JP6538883B2

JP6538883B2 - 酸化型β−１，４−グルクロン酸オリゴマーおよびその製造方法と使用

Info

Publication number: JP6538883B2
Application number: JP2017561949A
Authority: JP
Inventors: チェンチンチャン; ジエハオ; シューチャンスン; フイリンチャン
Original assignee: シャンハイグリーンバレーファーマシューティカルカンパニーリミテッド
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2016-05-20
Publication date: 2019-07-03
Anticipated expiration: 2036-05-20
Also published as: KR20190086595A; US10898508B2; KR102002058B1; KR20180012298A; CN104945448B; JP2019131574A; JP6900414B2; JP2018515592A; WO2016188381A1; CN104945448A; CN107922452A; EP3336095A1; EP3336095A4; US20180207194A1

Description

本発明は、医薬化合物の技術分野に属し、具体的に、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーおよびその製造方法と使用に関する。

セルロースは、重合度が3000〜5000で、β1→4グリコシド結合によって結合する直鎖のグルカンで、分子構造が直線状で、一定の強度および剛性を有し、希酸または塩基によって加水分解されにくく、植物の細胞壁の主要構成成分である。ヒトおよび肉食系動物の体内に含まれるβ-グルコシダーゼが少ないため、セルロースを消化して利用することができない。微晶質セルロース（MCC）は精製された、部分的に分解したセルロースで、主要成分はβ-1,4-グリコシド結合によって結合する直鎖の多糖類物質で、白色で、無臭・無味で、多孔微粒子からなる結晶粉末で、セルロースの使用効率を向上させ、低い重合度および大きい比表面積などの特殊な性質を有するため、製薬、化粧品、食品、軽化学工業などの産業で幅広く応用されている。

グルクロン酸は、よく見られる糖類分子で、体内でグリコサミノグリカンのグリコシル基を構成する一部として、たとえばヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸などがあり、小分子配糖体のグリコシル基部分にも現れるが、自然界にはグルクロン酸のポリマーまたはオリゴマーが存在しない。

近年、生活レベルの向上および人口構造の日々の老齢化に伴い、脳血管疾患の発症率および死亡率が上昇する傾向にあり、すでに死亡の要因の一つになっている。中でも、虚血性脳血管疾患は虚血性の種類における大半を占めている。現在、脳虚血疾患を好適に治療する薬物の種類は漢方薬組成物、漢方薬などがあるが、臨床治療効果はまだ検証が必要であるため、新規な抗脳虚血疾患薬の研究は重要な意義を有する。

上記既存技術に存在する欠陥に鑑み、本発明は酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーおよびその製造方法と使用を提供する。本発明において、自然界に豊富に存在するセルロースを利用し、臭化ナトリウム（NaBr）-2,2,6,6-テトラメチルピペリジンオキシド（TEMPO）-次亜塩素酸ナトリウム（NaClO）の酸化系で作用させ、ヒドロキシ基を酸化してグルクロン酸を形成させると同時に、反応条件を制御することによって末端が開環した酸化型グルクロン酸オリゴマーを製造する。発明者は、すでに、当該化合物は1μMの濃度で顕著に酸素-グルコース欠乏海馬細胞の増殖率を向上させ、かつ顕著な投与量依頼性があり、このような化合物は顕著な抗脳虚血活性を有し、潜在の抗脳虚血薬になる可能性があることを証明した。

本発明の目的は、以下の技術方案によって実現される。
本発明の一つの側面では、重合度が1〜20糖で、一般式Iの構造を有する、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを提供する。

（ただし、n = 0〜19、m = 0、1または2である。）
本発明のもう一つの側面では、上記の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの混合物であって、一般式I'の構造を有する酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーかるなるものを提供する。

（ただし、n'およびm'はそれぞれ混合物における各グルクロン酸オリゴマーのnおよびmの平均値で、n'は0〜19.0から、m'は0〜2.0から選ばれる。）n'およびm'は整数でもよく、非整数でもよく、混合物における各グルクロン酸オリゴマーのnおよびmのモル量に基づいた算術平均値である。）
本発明のさらにもう一つの側面では、上記の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーまたはその混合物の製造方法であって、
（1）微晶質セルロース（MCC）粉末を量って、マーセル化処理によってマーセル化されたMCC溶液を得、濃度が10-20 mg/mlである工程と、
（2）工程（1）で得られたマーセル化されたMCC溶液に順に2,2,6,6-テトラメチルピペリジンオキシド（TEMPO）および臭化ナトリウムを入れ、さらに塩基性pH調整剤でpHを10〜11に調整した後、次亜塩素酸ナトリウム溶液を入れて40〜80℃の条件で5〜10時間反応させ、最後に有機溶媒を入れて反応を終止させる工程と、
（3）500Daの透析バッグにおいて透析し、濃縮し、冷凍乾燥することによって、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの混合物を得るか、あるいは任意にクロマトグラフィーによって分離して単独の前記酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを得る工程と、
を含む方法に関する。

