JP6501247B2

JP6501247B2 - 免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体及びそれを含む医薬組成物

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Publication number: JP6501247B2
Application number: JP2014253763A
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Inventors: 櫻井　和朗; 和朗櫻井; 慎一望月
Original assignee: THE UNIVERSITY OF KITAKYUSHU
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Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2019-04-17
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Description

本発明は、新規な免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体及びそれを含む医薬組成物に関する。

ワクチンによる感染予防の基本的な原理は、人為的な擬似感染により、獲得免疫を誘導し、特定の病原体に対する抗体産生や細胞性免疫を誘導することにある。獲得免疫においては、免疫の「記憶」を担当するＴ細胞やＢ細胞が中心的な役割を果たし、ＤＮＡの再構成による抗体の可変領域の多様性が、無数の抗原への特異的な免疫反応を可能にしていることが知られている。一方、白血球、マクロファージ、樹状細胞等の食細胞が中心的な役割を果たしている自然免疫は、従来、病原体や異物を貪食する非特異的なプロセスであり、獲得免疫成立までの「一時しのぎ」としての役割のみを果たしていると考えられていたが、自然免疫の分子機構に関する研究の進展により、自然免疫においても、自己・非自己の特異的な認識が行われていることや、自然免疫が獲得免疫の成立に必須であることが明らかにされた。より具体的には、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等の抗原提示細胞に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーが、様々な病原体と反応し、サイトカインの産生を誘導し、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化の促進、キラーＴ細胞の活性化等を通して、獲得免疫を誘導することが、最近の研究により明らかにされた。

一連のＴＬＲファミリーにより認識される病原体の構成成分は多岐にわたるが、その中の１つに、ＴＬＲ９のリガンドである、ＣｐＧ配列を有するＤＮＡ（ＣｐＧＤＮＡ）がある。ＣｐＧ配列は、中心部にシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が並ぶ６個の塩基を基本とする配列で、ほ乳類には少なく、微生物には多く見られる塩基配列である。また、ほ乳類においては、少数存在するＣｐＧ配列の殆どがメチル化を受けている。ほ乳類中に殆ど存在しない非メチル化ＣｐＧ配列は、強力な免疫賦活活性を有している（例えば、非特許文献１〜３参照）。エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたＣｐＧＤＮＡは、ファゴソーム様小胞体に存在するＴＬＲ９により認識され、Ｔｈ１反応を強く誘導する。Ｔｈ１反応は、Ｔｈ２反応が優位なアレルギー反応を抑制すると共に、強い抗腫瘍活性を有する。また、ＣｐＧＤＮＡには、一部のアジュバントに見られるような毒性等の副作用もない。そのため、ＣｐＧＤＮＡは、感染予防に加え、アレルギー疾患、腫瘍性疾患に対するアジュバントとしても期待されている（例えば非特許文献４参照）。

しかし、ＣｐＧＤＮＡを免疫療法のアジュバントとして使用する場合、細胞質や血漿中のヌクレアーゼによる分解や、タンパク質との非特異的な結合を回避しつつ、いかに標的細胞の内部にＣｐＧＤＮＡを到達させるかが問題となる。

本発明者らは、新規な遺伝子キャリアとしてシゾフィラン（以下、「ＳＰＧ」と略称する場合がある。）に着目し、これまでに、シゾフィランが核酸医薬（アンチセンスＤＮＡ、ＣｐＧＤＮＡ）をはじめとする種々の核酸と新しいタイプの複合体を形成することを見出してきた（例えば、特許文献１、２、非特許文献５〜７参照）。

天然では三重螺旋で存在するシゾフィランを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性有機溶媒、或いは０．１Ｎ以上のアルカリ溶液に溶解して１本鎖に解離させた後に、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水或いは中性に戻すことによって、核酸１分子とシゾフィラン２分子とからなる三重螺旋複合体が形成することを見出した。この場合、三重螺旋複合体におけるシゾフィラン分子と核酸分子とは、主として水素結合と疎水性相互作用により分子間結合を形成しているものと考えられている（非特許文献８参照）。

上述のように、核酸をシゾフィランと複合化することにより、ヌクレアーゼによる核酸分子の加水分解や、血漿タンパク質と核酸との非特異的な結合等の、核酸分子と生体内タンパク質との望ましくない相互作用を抑制しつつ、核酸を細胞の内部に到達させることが可能になった。シゾフィランと核酸との複合体、さらには抗原性を有するタンパク質を含む３元複合体を利用して、ＣｐＧＤＮＡの細胞内へのデリバリーに成功した（例えば、特許文献３、４、非特許文献９〜１１参照）。

