JP6523992B2

JP6523992B2 - 画像取得方法、画像取得装置及び走査型顕微鏡

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Publication number: JP6523992B2
Application number: JP2016036382A
Authority: JP
Inventors: 伸一古田
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Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2019-06-05
Anticipated expiration: 2032-04-06
Also published as: JP2016106268A

Description

本発明は、画像取得方法、画像取得装置及び走査型顕微鏡に関する。

走査型顕微鏡等に用いられるポイントスキャン型の画像取得装置は、物体の観察面を点状の照明光で走査しながら離散的にその物体からの反射光又は蛍光を取得して１枚の画像を構成するポイントスキャンを実施する（例えば、特許文献１参照）。

特開２００４−２１２６００号公報

このようなポイントスキャン型の画像取得装置においては、画像取得開始時刻と画像取得終了時刻とに時間差が発生してしまう。したがって、１枚の画像内の各点の取得時刻が異なるため、スキャン速度に対し、変化の速い物体の画像取得には向いていないという課題があった。

本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、変化の速い物体であってもポイントスキャンにおける時間差を考慮した画像を取得することができる画像取得方法、並びに、この画像取得方法を有する画像取得装置及び走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明に係る画像取得方法は、走査型顕微鏡において、検出した信号を用いて観察対象の画像を２以上取得し、取得した画像を用いて、所定の時刻における観察対象の画像を生成する方法であって、画像の少なくとも第１の領域と第２の領域とにおいて、第１の領域の信号に関する情報を所定の時刻より前の第１の時刻と後の第２の時刻とで少なくとも取得し、第２の領域の信号に関する情報を第１の時刻および第２の時刻と異なる時刻であって所定の時刻より前の第３の時刻と後の第４の時刻とで少なくとも取得し、第１の時刻および第２の時刻で取得された第１の領域の信号に関する情報を用いて、第１の領域の所定の時刻における信号に関する情報を決定し、第３の時刻および第４の時刻で取得された第２の領域の信号に関する情報を用いて、第２の領域の所定の時刻における信号に関する情報を決定し、第１の領域の所定の時刻における信号に関する情報及び第２の領域の所定の時刻における信号に関する情報を用いて、観察対象の所定の時刻における画像を生成することを特徴とする。

また、このような画像取得方法は、第１の領域又は第２の領域の座標を座標（ｉ，ｊ）とし、時刻ｔａ及び時刻ｔｂにおける第１の領域又は第２の領域の信号に関する情報をＰ_i,j（ｔａ）及びＰ_i,j（ｔｂ）としたとき、第１の領域又は第２の領域の所定の時刻である時刻ｔｘにおける信号に関する情報Ｐ_i,j（ｔｘ）を、次式

により算出することが好ましい。但し、ｔａ≦ｔｘ≦ｔｂとする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡に用いられる画像取得装置は、検出された信号を用いて観察対象の画像を取得する画像取得部と、観察対象の所定の時刻における画像を生成する画像処理部と、を有し、画像取得部は、画像の少なくとも第１の領域と第２の領域とにおいて、第１の領域の信号に関する情報を所定の時刻より前の第１の時刻と後の第２の時刻とで少なくとも取得し、第２の領域の信号に関する情報を第の１時刻および第２の時刻と異なる時刻であって所定の時刻より前の第３の時刻と後の第４の時刻とで少なくとも取得して、観察対象の画像を２以上取得し、画像処理部は、第１の時刻および第２の時刻で取得された第１の領域の信号に関する情報を用いて、第１の領域の所定の時刻における信号に関する情報を決定し、第３の時刻および第４の時刻で取得された第２の領域の信号に関する情報を用いて、第２の領域の所定の時刻における信号に関する情報を決定し、第１の領域の所定の時刻における信号に関する情報及び第２の領域の所定の時刻における信号に関する情報を用いて、観察対象の所定の時刻における画像を生成することを特徴とする。

