JP6523566B2

JP6523566B2 - ジヒドロピリド環化合物の結晶形、製造方法および中間体

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Publication number: JP6523566B2
Application number: JP2018522961A
Authority: JP
Inventors: ハイインヘ; カイチョウ; シャオリンリ; シャオフェイワン; ダクンチン; シンシンワン; フェイフェイヤン; チェンワン; ゾンビンリ
Original assignee: チールーファーマシューティカルカンパニー、リミテッド
Priority date: 2015-11-04
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2019-06-05
Anticipated expiration: 2036-11-02
Also published as: CA3004147C; WO2017076286A1; JP2018537436A; CA3004147A1; PH12018500947B1; ES2794639T3; CN108368113B; TW201720825A; PH12018500947A1; CN108368113A; EP3372606A1; TWI715658B; HK1251555A1; EP3372606B1; EP3372606A4; US20180312512A1; US10253030B2

Description

本発明は、ジヒドロピリド環化合物の結晶形、その製造方法および中間体に関するものである。

B型肝炎ウイルスは、ヘパドナウイルス科に属するものである。それは、急性及び/又は持続的や漸進的慢性病の要因になっている。B型肝炎ウイルスは、さらに、病理的形態における多くの他の臨床所見、特に肝臓の慢性炎症、肝硬変や肝細胞の癌化を引き起こす。なお、疾患進行において、Ｄ型肝炎との共感染によって悪影響を及ぼす。

慢性肝炎への治療が許容される従来の薬剤が、インターフェロン及びラミブジン(Iamivudine)である。しかし、インターフェロンは、中程度の活性しか有さず、高い毒性反応を有し、一方、ラミブジン(Iamivudine)は、優れた活性を有するが、治療中に薬剤耐性レベルが大きく上昇し、しかも、治療停止後、反跳作用がよく起き、ラミブジン(3-TC)のIC50値は、300nMである(Science、299(2003)、893-896)。

Deresらは、Bay41_4109、Bay39_5493を代表として、正常ヌクレオカプシドの形成を阻止することによってHBV複製への阻害に役立つ複素芳香環置換のジヒドロピリミジン類(HAP)化合物を報告した。Bay41_4109は、臨床研究において良好な薬物代謝パラメータを現した(Science、299(2003)、893-896)。その薬効メカニズムの研究によれば、複素芳香環置換のジヒドロピリミジン類化合物は、コアタンパク質の113-143アミノ酸残基との作用によって、ヌクレオカプシドを形成する二量体の間における挟角を変化させることにより、不安定な拡張ヌクレオカプシドを形成し、コアタンパク質の分解を促進することが分かった(Biochem.Pharmacol.66(2003)、2273-2279)。

現在では、抗ウイルス薬として効果的に利用される新規な化合物、特に、B型肝炎の治療及び/又は予防のための薬剤が依然として必要である。

本発明は、化合物1の製造方法であって、

以下のステップを含み、

ここで、
該ステップの反応は、有機塩基や無機塩基を添加する必要がなく、
反応溶媒は、1,4-ジオキサンや、テトラヒドロフランから選択され、
化合物12とアミノスルホンアミドのモル比は、1:1〜20から選択され、
反応温度は、60℃〜還流温度から選択され、
任意的に、化合物1は、ジクロロメタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、n-ヘプタン、n-ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルにおける１つの単一溶媒もしくはいくつかの溶媒の混合溶媒により再結晶精製される製造方法を提供する。

本発明の一態様によれば、前記化合物12とアミノスルホンアミドのモル比は1:10から選択される。
本発明の一態様によれば、前記化合物1は、ジクロロメタン又は酢酸エチル/n-ヘプタンの混合溶媒により再結晶精製される。

本発明の一態様によれば、前記化酢酸エチル/n-ヘプタンの混合溶媒において、酢酸エチルとn-ヘプタンの体積比は0.5:1〜2から選択される。
本発明の一態様によれば、前記製造方法は、以下のステップを含み、

ここで、
NMMと化合物4のモル比は1〜4:1であり、好ましくは2〜3:1から選択され、
任意的に、化合物8を分離せずに、そのまま次の反応へ投入する。本発明の一態様によれば、前記反応で得られた化合物9Aと化合物9Bとの混合物を、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、シクロヘキサン、n-ヘプタンにおける１つの単一溶媒もしくはいくつかの溶媒の混合溶媒により再結晶し、分離精製することによって、化合物9Aを得る。

本発明の一態様によれば、前記NMMと化合物4のモル比は2〜3:1である。
本発明の一態様によれば、前記反応で得られた化合物9Aと化合物9Bとの混合物を、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、n-ヘプタンの混合溶媒により再結晶し、分離精製することによって、化合物9Aを得る。

本発明の一態様によれば、前記化合物9Aと化合物9Bとの混合物の再結晶溶媒であるn-ヘプタン、酢酸エチル、テトラヒドロフランの体積比は（6〜54）:（2〜18）:1である。
本発明の一態様によれば、前記n-ヘプタン、酢酸エチル、テトラヒドロフランの体積比は18:6:1である。

本発明の一態様によれば、前記製造方法は、以下のステップを含み、

縮合剤は、EDCI、DCC、DIC、DMC、HOBT、HATU、CDIから選択され、
反応温度は、-20℃〜10℃から選択され、
任意的に、化合物3を分離せずに、そのまま次の反応へ投入する。

