。したがって、十分な濃度で細胞の中へ送達されれば、デコイ薬剤は標的遺伝子のプロモーター領域へのタンパク質（典型的には転写因子）の結合を弱化し、したがって転写因子の機能を弱化してその標的遺伝子の発現を調節する可能性を有する。

ＮＦ−κＢは、その活性化が、多数の疾患（例えば癌、関節炎）の病因に関与するサイトカインおよび接着分子の遺伝子の調整されたトランス活性化において極めて重要な役割を果たす転写因子である。実際、ＮＦ−κＢの標的遺伝子は、抗アポトーシス性遺伝子および細胞増殖を調節する遺伝子に加えて、炎症性遺伝子および免疫調節因子遺伝子である。

治療用標的としての別の魅力的な転写因子はＳｔａｔ３であり、それは複数のヒト癌において活性化され、癌細胞増殖に関与する。

本発明に記載のさらに別の特に対象となる転写因子は、転写因子ＥＴＳ１であり、その発現は複数の固形腫瘍において増加し、血管新生および転移浸潤に関与する。

したがって、本発明の特定の目的は、炎症性疾患（癌または心血管性疾患等）の遺伝子療法における標的遺伝子の発現の調節または弱化のための使用のための、ＮＦ−κＢおよび／またはＳＴＡＴ３および／またはＥＴＳ１についての１つまたは複数の結合部位、より詳細には１〜１０のＮＦ−κＢ結合部位および／または１〜１０のＳＴＡＴ３結合部位および／または１〜１０のＥＴＳ１についての結合部位、ならびにさらにより詳細には１〜６のＮＦ−κＢ結合部位および／または１〜６のＳＴＡＴ３結合部位および／または１〜６のＥＴＳ１結合部位を含有するＤＮＡミニサークルに関する。実際、多重標的化デコイ戦略においてこれら３つの転写因子に向けた二重鎖Ｄ１１について例証されるように、多重標的化ミニサークルを使用することができた。

金属ベースの薬剤（例えばシスプラチンであるがこれに限定されない）等のアルキル化剤によって適切なＤＮＡ配列を含有するミニサークルを修飾して、ＤＮＡ損傷を形成することもでき、ＤＮＡ損傷は今度は標的タンパク質、特にヌクレオチド除去修復タンパク質（例えばＥＲＣＣ１−ＸＰＦ）等のＤＮＡ修復タンパク質を引きつけることができる。デコイ戦略において白金結合されたＤＮＡミニサークルを使用することで、薬剤ＤＮＡ損傷を積極的に修復することが公知の耐性癌細胞におけるＤＮＡ修復タンパク質の阻害によって、ＤＮＡアルキル化剤の化学療法有効性を増加させることができた。

本発明のさらに別の目的は、
ａ）ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質の産生のための一本鎖相補的重複オリゴデオキシヌクレオチドと、
ｂ）少なくとも１つのＤＮＡ湾曲タンパク質と、
ｃ）少なくとも１つのリガーゼと
を含む、
ＤＮＡミニサークルのインビトロの産生のためのキットである。

いくつかの実例において、前記キットは、
ａ）ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質の産生のための一本鎖相補的重複オリゴデオキシヌクレオチドと、
ｂ）ＤＮＡ湾曲タンパク質と、
ｃ）リガーゼと
を含む。

別の実施形態において、本発明に記載のキットは、
ａ）本発明に記載のニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質と、
ｂ）少なくとも１つのＤＮＡ湾曲タンパク質と、
ｃ）少なくとも１つのリガーゼと
を含む。

いくつかの実例において、前記キットは、
ａ）本発明に記載のニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質と、
ｂ）ＤＮＡ湾曲タンパク質と、
ｃ）リガーゼと
を含む。

３−本発明に記載の使用
本発明の別の目的は、ＤＮＡ結合試験のための基質としての本発明に記載のＤＮＡミニサークルの使用に関する。実際、本発明の一実施形態において、本発明に記載のＤＮＡミニサークルを使用してＤＮＡに結合する薬剤についてスクリーニングすることができる。典型的には、かかるミニサークルは、対象となる少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質についての少なくとも１つの推定結合部位を含有するように操作される。

本発明に記載の対象となるタンパク質は、トポイソメラーゼ、制限酵素、転写因子、リモデリング因子、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、テロメアタンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡメチル化酵素および構成上のタンパク質を含む群から選択することができる。優先的には、対象となるタンパク質はＤＮＡ修復タンパク質および転写因子である。典型的には、転写因子には、Ｅ２Ｆ、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ ３、ＴＡＲ、ＥＴＳ１、ＡＴＦ４、ＡＰ１、ＴＷＩＳＴ、ＳＮＡＩＬ、ＮＲＦ２、ＨＩＦおよびＯｃｔ４が含まれるが、これらに限定されない。

より詳細には、本発明に記載され、少なくとも１つの配列官能化（または修飾）を上述のように保有する（少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質について典型的には少なくとも１つの推定結合部位の）ＤＮＡミニサークルを使用して、細胞中の前記タンパク質を標的化し恐らくタイトレーションすることができる。

上述のように、本発明に記載の配列の官能化（または修飾）には、特異的結合部位、ＤＮＡ塩基ミスマッチまたは化学官能性が含まれるが、これらに限定されない。化学官能性は、部位特異的に配置された塩基修飾および部位特異的に配置されたリンカーまたは部位特異的に配置された標識を含む。

塩基およびヌクレオチドの除去修復のシステムからの複数のタンパク質は癌細胞において過剰発現され、化学療法および／または放射線療法への低応答に寄与する。したがって、対象となる少なくとも１つのトラッピング損傷により化学的に修飾したＤＮＡミニサークルを使用して、デコイ戦略アプローチにおける上述の修復システムからの標的タンパク質をタイトレーションすることができる。