また、このような画像取得装置において、画像処理部は、第１の領域又は第２の領域の座標を座標（ｉ，ｊ）とし、時刻ｔａ及び時刻ｔｂにおける第１の領域又は第２の領域の信号に関する情報をＰ_i,j（ｔａ）及びＰ_i,j（ｔｂ）としたとき、第１の領域又は第２の領域の所定の時刻である時刻ｔｘにおける信号に関する情報Ｐ_i,j（ｔｘ）を、次式

により算出して、観察対象の所定の時刻における画像を生成することが好ましい。但し、ｔａ≦ｔｘ≦ｔｂとする。

また、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源部から照射された照明光により走査手段を用いて観察対象を走査する照明光学系と、観察対象からの光を光検出部に導く集光光学系と、光検出部からの信号を用いて、観察対象の画像を取得する画像取得部と、観察対象の所定の時刻における画像を生成する画像処理部と、を有し、画像取得部は、画像の少なくとも第１の領域と第２の領域とにおいて、第１の領域の信号に関する情報を所定の時刻より前の第１の時刻と後の第２の時刻とで少なくとも取得し、第２の領域の信号に関する情報を第１の時刻および第２の時刻と異なる時刻であって所定の時刻より前の第３の時刻と後の第４の時刻とで少なくとも取得して、観察対象の画像を２以上取得し、画像処理部は、第１の時刻および第２の時刻で取得された第１の領域の信号に関する情報を用いて、第１の領域の所定の時刻における前記信号に関する情報を決定し、第３の時刻および第４の時刻で取得された第２の領域の信号に関する情報を用いて、第２の領域の所定の時刻における信号に関する情報を決定し、第１の領域の所定の時刻における信号に関する情報及び第２の領域の所定の時刻における信号に関する情報を用いて、観察対象の前記所定の時刻における画像を生成することを特徴とする。

本発明に係る画像取得方法、並びに、この画像取得方法を有する画像取得装置及び走査型顕微鏡を以上のように構成すると、変化の速い物体であってもポイントスキャンにおける時間差を考慮した画像を取得することができる。

走査型顕微鏡の構成を説明するための説明図である。観察面の走査方法を説明するための説明図であって、（ａ）は観察面のピクセルと走査方向の関係を示し、（ｂ）は時刻毎に取得されるピクセルを示す。標本の変化と走査される時刻との関係を説明するための説明図であって、（ａ）は時刻毎の標本の変化を示し、（ｂ）は変化する標本の画像を取得したときの状態を示す。標本の変化と画像の取得時刻との関係を説明するための説明図であって、（ａ）は変化する前に取得した画像を示し、（ｂ）は変化の途中で取得した画像を示し、（ｃ）は変化した後に取得した画像を示す。標本の変化と取得画像及び補正画像の関係を説明する説明図であって、（ａ）は標本の輝度の変化を示し、（ｂ）は走査によって所得されるピクセルの輝度値を示し、（ｃ）は取得された画像を示し、（ｄ）は補正された画像を示す。ピクセルｐ３２の時刻ｔ６及び時刻ｔ９に取得された輝度値と、これらの値から求められた時刻ｔ７の輝度値との関係を示す。補正画像の時間分解能を高くした場合の標本の変化と取得画像及び補正画像の関係を説明する説明図であって、（ａ）は標本の輝度の変化を示し、（ｂ）は取得された画像を示し、（ｃ）は補正された画像を示す。制御部の構成を説明する説明図である。制御部による画像取得方法を説明するためのフローチャートである。

以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて走査型顕微鏡の構成について説明する。この走査型顕微鏡１０は、光源装置２０と、この光源装置２０から放射されたレーザ光（照明光）をステージ上に載置された標本６０に照射して走査する走査光学系３０と、標本６０からの蛍光（観察光）を検出する検出部４０と、を有して構成されている。なお、以降の説明において、走査光学系３０の光軸方向をｚ軸とし、このｚ軸に直交する面内で互いに直交する方向をそれぞれｘ軸及びｙ軸とする。