本発明の一態様によれば、前記製造化合物3を製造する反応温度は、-10℃〜0℃から選択される。
本発明の一態様によれば、前記述製造方法は、以下のステップを含み、

反応溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n-ブタノール、tert-ブタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、トルエン、キシレンにおける１つの単一溶媒もしくはいくつかの溶媒の混合溶媒から選択される。

本発明の一態様によれば、前記化合物4を製造する反応溶媒は、トルエンとメタノールの混合溶媒から選択される。
本発明の一態様によれば、前記化合物4は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n-ブタノール、シクロヘキサン、n-ヘキサン、n-ヘプタン、石油エーテルにおける１つの単一溶媒もしくはいくつかの溶媒の混合溶媒により攪拌結晶化、叩解又は再結晶精製される。

本発明の一態様によれば、前記化合物4は、エタノール/シクロヘキサン、エタノール/n-ヘキサン、エタノール/n-ヘプタン又はエタノール/石油エーテルの混合溶媒により攪拌結晶化、叩解又は再結晶精製される。

本発明の一態様によれば、前記エタノールと、シクロヘキサン、n-ヘキサン、n-ヘプタン又は石油エーテルの体積比は、1:1〜3から選択される。
本発明の一態様によれば、前記エタノールと、シクロヘキサン、n-ヘキサン、n-ヘプタン又は石油エーテルの体積比は、1:1〜2から選択される。

本発明の一態様によれば、前記化合物4の精製溶媒は、エタノール/石油エーテルから選択され、エタノールと石油エーテルの体積比は、3：5である。
本発明の一態様によれば、前記化合物4の攪拌結晶化もしくは叩解精製の温度は、-5℃〜30℃である。

本発明の一態様によれば、前記化合物4の攪拌結晶化もしくは叩解精製の温度は、10℃〜20℃である。
本発明の一態様によれば、前記製造方法は、以下のステップをさらに含む。

。
本発明は、粉末X線回折スペクトルは、15.50±0.2°、17.00±0.2°、20.86±0.2°の角度2θに特徴的な回折ピークを有する化合物1の結晶形Iを提供する。

本発明の一態様によれば、前記結晶形Iは、粉末X線回折スペクトルは、11.04±0.2°、15.50±0.2°、17.00±0.2°、18.57±0.2°、19.36±0.2°、20.19±0.2°、20.86±0.2°、22.68±0.2°の角度2θに特徴的な回折ピークを有する。

本発明の一態様によれば、前記結晶形Iは、粉末X線回折スペクトルは、7.848°、10.489°、11.037°、12.875°、15.497°、16.995°、18.572°、19.360°、19.697°、20.192°、20.861°、22.676°、22.972°、23.225°、23.583°、23.940°、24.571°、24.886°、25.162°、25.476°、25.710°、26.405°、27.393°、28.237°、28.613°、29.007°、31.039°、32.892°、33.858°、34.095°、34.609°、35.000°、35.871°、36.538°、38.433°の角度2θに特徴的な回折ピークを有する。

本発明は、XRPDスペクトルが図1に表される化合物1の結晶形Iを提供する。
本発明の一態様によれば、結晶形IのXRPDスペクトルの解析データが表-1に表される。
表-1 図1のXRPDスペクトルの解析データ

本発明の一態様によれば、結晶形Iの製造方法は、化合物1を酢酸エチルと石油エーテルの体積比が1:0.5〜2である酢酸エチル、石油エーテルの混合溶媒に添加して再結晶することを含む。

本発明の一態様によれば、前記結晶形Iの製造方法における酢酸エチルと石油エーテルの体積比は、1:1である。
本発明の一態様によれば、結晶形Iの製造方法において、化合物1を酢酸エチルに添加し、加熱還流することにより溶解させ、n-ヘプタンを滴下した後、10℃〜-10℃までに徐々に降温し、結晶化させ、酢酸エチルとn-ヘプタンの体積比は1:0.5〜2である。

本発明の一態様によれば、前記結晶形Iの製造における酢酸エチルとn-ヘプタンの体積比は、1:1から選択される。
本発明の他の目的は、結晶形Iの、HBV受容体に関連する疾患治療用薬物の製造における応用を提供することである。

定義および説明
特に断らない限り、本明細書に用いられる下述の用語や短句は、下述の意味を有するとする。ある所定の短句や用語は、特に定義されていない場合に不確実や不明なものと見なすべきではなく、一般的な意味として理解すべきである。本明細書に製品名が出てくる場合に、それが対応する製品又はその活性成分を指すことを意図する。

本発明の中間体化合物は、以下に挙げられる具体的な実施形態、他の化学合成方法を組み合わせた実施形態および当業者に知られた均等置換方法を含む当業者に知られる多種の合成方法で製造することができ、好ましい実施形態が本発明の実施例を含むがこれに限定されない。

本発明における具体的な実施形態の化学反応は、本発明の化学変化及びその所望の試薬や材料に適した適切な溶媒中で達成される。本発明の化合物を取得するために、当業者は既存の実施形態に基づき合成ステップや反応流れを変更したり選択したりする必要がある場合がある。

