JP6499086B2 - 細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を含む試料を対象に電気刺激に伴う反応を観察するための細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法に関する。

創薬分野では、細胞などの試料に投与した薬品の影響を、細胞から放出された光を測定して評価する場合がある。特許文献１には、細胞の電場刺激に応じた生物学的応答を蛍光検出によってモニターする測定装置が開示され、この測定装置には、正極及び負極からなる同軸ケーブルの形状の電極対或いは互いに平行な板状の電極対を、細胞が配置されたウェルに配置可能な構成が採用されている。また、特許文献２には、細胞の膜電位を電気刺激を介して取り扱う測定装置に関して記載されている。この測定装置は、ウェル内の観察領域に電界を発生させるための２個の平行電極である電極対を有する。

特表２００５−５１４９０９号公報 特表２０１２−１１０３２７号公報

ここで、観察対象の細胞を配置させるマイクロプレートの形状としては、ウェルの底が平状のものが一般的であるが、近年では、ウェルの底がＵ字形状等の凹形状のものが使用されるようになってきている。このような形状のマイクロプレートを用いる場合には、上記特許文献１或いは上記特許文献２に記載の測定装置では、同軸ケーブルの形状の電極対或いは平行電極を採用しているため、ウェル内に配置された細胞に適切に電気刺激を与えることが困難な傾向にある。

そこで、本発明は、かかる課題に鑑みて為されたものであり、保持部に配置された細胞に対して適切に電気刺激を与えることが可能な細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法を提供することを目的とする。

本願の発明者らは、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された細胞に、電極対によって電気刺激を印加して、それに対する細胞の反応を観察する際には、電極対の位置関係が重要であることを見出し、本願発明の後述する構成を発案するに至った。

すなわち、上記課題を解決するため、本発明の一形態に係る細胞観察装置は、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された細胞を観察する細胞観察装置であって、試料ケースを載置するための載置部と、第１の電極と第２の電極とを含む電極対を有する電気刺激部と、試料ケースの保持部内に電極対が配置される際に、第１の電極が第２の電極に対して保持部の中心部寄りに配置された状態で、電気刺激部の位置を制御する位置制御部とを備え、第１の電極の先端は、第２の電極の先端よりも伸びている。

或いは、本発明の他の形態に係る電気刺激装置は、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースに挿入されて、細胞に電気刺激を印加する電気刺激装置であって、第１の電極と第２の電極とを含む電極対を備え、第１の電極の先端は、第２の電極の先端よりも伸びており、試料ケースの保持部内に電極対が配置される際に、第１の電極が第２の電極に対して保持部の中心部寄りに配置される。

このような細胞観察装置、或いは電気刺激装置によれば、試料ケースに設けられた保持部内に第１の電極と第２の電極とを含む電極対が配置されることにより、この電極対により細胞を含む試料に電気刺激が印加可能にされる。ここで、保持部内の中心寄りに配置された第１の電極の先端が、保持部内の外寄りに配置された第２の電極の先端よりも伸びているので、保持部が凹形状の底部を有している場合であっても、その底部上に保持された細胞を含む試料に対して、第１の電極の先端を容易に近づけることができる。これにより、簡易な位置制御機構を用いるだけで電極対から試料に対して適切に電気刺激を与えることができ、試料に関する適切な評価結果を得ることができる。

本発明の他の形態に係る細胞観察装置は、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された細胞を観察する細胞観察装置であって、試料ケースを載置するための載置部と、第１の電極と第２の電極とを含む電極対を有する電気刺激部と、試料ケースの保持部内に電極対が配置されるように、電気刺激部の位置を制御する位置制御部と、第２の電極の先端に対する第１の電極の先端の相対的な位置を調整する位置調整部と、を備える。

或いは、本発明の他の形態に係る電気刺激装置は、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースに挿入されて、細胞に電気刺激を印加する電気刺激装置であって、第１の電極と第２の電極とを含む電極対と、第２の電極の先端に対する第１の電極の先端の相対的な位置を調整する位置調整部と、を備える。

或いは、本発明の他の形態に係る細胞観察方法は、第１の電極と第２の電極とを含む電極対を用いて、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された細胞を観察する細胞観察方法であって、第２の電極の先端に対する第１の電極の先端の相対的な位置を調整するステップと、電極対を用いて試料に電気刺激を印加するステップと、を備える。

このような細胞観察装置、電気刺激装置、或いは細胞観察方法によれば、試料ケースに設けられた保持部内に第１の電極と第２の電極とを含む電極対が配置されることにより、この電極対により細胞を含む試料に電気刺激が印加可能にされる。ここで、第２の電極の先端に対する第１の電極の先端の相対的な位置が調整可能にされているので、保持部が凹形状の底部を有している場合であっても、その底部上に保持された細胞を含む試料に対して、第１の電極の先端を容易に近づけることができる。これにより、電極対を保持部内に配置させた際に電極対から試料に対して適切に電気刺激を与えることができ、試料に関する適切な評価結果を得ることができる。