この走査型顕微鏡１０において、光源装置２０は、波長が異なる複数のレーザ光を、同時または個別に射出することが可能に構成された光源を有して構成されている。

走査光学系３０は、光源装置２０側から順に、ダイクロイックミラー３１、走査ユニット３２、スキャンレンズ３３、第２対物レンズ３４、及び、対物レンズ３５を有して構成されている。

また、検出部４０は、ダイクロイックミラー３１の側方に配置されており、このダイクロイックミラー３１側から順に、集光レンズ４１、対物レンズ３５の標本側の焦点面と略共役な位置に配置された遮光板４２、及び、光検出器４３から構成されている。ここで、遮光板４２にはピンホール４２ａが設けられており、このピンホール４２ａは走査光学系３０の光軸を含むように配置されている。なお、光検出器４３としては、例えば、ＰＭＴ（Photo Multiplier Tube:光電子倍増管）が用いられる。

また、この走査型顕微鏡１０には、標本６０の観察面（走査面）においてレーザ光を走査する位置（標本６０上の走査面内の座標）を走査ユニット３２により制御し、光検出器４３で検出された値（検出された光の強度であって、以降の説明では「輝度値」と呼ぶ）を処理して標本６０の観察面の画像を取得する制御部５０が設けられている。

この走査型顕微鏡１０において、光源装置２０から放射された略平行光束であるレーザ光は、ダイクロイックミラー３１を透過し、走査ユニット３２に入射する。この走査ユニット３２は、光軸に直交する方向（上述のｘ軸方向及びｙ軸方向）にレーザ光を２次元的に走査するものであり、例えば、レーザ光を反射することによりこのレーザ光を光軸に直交する面内で所定の方向（この方向をｘ軸方向とする）に偏向させる第１の偏向素子、及び、光軸に直交する面内で第１の偏向素子の偏向方向と略直交する方向（この方向をｙ軸方向とする）に偏向させる第２の偏向素子からなる２つの偏向素子で構成されている。そして、この走査ユニット３２を出射したレーザ光（略平行光束）はスキャンレンズ３３により一次像面Ｉに結像された後、第２対物レンズ３４を通過することにより再び略平行光束となり対物レンズ３５によって標本６０上の対物レンズ３５の焦点面に集光される。なお、標本６０上に集光されたレーザ光は点像となっており、その点像の径は対物レンズ３５の開口数（ＮＡ）で決まる大きさである。

レーザ光が標本６０に照射されると、この標本６０からは蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３５に入射し、この対物レンズ３５で略平行光束となり、第２対物レンズ３４により一次像面Ｉに結像される。さらにスキャンレンズ３３で略平行光束にされて走査ユニット３２に入射し、この走査ユニット３２でデスキャンされて出射し、ダイクロイックミラー３１で反射されて検出部４０内に入り、集光レンズ４１により遮光板４２のピンホール４２ａ上に集光される。この検出部４０において、遮光板４２のピンホール４２ａを通過した光のみが光検出器４３に到達し検出される。

上述のように、遮光板４２のピンホール４２ａは標本６０上の走査面（対物レンズ３５の焦点面）に集光されたレーザ光の点像と共役であり、標本６０上の照射領域（対物レンズ３５の焦点面）から出た観察光（蛍光）はこのピンホール４２ａを通過することができる。一方、標本６０上の他の領域から出た光のほとんどはこのピンホール４２ａ上には集光されず、通過することができない。

以上より、走査光学系３０は、光源部である光源装置２０から放射された照明光により標本６０を走査する照明光学系及び走査手段、並びに、標本６０からの光を検出部４０に導く集光手段の機能を有している。そして、制御部５０が走査ユニット３２の走査に同期されて光検出器４３で検出された光信号を処理することにより、標本６０上のレーザ光の走査位置と光信号から求められる輝度値を用いて、標本６０の走査面（観察面）における二次元的な画像を得ることができる。すなわち、制御部５０は画像取得部及び画像処理部を有する画像取得装置としての機能を有している。これによりこの走査型顕微鏡１０は、高い分解能で標本６０の画像を得ることができる。