本分野のいずれかの合成ルート計画における、1つの重要な検討要因は、反応性官能基（例えば、本発明のアミノ基）に適合な保護基を選ぶことである。訓練を受けた従業者にとって、Greene and Wutsの(Protective Groups In Organic Synthesis,Wiley and Sons,1991)はこの分野の権威である。本発明に援用された全ての参考文献を全体として本発明に組み込む。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に記述するが、本発明はそれらの実施例に一切制限されない。
本発明に用いられる全ての溶媒は市販されるものであり、さらに精製される必要がなく、そのまま使用されることができる。反応は、一般的に、不活性窒素ガス下で、無水溶媒中で行われる。プロトン核磁気共鳴データは、Bruker Avance III 400(400MHz)分光計に記録され、化学シフトはテトラメチルシラン低磁場側の(ppm)で表す。マススペクトルは、アジレント1200シリーズプラス6110（&1956A）にて測定を行う。LC/ MSやShimadzu MSは、1つのDAD：SPD-M20A（LC）とShimadzu Micromass 2020検出器を備える。質量分析計は、1つの正または負のモードで動作するエレクトロスプレーイオン源（ESI）を備える。

本発明は、下記のように、DCMがジクロロメタンを代表し、PEが石油エーテルを代表し、EAが酢酸エチルを代表し、DMFがN,N-ジメチルホルムアミドを代表し、DMACがN,N-ジメチルアセトアミドを代表し、DMSOがジメチルスルホキシドを代表し、EtOAcが酢酸エチルを代表し、tolがトルエンを代表し、THFがテトラヒドロフランを代表し、EtOHがエタノールを代表し、MeOHがメタノールを代表し、NMPがN-メチルピロリドンを代表し、2-METHFが2-メチルテトラヒドロフランを代表し、i-PrOHが2-プロパノールを代表し、Bnがベンジル基を代表し、Cbzがアミン保護基になるベンジルオキシカルボニル基を代表し、Bocがアミン保護基になるtert-ブチルカルボニル基を代表し、Fmocがアミン保護基になるフルオレンメトキシカルボニル基を代表し、Allocがアミン保護基になるアリルオキシカルボニル基を代表し、Teocがアミン保護基になるトリメチルシリルエトキシカルボニル基を代表し、Boc₂Oがジ-tert-ブチルジカーボネートを代表し、HCl（g）が塩化水素ガスを代表し、H₂SO₄が硫酸を代表し、HOAcが酢酸を代表し、TFAがトリフルオロ酢酸を代表し、DIPEAがジイソプロピルエチルアミンを代表し、DIEAがジイソプロピルエチルアミンを代表し、NMMがN-メチルモルホリンを代表し、DBUが1,8-ジアザビシクロウンデセ-7-エンを代表し、Et₃Nがトリエチルアミンを代表し、LDAがジイソプロピルアミドリチウムを代表し、NaHMDSがビス(トリメチルシリル)アミノナトリウムを代表し、KHMDSがビス(トリメチルシリル)アミノカリウムを代表し、LiAlH₄が水素化アルミニウムリチウムを代表し、t-BuOKがカリウムtert-ブトキシドを代表し、H₂O₂が過酸化水素を代表し、NH₄Clが塩化アンモニウムを代表し、BaSO₄が硫酸バリウムを代表し、CaCO₃が炭酸カルシウムを代表し、SnCl₂が塩化第一スズを代表し、Zn(BH₄)₂が水素化ホウ素亜鉛を代表し、PPh₃がトリフェニルホスフィンを代表し、HMDSがヘキサメチルジシラザンを代表し、Pd/Cがパラジウム炭素を代表し、PtO₂が二酸化プラチナを代表し、Pd(OH)₂が水酸化パラジウムを代表し、Pd₂(dba)₃がトリ(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウムを代表し、Pd(PPh₃)₄がテトラトリフェニルホスフィンパラジウムを代表し、Pd(dppf)Cl₂が1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン塩化パラジウムを代表し、Pd(PPh₃)₂Cl₂がジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)を代表し、Pd(OAc)₂が酢酸パラジウムを代表し、PdCl₂が塩化パラジウムを代表し、CuIがヨウ化第一銅を代表し、CuBrが臭化第一銅を代表し、CuClが塩化第一銅を代表し、Cuが銅粉を代表し、Cu₂Oが酸化第一銅を代表し、Xantphosが4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテンを代表し、Sphosが2-ジシクロヘキシルホスフィニデン-2',6'-ジメトキシビフェニールを代表し、Xphosが2-ジシクロヘキシルリン-2',4',6'-トリイソプロピルビフェニールを代表し、Ruphosが2-ジシクロヘキシルホスフィン-2',6'-ジイソプロポキシ-,1,1'-ビフェニールを代表し、Brettphosが2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)-3,6-ジメトキシ-2'-4'-6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニールを代表する、略語を採用する。

化合物は、人工或はChemDraw（登録商標）ソフトで命名され、市販の化合物は、サプライヤーによるカタログ名称を採用する。

本発明の粉末X線回折（X-ray powder diffractometer,XRPD）法
機器型番：ブルカーD8 advance X線回折計
試験条件：XRPDパラメータの詳細は以下の通りである
X-ray発生装置：Cu,kα,(λ=1.54056Å)
管電圧：40 kV、管電流：40 mA.
発散スリット：1 deg.
上限スリット：10 mm
散乱スリット：1 deg.
受光スリット：0.15 mm
モノクロメータ：固定モノクロメータ
走査範囲：4-40 deg.
走査速度：10 deg/分間

本発明の示差走査熱量分析（Differential Scanning Calorimeter,DSC）方法
機器型番：TA Q2000示差熱分析計
テスト条件：試料（〜 1 mg）を、DSCアルミポットに入れて試験し、方法は、25°C - 350°Cで、昇温レートが10 °C/分間である。