さらに、多様な修飾される塩基（Ｏ^６メチルグアニンまたはメチル化シトシン）も、癌に関与する複数の標的タンパク質をトラップする目的でＤＮＡミニサークル内に取り込むことができる。かかるタンパク質は、典型的には修復タンパク質（Ｏ^６アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、またはＯ^６メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ等であるが、これらに限定されない）およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（シトシン−５メチルトランスフェラーゼ等であるが、これらに限定されない）である。

本発明の別の特定の実施形態は、インビボに加えてインビトロでの内在性遺伝子調節の研究のためのデコイ核酸として、リラックスまたはスーパーコイルの状態を賦与され、少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質について少なくとも１つの推定結合部位を含む、ＤＮＡミニサークルの使用に関する。

細胞中でＤＮＡミニサークルを複製することができないので、標的タンパク質（デコイ効果）の阻害は一時的であり、それは遺伝子阻害への薬剤様アプローチが有用ないくつかの適用において有利であるが、永続的な形質転換が所望される場合は欠点である。かかる事例において、標的タンパク質の不可逆的トラッピングはミニサークルの負の効果を延期するのには有利であり、それは化学官能性を含んでＤＮＡタンパク質共有結合を可能にすることによる。

生物学的液体中での環状核酸の送達は、エキソヌクレアーゼへの抵抗性による安定性の増加として複数の長所を提示することも公知である。ミニサークルのサイズは、複数のタンパク質相互作用を備えた核酸プラットフォームの構成への手法を開拓する複数のタンパク質結合性部位の存在も可能にする。

非ウイルス性遺伝子療法において、細胞質中のＤＮＡ拡散および核インポートは、環状スーパーコイルプラスミドＤＮＡの使用により実行される導入遺伝子送達についての律速的な決定要素であると考えられる。細胞中のＤＮＡ移動性の研究は、直線状ＤＮＡ（それはＤＮＡ末端効果の結果として環状ＤＮＡを模倣しない）を使用して、ＤＮＡサイズの関数として実行されてきた。

したがって、本発明の特定の実施形態は、複数のＤＮＡパラメーター（配列、トポロジー）の関数としての、細胞中での治療用核酸トラフィッキングの研究のための本発明に記載のＤＮＡミニサークル（遺伝子療法において使用されるプラスミド等）の使用である。一本鎖または二本鎖のリラックスまたはスーパーコイルの状態を賦与され、および／または上述のような少なくとも１つの配列官能化を含有する、本発明に記載のＤＮＡミニサークルは、様々な適用において使用することができる。

例えば、ＤＮＡミニサークルは、さらなるＤＮＡ集合体に加えて、細胞標的化送達およびトラフィッキングに関する様々な生物学的適用のために使用することができる。

別の実施例は、ＤＮＡトポロジーおよび湾曲の相互効果を研究するための本発明に記載のリラックスまたはスーパーコイルＤＮＡミニサークルの使用に関する。

リラックスまたはスーパーコイルの状態を賦与され、カスタマイズされた配列を備えた本発明に記載のＤＮＡミニサークル（例えば、部位特異的に配置された塩基修飾および部位特異的に配置されたリンカーまたは部位特異的に配置された標識が含まれる、少なくとも１つの化学官能性を有する）は、構造的ＤＮＡナノテクノロジーにおけるナノスケールの物体のデザインのために使用することができる。

最後に、本発明に記載のＤＮＡミニサークルは、出発ＤＮＡミニサークルとして同じ配列および長さの直線状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡの過剰生産のために、ならびにＤＮＡシーケンシングのために、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ増幅を支援することができる。

１−材料および方法：
ここで使用されるオリゴデオキシヌクレオチドは、テキスト中で示されているように変更され、または変更されないホスホアミダイト方法によって合成され、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ、ベルギー）から購入された。プロテイナーゼＫ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩはＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入し、Ｔ５エキソヌクレアーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。全長のＮＦ−κＢ ｐ５０およびＦｐｇはそれぞれＰｒｏｍｅｇａおよびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。Ｂａｌ３１ヌクレアーゼおよびストレプトアビジンはそれぞれＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、および７００ｂｐラダーＤＮＡ分子量マーカーはＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入した。

Ａｂｆ２ｐ遺伝子を含有するｐ−ＥＴ１５ ｂ由来ベクターはＦ．Ｃｕｌａｒｄ（Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ ｂｉｏｐｈｙｓｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ、ＣＮＲＳ、Ｏｒｌｅａｎｓ、フランス）によって快く提供され、このプラスミドを３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールのおよび３０μｇ／ｍｌのカナマイシンによりＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の形質転換のために使用した。形質転換された系統をＡ６００が０．５になるまで振盪して３７℃で増殖させた。培養はイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）により１００μΜの最終濃度で６時間誘導した。遠心分離後に、細胞を、プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１００ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｐｉｅｒｃｅ）を補足した超音波処理緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）中で再懸濁し、次いで超音波処理した。すべての精製工程は４℃で実行した。抽出物の遠心分離後に得られた溶解物をニッケルアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に適用し、ヒスチジン標識Ａｂｆ２ｐを１ｍｌ／分の流速で１００ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液により溶出した。Ａｂｆ２ｐをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ １０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および５％グリセロールを含有する緩衝液中で−７０℃で保存した。タンパク質濃度は、スタンダードとしてＢＳＡを使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用することによって決定した。タンパク質の最終的な濃度は３ｍｇ／ｍｌであった。純度は、ＥＺＢｌｕｅゲル染色試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用してドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル上で＞９５％と推測した。

