JP6484444B2 - フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ｆａｈ）欠損及び免疫不全ラット、並びにそれらの使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年８月２６日出願の米国仮特許出願第６１／５２７，８６５号「フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）欠損動物及びそれらの使用」の優先権の利益を主張し、その全体を参照によりここに援用する。

連邦政府支援による調査又は開発事項に関する記載
本発明の一部は、米国国立衛生研究所によって与えられる助成金番号１ＤＰ２ＯＤ００８３９６−０１の下、政府の支援で行われている。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。

配列表
添付の配列に記載される核酸及びアミノ酸配列は、Ｃ．Ｆ．Ｒ．３７（米国特許規則）１．８２２に従って提示される。それぞれの核酸一次構造の一方のストランドのみを示すが、その相補鎖も、表示されたストランドのあらゆる参照事項に含まれることが理解されよう。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されるが、これは２０１２年８月２４日に作成され、２２ＫＢであり、その全体を参照によりここに援用する。添付の配列表中：配列番号１はラットＦＡＨタンパクの部分の配列であり、配列番号２はラットＦａｈ遺伝子ターゲティングカセットのヌクレオチド配列であり、配列番号３〜２０はプライマーのヌクレオチド配列であり、配列番号２１は野生型Ｆａｈラット遺伝子の部分のヌクレオチド配列であり、配列番号２２は野生型ＦＡＨタンパクのアミノ酸配列であり、配列番号２３〜２５は突然変異株ｍ１−ｍ３のアミノ酸配列であり、配列番号２６は野生型Ｉｌ２ｒｇ遺伝子の部分のアミノ酸配列であり、配列番号２７は野生型Ｒａｇ２遺伝子の部分のアミノ酸配列であり、配列番号２８は配列番号１のアミノ酸配列の中にあり、配列番号２９はアナキンラのアミノ酸配列である。

本開示は、肝性欠損症及び／又は免疫不全症を有しているラットモデル及びその使用に関する。また、この開示は、この動物モデルを用いる方法に関し、例えばこの動物モデル内でヒト肝細胞等の異種の肝細胞を増殖させることを含む。

肝臓は、医学的な薬剤を含む生体外物質化合物の新陳代謝を行う主要部位である。多くの肝酵素が化学種特異性を有するので、培養された初代ヒト肝細胞又はそのミクロソーム分画を用いて候補薬剤の新陳代謝を評価することが必要となる。ミクロソーム肝細胞画分は、代謝のいくつかの機能を解明するために用いることができるものの、生きている肝細胞に依存する試験も存在する。例えば、肝酵素に作用して、それらの新陳代謝を、時間とともに変化させるような化合物も存在する。酵素作用を分析するため、肝細胞は、生きている必要があるだけでなく、完全に区別され機能を有する必要もある。

ヒト肝細胞は、医薬品業界において臨床前の薬剤開発に広く用いられる。ヒト肝細胞の使用は、薬剤開発の一部としてＦＤＡによって委任される。薬物代謝及びその他の研究では、肝細胞は、通常、献体ドナーから分離され、試験を行う場所に持ち運ばれる。献体からの肝細胞の状態（生存能力及び判別状態）は非常に変化しやすく、多くの細胞標品は、ぎりぎりの品質である。高品質ヒト肝細胞の利用度は、組織培養中で大量に増殖できない
という事実によってさらに低くなる。プレーティングの後に、細胞は生き残るが分割しない。容易に利用できる哺乳動物種、例えばマウス等のからの肝細胞は、薬剤試験には適切でなく、この理由は、代謝性酵素の補体が異なっており、導入に関する研究中の応答が異なっているためである。また、不死のヒト肝細胞（肝癌）又は胎児の肝芽腫も、完全に分化された大人の細胞の代替としては適切でない。また、ヒト肝細胞は、微生物学分野の研究に必要である。肝炎を引き起こすウイルス等の多くのヒトウイルスは、他の細胞型に複製することができない。

さらに、生体外で肝細胞を用いる生体人工肝臓補助装置が、急性肝不全の患者の支援に使用されている。その他、肝細胞移植の臨床試験が行われており、肝細胞移植が有益な可能性があるという原理証明が提示されている。現在、ヒト肝細胞は、培養で大量に増殖することができない。幹細胞に由来する培養した肝細胞は、未熟であり、一般に全ての機能を有していない。したがって、今日用いられている全ての肝細胞は、献体又は外科の検査材料としての、ヒトドナーに由来し、それは、肝細胞の利用度を大きく制限する。十分なヒト肝細胞が利用できれば、生体人工肝臓援助装置は、現実的な技術になり、ヒト肝細胞移植の使用は、さらに広がっていく筈である。これらの限界がある中で、初代ヒト肝細胞を増殖する方法が大きく望まれている。また、プロセス動物衛生産業においては、調査及び研究のため、別の生物種、例えばイヌ、ウマその他からの肝細胞を増殖することが必要である。

別の生物種（特にヒト）からの肝細胞の増殖を含む様々な目的の用途を有するラットが、肝硬変、肝細胞癌及び肝感染症を含む肝臓疾患の動物モデルとして、ここに記載される。一般に、ラットは、肝臓損傷及び／又は免疫不全症が誘発された機能不全の肝臓（肝欠損症）を有するが、それはここでさらに詳述する。

ここは、異種の肝細胞の増殖方法、特に生体内におけるヒト肝細胞の増殖方法が提供される。特定の実施形態においては、本方法は、異種の肝細胞（又は肝細胞原体）をＦａｈ欠損ラットに移植するステップと、異種の肝細胞の増殖するステップとを有している。Ｆａｈ欠損ラットは、免疫抑制又は免疫不全である場合もある。特定の実施形態では、Ｆａｈ欠損ラットは、異種の肝細胞の移植の前に、ウロキナーゼをコード化するベクターを投与される。

また、生体内における異種肝細胞の増殖方法は、異種の肝細胞（又は肝細胞原体）を免疫不全ラットに移植するステップと、異種の肝細胞を増殖するステップとにより提供される。特定の実施形態では、異種の肝細胞は、少なくとも約２週、４週、５週、６週、７週、８週又は数か月間増殖することが可能になる。

また、Ｆａｈ欠損及び／又は免疫不全ラット内で増殖し収集された分離肝細胞（ヒト肝細胞等）が、本開示によって提供される。

また、本発明は、遺伝子組み替えラットのゲノムがホモ接合性を示して、Ｆａｈ遺伝子が分裂し、この分裂により機能的ＦＡＨタンパクの発現に欠損が生じてラットの肝機能が低減する、遺伝子組み替えラットを提供する。実施例では、Ｆａｈ欠損ラットはさらに、移植された異種の肝細胞を有している。Ｆａｈ欠損ラットは、免疫抑制されているケースもある。

Ｆａｈ遺伝子中に分裂部分を有する分離されたラット胎生期幹細胞が、さらに提供される。

また、ＴＡＬＥＮの他にＡＡＶ−ＤＪベクターを用いた同種遺伝子組換えを含む各種方法によってＦａｈ欠損ラット細胞を生成する方法が提供される。

ヒト肝臓疾患、薬剤候補者及び生体外物質の生体内の分析、ラットモデルを使う方法は、また、提供される。

上記及びその他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して説明する実施形態の詳細な説明から、さらに明らかになる。

対応するアミノ酸配列（配列番号２８）及びＰＣＲプライマーに加えてヌクレオチド配列（配列番号１）と共にイントロン２〜３及びイントロン３〜４を含む野生型ｒＦＡＨ遺伝子の概略図である。概略図中のイントロンに隣接する配列は、ｒＦａｈ ＫＯターゲティングカセット中に含まれる配列を示す。外側配列は、標的配列の外に存在するがｒＦａｈ遺伝子の一部である配列を示す。 側に１．７ ｋｂの選択カセットＰＧＫ：ＮＥＯがある１．５ ｋｂの５ｆホモロジー領域及び１．５ ｋｂの３ｆホモロジー領域を含むラットＦａｈターゲティング構成を示す概略図である。 ＰＧＫ：ＮＥＯ配列を含む一体型のターゲティングＫＯカセットによるラットＦａｈ遺伝子の概略図である。 ＰＧＫ：ＮＥＯ配列を含む一体型の目標とするＫＯカセットによるｒＦａｈ遺伝子の概略図である。矢印は、プライマー結合部を示し、括弧は全体のＰＣＲ生成物を示す。５ｆ及び３ｆＰＣＲプライマーペアは、ターゲットの配列の外のｒＦａｈ遺伝子をアニールした第１のプライマーとＰＧＫ：ＮＥＯに配列をアニールした第２のプライマーとを含む。それぞれのＰＣＲ反応では、ｇＤＮＡ０．１ ｎｇと各ＰＣＲプライマー２μＭを含んでいた。変性、アニーリング及び伸張温度は、サイクル数とともにそれぞれのプライマーに最適化した設定にした。 図５（Ａ）は、それぞれの潜在的なｒＦａｈＫＯＥＳクローン１１〜１９を示す５ｆ及び３ｆＰＣＲ反応の写真である。各プライマーペアの予測された分子量が示される。クローン１４、１７及び１９は、一体型のｒＦａｈＫＯカセットを含んでいないと考えられる。図５（Ｂ）は、組込み部位の外側の全てのｒＦａｈプライマーを用いたＥＳクローンからのＰＣＲ生成物の写真である。 図６（Ａ）は、ｒＦａｈ遺伝子ＷＴ及びターゲットの領域のＫＯゲノムの概略図である。矢印及び括弧は、サザンブロットのハイブリッド化に使用される３２Ｐのラベルが付いたＰＣＲ生成物を示す。図６（Ｂ）は、サザンブロットの画像を示す。各ＥＳクローンからのゲノムＤＮＡ１５μｇを、ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで３７℃一昼夜消化した。消化された生成物を、０．７％のアガロース：ＴＢＥゲルで電気泳動し、アルカリ転写バッファーによるナイロン膜へのキャピラリー移植の前に、ＤＮＡを酸デプリネイションに晒した。膜は、Ａ及びＢに示されたＰＣＲ生成物からのプローブでラベルされた３２Ｐでハイブリッド化された。 図７（Ａ）は、ラット２９の肝臓の内側のヒト肝細胞のクラスターのＦＡＨポジティブ染色（赤）の画像を示し、図７（Ｂ）は、ＦＲＧＫＯマウス制御の肝臓内のヒト肝細胞のＦＡＨポジティブ染色（赤）の画像を示す。 図８（Ａ）は、ラットＦａｈ遺伝子の情報配列３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿０１７１８１）中の配列をターゲットとし分裂させるようデザインされたペアのＴＡＬＥＮの概略図であり、図８（Ｂ）は、特異的なＴＡＬＥＮ結合部（下線及び大文字で強調）を有する野生型ＴＡＬＥＮ標的配列（配列番号２１）である。 実施例６の配列番号２２〜２５で識別される野生型及び突然変異のアミノ酸配列である。 ともに実施例６の菌種の中（配列番号２６）の遺伝子を阻害するためにＳＳ及びＳＤ胚に注入される、ラットＲａｇ２のＴＡＬＥＮｓターゲティング暗号配列及びクロモソームＸ−リンクＩｌ２ｒｇ遺伝子である。各標的部位の野生型配列が示され、ＴＡＬＥＮモノマー結合部を下線で強調した。 ヌルアニマル（ＳＳ−Ｉｌ２ｒｇ−ｍ１^−／ｙ及びＳＳ−Ｒａｇ２ｍ１^−／−ｍａｌｅｓ）の免疫性の表現型を示し、Ｉｌ２ｒｇヌルアニマルに特異的なＣＤ３＋Ｔ細胞（緑円）、両菌種中のＣＤ４５ＲＡ＋Ｂ細胞（青円）、及びＣＤ３−／ＣＤ１６１ａ^ＨＩＧＨＮＫ細胞（赤円）の欠損症を明らかにした。 ヌルアニマル（ＳＳ−Ｉｌ２ｒｇ−ｍ１^−／ｙ及びＳＳ−Ｒａｇ２ｍ１^−／−ｍａｌｅｓ）の免疫性の表現型を示し、Ｉｌ２ｒｇヌルアニマルに特異的なＣＤ３＋Ｔ細胞（緑円）、両菌種中のＣＤ４５ＲＡ＋Ｂ細胞（青円）、及びＣＤ３−／ＣＤ１６１ａ^ＨＩＧＨＮＫ細胞（赤円）の欠損症を明らかにした。 Ｆａｈヘテロ接合育種から生きて生まれた子ラットの遺伝子型の表である。 ８日間のＮＴＢＣ禁断の後の９週齢ＳＳ−Ｆａｈ−ｍ１^−／−の固定組織のトリクロム染色であり、ＮＴＢＣの同齢のコントロールＳＳ近交系動物と比較して明らかに肝臓機能不全制御（矢印）の証拠を示す。 ８日間のＮＴＢＣ禁断の後の９週齢ＳＳ−Ｆａｈ−ｍ１^−／−の固定組織のトリクロム染色であり、ＮＴＢＣの同齢のコントロールＳＳ近交系動物と比較して明らかに腎臓の傷害の証拠を示す。

Ｉ． 用語及び方法
特に明記しない限り、専門用語は、従来の使用法によって用いられる。分子生物学中の通常の用語の定義は、オックスフォード大学出版部から出版のＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ著、「遺伝子Ｖ」１９９４ （ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）、Ｋｅｎｄｒｅｗら編纂、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．より出版のＴｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４ （ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）、及びＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃより出版のＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ編纂のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， １９９５ （ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。開示の各種実施形態のレビューを容易にするため、特定の用語の説明を、以下に提供する。

ＡＡＶ−ＤＪベクター：ＡＡＶ２、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８カプシドタンパク質及びＡＡＶ２レプタンパクを含むハイブリッドカプシッドを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）実装ヘルパーである（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：５８８７， ２００８；米国特許第７，５８８，７７２号；米国特許出願公開第２０１０／００４７１７４号）。

投与：治療薬等の試剤を、あらゆる有効なルートによって、被験者に提供又は与えることをいう。非限定的かつ例示的な投与のルートは、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹膜内の及び静脈等）、経口、導管内、舌下の、直腸、経皮、鼻腔内、膣及び吸入のルートを含む。

肝臓疾患の発達を抑制、防止又は回避する試剤：Ｆａｈ欠損ラットに投与した場合に、動物中の肝臓疾患の発達を防止、回避、遅延又は抑制する化合物又は組成物をいう。肝臓疾患又は肝臓機能不全は、肝臓組織中の変質作用（例えばネクローシス、炎症、線維症、形成異常又は肝癌）や、肝臓−特定の酵素及び別のタンパク（例えばアスパルテートアミノトランスフェラーゼ、Ａアミノトランスフェラーゼ、ビリルビン）アルカリホスファタ
ーゼ及びアルブミン）、血漿又は尿のスクシニルアセトン（ＳＡ）、又は広範囲な肝不全等のレベルの変質作用を非限定的に含む、多数の徴候又は症状により特徴づけられる。特定の実施形態においては、肝臓疾患を抑制する試剤は、例えば２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチルベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）（２−［２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンゾイル］シクロヘキサン−１，３−ジオン）又はメチルＮＴＢＣ等の４−ＯＨ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの薬理学の阻害剤を用いている。１つの非限定的な実施例では、肝臓疾患を抑制する試剤は、ＮＴＢＣである。

アナキンラ：インターロイキン−１（ＩＬ−１）のレセプターアンタゴニストである。アナキンラは、多くの組織及び器官の中に発現されるＩＬ−１とＩＬ−１レセプターとの結合を競争的に抑制することにより、自然に生じるＩＬ−１の生物学的活動度をブロックする。ＩＬ−１は、炎症性の刺激に反応して生成され、炎症反応及び免疫反応を含む各種生理学上の応答の媒介となる。アナキンラは、遺伝子組み替え大腸菌の培養から調製されるヒトＩＬ−１ＲＡ（ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト）の、組換え型非グリコシル化バージョンである。アナキンラタンパクは、１５３個のアミノ酸であり、約１７．３ ｋＤの分子量を有し、それがそのアミノ末端に単一のメチオニン残基を有するという点で、天然のヒトＩＬ−１ＲＡとは異なっている（アナキンラのアミノ酸配列は、ここでは配列番号２９と記す）。また、アナキンラは、ＫＩＮＥＲＥＴＴＭとしても知られている。

アザチオプリン：細胞増殖、特に白血球の増殖を抑制するプリン合成阻害剤である免疫抑制剤である。この免疫抑制剤は、自己免疫性疾患や器官移植拒絶反応の治療にしばしば使用される。これは、体内で、活性なメタボライト６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）及び６−チオイノシン酸に変換されるプロドラッグである。アザチオプリンは、多数の製造業者により以下のブランド名で生産されている（ＳａｌｉｘからＡｚａｓａｎ（商標）、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ ＫｌｉｎｅからＩｍｕｒａｎ（商標）、Ａｚａｍｕｎ（商標）及びＩｍｕｒｅｌ（商標））。

生体サンプル：被験者の細胞、組織又は体液から得られるサンプル、例えば末しょう血液、血清、血漿、脳脊髄液、骨髄、尿、唾液、組織生検、外科の検査材料及び死体解剖材料などである。ここでは、単に「サンプル」とも言う。

肝硬変：正常な微細な小葉の構成を損失させ、壊死した実質の組織を、結合組織の繊維状バンドで再生式に置換し、ついには器官を収縮させて不規則な小結節に分割するという特徴を有する一群の慢性の肝臓疾患をいう。肝硬変は、長期間の潜伏期があり、通常はその後、突然の腹部の痛覚及び吐血、それに伴う水腫又は黄疸による腫脹が生じる。進行した段階では、腹水、顕著な黄疸、門脈圧高進、静脈瘤が生じることもあり、中心神経系が障害を起こして、肝性昏睡となる場合もある。

収集：ここで用いられる例では、増殖した異種の肝細胞を「収集する」こととは、単離された異種の肝細胞を注入又は移植したラット（レシピエントラットとも言う）から、増殖された肝細胞を除去するプロセスをいう。この収集には、肝細胞を別の細胞型から分離することを、随意含む。一具体例では、増殖された異種の肝細胞は、ラットの肝臓から収集される。