本発明によれば、凹形状のウェルに配置された細胞に対して適切に電気刺激を与えることが可能になる。

本発明の第１実施形態に係る細胞観察装置１の概略構成を示す図である。 図１のマイクロプレート２０の構成を示す斜視図である。 図１のマイクロプレート２０の断面構造を示す側面断面図である。 図１のマイクロプレート２０に形成されたウェルの形状のバリエーションを示す図である。 図１の電気刺激部１６がウェルに挿入された状態での電極対１７の構造を示す図である。 図１の電気刺激部１６がウェルに挿入された状態での電極対１７の別の構造を示す図である。 図１の電気刺激部１６がウェルに挿入された状態での電極対１７の別の構造を示す図である。 図１の電気刺激部１６がウェルに挿入された状態での電極対１７の別の構造を示す図である。 図１の電気刺激部１６がウェルに挿入された状態での電極対１７の別の構造を示す図である。 図１の電気刺激部１６がウェルに挿入された状態での電極対１７の別の構造を示す図である。 図１の細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の動作を示すフローチャートである。 本発明の第２実施形態に係る細胞観察装置１Ａの概略構成を示す図である。 図１２の位置調整機構７１の詳細な構成を示す側面図である。 図１２の位置調整機構７１の詳細な構成を示す側面図である。 図１２の位置調整機構７１の詳細な構成を示す側面図である。 図１２の細胞観察装置１Ａの試料Ｓの光測定時の動作を示すフローチャートである。 （ａ）は、従来の同軸ケーブルの形状の電極を有する電気刺激装置を用いて蛍光強度の時間変化を測定した結果を示すグラフ、（ｂ）は、本実施形態の細胞観察装置１を用いて蛍光強度の時間変化を測定した結果を示すグラフである。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７Ａの構造を示す断面図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７Ｂの構造を示す断面図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７Ｃの構造を示す断面図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７Ｄの構造を示す断面図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７Ｅの構造を示す断面図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７Ｆの構造を示す断面図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７Ｇの構造を示す断面図である。

以下、添付図面を参照しながら本発明による細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、各図面は説明用のために作成されたものであり、説明の対象部位を特に強調するように描かれている。そのため、図面における各部材の寸法比率は、必ずしも実際のものとは一致しない。

［第１実施形態］

図１は、本発明の第１実施形態に係る細胞観察装置１を模式的に示す構成図である。また、図２は、マイクロプレート２０の構成の一例を示す斜視図である。また、図３は、図２に示したマイクロプレート２０の断面構造を示す側面断面図、図４は、マイクロプレート２０に形成されたウェルの形状のバリエーションを示す図である。本実施形態による細胞観察装置１は、試料ケースとしてマイクロプレート２０を用い、マイクロプレート２０によって保持された状態で測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光を測定するための装置である。

また、試料Ｓは所定の細胞を含む。所定の細胞には、例えば、ｉＰＳ（induced Pluripotent Stem）細胞やＥＳ（Embryonic Stem）細胞などの幹細胞から分化した心筋細胞、筋細胞又は神経細胞、皮膚細胞、視細胞、生殖細胞、肝細胞等がある。また、所定の細胞は、膜電位感受性色素、カルシウム感受性色素又はナトリウムイオン感受性色素で染色した細胞であってもよい。また、本実施形態における細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法は、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料から放出された光を測定する光測定に一般に適用可能である。以下、細胞観察装置１の構成について説明する。

図１に示す細胞観察装置１は、データ取得装置１０、位置制御コントローラ（位置制御部）３０、撮像制御コントローラ３２、電気刺激制御コントローラ３４及びＰＣなどのコンピュータ５０を備えて構成されている。データ取得装置１０は、蛍光観察の対象となる細胞を保持したマイクロプレート２０が内部に収容される暗箱１５と、暗箱１５の内部に設置されて測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光の測定に用いられる動画像取得部４０とを有している。なお、位置制御コントローラ３０、撮像制御コントローラ３２及び電気刺激制御コントローラ３４は、データ取得装置１０の内部に設置されてもよい。

本実施形態において試料ケースとして用いられているマイクロプレート２０は、図２及び図３に示すように、複数のウェル（保持部）２１が二次元アレイ状に配列された板状部材であり、その複数のウェル２１のそれぞれにおいて、試料Ｓを保持可能な構成となっている。図２に示した構成例では、複数のウェル２１として、８×１２＝９６個の円形状のウェル２１が二次元アレイ状に配置されている。ウェル２１の配列数としては、６、２４、３６４個等の任意の個数であってもよい。ウェル２１の開口形状（ウェル２１の断面形状）としては、円形状、楕円形状、矩形形状等が挙げられる。図３に示すように、ウェル２１の底の深さ方向の断面形状は、凹形状であるＵ字形状に形成されている。このような凹形状の断面形状を有するマイクロプレートを用いれば、ウェル２１内で細胞を培養する際にウェル２１の底部に細胞が収まりやすいので、細胞のローカリゼーションが良く、ウェル２１内で細胞を立体的に形成しやすいというメリットがある。

また、このマイクロプレート２０の底面２２は、試料Ｓに照射される蛍光測定用の励起光、及び試料Ｓから放出される蛍光を透過可能な材質（例えば、ガラス、石英ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなど）によって形成されている。なお、一般に細胞観察装置１においては、マイクロプレート２０の底面２２は、測定対象となる試料Ｓから放出された光を透過可能な材質によって形成されていれば良い。

暗箱１５内においては、マイクロプレート２０は、蛍光観察用の開口を有するマイクロプレートホルダ（載置部）１１に載置されている。また、これらのマイクロプレート２０及びマイクロプレートホルダ１１を、暗箱１５内で所定の方向（図１中においては、右側から左側へと向かう方向）に搬送するマイクロプレート搬送機構１２が、暗箱１５内に設置されている。

搬送機構１２でのマイクロプレート２０の搬送方向に対して搬入側となる暗箱１５の一方側には、試料Ｓが保持された測定前のマイクロプレート２０を所定枚数（例えば、２５枚）ストックしておくための搬入側マイクロプレートスタッカー１３が設置されている。また、マイクロプレート２０の搬送方向に対して搬出側となる暗箱１５の他方側には、測定後のマイクロプレート２０をストックしておくための搬出側マイクロプレートスタッカー１４が設置されている。

このような構成において、搬入側マイクロプレートスタッカー１３から暗箱１５内へと搬入されたマイクロプレート２０は、マイクロプレートホルダ１１によって保持されるとともに搬送機構１２によって搬送される。そして、マイクロプレート２０は測定位置Ｐで一旦停止させられ、この状態で、マイクロプレート２０によって保持された試料Ｓに対して必要な光測定が行われる。測定完了後、マイクロプレート２０は再び搬送機構１２によって搬送され、搬出側マイクロプレートスタッカー１４へと搬出される。なお、図１においては、搬送機構１２、及びスタッカー１３、１４については、マイクロプレート２０を搬入、搬送、搬出するための具体的な構成の図示を省略している。