環状化反応
二本鎖の閉鎖されたリラックスミニサークルの産生の方法：
各々の重複ＤＮＡテンプレートの調製は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中で等モルの量の相補的一本鎖オリゴヌクレオチドを、４０μΜ（重複二重鎖のモルで表現される）の濃度で混合することによって実行した。ハイブリダイゼーションは、８０℃でのオリゴヌクレオチド混合物の加熱、続いてウォーターバス中で１５℃の温度での徐冷によって実行した。

環状化の標準的反応は、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰおよび５％のグリセロール、ｐＨ７．８を含有する緩衝液中に、重複したニックの入った二重鎖を２μΜの最終的な濃度で添加することによって実行した。次いでＡｂｆ２ｐを２μΜの最終的な濃度で、続いてＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２０単位）を添加した。次いで反応混合物を２０℃で１時間インキュベーションし、続いてプロテイナーゼＫ（０．３単位）を添加した。５５℃での３０分間のインキュベーション時間後に、エキソヌクレアーゼＴ５を添加し（２００単位）、インキュベーションを３０分間３７℃で続けた。最終的に、プロテイナーゼＫによる第２の消化工程を実行した。次いで２．５Ｍの最終的な濃度でＡｃＯＮＨ_４の添加、および２体積の冷エタノールの添加によってミニサークルを沈殿させた。１４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離後に、上清を廃棄し、ペレットを７０％のエタノールの添加によって洗浄し、続いて遠心分離した。次いでペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中でＤＮＡミニサークルで約２００μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＤＮＡミニサークルサンプルの光学的密度を濃度決定のために測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比が高品質ＤＮＡに対応する１．８よりも大きいように制御した。純粋なＤＮＡミニサークルのワンポット産生についての全収率は３０％である（１５０μｇの初期量のインプットＤＮＡによる環状化反応の１ｍｌあたり、５０μｇの９５ｂｐミニサークルが産生された）。取扱い説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってシリカビーズＤＮＡゲル抽出キットを使用してＤＮＡミニサークル精製を実行できることに注目されたい。

ニックの入った環状ミニサークル中間体の形成を介するスーパーコイルＤＮＡミニサークルの産生：
環状化の標準的反応は、非リン酸化５’末端が重複二重鎖のいずれかの鎖上に存在する場合に、ニックの入った環状ミニサークルを産生するために使用することができる（図１Ｂ）。かかる事例において、環状化反応は、１つの鎖のＤＮＡ末端をシールして他の鎖中に単一のニックを含有するミニサークルを形成することによって起こる。次いで、反応混合物は、テキスト中で示されるように漸増濃度のエチジウムブロマイド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の非存在または存在下において、プロテイナーゼＫ（０．３単位、５５℃で３０分）、１ｍＭ ＡＴＰと共にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（２００単位、３７℃で３０分）、および最終的にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１００単位、２０℃で１時間）により連続してインキュベーションした。次いで、エチジウムブロマイドをブタノール抽出によって除去した。精製工程は上述と同じであり、反応の全収率は２０％であった。

図１Ｂの経路１中で示されるように、単一のニックの入った環状ＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩ（３２００単位、３７℃で２時間）により処理し、ニックの入った鎖の完全な消化は一本鎖ミニサークルをもたらすことも可能にし、次いでそれはシリカビーズＤＮＡゲル抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製された（出発二本鎖のミニサークル形態から計算して１０％の最終的な収率）。次いで、一本鎖ミニサークルを、９５ｎｔの相補鎖、または４０ｎｔおよび５５ｎｔの両方の相補鎖と、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中でハイブリダイズさせ、それぞれ単一のニックの入ったミニサークルまたは二重ニックの入ったミニサークルを得た。

ゲル電気泳動分析：
環状化反応において形成された産物を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。１３０ｎｇのインプットＤＮＡを、５％未変性ポリアクリルアミドゲル（１９：１、アクリルアミド：ビスアクリルアミド（ｗ／ｗ）、９０ｍＭトリスホウ酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）上にロードし、続いて９０分間１２．５Ｖ／ｃｍで移動させた。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるゲル染色後に、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりイメージングし、ゲルバンドの定量化をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア５．１によって実行した。未変性ポリアクリルアミドゲル中のＤＮＡが蛍光によって可視化され、したがってオリゴマーに対する出発の直線状二重鎖のモル比は、バンド強度がオリゴマー長の関数として増加することを考慮して計算されることに注目されたい。ミニサークルの電気泳動も、ミニサークルトポイソマーを分離するために１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を追加で存在させて上述のように実行した。

環状化反応において生成されたミニサークルも、８％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１９：１、アクリルアミド：ビスアクリルアミド；８Ｍ尿素；９０ｍＭトリスホウ酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）上で分析した。ホルムアミド中でＤＮＡサンプルを熱変性し、１サンプルあたり６５ｎｇのＤＮＡを変性ゲル上にロードし、１８ワットで９０分間電気泳動した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるゲル染色後に、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりイメージングし、ゲルバンドの定量化をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア５．１によって実行した。１つまたは２つの８−オキソグアニン残基を含有する９５ｂｐミニサークル（０．２μΜ）とＦｐｇ（８単位）の反応は、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６を含有する緩衝液中で３７℃で１時間実行した。６０℃で１０分間の加熱によるタンパク質不活性化後に、反応産物を変性ゲル電気泳動上で上記のように分析した。