インターロイキンレセプター（Ｉｌ２ｒｇ）の共通γ鎖：インターロイキンレセプターの共通のガンマ鎖をコード化する遺伝子のことを言う。Ｉｌ２ｒｇは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む多数のインターロイキンレセプターの成分である（Ｄｉ Ｓａｎｔｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：３７７−３８１， １９９５）。Ｉｌ２ｒｇ欠損動物は、Ｂ細胞及びＴ細胞が低減し
、ナチュラルキラー細胞が欠損している。また、既知のインターロイキン２レセプターガンマ鎖としても知られている。

低温保存：ここでの用例では、「低温保存した」とは、零下よりも低い温度、例えば７７Ｋないし−１９６℃（液体窒素の沸点）に冷却することにより保存又は維持される細胞（肝細胞等）又は組織のことを言う。この低い温度では、細胞を死に導く生化学反応を含むあらゆる生物学的活性度が、効果的に停止される。

シクロスポリンＡ：土壌真菌ボーベリアニベア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｎｉｖｅａ）により生成される１１のアミノ酸の非リボソーム環状ペプチドである免疫抑制剤化合物をいう。シクロスポリンＡは、器官・組織移植における移植片拒絶の予防に用いられる。また、シクロスポリンＡは、サイクロスポリンないしシクロスポリンとして知られている。

肝機能低下：肝臓の健康状態又は機能を測定する多数のパラメータのいずれかにおける異常な変化をいう。また、肝機能低下はここでは、「肝臓機能不全」ともいう。肝機能は、従来技術で周知の多数の手段のいずれかにより評価でき、非限定的な例としては、肝臓組織学的検査、肝酵素その他のタンパクの計測を挙げることができる。例えば、肝臓機能不全は、ネクローシス、炎症、線維症、酸化による損傷又は肝臓の形成異常によって示すことができる。場合により、肝臓機能不全は、肝細胞癌等の肝性癌により示される。肝臓機能不全の評価用の試験が可能な肝酵素及びタンパクの実施例には、非限定的に、Ａアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、アルカリホスファターゼ及びアルブミンが含まれる。また、肝臓機能不全は、一般的な肝不全に至ることもある。肝機能試験の手順は、従来技術において周知であり、例えば、Ｇｒｏｍｐｅら（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７： ２２９８−２３０７， １９９３）及びＭａｎｎｉｎｇら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６：１１９２８−１１９３３， １９９９）により教示されている。

欠損：ここで用いられる例では、「Ｆａｈ欠損」又は「Ｆａｈの欠損」とは、ＦＡＨ酵素産生又は活性が著しく小さいか不在の動物、例えばラット等をいい、例えば、Ｆａｈ遺伝子（例えば組込み、欠失又は１つ以上のポイントミューテーション）に分裂部分を有する動物をいい、これにより、ＦａｈｍＲＮＡの発現及び／又は機能性ＦＡＨ酵素の活性が著しく小さいか不在の状態になる。ここで用いられる例では、機能性ＦＡＨタンパクの用語「発現の損失」は、発現の完全な損失のみにとどまらず、機能性ＦＡＨタンパクの発現が著しく低減すること、例えば約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％の減少等を指す。特定の実施形態では、Ｆａｈ欠損ラットは、Ｆａｈ遺伝子（インフレーム終止コドンを含む組込み等）中にヘテロ接合性又はホモ接合性の組込みを備え、この中でもホモ接合性組込みが特に好適である。特定の実施形態では、組込みは、Ｆａｈの情報配列３の中にある。特定の実施形態では、Ｆａｈ欠損ラットは、Ｆａｈ遺伝子中にヘテロ接合性又はホモ接合性欠失を備え、この中でもホモ接合性欠失が特に好適である。一例では、欠失は、Ｆａｈの情報配列３の中にある。別の実施形態では、Ｆａｈ欠損ラットは、Ｆａｈ遺伝子中に１つ以上のポイントミューテーションを備える。適切なＦａｈポイントミューテーションの例は、従来技術において既知である（例えば、Ａｐｏｎｔｅら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９８（２）： ６４１−６４５， ２００１を参照）。

枯渇：低減又は除去することをいう。例えば、「マクロファージ枯渇」は動物中のマクロファージを排除し、除去し、低減し、又は殺すプロセスをいう。マクロファージの枯渇した動物は、必ずしも完全にマクロファージがないというわけではなく、少なくともマクロファージの数又は活性が低減しているだけである。特定の実施形態では、マクロファージの枯渇により、機能性マクロファージが少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なく
とも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％あるいは１００％低減される。

破壊：ここで用いられる例では、遺伝子の「破壊」は、組込み、欠失又は先端突然変異のいずれか、又はこれらの組合せのことをいう。特定の実施形態では、破壊は、ｍＲＮＡ及び／又は機能性タンパクの発現の一部又は全部の損失になる。

生着：動物中に細胞又は組織を組み込むことをいう。ここで用いられる例では、レシピエントラットにおける異種肝細胞の生着とは、異種肝細胞が注入によりレシピエントラットに移植されるプロセスのことをいう。生着された異種の肝細胞は、レシピエントラット中で増殖できる。

増殖：数が増加することをいう。ここで用いられる例では、異種の肝細胞を「増殖する」とは、細胞分割を可能にして、肝細胞が生体内に活発に増殖し、異種の肝細胞数が、レシピエントラットに移植した異種肝細胞の最初の数と比較して増加するようにするプロセスのことをいう。

胚：後胚期間中にある、生まれていない動物の子孫をいう。

ＦＫ５０６：ＦＫ５０６は、タクロリムス又はフジマイシンとしても知られており、免疫抑制剤薬剤である。ＦＫ５０６ ２３員のマクロライドラクトンが、バクテリアストレプトマイセスツクバエンシスを含む日本の土試料の培養液中で最初に発見された。この化合物は、同種異系臓器移植の後、患者の免疫系の活性を低減して器官拒絶反応のリスクを下げるために、しばしば使用される。ＦＫ５０６は、Ｔ細胞及びインターロイキン２活性を低減する。また、骨髄移植を行った後のひどいアトピー性皮膚炎（湿疹）、ひどい抗療性のブドウ膜炎及び皮膚状態白斑の治療における局所用製剤にも使用される。

フルダラビン：ＤＮＡ合成を抑制するプリン類似体である。フルダラビンは、各種血液学的悪性腫瘍の治療化学療法薬にしばしば使用される。

ＦＲＧＫＯマウス：フマリルアセト酢酸加水分解酵素（Ｆａｈ）のホモ接合性欠失、遺伝子組換活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）、及びインターロイキンレセプター（Ｉｌ２ｒｇ）Ｘ結合遺伝子の共通γ鎖の半接合性又はホモ接合性欠失を有する突然変異株マウスをいう。また、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−又はＦａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／ｙとも表記する。ここで用いられる例では、Ｆａｈ、Ｒａｇ２及びＩｌ２ｒｇ遺伝子中のホモ接合性欠失とは、突然変異を有するマウスに機能性ＦＡＨ、ＲＡＧ−２及びＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現が無いことを示す。

フマリルアセト酢酸加水分解酵素（ＦＡＨ）：チロシン異化作用の最終のステップにおいて触媒作用を及ぼす代謝性酵素をいう。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合性欠失を有するマウスは、肝臓ｍＲＮＡの発現が変化し重篤な肝機能不全を示す（Ｇｒｏｍｐｅら、 Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７： ２２９８−２３０７， １９９３）。また、Ｆａｈ遺伝子の中に点突然変異が、肝機能不全及び出生後致死率を引き起こすことが示された（Ａｐｏｎｔｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９８（２）： ６４１−６４５， ２００１）。ヒトのＦａｈ欠損は、肝疾患遺伝性のチロシン血症型１（ＨＴ１）を発達させ、また、肝機能不全を発達させる。Ｆａｈ欠損症により、有力な酸化薬であるフマリルアセト酢酸が蓄積し、これは、Ｆａｈ肝実質細胞欠損の細胞死を最終的に生じさせる。したがって、Ｆａｈ欠損ラットは、ヒトを含む別の生物種からの肝実質細胞で再び占められることができる。多数の異なる生物種のＦａｈゲノム、ｍＲＮＡ及びタンパク質の配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベース中に公然と利用可能となっている（例えば、遺伝子ＩＤ ２９３８３（ラットＦａｈ）；遺伝子ＩＤ １４０８５（マウスＦ
ａｈ）；遺伝子ＩＤ ６１０１４０（イヌＦＡＨ）；遺伝子ＩＤ ４１５４８２（ニワトリＦＡＨ）；遺伝子ＩＤ １０００４９８０４（ウマＦＡＨ）；遺伝子ＩＤ ７１２７１６（アカゲザルマカクＦＡＨ）；遺伝子ＩＤ １００４０８８９５（キヌゲザルＦＡＨ）；遺伝子ＩＤ １００５８９４４６（テナガザルＦＡＨ）；遺伝子ＩＤ ４６７７３８（チンパンジーＦＡＨ）；及び遺伝子ＩＤ ５０８７２１（ウシＦＡＨ））。

肝病原体：例えば細菌性、ウイルス、又は寄生病原体等、肝臓細胞を感染させるあらゆる病原体のことをいう。特定の実施形態では、肝病原体は、「肝臓指向性ウイルス」（肝臓を目標とするウイルス）（例えばＨＢＶ又はＨＣＶ）である。

肝細胞癌（ＨＣＣ）：ＨＣＣとは、通常、ウイルス性肝炎、肝臓毒素又は肝硬変症により炎症性肝臓として患者に生じる肝臓の初代悪性腫瘍である。

肝実質細胞：肝臓の細胞質の集団の７０〜８０％を産生する細胞をいう。肝実質細胞は、蛋白合成、タンパク質貯蔵及び炭水化物の変換、コレステロール、胆汁酸塩及びリン脂質の合成、並びに外部性及び内因性物質の解毒、修飾、及び排泄に関与する。また、肝実質細胞は、胆汁の形成及び分泌を開始させる。肝実質細胞は、血清アルブミン、フィブリノーゲン及び凝血因子のプロトロンビン群を産生し、リポ蛋白質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体及び糖蛋白質の合成の主部位でもある。その他、肝実質細胞は、例えば薬剤及び殺虫剤等の外部性化合物やステロイド等の内因性化合物を新陳代謝し、解毒し、不活化する能力を有する。

肝細胞前駆体：肝細胞を引き起こすことでできるあらゆる細胞型をいう。肝細胞前駆体の非限定的な例としては、胎生期幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）、成人肝内幹細胞、間葉幹細胞及び羊膜幹細胞を挙げることができる。本開示の文脈において、生体内で異形の肝細胞を増殖する方法は、異形の肝細胞又は肝細胞前駆体の移植を含む。

遺伝性のチロシン血症型１（ＨＴ１）：チロシン血症は、通常生来の、物質代謝の障害であり、効果的にアミノ酸チロシンを遮断することができない。ＨＴ１は、この障害の最も重篤な形態であり、ヒト染色体数１５上に見いだされる遺伝子Ｆａｈによってコード化される酵素フマリルアセト酢酸加水分解酵素（ＦＡＨ）の欠乏によって引き起こされる。ＦＡＨは、ダウンチロシンの遮断に必要な一連の５つの酵素の最終のものである。ＨＴ１の徴候は、生後最初の数ヶ月に通常現れ、体重増加及び期待される割合の生育の障害（成長障害）、下痢、おう吐物、皮膚の黄変、白眼（黄疸）、キャベツ類似臭、及びブリード（特に鼻血）が増大する傾向等の障害を含む。ＨＴ１は、肝臓及び腎不全、神経系に影響を及ぼす問題、及び肝癌リスクの増大といった問題を引き起こす。

異種：その生物種由来材料、その生物種と自然結合する材料、又はその生物種生来の材料ではなく、その生物種以外の供給源から由来する（すなわち異なる）ことをいう。ここでのラットモデルの場合、ラットは、レシピエントラット以外の生物種、例えばヒト、イヌ、ブタ、その他からの肝細胞が移植できかつ生着できる。

ヘテロ：対応する染色体の遺伝子座で異種の対立遺伝子を有することをいう。例えば、特定の遺伝子突然変異ヘテロのラットは、遺伝子の対立遺伝子の一方には突然変異を有するが、他方には有さない。

ホモ接合性：一般に、１つ以上の遺伝子座で同一の対立遺伝子を有していることをいう。ここで用いられる例では、破壊「ホモ接合性」又は欠損症「ホモ接合性」とは、遺伝子の対立遺伝子の両方ともに破壊（例えば欠失、組込み又は点突然変異）を有する生体をい
い、また、「複方異型接合性」とは、生体は２つの無関係な対立遺伝子上に破壊を有しているが、類似ホモ接合性破壊として振る舞い、得られた機能性遺伝子生成物が損失することをいう。

ヒト化：ここで用いられる例では、「ヒト化」動物（ラット）又は肝臓とは、ヒト肝細胞を移植した動物又は肝臓のことをいい、その際、ヒト肝細胞が生体内で増殖し、ヒト肝細胞でほぼ動物の肝臓を再び占めることをいう。

免疫不全：免疫系の必須の機能の少なくとも１つが不足することをいう。ここで用いられる例では、「免疫不全」ラットとは、免疫系の特定の成分が不足したラット又は免疫系の特定の成分の機能が不足したラットをいう（例えばＢ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）。一例としては、免疫不全ラットは、マクロファージが不足する。特定の実施形態では、免疫不全ラットは、機能性免疫細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の発達を防止して又は抑制する遺伝の変質作用を１つ以上備える。特定の実施形態では、遺伝の変質作用は、組換活性化遺伝子１（Ｒａｇ１）欠損症、組換活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）欠損症、インターロイキン２レセプターガンマ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）欠損症、Ｄｎａｐｋ^−／−（ＳＣＩＤ）突然変異、ヒト化／ヒト化ＳＩＲＰアルファ遺伝子型、ヌードラット突然変異、パーフォリンノックアウト（ｐｅｒｆｏｒｉｎ^−／−）、及びこれらの組合せからなる群より選択される。例えば、ヒト配列によるラットＳｉｒｐ−α遺伝子の置換、すなわちヒト化（ｈｕｍ）Ｓｉｒｐ−α^{ｈｕｍ／ｈｕｍ}では、ヒト細胞によってラットマクロファージの活性化をブロックする。特定の実施形態では、「免疫不全ラット」は、Ｒａｇ１^−／−、Ｒａｇ２^−／−、Ｉｌ２ｒｇ^−／−、Ｉｌ２ｒｇ^−／ｙ、ＳＣＩＤ、ＳＩＲＰ−アルファ遺伝子型、パーフォリン^−／−及び／又はヌード、の遺伝の変質作用の１つ以上を有する。免疫不全動物株は、従来技術において周知であり、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（米国メイン州バーハーバー）やＴａｃｏｎｉｃ社（米国ニューヨーク州ハドソン）より入手可能である。特定の実施形態では、ラットは、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−ラット、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−ラット、Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−ラット、又はＦａｈ^−／−／Ｒａｇ１^−／−／Ｉｌ２ｒｇ^−／−／Ｉｌ１ｒ１^−／−ラットである。特定の実施形態では、免疫不全ラットは、１以上の免疫抑制薬を投与された動物である。

免疫抑制薬：体液又は細胞免疫系の成分又は補体系等の免疫系の１つ以上の態様の機能又は活性を低減する化合物をいう。免疫抑制薬は、「免疫抑制剤」ともいう。
例示的な免疫抑制薬は、限定するものではないが、（１）例えばプリン合成阻害剤（例えばアザチオプリン及びミコフェノール酸）、ピリミジン合成阻害剤（例えばレフルノミド及びテリフルノミド）及び抗葉酸剤（例えばメトトレキセート）等の代謝拮抗剤；（２）例えばＦＫ５０６、サイクロスポリンＡ及びピメクロリムス等のマクロライド；（３）例えばサリドマイド及びレナリドマイド等のＴＮＦ−α阻害剤；（４）例えばアナキンラ等のＩＬ−１レセプター拮抗薬；（５）例えばラパマイシン（シロリムス）、デフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス及びバイオリムスＡ９等の、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤の哺乳動物ターゲット；（６）例えばプレドニゾン等のコルチコステロイド；及び（７）多数の細胞又は血清ターゲットのいずれかに対する抗体。特定の開示の実施形態では、免疫抑制薬は、ＦＫ５０６、サイクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノール酸、プレドニゾン、ラパマイシン又はアザチオプリン又はこれらの組合せ、を含む。

例示的な細胞のターゲット及びそれらのそれぞれの阻害剤化合物の非限定的な例としては、補体成分５（例えばエクリズマブ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、アフェリモマブ及びゴリムマブ等）；
ＩＬ−５（例えばメポリズマブ）；免疫グロブリンＥ（例えばオマリズマブ）；ＢＡＹＸ（例えばネレリモマブ）；インターフェロン（例えばファラリモマブ）；ＩＬ−６（例えばエルシリモマブ）；ＩＬ−１２及びＩＬ−１３（例えばレブリキズマブ及びウステキヌマブ）；ＣＤ３（例えばムロモナブＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビシリズマブ）；ＣＤ４（例えばクレノリキシマブ、ケルキシマブ及びザノリムマブ）；ＣＤ１１ａ（例えばエファリズマブ）；ＣＤ１８（例えばエルリズマブ）；ＣＤ２０（例えばアフツズマブ、オクレリツマブ、パスコリズマブ）；ＣＤ２３（例えばルミリキシマブ）；ＣＤ４０（例えばテネリキシマブ、トラリズマブ）；ＣＤ６２Ｌ／Ｌ−セレクチン（例えばアセリズマブ）；ＣＤ８０（例えばガリキシマブ）；ＣＤ１４７／ベイシジン（例えばガビリモマブ）；ＣＤ１５４（例えばルプリズマブ）；ＢＬｙＳ（例えばベリムマブ）；ＣＴＬＡ−４（例えばイピリムマブ、トレメリムマブ）；ＣＡＴ（例えばベルチリムマブ、レルデリムマブ、メテリムマブ）；インテグリン（例えばナタリズマブ）；ＩＬ−６レセプター（例えばトシリズマブ）；ＬＦＡ−１（例えばオデュリモマブ）；及びＩＬ−２レセプター／ＣＤ２５（例えばバシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ）等を挙げることができる。