蛍光測定の実行時にマイクロプレート２０及び試料Ｓが配置される測定位置Ｐの上方には、マイクロプレート２０のウェル２１内に挿入されて試料Ｓに電界（電気刺激）を印加するための電気刺激部（電気刺激装置）１６が設置されている。また、測定位置Ｐの下方には、ウェル２１内に収容された試料Ｓからマイクロプレート２０の底面２２を介して放出される蛍光の検出に用いられる動画像取得部４０が設置されている。

動画像取得部４０は、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された光を含むマイクロプレート２０の二次元の光強度分布を表す二次元光像を検出して、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段である。検出される二次元光像としては、少なくとも１つのウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された光を含む光強度分布であればよい。この動画像取得部４０は、撮像装置４５と、導光光学系４１と、光学フィルタ部４２と、励起光源４３とによって構成されている。撮像装置４５は、複数の画素が二次元に配列された二次元画素構造を有し、試料Ｓから放出される蛍光による二次元の光検出画像である蛍光画像を検出する。この撮像装置４５としては、例えば高感度のＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどのエリアイメージセンサが搭載されたカメラを用いることができる。また、必要があれば、カメラの前段にＭＣＰ（マイクロチャネルプレート）などのイメージ増倍素子、リレーレンズ等を配置して動画像取得部４０を構成しても良い。なお、動画像取得部４０は、静止画を取得してもよく、動画及び／又は静止画を取得する画像取得部としての機能を有する。

また、マイクロプレート２０が配置される測定位置Ｐと、撮像装置４５との間には、導光光学系４１が設置されている。導光光学系４１は、複数のウェル２１のそれぞれに試料Ｓが保持されたマイクロプレート２０を底面２２側からみた二次元光像を撮像装置４５へと導く光学系である。導光光学系４１の具体的な構成については、マイクロプレート２０及び撮像装置４５の構成等に応じ、必要な機能（例えば集光機能、光像縮小機能等）を実現可能な光学素子によって適宜構成すれば良い。そのような光学素子としては、例えばテーパファイバがある（特開２００１−１８８０４４号公報参照）。また、導光光学系４１としては、凹凸を有する導光部材を有する光照射装置を用いる構成でもよい（特開２０１０−２３０３９７号公報および特開２０１０−２３０３９６号公報参照）。

また、図１においては、さらに、導光光学系４１と撮像装置４５との間に、必要に応じて蛍光の導光光路上への光学フィルタの配置、切換等を行うことが可能な光学フィルタ部４２が設置されている。ただし、このような光学フィルタ部４２については、不要であれば設けなくても良い。

励起光源４３は、試料Ｓに対して蛍光測定用の励起光を供給するための励起光供給手段である。励起光源４３の具体的な構成としては、蛍光測定の対象となる試料Ｓの種類、試料Ｓに照射する励起光の波長等に応じて適宜構成すれば良いが、例えば、光を供給する照明光源と、励起光の波長の選択、切換を行うための光学フィルタ部とによって構成することができる。また、試料Ｓに対して行われる光測定の種類により、励起光の供給が不要な場合には、励起光源４３を設けない構成としても良い。

本実施形態においては、導光光学系４１は、マイクロプレート２０及び試料Ｓからの二次元光像を撮像装置４５へと導くとともに、励起光源４３からの励起光を試料Ｓへと導くことが可能な光学系として構成される。このような光学系は、例えば、マイクロプレート２０からの蛍光を通過させるとともに、励起光源４３からの励起光を反射させるダイクロイックミラー等を用いて構成することができる。なお、図１においては、導光光学系４１における蛍光及び励起光の光路を、それぞれ実線及び破線によって模式的に示している。

なお、細胞観察装置１において用いられるマイクロプレート２０としては、様々なウェル２１の形状を有するものが採用され得る。図４（ａ）〜（ｄ）には、ウェル２１の凹形状のバリエーションが示され、それぞれ、上部にウェル２１の深さ方向に沿った断面図、下部にウェルの深さ方向から見た平面図が示されている。同図に示すように、ウェル２１として、断面Ｕ字状の底部を有するもの、断面Ｖ字状の底部を有するものの他、円錐状の底部を有するもの、角錐状の底部を有するものが用いられる。このような形状のウェル２１を有するマイクロプレート２０を用いても、細胞のローカリゼーションが良く、ウェル２１内で細胞を立体的に形成しやすいというメリットがある。

次に、電気刺激部１６の構成について詳細に説明する。

電気刺激部１６は、マイクロプレート２０に向けて垂直に伸びる複数の電極対１７が２次元的に配列されるようにベース部１８に固定された構造を有している。詳細には、電極対１７は、マイクロプレート２０のウェル２１に対向して伸びるように、マイクロプレート２０の複数のウェル２１の二次元アレイ状の配列に対応して二次元状に配列されている。

図５は、電気刺激部１６がマイクロプレート２０のウェル２１に挿入された状態での電極対１７の構造を示し、（ａ）はウェル２１の開口に沿った断面図、（ｂ）はウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。同図に示すように、電極対１７は、ウェル２１の深さ方向に伸びる棒状（例えば、円柱形状）の第１の電極１７ａと、先端が開口され、第１の電極１７ａが内部の中心軸上に位置するような円筒形状を有する第２の電極１７ｂとによって構成され、第２の電極１７ｂの外径がウェル２１の内径よりも小さくされている。この電極対１７は、第１の電極１７ａのウェル２１の底部側の先端が、第２の電極１７ｂのウェル２１の底部側の先端よりも伸びた構造を有している。このような形状の電極対１７は、ウェル２１に挿入された際に、ウェル２１の底面２２に円筒形状の第２の電極１７ｂが当接することにより位置決めされる。その際、第２の電極１７ｂはＵ字状や円錐状のウェル２１にフィットしやすく、電極対１７を容易に位置決めできる。さらには、第１の電極１７ａが第２の電極１７ｂよりも伸びているため、底面２２に位置する試料Ｓと第１の電極１７ａの先端との距離を小さくすることができ、試料Ｓに効率的に電気刺激を印加することができる。