本発明の熱重量分析（Thermal Gravimetric Analyzer,TGA）方法
機器型番：TA Q5000IR熱重量分析計
テスト条件：試料（2 〜 5 mg）置于TGAプラチナポットにに入れてテストするが、方法は、室温 - 350°Cで、昇温レートが10 °C/分間である。

図1は、結晶形IのCu-Kα放射のXRPDスペクトルである。図2は、結晶形IのDSCスペクトルである。図3は、結晶形IのTGAスペクトルである。図4は、化合物14の単分子立体構造ORTEP図である。

技術効果：
本発明の化合物I及びその中間体を合成するプロセスの有益な効果は、出発原料が安くて、購入が容易で、且つ投与された試薬の毒性が大きく、反応条件が厳しく、分離精製が難しく、産業化し易くないと言った欠点を克服したことにある。

具体的には、
1) 本発明は、化合物1を製造する方法の原料が通常又は一般的な試薬であり、市場で入手しやすく、値段が安く、
2) 化合物4の製造において、EDCI、DCC、DICなどを縮合剤として利用しており、反応条件が穏やかであり、得られる化合物4が、エタノールと石油エーテルやn-ヘプタン、n-ヘキサンやシクロヘキサンなど低極性溶媒を使って、攪拌結晶化若しくは叩解を行い、操作が簡単で、生成物の純度が高く、
3) 化合物8の製造において、化合物4、化合物6及び化合物7を原料として、化合物8を合成し、反応条件が穏やかであり、収率が高く、そして、化合物8を分離せずに、そのまま次の反応を投入することができると共に、操作が簡単であり、
4) 反応で取得された化合物9Aと化合物9Bの混合物は、酢酸エチル、テトラヒドロフラン及びn-ヘプタンの混合溶媒により再結晶して、純度が95%以上であり、Deが96%より大きい化合物9Aを直接に得ることができる。

5) 化合物1の製造ステップにおいて、無機塩基や有機塩基を添加する必要がない条件で、ジオキサンを溶媒として、ほぼ10当量のアミノスルホンアミドと化合物12を還流条件下で反応させ、クリーンな生成物を取得すると共に、後処理が便利で簡単である。

6) 化合物1の結晶形Iの性質が安定しており、良い製薬の見込みがある。
そのため、本発明は、化合物1及び中間体において、高い工業的応用価値及び経済価値を有する。
(発明を実施するための形態)

本発明の内容をよく把握するために、以下、具体的な実施例を合わせて更なる説明をするが、具体的な実施形態は本発明の内容を限定するわけではない。
実施例1：化合物1粗化合物の製造

第1ステップ：化合物4の製造
50Lの反応釜に、DCMを12L加えた。出発原料(5.00kg,15.46mol)を加えた。DMAP（2.83kg,23.20mol）を入れて10分間攪拌した。化合物2(2.23kg,15.46mol)を加え、反応釜の温度を0℃に下げた。EDCI（4.45kg、23.20mol）をDCM(20L)にバッチで溶解させ、懸濁液を形成した。滴下を、内部温度を0℃未満に制御しながら徐々に行った。滴下終了後、反応液を0℃で16時間攪拌した。サンプリング検出をした場合、TLC(PE:EtOAc=1:1)およびLCMSによる検出は、原料がなくなり、反応が終了したことを示した。反応液を、NaHCO₃飽和溶液(20L * 2)で洗浄した。TLC(PE : EtOAc=0:1)検出によれば、DMAPがなくなり、且つ、LCMSによれば、DMAPが無かった。NaCl飽和溶液（15L）で１回洗浄した。減圧濃縮、スピン乾燥した後、トルエンを3L添加した。減圧濃縮を続けて化合物3を得た。分離重量が6.95kg、分離収率が87.7%、純度が85%になった。

¹H NMR(400 MHz,CHLOROFORM-d) ppm 1.42(s,8 H)1.65 - 1.76(m,5 H)3.54 - 3.72(m,2 H)4.85(d,J=6.02 Hz,1 H)5.07 - 5.25(m,2 H)5.35(d,J=8.28 Hz,1 H)7.29 - 7.40(m,5 H)
LCMS：m/z: 472.1 [M+Na⁺]

50Lの反応釜に、無水トルエン(20L)を加えた。化合物3(6.95kg,15.46mol)を加えた。機械攪拌で、無水MeOH（6.26L,154.6mol）を加えた。内部温度を70℃になるように制御しながら16時間攪拌した。サンプリング検出を行った。TLC(PE : EtOAc=1:1)およびLCMSによる検出は、反応終了を示した。反応液を減圧濃縮することによって、赤褐色の粘稠液体を得た。粗化合物を、6LのEtOH、10Lの石油エーテルに溶解させた。溶液を13℃で30分間攪拌することで、白色固体が析出した。2時間攪拌し、一晩静置し、ろ過して、固体を石油エーテル(5L)で３回洗浄後、陰干しをして、白色生成物(4.2kg,11.07mol)を得た。ろ過母液の温度を-11℃に下げて、ろ過することで白色の生成物(600g,1.58mol)を得た。分離重量が合計4.8kg、2ステップの分離収率が81.7%、純度が98%である。

¹H NMR(400 MHz,CHLOROFORM-d) ppm 1.43(s,9 H)3.07 - 3.16(m,1 H)3.22 - 3.33(m,1 H)3.44(s,2 H)3.72(s,3 H)4.51 - 4.62(m,1 H)5.16(s,2 H)5.48(d,J=8.03 Hz,1 H)7.29 - 7.40(m,5 H)
LCMS：m/z: 402.1 [M+Na⁺]