別の免疫抑制剤としては、ゾリモマブアリトックス、アトロリムマブ、セデリズマブ、ドリキシズマブ、フォントリズマブ、ガンテネルマブ、ゴミリキシマブ、マスリモマブ、モロリムマブ、ペキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、シプリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトクス、バパリキシマブ、ベパリモマブ、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン；ＣＴＬＡ−４の阻害剤（例えばアバタセプト、ベラタセプト）；アフリバーセプト；アレファセプト；リロナセプト；及びＴＮＦ阻害剤（例えばエタネルセプト）等を挙げることができる。

免疫抑制：免疫系の活性又は機能を低減させることをいう。免疫抑制は、免疫抑制化合物の投与によって達成でき、又は、疾患ないし障害（例えば、ＨＩＶ感染の結果又は遺伝子欠陥に起因する免疫抑制）の作用として得ることができる。一例としては、免疫抑制は、機能的免疫細胞の発生を妨害又は阻害する遺伝子変異の結果として生じる。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）：特定の遺伝子の発現の誘発により、非多能性細胞、代表的には成体の体細胞から人工的に誘導される多能性肝細胞の一種をいう。ｉＰＳＣは、哺乳類等の生物から誘導できる。特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類又はヒトから生成される。ここではヒトから誘導されたｉＰＳＣを例示することができる。ｉＰＳＣは、幹細胞の特定の遺伝子やタンパク質の発現、クロマチンのメチル化のパターン、倍化時間、胚葉体の形成、奇形腫の形成、生存能のキメラの形成、並びに、潜在能力及び分化能のような多くの場合でＥＳ細胞と類似している。ｉＰＳＣを産生するための方法は、従来技術において既知である。例えば、ｉＰＳＣは、典型的には、成体の線維芽細胞等の非多能性細胞への特定の幹細胞関連遺伝子（例えば、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）及びＳｏｘ２）の移入によって導かれる。トランスフェクションは、レトロウイルス、レンチウイルス又はアデノウイルス等のウイルスベクターにより得ることができる。例えば、細胞のトランスフェクションにより、レトロウイルス系を用いてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃを、又は、レンチウイルス系を用いてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８を得ることができる。３〜４週間後、少数のトランスフェクト細胞が、形態的及び生化学的に多能性幹細胞との類似化を開始し、典型的には、形態学な選択、倍化時間によって、又は、レポーター遺伝子及び抗生物質による選択により単離される。一例では、成人ヒト細胞からのｉＰＳＣｓは、Ｙｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５４）： １２２４， ２００７）又はＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｃｅｌｌ １３１（５）： ８６１−７２， ２００７）の方法により発生する。また、ｉＰＳＣｓは、ｉＰＳ細胞として知られている。

感染負荷：被験者、又は被験者由来のサンプル中の特定の病原体の量をいう。感染負荷量は当該分野で公知の多数の方法のうちのいずれか１つを用いて測定することができる。検出される病原体の型及び病原体の検出に利用可能な試薬に応じて、適当な方法を選択する。また、感染負荷量は、例えば、病原体の力価を測ることにより測定することができ、そのための方法は、検出される病原体に依存して変化する。例えば、ウイルスの力価は、プラークアッセイを行うことにより定量することができる。ある例では、感染負荷量は、サンプル中の病原体特異的抗原の量を定量することにより測定される。他の例では、感染負荷量は、サンプル中の病原体特異的核酸分子の量を定量することにより測定される。定量操作は、数値の決定を含み、あるいは、相対値で示してもよい。

単離：「単離された」生体成分、例えば核酸、タンパク質（抗体を含む）又は細胞小器官、は、その成分が天然に存在する環境（細胞等）における他の生体成分、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質、並びに細胞小器官、から実質的に分離又は抽出されている。「単離された」核酸及びタンパク質としては、標準的な精製法で純化された核酸及びタンパク質が挙げられる。また、この語は、宿主細胞における組換え発現により調製された核酸及びタンパク質並びに化学合成された核酸を包含する。いずれの場合も、核酸及び／又はタンパク質を「単離」することにより、自然界では見いだされない新しい化学物質を与える。

ラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤の哺乳動物ターゲット：ｍＴＯＲの発現又は活性を阻害する分子のことをいう。ｍＴＯＲ阻害剤としては、低分子、抗体、ペプチド及び核酸の阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲのキナーゼ活性を阻害するか、又は、リガンドに対するｍＴＯＲの結合を阻害する分子であり得る。また、ｍＴＯＲの阻害剤は、ｍＴＯＲの発現をダウンレギュレートする分子を含む。多数のｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン（シロリムス）を含めて従来技術において既知である。

ミコフェノール酸：同種同系移植の拒絶を予防するために代表的に使用される免疫抑制薬のことである。この薬物は一般に、経口又は静脈内投与される。ミコフェノレートは、真菌ペニキリウムストレンニフェラム由来である。そのプロドラッグの態様であるミコフェノレートモフェチルは、肝臓で、活性部分ミコフェノール酸に代謝される。これは、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の増殖で用いられるプリン合成のデノボ経路において、グアニン一リン酸の合成速度を制御する酵素であるイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害する。ミコフェノール酸は、商品名ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標）（ミコフェノール酸モフェチル；Ｒｏｃｈｅ社）及びＭｙｆｏｒｔｉ（登録商標）（ミコフェノール酸ナトリウム；Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）で市販されている。

ＮＴＢＣ（（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン）：４−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＰＰＤ）の阻害剤である。ＨＰＰＤは、チロシン異化の第２段階である４−ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチシン酸への転換反応を触媒する。ＮＴＢＣでの処理は、チロシン異化経路をこの段階でブロックし、そして、Ｆａｈ欠損のヒト及び動物において蓄積される疾病特有症候の代謝産物であるスクシニルアセトンの蓄積を予防する。

ヌードラット：胸腺で悪化又は不在を引き起こす遺伝子突然変異を有するラット株をいい、その際、Ｔ細胞の数が著しく低減することにより免疫系が抑制される。

プレドニゾン：有効な免疫抑制薬である合成コルチコステロイドのことをいう。特定の炎症性疾患、自己免疫疾患及び癌の処置、並びに、臓器移植拒絶の処置又は予防に、よく用いられる。プレドニゾンは通常、経口摂取されるが、筋肉注射又は静脈注射によっても
供給が可能である。プレドニゾンは、肝臓でプレドニゾロンに変換されるプロドラッグであり、そのプレドニゾロンは、活性な薬剤であり、さらにはステロイドである。

ラパマイシン：免疫抑制性かつ抗増殖性特性を有する既知の化合物である。シロリムスとしても知られるラパマイシンは、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの生成物として最初に発見されたマクロライドである。ラパマイシンは、ｍＴＯＲに結合し、ｍＴＯＲの活性を阻害する。

レシピエント：ここで用いられる例では、「レシピエントラット」は、ここに記載するように、異種の肝細胞を注入されたラットである。典型的には、異種の肝細胞の一部（パーセンテージは変更することができる）が、レシピエントラット中に生着する。実施形態では、レシピエントラットは、免疫抑制又は免疫不全状態である。特定の実施形態では、レシピエントラットは、Ｆａｈ欠損である。

リコンビナーゼ活性化遺伝子１（Ｒａｇ１）：免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊ組換えの活性化に関与する遺伝子のことをいう。ＲＡＧ１タンパク質は、ＤＮＡ基質の認識に関与するが、安定な結合及び切断の活性のためには、ＲＡＧ２を必要とする。ＲＡＧ−１−欠損ラットは、成熟Ｂリンパ球及びＴリンパ球を有さない。

組換活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）：免疫グロブリン遺伝子座とＴ細胞受容体遺伝子座の組換えに関与する遺伝子である。Ｒａｇ２遺伝子を欠損する動物は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを行うことができず、機能性Ｔ細胞及びＢ細胞の完全な欠如を引き起こす（Ｓｈｉｎｋａｉら、Ｃｅｌｌ ６８：８５５−８６７， １９９２）。

継代移植：最初の動物において増殖させた肝細胞が収集され、そして、さらなる増殖のために二次動物へと注入などによって移植される、ヒト肝細胞を生体内で増殖するためのプロセスである。継代移植は、三次、又は四次、又は追加次のマウスをさらに含むことができる。

体細胞核移植（ＳＣＮＴ）：ドナーの核を有する卵を用いてクローン性の胚を作製するための実験技術のことをいう。ＳＣＮＴでは、体細胞の核が取り出され、細胞の残余が破棄される。それと同時に、卵細胞の核が取り出される。体細胞の核が、その後、除核された卵細胞へと挿入される。卵へと挿入された後、体細胞の核は宿主細胞によってリプログラミングされる。この時点で体細胞の核を含んでいる卵は、ショックにより刺激されて、分裂を開始する。培養において多数の有糸分裂が生じた後、この単一細胞は、元の生物とほぼ同一のＤＮＡを持つ胚盤胞を形成する。

幹細胞：不変の娘細胞を生成する（自己再増殖；親細胞と同一である娘細胞を少なくとも１つ生成する細胞分裂）、及び特殊化細胞型を産生するための特異な能力（潜在能力）を有する細胞のことをいう。幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、生殖系列幹（ＧＳ）細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体生殖系列幹細胞（ｍａＧＳＣ）、及び非制限体性幹細胞（ＵＳＳＣ）が挙げられる。生体内における幹細胞の役割は、動物の正常な寿命の間に破壊される細胞を置換することにある。通常、幹細胞は、無制限に分裂することが可能である。幹細胞は、分裂後に幹細胞のままでいてもよいし、前駆細胞になっても良いし、末端分化に進行しても良い。前駆細胞は、所与の細胞型に十分に分化した機能的細胞を少なくとも１つ生成することができる細胞である。一般に、前駆細胞は分裂することが可能である。前駆細胞は、分裂後に前駆細胞のままであってもよいし、末端分化に進行しても良い。一実施形態において、幹細胞は、肝細胞を産生する。

治療薬：被験体に対して適切に投与された際に、所望の治療効果又は予防効果を誘導することができる、アンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインもしくはサイトカイン等、化合物、低分子又はその他の組成物のことをいう。ここで用いられる例では、「候補薬剤」は、特定の疾患又は障害のための治療剤として機能出来るか否かを決定するためのスクリーニング用に選択される化合物である。

力価：本開示の文脈においては、力価は、サンプル中の特定の病原体の量のことをいう。

耐性：被験体（例えばヒトや動物）が通常は応答する特定の抗原又は抗原の群に対して応答しない状態をいう。免疫耐性は、免疫反応を抑制するが、単に免疫応答が存在しない状態ではない条件下で実現される。免疫耐性は、免疫系がまだ成熟していない、胎児の生命又は新生の期間における同じ抗原との事前接触；極めて高いもしくは低い用量の抗原との事前接触；免疫系を損ねる放射線、化学療法薬もしくは他の薬剤に対する曝露；免疫系の遺伝性の疾患；免疫系の後天性疾患、を含む、多数の原因から生じうる。

毒素：本開示の文脈では、「毒素」とは、全ての化学的毒素又は生物学的毒素を含むあらゆる有毒物質をいう。

遺伝子導入：細胞に導入される外因核酸一次構造又は生体のゲノムのことをいう。

移植又は移植操作：ある被験体由来の臓器、組織もしくは細胞を、別の被験体又は同じ被験体の別の領域に移植するプロセスをいう。

ウロキナーゼ：ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）とも呼ばれ、ウロキナーゼは、セリンプロテアーゼである。ウロキナーゼは、元々人尿から単離したものであるが、別の生理学的場所、例えば血流及び細胞間マトリックス中にも存在する。原始の生理学的な基質は、プラスミノーゲンであり、それは、セリンプロテアーゼプラスミンの不活性チモーゲン形態である。プラスミンの活性化は、タンパク質分解カスケードを起動させ、これは、生理学的な生育環境に従い、血小板崩壊又は細胞間マトリックス劣化へと至る。ここで提供される方法の実施形態においては、ウロキナーゼは、肝細胞注入の前にレシピエントラットに投与される。特定の実施形態では、ウロキナーゼは、ヒトウロキナーゼである。別の実施形態では、ヒトウロキナーゼは、ウロキナーゼの分泌された形態である。別の実施形態では、ヒトウロキナーゼを改変し、ウロキナーゼの非分泌型である（米国特許第５，９８０，８８６号参照）。

ベクター：宿主細胞において複製及び／又は組み込みを行うベクターの能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子のことをいう。ベクターは、複製起点等宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含み得る。また、ベクターは、１つ以上の選択可能な標識遺伝子及び別の遺伝の成分を含むことができる。組み込みベクターは、宿主の核酸に自分自身を組み込むことが可能である。発現ベクターは、挿入された遺伝子（単数又は複数）の転写及び翻訳を可能にするために必須の調節配列を含むベクターである。

注記しない限りにおいて、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。単数形のように記載していても、文脈から明確に単数であると示さない限り、複数の対象物をも含む。同様に、語「又は（もしくは、あるいは）」は、文脈から明確にそうでないと示さない限り、「及び（並びに）」を含むことが意図される。したがって、化合物が、成分Ａ、Ｂ
及び／又はＣを含むとした場合、化合物は：Ａ単独を含むか排除；Ｂ単独を含むか排除；Ｃ単独を含むか排除；Ａ及びＢの組合せ；Ａ及びＣの組合せ；Ｂ及びＣの組合せ；又はＡ、Ｂ及びＣの組合せ、である。さらに、所与の核酸又はポリペプチドに対して、全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量又は分子質量値は全て近似値であり、説明のために提供されることが理解されるべきである。本明細書中に記載されるものと類似もしくは等価の方法及び材料が本開示の実施又は試験に使用され得るが、適切な方法及び材料は以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の引用文献は、その全体が参照により援用される。矛盾が生じる場合には、用語の説明を含めて、本明細書が支配する。さらに、材料、方法及び実施例は説明的なものに過ぎず、限定的であることは意図されない。

ＩＩ．実施形態の概要
遺伝子が組み替えられたラット（Ｒａｔｔｕｓ ｓｐ）が、ここで記載され、別の生物種（特にヒト）からの肝細胞の増殖を含む様々な目的効用を有し、肝硬変、肝細胞癌、肝の感染症、肝の毒性、遺伝子療法、肝再生、アルコール性肝疾患、脂肪肝疾患、代謝の肝疾患等に加えて、中間代謝、胆汁酸生成、小分子輸送体、生物製剤の事前評価、薬物代謝、薬物動力学を含む肝疾患及び正常肝病理学の動物モデルとして用いられる。用語「ラット」（ここで用いられる例では）は、ラット属に特定され、明白にマウス種（Ｍｕｓ ｓｐ）を含まない。

１以上の実施形態では、ラットは、Ｆａｈ欠損であり、好ましくは、Ｆａｈ遺伝子中の破壊に対するホモ接合性を有するゲノムを備えることで、その破壊が、機能性ＦＡＨタンパク質の発現の損失を引き起こし、ひいては肝機能低下を生じさせる。Ｆａｈ遺伝子破壊は必ずしも、機能性ＦＡＨタンパク質の発現の完全な損失を引き起こすものではない。いくつかの例では、機能性ＦＡＨタンパク質の発現、活性又は、機能の損失又は減少は、約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％の機能性タンパク質の発現の損失のことである。Ｆａｈ遺伝子破壊は、機能性ＦＡＨタンパク質の発現を著しく減少（低減）させ又は完全にゼロにする全ての修飾とすることができる。特定の実施形態では、破壊は、Ｆａｈ遺伝子の中の組込み、欠失、もしくは１つ以上の点変異、又はこれらのあらゆる組合せである。例えば、破壊は、インフレーム終止コドンを含む組込みであってもよい。また、組込みは、選択可能な標識をコード化する核酸等、付加的な核酸一次構造を含むことができる。特定の例の中に、Ｆａｈ欠損ラットは、Ｆａｈ遺伝子の情報配列３中の破壊に対するホモ接合性である。さらに、Ｆａｈ遺伝子中に破壊を有する単離ラット胎生期茎（ＥＳ）細胞が提供される。

また、ＡＡＶ−ＤＪターゲッティングベクターでラット細胞を導入することによりＦａｈ欠損ラット細胞（胎生期幹細胞等）を産生する方法が提供され、ターゲッティングベクターは、５ｆ及び３ｆ相同性アームを備えるターゲッティングカセットを備え、これら相同性アームは、ラットＦａｈ遺伝子（Ｆａｈ遺伝子の情報配列３等）の部分をターゲットにし、核酸一次構造（抗生物質抵抗性遺伝子をコード化する核酸一次構造等）の側面に位置することにより、ターゲッティングベクターによる細胞の移入に続いて同種遺伝子組換えが生じ、ラットＦａｈ遺伝子のターゲットの部分をターゲッティングカセットで置換することでＦａｈ欠損ラット細胞を産生する。

一部の実施形態では、免疫不全ラットが提供される。マウスの免疫不全症は、遺伝の変質作用、免疫学的抑制又はこれらの組合せにより生じる。１以上の実施形態では、ラットは、機能性Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又はＮＫ細胞が不足する。

一部の実施形態では、ラットは免疫抑制症である。いくつかの例では、免疫学的抑制は、１つ以上の免疫抑制剤の投与の結果である。ラットの免疫学的抑制を実現するのに有効
な全ての適切な免疫抑制剤又は試剤を用いることができる。免疫抑制剤の非限定的な例としては、ＦＫ５０６、サイクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノール酸、プレドニゾン、ラパマイシン及びアザチオプリンを挙げることができる。また、免疫抑制剤を組合せて投与することができる。

別の実施形態では、免疫不全症は、１つ以上の遺伝の変質作用の結果であり、免疫系の特定の成分の欠如や、免疫系の特定の成分の機能の欠如（機能性Ｂ、Ｔ及び／又はＮＫ細胞の欠如等）を引き起こす。いくつかの例では、１つ以上の遺伝の変質作用は、Ｒａｇ２遺伝子の遺伝子変質作用又はＩｌ２ｒｇ遺伝子の遺伝子変質作用を含み、これら遺伝子の変質作用の結果、機能性ＲＡＧ−２タンパク質又はＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現の損失が生じる。一例では、１つ以上の遺伝の変質作用は、Ｒａｇ２遺伝子の遺伝子の変質作用及びＩｌ２ｒｇ遺伝子の遺伝子の変質作用を含む。いくつかの例では、遺伝子の変質作用は、Ｒａｇ２遺伝子又はＩｌ２ｒｇ遺伝子の中にホモ接合性欠失を備える。この欠失は、Ｆａｈ欠損症と組み合わされて、ＦＲＧＫＯラットを産生する。別の例では、遺伝子の変質作用は、ＳＣＩＤ、ＮＯＤ、又はヌードである。また、免疫系の特定の細胞（例えばマクロファージ又はＮＫ細胞）は、枯渇することができる。特定の細胞型を枯渇させる方法は、従来技術で既知である。