国際公開第０１／３４２０７号国際公開第０２／０７２１５２号特開２００７−１７４１０７号公報特開２０１０−７０３０７号公報

Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger, H. Wagner, Adv. Immunol., 73, 329-368 (1999). CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, M. Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760 (2002). The discovery of immunostimulatory DNA sequence, S. Yamamoto, T. Yamamoto, and T. Tokunaga, Springer Seminars in Immunopathology, 22, 11-19 (2000). 「標準免疫学」第２版、医学書院、２００２年、３３３頁 Molecular Recognition of Adenine, Cytosine, and Uracil in a Single-Stranded RNA by a Natural Polysaccharide: Schizophyllan. K. Sakurai and S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520-4521 (2000). Polysaccharide-Polynucleotide Complexes. 2. Complementary Polynucleotide Mimic Behavior of the Natural Polysaccharide Schizophyllan in the Macromolecular Complex with Single-Stranded RNA and DNA. K. Sakurai, M. Mizu and S. Shinkai, Biomacromolecules, 2, 641-650 (2001). Dectin-1 targeting delivery of TNF-α antisense ODNs complexed with β-1,3-glucan protects mice from LPS-induced hepatitis. S. Mochizuki and K. Sakurai, J. Control. Release, 151 (2011) 155-161. Structural Analysis of the Curdlan/Poly (cytidylic acid) Complex with Semiempirical Molecular Orbital Calculations. K. Miyoshi, K. Uezu, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomacromolecules, 6, 1540-1546 (2005). A Polysaccharide Carrier for Immunostimulatory CpG DNAs to Enhance Cytokine Secretion, M. Mizu, K. Koumoto, T. Anada, T. Matsumoto, M. Numata, S. Shinkai, T. Nagasaki and K. Sakurai， J. Am. Chem. Soc., 126, 8372-8373 (2004). Protection of Polynucleotides against Nuclease-mediated Hydrolysis by Complexation with Schizophyllan, M. Mizu, K. Koumoto, T. Kimura, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomaterials, 25, 15, 3109-3116 (2004). Synthesis and in Vitro Characterization of Antigen-Conjugated Polysaccharide as a CpG DNA Carrier, N. Shimada, K. J. Ishii, Y. Takeda, C. Coban, Y. Torii, S. Shinkai, S. Akira and K. Sakurai, Bioconjugate Chem., 17 1136-1140 (2006).

しかしながら、上記従来の技術は、以下のような課題を有していた。例えば、非特許文献１１記載のシゾフィラン／抗原性を有するタンパク質／ＣｐＧＤＮＡの３元複合体の製造方法においては、過ヨウ素酸酸化により、シゾフィランの側鎖のグルコース残基上にホルミル基を生成させ、還元的アミノ化反応により、ホルミル基と抗原性を有するペプチド（以下、「抗原性ペプチド」と略称する場合がある。）のアミノ基とを反応させ、シゾフィランと抗原性ペプチドとが共有結合した複合体を形成するが、収率がきわめて低いという課題を有していた。かかる事情に鑑みて、例えば、特許文献４記載のシゾフィラン／抗原性タンパク質（抗原性ペプチド）／ＣｐＧＤＮＡの３元複合体の製造方法においては、側鎖にホルミル基を有するシゾフィランと抗原性ペプチドとを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行ない、或いはアルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なうことにより、シゾフィランの側鎖上のホルミル基と抗原性ペプチドのアミノ基との反応性及び収率を向上させている。しかしながら、ペプチドには複数のアミノ基が存在するため、反応点の制御が困難である。したがって、抗原性ペプチドの反応位置による免疫原性の違いや、シゾフィランとの反応生成物が複雑な混合物となることに起因する分離精製の困難性等の問題の発生が懸念される。また、水素結合による複合体形成を利用したシゾフィランとＤＮＡとの複合体の形成に比べ、シゾフィランと抗原性ペプチドの共有結合の形成に基づく複合体の形成は煩雑な工程を必要とする。これらの点において、特許文献４記載のシゾフィラン／抗原性ペプチド／ＣｐＧＤＮＡの３元複合体の製造方法は、生産性等の点で依然として課題を有している。

本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、生産性に優れ、高い免疫賦活活性を有する免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。

前記目的に沿う本発明の第１の態様は、シゾフィランと、
前記シゾフィランと水素結合を介して結合し、ＣｐＧ配列を有するポリデオキシリボヌクレオチド又は該ポリデオキシリボヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合もしくはホスホロジチオエート結合で置換されたポリデオキシリボヌクレオチド誘導体（以下、本発明において「前記ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体」又は「ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体」と略称する。）とを含み、
前記ポリデオキシリボヌクレオチド又は前記ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記シゾフィランの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成しており、
多角度光散乱測定又はＸ線小角散乱による慣性半径の測定値が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、
Ｘ線小角散乱を用いて測定したＸ線の散乱強度Ｉを、下記の式（Ｉ）で定義されるｑ値の対数に対しプロットした場合、ｑが１０^−１ｎｍ^−１から１ｎｍ^−１の範囲における傾きａが−１．５以上−０．５以下であり、
前記ポリデオキシリボヌクレオチド又は前記ポリデオキシリボヌクレオチドの誘導体のうち、前記シゾフィランと水素結合を介して結合する部分の重合度が６０以上であることを特徴とする免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を提供することにより上記課題を解決するものである。