第2ステップ：化合物6の製造
50Lの反応釜に、12LのMeOHを加えた。化合物5（2200g、20.00mol、1 eq）を加えた。NaOMe（54g,1mol,0.05 eq）を添加して、10℃で、0.5時間攪拌した。サンプリング検出をした場合、TLC(PE : EtOAc=2:1)は、原料がなくなり、中間体を生成したことを示した。NH₄Cl(1296g、24.00mol、1.2eq)を加え、65℃下で16時間攪拌した。サンプリング検出をした場合、TLC(PE : EtOAc=2:1)は、中間体がなくなり、反応が終了したことを示した。反応液をろ過することで210gのNH₄Clの固体を得ると共に、ろ液をスピン乾燥することで粗化合物を得た。20LのEtOAcで粗化合物を2時間叩解して、ろ過によって、生成化合物6を3200g得、ここで、純度が98%、Q-NMR検出による有効含有量がNMR 95%、分離収率が93%である。

¹H NMR(400 MHz,DMSO-d₆) ppm 8.26(d,J=2.76 Hz,1 H)8.38(d,J=3.01 Hz,1 H)9.81(br. s.,1 H)
LCMS: m/z: 127.9 [M+H⁺]

第3ステップ：化合物9Aの製造
30Lのジャケット付き反応フラスコに化合物4（1140g,3mol）と、無水THF（7.5L）を加えて、攪拌した。化合物6（566g,3.45mol）、化合物7（502g,1.1mol）およびNMM(760g,7.5mol)を加えた。反応を（60℃）20時間還流させ、HPLCで中間体のカルボン酸含有量を検出しながら、5〜10℃に降温し、イソブチルクロロホルメート（492g,3.6mol、500 mLのTHFに溶解）を滴下して、5〜10℃下で反応を1時間行った。TLCとHPLCは、反応中間体のカルボン酸が完全に反応したことを示した。H₂Oを3L添加してクエンチング反応を行った。EtOAcを9L添加して抽出し、有機溶媒にH₂Oを3L入れて1回洗浄した。有機溶媒の濃縮によって母液を2.2kg得た。母液をEtOAc(3L)に溶解させ、THF（500 mL）を添加し、n-ヘプタン（約9L）を徐々に滴下、15℃で一晩攪拌し、固体が析出した。ろ過によって純度95%且つDe=85%の固体粗化合物を得た。粗化合物の再結晶は、固体100gごとにTHF/EtOAc(500/500 mL)を添加して50℃で溶解させ、n-ヘプタン（1L）を滴下し、1時間攪拌した。25℃までに段々降温し、一晩攪拌した。固体のろ過によって、白色固体の化合物9Aを500g得、ここで、生成物純度が96%、De>96%である。収率27%
¹H NMR(400 MHz,CHLOROFORM-d) ppm 1.46(s,9 H)3.11(dd,J=17.82,8.03 Hz,1 H)3.70(s,3 H)3.86 - 4.03(m,1 H)4.46(d,J=7.78 Hz,1 H)5.30(d,J=6.27 Hz,1 H)6.02(s,1 H)6.89 - 7.00(m,1 H)7.01 - 7.12(m,1 H)7.49(d,J=3.26 Hz,1 H)7.90(d,J=3.01 Hz,1 H)
LCMS: m/z: 523.1 [M+H⁺]

第4ステップ：化合物10の製造
10リットルの反応フラスコに、200 mLのH₂Oを加え、さらに、NaBH₄（39.2g,1.03mol）を加えて溶解させ、0℃で化合物9（270.0g,0.52mol）に、4.0リットルのTHFを加えて溶解させ、そして、反応フラスコに徐々に滴入して、温度が0〜5℃になるように制御しながら3時間反応させた。サンプリング検出をした場合、反応が終了したことを示した。反応液に750 mLのHCl（1mol/L）を添加して、pH=7になるように調節した。反応液の濃縮により粗化合物を得、粗化合物に200 mLの水を加えた。酢酸エチル（500 mL*3）で抽出し、有機相を組み合わせた。有機相をNa₂SO₄で乾燥させた。濃縮によって、粗化合物を299g得、ここで、純度が97.23%、分離収率>100%（粗化合物）、有効含有量が90%、収率が96%である。

¹H NMR(400 MHz,DMSO-d₆) ppm 1.14(s,9 H)2.61 - 2.69(m,1 H)3.38(br. s.,2 H)3.52 - 3.59(m,4 H)3.84 - 3.94(m,1 H)4.81(t,J=5.65 Hz,1 H)5.86(s,1 H)6.40(d,J=9.54 Hz,1 H)7.15 - 7.25(m,2 H)7.94(d,J=3.26 Hz,1 H)8.01(d,J=3.01 Hz,1 H)9.71(s,1 H)
LCMS: m/z: 527.1 [M+H⁺]