図６は、電気刺激部１６がマイクロプレート２０のウェル２１に挿入された状態での電極対１７の別の構造を示し、（ａ）はウェル２１の開口に沿った断面図、（ｂ）はウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。同図に示すように、電極対１７は、ウェル２１の深さ方向に伸びる棒状（例えば、円柱形状）の第１の電極１７ａと、先端が開口され、第１の電極１７ａが内部の中心軸上に位置するような四角筒形状を有する第２の電極１７ｂとによって構成されていてもよい。このような電極対１７も、第１の電極１７ａのウェル２１の底部側の先端が、第２の電極１７ｂのウェル２１の底部側の先端よりも伸びた構造を有している。このような形状の電極対１７においては、第２の電極１７ｂが角錐状のウェル２１にフィットしやすく、電極対１７をウェル２１に対して容易に位置決めできる。さらには、第１の電極１７ａが第２の電極１７ｂよりも伸びているため、底面２２に位置する試料Ｓと第１の電極１７ａの先端との距離を小さくすることができ、試料Ｓに効率的に電気刺激を印加することができる。

また、電極対１７を構成する第１の電極１７ａの形状としては、円柱形状以外に様々な形状に変更されてもよい。図７及び図８は、電気刺激部１６がウェル２１に挿入された状態での電極対１７のウェル２１の開口に沿った断面図である。これらの図に示すように、第１の電極１７ａは、角柱形状であってもよく、板形状であってもよい。また、電極対１７を構成する第１及び第２の電極１７ａ，１７ｂのウェル２１の底部側の先端は、いずれか又は両方が、尖った凸形状、又は丸みをもった凸形状を有していてもよい。図９は、凸形状を有する電極対１７のウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。このような形状の第１の電極１７ａによれば、第１の電極１７ａの近傍の試料Ｓに対してより効率的に電気刺激を印加することができる。また、このような形状の第２の電極１７ｂによれば、Ｕ字状のウェル２１や角錐状のウェル２１に電極対１７がフィットしやすくなる。

さらに、電極対１７を構成する第１の電極１７ａは、試料Ｓに電気刺激を与える先端部以外を絶縁体で被覆してもよい。図１０は、絶縁体で被覆された電極対１７のウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。同図に示すように、第１の電極１７ａには、ウェル２１の底部側の先端部を除いて絶縁体７０で被覆されている。このような構成の第１の電極１７ａによれば、試料Ｓに対してより効率的に電気刺激を印加することができる。第１の電極１７ａには、絶縁材料でコーティングしたり、絶縁チューブで覆ったりすることにより、絶縁体７０を形成することができる。

ここで、電極対１７は、第１の電極１７ａと第２の電極１７ｂとがそれぞれ一部材によって構成されるものには限定されず、どちらか或いは両方が複数部材によって構成されていてもよい。

図１に戻って、電気刺激部１６には、電極対１７をベース部１８を介して支持する移動機構１９が設けられている。移動機構１９は、電極対１７をマイクロプレート２０に対して接近或いは後退させるように（図１のＺ方向）移動させる駆動機構であり、試料Ｓの観察時にそれぞれの電極対１７を対向するウェル２１内に配置させるように駆動すると共に、試料Ｓの観察終了時に電極対１７をウェル２１内から離脱させるように駆動する。これにより、第１の電極１７ａが第２の電極１７ｂに対してウェル２１の中心部寄りに配置された状態で、電極対１７をウェル２１内に配置することができる。なお、移動機構１９は、電極対１７をマイクロプレート２０の底面２２に沿った方向（図１のＸ軸Ｙ軸を含む平面に沿った方向）に移動させてもよい。この場合、移動機構１９は、第１の電極１７ａが第２の電極１７ｂに対してウェル２１の中心部寄りに配置されるように位置を調整する精度を向上することができる。また、移動機構１９の代わりに、マイクロプレート２０が載置されるマイクロプレートホルダ１１を図１のＺ方向や図１のＸ軸Ｙ軸を含む面に沿った方向に移動させるような構成を採用してもよい。

このような構成のデータ取得装置１０に対し位置制御コントローラ（位置制御部）３０、撮像制御コントローラ３２、電気刺激制御コントローラ３４が接続されている。位置制御コントローラ３０は、移動機構１９に電気的に接続され、試料Ｓの光測定開始時に、電極対１７をマイクロプレート２０のウェル２１内に配置させるように移動機構１９を制御する。具体的には、位置制御コントローラ３０は、図５〜図１０に示すように、電極対１７がウェル２１内に配置される際に、第１の電極１７ａが第２の電極１７ｂよりもウェル２１の中心部寄りに配置された状態で電極対１７をウェル２１に出し入れするように、電極対１７の位置を制御する。より詳細には、位置制御コントローラ３０は、第２の電極の先端がウェル２１の底面２２の中心の外側に接触するように電極対１７をウェル２１に挿入（移動）させることにより、第１の電極１７ａの先端がウェル２１の底面２２の中心近傍に位置するように制御する。また、電気刺激制御コントローラ３４は、電気刺激装置１６に電気的に接続され、電極対１７の第１の電極１７ａと第２の電極１７ｂとの間に電気信号を供給して、試料Ｓに対して電圧や電流等の電気刺激を印加する。撮像制御コントローラ３２は、励起光源４３による励起光の照射、及び撮像装置４５によるマイクロプレート２０における二次元の蛍光画像の撮像を制御する。