なお、式（Ｉ）において、θはＸ線の散乱角を表し、λはＸ線の波長を表す。
本発明の第２の態様は、シゾフィランと、
前記シゾフィランと水素結合を介して結合し、ＣｐＧ配列を有するポリデオキシリボヌクレオチド又は該ポリデオキシリボヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合もしくはホスホロジチオエート結合で置換されたポリデオキシリボヌクレオチド誘導体とを含み、
前記ポリデオキシリボヌクレオチド又は前記ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記シゾフィランの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成しており、
多角度光散乱測定又はＸ線小角散乱による慣性半径の測定値が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、
Ｘ線小角散乱を用いて測定したＸ線の散乱強度Ｉを、上記の式（Ｉ）で定義されるｑ値の対数に対しプロットした場合、ｑが１０ ^−１ｎｍ ^−１から１ｎｍ ^−１の範囲における傾きａが−１．５以上−０．５以下であり、
前記ポリデオキシリボヌクレオチド又は前記ポリデオキシリボヌクレオチドの誘導体のうち、前記シゾフィランと水素結合を介して結合する部分の重合度が１０以上であり、且つポリデオキシリボヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたポリデオキシリボヌクレオチドの誘導体であることを特徴とする免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明の第１又は第２の態様に係る免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体において、分子量が１×１０^５以上３×１０^６以下であってもよい。

本発明の第３の態様は、本発明の第１又は第２の態様に係る免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を含む医薬組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明によると、以下のような有利な効果が得られる。
（１）シゾフィラン及びＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチドの種類、分子量、組み合わせ等に関わりなく、シゾフィランとポリヌクレオチドとの間の水素結合を介してポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を形成できるため、広範なシゾフィランとＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチドの組み合わせについて、単一の操作により免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を得ることができる。

（２）シゾフィランとＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチドとの水素結合は、溶媒のｐＨを変化させることにより迅速かつ高効率に反応を進行させることができる。したがって、短時間に高収率でポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体が得られ、単離精製に要する手間も軽減することが可能になる。したがって、本発明の免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体は、生産性に優れており、低コストで製造することができる。

（３）本発明の免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を用いることにより、ＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチドを単独で使用した場合に比べ、ＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチドに特異的な免疫応答の誘導をより効果的に行うことができる。

（４）本発明の免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を含む医薬組成物は、ＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチドを単独で用いた場合よりも、広範なＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチドについて特異的な免疫応答をより効果的に誘導できる。そのため、ワクチンや免疫賦活剤としての応用が期待できる。

Ｓ−ｄ（Ａ）_４０−Ｄ３５複合体の分子量と慣性半径の関係を示すグラフである。

続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。

［１］免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体
本発明の第一の実施の形態に係る免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体（以下、単に「ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体」と略称する場合がある。）は、シゾフィランと、シゾフィランと水素結合を介して結合し、ＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体（ポリヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合もしくはホスホロジチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体）とを含んでいる。

ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、シゾフィランとは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本とシゾフィランの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成している。

ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の製造に使用されるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、シゾフィランと水素結合を介して結合することができると共に、ＣｐＧ配列を有している。

免疫応答の刺激活性を有するオリゴヌクレオチドは、１９８４年にTokunagaらによりBCGの抗腫瘍性成分を検索する過程で発見された。そして、その活性化作用がシトシン・グアニンジヌクレオチド（５’−ＣｐＧ−３’：所謂ＣｐＧ配列）を含む特定の塩基配列に起因するものであることが明らかにされた（例えば、Tokunaga, T., et al., J. Natl. Cancer Inst., 72, 955（1984）及びTokunaga, T., et al., J. Natl. Cancer Res., 79, 682（1988）を参照。）。

脊椎動物又は植物以外のＣｐＧ配列をもつゲノムＤＮＡにも同様の活性が認められている。免疫刺激活性にはＣｐＧコアの前後の配列も重要と考えられ、特に、メチル化されてないＣｐＧを有し、その前後に置換プリン（Ｐｕ）と置換ピリミジン（Ｐｙ）が配列した５’−ＰｕＰｕＣｐＧＰｙＰｙ−３’が、代表的な非メチル化ＣｐＧモチーフとしてコンセンサスを得ている（例えば、Krieg, A.,他, Nature, 374, 576（1995）を参照。）。ここで、非メチル化ＣｐＧモチーフとは、よく知られているように、少なくとも１つのシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）配列を含む短いヌクレオチド配列（一般的には４〜１０個のヌクレオチドから成る配列）であって、該シトシン−グアニン配列におけるシトシンの５位がメチル化されていないものを指称する。なお、以下の説明において、ＣｐＧとは、特に断らない限り非メチル化ＣｐＧを意味する。

有用なＣｐＧモチーフ（ヘキサマー）の例を以下に記載する（但し、Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン、Ｕ：ウラシル）。

ＡＡＣＧＴＴ、ＡＧＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＴ、ＧＧＣＧＴＴ、ＡＡＣＧＴＣ、ＡＧＣＧＴＣ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＧＣＧＴＣ、ＡＡＣＧＣＣ、ＡＧＣＧＣＣ、ＧＡＣＧＣＣ、ＧＧＣＧＣＣ、ＡＡＣＧＣＴ、ＡＧＣＧＣＴ、ＧＡＣＧＣＴ、及びＧＧＣＧＣＴ