第5ステップ：化合物11の製造
5Lの反応フラスコに、化合物10（269.0g,0.51mol）を加え、1.2Lのジクロロメタンを加えて溶解させた。さらに、DMAP（187.4g,1.53mol）を添加して、内部温度が0℃に下がるように10分間攪拌した。内部温度を制御しながら塩化メチルスルホニル（118.09g,1.03mol）のDCM(50 mL)溶液を滴下し、滴下終了後、反応温度を0℃になるように制御する条件で、攪拌反応を20分間行った。温度を35℃に昇温した条件で、攪拌反応を行った。反応を16時間続け、サンプリング検出をした場合、反応が終了したことを示した。反応液に1mol/LのHClを500mL添加し、pH=2〜3になるように調節した。反応液に500mLの水を加え、ジクロロメタン（700 mL*3）で抽出し、有機相を組み合わせた。有機相の検出では、DMAPがほとんど無くなり、水相の検出では、水相に目的生成物が無かった。さらに、有機相に2mol/LのHClを50mL添加し、飽和NaClで洗浄した(500 mL*2)。有機相の検出では、DMAPがほとんど無くなり、水相をジクロロメタン（100 mL*3）で抽出し、有機相を組み合わせ、有機相を1MのNaHCO₃(300 mL*2)で洗浄して、無水Na₂SO₄で乾燥させた。濃縮により、270gの黄色固体を得、ここで、分離重量が270g、分離収率が85.7%、純度が88.56%である。

¹H NMR(400 MHz,DMSO-d₆) ppm 1.38(s,9 H)3.01(dd,J=17.82,6.27 Hz,1 H)3.35(dd,J=17.82,7.53 Hz,1 H)3.53(s,3 H)4.06 - 4.29(m,2 H)4.40(dd,J=11.04,6.78 Hz,1 H)5.89(s,1 H)7.21 - 7.27(m,2 H)7.39(d,J=6.02 Hz,1 H)7.89(d,J=3.26 Hz,1 H)7.96(d,J=3.26 Hz,1 H)
LCMS: m/z: 509.2 [M+H⁺]

第6ステップ：化合物12の製造
30Lの釜R1に、化合物11（1.1kg、2.1mol、重量分率97.14%）、9.9kgの酢酸エチルおよび0.87kgの濃塩酸を加えた。25度で3時間攪拌し、サンプリング検出をした場合、反応が終了したことを示した。水を4.4kg添加し、分液抽出をして、酢酸エチル相を取り除いた。水相をそれぞれ6.82kgのジクロロメタンで2回洗浄して、分液し、ジクロロメタン相を取り除いた。水相に、さらに13.25kgのジクロロメタン、1.19Lのメタノールを添加し、5度に冷却するまでに攪拌し、PHを13に調節（約20分間）するように3Nの水酸化ナトリウムを約4.4kgゆっくり添加して、分液し、有機相を採取した。水相を9.71kgのジクロロメタンと0.58kgのメタノール（10/1）の混合溶媒で1回抽出した。有機相をスピン乾燥することで0.85kgの粗化合物を得た（重量分率：94.19%）。

¹H NMR(400 MHz,DMSO-d₆) ppm 1.84(br. s.,2 H)2.84(dd,J=17.57,6.02 Hz,1 H)3.26(dd,J=17.57,6.78 Hz,1 H)3.55(s,3 H)3.63(m,J=6.15 Hz,1 H)4.00(dd,J=10.92,5.65 Hz,1 H)4.29(dd,J=11.04,6.27 Hz,1 H)5.90(s,1 H)7.14 - 7.31(m,2 H)7.89(d,J=3.26 Hz,1 H)7.97(d,J=3.26 Hz,1 H)
LCMS: m/z: 409.1 [M+H⁺]

第7ステップ：化合物1の製造
30Lの反応釜へ化合物12（0.82kg,1.89mol、重量分率94.19%）、1,4-ジオキサン(8.2L)、アミノスルホンアミド（1.89kg,2.35mol）を順次に加え、窒素で置換した。還流で2時間反応させた。サンプリング反応がほぼ完全に進行した。反応液をスピン乾燥し、4.4kgの酢酸エチルを添加し、12.3kgの水道水で1回洗浄した。有機相に6.5kgのジクロロメタンを入れて、（3*12.3kg）脱イオン水で3回洗浄し、有機相を濃縮乾固することで、化合物1の粗化合物を得た。

実施例2 化合物1の結晶形Iの製造
実施例1の粗化合物を、4.76kgのジクロロメタンで還流する状態下で溶解させた。30分間ごとに摂氏10度で、零下摂氏30度までにプログラム冷却する。零下摂氏20度を60時間維持した。多量の固体を析出させ、ろ過して、固体を2.87kgのジクロロメタンで叩解した。ろ過によって、790gの固体を得た。固体を1.58Lの酢酸エチルで全部溶解するまでに還流し、1.58リットルのn-ヘプタンを滴下し、50℃に冷却した状態下で多量の固体が現れるまでに攪拌し、プログラム冷却し（100分間で零下10度までに冷却する）、零下10度を10時間保持した。ろ過し、0.79リットルの酢酸エチルと0.79リットルのn-ヘプタンの混合溶媒で固体を洗浄し、真空オーブンで乾燥することで、純度98.5%の化合物1の結晶形Iを0.61kg得た。

¹H NMR(400 MHz,DMSO-d₆) ppm 3.07(dd,J=17.69,6.90 Hz,1 H)3.48(dd,J=17.82,7.53 Hz,1 H)3.55(s,3 H)4.10(m,J=6.88 Hz,1 H)4.20(dd,J=11.29,6.27 Hz,1 H)4.51(dd,J=11.29,6.78 Hz,1 H)5.91(s,1 H)6.76(s,2 H)7.17(d,J=7.28 Hz,1 H)7.22 - 7.29(m,2 H)7.89(d,J=3.26 Hz,1 H)7.98(d,J=3.26 Hz,1 H)
LCMS: m/z: 488.1 [M+H⁺]。