１以上の実施形態では、ラットはヒト肝細胞等の異種の肝細胞を備える。本発明の重要な利点は、異種の肝細胞のラットへの移植／生着が行われただけでなく、ラット中で増殖した（すなわち、活発に増殖した）ということが理解されよう。言い換えると、本発明の各種実施形態は、ヒト化肝臓を有するラットに関する。

また、生体内で異種の肝細胞を増殖する方法が提供される。特定の実施形態では、本方法では、異種の肝細胞（又は肝細胞前駆体）をＦａｈ欠損ラットに移植して、異種の肝細胞の増殖を可能にする。別の実施形態では、方法は、異種の肝細胞を免疫不全ラットに移植することを含み、異種の肝細胞の増殖を可能にする。また別の実施形態では、方法は、異種の肝細胞をＦａｈ欠損及び免疫不全ラットに移植することを含み、異種の肝細胞の増殖を可能にする。別の実施形態では、方法は、例えばチロシン異化代謝経路中の酵素の発現、活性、又は機能の低下等、肝欠損症のラットに異種の肝細胞を移植することを含み、異種の肝細胞の増殖を可能にする。

一部の実施形態一部の実施形態では、異種の肝細胞は、ラットの肝動脈、脾臓、門静脈、腹膜腔、肝組織集団又はリンパ系への注入によって移植される。一部の実施形態一部の実施形態では、ラットに移植される異種の肝細胞（又は肝細胞前駆体）は、単離するヒト肝細胞（又は肝細胞前駆体）である。一部の実施形態一部の実施形態では、異種の肝細胞は、肝臓組織移植の一部として移植される。単離する異種の肝細胞は、異なる供給源と同様に多数の異なる哺乳動物のいずれかのから得られることができる。哺乳動物肝細胞は、イヌ、ブタ、ウマ、ウサギ、マウス、キヌゲザル、ウッドチャック、非ヒト霊長目動物及びヒトから得られることができる。特定の実施形態では、異種の肝細胞は、ヒト又は非ヒト器官ドナーの肝臓から単離する。別の実施形態では、異種の肝細胞は、外科の切除から単離する。別の実施形態では、異種の肝細胞は、幹細胞に由来し、幹細胞としては例えば、胎生期幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉−由来する幹細胞、脂肪組織−由来する幹細胞、強力な成人の前駆細胞、無制限の身体の幹細胞又は組織特定の肝臓幹細胞を挙げることができ、それらは、肝臓、胆嚢、小腸、膵臓又は唾液腺に見いだすことができる。別の実施形態では、異種の肝細胞は、単球又は羊膜細胞に由来し、したがって、幹細胞又は前駆細胞は、インビトロに得られ、肝細胞を産生する。別の実施形態では、異種の肝細胞は、皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト又はリンパ球等の異なった細胞系統を再プログラムすることによって得られる。別の実施形態では、異種の肝細胞は、注入の前低温保存された（すなわち解凍され低温保存ロットから得られる）。特定の実施形態では、ここでさらに詳
細に記載するように、ヒト肝細胞は、ヒト化マウス、ブタ又は別のラットから単離することができる。

一部の実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤（上述）は、少なくとも異種の肝細胞移植術の約２日前に、ラットに投与される。免疫学的抑制は、移植術の後所定の期間、例えばラットのライフの一部又は全体に対して、継続されてもよい。

肝損傷の多機種は、肝細胞生着及び増殖を容易にするためにラットの中に使用されてもよいことが理解され、この肝細胞生着及び増殖の非限定的な例としては例えば、誘導性の外傷及び／又は遺伝子の修飾（例えばＦａｈ破壊、ｕＰＡ、ＴＫ−ＮＯＧ（Ｗａｓｈｂｕｒｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １４０（４）： １３３４−４４， ２０１１）、アルブミンＡＦＣ８、アルブミンジフテリア毒素、ウィルソンｆｓ疾患など）が挙げられる。また、肝損傷技術の組合せを使ってもよい。特定の実施形態では、ラットは、異種の肝細胞の注入の前に、ウロキナーゼ遺伝子をコード化するベクターを投与される。一実施形態では、ウロキナーゼ遺伝子は、ヒトウロキナーゼである。野生型ウロキナーゼは、分泌されたタンパク質である。したがって、実施形態では、ヒトウロキナーゼは、ウロキナーゼの分泌された形態である（Ｎａｇａｉら、Ｇｅｎｅ ３６：１８３−１８８， １９８５）。特定の実施形態では、ヒトウロキナーゼは、ウロキナーゼの修飾非分泌型である。例えば、Ｌｉｅｂｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
９２： ６２１０−６２１４， １９９５）によれば、ウロキナーゼのカルボキシル末端に、小胞体保持信号をコード化する配列を挿入することにより、あるいは又はアミノ末端ＲＲ−保持信号でｐｒｅ−ｕＰＡシグナルペプチドを置換することにより（Ｓｔｒｕｂｉｎら， Ｃｅｌｌ ４７：６１９−６２５， １９８６； Ｓｃｈｕｔｚｅら， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：１６９６−１７０５， １９９４）、生成されるウロキナーゼの非分泌型を記載し、また、膜内外錘が、膜ＩＩタンパクＩｉｐ３３からのスペーサーペプチドによって分離される（Ｓｔｒｕｂｉｎら、 Ｃｅｌｌ ４７：６１９−６２５， １９８６）。また、ウロキナーゼの非分泌型は、米国特許第５，９８０，８８６号に記載される。

ウロキナーゼをコード化するベクターは、ラットへの供給に適し、かつウロキナーゼ遺伝子を発現できるあらゆる型のベクターとすることができる。このベクターは、ウイルス性ベクター又はプラスミドベクトルを含む。一実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。ウロキナーゼをコード化するベクターは、従来技術で既知のあらゆる適切な手段によって投与することができる。一実施形態では、ベクターは静脈内に投与される。１つの態様では、ベクターは、眼窩後注入によって投与される。ウロキナーゼをコード化するベクターは、異種の肝細胞の注入の前のいつでも、投与されることができる。通常、ベクターを投与することで、発現されるべきウロキナーゼに十分な時間を確保する。一実施形態では、ベクターは、肝細胞注入の２４〜４８時間前に投与される。

肝細胞増殖時間の長さは、変更することができ、また、元々移植される肝細胞の数、異種の肝細胞所望の次の増殖の数、及び／又は異種の肝細胞による肝臓再増殖の所望の程度を含む様々な因子に依存する。いくつかの例では、これらの因子は、肝細胞の所望の使用又は異種の肝細胞で生着されるラットの所望の使用によって指図される。特定の実施形態では、異種の肝細胞は、ラットの中増殖され、その期間は、少なくとも約３日、少なくとも約５日、少なくとも約７日、少なくとも約２週、少なくとも約４週又は少なくとも約５週、少なくとも約６週、少なくとも約２月、少なくとも約３月、少なくとも約４月、少なくとも約５月、少なくとも約６月、少なくとも約７月、少なくとも約８月、少なくとも約９月、少なくとも約１０月又は少なくとも約１１月である。特定の例では、異種の肝細胞は、少なくとも７日間、ラット中で増殖される。別の例では、異種の肝細胞は、少なくと
も６月間、ラット中で増殖される。いくつかの例では、異種の肝細胞は、１２月を超えない期間、ラット中で増殖される。

一部の実施形態では、肝の欠損症によるラットは、ラット中の肝疾患の発達を抑制し、遅らせ、回避し、又は防止する試剤を投与することができる。この試剤の投与は、健康な（例えば、ＦＡＨ発現している）肝細胞によるラットの再増殖の前に、肝機能不全及び／又はラットの死を回避する。この試剤は、従来技術で既知の肝疾患を抑制するあらゆる化合物又は組成物であってよい。この試剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチルベンゾイル）−１、３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）であるが、フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの別の薬理学的阻害剤、例えば、メチルＮＴＢＣを用いてもよい。ＮＴＢＣ（又は肝臓防護効果による別の化合物）肝疾患の発達を調整するために、Ｆａｈ欠損ラットに投与される。ドーズ、投薬スケジュール及び投与の方法はＦａｈ欠損ラットの中に、肝機能不全を回避する必要であるように、調整されることができる。特定の実施形態では、Ｆａｈ欠損ラットは、肝細胞移植術の後、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日又は少なくとも６日、さらにＮＴＢＣを投与される。特定の実施形態では、Ｆａｈ欠損ラットは、少なくとも約１週、少なくとも約２週、少なくとも約３週、少なくとも約４週、少なくとも約１月、少なくとも約２月、少なくとも約３月、少なくとも約４月、少なくとも約５月、又は少なくとも約６月、さらにＮＴＢＣを投与される。特定の実施形態では、肝細胞移植術の約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後又は約７日後、ＮＴＢＣ（又は肝臓防護効果による別の化合物）は回収される。

Ｆａｈ欠損ラットに投与されるＮＴＢＣのドーズ量は、変更することができる。特定の実施形態では、ドーズ量は、１日当たり、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ〜１日当たり約２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１日当たり約２０ｍｇ／ｋｇである。ＮＴＢＣは、あらゆる適切な手段によって投与されることができるが、非限定的な例としては、飲料水中、食品中に又は注入を挙げることができる。一実施形態では、飲料水中に投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１〜約３０ｍｇ／ｌ、好ましくは約１０〜約２５ｍｇ／ｌ、より好ましくは約１５〜約２０ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは約２０ｍｇ／ｌである。

一部の実施形態では、本方法は、ラットから増殖された異種の肝細胞を収集することをさらに含む。ラットの肝臓から単離された増殖異種肝細胞が、さらに提供される。

レシピエントラット中の異種の肝細胞（又は別の生物種からの肝細胞）の継代移植の方法が、さらに提供される。本方法は、第１のレシピエントラットから増殖された異種の肝細胞を収集するステップと、第２の、第３の、第４の又は付加的なレシピエントラットにおいて、肝細胞をさらに増殖するステップとを有している。増殖された肝細胞は、多数の技術のいずれかを用いて、ラットから収集することができる。例えば、肝細胞は、ラット肝臓の酵素消化に続いて、穏やかにミンチし、濾過及び遠心分離を経て収集することができる。さらに、肝細胞は、周知の方法、例えば特異的に生着された肝細胞生物種の細胞型を認識する抗体を使う方法により、別の細胞型、組織及び／又はデブリから分離されることができる。この抗体の非限定的な例としては、抗ヒトＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：４５５−４６２，１９９７）等の、特異的に型式Ｉ主要組織適合抗原に結合する抗体を挙げることができる。抗体結合された肝細胞は、次いで、（固形のマトリックスに固定される単クローン抗体を利用した）パニング、蛍光活性化された細胞の選別（ＦＡＣ）、磁石ビーズ分離等により、分離することができる。肝細胞を収集するその他の方法は、従来技術においても知られている。

ヒト肝細胞等の肝細胞に対する外因の試剤（生体異物）の効果を、例えば生体内で評価する方法がさらに提供される。特定の実施形態では、本方法は、ここに記載するラットモデルに外因試剤を投与し、異種の肝細胞が移植されたラットの肝機能の少なくとも１つの標識を測定することを含む。特定の実施形態では、肝機能の少なくとも１つの標識は、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼ及びアルブミンから選択され、ラットのアルブミンの中のＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン又はアルカリ性ホスファターゼの、外因試剤の投与の前のラットと比較した増加又は減少があれば、その外因試剤が毒性を有することを示す。特定の実施形態では、外因の試剤は、毒性が知られているか、あるいは疑われている。

ＩＩＩ．動物モデル及びその使用
ここに記載する一実施形態では、ラット胎生期茎（ＥＳ）細胞中にＡＡＶターゲッティング構築を用いた同種遺伝子組換えによるＦａｈ欠損ラットの産生方法が示される。実施例では、ネオマイシン−耐性カセットと、ラットＦａｈ遺伝子の情報配列３中の組込み構築をターゲットにする５ＯＥ及び３ＯＥ相同性アームとを含む、ＡＡＶターゲッティング構築の産生を説明する。ラットＥＳ細胞は、ＡＡＶターゲッティングベクターに感染し、ネオマイシン耐性を選択し、一体型のベクターで個々の細胞クローンを単離させる。ＦＡＨノックアウト（ＫＯ）ＥＳ細胞を、ラット胚盤胞に注入して、疑似妊娠したＳＤラットをＥ３．５へ移すことができる。これらのラットからの子孫は、遺伝子型を決めることができ、キメララットが産まれて、同型接合体ＦＡＨＫＯラットを発生させるように生育することができるヘテロ接合体男性及び女性を発生させることが可能である。この開示は、Ｆａｈ欠損ラットを発生させる１つの特定の方法に限定されず、Ｆａｈ欠損ラットを産生するための従来技術に既知の全ての方法を含み、例えば非限定的な例としては、ＴＡＬＥＮ、亜鉛指ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＳＣＮＴ、などを挙げることができる。

１以上の実施形態では、Ｆａｈに加えて、又はＦａｈの代わりに、チロシン異化代謝経路中の付加的な代謝性酵素をターゲットにして、重篤な肝機能不全（「肝の欠損症」）の動物モデルを発生させることができる。例えば、ここに記載されると同様の方法を用いる破壊に対して、チロシンアミノトランスフェラーゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチジン酸１，２−ジオキシゲナーゼ及び／又はマレイルアセト酢酸イソメラーゼをエンコードする遺伝子をターゲットにすることができる。治療がない場合、上記の酵素の１つ以上が欠損（すなわち、発現、活性又は機能が低減した）したラットは、最終的に内因性肝細胞の死に至らしめる、例えばチロシン血症（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）、ホーキンシン尿症、アルカプトン尿症など、肝機能不全が発達される。したがって、Ｆａｈ欠損モデル（このラット）と同様に、ヒトを含む別の生物種から肝細胞で再び占めることができる。

また、免疫不全ラットの肝臓中に異種の肝細胞を生着させることが、ここに開示される。従って、異種の肝細胞の増殖に対して、免疫不全ラット（Ｆａｈ欠損症がない）の使用がここで意図される。また、ヒト化ラット（すなわちヒト肝細胞で再構成される肝臓を有しているラット）は、下述される薬理学、中毒学及び遺伝子療法研究の他に、例えば、ヒト肝臓再構成肝細胞の供給源として用いることができる。

いくつかの事例では、異種の肝細胞による移植術の前に、ｕＰａ、Ｔｋ、選択的塞栓症、過渡虚血、レトロルシン、モノクロタリン、γ線による照射、四塩化炭素などを含む肝損傷のあらゆる適切なモデルを使い急性の肝損傷がラット中に誘発される。一部の実施形態では、肝損傷は、発現組換え型アデノウイルスにウロキナーゼプラスミノーゲン類似酵素を投与することによって誘発される。ウロキナーゼの投与の後（２４時間後等）、脾臓内注入を介して異種の肝細胞を届けることができ、肝細胞は、肝臓に到達するために脈管
構造中を移動する。その他、任意に、移植前、移植中及び移植後に免疫抑制薬剤を、ラットに与えて、異種移植された異種の肝細胞からラット中の移植応答対宿主を排除することができる。定められた期間ＮＴＢＣを離れてラットを循環させることによって、ラット細胞は、静止状態になり、生着された細胞は増殖に有利となり、異種の肝細胞で内因性ラット肝細胞を置換できる。ヒト肝細胞の場合、これは、高レベルでヒト化肝臓を有するラットを発生させる。異種の肝細胞再増殖レベルは、移植されたラットからの肝臓切片の免疫組織化学に関するヒト血清アルブミンレベルの計量により決定されることができる。

Ａ．肝細胞及びその医療用増殖
本開示は、この療法が必要な被検者における肝臓再構成のための肝細胞の供給源として、レシピエントラットにおいて増殖されそのレシピエントラットから収集される異種の肝細胞の使用を意図する。患者への肝細胞の導入による肝臓組織の再構成は、急性の肝機能不全を有する患者にとって、肝臓移植を見据えた一時的な治療として、又は単離する代謝欠損を有する患者の結末的な治療として、潜在的な治療のオプションである（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５： ５３−６１， １９９８）。例えば、肝細胞再構成を用いて、遺伝子療法遺伝子が組み替えられた肝細胞を導入したり、疾患、身体的な又は化学傷害又は悪性腫瘍の結果失われた肝細胞を置換したりすることができる（米国特許第６，９９５，２９９号）。例えば、家族性高コレステロール血症を起こしている患者の遺伝子療法中に導入された肝細胞の使用が報告されている（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ６： ３３５， １９９４）。その他に、増殖されたヒト肝細胞を用いて、人工肝臓援助装置内に生息させることができる。ラットに移植して異種の肝細胞を増殖する特定の方法が、増殖異種の肝細胞の医療での使用と共に、さらに詳細に下に記載される。

１．免疫前の胎児への肝細胞の移植
ここで開示されるラットの中に異種の肝細胞を増殖する一方法には、異種の肝細胞及び／又は肝細胞前駆体を胎児に移植することが含まれる。１以上の実施形態では、ここに開示する、ラット中に免疫前の肝細胞を移植する方法は、Ｆａｈ欠損ラット同士を交配させて、ホモ接合性Ｆａｈ−ノックアウト子孫のみを発生させることを含む。妊娠語約９〜１５日（例えば１２日）で、Ｆａｈ欠損ラット胎児は、外科的に外に取り出され、臍帯静脈を介して又は直接に胎児の肝臓に、異種の肝細胞を注入した。また、この方法は、遺伝子が組み替えられた免疫不全ラット胎児又は別の肝欠損症を有するラット胎児で行われる。

ラットに注入される異種の肝細胞の数は、変更することができ、これは所望の使用、供給の経路及び別の因子に依存する。特定の実施形態では、約５０，０００個〜約１ｘ１０^８個、例えば約５００，０００個〜約１×１０^７個の異種の肝細胞が、胎児に注入される。いくつかの例では、約１×１０^６個〜約１×１０^８個、例えば約１×１０^７個の異種の肝細胞が、胎児に注入される。１つの非限定的な例では、胎児の肝臓に直接に、約１×１０^７個の異種の肝細胞が胎児に注入される。別の例では、注入される異種の肝細胞の数は、約１００，０００〜約５００，０００、例えば約３００，０００である。胎児の発達中は免疫系が未熟であるため、胎児は、異種の肝細胞に免疫トレランスを発達させる。したがって、免疫抑制剤による胎児発達中に異種の肝細胞が移植されたラットを治療することは必要でない。