また、本発明は、本発明の一般式Iの酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーまたはその混合物と、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む組成物に関する。
また、本発明のもう一つの側面では、抗脳虚血薬または脳神経保護薬の製造における本発明の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーまたはその混合物の使用を提供する。これらは、卒中、心筋梗塞、脳ショック、新生児窒息や脳外傷によるニューロンの虚血性損傷の治療または予防に使用することができる。

また、本発明のもう一つの側面では、被験者のニューロンの虚血性損傷を治療または予防する方法あるいは被験者の脳神経を保護する方法であって、必要な被験者に有効量の前記の一般式Iの酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーまたはその混合物を投与することを含む方法を提供する。

また、本発明は、ニューロンの虚血性損傷を治療または予防する薬剤あるいは脳神経を保護する薬剤としての一般式Iの酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーまたはその混合物を提供する。

上記方案において、前記ニューロンの虚血性損傷は、卒中、心筋梗塞、脳ショック、新生児窒息や脳外傷によるものである。
本発明の突出した効果は、自然界で豊富に存在するセルロースを原料として酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを製造することができる、製造方法が簡単、条件が温和、コストが低い、産業化しやすいといったことを含む。同時に、このような化合物は、顕著な抗脳虚血活性を有し、1μMで顕著に酸素-グルコース欠乏海馬細胞の増殖率を向上させ、かつ顕著な投与量依頼性があり、抗脳虚血、たとえば卒中、心筋梗塞、脳ショック、新生児窒息や脳外傷によるニューロンの虚血性損傷の潜在薬物になる可能性がある。

以下、本発明の技術方案がより理解・把握しやすいように、実施例や図面を参照し、本発明の具体的な実施形態をさらに詳しく説明する。

図1は、実施例5における酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーのトータルイオンクロマトグラム（TIC）および210 nmにおける紫外線スペクトルである。図2は、実施例5におけるピーク0の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの11および10糖の質量分析グラフである。図3は、実施例5におけるピーク1の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの9糖の質量分析グラフである。図4は、実施例5におけるピーク2の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの8糖の質量分析グラフである。図5は、実施例5におけるピーク3の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの7糖の質量分析グラフである。図6は、実施例5におけるピーク4の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの6糖の質量分析グラフである。図7は、実施例5におけるピーク5の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの5糖の質量分析グラフである。図8は、実施例5におけるピーク6の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの4糖の質量分析グラフである。図9は、実施例5におけるピーク7の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの3糖の質量分析グラフである。図10は、実施例5におけるピーク8の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの2糖の質量分析グラフである。図11は、実施例5におけるピーク8の一段階の質量分析グラフ、すなわち、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの1糖の質量分析グラフである。図12は、実施例5における酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの12糖〜20糖（すなわちdp12〜dp20）の質量分析グラフである。図13は、実施例6における酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの核磁気共鳴水素スペクトルである。図14は、実施例6における酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの核磁気共鳴炭素スペクトルである。図15は、実施例7における酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの正常マウスの海馬細胞に対する作用である。図16は、実施例7における酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの酸素-グルコース欠乏マウスの海馬細胞に対する作用である。

具体的な実施形態
以下、本発明の方法を具体的に実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

本発明の第一の側面は、重合度が1〜20糖で、一般式Iの構造を有することを特徴とする酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーに関する。

（ただし、nは0〜19から、mは0、1または2から選ばれる。）
ここで、m=0の場合、末端のグルコース分子は酸化によって2つの-CH(OH)-単位が脱去されたことを、m=1の場合、末端のグルコース分子は酸化によって1つの-CH(OH)-単位が脱去されたことを、m=2の場合、末端のグルコース分子は-CH(OH)-が脱去されず、ヒドロキシ基の酸化だけが生じたことを表す。一つの酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマー、すなわち、nがある数値の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーにおいて、mが0、1および2の産物は混在してもよく、単独で存在してもよい。異なるm値の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーは類似の生物活性を有する。