電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
本明細書において使用されるＤＮＡ結合タンパク質とＤＮＡミニサークルの相互作用研究のためにＥＭＳＡを使用した。Ａｂｆ２ｐは、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール、ｐＨ７．６を含有する緩衝液中でテキスト中で示されるように濃度の関数としてミニサークル（１０ｎｇ）と１０分間インキュベーションした。ゲルローディング緩衝液を添加した後に、反応混合物を、５％未変性ポリアクリルアミドゲル（１９：１、アクリルアミド：ビスアクリルアミド（ｗ／ｗ）；９０ｍＭトリスホウ酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）上にロードした。ゲルを１時間電気泳動した。ＮＦ−κΒ ｐ５０／ｐ５０は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２％グリセロール、５０μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中でテキスト中で示されるように濃度の関数としてミニサークル（１０ｎｇ）と４℃で３０分間インキュベーションした。ゲルローディング緩衝液を添加した後に、反応混合物を、５％未変性ポリアクリルアミドゲル（１９：１、アクリルアミド：ビスアクリルアミド（ｗ／ｗ）；９０ｍＭトリスホウ酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）上にロードした。ゲルを１時間電気泳動した。ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２％グリセロール、５０μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、ｐＨ７．５を含有する緩衝液によりテキスト中で示されるように濃度の関数としてＤＮＡミニサークル（１０ｎｇ）とインキュベーションした。ローディング緩衝液の添加後、反応混合物を、５％ポリアクリルアミドゲル（１９：１、アクリルアミド：ビスアクリルアミド（ｗ／ｗ）；４５ｍＭトリスホウ酸塩、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）上にロードした。ゲルを１時間電気泳動し、染色は２０分間ＳＹＢＲグリーン中のゲルのインキュベーションによって実行した。最終的にゲルをＴｙｐｈｏｏｎフォスフォイメージャーに曝露し、結合分率（結合複合体の強度／全強度）をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ５．１ソフトウェアによって決定した。

ＤＮＡミニサークルのヒト血清安定性：
３６５ｎｇのＤＮＡを５０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃でインキュベーションした。アリコートを時間の関数として採取し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物の添加によって、直ちに除タンパクを２回行った。遠心分離後に、血清中でインキュベーションされた核酸の性質に依存して、上清のアリコートをアガロースまたはポリアクリルアミドゲル上にロードした（プラスミドＤＮＡについては０．８％未変性アガロースゲル；ミニサークルおよび直線状ＤＮＡ二重鎖についてはそれぞれ５％および２０％の変性ポリアクリルアミドゲル）。電気泳動後に、ゲル電気泳動分析のセクション中で記載されるように、ゲルを染色し、バンドの強度を定量化した。対象となる出発の核酸に対応するバンド強度を、インキュベーション時間の関数として報告した。データポイントは単一指数関数にフィッティングさせた。核酸消失の速度定数を使用して、血清中で核酸安定性の半減期を推定した。

２−結果：
ＤＮＡミニサークル産生：
オリゴヌクレオチド合成の最も良い商業的に利用可能な化学的アプローチは固相ホスホアミダイト方法であり、良好な収率および純度により６０ヌクレオチド（ｎｔ）の範囲で一本鎖オリゴヌクレオチドの産生を可能にする。したがって、本方法は、内部ニック（１つの鎖中の一本鎖切断）を含有する対象となる出発の平滑末端ＤＮＡテンプレートを形成するために、適切な重複オリゴヌクレオチドを集合させることであった。９５ｂｐの直線状のニックの入った平滑末端二重鎖は、２つの適切な重複オリゴヌクレオチドを２つの対応する相補的オリゴヌクレオチドと混合することによって形成された（図２、Ｄ１）。すべてのＤ１内のＤＮＡの５’末端は以下で図示されるような条件において酵素によるライゲーションを実行するためにリン酸化される。二重鎖Ｄ１は、分子量マーカーの１００ｂｐ ＤＮＡ断片の移動度に近い移動度で１つのバンドとして未変性ポリアクリルアミドゲル上で予期された通りに移動する。環状化緩衝液中でＡｂｆ２ｐの非存在下においてＴ４ ＤＮＡリガーゼとＤ１をインキュベーションした後に、出発バンドは減少し、より遅い移動度の複数の強いバンドが現われた。今までに文献中で記載されているように、これらのバンドは出発のＤ１二重鎖の直線状のオリゴマーに対応し、最も多量であるオリゴマーはダイマーである。この結果から、ここで使用されるような高いＤＮＡ濃度（二重鎖Ｄ１において２μΜ）では、ミニサークルの生成なしに、混入の分子間ライゲーション産物のみがニックの入った直線状のＤＮＡ基質から形成されることが実証される。