これらの配列を含む８〜１００個程度で構成されるオリゴヌクレオチドが免疫刺激活性を有するものである。

以下の配列は、ＮＫ細胞の活性化に有効と報告されたＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドの例である（下線部分がＣｐＧモチーフを示し、また、大文字はチオール化ＤＮＡを表わす）（例えば、S. Iho, T. Yamamoto, T. Takahashi and S. Yamamoto, J. immunol., 1999, 163, 3642-3652. を参照。）。

accgataccggtgccggtgacggcaccacg
accgatagcgctgccggtgacggcaccacg
accgatgacgtcgccggtgacggcaccacg
accgattcgcgagccggtgacggcaccacg
ggggggggggggcgatcggggggggggggg
gggggggggggacgatcgtcgggggggggg
ggggggggggggaacgttgggggggggggg
GAGAACGCTCGACCTTCGAT
TCCATGACGTTCCTGATGCT
TCTCCCAGCGTGCGCCAT
GGggtcaacgttgaGGGGGg

上述したＣｐＧ配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）と、シゾフィランと水素結合を介して結合する塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とをハイブリッドさせてもよく、そのようなハイブリッドは、任意の公知の方法を用いて入手又は合成できる。なお、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、ＤＮＡの３’末端側にＲＮＡの５’末端側が結合したキメラ核酸である場合、ＲＮＡとＤＮＡの間のホスホジエステル結合が、特に分解を受けやすくなるため、ＤＮＡと結合したＲＮＡの５’末端側ヌクレオチドにおける２’位のヒドロキシル基をメトキシ基又はフルオロ基で置換し、かつ／又はＤＮＡと結合した最初のリボヌクレオチドの３’位と、それに隣接するＲＮＡの５’位との間のホスホジエステル基をホスホロチオエート基で置換する等の誘導体化を行い、加水分解に対する耐性を向上させておくことが好ましい。

ポリヌクレオチドは、生体内でヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、生体内での安定性を向上させるために、ポリヌクレオチドの代わりにポリヌクレオチド誘導体を用いてもよい。ポリヌクレオチド誘導体の例としては、リボヌクレオチドの２’位のヒドロキシル基の全部又は一部がフッ素又はメトキシ基で置換されているもの、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のホスホジエステル基の全部又は一部がホスホロチオエート基で置換されているもの等が挙げられる。ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドのホスホジエステル基の一部がホスホロチオエート基で置換されている場合、ホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていることが好ましい。ホスホロチオエート基で置換されるホスホジエステル基の位置は特に制限されず、連続した複数のホスホジエステル基が置換されていてもよく、或いはホスホロチオエート基が互いに隣り合わないように置換されていてもよい。

水素結合を介して結合する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の具体例としては、シゾフィランと結合能が高いポリアデノシン（ポリアデニル酸、ポリリボアデニル酸）（ｐｏｌｙＡ）、ポリシチジン（ポリシチジル酸、ポリリボシチジル酸）（ｐｏｌｙＣ）、ポリデオキシアデノシン（ポリデオキシアデニル酸、ポリデオキシリボアデニル酸）（ｐｏｌｙ（ｄＡ））、ポリデオキシチミジン（ポリデオキシチミジル酸、ポリデオキシリボチミジル酸）（ｐｏｌｙ（ｄＴ））が挙げられる。ポリヌクレオチドの塩基数は、上述のとおり、シゾフィランとの間で三重螺旋構造を有する複合体を形成できる限りにおいて特に制限されないが、複合体形成能を向上させるために、ポリヌクレオチドは、シゾフィランと結合能が高いポリアデノシン（ｐｏｌｙＡ）、ポリシチジン（ｐｏｌｙＣ）、ポリデオキシアデノシン（ｐｏｌｙ（ｄＡ））、ポリデオキシチミジン（ｐｏｌｙ（ｄＴ））のいずれかの繰り返し配列を有していることが好ましい。好ましい繰り返し配列を構成する塩基及びヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の種類並びに塩基数は、ＣｐＧ配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体部分の長さ、用いられるシゾフィランの分子量等に応じて適宜決定される。繰り返し配列の長さは、塩基数が少ないと、シゾフィランとの水素結合による三重螺旋構造の形成が困難であるため、塩基数は、１０以上である必要があり、２０〜８０であることが好ましく、３０〜８０であることが更に好ましい。

シゾフィランの分子量は、ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体に含まれるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の塩基配列及び塩基長等に応じて適宜調節される。しかし、分子量が小さいと、いわゆるクラスター効果（高分子系の協同現象）が発現し難くなり好ましくない。通常は、核酸と複合体を形成しうるシゾフィランの重量平均分子量（分子鎖１本あたり）としては、核酸塩基の種類や高次構造によって異なるが、好ましくは２万以上、さらに好ましくは４万以上、より好ましくは６万以上である。また、ポリヌクレオチド上の核酸塩基と水素結合を形成する水酸基の数は、通常は、５個以上、好ましくは、８個以上、さらに好ましくは、１０個以上必要である。
なお、シゾフィランの重量平均分子量は、光散乱法、沈降速度法（超遠心法）等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。

シゾフィランは、一般に菌類や真性細菌によって産生されるため、これらの微生物を培養後、菌体をホモゲナイズし、細胞溶出分や不溶性残渣等の不純物から超遠心法等の方法により単離することにより得ることができる。一般に、このようにして得られるシゾフィランは高分子量（重量平均分子量が数十万程度）で三重螺旋構造を取る。必要に応じて低分子化して用いてもよい。低分子化は、酵素分解、酸加水分解等から適宜適当な方法及び条件を選択して行う。