それではこのような走査型顕微鏡１０において、画像取得装置である制御部５０によりポイントスキャンを行って、標本６０の観察面（走査面）の画像を取得する方法について説明する。まず、説明を簡単にするために、図２（ａ）に示すように、走査面をｘ軸方向及びｙ軸方向にそれぞれ３分割し、３×３の領域をレーザー光により走査して各領域毎に光検出器４３から出力される信号（観察光の強度である輝度値）を取得し、標本６０の観察面（走査面）の画像を構成する場合について説明する。なお、以降の説明では分割された各領域を「ピクセル」と呼ぶ。また、ここでは、図２（ｂ）に示すように、図２に示すｘｙ平面において、左上のピクセル（ｐ１１）から開始し、ｘ軸方向に走査して右上のピクセル（ｐ１３）に到達すると、ｙ軸方向中段右端のピクセルに移動してｘ軸方向の走査を繰り返し、右下のピクセル（ｐ３３）まで走査を行う場合について説明する。なお、図２（ｂ）に示す横軸は、各ピクセルにおいて、光検出器４３から出力される信号（輝度値）を取得する時刻を表している。

図３（ａ）に示すように、走査面の３×３のピクセルのうち、中列の３つのピクセルに観察する標本が配置されているとする。また、この図３（ａ）に示すように、この標本の走査を時刻Ｔ０に開始したときに、時刻Ｔ３でその状態が変化する（例えば、図３（ａ）に示すように、標本の輝度値が０（白色で表現する）から１００（黒色で表現する）に変化する）とする。そうすると、制御部５０で得られる走査面の画像は図３（ｂ）のようになり、標本の画像のうち、上段のピクセルは輝度値が０の像として取得されるが、中段及び下段のピクセルは輝度値が１００の像として取得されることになる。すなわち、標本の変化と走査時間との関係をまとめると、時刻Ｔ３よりも前に走査面の走査が完了していると図４（ａ）のように変化する前の標本の状態が取得でき、時刻Ｔ３よりも後に走査を開始すると図４（ｃ）のように変化した後の標本の状態が取得できるが、変化している途中で走査を行うと、図４（ｂ）のように、標本の変化を正しく取得できないことになる。

そこで、本実施形態に係る制御部５０は、１画像内のピクセル毎の信号（輝度値）取得時刻の差を補間することにより、変化の速い標本の画像取得を可能にするように構成されている。具体的には、ポイントスキャン型で画像取得した２枚以上の画像を用いて、１画像内の各ピクセルの時刻のずれを補間する。

図５（ａ）は、上述の３×３のピクセルのうち、標本が存在する中列のピクセル（それぞれ、ｐ２１，ｐ２２，ｐ３２とする）の信号（輝度値）取得時刻の変化の状態を示している。なお、この図５においては、走査面の１回の画像（信号、輝度値）取得をフレーム（ｆｒａｍｅ＝ｆ）と呼び、各フレームにおいて上述の中列のピクセルの信号（輝度値）取得時刻（ｔｉｍｅ＝ｔ）だけを記載している。また、この図５に示す標本は上述の図３のように標本全体が同じ時刻（Ｔ３）に変化するのではなく、それぞれの部分が異なる時刻に変化する場合を示している。具体的には、ピクセルｐ１２に相当する部分ではフレームｆ２の（２回目の画像（信号、輝度値）取得の）時刻ｔ５で輝度値が０から１００に変化し、フレームｆ５の時刻ｔ１３で輝度値が１００から０に変化している。同様に、ピクセルｐ２２に相当する部分ではフレームｆ２の時刻ｔ６及びフレームｆ５の時刻ｔ１４で変化し、ピクセルｐ３２に相当する部分ではフレームｆ３の時刻ｔ７及びフレームｆ５の時刻ｔ１５で変化している。