反対に、同じライゲーション反応が湾曲タンパク質Ａｂｆ２ｐの存在下において実行される場合、反応産物はかなり異なる。出発の二重鎖Ｄ１に対応するバンドは非常に弱く、ＤＮＡミニサークルに対応する強い新しいバンドが存在する。顕著なことには、混入する直線状のオリゴマーに対応するすべてのバンドは非常に弱い強度を有する。環状化効率は、直線状のダイマーに対するミニサークルの量の間の比によって大まかに推測することができる。ニックを含有する９５ｂｐのＤＮＡ二重鎖Ｄ１による環状化は８という高い比をもたらし、それは、連続的な直線状ＤＮＡ基質の環状化反応において得られる１．５未満の比に対して有意である。したがって、このニックの入ったＤＮＡ基質は、糖−リン酸骨格の連続性を備えたＤＮＡ二重鎖を超える、Ａｂｆ２ｐ依存性に誘導される柔軟性のための非常に効果的なインプットＤＮＡである。１５塩基対の重複配列によって分離された各々の鎖中のニックの導入は、上昇させたＤＮＡ濃度でのミニサークル産生の高収率への寄与に関係する研究結果である。鎖のニックの存在によって導入されたＤＮＡ柔軟性は、対応するＤＮＡミニサークル（Ａｂｆ２ｐのための周知の選択的ＤＮＡ基質であるかかる環状ＤＮＡ形態）と比較して、Ａｂｆ２ｐが直線状のニックの入ったＤＮＡ基質についての類似の高い結合親和性を示すという事実から推定される。パラメーター（ニックに隣接する塩基対の性質、重複配列の長さおよび位置、リガーゼ量等）は、環状化反応の効率と関係があるだろう。これらのパラメーターの複数の組み合わせは環状化反応を不十分に修飾する。特に、反応の収率が重複領域の長さに依存しないことが見出された。実際、１０、１５および２０塩基対の重複は反応効率の修飾に寄与せず、ニックがＤＮＡ柔軟性を誘導し、この柔軟性が、効果的なリガーゼ媒介性ＤＮＡ環状化反応のために、Ａｂｆ２ｐがＤＮＡに結合し恐らく湾曲させる効率を改善することを示す。

混合物をＴ５エキソヌクレアーゼにより続いて処理する。かかる酵素は、５’末端から効率的に直線状の二本鎖のＤＮＡを消化し、一本鎖ＤＮＡにはより弱いエンドヌクレアーゼ活性を示す。エタノール沈殿およびゲルローディングに続いて、ＤＮＡの直線状の形態はすべて酵素によって消化され、これに対して二本鎖の閉鎖環状ミニサークルは予想されるように自由端部の非存在下においてエキソヌクレアーゼ消化に耐性があった。ゲル電気泳動から環状ＤＮＡのサイズを確定することができないので、次いで、環状化反応の間に特異的に形成された単一のＨａｅＩＩＩ制限部位の存在の利用によって、ミニサークル産物が出発の直線状の９５ｂｐ二重鎖に戻ることができることを確認した。ＨａｅＩＩＩによるミニサークルのインキュベーション後に、この移動は９５ｂｐの直線状の二重鎖の移動と同じであり、開始産物が９５ｂｐミニサークルであることを示す。純粋なＤＮＡミニサークルのワンポット産生についての全収率は３０％である（１５０μｇの初期量のインプットＤＮＡによる環状化反応の１ｍｌあたり、５０μｇの９５ｂｐミニサークルが産生された）。

ミニサークルが、Ｔ５エキソヌクレアーゼ活性後にニックがないこと（共有結合で閉鎖されたミニサークル）を確かめるために、最終的な９５ｂｐミニサークルを変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ＤＮＡミニサークルは１つのバンドとして移動し、完全に共有結合で閉鎖されていることを示唆する。ニックの入ったミニサークル中間体を変性条件下でゲル上で容易に分離することを制御するために、２つのニックの入ったミニサークル中間体を構築した。その目的のために、出発の直線状ＤＮＡ（図２、Ｄ２）を使用し、このＤＮＡは、環状化が１つの鎖のみのＤＮＡ末端のシールによって起こるために、一方の鎖上で１つの５’末端だけがリン酸化される（図１Ｂ）。ミニサークルのニックの入った鎖の消化は一本鎖ＤＮＡミニサークルをもたらす（図１Ｂ、経路１）。９５ヌクレオチド（ｎｔ）の相補的一本鎖ＯＤＮ、または相補的な４０ｎｔおよび５５ｎｔの一本鎖オリゴヌクレオチド両方との等モルのハイブリダイゼーションは、それぞれ単一ニックおよび二重ニックの入ったミニサークルの形成を生じる。各々のニックの入った環状ＤＮＡ対照は変性ゲル上で複数のバンド（一本鎖オリゴヌクレオチドおよび一本鎖ミニサークル）として移動する。この実験は、本方法論によって産生された二本鎖のＤＮＡミニサークルにニックの入った鎖が欠けていることを示す。

図１Ｂ（経路１）中で示されるように、本方法は、二本鎖ミニサークル産生のためのものと同様の収率で、一本鎖環状ミニサークルの調製のためにも容易に使用することができる。したがって、本方法は環状の二本鎖および一本鎖のＤＮＡナノ物体の構築には興味深い方法である。Ａｂｆ２ｐはＤＮＡ巻き戻しを介してプラスミド中に負の超らせんの回転を導入することが示されている。本方法において産生されたミニサークルがスーパーコイルかどうかを決定するために、２つの標準的な方法（すなわち未変性ゲル電気泳動およびヌクレアーゼＢａｌ３１に感受性）を使用した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、マグネシウムカウンターイオンの存在が、ＤＮＡミニサークルが負のスーパーコイルの程度の関数として分離されることを支援することが公知である。図１Ｂの経路１中で図示されるように調製された９５ｂｐの単一ニックの入ったミニサークルを、対照として非拘束ＤＮＡのために使用する。本標準方法において調製されたＤＮＡミニサークルは、Ａｂｆ２ｐ／ＤＮＡモル比（この比はモル／ｌでのＤＮＡ二重鎖の濃度に対するモル／ｌでのＡｂｆ２ｐの濃度として定義される）が１では、ニックの入ったＤＮＡミニサークルの移動と同じ移動を示す。この結果は、本明細書において産生された９５ｂｐミニサークルがリラックス状態の共有結合で閉鎖された環状ＤＮＡであることを示唆する。このデータを確認するために、リラックスＤＮＡミニサークルではなく拘束されたＤＮＡミニサークルを消化する以前に使用された条件で、ミニサークルをＢａｌ３１ヌクレアーゼと共にインキュベーションした。本方法論で産生されたＤＮＡミニサークルはＢａｌ３１に耐性があり、リラックス状態の閉鎖された環状ＤＮＡの形成が確認され、Ａｂｆ２ｐの存在が本アッセイ条件でＤＮＡ巻き戻しを誘導しないことを示す。９５ｂｐミニサークルが、９（９５ｂｐを１０．５４ｂｐで割った）に等しい整数のらせんの反復（Ｌｋ_０）を有し、ＤＮＡミニサークルのらせんの反復は本実験条件下で１０．５４ｂｐ／回転であると推測されることに注目されたい。したがって二重鎖の共有結合の閉鎖がねじれずに起こる。本戦略は、図２中で示されるように、インプットされた出発の直線状重複二重鎖Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５およびＤ６の長さに依存して、様々なサイズのミニサークルをもたらすことができる。したがって８４、９５、１１６、１５８および２００ｂｐの長さのミニサークルが成功して産生された。