（３）ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の製造
シゾフィランは、通常、水中でシゾフィランの分子鎖３本からなる三重螺旋構造を呈している。したがって、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と複合体を形成するためには、シゾフィランをＤＭＳＯのような溶媒に溶解して分子間水素結合及び疎水性相互作用による会合状態を解いて一本鎖にする。このようにして得られた一本鎖状のシゾフィランの溶液に、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を含有する水溶液（又はアルコール等の極性溶媒の溶液）を添加していくと、水の添加による溶媒の極性の増大に伴い、疎水性相互作用によりポリヌクレオチドとシゾフィランとが会合し、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖を取り込みながら、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とシゾフィランとの複合体が形成される。その結果、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本とシゾフィランの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体が形成される。複合体の形成は、例えば、ＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを測定することにより、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体のコンホメーション変化を調べることによって確認することができる。

ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び粘度測定等の任意の公知の方法を用いて測定することができる。ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の分子量は、好ましくは、１×１０^５以上３×１０^６以下である。

ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体において、多角度光散乱測定又はＸ線小角散乱による慣性半径の測定値は、好ましくは、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の慣性半径が２０ｎｍを下回り、或いは２００ｎｍを超えると、細胞表面に存在するシゾフィランの受容体に認識されにくくなるため、細胞への取り込みが起こりにくくなると考えられる。

ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の慣性半径の測定には任意の公知の方法を用いることができるが、例えば、文献（The Journal of Physical Chemistry B 116 (1), 87-94（2011））に記載されている方法を用いることができ、より具体的には、ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の分子量より、慣性半径が１０ｎｍ以上であると予想されるものについては光散乱法、１０ｎｍ未満であると予想されるものについてはＸ線小角散乱法が好ましく用いられる。

ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体において、Ｘ線小角散乱を用いて測定したＸ線の散乱強度Ｉを、下記の式（Ｉ）で定義されるｑ値（散乱ベクトルの絶対値）の対数に対しプロットした場合、ｑが１０^−１ｎｍ^−１から１ｎｍ^−１の範囲における傾きａが−１．５以上−０．５以下であることが好ましい。

なお、式（Ｉ）において、θはＸ線の散乱角を表し、λはＸ線の波長を表す。したがって、ｑ値はＸ線の散乱角θ及びＸ線の波長λの関数であり、Ｘ線の散乱強度Ｉとｑ値との関係は、Ｘ線の散乱強度Ｉの角度及び波長依存性を示す。

Ｘ線散乱強度Ｉとｑ値との間には、Ｉ∝ｑ^ａという関係が成立する。したがって、ａ値は、Ｘ線の散乱強度Ｉを、ｑ値の対数に対しプロットした場合の傾きａに相当する。ａ値は、高分子鎖の形状を反映し、ａ＝−１のときは枝分かれのない棒状であることを示している。｜ａ｜＜１のときは折れ曲がった棒状又は柔らかい棒状であることを示し、｜ａ｜＞１のときは、分岐構造をとっていることを示す。｜ａ｜の値が大きければ大きいほど、分岐度が高いことを示す。ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体において、ｑが１０^−１ｎｍから１ｎｍ^−１の範囲における傾きａは、好ましくは、−１．５以上−０．５以下である。

ａが上記の範囲外である場合にも、細胞表面に存在するシゾフィランの受容体に認識されにくくなるため、細胞への取り込みが起こりにくくなると考えられる。

本発明の第２の実施の形態に係る医薬組成物（以下、「医薬組成物」と略称する。）は、本発明の第１の実施の形態に係るポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を含んでいる。

医薬組成物の製造には、有効成分としてのポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体及びポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体に加え、任意の公知の成分（医薬用途に許容される任意の担体、賦形剤及び添加物）及び製剤方法を用いることができる。例えば、医薬組成物は、錠剤、座剤、カプセル剤、シロップ剤、ナノゲル等のマイクロカプセル剤、滅菌液剤、懸濁液剤等の注射剤、エアゾール剤、スプレー剤等の形態を取ることができる。

医薬組成物は、ヒト又は温血動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、サル等）に対し、経口及び非経口経路のいずれによっても投与可能である。非経口投与経路としては、皮下、皮内及び筋中注射、腹腔内投与、点滴、鼻粘膜や咽頭部への噴霧等が挙げられる。

活性成分であるポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の用量は、活性、治療対象となる疾患、投与対象となる動物の種類、体重、性別、年齢、疾患の重篤度、投与方法等に応じて異なる。体重６０ｋｇの成人を例に取ると、経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇであり、非経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇである。他の動物に投与する場合には、上記用量を単位体重当たりの用量に換算後、投与対象となる動物の体重を乗じて得られた用量を用いる。

医薬組成物は、免疫を活性化することによる細菌、ウィルス等の病原体の感染に起因する感染症、ガン等の腫瘍の治療及び予防のためのワクチン、免疫賦活剤等として用いることができる。

実施例１：分子量の異なるシゾフィランの作製
本実施例において、Schizophyllum commune Friesを培養し、培養液中に産生されたシゾフィランを分離、精製することで高分子量シゾフィランを得た。その高分子シゾフィランを超音波処理することでシゾフィランを物理的に分解させた。また、超音波処理の時間を変えることで得られるシゾフィランの分子量を変化させるができた。