図５（ｂ）に示すように、各フレームの各時刻でそれぞれのピクセルの輝度値が取得される。例えば、フレームｆ１の時刻ｔ１でピクセルｐ１２の輝度値が取得され、時刻ｔ２でピクセルｐ２２の輝度値が取得され、時刻ｔ３でピクセルｐ３２の輝度値が取得される。図５（ｃ）の取得画像は、フレーム毎に、３つのピクセルｐ１２〜ｐ３２の取得された輝度値を示している。

本実施形態に係る制御部５０は、隣接する２つのフレームの画像（ピクセル毎の輝度値）から、その２つのフレームが画像（信号、輝度値）取得された時刻の間の任意の時刻における画像（これを「補正画像」と呼ぶ）を求めるように構成されている。具体的には、時刻ｔにおけるｘ軸方向ｉ番目でｙ軸方向ｊ番目のピクセル（座標（ｉ，ｊ）のピクセル）の輝度値をＰ_i,j（ｔ）とすると、時刻ｔｘのときの輝度値Ｐ_i,j（ｔｘ）を、この時刻ｔｘの前後の時刻ｔａ及び時刻ｔｂに取得されたピクセルの輝度値Ｐ_i,j（ｔａ）及びＰ_i,j（ｔｂ）を用いて次式（１）により求める。但し、ｔａ≦ｔｘ≦ｔｂ（ｔａ≠ｔｂ）とする。

図５（ｄ）は、各フレームの最初の時刻において補間された補正画像を示している。例えば、フレームｆ３は、時刻ｔ７のときの補正画像を示している。図６に示すように、このフレームｆ３において、時刻ｔ７のときのピクセルｐ３２の輝度値は、フレームｆ２の時刻ｔ６において取得された輝度値０と、フレームｆ３の時刻ｔ９において取得された輝度値１００から、式（１）を用いて輝度値３３として求められる。

ここで、各ピクセルの輝度値を求める時刻ｔｘは任意のタイミングを選択することが可能であり、この時刻を細かく分割することで、取得される画像の時間分解能の向上に利用することができる。例えば、図７（ｃ）に示すように、時刻ｔ１〜ｔ１８の全てにおいて上述の式（１）により補間した輝度値を求めると、各時刻における補正画像から、標本の変化を取得することができる。なお、図７（ａ）は標本の輝度値を示し、図７（ｂ）はフレームｆ１〜ｆ７で取得された画像を示している。

図８に制御部５０の構成を示す。この制御部は、光検出器４３から信号を受信するとともに、走査ユニット３２の作動を制御して画像取得を行う画像取得部５１と、光検出器４３から取得した信号（輝度値）を一時的に記憶するバッファメモリ５２と、取得した輝度値から各時刻の補間された画像（補正画像）を生成する画像処理部５３と、この補正画像を記憶する記憶部５４と、から構成される。なお、画像取得部５１は、図示しない発振器からのクロック信号に基づいて走査ユニット３２を制御することにより、上述した順番で照明光を各ピクセルに対応する走査面上の位置に移動させ、そのタイミングで、光検出器４３から出力される輝度値を取得してバッファメモリ５２に記憶するように構成されている。

図９に示すように、画像取得部５１は、標本の画像取得処理を開始すると、まず、最初のフレームの各ピクセルの輝度値をバッファメモリ５２に記憶する（ステップＳ１００）。なお、各ピクセルの輝度値は、その輝度値が取得された時刻と対応付けられて記憶される。この時刻は、それぞれの輝度値が取得された時刻をピクセルと対応付けて記憶するように構成しても良いし、各フレームの画像（信号、輝度値）取得を開始した時刻と終了した時刻とを記憶しておいて、これらの時刻から求めるようにしても良いし、予め各ピクセルが取得される時刻が分かっている場合には、時刻を記憶しなくても良い。この時刻は絶対時刻に限定されることはなく、所定の基準時刻（例えば、上述したように標本の画像（信号、輝度値）取得を開始した時刻）からの相対的な時刻でも良い。