ＤＮＡミニサークル中に存在するＤＮＡ配列の性質および位置の選択の自由度（図３）：
上で報告されたデータはランダム配列を含有するＤＮＡにより得られた。ミニサークルの形成に使用されるＤＮＡ配列の性質および位置に関する本方法の多用性を例示するために、次いで本出願人は周知の転写因子ＮＦ−κＢのためのコンセンサス配列を含有するＤＮＡミニサークルをデザインした（図３）。１つまたは２つのκＢ結合部位（ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ）を含有する９５ｂｐミニサークルは、上で図示されたものと同じ条件において生成された（図３、Ｄ７およびＤ８）。反応の収率は変化せず、κＢ配列の位置（重複領域中で、または出発の直線状のニックの入ったＤＮＡの末端で）に依存しなかった。次いでかかるＤＮＡミニサークルの結合能力は、結合部位の数に従って試験された。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は非標識ＤＮＡミニサークルおよびＳＹＢＲグリーン染色（それは本方法によって産生された多量のミニサークルによる放射性標識を回避するという長所を提示する）を使用して実行された。ミニサークルとＮＦ−κＢの結合活性の実施例は図５中で示される。第一に、単一のＮＦ−κＢ結合部位（図５、Ａ）を含有する９５ｂｐのリラックス状態の閉鎖されたミニサークルを漸増濃度のＮＦ−κＢによりインキュベーションし、次いで反応混合物をＥＭＳＡによって分析した。ＮＦ−κＢタンパク質（ｐ５０／ｐ５０ホモダイマー）の存在下において、遅れたバンドはＤＮＡタンパク質複合体に対応して観察され、その強度はタンパク質濃度の関数として増加する。第２の結合部位がミニサークル内に存在する場合、ミニサークルへ第２のタンパク質が結合したことに対応する、第２のより遅く遅れたバンドの存在が観察された（図５、Ｂ）。この結果は、短いＤＮＡミニサークルがＤＮＡ結合タンパク質（転写因子等）を効率的に引きつけることが可能であることを示す。ＮＦ−κＢは炎症性経路の刺激を介して癌に関与する。治療用の対象となる特異的な標的タンパク質を引きつけるミニサークルの能力は、治療用の適用（デコイ戦略）のために非常に興味が持たれる。

プラスミドＤＮＡの核インポートの促進のために従来使用される複数のＮＦ−κＢ配列（配列３ＮＦ等）または６つのκＢ配列の配列を包含する９５ｂｐミニサークル（図３中で示されるような出発の二重鎖Ｄ９およびＤ１０）；出発の二重鎖Ｄ１１を使用して様々な転写因子結合部位（ＮＦ−κＢ、ＥＴＳ１、ＳＴＡＴ３）の組み合わせを備えた９５ｂｐミニサークルも、効率的に産生された。

ヒトテロメア配列（ＴＴＡＧＧＧ）も二重鎖Ｄ１２を使用して９５ｂｐミニサークルの一部とすることができる。ＤＮＡミスマッチも二重鎖Ｄ１３を使用してミニサークル内に導入することができ、本明細書において提示された方法がＤＮＡひずみを備えたミニサークルの調製を可能にすることを示す。

したがって、本明細書において提示されるような様々な配列を備えたミニサークル産生の全収率は、Ａｂｆ２ｐ活性とともに環状化される出発ＤＮＡ基質中のニックの存在に主に依存する。しかしながら、予測されないＤＮＡ配列効果によって環状化反応の効率が修飾され得るかもしれないことを完全に除外することができない。かかる事例において、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動上での二重鎖の単純な分析によってオリゴヌクレオチドのアニーリングを制御することおよび／または環状化反応におけるＡｂｆ２ｐの量を増加させることが推奨される。

化学官能性を含有するミニサークルの産生（図４）：
商業的に入手可能な合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、固体支持体合成の過程で様々な塩基類似体および修飾により容易に官能化される。本明細書において、環状化反応が化学的に修飾したオリゴヌクレオチドを許容するかどうかを知るために、環状化の本方法論を複数の塩基修飾を含有するＤＮＡへ拡張した。

部位特異的に配置された天然の塩基修飾を備えたミニサークル：
・８−オキソグアニン：
８−オキソグアニンは、ＤＮＡが酸化条件またはイオン化照射へさらされる場合に天然で形成される塩基修飾である。かかる損傷は、８−オキソグアニンの切り出しを触媒する周知の大腸菌由来ホルムアミドピリミジン（Ｆｐｇ）修復タンパク質によって修復することができ、本アッセイにおいて鎖のニックをもたらす。