さらに、位置制御コントローラ３０、撮像制御コントローラ３２、及び電気刺激制御コントローラ３４に対し、コンピュータ５０が接続されている。このコンピュータ５０は、動画像取得部４０によって取得された光検出画像を含む動画像データを取得し、動画像データを対象にして解析処理を行うデータ解析部５１を有する。また、コンピュータ５０は、位置制御コントローラ３０、撮像制御コントローラ３２、及び電気刺激制御コントローラ３４を介して、データ取得装置１０の各部の動作を制御する制御部５２を有し、細胞観察装置１における試料Ｓに対する蛍光測定を制御する（詳細は後述する）。また、図１においては、コンピュータ５０には、測定結果等を表示する表示装置６１と、データの入力や蛍光測定に必要な指示の入力等に用いられる入力装置６２とが接続されている。

以下、図１１を参照しながら、細胞観察装置１による試料Ｓの光測定時の動作を説明すると共に、本実施形態にかかる細胞観察方法について詳述する。図１１は、細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の動作を示すフローチャートである。

まず、細胞の光測定の開始入力が入力装置６２を介して入力されると、マイクロプレートスタッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ０１）。そして、コンピュータ５０によって移動機構１９を利用して電気刺激部１６の位置が制御されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ０２）。このとき、コンピュータ５０は、電極対１７の第２の電極１７ｂの先端がマイクロプレート２０の底面２２の中心より外側に接触するように電極対１７の位置を制御する。これにより、第１の電極１７ａは、その先端がウェル２１の底面２２の中心近傍から所定距離ほど離れた状態で配置される。

その後、コンピュータ５０によって電気刺激制御コントローラ３４が制御されることによって、電極対１７に電気信号が供給されてマイクロプレート２０のウェル２１内の試料Ｓに電気刺激が印加される（ステップＳ０３）。電気刺激の印加は、所定の周期（例えば、１〜１０Ｈｚ）で繰り返し行われる。さらに、電気刺激の印加が開始された状態で、コンピュータ５０によって撮像制御コントローラ３２が制御されることによって、励起光源４３による励起光の照射が開始される（ステップＳ０４）。次に、動画像取得部４０によってウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された蛍光を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データがコンピュータ５０によって取得される。なお、動画像取得部４０のフレームレートは電気信号の周波数よりも高く設定されている。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、コンピュータ５０により、マイクロプレートホルダ１１上のマイクロプレート２０の電極対１７に対面する領域に設定された解析領域における光強度が解析されることによって、試料Ｓに関する解析情報（モニタリング結果）が取得されて表示装置６１に出力される（ステップＳ０５）。

例えば、試料Ｓに試薬にさらされた心筋細胞を含む場合には、カルシウムイオン感受性色素で染色された心筋細胞からの蛍光強度を時系列的にモニターすることで解析情報が得られる。その際、心筋細胞に電気刺激を与えることで拍動の強度や周期が揃えられるので、試薬の定量的な評価が可能にされる。これにより、試薬の心筋細胞に対する副作用を評価することができる。また、試料Ｓ中の細胞に膜電位感受性蛍光色素が付与されている場合は、電気刺激を印加したときには、細胞のイオンチャネルに開閉に伴う膜電位の変化が蛍光の強度変化として観察される。試料Ｓに膜電位感受性色素やナトリウムイオン感受性色素で染色した細胞を含む場合には、試料Ｓに電気刺激を与えることにより膜電位をコントロールすることもできる。解析領域における光強度の解析手法としては、解析領域における画素値の変化の振幅、変化率、ピーク周期、ピーク回数、ピーク時間、立ち上がり時間、立ち下がり時間、及びピーク変動幅等を評価値として算出する手法が考えられる。

以上説明した細胞観察装置１及び細胞観察装置１による細胞観察方法によれば、マイクロプレート２０に設けられたウェル２１内に第１の電極１７ａと第２の電極１７ｂとを含む電極対１７が配置されることにより、この電極対１７により細胞を含む試料Ｓに電気刺激が印加可能にされる。ここで、ウェル２１内の中心寄りに配置された第１の電極１７ａの先端が、ウェル２１内の外寄りに配置された第２の電極１７ｂの先端よりも伸びているので、ウェル２１が凹形状の底部を有している場合であっても、その底部上に保持された細胞を含む試料Ｓに対して、第１の電極１７ａの先端を容易に近づけることができる。これにより、簡易な位置制御機構を用いるだけで電極対１７から試料Ｓに対して適切に電気刺激を与えることができ、試料Ｓに関する適切な評価結果を得ることができる。

また、電極対１７の上述した構造により、電極対１７をマイクロプレート２０のウェル２１内に配置する際に、電極対１７の形状がウェル２１の凹形状の内部形状にフィットしやすく、ウェル２１の底部に保持された試料Ｓと第１の電極１７ａとの距離を小さくすることができる。その結果、試料Ｓに効率的に電気刺激を印加することができる。さらに、第１の電極１７ａが柱形状の場合、ウェル２１の底部に保持された試料Ｓと第１の電極１７ａとの距離を容易に小さくすることができる。その結果、試料Ｓに効率的に電気刺激を印加することができる。

［第２実施形態］

次に、本発明の第２実施形態について説明する。図１２は、本発明の第２実施形態に係る細胞観察装置１Ａを模式的に示す構成図である。

同図に示す細胞観察装置１Ａの第１実施形態に係る細胞観察装置１との相違点は、電気刺激部１６Ａに位置調整機構７１が具備されている点であり、細胞観察装置１Ａのその他の構成は第１実施形態と同様である。この位置調整機構７１は、電気刺激部１６Ａのベース部１８に固定されるとともに、電極対１７を第１の電極１７ａ及び第２の電極１７ｂが独立して移動可能なように支持する。

図１３〜図１５には、位置調整機構７１の詳細な構成を示している。これらの図に示すように、位置調整機構７１は、複数の電極対１７の第１の電極１７ａのベース部１８側の基端を支持する長尺状の第１の支持体７２ａと、複数の電極対１７の第２の電極１７ｂのベース部１８側の基端を支持する長尺状の第２の支持体７２ｂと、第１及び第２の支持体７２ａ，７２ｂの間の距離を調整可能なように、第１及び第２の支持体７２ａ，７２ｂを移動させる調整部７３とにより構成されている。この第２の支持体７２ｂには、第１の電極１７ａが貫通する貫通孔７４が設けられている。