１以上の実施形態では、妊娠したラットは、例えばＮＴＢＣその他の化合物等、フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの薬理学的阻害剤の有効な量が維持され、妊娠を通してＦａｈ欠損胎児の中に肝機能不全又は障害が回避される。フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの薬理学的阻害剤のドーズ量は、変更することができる。例示的な投薬量は、上で検討される。Ｆａｈ欠損ラット中の肝機能不全を回避するに必要となるよう、ＮＴＢＣのドーズを修正することができる。出生後は、異種の肝細胞が生着されたＦａｈ欠損ラットに
はＮＴＢＣの投与はされず、異種の肝細胞の増殖ができるようになる。いくつかの例では、Ｆａｈ欠損ラットは、出生の直後にからＮＴＢＣをもはや投与されない。別の例では、ＮＴＢＣのドーズは、例えば生後から約１〜６日、例えば１〜６日等、時間と共に徐々に低減される。

２．肝細胞の出生後移植
ここに記載されるラットモデルに異種の肝細胞を増殖する第２の方法は、異種の肝細胞の出生後移植及び／又はラットへの肝細胞前駆体を含む。特定の実施形態では、ラットは、出生の後すぐ、例えば２日内に又は出生の１週内に、移植がされる。別の実施形態では、例えば成人ラットを含むより古いラットに移植される。異種の肝細胞は、肝動脈注入、脾臓内注入又は門静脈注入を介して一般に移植される。特定の実施形態では、Ｆａｈ欠損ラットには、例えばＮＴＢＣ又はメチルＮＴＢＣ等の、フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの薬理学的阻害剤が維持され、肝機能不全が抑制又は回避される。異種の肝細胞の移植の前に、ラットは、異種の肝細胞の拒絶反応を防止するために１つ以上の免疫抑制剤で治療することができる。典型的には、１つ以上の免疫抑制剤が、異種の肝細胞移植の約２日前に投与される。しかしながら、最適の結果を実現するために必要なら、免疫抑制剤で治療を開始するタイミングは変更することができる。免疫抑制剤の投与は、典型的には、有効量で無期限に継続し、異種の肝細胞の拒絶反応を回避する。

異種の肝細胞の移植が完了した後、Ｆａｈ欠損ラットは、ＮＴＢＣをもはや投与されず、異種の肝細胞の増殖が可能になる。異種の肝細胞（Ｆａｈ欠損ではない）の存在により、ＮＴＢＣがない場合でも、ラットが健康なままでいることを可能にする。いくつかの事例では、ＮＴＢＣによる治療は、肝細胞移植の直後に停止される。別の場合、例えば約１〜約６日にわたり、ＮＴＢＣは時間と共に徐々に低減される。特定の実施形態では、Ｆａｈ欠損ラットに投与する場合のＮＴＢＣのドーズは、１日当たり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの例では、ＮＴＢＣのドーズは、１日当たり約１．０ｍｇ／ｋｇである。ＮＴＢＣのドーズは、必要に応じて修正して、Ｆａｈ欠損ラットの肝機能不全を回避することができる。

Ｂ．異種の肝細胞の供給源
異種の肝細胞又は前駆体／祖先肝細胞のあらゆる適切な供給源は、ラットへの移植についてここに開示された方法で使用することができる。例えば、ヒト肝細胞は、哺乳類の各種生物種からの献体のドナー又は肝切除術から得ることができ、又は市販の供給源から得られることができる。ヒト肝細胞は、また、あらかじめ生着された動物から得られることができる（すなわち、肝臓がヒト肝細胞であらかじめ再び占められたヒト化動物、国際公開第２００８／１５１２８３号及び国際公開第２０１０／１２７２７５号に開示されるヒト化ＦＲＧ ＫＯマウス等）。ヒト肝細胞をこの動物から単離させる方法が、ここに記載される。あらゆる年齢のドナーからの異種の肝細胞、又は低温保存された肝細胞を、ラットに移植することが可能であることが予測される。ヒト肝細胞の隔離と移植との間に、遅延（典型的には１〜２日）がしばしばあり、肝細胞の生存力の低下が引き起こされる。しかしながら、肝細胞の数が総計で限定される場合においても、ここに記載するラットシステムは、ヒト肝細胞を増殖する手段としての役目を果たすことができる。

肝細胞を単離させる方法は、従来技術で周知である。例えば、肝細胞を器官ドナー又は肝切除術から単離させる方法は、国際公開第２００４／００９７６６号及び国際公開第２００５／０２８６４０号、米国特許第６，９９５，２９９号及び同第６，５０９，５１４号に記載されている。肝細胞は、経皮的に又は腹部外科処置を介して取得される肝生検から得ることができる。レシピエントラットに移植用の異種の肝細胞は、従来技術で既知のあらゆる便利な方法により、哺乳類の肝臓組織から単離することができる。肝臓組織を機械的に又は酵素で分離して単一の細胞の懸濁液を提供しても、あるいは、損なわれていな
い肝組織の破片を用いてもよい。例えば、肝細胞は、ルーチンコラゲナーゼ灌流を行い（Ｒｙａｎら、 Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３：２９， １９７６）、その後、低速の遠心分離を行うことにより、移植用提供組織から単離することができる。肝細胞は、ステンレス鋼メッシュで濾過を行った後、密度勾配遠心法を行うことにより、さらに精製される。あるいは、肝細胞を濃縮する別の方法、例えば、例えば、蛍光活性化された細胞の選別、パン、磁石ビーズ分離、遠心力場内の水ひ法等、従来技術で周知の全ての別の方法を用いることができる。同様の肝細胞単離法は、レシピエントラットの肝臓から増殖された異種の肝細胞を収集するために用いることができる。

あるいは、Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏらにより記載される技術を用いて、異種の肝細胞を調製することができる（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔ． Ｒｅｐ． ６： ６２５−６２８，１９８２）。肝臓又はその一部は簡単に単離し、カニューレは門静脈又は門脈の分岐に導入される。次いで、肝臓組織は、カニューレを介して、カルシウムフリーな緩衝液で灌流された後、ＨＥＰＥＳ緩衝液中、塩化カルシウム溶液（約０．０７５％の塩化カルシウム等）中にコラゲナーゼ（約０．０２５％のコラゲナーゼ等）を含む酵素の溶液により、毎分３０〜７０ミリリットルの流速で３７℃で灌流される。灌流された肝臓組織は、小さい（約１立方ミリメートル等）部分に細かく切り刻まれる。上記と同じ緩衝液中で、穏やかに攪拌をしながら１０〜２０分間３７℃で酵素消化を継続して、細胞懸濁液を産生し、６０〜８０マイクロメートルのナイロンメッシュを用いて細胞懸濁液をろ過して、リリースされた肝細胞を収集する。次いで、ｐＨ７．０で緩やかな遠心分離を用いて常温のＨＥＰＥＳ緩衝液中で、収集した肝細胞を洗浄し、コラゲナーゼ及び細胞デブリを除去する。非実質細胞を、メトリザミド勾配遠心分離によって除去してもよい（米国特許第６，９９５，２９９号参照）。

肝細胞は、新鮮な組織（死亡から数時間以内に得た組織など）又は新鮮な状態で凍結された組織（約０℃以下で凍結及び保持された新鮮な組織など）から得ることができる。一部の用途に対しては、異種組織は、検出可能な病原体を有さないこと、形態学上及び組織学上正常であること、及び本質的に罹患がないことが好ましい。移植に用いる肝細胞は、例えば数時間以内といった直近に分離されたものであることができ、あるいは、その細胞が適切な保存媒体中に保持される場合には、より長期間を経た後で移植することができる。かかる媒体の１つが、ＶＩＡＳＰＡＮ（商標）（一般的な大動脈フラッシング用及び腹腔内臓器保存のための冷時保存用の溶液、ウィスコンシン大学溶液又はＵＷとも呼ばれる。）である。また肝細胞は、移植に先立ち冷凍保存することもできる。肝細胞の冷凍保存方法は本技術分野において周知であり、例えば米国特許第６，１３６，５２５号に記載される。

臓器ドナー又は肝臓切除からの異種肝細胞の入手に加えて、移植に用いる細胞は、ヒト肝細胞などの哺乳動物の幹細胞、又は、被移植ラット中への移植の後に、増殖可能な肝細胞を発生させる、又はかかる肝細胞に分化する肝前駆細胞とすることができる。ＥＳ細胞特性を有するヒト細胞は、胚盤胞内部細胞塊（Ｔｈｏｍｓｏｎら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７、１９９８）及び発生する胚細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６〜１３７３１、１９９８）から分離されており、ヒト胚幹細胞が作製されている（米国特許第６，２００，８０６号を参照のこと。）。米国特許第６，２００，８０６号に開示されるように、ＥＳ細胞は、ヒト及び非ヒト霊長動物から作製することができる。また、ヒト及び非ヒト霊長動物細胞から誘導された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞も得られる（例えば、Ｙｕら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８）：１９１７〜１９２０、２００７、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、 Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１〜８７２、２００７、Ｌｉｕら、 Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３（６）：５８７〜５９０、２００８を参照のこと。）。一般的に、霊長動物のＥＳ細胞は、ＥＳ細胞培地の存在下で、マウスの胚線維芽細胞の集密
層上に分離される。ＥＳ細胞培地は、一般的に、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、及び１％の非必須アミノ酸ストック（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含む８０％のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ピルビン酸塩なし、高グルコース処方、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）から構成される。成体中に存在するコミテッド（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）「多分化能」幹細胞と比較すると、ＥＳ細胞の際立った特徴としては、培養において無期限に未分化状態を保持するＥＳ細胞の能力、及びＥＳ細胞が有する、全ての異なる細胞の種類へと発生する潜在能力が挙げられる。ヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞は、特定のモノクローナル抗体により認識される糖脂質細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−４を発現する（例えば、Ａｍｉｔら、 Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：２７１〜２７８、２０００を参照のこと。）。１つの、あるいは２つ以上の実施形態において、前記肝細胞は、ＥＳＣ以外の供給源由来であることもできる。

ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）由来のヒト肝細胞もまた、本願に記載される方法において使用することができる。骨髄由来のｈＭＳＣを連続して肝由来の因子に曝露することにより、当該幹細胞が肝細胞の特性を備える細胞へと分化することとなる（Ｓｎｙｋｅｒｓら、 ＢＭＣ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． ７：２４、２００７、Ａｕｒｉｃｈら、 Ｇｕｔ．
５６（３）：４０５〜１５、２００７を参照のこと。）。骨髄由来の間葉系幹細胞及び脂肪組織由来の幹細胞（ＡＤＳＣ）の肝細胞への分化も報告されている（Ｔａｌｅｎｓ−Ｖｉｓｃｏｎｔｉら、 Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １２（３６）：５８３４〜４５、２００６を参照のこと。）。ヒト肝細胞は、単球からも作成することができる。Ｒｕｈｎｋｅら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７９（９）：１０９７〜１０３、２００５）は、最終的に分化した末梢血単球からの肝細胞様（ＮｅｏＨｅｐ）細胞の作成を報告する。ＮｅｏＨｅｐ細胞は、組織形態、肝細胞マーカーの発現、種々の分泌及び代謝機能並びに薬物の解毒活性の点で、一次ヒト肝細胞に類似する。加えて、羊膜細胞由来のヒト肝細胞も、本願記載の方法において用いることができる。

肝細胞は、皮膚線維芽細胞などの別な細胞の種類の再プログラムによって誘導することもできる（Ｈｕａｎｇら、 Ｎａｔｕｒｅ ４７５（７３５６）：３８６〜３８９、２０１１）。

ヒトＥＳ細胞株が存在し、これを本願に開示する方法において用いることができる。ヒトＥＳ細胞は、生体外受精した（ＩＶＦ）胚由来の未着床胚から誘導することもできる。胚が日齢１４日未満であれば、未使用の、ＩＶＦで作製したヒト胚に対する実験が、シンガポール及び英国などの多くの国で認可されている。高品位の胚のみが、ＥＳ細胞の分離に適する。ヒト胚の１つの細胞を、増殖した胚盤胞にまで培養するための培養条件が報告されている（Ｂｏｎｇｓｏら、 Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ． ４：７０６〜７１３、１９８９を参照のこと。）。ヒト胚を卵管細胞と共培養すると、高い品位の胚盤胞が作製されることとなる。細胞共培養において、又は改良され明確化された培地中で生育されたＩＶＦ由来の増殖したヒト胚盤胞は、ヒトＥＳ細胞の分離を可能とする（米国特許第６，２００，８０６号を参照のこと。）。

Ｃ．移植されたラットからの異種肝細胞の集取
増殖した肝細胞は、本技術分野において公知の数多くの手法の任意の手法により、被移植ラットから集取することができる。例えば、ラットに麻酔をかけ、門脈又は下大静脈にカテーテルを挿入することができる。次に、肝臓を適当な緩衝液（０．５ｍＭ ＥＧＴＡ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを追加した、カルシウム及びマグネシウムを含まないＥＢＳＳなど）により灌流し、続いてコラーゲン分解酵素処理することができる（例えば、カルシウム及びマグネシウムを含み、１ｍｇ／ｍＬ コラーゲン分解酵素を追加したＥＢＳＳ溶液を用いて）。消化された肝臓は動物から取り出され、細かく刻まれて、細胞の凝集体を分離し、均一な懸濁液を生成する。肝細胞を濃縮するために、細胞懸濁液はナイロンメッ
シュを通され（順に１００μｍ、７０μｍ及び４０μｍのナイロンメッシュを通すなどして）、次に低速度での遠心分離及び細胞の洗浄が行われる。

本技術分野において周知の任意の手法を用いて、被移植ラットから集取された異種肝細胞を、ラットの細胞及び他の混入物（組織又は細胞の細片など）から分離することができる。例えば、かかる手法としては、異種肝細胞種に対して選択的に結合する抗体の使用が挙げられる。ヒト肝細胞に関する、かかる抗体としては、それらに限定されないが、抵ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｍａｒｋｕｓら、 Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
６：４５５〜４６２、１９９７）又はＣＤ４６抗体などの、特異的にクラスＩの主要組織適合性抗原に結合する抗体が挙げられる。ヒト細胞又はヒト肝細胞に対して特異性を有する抗体は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）法、パニング法又は磁気ビーズ分離法などの、様々な異なる手法において用いることができる。あるいは、ラット細胞に選択的に結合する抗体を用いて、混入する動物細胞を除去し、それによりヒト肝細胞を濃縮することもできる。ＦＡＣＳ法は、より洗練された検出レベルの中でも、複数の色の経路、低角及び低感度光散乱検出経路、及びインピーダンス経路を用い、抗体が結合した細胞を分離すなわち選別する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照のこと。）。磁気分離は、１）ヒト特異性抗体に接合した、２）ヒト特異性抗体に結合可能な検出用抗体に接合した、３）ビオチン標識された抗体に結合可能なアビジンに接合した、常磁性粒子の使用を伴う。パニング法は、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜又はプラスチックペトリ皿などの固体マトリックスに連結されたモノクローナル抗体を伴う。抗体が結合した細胞は、試料から単純に物理的に固体担体を分離することにより、試料から分離できる。

ラットから集取された肝細胞は、例えば、後の使用のために凍結保存することができ、あるいは、輸送及び将来の使用のために、組織培養にプレーティングすることができる。

Ｄ．肝臓再構成
本願に記載されるラットは、ヒト又は非ヒト哺乳動物における肝移植の代替手段又はこれを補助するものとして、肝臓を再構成するために用いることができる肝細胞を増殖させるためのシステムを提供する。現在、肝疾患を病む患者は、恐らく、移植に適した臓器が利用可能になるまで、長期間待たざるを得ないこととなる。移植後には、患者は、ドナーの肝臓の拒絶反応を避けてその生命を存続させるために、免疫抑制剤による治療を受ける必要がある。患者自身の存続している健康な肝細胞を増殖させる方法は、生存し続けるための免疫抑制を必要としない、機能し得る肝臓組織の供給源を提供することができることとなる。従って、本願に開示するラットは、肝疾患及び／又は肝不全を有するヒト及び非ヒト哺乳動物の両方の肝細胞を、ラット中で増殖させた、患者特異的幹細胞から作製される肝細胞を含む、彼ら自身の肝細胞を用いて、あるいはドナーからの肝細胞を用いて、再構成するために用いることができる。

肝細胞の導入による、患者における肝臓組織の再構成（「肝細胞移植」とも呼ばれる）は、将来の肝臓移植を期待した上での一時的な治療、あるいは、孤立性代謝不全（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｅｔｈａｂｏｌｉｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）を有する患者に対する最終的な治療のいずれかとして、急性肝不全の患者に対する可能性のある治療の選択肢である（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒら、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５： ５３〜６１、１９９８）。肝臓再構成治療を達成する上での主たる障害は、ホストによる移植された肝細胞の免疫的拒絶であり、（ホストとドナーの細胞が、遺伝的及び表現型的に異なる場合）「同種移植片拒絶」と呼ばれる現象である。免疫抑制剤は、同種移植片拒絶の防止に対して部分的に功を奏するのみである（Ｊａｖｒｅｇｕｉら、 Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５： ３５３〜３６７、１９９６、Ｍａｋｏｗｋａら、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４２： ５３７−５４１、１９８６）。

ラット中で増殖した肝細胞は、遺伝子治療用途にも使用することができる。広義には、かかる肝細胞は、ホストに移植されて遺伝子の欠陥を修正する。継代肝細胞は、必ずしもその必要はないが、元々は、被移植者となる同一の個人又は対象に由来することができる。