X-Ray検出分析：化合物1は、単結晶の育成が容易ではなく、化合物1の絶対配置の確認するために、化合物12をメシルクロリドと反応させることによって、化合物14を取得し、化合物14に対し単結晶を育成させ、ルートは以下の通りである。

該置換反応はNで起こし、且つ、使われた塩基TEAの塩基性が弱いため、化合物12における2つのキラル炭素の配置が反転しない。そのため、化合物1における2つのキラル炭素の配置は、化合物14における2つのキラル炭素の配置と一致している。化合物14の単結晶のデータによって、化合物1の絶対配置を特定することもできる。化合物14のX-Rayは図面4に示されている。

実施例3：化合物1の結晶形Iの製造
実施例1で得られた化合物1の粗化合物をシリカゲルカラムで精製し、移動相がジクロロメタン/メタノール=100:1であり、得られた生成物を酢酸エチル/石油エーテルの混合溶媒（体積比1:1）で2回再結晶することによって、化合物1の結晶形Iを得た。

HBVインビトロ試験による定量qPCR試験
1実験目的：
リアルタイム定量qPCR試験（real time-qPCR）によってHepG2.2.15細胞内のHBV DNA含有量を検出し、化合物のEC₅₀値を指標として、化合物によるHBVの阻害効果を評価する。
2 実験材料:
2.1 細胞系：HepG2.2.15 細胞
HepG2.2.15 細胞培地(DMEM/F12、Invitrogen-11330057；10%の血清、Invitrogen-10099141；100 ユニット/mlペニシリンおよび10 μg/mlストレプトマイシン、Invitrogen-15140122；1% 非必須アミノ酸、Invitrogen-11140076；2mML-グルタミン、Invitrogen-25030081；300 μg/ml Geneticin、Invitrogen-10131027
2.2試薬：
パンクレアチン（Invitrogen-25300062）
DPBS （Hyclone-SH30028.01B）
DMSO （Sigma-D2650-100ML）
高スループットDNA精製キット（QIAamp 96 DNA Blood Kit、Qiagen-51162）
定量ファストスタートユニバーサルプローブ試薬（FastStart Universal Probe Master、Roche-04914058001）
2.3消耗材と機器：
96ウェル細胞培養プレート（Corning-3599）
CO₂インキュベーター（HERA-CELL-240）
光学接着フィルム（ABI-4311971）
定量PCR 96ウェルプレート（Applied Biosystems-4306737）
蛍光定量PCR計（Applied Biosystems-7500 リアルタイム PCR system）
1. 実験ステップおよび方法：
3.1HepG2.2.15細胞（4x10⁴細胞/ウェル）を96ウェルプレートへ播種し、37℃で、5 % CO₂で一晩培養した。

3.2翌日、化合物を、合計8つの濃度、3倍の勾配で希釈した。濃度の異なる化合物をダブルホールである培養ウェルに加えた。培養液において、DMSOの最終濃度が1%である。1mMのGLS4を100%inhibition対照とし、1%のDMSOを0%inhibition対照とする。

3.3五日目、化合物を含有する新鮮な培養液に交換した。
3.4八日目、培養ウェルにおける培養液を取り、高スループットDNA精製キット（Qiagen-51162）でDNAを抽出し、具体的なステップは、該製品の説明書を参考する。

3.5 PCR反応液の配合は、表1に表される：

上流プライマーシーケンス：GTGTCTGCGGCGTTTTATCA
下流プライマーシーケンス：GACAAACGGGCAACATACCTT
プローブシーケンス：5'+ FAM + CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC + TAMRA -3'
3.1 96ウェルPCRプレートにおいて、ウェルごとに15 μlの反応混合液を加え、そして、ウェルごとに10 μlの試料DNAやHBV DNAの標準品を加えた。

3.2 PCRの反応条件は、95°Cで10分間加熱し、そして、95°Cで15秒間変性し、60°Cで1分間伸長反応し、合計40サイクルで行った。
3.3 データ分析：
3.8.1 阻害パーセンテージの計算は、% Inh.=［1-(試料におけるDNA複製数-1 mMの GLS4におけるDNA複製数)/(DMSO対照におけるDNA複製数-1 mM GLS4におけるDNA複製数)］x100である。