上記構成の位置調整機構７１により、複数の電極対１７の第１の電極１７ａと、複数の電極対１７の第２の電極１７ｂとを、それぞれ、第２の電極１７ｂの中心軸方向（第１の電極１７ａの長手方向）に沿って独立に移動させることが可能にされる。その結果、複数の電極対１７において、第２の電極１７ｂの先端に対する第１の電極１７ａの先端の相対的な位置が同時に調整可能とされる。特に、第１及び第２の支持体７２ａ，７２ｂのそれぞれに複数の第１及び第２の電極１７ａ，１７ｂを取り付ける構成によれば、複数の電極対１７の先端の位置を同時且つ容易に調整することができる。

具体的には、図１３に示すように、第１の電極１７ａの先端が第２の電極１７ｂの先端よりも伸びるようにそれらの先端位置を調整することが可能にされる。また、図１４及び図１５に示すように、マイクロプレート２０のウェル２１が平底の場合には、第１の電極１７ａの先端と第２の電極１７ｂの先端とがベース部１８から見て同じ高さになるように調整することも可能にされ、第２の電極１７ｂの先端が第１の電極１７ａの先端よりも伸びるように調整することも可能にされる。

なお、位置調整機構７１は、第２の支持体７２ｂの位置を固定し、第１の支持体７２ａのベース部１８からの距離を調整してもよいし、第１の支持体７２ａの位置を固定し、第２の支持体７２ｂのベース部１８からの距離を調整してもよいし、第１及び第２の支持体７２ａ，７２ｂの双方のベース部１８からの距離を調整してもよい。いずれの場合も、第１の電極１７ａの先端と第２の電極１７ｂの先端との相対的位置を調整することができる。位置調整機構７１は、ピエゾアクチュエータやステッピングモータなどを用いた電気駆動部により構成されてもよいし、手動で位置調整可能な手動機構により構成されてもよいし、ネジ構造を採用した構造であってもよい。位置調整機構７１が電気駆動部により構成されている場合には、調整部７３が、位置制御コントローラ３０に電気的に接続されて、位置制御コントローラ３０からの制御信号により、第１及び第２の支持体７２ａ，７２ｂの位置が電子制御可能に構成される。

また、位置調整機構７１が電子制御可能に構成されている場合には、次のようにして電極対１７の位置が制御可能とされていてもよい。まず、入力装置６２により観察に使用されるマイクロプレート２０のウェル２１の形状の情報（例えば、平底かＵ字状底かを示す情報、Ｕ字状底の深さ情報等）、又は第２の電極１７ｂの先端位置に対する第１の電極１７ａの先端位置に関する情報（幅又は高さの情報）が入力される。そして、位置制御コントローラ３０により、第２の電極１７ｂの先端に対する第１の電極１７ａの先端の相対位置が決定され、その相対位置の関係になるように第１の支持体７２ａ及び第２の支持体７２ｂの間隔が自動調整される。このようにして、位置調整機構７１による第２の電極１７ｂの先端に対する第１の電極１７ａの先端の位置調整が可能にされる。

以下、図１６を参照しながら、細胞観察装置１Ａによる試料Ｓの光測定時の動作を説明すると共に、本実施形態にかかる細胞観察方法について詳述する。図１６は、細胞観察装置１Ａの試料Ｓの光測定時の動作を示すフローチャートである。

まず、細胞の光測定の開始入力及びウェル２１の形状の情報が入力装置６２を介して入力されると、位置制御コントローラ３０の制御により、複数の電極対１７における第１の電極１７ａの先端と第２の電極１７ｂの先端との位置関係が自動調整される（ステップＳ２１）。その後、マイクロプレートスタッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ２２）。そして、コンピュータ５０によって移動機構１９を利用して電気刺激部１６の位置が制御されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ２３）。このとき、コンピュータ５０は、電極対１７の第２の電極１７ｂの先端がマイクロプレート２０の底面２２の中心より外側に接触するように電極対１７の位置を制御する。これにより、第１の電極１７ａは、その先端がウェル２１の底面２２の中心近傍から所定距離ほど離れた状態で配置される。

その後、コンピュータ５０によって電気刺激制御コントローラ３４が制御されることによって、電極対１７に電気信号が供給されてマイクロプレート２０のウェル２１内の試料Ｓに電気刺激が印加される（ステップＳ２４）。電気刺激の印加は、所定の周期（例えば、１〜１０Ｈｚ）で繰り返し行われる。さらに、電気刺激の印加が開始された状態で、コンピュータ５０によって撮像制御コントローラ３２が制御されることによって、励起光源４３による励起光の照射が開始される（ステップＳ２５）。次に、動画像取得部４０によってウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された蛍光を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データがコンピュータ５０によって取得される。なお、動画像取得部４０のフレームレートは電気信号の周波数よりも高く設定されている。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、コンピュータ５０により、マイクロプレートホルダ１１上のマイクロプレート２０の電極対１７に対面する領域に設定された解析領域における光強度が解析されることによって、試料Ｓに関する解析情報（モニタリング結果）が取得されて表示装置６１に出力される（ステップＳ２６）。

ここで、上記のステップＳ２１の電極対１７の位置調整処理は、ステップＳ２２の電極対１７をウェル２１に挿入する際に行われてもよい。また、ステップＳ２１の処理は、ステップＳ２３の電極対１７をウェル２１に挿入する処理の後であって、電気刺激を印加開始するステップＳ２４の前に実行されてもよく、ステップＳ２６の試料からの光のモニタリングに基づいて、試料Ｓの反応を評価し、再びステップＳ２１の電極対１７の位置調整処理を行い、ステップ２４の電気刺激印加処理、ステップ２５の励起光照射処理、ステップＳ２６の光モニタリング処理のサイクルを行っても良い。このサイクルは複数回繰り返されてもよい。これらにより、試料Ｓの反応に応じて印加する電気刺激の強度（電圧値や電流値）を調整することができる。