一部の実施形態において、ラット中で増殖した異種肝細胞は、肝臓移植の前段階又は代替手段として、対象において肝臓組織を再構成するために用いられてもよい。１つの限定されない例として、例えばアルコール依存症の結果として、肝臓の進行性変性を病む対象は、肝細胞のドナーを務めることができ、その肝細胞をその後ラット中で増殖させる。肝細胞の数は、初めに対象から得られ、ラットに移植された数に比較して拡大する。増殖に続き、増殖した肝細胞はラットから分離され、対象の肝機能を再構成するために用いることができる。ラット中での肝細胞の増殖は、肝細胞の数を増加させるためだけでなく、感染性又は悪性疾患に罹患した肝細胞を選択的に除去するためにも用いられる。詳細には、対象が肝炎に罹患しており、肝細胞は全てではなくその一部が感染し、感染した肝細胞は、細胞中又はその表面上のウイルス抗原の有無によって識別することができるといったことが考えられる。かかる例においては、肝細胞は対象から集取することができ、１頭又は２頭以上のラット中での増殖に向けて、例えばＦＡＣＳ法によって、非感染の細胞を選別することができる。その間、患者における感染症を排除するために積極的な処置をとることも可能である。治療に続いて、対象の肝臓組織は、１頭又は２頭以上のラット中で増殖した肝細胞によって再構成することができる。類似の方法を、ＨＣＣなどの肝臓の悪性腫瘍に罹患した患者から非悪性細胞を選択的に継代するために用いることもできる。

Ｅ．ＨＴ１のモデル
遺伝性チロシン血症１型（ＨＴ１）は、肝臓及び腎臓に影響を与える重症の常染色体劣性代謝疾患である。ＨＴ１は、ヒトにおいては染色体１５のｑ２３〜ｑ２５、マウスにおいては染色体７の位置におけるＦａｈ遺伝子中の欠陥から起こる。ＨＴ１の患者は、肝硬変に進展する幼少時からの肝臓障害、凝固因子の減少、低血糖症、血清プラズマの中のメチオニン、フェニルアラニン及びアミノレブリン酸の高濃度化、肝細胞癌の高い危険性、並びに尿細管及び糸球体の腎臓機能不全などの様々な臨床的な症状を示す。その重症の形態においては、ある種の進行性肝臓不全が早期の幼少時から始まる。その軽症の形態においては、肝細胞癌の高い発生率を伴う慢性肝臓不全が特徴である。

Ｆａｈ遺伝子破壊に対してホモ接合である動物は、肝機能不全によって起こる新生児期の致死性表現型を有する。Ｆａｈ欠損マウスのＮＴＢＣによる治療により、肝機能が修復され新生児期の致死性が消滅することが、以前より論証されている。（Ｇｒｏｍｐｅら、
Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １０：４５３〜４６０、１９９５）。これらの動物における生存期間の延長は、肝細胞癌及び線維症の発生などの、ヒトにおけるＨＴ１に対する表現型と類似する結果となる。従って、本願において開示されるＦａｈ欠損ラットは、また、ヒト疾患ＨＴ１の動物モデルでもあることを意味する。

Ｆ．肝臓疾患モデル
上記に議論したように、ラットにおけるＦａｈ欠損は、ヒト疾患ＨＴ１に類似する疾患表現型に繋がる。死に至ることを防止するために、Ｆａｈ欠損ラットは、ＮＴＢＣ又は肝機能不全を忌避する他の化合物を継続使用されるが、ＮＴＢＣの用量滴定を用いて、ＨＣＣ、線維症及び肝硬変などのＨＴ１型の表現型の発生を促進することもできる。従って、本願に開示の種々の肝不全を有するラットは、ＨＣＣ及び肝硬変などの種々の肝臓疾患を研究するために使用することができる。

一部の実施形態において、ヒト化された肝臓を有するラットが、ヒト肝臓疾患の動物モデルとして用いられる。前記ラットは、例えば、毒性物質への曝露、感染性疾患又は悪性
腫瘍若しくは遺伝的欠陥（すなわち、ＨＴ１へ繋がるＦａｈ欠損）から起こる肝臓疾患のモデルとして用いることができる。前記ラットが、そのモデルとして役立つことができるヒトの遺伝性肝臓疾患の例としては、それらに限定されないが、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高シュウ酸尿症、フェニルケトン尿症、楓糖尿症、グリコーゲン貯蔵疾患、リソソーム貯蔵疾患（ゴーシェ病など）、及び任意の先天性代謝異常が挙げられる。開示するモデル系は、個々の肝臓疾患のよりよい理解を得るために、及び、疾患の過程を防止する、遅延させる又は逆戻しすることができる薬剤を識別するために用いることができる。

前記ラットが、毒性物質によって起こる肝臓疾患のモデルとして用いられる場合、Ｆａｈ欠損ラットは、肝機能障害又は肝不全に対して効果のあるＮＴＢＣ（又はＮＴＢＣと同様の肝臓保護効果を有する薬剤）を継続投与される。相当するヒトにおける状態に最も近い結果をもたらす毒性物質の必要量は、毒性物質の投与量を増加させながら、多くのラットをこれに曝露することによって決定することができる。毒性物質の例としては、それらに限定されないが、エタノール、アセトアミノフェン、フェニトイン、メチルドーパ、イソニアジド、四塩化炭素、黄リン及びファロイジンが挙げられる。いくつかの場合、毒性物質の効果を評価するためのモデルとして、ヒト肝細胞をもたないラットが用いられる。その他の例においては、ヒト肝細胞に対する毒性物質の影響を評価するために、ヒト肝細胞がラットに移植される。これらの例においては、肝機能を維持するために、Ｆａｈ欠損ラットに、ＮＴＢＣなどの肝臓保護のための薬剤を継続投与する必要はない。一般的には、ヒト肝細胞の増殖を、ヒト肝細胞集団の大きさが十分となる（例えば、最大値に近付く）時点まで進行させ、その後、ラットは毒性物質に曝露される。

ラットが、悪性肝疾患（ＨＣＣ又は肝細胞癌など）のモデルとして用いられることになる実施形態においては、Ｆａｈ欠損ラットは、肝機能不全による致死を防止するために、ＮＴＢＣなどの肝臓保護薬剤を十分に高い用量で投与されるが、ＨＣＣ又は他の肝臓の悪性腫瘍を発生させる場合には、十分に低い用量で投与される。あるいは、Ｆａｈ欠損ラットに肝機能を保持する薬剤を継続投与し、形質転換剤への曝露又は悪性腫瘍細胞の導入により悪性腫瘍を生成させることができる。いくつかの例においては、異種肝細胞を含まないラットが、悪性肝臓疾患のモデルとして用いられる。その他の例においては、ラットは、ヒト肝細胞を移植され、ヒト細胞の悪性肝臓疾患を評価する。これらの例においては、Ｆａｈ欠損ラットにＮＴＢＣなどの肝臓保護薬剤継続投与する必要はない。形質転換剤又は悪性腫瘍細胞は、初期のヒト肝細胞の移植導入と共に導入されてもよいし、又は、ヒト肝細胞がホストラット中で増殖し始めた後に導入されてもよい。形質転換剤の場合、異種肝細胞が活発に増殖しているときに、形質転換剤を投与することが好ましいと思われる。形質転換剤の例としては、アフラトキシン、ジメチルニトロソアミン、及び０．０５〜０．１％ｗ／ｗのＤＬ−エチオニンを含むコリン欠乏食（Ｆａｒｂｅｒ及びＳａｒｍａ、１９８７、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｉｅｓ ｉｎ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ中、Ｍａｓｋｅｎｓら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｐｐ． １８５〜２２０）が挙げられる。かかる形質転換剤は、ラットに対して全身的に投与されるか、又は肝臓そのものに投与されるかのいずれかであってよい。悪性腫瘍細胞は、直接肝臓に接種することができる。

Ｇ．肝臓感染症のためのモデル
被移植ラット中で増殖し、該ラットから集取された肝細胞は、様々な微生物学的研究にも使用することができる。多数の病原体（例えば、細菌、ウイルス及び寄生生物）は、ヒトホスト中すなわち一次ヒト肝細胞中のみで増殖することとなる。従って、十分な一次ヒト肝細胞の供給源を有することは、これらの病原体の研究にとって重要である。増殖したヒト肝細胞は、ウイルス性感染症及びウイルスの増殖の研究又は肝炎ウイルスの感染を変調する化合物を識別するための研究に用いることができる。一次ヒト肝細胞を肝炎ウイル
スの研究に用いる方法が、例えば、欧州特許出願公開第１５５２７４０号、米国特許第６，５０９，５１４号及び国際公開第００／１７３３８号に記載される。肝炎ウイルスの例としては、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。肝臓に入る寄生生物の例としては、例えば、マラリアの病原体（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｍａｌａｒｉａｅ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種）及びリーシュマニア症の病原体（Ｌ． ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ． ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ． ｃｈａｇａｓｉ、Ｌ． ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ． ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌ． ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ、Ｌ． ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ． ｍａｊｏｒ、Ｌ． ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ、Ｌ． （Ｖ．） ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ． （Ｖ．） ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ、Ｌ． （Ｖ．） ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ、及びＬ． （Ｖ．） ｐｅｒｕｖｉａｎａなどのＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種）が挙げられる。

ラット中で増殖したヒト肝細胞を微生物学的研究に用いることに加えて、ラットそのものが肝炎病原体感染の動物モデルとして役立つことができる。例えば、ヒト肝細胞を再増殖されたラットは、肝炎病原体に感染させることができ、当該感染症の治療のための候補薬を選抜するために用いることができる。候補薬としては、有機低分子化合物などの、多数の化学上の分類の任意の１種の中の任意の化合物が挙げられる。また、候補薬としては、例えば核酸分子（アンチセンスオリゴヌクレオチド、小さい干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、発現ベクター及びその他など）、ペプチド及び抗体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的類似体又はそれらの組み合わせも挙げられる。

候補薬は、合成化合物又は天然化合物のライブラリなどの多様な供給源から得ることができる。例えば、広範な有機化合物及び生物分子の無作為な合成又は目的合成に対して、無作為化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現などの、多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態での天然化合物のライブラリが利用可能又は容易に製造される。加えて、天然の又は合成的に製造されたライブラリ及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生物学的手段を通して容易に改変され、それらを用いて、組み合わせのライブラリをつくることができる。公知の薬理的物質は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの、目的的な又は無作為の化学的改変に供され、構造的類似体を製造することができる。

ＨＣＶ及びＨＢＶ感染症を研究するために、並びにこれらの感染症の治療のための候補薬を評価するためのラットの使用を以下に議論する。しかし、これらの方法は、任意の、対象とする肝疾患の病原体に対して適用することができる。１つの実施形態において、ラットは、ウイルス感染を抑制する薬剤、ウイルスの増殖を低減する薬剤、及び／又は、１つ又は２つ以上のＨＢＶ又はＨＣＶ感染により生じる症状を改善する薬剤を識別するために用いられる。一般的に、候補薬はラットに投与され、候補薬の効果が対照実験との比較において評価される。例えば、候補薬がＨＣＶ感染ラットモデルに投与され、治療を受けたラットのウイルス力価（例えば、血清試料のＲＴ−ＰＣＲによって測定される）が、治療前のラットのウイルス力価、及び／又は治療を受けないＨＣＶ感染ラットのウイルス力価と比較され得る。感染し、その後候補薬を用いた治療を受けたラットのウイルス力価における検出可能な低下によって、当該薬剤の抗ウイルス活性が示される。

候補薬は、当該薬剤の送達に適した任意の好適な方法で投与し得る。例えば、候補薬は、注射により（静脈内に、筋内に、皮下に、又は目標組織へ直接注射することによるなど）、経口投与により、又は任意のその他の望ましい手段で投与することができる。いくつかの場合において、生体内での選抜は、候補薬の量及び濃度を変化させ（薬剤なしから、
動物に安全に送達可能な量の上限に近づく薬剤の量まで）、それを受け入れる多数のラットを必要とすることとなり、また、異なる処方及び経路での薬剤の送達を伴ってもよい。候補薬は、単独で投与することができ、又は、特に組み合わせによる薬剤の投与が相乗的な効果をもたらし得る場合には、２種又は３種以上を組み合わせて投与することもできる。

候補薬の活性は、本技術分野で公知の多様な手段の任意の１つを用いて評価することができる。例えば、ラットが肝臓指向性病原体（例えば、ＨＢＶ又はＨＣＶ）に感染している場合、薬剤の効果は、病原体の有無について（例えば、ウイルス力価を測定する）、又は病原体の有無に関係するマーカーについて（例えば、病原体特異性のタンパク質又はそれをコードする核酸）、血清試料を検査することによって評価することができる。ウイルス感染の有無及び重篤度の検出及び評価のための定性的及び定量的方法は、本技術分野で周知である。ひとつの実施形態において、ＨＢＶ感染症に対する薬剤の活性は、血清試料及び／又は組織切片を、ウイルス抗原（ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）又はＨＢＶ核心抗原（ＨＢｃＡｇ）など）の有無について検査することにより評価することができる。他の実施形態において、ウイルス感染症に対する薬剤の活性は、ウイルスの核酸（ＨＣＶ ＲＮＡなど）の有無について、血清試料を検査することにより評価することができる。例えば、ＨＣＶ ＲＮＡは、例えば、逆転写酵素重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的ＲＴ−ＰＣＲ又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲによるネガティブ鎖ＲＮＡ（ＨＣＶの増殖中間体）の検出、又は、治療によるウイルスゲノムにおける変異／シフト（「疑似種進化」）を検出するためのウイルスＲＮＡの配列決定を用いて検出することができる。上記に代えてあるいは上記に加えて、ホストの肝臓を生検し、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ ハイブリダイゼーションを実施し、組織切片におけるウイルス粒子の量の定性的又は定量的変化を直接証明してもよい。上記に代えてあるいは上記に加えて、ホストを安楽死させ、その肝臓を組織学的に、感染及び／又は当該薬剤によって引き起こされる毒性の痕跡について検査することができる。

本願に記載されるラットモデルは、候補ワクチンを、その肝臓指向性病原体による感染症を予防する又は改善する能力について選別するために用いることもできる。一般的に、ワクチンは、投与に続いて、ホストが標的病原体に対する免疫応答を開始することを促進する薬剤である。誘発された液性、細胞性、又は液性／細胞性免疫応答は、ワクチンの開発対象である病原体による感染症の抑制を促進することができる。本開示において特に対象とするのは、肝臓指向性病原体（例えば、細菌、ウイルス、又は寄生病原体）、特にＨＢＶ及び／又はＨＣＶなどのウイルス病原体による感染、及び／又は前記病原体の肝臓内での増殖を抑制する免疫応答を誘発するワクチンである。

候補ワクチンを評価するために、ラットはヒト肝細胞を移植され、ラットの肝臓をヒト肝細胞により再増殖させる。有効なワクチンの選抜は、前述の選抜方法と同様である。一部の実施形態において、肝臓指向性病原体の植菌に先立って、候補ワクチンがラットに投与される。いくつかの場合において、候補ワクチンは、一回の急速投与（例えば、腹腔内又は筋内注射、局所投与、又は経口投与）を施すことにより投与され、その後、任意に１種又は２種以上の追加免疫化処置を行う。免疫応答の誘発は、当技術分野において周知の方法に従って、抗原／ワクチンに特異的なＢ又はＴ細胞応答を検査することにより評価することができる。次に、免疫化されたラットは、肝臓指向性病原体を負荷される。一般的には、病原体力価を増加させながら数頭のラットが負荷される。次に、ラットは、感染症の発症を観察され、感染症の重篤度が評価される（存在する病原体の力価を評価する、又は、ヒト肝細胞の機能パラメータを検査することによるなど）。負荷後に起こる、当該病原体による感染の顕著な低下、及び／又は疾患の重篤度の顕著な低下を与えるワクチン候補が、ウイルスワクチンとして識別される。

Ｈ．薬理、毒性及び遺伝治療の研究
上記のラットモデル、及び／又は当該ラット中で増殖し及びそこから集取された異種肝細胞は、低分子、生物学的製剤、環境上の若しくは生物学上の毒物又は遺伝子導入系などの、任意の薬理化合物による遺伝発現の変質を、かかる肝細胞中で評価するために用いることができる。

例えば、ラット中で増殖し及びそこから集取されたヒト肝細胞は、ヒト細胞中で個々の物質の毒性を評価するために用いることができる。分離された肝細胞における化合物の毒性の試験方法は本技術分野において周知であり、例えば、国際公開第２００７／０２２４１９号に記載される。同様に、ヒト肝細胞を移植されたラットは、外因性の物質の毒性を評価するために用いることができる。一部の実施形態において、外因性の物質は、公知の毒物又は毒性が疑われる物質である。

一部の実施形態において、ヒト肝細胞を移植されたラット（又は、ラット中で増殖し及びそこから集取されたヒト肝細胞）は、多数の薬物代謝及び薬物動態パラメータの任意の１つを評価するために用いられる。例えば、薬物代謝、生体内における薬物／薬物相互作用、薬物半減期、排出／除去の経路、尿、便、胆汁、血液又は他の体液中の代謝物、チトクロームｐ４５０誘発、腸肝再循環、及び酵素／輸送体誘発を評価するための研究を行うことができる。

一部の実施形態において、ヒト肝細胞を移植されたラット（又は、ラット中で増殖し及びそこから集取されたヒト肝細胞）は、治療のための薬剤若しくは候補薬（低分子、生物学的製剤など）、環境上の若しくは生物学上の毒物、又は遺伝子導入系などの化合物の毒性及び安全性を評価するために用いられる。例えば、増殖したヒト肝細胞における細胞周期増殖を評価し、前記化合物への曝露の後に癌の危険性を特定することなどができる。組織診、枯死指数、肝機能試験、遺伝発現分析、代謝分析他によるなどして、肝細胞に対する毒性も評価することができる。安定な同位体前駆体を感染させた後の代謝分析などの肝細胞代謝の分析も行うことができる。

個々の薬剤の効能も、ヒト肝細胞を移植されたラット中で評価することができる。かかる薬剤としては、例えば、高脂血症／アテローム性動脈硬化症、肝炎及びマラリアの治療薬が挙げられる。

一部の実施形態において、ヒト肝細胞を移植されたラット（又は、ラット中で増殖し及びそこから集取されたヒト肝細胞）は、遺伝子治療計画及びベクターを研究するために用いられる。例えば、ウイルス及び非ウイルスベクターなどの遺伝子送達ビヒクルの形質導入効率、組込み頻度及び搭載遺伝子の位置（組込み部位分析）、搭載遺伝子の機能性（遺伝子発現レベル、遺伝子ノックダウン効率）、並びに搭載遺伝子の副作用（遺伝子発現の分析すなわち生体内でのヒト肝細胞におけるプロテオミクス）、のパラメータを評価することができる。