９５ｂｐミニサークルは、同じ鎖内に１つまたは２つのいずれかで８−オキソグアニン残基を含有するインプットＤＮＡから産生した（図４、Ｄ１４、Ｄ１５）。単一または二重の８−オキソグアニンで修飾されたミニサークルの産生収率はＤＮＡ内の塩基修飾の存在に感受性はなく、塩基修飾の有無にかかわらず９５ｂｐミニサークルは、変性ＰＡＧＥ上で単一のバンドとして同一に移動する。単一の塩基修飾を含有するミニサークルがＦｐｇの存在下においてインキュベーションされ、次いで反応混合物が変性ゲル上にロードされる場合、ミニサークルに対応する出発バンドが消滅して、それぞれ９５ｎｔの一本鎖ミニサークルおよび９４ｎｔの直線状の断片として共移動する２本の新規のバンドを生じることが観察できる。９５ｂｐミニサークルの同じ鎖内に２つの８−オキソグアニン残基を図示されるような位置（図４、Ｄ１５）で導入することにより、Ｆｐｇ活性後にＤＮＡ産物の予想されるサイズがもたらされる。治療用の対象となる修復タンパク質を引きつけそのための基質である複数の修飾塩基を持つＤＮＡミニサークルの能力は、生物学的な適用（デコイベースの戦略）のために非常に興味が持たれる。

本方法論は、癌に関与する以下の複数の標的タンパク質をトラップする目的で、ＤＮＡミニサークル内に多様な修飾塩基を取り込むことへ拡張される。修復タンパク質（０６−Ｍｅ−ｄＧ修飾塩基による、０６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ等）；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（メチル化シトシン修飾塩基による、シトシン−５メチルトランスフェラーゼ等）。

部位特異的に配置された標識を備えたＤＮＡミニサークル：
・ビオチン残基
ピリミジン環のＣ５原子へスペーサーによって連結したビオチン分子を備えた誘導体ｄＴヌクレオチドの存在が本方法論において使用される環状化反応を修飾するかどうかを第一に調べた。二重鎖Ｄ１６（図４）を使用して本プロトコルが完了した後に、産生の収率の減少なしに純粋な閉鎖されたＤＮＡミニサークルを得た。ビオチン残基の存在および非存在下でミニサークルはＥＭＳＡゲルの下部で単一のバンドとして移動した。ミニサークルがストレプトアビジンによりプレインキュベーションされる場合、ミニサークルがビオチン残基を含有する時のみでより遅く移動するバンドが観察され、ストレプトアビジンがビオチン標識ミニサークルを結合することを示す。反対のＤＮＡ鎖上に配置された場合に第２のビオチンも取り込むことができる（図４、Ｄ１７）。したがって、Ａｂｆ２ｐ依存性環状化反応は、かさ高いＤＮＡの修飾の存在を支援する。

・蛍光色素分子：
ビオチンそれ自体は比較的小さな残基であるので、次いでビオチンの代わりの標識としてより大きな分子（蛍光色素分子等）を使用できるかどうかを調べた。インプットのシアニン３またはカルボキシフルオレセインにより修飾したＤＮＡ（図４、Ｄ１８、Ｄ１９、Ｄ２０、Ｄ２１）を使用して、本方法論は、シアニン３またはカルボキシフルオレセインによって部位特異的に標識された９５ｂｐミニサークルを良好な量で生成する。分光測光法測定から推定されるように、ヌクレオチドに対する蛍光色素分子の比から、１つまたは２つの蛍光色素分子が１つのミニサークルあたり存在することが確認された。

血清中でのヌクレアーゼ活性への抵抗性（図６）：
上で示された実験および結果において例証されたように、本発明の閉鎖された二本鎖ミニサークルは、組換えエキソヌクレアーゼタンパク質（エキソヌクレアーゼＩＩＩＩおよびＴ５エキソヌクレアーゼ等）に耐性がある。エンドヌクレアーゼ活性ではなくエキソヌクレアーゼ活性が細胞質中の外来ＤＮＡ分解の主要な機構であることが知られている（Ｓａｓａｋｉ，Ａ．ａｎｄ Ｋｉｎｊｏ．，Ｍ．，２０１０，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １４３，１０４−１１１）。したがって、ミニサークルが細胞中で高い安定性を有するに違いないことが予想される。しかしながら、分子療法（デコイ戦略等）における核酸の使用で重要な限定工程は、血液中での大きな不安定性である。ヌクレアーゼ分解に対するＤＮＡミニサークル感受性を決定するために、ＤＮＡミニサークルをヒト血清中で３７℃でインキュベーションした。アリコートを時間の関数として採取し、ポリアクリルアミドゲル上での移動後にミニサークル安定性を分析した。出発ミニサークルの量を、図６中で示されるように時間の関数として定量化した。９５ｂｐミニサークルの半減期は、リラックス形態および拘束形態についてそれぞれ約１１時間および１３時間であることが見出された。比較の目的のために、本実験条件におけるスーパーコイルプラスミドＤＮＡは、以前のデータに一致して、約１分の非常に短い半減期を示すことが見出された（Ｈｏｕｋ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＡＡＰＳ Ｐｈａｒｍｓｃｉ．１，１−５．）。文献（Ｏｓａｋｏ，Ｍ．，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９，８１２−８１９）にも一致して、直線状のＤＮＡ二重鎖は血清ヌクレアーゼ分解に非常に影響を受けやすいことが見出された。したがって、本発明に記載のホスホジエステル骨格を備えたミニサークルは、治療用オリゴヌクレオチドとしてのミニサークルのさらなる使用のために必要とされる特性であるヒト血清中で３７℃での高い安定性を示す。