以上説明した細胞観察装置１Ａ及び細胞観察装置１Ａによる細胞観察方法によれば、マイクロプレート２０に設けられたウェル２１内に第１の電極１７ａと第２の電極１７ｂとを含む電極対１７が配置されることにより、この電極対１７により細胞を含む試料Ｓに電気刺激が印加可能にされる。ここで、第２の電極１７ｂの先端に対する第１の電極１７ａの先端の相対的な位置が調整可能にされているので、ウェル２１が凹形状の底部を有している場合であっても、その底部上に保持された細胞を含む試料Ｓに対して、第１の電極１７ａの先端を容易に近づけることができる。さらに、ウェル２１が平底等の他の形状を有している場合であっても、その形状に対応して第１の電極１７ａの先端を適切に試料Ｓに近づけることができる。これにより、電極対１７をウェル２１内に配置させた際に電極対１７から試料Ｓに対して適切に電気刺激を与えることができ、試料Ｓに関する適切な評価結果を得ることができる。

図１７は、ウェル２１の底の深さ方向の断面形状がＵ字形状を有するマイクロプレート２０を用いて、ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞を観察した際の測定結果の例を示す。この心筋細胞は、Ｃａ^２＋感受性色素で染色されている。図１７（ａ）には、従来の同軸ケーブルの形状の電極を有する電気刺激装置を用いて、１．０Ｈｚの電気刺激を印加し、細胞内のＣａ^２＋濃度の変化に伴う蛍光強度の時間変化を測定した結果を示す。また、図１７（ｂ）には、Ｕ字形状のウェル２１内に電極対１７が配置される際にウェル２１の中心よりに配置された第１の電極１７ａが第２の電極１７ｂよりも伸びた構造を有する細胞観察装置１を用いて、１．０Ｈｚの電気刺激を印加し、細胞内のＣａ^２＋濃度の変化に伴う蛍光強度の時間変化を測定した結果を示す。図１７（ａ）からわかるように、従来の電極構造を用いた場合、電気刺激の印加（図中の点線が印加開始タイミングを示し、図中の矢印が１．０Ｈｚの各印加タイミングを示す。）に応じた蛍光強度変化が見られなかった。一方、図１７（ｂ）からわかるように、本実施形態の電極構造を用いた場合、電気刺激の印加（図中の点線が印加開始タイミングを示し、図中の矢印が１．０Ｈｚの各印加タイミングを示す。）に応じた蛍光強度変化が見られた。以上の観察結果から、ウェル２１の底面がＵ字形状などの凹形状のマイクロプレート２０を用いて細胞を観察する場合、中心よりに配置された第１の電極１７ａが第２の電極１７ｂよりも伸びているため、ウェル２１の底面に位置する試料Ｓと第１の電極１７ａの先端との距離を小さくすることができ、試料Ｓに効率的に電気刺激を印加することができることがわかる。

なお、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではない。

例えば、細胞観察装置１，１Ａの電気刺激部１６の電極対１７の構造は、筒形状には限定されず、様々な形状を採用できる。図１８は、本発明の変形例に係る電極対１７Ａのマイクロプレート２０のウェル２１に挿入された状態での構成を示し、（ａ）はウェル２１の開口に沿った断面図、（ｂ）はウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。同図に示すように、第２の電極１７ｂが、２つの平行に配置された板状電極で構成され、第１の電極１７ａが２つの板状電極の間の中心にそれらに沿って配置された棒状電極（例えば、円柱形状の電極）であってもよい。また、図１９は、本発明の別の変形例に係る電極対１７Ｂのマイクロプレート２０のウェル２１に挿入された状態での構成を示し、（ａ）はウェル２１の開口に沿った断面図、（ｂ）はウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。同図に示すように、第２の電極１７ｂが、２つの平行に配置された棒状電極（例えば、円柱形状の電極）で構成され、第１の電極１７ａが２つの板状電極の間の中心にそれらに沿って配置された棒状電極（例えば、円柱形状の電極）であってもよい。電極対１７Ａ，１７Ｂにおいては、第１の電極１７ａが角柱形状であってもよく、板形状であってもよいし、絶縁体で被覆されていてもよい。

また、図２０は、本発明の別の変形例に係る電極対１７Ｃのマイクロプレート２０のウェル２１に挿入された状態でウェル２１の開口に沿った断面図である。同図に示す電極対１７Ｃのように、第２の電極１７ｂは、３つ以上で構成されていてもよい。この電極対１７Ｃは、３つの平行に配置された棒状の第２の電極１７ｂと、第２の電極１７ｂの間に配置された棒状の第１の電極１７ａとを備えている。詳細には、第１の電極１７ａは、第２の電極１７ｂのウェル２１の開口に沿った断面の中心を結ぶ境界線Ｌ１で囲まれた領域の中心に配置されている。

さらに、図２１は、本発明の別の変形例に係る電極対１７Ｄのマイクロプレート２０のウェル２１に挿入された状態での構成を示し、（ａ）はウェル２１の開口に沿った断面図、（ｂ）はウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。同図に示すように、第２の電極１７ｂが、１つの棒状電極（円柱状又は角柱状の電極）で構成され、第１の電極１７ａがウェル２１の中心寄りに第２の電極１７ｂと平行に配置された棒状電極（円柱状又は角柱状の電極）で構成されてもよい。また、図２２は、本発明の別の変形例に係る電極対１７Ｅのマイクロプレート２０のウェル２１に挿入された状態での構成を示し、（ａ）はウェル２１の開口に沿った断面図、（ｂ）はウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。同図に示すように、第２の電極１７ｂが、１つの板状電極で構成され、第１の電極１７ａがウェル２１の中心寄りに第２の電極１７ｂと平行に配置された棒状電極（円柱状又は角柱状の電極）で構成されてもよい。このような電極対１７Ｄ，１７Ｅは、マイクロプレート２０に設けられたウェル２１が３６４個などの１００個以上の場合であって、ウェル２１の横幅が狭い場合に採用される。このような場合に電極対１７Ｄ，１７Ｅを用いれば、ウェル２１内に容易に挿入され、第１の電極１７ａの先端をウェル２１の底面の中心近くに容易に配置させることができる。