さらに低分子量のシゾフィランを得るために、ギ酸で処理した。得られた分子量の異なるシゾフィランは、文献（Norisuyeら、J. Polym. Sci., Polym. Phys. Ed. 1980, 18, 547、Yanakiら、Macromolecules 1980, 13, 1462、Kashiwagiら、Macromolecules 1981, 14, 1220）に記載されているように、水を良溶媒、アセトン又はメタノールを貧溶媒として分別精製した。

得られた試料名と得られた分子量を表１に示す。また、各試料に関して、ＤＭＳＯ中７０度で^１ＨＮＭＲ測定を行い、β−１，３−グルカン骨格を保持していること、特にケミカルシフト４．１ｐｐｍと４．５ｐｐｍのピーク比から、β−１，６−グルカン結合の側鎖が主鎖のグルコース１０に対して２から５の範囲で保持されていることを確認した。また、化学構造に関しては、梁木利男の学位論文（大阪大学理学部１９８４年）の８７〜９０ページに記載されている、（１）硫酸で加水分解した後に適切な処理をしてガスクロマトグラムで解析する方法、（２）箱守法（文献：山形大学紀要（農学）第１１巻第４号：９０７〜９５６ページ、別冊平成５年１月）で確認をした。分子量の測定には、光散乱光度計による散乱法、超遠心による遠心平衡法、Ｘ線小角散乱による散乱法で決定した。光散乱法は比較的高分子量の試料、遠心平衡法は比較的中程度量から低分子の試料、Ｘ線小角散乱は比較的低分子量の試料の分子量決定に適する。水系における分子量決定は誤差が多いので、２つ以上の独立した方法で決定した。また、ＤＭＳＯ中では溶媒の粘度が高く、遠心平衡法では沈降平衡に達する時間が長く、高分子量の試料では、測定が困難であり、Ｘ線小角散乱ではＸ線の透過率が悪く測定が困難であった。

表１に結果を示す。文献（Norisuyeら、J. Polym. Sci., Polym. Phys. Ed. 1980, 18, 547. Yanakiら Macromolecules 1980, 13, 1462、Kashiwagiら、Macromolecules 1981, 14, 1220.）が示すように、シゾフィランはＤＭＳＯ中では１本の高分子鎖として分子分散している。したがって、ＤＭＳＯ中の分子量と水中の分子量の比が３になっている場合には、シゾフィランは水中で三重螺旋構造を取っていると判断される。表に示した結果から、シゾフィランの１本の高分子鎖として、重量平均分子量が２万以上、好ましくは３万以上であれば、水中ではシゾフィランは大多数が三重螺旋構造を取っている。また、重量平均分子量が１万以下の場合には、水中でも１本の高分子鎖として存在していると判断できる。

注１：ＬＳは光散乱、ＵＣＦは超遠心、ＳＡＸＳはＸ線小角散乱法を示す。分子量分布は、光散乱ではＧＰＣのクロマトグラムから求めた重量平均分子量と数平均分子量の比、超遠心では遠心平衡時のデータから文献（Fujita, H. Foundations of Ultracentrifugal Analysis; Wiley: New York, 1975）記載の方法にしたがって決定した。
注２：光散乱の測定を精度よくするために、シゾフィランが中性の水中と同じコンホメーションを保っていることが分かっている０．０１ＮＮａＯＨ水溶液中で測定した。

実施例２：分子量の異なるシゾフィランと核酸ｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘの複合化
公知の核酸固相合成法にて、デオキシアデノシン１リン酸の重合体であるｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘを合成した。ここでＸは重合度を示す。すなわち、（ｄＡ）_Ｘは、デオキシアデノシンのＸ量体であることを示す。この類縁体として、ホスホジエステル結合のリン酸の酸素原子の一つがイオウに置換されているホスホロチオエート誘導体であるＳ−ｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘと、リン酸の酸素原子の２つがイオウに置換されているホスホロジチオエート誘導体であるＤ−ｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘも合成した。いずれもＨＰＬＣを用いて精製し、純度９９％以上の精製物を得た。

Bioorganic Chemistry Vol. 38. P260-264 (2010) に記載されている、ゲル電気泳動、ゲル浸透クロマトグラフィー（Gel Permeation Chromatography：ＧＰＣ）、円偏光２色性スペクトルを用いてシゾフィランとの複合化率が９５％以上である場合（○）、５０％以上である場合（△）、１０％以下である場合（×）を、表１の試料ごとに分類した。その結果を表２から表４に示す。表２はホスホジエステル結合、表３は酸素の一つがイオウに置換されているＳ−ｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘ、表４は酸素の２つがイオウに置換されているＤ−ｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘの結果である。

なお、複合体の調製には、シゾフィランを０．２５ＮＮａＯＨ溶液に溶解し（１５ｍｇ／ｍＬ）２日以上放置し、完全にシゾフィランを１本鎖に解離させたのち、ポリ（デオキシリボヌクレオチド／シゾフィラン複合体）溶液とリン酸緩衝液（３３０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ４．５）とを混合し、ｐＨが６〜７の範囲になるよう、かつ、シゾフィランとデオキシリボヌクレオチドの混合比がモル比で３：１となるようシゾフィランの塩基性水溶液を添加し攪拌した。得られた溶液を４℃で一晩静置させた後、各種測定を行った。なお、先行特許には、適当な濃度のシゾフィラン／ＤＭＳＯ溶液をＤＮＡ溶液に加える方法が開示されているが、生体実験に用いる際、ＤＭＳＯが残存して好ましくない。