比較結果（図７）：
本発明のＤＮＡミニサークルを得る方法を、ミニサークルを得るための先行技術において使用された実験条件と、特に基質として直線状のニックの入っていないＤＮＡ二重鎖を使用し、かつ環状化反応の間に湾曲タンパク質の使用のないリガーゼ媒介性環状化方法と、比較した。図７は染色した未変性ポリアクリルアミドゲルのイメージを示し、Ａｂｆ２ｐ湾曲タンパク質の存在下において、リガーゼ媒介性環状化において形成されるオリゴマーの直線状産物が大幅に減少し、それと共にミニサークル産物が同時形成されることを、Ａｂｆ２ｐの非存在下において実行された反応と比較して例証する。使用したリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。リガーゼによるＤＮＡ二重鎖のインキュベーションを、Ａｂｆ２ｐ有り（ライン５）または無し（ライン２）で実行した。

これらの結果は、先行技術の実験条件において（すなわち、ニックの入っていないＤＮＡ基質の使用およびＤＮＡ湾曲タンパク質無し）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、９５ｂｐの直線状二重鎖から環状ＤＮＡを完全に生成することができないことを実証する（図７のレーン３を参照）。かかる反応において形成されたライゲーション産物は直線状マルチマーであり、重要なことにはＤＮＡミニサークルは形成されない。比較の目的のために、本発明において図示されるような典型的な反応条件がレーン５中で示され、高収率のＤＮＡミニサークルが、わずかな量の直線状マルチマーと共に形成されることを示す。これらのデータは小さなＤＮＡ断片はリガーゼ媒介性環状化へ完全に耐性があることを例証する。

これらの結果は、リガーゼ依存性環化工程の間に直線状の合成のニックの入った基質およびＤＮＡ湾曲タンパク質の組み合わせ使用が、任意のサイズ（場合によっては２５０未満の塩基対）のミニサークルの産生の収率を大幅に改善することを実証する。かかる方法は、任意のサイズおよび配列のミニサークルのデザインならびに塩基修飾の包含における大きな柔軟性も提供する。

Claims (13)

1. ８０〜２５０未満の間の塩基対を含むＤＮＡミニサークルのインビトロの産生のための方法であって、
   ａ）少なくとも１つのリン酸化５’末端を有するニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質であって、８０〜２５０未満の間の塩基対を含むニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質を提供する工程と；
   ｂ）前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質、およびＨＭＧ群からの非配列特異的タンパク質からなる群から選択されるＤＮＡ湾曲タンパク質を含む反応混合物上でリガーゼ媒介性環状化を実行する工程と；
   ｃ）ＤＮＡミニサークルを得る工程と
   を含む、ＤＮＡミニサークルのインビトロの産生のための方法。
2. 工程ｃ）が反応混入物を排除する工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 反応混入物を排除する工程ｃ）が、プロテアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群から選択された少なくとも１つの酵素の添加を含む、請求項２に記載の方法。
4. ＨＭＧ群からの非配列特異的タンパク質からなる群から選択される前記ＤＮＡ湾曲タンパク質が、ＨＭＧＢ１、ＮＨＰ６ＡまたはＡｂｆ２ｐタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 工程ａ）で提供された前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質が、１０〜２０塩基対の間に含まれる重複ニック間領域を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 工程ａ）で提供された前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質が２つのリン酸化５’末端を有し、工程ｃ）で得られた前記ＤＮＡミニサークルが二本鎖の閉鎖されたリラックスＤＮＡミニサークルである、請求項１または５のいずれか一項に記載の方法。
7. 工程ａ）で提供された前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質がただ１つのリン酸化５’末端を有し、工程ｃ）で得られた前記ＤＮＡミニサークルが一本鎖ＤＮＡミニサークルである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
8. ｄ）工程ａ）のニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質鎖の非リン酸化５’末端を有する鎖に相補的な直線状のオリゴヌクレオチドを添加する工程と；
   ｅ）ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルを得る工程と
   をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. ａ）ただ１つのリン酸化５’末端を有するニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質を提供する工程と、
   ｂ）前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド基質およびＤＮＡ湾曲タンパク質を含む反応混合物上でリガーゼ媒介性環状化を実行する工程と、
   ｃ）ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルを得る工程と、
   ｄ）工程ｃ）で得られたニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルへキナーゼを添加する工程と、
   ｅ）ＤＮＡインターカレーターの存在下において前記ニックの入った二本鎖ＤＮＡミニサークルをライゲーションする工程と、
   ｆ）スーパーコイルＤＮＡミニサークルを得る工程と
   を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
10. 少なくとも１つのリン酸化５’末端を有する前記ニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質が、タンパク質推定結合部位、ＤＮＡ結合部位、化学官能性、ＤＮＡ塩基ミスマッチからなる群から選択される少なくとも１つの配列官能化をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. タンパク質推定結合性部位が、転写因子、ＤＮＡ修復タンパク質、テロメアタンパク質、リモデリング因子、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、構成上のタンパク質、トポイソメラーゼおよび制限酵素からなる群から選択されるタンパク質のための結合部位を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記化学官能性が、部位特異的に配置された塩基修飾および部位特異的に配置された標識を含む、請求項１０に記載の方法。
13. ａ）少なくとも１つのリン酸化５’末端を有し、８０〜２５０未満の間の塩基対を含むニックの入った二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド平滑末端基質と；
    ｂ）ＨＭＧ群からの非配列特異的タンパク質からなる群から選択されるＤＮＡ湾曲タンパク質と；
    ｃ）リガーゼと
    を含む、ＤＮＡミニサークルのインビトロの産生のためのキット。