ＩＶ．ウロキナーゼをコードするベクター
本願記載の方法の一部の実施形態において、ラットは、異種肝細胞の移植に先立って、ウロキナーゼをコードするベクターを投与される。ウロキナーゼの異所的発現は、肝細胞の死を誘発して、それに続く肝臓の再生を促進し、そのために、肝細胞の生着効率を補助することができる（Ｌｉｅｂｅｒら、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
９２：６２１０〜６２１４、１９９５）。

１つの実施形態において、前記ウロキナーゼ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）としても知られる）は、ヒトウロキナーゼの分泌された形態である。他の実施
形態において、ウロキナーゼは、改変された、分泌されたものではないウロキナーゼの形態である（米国特許第５，９８０，８８６号を参照のこと。）。動物中でのウロキナーゼの発現に好適な任意の型のベクターが考えられる。かかるベクターとしては、プラスミドベクター又はウイルスベクターが挙げられる。好適なベクターとしては、それらに限定されないが、ＤＮＡベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、疑似型レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、テナガザル類人猿白血病ベクター、ＶＳＶ−Ｇベクター、ＶＬ３０ベクター、リポソーム媒介ベクター、及びその他が挙げられる。１つの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス血清型（それらに限定されないが、Ａｄ２及びＡｄ５など）などの、任意の適当なアデノウイルスに由来することができる。アデノウイルスベクターは、第１世代、第２世代、第３世代及び／又は第４世代のアデノウイルスベクター又は情弱なアデノウイルスベクターとすることができる。非ウイルスベクターは、種々の構造の、プラスミド、リン脂質又はリポソーム（カチオン系及びアニオン系）によって構成されることができる。他の実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、本技術分野において公知の任意の好適なＡＡＶベクターとすることができる。

ウロキナーゼをコードするウイルスベクター及び非ウイルスベクターは、本技術分野において周知である。例えば、ヒトウロキナーゼをコードするアデノウイルスベクターが、米国特許第５，９８０，８８６号に、及びＬｉｅｂｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２（１３）：６２１０〜４、１９９５）によって記載される。米国特許出願公開第２００５−１７６１２９号及び米国特許第５，５８５，３６２号は、組換え型アデノウイルスベクターを記載し、米国特許第６，０２５，１９５号は、肝臓特異的な発現のためのアデノウイルスベクターを開示する。米国特許出願公開第２００３−０１６６２８４号は、対象とする、ウロキナーゼなどの肝臓特異的な遺伝子発現のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを記載する。米国特許第６，５２１，２２５号及び第５，５８９，３７７号は、組換え型ＡＡＶベクターを記載する。国際公開第０２／４４３９３号は、ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤遺伝子を含むウイルス及び非ウイルスベクターを記載する。ヒトウロキナーゼ遺伝子の高いレベルの発現が可能な発現ベクターが、国際公開第０３／０８７３９３号に開示される。前述の特許及び公開のそれぞれは、参照により本願に援用される。

ウロキナーゼをコードするベクターは、任意に、適当なプロモータ、エンハンサ、転写終結因子、タンパク質コード化遺伝子の前の開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロン及びｍＲＮＡの適正な翻訳を可能にするその遺伝子の正しい読み枠の保持のためのスプライシング信号、及び終止コドンなどの発現制御配列を含むことができる。一般的に、発現制御配列は、転写を指示するために十分な最小限の配列であるプロモータを含む。

発現ベクターは、複製起点、プロモータ、並びに形質転換細胞の表現型の選択を可能にする特定の遺伝子（抗生物質抵抗性カセットなど）を含むことができる。一般的には、発現ベクターはプロモータを含むこととなる。プロモータは、誘導性又は構成的であることができる。プロモータは組織特異的であることができる。好適なプロモータとしては、チミジンキナーゼプロモータ（ＴＫ）、メタロチオネインＩ、多面体、ニューロン特異性エノラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ベータ−アクチン、又は他のプロモータが挙げられる。１つの実施形態において、プロモータは、異種プロモータである。

一例において、ウロキナーゼをコードする配列は、所望のプロモータの下流に位置する。任意に、エンハンサ要素も含まれ、エンハンサ要素は、一般的にベクター上のいずれにも位置でき、それでも転写促進効果を有する。しかし、活性の増加量は、一般的に距離と共に減じられる。

ウロキナーゼをコードするベクターは、それらに限定されないが、静脈内投与、腹腔内投与又は門脈を介した血管内注入などの様々な経路により投与することができる。投与されるベクターの量は一様ではなく、通例の実験法を用いることにより決定することができる。１つの実施形態において、ラットは、ウロキナーゼをコードするアデノウイルスベクターを約１×１０^８〜約１×１０^１０プラーク形成単位、例えば約５×１０^９プラーク形成単位の用量で投与される。

１つの実施形態において、ラットは、ヒトウロキナーゼをコードするアデノウイルスベクターを投与される。アデノウイルスベクターは、非常に高い感染性粒子の力価のものまで作成することができる、多種多様な細胞に感染する、分裂していない細胞に対して効率的に遺伝子を移入する、及びゲストのゲノム内に殆ど組み込まれず、これにより、挿入変異による細胞の形質転換の危険性を回避する（Ｄｏｕｇｌａｓ及びＣｕｒｉｅｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３月／４月 １９９７、４４〜５３ページ、Ｚｅｒｎ及びＫｒｅｓｉｎａｍ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：２５（２）、４８４〜４９１、１９９７）などの、他の型のウイルスベクターに対するいくつかの利点を有する。ウロキナーゼをコードするために用いることができる代表的なアデノウイルスベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０： ６２６〜６３０、１９９２）、Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃ（Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７： １０９〜１２８、１９９１）、及びＢａｒｒら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２：１５１〜１５５、１９９５）によって報告される。

記載される実施形態の更なる利点は、実施例に基づいて、当業者に対して明らかにされることとなる。

以下の実施例は、ある特定の特徴及び／又は実施形態を例証するために提示される。これらの実施例は、本開示を、記載された特定の特徴又は実施形態に限定すると解されるべきではない。

実施例１
ＡＡＶ−ｒＦＡＨ：ＰＧＫ−ＮＥＯヌルターゲッティングベクターの作成及びＦＡＨ ＫＯラットＥＳ細胞の作製
ラットＦＡＨ ＫＯ構築物は、ＦＡＨ遺伝子のエキソン３を標的とする。ラットＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを、ターゲティング構築物のための５’及び３’ＦＡＨ相同性領域を作成するために用いた。エキソン３の上流１．５ｋｂのフォワードプライマー（イントロン１〜２、表１）、及びＦＡＨ遺伝子のエキソン３内５４ｂｐで終える終止コドンを含むリバースプライマー（配列番号１、図１）を用いて、５’ＦＡＨ相動性領域を作成した。エキソン３内の９０ｂｐで開始し、イントロン４〜５内で終えるフォワードプライマー（１．５ｋｂ、表１）を用いて３’ＦＡＨ相同性領域を作成した。２つの１．５ｋｂのＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定し、ＰＧＫ：ＮＥＯセレクションカセットに結合し、合計４．７ｋｂとなった（図２）。ターゲッティングカセットのヌクレオチド配列を配列番号２として、本願に示す。

前記４．７ｋｂの断片を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに結合し、これを直線化し、ラット２０８Ｄ線維芽細胞に遺伝子導入して、ＮＥＯ耐性を試験した。５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８、１週間により、細胞を選択した。耐性の２０８Ｄクローンを得た。次に、前記４．７ｋｂカセットをｐＡＡＶ２シャトルベクターに結合し、完全なＦＡＨカッセトを含む
クローンを選択し、組換えＡＡＶを作成した。ＡＡＶ−ｒＦＡＨ：ＰＧＫ−ＮＥＯ構築物を内部反復配列が未変化であることについて確認し、配列決定した後、ＡＡＶの作製に用いた。

精製された高力価ワイルスを増殖させ、ラット胚幹細胞を形質導入するために用いた。組換えＦＡＨ ＫＯクローンは、１００μｇ／ｍＬのＧ４１８を用いて選択した。選択下で生育可能なＥＳ細胞クローンをさらに増幅し、ゲノムＤＮＡを分離した。９５ Ｇ４１８選択クローン由来のＥＳ細胞クローンを、組み込み部位の５’末端又は３’末端に対するＦＡＨ特異的プライマーを用いたＰＣＲによって決定された適正なラットゲノムの座位に組み込んだ。１０個のＥＳクローンをさらにサザンブロット解析により検証して、ＦＡＨ ＫＯカセットの適正なゲノム組み込みを確認した（図３）。始めにＥＡクローンを解凍し、２４ウェルプレートの同等のウェル中で増殖させた。それぞれのクローン毎に１つのウェルを回収し、ペレット化し、液体窒素中で凍結し、その後、使用の準備ができるまで−８０℃で貯蔵した。細胞ペレットをＳＤＳにより溶解し、タンパク質を消化させ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を飽和塩化ナトリウム水溶液及びイソプロパノールにより沈殿させることにより、試料からゲノムＤＮＡを分離した。各クローン由来の約２０μｇのｇＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ ＩＩにより消化させ、その試料を、０．７％アガロース：トリス−ボレート−ＥＤＴＡゲル上で４５ボルトにおいて６時間電気泳動した。ＤＮＡを脱プリン化に供し、その後アルカリ性転写緩衝液によるキャピラリー転写に供した。組換えＦＲＧ ＫＯクローンを、^３２Ｐ標識したプローブを用いたナイロン膜のハイブリダイゼーションにより同定し、これにより、迅速にＦＲＧ ＫＯ：ＰＧＫ−ネオマイシンカセットの３’末端と位置付けられた。図４は、組込まれたターゲッティングカセットを有するｒＦａｈ遺伝子の概略図である。ノックアウト組換えクローンは、７．９Ｋｂの特有な断片によって識別された。結果を図５〜６に示す。

図５（ａ）により、相同的組換えによる組込みが確認される。５’ＦＡＨ＋ＮＥＯ（リバース）及び３’ＦＡＨ＋ＮＥＯ（フォワード）プライマーを用いることにより、両隣接部は、相同的組換えによるエキソン３への組込みに対して予見されたように、未変化であることが確認された。図５（ｂ）は、試料中にＤＮＡが存在することを確認する、対照のゲルである。図６は、ｒＦａｈ遺伝子の野生型及び標的領域のＫＯゲノムの概略図を、Ｆ
ａｈプローブを用いたサザンブロットと併せて示す。標的としない及び標的とした対立遺伝子の両方が視覚化され、予想されたバンドの大きさを有する。これにより、クローン１１、１５、及び１８中のラットＦａｈ座位の適切なターゲッティングが行われたことが確認される。

標的としたＦＡＨノックアウトＥＳ細胞は、Ｔｏｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ ４６７（７３１２）：２１１〜２１３、２０１０）によって報告される操作法を用いて、Ｆａｈ ＫＯラットを作成するために用いることができる。

実施例２
ＦＡＨ ＫＯラットの作成及びヒト肝細胞の移植
ＦＡＨ ＫＯ ＥＳ細胞をラット胚盤胞に注射し、次にこれをＥ３．５偽妊娠ＳＤラットに移植することによって、ＦＡＨ ＫＯラットを作成した。これらのラットからのキメラの後代を繁殖させて、ジャームライントランスミッションによりヘテロ接合性のＦＡＨ
ＫＯラットを作成する。次に、ヘテロ接合体の雄と雌をさらに繁殖させてＦＡＨノックアウトラットを作成する。ＦＡＨ遺伝子の欠失により、肝臓障害の誘発が可能になり、移植されたヒト肝細胞による、高いレベルでの肝臓の生着及び再増殖を促進する。

ヒト肝細胞の移植に先立ち、プラスミノーゲン様ウロキナーゼ酵素を発現する組換えアデノウイルスの投与により、ラットに急性肝臓障害を誘発させる。２４時間後に、脾臓内注射を介してヒト肝細胞を送達し、肝細胞は血管系を通して移動して肝臓に到達する。加えて、移植の前、最中及び後に、ラットに免疫用抑制剤を与え、ラットにおいて、異種移植されたヒト肝細胞からの対移植片宿主応答を排除する。限定した期間、ラットへのＮＴＢＣの投与を停止することにより、ラット細胞は活動を止めた状態となって、ヒト細胞は増殖の面で有利となり、これがラット肝細胞のヒト肝細胞による置換を引き起こし、肝臓における高いレベルのヒトキメラ性を有するラットを生み出す。ヒト肝細胞の再増殖レベルは、ヒト血清のアルブミン濃度及びその他のヒト特異性マーカーの定量によって決定され、また、移植を受けたラット由来の肝臓切片の免疫組織化学と関係付けられる。

実施例３
Ｉｌ２ｒｇ構築物の作成
ラットＩｌ２ｒｇ構築物は、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子のエキソン３を標的とする。ラットＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを、ターゲティング構築物のための５’及び３’Ｉｌ２ｒｇ相同性領域を作成するために用いた。エキソン３の上流１．４６ｋｂのフォワードプライマー（表２）、及びＩｌ２ｒｇ遺伝子のエキソン３内側４０ｂｐで終える終止コドンを含むリバースプライマーを用いて、５’Ｉｌ２ｒｇ相同性領域を作成した。エキソン３の４０ｂｐを含み、エキソン６内で終えるフォワードプライマー（１．５ｋｂ、表２）を用いて３’Ｉｌ２ｒｇ相同性領域を作成した。２つの１．５ｋｂのＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定し、ＰＧＫ：ＮＥＯセレクションカセットに結合し、実施例１において述べたＦＡＨ構築物と類似の合計４．７ｋｂとなった。構築物を配列決定し、ウイルス作製に用いた。

実施例４
ヒト化マウス由来の肝細胞の灌流及び分離
この実施例においては、ヒト肝細胞を、ヒト肝細胞を再増殖された遺伝子組換えマウス（ＦＲＧ ＫＯマウス）から分離した。マウスから分離したヒト肝細胞は、実施例５に記載される研究に用いた。

高度に再増殖されたマウス（ＦＲＧ ノックアウトマウスモデル、Ｙｅｃｕｒｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、国際公開第２００８／１５１２８３号及び国際公開第２０１０／１２７２７５号参照、アルブミン濃度＝４．３７ｍｇ／ｍＬ、ＮＴＢＣ状況：０ｍｇ／Ｌ）の原位置肝臓から、コラーゲン分解酵素灌流法を用いて肝細胞を分離した。まず、マウスに麻酔し、次に水分を吸収する表面上に固定した。開腹し、門脈にカニューレを挿入した。次に、肝臓を脱色し、血液凝固を一切排除するために、肝臓をカルシウム又はマグネシウムを含まないＥＢＳＳ、１０ｍＭ ｐＨ７．４ヘペス及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡにより灌流した。次に、カルシウム及びマグネシウムを含むＥＢＳＳ中１ｍｇ／ｍＬ コラーゲン分解酵素ＩＩ型溶液及び１０ｍＭ ｐＨ７．４ヘペスを用いて８分間、肝臓が完全に消化されるまで肝臓を灌流した。次に肝臓をペトリ皿に取り出し、ピンセット及び鋏を用いて均一な懸濁液へと解離させた。次に、５ｍＬの灌流媒体（ＤＭＥＭ＋１０％ ウシ胎児血清）を用いてコラーゲン分解酵素を失活させた。

２５ｍＬの無菌ピペットを用いて、肝臓懸濁液を１００ミクロンのフィルタを通して５０ｍＬの管に移した。次に、ペトリ皿を灌流媒体によって洗浄し、その洗液を、フィルタを通して前記の５０ｍＬの管に移した。灌流媒体により管内の容量を４５ｍＬに調整し、均一な溶液を確保するために、２〜３回転倒した。次に、この細胞懸濁液を７０ミクロンのフィルタを通して、新しい５０ｍＬの管に移した。細胞を、４℃、１４０×ｇで５分間遠心分離した。上清を注意深く吸い出し、細胞ペレットを１０ｍＬの灌流媒体中に再懸濁させた。いずれの細胞凝集をも解離させるために、細胞懸濁液を合計５回、１０ｍＬピペットに通した。懸濁液の容量を灌流媒体によって４５ｍＬに調整した。細胞を、４℃、１４０×ｇで５分間遠心分離して、ペレット化した。これを細胞ペレットの第１回目の洗浄と見なす。このステップをもう一度繰り返す。最後の細胞の遠心分離の後、細胞を１０ｍＬの灌流媒体中に再懸濁させ、ピペットを５回通し、灌流媒体により容量を４５ｍＬに調整した。次に、細胞懸濁液を１：２で灌流媒体中で希釈し、血球計算器チャンバ中で、トリパン青を用いて計数した。結果を以下に一覧として示す。

ＦＡＣＳ分析に使用する細胞（２．２５×１０^６）を無菌の１５ｍＬ管に移し、灌流媒体により容量を１０ｍＬに調整した。

次の細胞数をラットへの移植のために取り除いた。

２つの管の間で容量を等量とした。４℃、１４０×ｇで５分間により細胞をペレット化した。上清を吸い出し、ペレットを、示した容量の明示した媒体中に再懸濁させた。

％ヒト肝細胞を測定するためのＦＡＣＳ分析
４×２００μＬの、ＦＡＣＳ分析に用いる細胞懸濁液を１．５ｍＬのミクロ管に分注した（各管は約４００，０００個の細胞を含んでいた。）。次に、以下の一次抗体を各管に添加した：＃１＝なし、負の対照；＃２＝２μＬのＨＬＡ ＡＢＣ；＃３＝２μＬのＯＣ２−２Ｆ８及び２μＬのＯＣ２−２Ｇ９；及び＃４＝２μＬのＨＬＡ ＡＢＣ、２μＬのＯＣ２−２Ｆ８及び２μＬのＯＣ２−２Ｇ９。

管を指で弾いて溶液を混合し、続いて氷上で３０〜６０分間、細胞を懸濁状態に保つために５〜１０分毎に指で弾きながら培養した。１ｍＬの灌流媒体を各管に添加し、数回転倒することにより混合して、一次抗体を洗い流した。４℃、１００×ｇで３分間の遠心分離により細胞をペレット化した。上清を吸い出し、次に各細胞ペレットを、８５０μＬの灌流媒体、８．５μＬのストレプトＡＰＣ、及び８．５μＬの抗ラットＰＥからなる２００μＬの二次抗体溶液中に再懸濁させた。管を指で弾いてこの溶液を混合し、続いて氷上で３０〜６０分間、細胞を懸濁状態に保つために５〜１０分毎に指で弾きながら培養した。