そして、次のフレームになると、最初のピクセルの輝度値を光検出器４３から取得しバッファメモリに記憶する（Ｓ１１０）。そして、画像処理部５３は、当該ピクセルにおいて、前回のフレームで取得した輝度値をバッファメモリ５２から読み出し、今回取得した輝度値とともに、前回の取得時刻から今回の取得時刻までの補間された輝度値を上述の式（１）を用いて算出し、記憶部５４に記憶する（ステップＳ１２０）。補間する時刻（補正画像を生成する時刻）は、図５に示すように、２つのフレーム（前回のフレーム及び現在のフレーム）の間の１時刻でも良いし、図７に示すように複数の時刻でも良い。そして、現在のフレームにおいて全てのピクセルに対して上述の処理が終了したか否かを判断し（ステップＳ１３０）、全てのピクセルに対して終了するまで、上述のステップＳ１１０及びステップＳ１２０の処理を繰り返す。一方、現在のフレームにおいて全てのピクセルに対して処理が終了したと判断すると、画像取得が終了したか否かを判断し（ステップＳ１４０）、次のフレームの画像を取得する場合には、次のフレームの画像を取得する準備をして（ステップＳ１５０）、上述したステップＳ１１０の処理に戻る。なお、バッファメモリ５２は、現在のフレームと前回のフレームの輝度値を記憶するように循環的に使用される。

本実施形態に係る制御部５０の画像取得部５１及び画像処理部５３により以上の処理を行うことにより、少なくとも２フレームの標本の画像を取得することで、これらの２つのフレームの時刻の間の時刻において補間された標本の画像（補正画像）を取得することができ、ポイントスキャン型における時間差を考慮した標本の画像を取得することができる。

なお、以上の説明では、２枚の画像を用いて、線形補間した例を示したが、複数画像を用いて補間することも可能である（この場合、補間式は上述の式（１）に限定されず、最小二乗法やベジエ曲線を用いて補間される）。また、これまでの例では、２枚の画像の間の任意の時刻の画像を推定するにとどまっているが、これらの画像から、画像取得前の画像や、画像取得後の画像を推定することも可能である。例えば、図７の場合において、フレームｆ１、ｆ３、ｆ５の画像を用いて、フレームｆ２の画像（例えば、時刻ｔ４の画像）を演算により求めたり、フレームｆ３，ｆ４，ｆ５の画像からフレームｆ１やフレームｆ６の画像（例えば、時刻ｔ１や時刻ｔ１６の画像）を演算により求めることも可能である。

また、以上の説明における画像処理部５３は、フレーム毎に補正画像を算出して記憶部５４に記憶するように構成した場合について説明したが、まず、画像取得部５１により複数のフレームの画像を取得し、それらの画像を用いて任意の時刻の補正画像を算出するように構成しても良い。

また、以上の説明においては、本実施形態に係る画像取得装置である制御部５０を走査型顕微鏡１０に適用した場合について説明したが、この画像取得装置は走査型顕微鏡における画像取得に限定されることはなく、電子顕微鏡やＣＴ（Computed Tomograph）装置、コピー、ＦＡＸ等に適用することができる。