ここで、細胞観察装置１に採用される電極対１７Ａ〜１７Ｅにおいては、第１の電極１７ａの先端が第２の電極１７ｂの先端よりも伸びた構造を有している。さらに、電極対１７，１７Ａ〜１７Ｅにおいて、第１の電極１７ａを板状電極で構成した場合には、第１の電極１７ａの先端の幅を、第２の電極１７ｂの先端の幅よりも小さくすることが望ましい。図２３及び図２４は、このような場合の本発明の変形例に係る電極対１７Ｆ，１７Ｇのマイクロプレート２０のウェル２１に挿入された状態での構成をそれぞれ示し、（ａ）はウェル２１の開口に沿った断面図、（ｂ）はウェル２１の深さ方向に沿った断面図である。電極対１７Ｇは、板状電極で第１の電極１７ａ及び第２の電極１７ｂが構成され、全体的に第１の電極１７ａの幅が第２の電極１７ｂの幅よりも小さくされている。電極対１７Ｆは、第２の電極１７ｂが棒状電極で構成され、第１の電極１７ａが板状電極で構成され、第１の電極１７ａの幅が先端に向けて細くなるように構成され、第１の電極１７ａの先端において第２の電極１７ｂの先端よりも小さい幅の凸部が形成されている。このような構成の電極対１７Ｆ，１７Ｇによれば、ウェル２１の凹形状の底面２２に保持された試料Ｓと第１の電極１７ａとの距離を容易に小さくすることができる。

ここで、上記の細胞観察装置、或いは電気刺激装置においては、第２の電極は筒形状であり、第１の電極は第２の電極の内部に配置される、ことでもよい。かかる構成を採れば、電極対を試料ケースの保持部内に配置する際に、電極対の形状が保持部の凹形状の内部形状にフィットしやすく、保持部の底部に保持された試料と第１の電極との距離を小さくすることができる。その結果、試料に効率的に電気刺激を印加することができる。

また、第２の電極は複数の電極部材を含み、第１の電極は複数の電極部材の間に配置される、ことでもよい。かかる電極対を備えれば、電極対を容易に小型化することができ、かつ、保持部内の試料に適切に電気刺激を印加することができる。

さらに、第１の電極は柱形状である、ことでもよい。この場合、保持部の底部に保持された試料と第１の電極との距離を容易に小さくすることができる。その結果、試料に効率的に電気刺激を印加することができる。

またさらに、第１の電極の先端の幅は、第２の電極の先端の幅よりも小さい、ことでもよい。かかる構成を採れば、保持部の凹形状の底部に保持された試料と第１の電極との距離を小さくすることができる。その結果、試料に効率的に電気刺激を印加することができる。

本発明は、細胞を含む試料を対象に電気刺激に伴う反応を観察するための細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法を使用用途とし、保持部に配置された細胞に対して適切に電気刺激を与えることを可能とするものである。

１７，１７Ａ-１７Ｇ…電極対、１，１Ａ…細胞観察装置、１０…データ取得装置、１１…マイクロプレートホルダ（載置部）、１２…マイクロプレート搬送機構、１６，１６Ａ…電気刺激部（電気刺激装置）、１７ａ…第１の電極、１７ｂ…第２の電極、１９…移動機構、２０…マイクロプレート（試料ケース）、２１…ウェル（保持部）、２２…底面、３０…位置制御コントローラ（位置制御部）、３２…撮像制御コントローラ、３４…電気刺激制御コントローラ、４０…動画像取得部、５０…コンピュータ、５１…データ解析部、５２…制御部、７１…位置調整機構（位置調整部）、７２ａ，７２ｂ…支持体、７３…調整部、Ｓ…試料。

Claims (6)

1. 細胞を含む試料を凹形状の底部上に保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記細胞を観察する細胞観察装置であって、
   前記試料ケースを載置するための載置部と、
   第１の電極と第２の電極とを含む電極対を有する電気刺激部と、
   前記試料ケースの前記保持部内に前記電極対が配置される際に、前記第１の電極が前記第２の電極に対して前記保持部の中心部寄りに配置された状態で、前記電気刺激部の位置を制御する位置制御部とを備え、
   前記第１の電極及び前記第２の電極は、前記保持部に対向して伸びた形状を有しており、
   前記第２の電極は筒形状であり、
   前記第１の電極は前記第２の電極の内部に配置され、
   前記第１の電極の先端は、前記第２の電極の先端よりも伸びている、
   細胞観察装置。
2. 前記第１の電極は柱形状である、
   請求項１に記載の細胞観察装置。
3. 前記第１の電極の先端の幅は、前記第２の電極の先端の幅よりも小さい、
   請求項１又は２に記載の細胞観察装置。
4. 細胞を含む試料を凹形状の底部上に保持する保持部を有する試料ケースに挿入されて、前記細胞に電気刺激を印加する電気刺激装置であって、
   第１の電極と第２の電極とを含む電極対を備え、
   前記第１の電極及び前記第２の電極は、前記保持部に対向して伸びた形状を有しており、
   前記第２の電極は筒形状であり、
   前記第１の電極は前記第２の電極の内部に配置され、
   前記第１の電極の先端は、前記第２の電極の先端よりも伸びており、
   前記試料ケースの前記保持部内に前記電極対が配置される際に、前記第１の電極が前記第２の電極に対して前記保持部の中心部寄りに配置される、
   電気刺激装置。
5. 前記第１の電極は柱形状である、
   請求項４に記載の電気刺激装置。
6. 前記第１の電極の先端の幅は、前記第２の電極の先端の幅よりも小さい、
   請求項４又は５に記載の電気刺激装置。

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