3.8.2 EC₅₀の計算は、GraphPad Prismソフトを利用し、化合物によるHBVの50%阻害濃度（EC₅₀）値を算出した。
4実験結果
実験結果を表-3に表した。

生物学的活性定義：A：EC₅₀≦100 nM。
結論：化合物1によるHBV DNAの阻害効果が顕著である。

Claims

粉末X線回折スペクトルは、15.50±0.2°、17.00±0.2°、20.86±0.2°の角度2θに特徴的な回折ピークを有する、
化合物1の結晶形I。
粉末X線回折スペクトルは、11.04±0.2°、15.50±0.2°、17.00±0.2°、18.57±0.2°、19.36±0.2°、20.19±0.2°、20.86±0.2°、22.68±0.2°の角度2θに特徴的な回折ピークを有する、請求項１に記載の化合物1の結晶形I。
粉末X線回折スペクトルは、7.848°、10.489°、11.037°、12.875°、15.497°、16.995°、18.572°、19.360°、19.697°、20.192°、20.861°、22.676°、22.972°、23.225°、23.583°、23.940°、24.571°、24.886°、25.162°、25.476°、25.710°、26.405°、27.393°、28.237°、28.613°、29.007°、31.039°、32.892°、33.858°、34.095°、34.609°、35.000°、35.871°、36.538°、38.433°の角度2θに特徴的な回折ピークを有する、
化合物1の結晶形I。
XRPDスペクトルは、以下の図に表される、
化合物1の結晶形I。
前記化合物1の結晶形Iは、以下の図に表されるDSCスペクトルを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物1の結晶形I。
前記化合物1の結晶形Iは、以下の図に表されるTGAスペクトルを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物1の結晶形I。
化合物1の製造方法であって、
以下のステップを含み、
ここで、
前記ステップは、有機塩基や無機塩基を添加する必要がなく、
反応溶媒は、1,4-ジオキサン又はテトラヒドロフランから選択され、
化合物12とアミノスルホンアミドのモル比は、1:1〜20から選択され、
反応温度は、60℃〜還流温度から選択され、
化合物1は、ジクロロメタン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、n-ヘプタン
、n-ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルにおける１つの単一溶媒もしくはいくつかの溶媒の混合溶媒により再結晶精製される、化合物1の製造方法。
化合物12と前記アミノスルホンアミドのモル比は1：10である、請求項７に記載の化合物1の製造方法。
以下のステップを含み、
ここで、
当該ステップ中のNMMはN−メチルモルホリンであり、THFはテトラヒドロフランであり、
NMMと化合物4のモル比は1〜4:1であり、
化合物8を分離せずに、そのまま次の反応へ投入し、
反応で得られた化合物9Aと化合物9Bとの混合物を、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、シクロヘキサン、n-ヘプタンにおける１つの単一溶媒もしくはいくつかの溶媒の混合溶媒により再結晶し、分離精製することによって、化合物9Aを得る、
請求項７に記載の化合物1の製造方法。
前記NMMと化合物4のモル比は2〜3:1から選択される、請求項９に記載の化合物1の製造方法。
再結晶溶媒は、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、n-ヘプタンの混合溶媒である、請求項９に記載の化合物1の製造方法。
前記再結晶溶媒におけるn-ヘプタン、酢酸エチル、テトラヒドロフランの体積比は（6〜54）:（2〜18）:1である、請求項１１に記載の化合物1の製造方法。
前記再結晶溶媒におけるn-ヘプタン、酢酸エチル、テトラヒドロフランの体積比は18:6:1である、請求項１１に記載の化合物1の製造方法。
以下のステップを含み、
ここで、
当該ステップ中のDMAPは4−ジメチルアミノピリジンであり、
縮合剤は、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDCI）、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウム塩化物（DMC）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HATU）、1,1'-カルボニルジイミダゾール（CDI）から選択され、
反応温度は、-20℃〜10℃から選択され、
化合物3を分離せずに、そのまま次の反応へ投入する、請求項７に記載の化合物1の製造方法。
前記反応温度は、-10℃〜0℃から選択される、請求項１４に記載の化合物1の製造方法。
以下のステップを含み、
反応溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n-ブタノール、tert-ブタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、トルエン、キシレンにおける１つの単一溶媒もしくはいくつかの溶媒の混合溶媒から選択され、化合物4は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n-ブタノール、シクロヘキサン、n-ヘキサン、n-ヘプタン、石油エーテルにおける１つの単一溶媒もしくはいくつかの溶媒の混合溶媒により攪拌結晶化、叩解又は再結晶精製され、
化合物4の攪拌結晶化又は叩解精製の温度は-5℃〜30℃である、
請求項７に記載の化合物1の製造方法。
前記反応溶媒は、トルエンとメタノールの混合溶媒である、請求項１６に記載の化合物1の製造方法。
化合物4の攪拌結晶化又は叩解精製の温度は10℃〜20℃である、請求項１６に記載の化合物1の製造方法。
化合物4は、エタノール/シクロヘキサン、エタノール/n-ヘキサン、エタノール/n-ヘプタン又はエタノール/石油エーテルの混合溶媒により攪拌結晶化、叩解又は再結晶精製される、請求項１６に記載の化合物1の製造方法。
前記混合溶媒において、エタノールと、シクロヘキサン、n-ヘキサン、n-ヘプタン又は石油エーテルの体積比は1:1〜3から選択される、請求項１９に記載の化合物1の製造方法。
前記混合溶媒はエタノール/石油エーテルであり、エタノールと石油エーテルの体積比は3：5である、請求項１９に記載の化合物1の製造方法。
以下のステップをさらに含み、
ここで、
当該ステップ中のTHFはテトラヒドロフランであり、DMAPは4−ジメチルアミノピリジンであり、DCMはジクロロメタンである、請求項７に記載の化合物1の製造方法。
化合物1を、酢酸エチルと石油エーテルの体積比が1:0.5〜2から選択される酢酸エチル、石油エーテルの混合溶媒に添加して再結晶し、又は
化合物1を、酢酸エチルに添加し、加熱還流することにより溶解させ、n-ヘプタンを滴下した後、10℃〜-10℃までに徐々に降温し、結晶化させ、酢酸エチルとn-ヘプタンの体積比は1:0.5〜2から選択されることを含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の化合物1の結晶形Iの製造方法。
前記酢酸エチルと前記石油エーテルの体積比は1:1である、請求項２３に記載の化合物1の結晶形Iの製造方法。
前記酢酸エチルと前記n-ヘプタンの体積比は1:1である、請求項２３に記載の化合物1の結晶形Iの製造方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物1の結晶形Iを、HBVに関連する疾患治療用薬物の製造において使用する方法。