１ｍＬの灌流媒体を各管に添加し、転倒することにより混合して、二次抗体を洗い流した。次に管を４℃、１００×ｇで３分間遠心分離して細胞をペレット化し、続いて上清を吸い出し、各細胞ペレットを、５μＬのＰＩ、４μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、及び１ｍＬの灌流媒体からなる２００μＬのＰＩ溶液中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ分析により、マウスの肝臓中でのヒト肝細胞による再増殖のパーセンテージは９１％と測定された。

実施例５
ヒト肝細胞の免疫不全ラットへの生着
ラットにおいて、部分的肝切除を用いずに肝臓のヒト化が成功裡に試みられた例はない。この実施例においては、ヌード（ＲＮＵ）ラットにＡｄ：ｕＰａを注射し、アナキンラを含むヒト肝細胞を移植し、ＦＫ５０６による治療を行うことにより、部分的肝切除を行わずに、ヒト肝細胞の再増殖を行った。

４０頭のヌードラットの子（２週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒより入手し、研究を開始するまでに１週間順化させた。ラットを、＋又は−免疫抑制群に、それぞれの群に対する対照と共に割り当てた（下記の表３参照）。＋免疫抑制群に割り当てられたラットは、２ｍｇ／ｋｇ／日のＦＫ５０６（タクロリムス）の皮下投与による治療を研究の間を通して受け、初期の用量は、研究開始の時点における平均の初期の動物の体重である５０ｇに基づいて、１日当たり２０μＬの５ｍｇ／ｍＬ ＦＫ５０６（腹腔内注射）であった。−免疫抑制群のラットには、ＦＫ５０６による治療を行わず、研究期間を通して同量の生理食塩水を皮下注射した。その後、肝細胞の注射の４８〜９６時間前に、全てのラットに、ｕＰＡアデノウイルス（ラット５０ｇ当たり２．５×１０^９プラーク形成単位（ＰＦＵ））の静脈内注射（後眼窩）を行った。

ＦＫ５０６の最初の投与が行われた２１日後に、今度は、ラットに、プラセボ（ＰＢＳ）又はヒト肝細胞の細胞懸濁液を、下記の表３に従ってアナキンラと共に脾臓内注射し、その後に、１μｇ／ｍＬ（５μＬ／ｇ）のブプレネックスストック及び１．２５ｍｇ／ｍＬ（２００μＬ）のセフチオファの術後投与を行った。ヒト肝細胞は、実施例４において説明したように、ヒト化されたマウスから灌流された。

肝細胞の注射の２４時間後に、全てのラットに、アナキンラ（１０μＬ／２５１０μＬ／２５ｇ）、ブプレネックス（５μＬ／ｇ）及び１．２５ｍｇ／ｍＬ（２００μＬ）のセフチオファを注射し、次に、４８時間後に再度術後投与を行った。手術の３日後に、各ラットから２μＬの血液を採取した（伏在静脈血）。前記血液を１ｍＬのＥＬＩＳＡ緩衝試料希釈液中で希釈した。その後、試料を、定量的ヒトアルブミンＥＬＩＳＡによりヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）について試験した。この過程を研究期間中毎週繰り返した。最初のＥＬＩＳＡからの分析は、実験試料の平均光学密度の示度（４５０ｎｍ）はＰＢＳを注射した対照のそれの２倍であることを示した。−ＦＫ５０６、１×１０^６細胞注射と、＋ＦＫ５０６、３×１０^６細胞注射との両方で、最高の光学密度の示度０．０２７であった。ヒトアルブミン濃度の範囲がＥＬＩＳＡ標準曲線の直線範囲を下回ったにも拘わらず、試料はなおヒトアルブミンに対する検出可能な光学密度の示度を示した。

研究開始２週間後に、動物の体重増加のために、ＦＫ５０６の用量を５ｍｇ／ｍＬの３０μＬにまで増加させた。研究開始４週間後に、ラットの成長に合わせるために、ＦＫ５０６の用量を再度１０ｍｇ／ｍＬの２５μＬにまで増加させた。

肝細胞の注射の４週間後（研究開始後約５週間）に、少なくとも５０μＬの全血をラットから採取し、室温で１時間凝固させた。その全血を１，５００ｒｐｍ×１５分間で遠心分離して、血清を採取した。その後、血清を１：２５及び１：５０で希釈して、ＥＬＩＳＡを介したｈＳＡ試験に用いた。また、＋ＦＫ５０６治療群中の無作為に選んだラット６頭から５μＬの全血も採取した。５頭の動物の試験が、ヒトアルブミンについて、血清に
おいて１２と７０ｎｇ／ｍＬの間の範囲の陽性であった。１つの全血試料（＃３３）の試験が、ヒトアルブミンについて２２０ｎｇ／ｍＬで陽性であった。ラットの体重を再測定し、＋免疫抑制のラットは、それに相対するラットに比較して著しく小さいことが判明し、そのために、ＦＫ５０６の投与を１日おきに変更した。

肝細胞の注射の８週間後に、各動物から５μＬの全血をＥＬＩＳＡ用に採取した。前記血液をすぐに１ｍＬの試料緩衝液中、１：２００の希釈となるように希釈した。ラット＃２９（３×１０^６、＋ＦＫ５０６群）の試験が、ｈＳＡに対して全ての複製試料について陽性であった。結果は、独立したブラインドでの繰り返しにおいても確認された。

肝細胞の注射のほぼ９週間後に、全ての動物を屠殺した。心臓穿刺及び全採血を行い、全血及び血清をＥＬＩＳＡ用に得た。心臓穿刺の前に、動物にまず５００μＬのケタミンカクテルを投与した。脾臓及び肝臓の一部（第６葉）をゲノムＤＮＡの分離及びヒト遺伝子の検出のために急速冷凍した。次に、残余の肝臓及び脾臓の部分を、１０％通常緩衝ホルマリン中で４８時間固定化し、その時間に７０％エタノールに移し、その後パラフィン包埋した。肝臓切片をＦＡＨ抗体により染色し、ヒト肝細胞の同定を行った。ヒト化されたＦＲＧ ＫＯマウスの肝臓を対照として用いた。組織を組織学的評価及び染色について分析した。結果を図７に示す。対照試料の肝臓及び脾臓並びにラット＃２９由来の肝臓及び脾臓から切片を作成した。ヒト特異的ＦＡＨ抗体を用いた染色により、画像は、ラット＃２９由来の肝臓が明確なヒト肝細胞を含むことを示している。これらの切片は、同様の抗体を用いて、確立されたＦＡＨマウスモデル中で観察される生着と類似する。

初期のＥＬＩＳＡのデータは、移植されたヌードラット中のヒト血清アルブミンの存在を示した。その後のＥＬＩＳＡ分析から得られたデータ並びに陽性のＩＨＣは、ヒト細胞の集団が、ｕＰＡ、アナキンラ、及びＦＫ５０６によって治療されたヌードラット中に生着することができることを示している。このヒトアルブミンの濃度（約１．５μｇ／ｍＬ）は、肝臓中の、ヒト肝細胞である１０，０００個の肝細胞と相関する。

実施例６
Ｆａｈ欠損ラット
高度に保護されたＦａｈ遺伝子における変異を有するラット（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系）を、内在性のＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｆａｈ遺伝子エキソン３配列（配列番号２１、図８）を標的とするために設計された転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いて作成した。図８の配列の下線部は、逆ＤＮＡ鎖上の、ＴＡＬＥＮヘテロ二量体に媒介される開裂が起こる小文字の配列によって分離された、２つのＴＡＬＥＮ単量体の標的結合配列である。Ｄａｈｌ ＳＳ（ＳＳ、ＳＳ／ＪｒＨｓｄＭｃｗｉ）及びＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ、ＳＤ／Ｃｒｌ）由来の雄のラット胚の前核を、最終濃度が１０ｎｇ／μＬの、２種の、生体外で転写された、それぞれのＴＡＬＥＮ単量体をコードするｍＲＮＡの等モル混合物と共に、標準的な方法で微量注入することにより、以前に報告されたような（Ｇｅｕｒｔｓ， Ａ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｓｐｅｓｈｉｆｗｉｃ ｍｕｔａｔｅｄ ｒａｔｓ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５９７、２１１〜２５ （２０１０））、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ， Ｉｎｃ）を用いた、Ｆａｈゲノムにおける推定上の破壊的変異を有する３種のファウンダの同定に至った。

サンガー配列決定法を用いてラットＦａｈ標的遺伝子の破壊を確認し、全ての３種の変異動物対立遺伝子を、エキソン３内のコード配列の微小欠失（１〜２０対）により証明した（図８（ｂ））。３種の変異対立遺伝子を同定した（Ｆａｈ−ｍ１、Ｆａｈ−ｍ２及び
Ｆａｈ−ｍ３）。Ｆａｈ−ｍ１（６ｂｐ欠失）及びＦａｈ−ｍ２（２０ｂｐ欠失）はＳＳにおいて発生し、一方、Ｆａｈ−ｍ３（１ｂｐ欠失）は、ＳＤラット系遺伝的背景において同定された。２種の変異（Ｆａｈ−ｍ１及びＦａｈ−ｍ２）は、遺伝子転写物中において、それぞれセリン６９又はグリシン７３の後の天然の読み取り枠をシフトするフレームシフト、及び、それぞれアミノ酸９１及び１２０の後の読み取り枠中への終止コドンの挿入を介するタンパク質生成物のトランケーションを起こす。Ｆａｈ−ｍ１変異は、３つのアミノ酸の喪失（メチオニン７１−グリシン７２−リジン７３）及びイソロイシン残基の挿入（図９、配列番号２２〜２５）を引き起こす。これらのファウンダから、ヘテロ接合保有体の戻し交配及び相互交配により、３つのコロニ（ＳＳ−Ｆａｈ−ｍ１、ＳＳ−Ｆａｈ−ｍ２及びＳＳ−Ｆａｈ−ｍ３）が形成される。

Ｉｌ２ｒｇ及びＲａｇ２遺伝子における変異は、両遺伝的背景において類似の形態で発生した。標的配列及び対立遺伝子を図１０に示す（配列番号２６〜２７）。全ての変異は、標的遺伝子のフレームシフトトランケーションと予測された。ＳＳ遺伝的背景上での両遺伝子のノックアウトは、両方の系において、Ｔ−及びＣ−細胞集団の深刻な免疫不全を引き起こし、ＳＳ−Ｉｌ２ｒｇ−ｍ１において、ＮＫ細胞集団は縮小する（図１１〜１２）。

如何なる治療もなしには、ヘテロ接合動物の相互交配において、ヘテロ接合の子孫は観察されないので、ラットにおける３種の全ての対立遺伝子に対するＦａｈの破壊は、胚致死を引き起こす。しかしながら、ヘテロ接合体の飼育の飲料水にＮＴＢＣを投与すると（８ｍｇ／ｍＬ）、対立遺伝子に応じて、メンデル比又は近似メンデル比において、これらの変異の致死的な影響からラットを救うことができ（図１３）、このことは、この薬剤が、変異ラット胚を胚致死から保護することができることを実証している。飲料水中のＮＴＢＣの継続投与を行うＳＳ−Ｆａｈ−ｍ１ヌル動物は健康であり、且つ再現性をもって適正な大きさである。図１３中の表は、ヘテロ接合交配由来の生産児ラットの遺伝子型を示す。各遺伝型を有する子ラットのメンデル比から予想される数を、赤で示す実際に測定した数（観測：ｏｂｓｅｒｖｅｄ）と共に示す。妊娠中にＮＴＢＣによる治療を行わない場合、ホモ接合変異子ラットは誕生しない。母親の飲料水へのＮＴＢＣの添加により、Ｆａｈ−ｍ１及びＦａｈ−ｍ２種畜の両方を有する変異胚の誕生との結果となった。

成体ＳＳ−Ｆａｈ−ｍ１動物へのＮＴＢＣの投与の停止（但し、それ以外の食餌及び水の摂取は自由とする）は、体重の急激な減少（７〜８日で２０％を超える減少）を引き起こす。切片及び三重染色による定着した肝臓組織の検査（図１４）から、著しい肝細胞の空胞化及び膨大が明らかとなった。加えて、壊死肝細胞が多数見られる一方で、ＮＴＢＣ治療を行った同腹子の対照には全く見られない。同様に、ＮＴＢＣ投与停止後に、腎臓に広範な損傷、特に尿細管の嚢状拡張が見られた（図１５）。これらの組織上の所見は、げっ歯動物におけるＦａｈ欠損に典型的である。

開示した発明の本質が適用され得る多くの可能な実施形態に鑑みて、説明した実施形態は本発明の好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、下記の特許請求の範囲により規定される。従って、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲及び趣旨に含まれる全てを、本発明者らの発明として権利請求する。

Claims (34)

1. ゲノムが、Ｆａｈ遺伝子における破壊に対してホモ接合であり、前記破壊が機能的ＦＡＨタンパク質発現の低下及び肝機能を減退させる、遺伝子組換えＦａｈ欠損ラットであって、移植された異種肝細胞を含む、遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
2. 前記破壊が、Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、又は１つ若しくは２つ以上の点変異である、請求項１に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
3. 前記破壊が、挿入であって、前記挿入が終止コドン、選択マーカー、又はその両者を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子組み換Ｆａｈ欠損ラット。
4. 前記破壊が、Ｆａｈ遺伝子のエキソン３内である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
5. 前記ラットが、免疫抑制である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
6. 前記免疫抑制が、１種又は２種以上の免疫抑制剤投与の結果である、請求項５に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
7. 前記１種又は２種以上の免疫抑制剤が、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、マイコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシン、アザチオプリン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
8. 前記免疫抑制が、機能的免疫細胞の発生を抑制する１種又は２種以上の遺伝子変異の結果である、請求項５に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
9. 前記１種又は２種以上の遺伝子変異が、Ｒａｇ１欠損、Ｒａｇ２欠損、Ｉｌ２ｒｇ欠損、ＳＣＩＤ、Ｓｉｒｐ−αｈｕｍ／ｈｕｍ、ヌード、パーフォリンノックアウト、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
10. 前記１種又は２種以上の遺伝子変異が、Ｒａｇ２遺伝子の遺伝子変異又はＩｌ２ｒｇ遺伝子の遺伝子変異を含み、前記遺伝子変異が機能的ＲＡＧ−２タンパク質又はＩＬ−２Ｒγタンパク質の発現を低下させる、請求項８に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
11. 前記異種肝細胞が、犬、豚、馬、ウサギ、マウス、マーモセット、ウッドチャック、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群より選択される哺乳動物由来の哺乳類肝細胞である、請求項１０に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
12. 前記肝細胞が、ヒト肝細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
13. 前記ラットが、増殖したヒト肝細胞を含み、肝機能が前記ラット内で回復する、請求項１〜１２に記載のいずれか一項の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラット。
14. 請求項１〜１０に記載のいずれか一項に記載の遺伝子組換えＦａｈ欠損ラットを得るために、ゲノムがＦａｈ遺伝子における破壊に対してホモ接合である第１のＦａｈ欠損ラットに異種肝細胞を移植するステップと、
    前記異種肝細胞を増殖させ、それによりラット生体内で前記異種肝細胞を増殖させるステップと、
    を含む、ラット生体内における異種肝細胞の増殖方法。
15. 前記異種肝細胞が、第１のＦａｈ欠損ラットの肝動脈、脾臓又は門脈への注射により移植される、請求項１４に記載の方法。
16. 第１のＦａｈ欠損ラットに移植された前記異種肝細胞が、分離されたヒト肝細胞である、請求項１４〜１５に記載のいずれか一項の方法。
17. 前記ヒト肝細胞が、第１のＦａｈ欠損ラットに移植する前に、ヒト化された非ヒト哺乳動物の肝臓から分離される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記非ヒト哺乳動物が、ＦＲＧ ＫＯマウスである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記異種肝細胞が、第１のＦａｈ欠損ラット中で、少なくとも約２週間増殖される、請求項１４〜１８に記載のいずれか一項の方法。
20. 前記異種肝細胞を移植する前に、第１のＦａｈ欠損ラットに急性の肝臓障害を誘発させるステップをさらに含む、請求項１４〜１９に記載のいずれか一項の方法。
21. 前記異種肝細胞を移植する前に、第１のＦａｈ欠損ラットにウロキナーゼをコードするベクターを投与するステップをさらに含む、請求項１４〜２０に記載のいずれか一項の方法。
22. 前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ベクターが、前記異種肝細胞を移植する約２４〜４８時間前に投与される、請求項
    ２１〜２２に記載のいずれか一項の方法。
24. 前記異種肝細胞を移植する前に、第１のＦａｈ欠損ラットに、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を、肝臓の機能障害を防止するために十分な用量で投与するステップをさらに含む、請求項１４〜２３に記載のいずれか一項の方法。
25. 前記異種肝細胞を移植後の少なくとも約２日間、第１のＦａｈ欠損ラットにＮＴＢＣを投与するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. 肝細胞移植後の約２日後に、ＮＴＢＣ投与を中止する、請求項２４又は２５に記載の方法。
27. ＮＴＢＣが、第１のＦａｈ欠損ラットに、１日当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２４又は２５に記載の方法。
28. ＮＴＢＣが、第１のＦａｈ欠損ラットに、１日当たり約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記異種肝細胞を移植する少なくとも約２日前に、第１のＦａｈ欠損ラットに、１種又は２種以上の免疫抑制剤が投与されるステップをさらに含む、請求項１４〜２８に記載のいずれか一項の方法。
30. 第１のＦａｈ欠損ラットから、増殖した異種肝細胞を集取するステップをさらに含む、請求項１４〜２９に記載のいずれか一項の方法。
31. 前記集取した異種肝細胞を、連続する移植により増殖させるステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記連続する移植が、
    第１のＦａｈ欠損ラットから、増殖した異種肝細胞を集取するステップと、
    第１のＦａｈ欠損ラットから集取した増殖した異種肝細胞を、第２の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＦａｈ欠損ラットに移植するステップと、
    前記異種肝細胞を増殖させ、それにより生体内で異種肝細胞を増殖させるステップと、を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 第１のＦａｈ欠損ラットから、生物学的試料を採取するステップをさらに含む、請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記生物学的試料が、血液、尿、細胞、及び／又は組織の試料である、請求項３３に記載の方法。

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