１０走査型顕微鏡２０光源装置（光源部）３０走査光学系
４０検出部４３光検出器
５０制御部（画像取得装置）５１画像取得部５３画像処理部

Claims

走査型顕微鏡において、検出した信号を用いて観察対象の画像を２以上取得し、
前記取得した画像を用いて、所定の時刻における前記観察対象の画像を生成する方法であって、
前記画像の少なくとも第１の領域と第２の領域とにおいて、前記第１の領域の前記信号に関する情報を前記所定の時刻より前の第１の時刻と後の第２の時刻とで少なくとも取得し、前記第２の領域の前記信号に関する情報を前記第１の時刻および前記第２の時刻と異なる時刻であって前記所定の時刻より前の第３の時刻と後の第４の時刻とで少なくとも取得し、
前記第１の時刻および前記第２の時刻で取得された前記第１の領域の前記信号に関する情報を用いて、前記第１の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を決定し、
前記第３の時刻および前記第４の時刻で取得された前記第２の領域の前記信号に関する情報を用いて、前記第２の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を決定し、
前記第１の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報及び前記第２の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を用いて、前記観察対象の前記所定の時刻における画像を生成することを特徴とする画像取得方法。
前記第１の領域又は前記第２の領域の座標を座標（ｉ，ｊ）とし、時刻ｔａ及び時刻ｔｂにおける前記第１の領域又は前記第２の領域の前記信号に関する情報をＰ_i,j（ｔａ）及びＰ_i,j（ｔｂ）としたとき、前記第１の領域又は前記第２の領域の所定の時刻である時刻ｔｘにおける前記信号に関する情報Ｐ_i,j（ｔｘ）を、次式

により算出することを特徴とする請求項１に記載の画像取得方法。但し、ｔａ≦ｔｘ≦ｔｂとする。
検出された信号を用いて観察対象の画像を取得する画像取得部と、
前記観察対象の所定の時刻における画像を生成する画像処理部と、を有し、
前記画像取得部は、
前記画像の少なくとも第１の領域と第２の領域とにおいて、前記第１の領域の前記信号に関する情報を前記所定の時刻より前の第１の時刻と後の第２の時刻とで少なくとも取得し、前記第２の領域の前記信号に関する情報を前記第１の時刻および前記第２の時刻と異なる時刻であって前記所定の時刻より前の第３の時刻と後の第４の時刻とで少なくとも取得して、前記観察対象の画像を２以上取得し、
前記画像処理部は、
前記第１の時刻および前記第２の時刻で取得された前記第１の領域の前記信号に関する情報を用いて、前記第１の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を決定し、
前記第３の時刻および前記第４の時刻で取得された前記第２の領域の前記信号に関する情報を用いて、前記第２の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を決定し、
前記第１の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報及び前記第２の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を用いて、前記観察対象の前記所定の時刻における画像を生成することを特徴とする走査型顕微鏡に用いられる画像取得装置。
前記画像処理部は、前記第１の領域又は前記第２の領域の座標を座標（ｉ，ｊ）とし、時刻ｔａ及び時刻ｔｂにおける前記第１の領域又は前記第２の領域の前記信号に関する情報をＰ_i,j（ｔａ）及びＰ_i,j（ｔｂ）としたとき、前記第１の領域又は前記第２の領域の前記所定の時刻である時刻ｔｘにおける前記信号に関する情報Ｐ_i,j（ｔｘ）を、次式

により算出して、前記観察対象の前記所定の時刻における画像を生成することを特徴とする請求項３に記載の画像取得装置。但し、ｔａ≦ｔｘ≦ｔｂとする。
光源部から照射された照明光により走査手段を用いて観察対象を走査する照明光学系と、
前記観察対象からの光を光検出部に導く集光光学系と、
前記光検出部からの信号を用いて、前記観察対象の画像を取得する画像取得部と、
前記観察対象の所定の時刻における画像を生成する画像処理部と、を有し、
前記画像取得部は、
前記画像の少なくとも第１の領域と第２の領域とにおいて、前記第１の領域の前記信号に関する情報を前記所定の時刻より前の第１の時刻と後の第２の時刻とで少なくとも取得し、前記第２の領域の前記信号に関する情報を前記第１の時刻および前記第２の時刻と異なる時刻であって前記所定の時刻より前の第３の時刻と後の第４の時刻とで少なくとも取得して、前記観察対象の画像を２以上取得し、
前記画像処理部は、
前記第１の時刻および前記第２の時刻で取得された前記第１の領域の前記信号に関する情報を用いて、前記第１の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を決定し、
前記第３の時刻および前記第４の時刻で取得された前記第２の領域の前記信号に関する情報を用いて、前記第２の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を決定し、
前記第１の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報及び前記第２の領域の前記所定の時刻における前記信号に関する情報を用いて、前記観察対象の前記所定の時刻における画像を生成することを特徴とする走査型顕微鏡。