表２〜４に示した結果より、ホスホジエステル結合では、デオキシアデノシン１リン酸の重合Ｘが、好ましくは２０以上、更に好ましくは４０以上、複合体の収率を１００％近くにするには６０以上が必要である。ホスホロチオエート型のＳ−ｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘでは、好ましくは１０以上、更に好ましくは２０以上、複合体の収率を１００％近くにするには４０以上が必要である。ホスホロジチオエート型のＤ−ｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘでは、好ましくは１０以上、複合体の収率を１００％近くにするには２０以上が必要である。

実施例３：分子量の異なるシゾフィランとｐｏｌｙ（ｄＡ）_Ｘテールを付加したＣｐＧＤＮＡとの複合化
ＣｐＧＤＮＡは、Ｋ−タイプのＣｐＧＤＮＡとして５’−末端にポリｄＡテール：（ｄＡ）_４０を付加した５’−（ｄＡ）_４０−ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１；（ｄＡ）_４０−Ｋ３と略記）を、及びＤ−タイプのＣｐＧＤＮＡとして５’−（ｄＡ）_４０−ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号１；（ｄＡ）_４０−Ｄ３５と略記）を使用した。ＤＮＡのリン酸バックボーンはいずれもホスホロチオエート型で、両サンプルともＨｏｋｋａｉｄｏＳｙｓｔｅｍＳｃｉｅｎｃｅ社の合成品で、高速液体クロマトグラフィーで精製されている。また、３’−末端にポリｄＡテールを付加したＫ３−（ｄＡ）_４０とＤ３５−（ｄＡ）_４０も同様にして合成した。これらの試料の複合化を実施例２と同様の方法で評価した。結果を表５に示す。

なお、シゾフィランとｄＡの混合比がモル比で３：１となるようシゾフィランの塩基性水溶液を添加し攪拌した。この結果より、ＣｐＧがｄＡに付加されると、僅かであるが、複合化がされにくいことが分かる。

実施例４：複合体の精製と分子量、拡がりの測定と細胞刺激性
未反応のＤＮＡは複合体に比べて分子量がはるかに小さいために、ＧＰＣで分離することができる。複合体のフラクションを確認しながら検出器から流出してくる溶液を分取した。また、未反応のシゾフィランは、特開２０１１−１７８７０７号公報に記載されている陰イオン交換カラムを用いた方法で取り除いた。複合化率５０％以下の混合溶液から、これらの方法を用いて複合化率９０％以上にすることができた。この精製された複合体は、水溶液として室温で１０日放置しても複合化率が変わることはなかった。

このようにして得た複合化率９０％以上の試料に関して、文献（The Journal of Physical Chemistry B 116 (1), 87-94（2011））に記載されている方法で、重量平均絶対分子量Ｍｗと慣性半径Ｒｇを測定した。慣性半径Ｒｇの測定には、１０ｎｍ以上のものについては光散乱法を、１０ｎｍ未満の場合にはＸ線小角散乱法を用いた。複合体にすると、分子量と慣性半径の分布が大きくなるので、両者の測定値の最小値及び最大値を記録した。

また、以下の方法で、ＣｐＧＤＮＡの刺激によるマウス由来腹腔マクロファージからのサイトカインＩＬ−１２産生量の増強効果（以下、「生理活性」という。）を調べた。すなわち、マウス由来腹腔マクロファージの単離は、文献記載の定法で行った。すなわち８週齢の雌のBalb/cマウスの頚動脈を切断し脱血死させ、７０％エタノールで消毒後に腹部外皮に切れ目を入れ外皮をはいで腹膜を露出させた。冷ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を５ｍＬ腹部に注入し、よくマッサージしたのち液を回収した。ポリプロピレン製の遠心管を用いて１，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した。上清を除き、１０％仔牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した（日本生化学会編、新生化学実験講座１２分子免疫学Ｉ免疫細胞・サイトカイン、東京化学同人（１９８９））。

９６穴プレートに１００μＬの１０％仔牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した２×１０^５個のマウス由来腹腔マクロファージを播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２時間培養してプレートに細胞を接着後に、ＣｐＧＤＮＡ及びＣｐＧＤＮＡとシゾフィランの複合体を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養後に培養上清を回収した。培養上清中に含まれるマウスの全ＩＬ−１２量の測定は、Mouse Interleukin-12 Total ELISA（ＥＮＤＯＧＥＮ社製）を利用し、付属のプロトコールにしたがって測定した。培養上清に含まれる全ＩＬ−１２量は、ＣｐＧＤＮＡ単独投与よりも複合体である本発明の免疫刺激剤の方が、多く含まれていた。この差が２倍以上の系を生理活性ありとして○、同程度の場合を×として結果を示す。表には、ＤタイプのＣｐＧＤＮＡを含む複合体の結果を示すが、ＫタイプのＣｐＧＤＮＡを含む複合体でも結果は同様であった。

Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３を用いたＳ−ｄ（Ａ）_４０−Ｄ３５の複合体において、多角度光散乱測定から算出した分子量を慣性半径に対してプロットしたグラフを図１に示す。シゾフィランの分子量の増加に伴い形成される複合体の分子量及び慣性半径が大きくなっていることがわかった。作製した複合体の生理活性を評価したところ、分子量、慣性半径が大きい複合体は高い活性を示したが、慣性半径の小さい複合体の活性は非常に小さかった。これは分子量の小さいシゾフィランでは複合化率が低く複合体の存在比が少ないため、さらに小さい分子ほど細胞へ取り込まれにくい（シゾフィランの受容体に認識されにくい）ためと考えられる（表６及び７参照）。

実施例５：ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の調製濃度及び分岐度と生理活性との関係
Ｓ３を用いた、Ｓ−ｄ（Ａ）_４０−Ｄ３５の複合体において、実施例２では、複合体の調製には、シゾフィランを０．２５ＮＮａＯＨ溶液で、濃度１５ｍｇ／ｍＬに溶解して、シゾフィランを１本鎖に解離させたのち、ポリ（デオキシリボヌクレオチド／シゾフィラン複合体）溶液とリン酸緩衝液（３３０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ４．５）とを混合した。シゾフィランとポリ（デオキシリボヌクレオチド／シゾフィラン複合体）の濃度を５倍、１０倍、３０倍と濃くしていくと、複合体の分子量が増加するとともに、Ｘ線小角散乱で測定した散乱強度の散乱角度依存性（Ｉ∝ｑ^ａと表す。ここでｑは散乱ベクトルの絶対値）が、ｑが１０^−１から１ｎｍ^−１の範囲で、ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体の濃度が低い場合には、ａ＝−１であったが、濃度が増加するにつれて符号は常に負であるものの、ａの絶対値｜ａ｜が増加していった。また、同様の測定を、Ｓ４を用いたＳ−ｄ（Ａ）_４０−Ｄ３５の複合体においても実施した。Ｓ４の場合は濃度を基準の１／１００から調製した。

Ｓ３を用いた、Ｓ−ｄ（Ａ）_２０−Ｄ３５及びＳＤ３５−ｄ（Ａ）_４０の複合体においてシゾフィランの濃度を高くするにつれ枝分かれ構造を有する複合体（｜ａ｜＞１）が生成されるようになり、生理活性が低下することがわかった。複合体の枝分かれ構造が細胞への取り込みに影響、つまり受容体への被認識能が低下していることが考えられる。Ｓ４を用いた複合体においても、やはり同様に枝分かれ構造を有することで生理活性が無くなっていることがわかる。さらにシゾフィランの分子量の低下に伴う慣性半径の低下によりＳ３と比較すると生理活性も大きく低下したと考えられる（表８参照）。

Claims

シゾフィランと、
前記シゾフィランと水素結合を介して結合し、ＣｐＧ配列を有するポリデオキシリボヌクレオチド又は該ポリデオキシリボヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合もしくはホスホロジチオエート結合で置換されたポリデオキシリボヌクレオチド誘導体とを含み、
前記ポリデオキシリボヌクレオチド又は前記ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記シゾフィランの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成しており、
多角度光散乱測定又はＸ線小角散乱による慣性半径の測定値が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、
Ｘ線小角散乱を用いて測定したＸ線の散乱強度Ｉを、下記の式（Ｉ）で定義されるｑ値の対数に対しプロットした場合、ｑが１０^−１ｎｍ^−１から１ｎｍ^−１の範囲における傾きａが−１．５以上−０．５以下であり、
前記ポリデオキシリボヌクレオチド又は前記ポリデオキシリボヌクレオチドの誘導体のうち、前記シゾフィランと水素結合を介して結合する部分の重合度が６０以上であることを特徴とする免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体。

なお、式（Ｉ）において、θはＸ線の散乱角を表し、λはＸ線の波長を表す。
シゾフィランと、
前記シゾフィランと水素結合を介して結合し、ＣｐＧ配列を有するポリデオキシリボヌクレオチド又は該ポリデオキシリボヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合もしくはホスホロジチオエート結合で置換されたポリデオキシリボヌクレオチド誘導体とを含み、
前記ポリデオキシリボヌクレオチド又は前記ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記シゾフィランの分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成しており、
多角度光散乱測定又はＸ線小角散乱による慣性半径の測定値が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、
Ｘ線小角散乱を用いて測定したＸ線の散乱強度Ｉを、下記の式（Ｉ）で定義されるｑ値の対数に対しプロットした場合、ｑが１０ ^−１ｎｍ ^−１から１ｎｍ ^−１の範囲における傾きａが−１．５以上−０．５以下であり、
前記ポリデオキシリボヌクレオチド又は前記ポリデオキシリボヌクレオチドの誘導体のうち、前記シゾフィランと水素結合を介して結合する部分の重合度が１０以上であり、且つポリデオキシリボヌクレオチドにおいてホスホジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたポリデオキシリボヌクレオチドの誘導体であることを特徴とする免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体。

なお、式（Ｉ）において、θはＸ線の散乱角を表し、λはＸ線の波長を表す。
分子量が１×１０^５以上３×１０^６以下であることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体。
請求項１から３のいずれか１項記載の免疫賦活用ポリヌクレオチド／シゾフィラン複合体を含む医薬組成物。