本発明の一つの好適な実施形態において、nが1〜9、すなわち、2糖〜10糖の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーは、いずれも本発明にて分離されて特徴付けられる。より具体的に、式Iの酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーにおいて、nが20場合、酸化1糖に、nが1の場合、酸化2糖に、nが2の場合、酸化3糖に、nが3の場合、酸化4糖に、nが4の場合、酸化5糖に、nが5の場合、酸化6糖に、nが6の場合、酸化7糖に、nが7の場合、酸化8糖に、nが8の場合、酸化9糖に、nが9の場合、酸化10糖に、nが10の場合、酸化11糖に該当する。これらの酸化した糖オリゴマーは、一種または複数種の混合物の様態で使用することができる。

本発明の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの特徴は、末端が開環した異なる炭素原子数のグルクロン酸オリゴマーの構造を有することにある。一つの実施形態において、末端が開環した異なる炭素原子数のグルクロン酸オリゴマーは混合物の様態で存在してもよく、異なる重合度のグルクロン酸オリゴマーも混合物の様態で存在してもよい。

本発明のもう一つの側面では、以下の一般式I'の構造を有する、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーに関する。

（ただし、m'およびn'はそれぞれ混合物における各グルクロン酸オリゴマーのnおよびmの平均値で、n'は0〜19.0から、m'は0〜2.0から選ばれる。）好ましくは、n'は0〜10.0から、m'は0.5〜1.8から選ばれ、より好ましくは、n'は0〜10.0から、m'は0.8〜1.5から選ばれる。

もう一つの好適な実施形態において、本発明の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの混合物に、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の末端が開環したβ-1,4-グルクロン酸の1〜11個の重合体（nが0〜10のものに該当する）が含まれ、ここで、m'は0.8〜1.5である。

本発明の酸化方法は、セルロースのマーセル化、セルロース溶液の酸化、および酸化産物の後処理による酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの形成といった工程を含む。
1．セルロースのマーセル化
本発明の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを製造するために、原料である微晶質セルロースをマーセル化させ、溶液とし、溶液の濃度は約10〜20 mg/mLである。出願者は、溶液の濃度が高すぎると、酸化過程が完成しにくく、溶液の濃度が低すぎると、酸化産物が不均一になりやすいことを見出した。

2．セルロース溶液の酸化
本発明は、臭化ナトリウム(NaBr)-2,2,6,6-テトラメチルピペリジンオキシド（TEMPO）-次亜塩素酸ナトリウム（NaClO）の酸化系を使用する。反応条件の調整によって、当該酸化系の酸化性は特に本発明のβ-1,4-グルクロン酸オリゴマーを得るに適する。通常の酸化剤と比べ、本発明の酸化系は酸化反応をより完全にさせ、末端が開環した反応産物を得ることができるが、反応系の均一性を損なわない。また、モル量で換算する酸化系における各物質の比率は、たとえばTEMPO：NaBr=1:5〜1:50で、セルロースにおけるグルコース単位：活性NaClO = 1:0.5〜1:5で、TEMPO：セルロースにおけるグルコース単位= 1:1〜1:5でもよい。本発明の一つの実施形態において、次亜塩素酸ナトリウム溶液における次亜塩素酸ナトリウムの重量百分率は1〜20％、好ましくは2〜15％、より好ましくは3〜12％である。

酸化反応は塩基性条件で行われ、研究では、最適なpH値の範囲は10〜11で、反応系のpH値が高すぎると、酸化効率が低下するが、pH値が低すぎると、酸化の発生に不利である。反応のpH値は塩基性化合物によって制御され、最適な塩基性化合物はNaOH溶液である。NaOHの溶液は特に限定されない。

本発明の酸化反応に適する酸化温度は40〜80℃、好ましくは50〜70℃、より好ましくは52〜68℃であるが、この温度の範囲内で酸化を行うのは、残った不要な酵素を除去し、同時に末端が開環したグルクロン酸を得ることに有利である。どのような理論にも関わらず、発明者は、反応温度が40℃未満であることは、末端が開環した酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを得ることに不利であることを見出した。反応温度が高すぎると、原料の生物活性を損ない、反応産物の利用に不利である。

有機溶媒を入れて反応を終止させた後、酸化して得られた産物溶液を精製し、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを得る。好適な精製手段として、透析法で得られたグルクロン酸オリゴマーを精製し、特に、使用された材料を透析して分子量が500Daの物質を残すことによって、本発明のオリゴ糖を精製することができる。精製は、ほかの本分野で既知の手段を使用してもよいが、透析で得られるグルクロン酸オリゴマーの純度が99％超、より好ましくは99.5％以上になるようにできればよい。

また、本発明は、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーまたはその混合物を活性化合物成分として抗脳虚血薬の製造における使用に関する。
脳血管疾患は、我が国で高齢者の死亡につながる一番の病因で、世界衛生戦略の研究の重点の一つでもある。脳血管疾患では、虚血性疾患の発症率が一位を占め、通常、軽度の虚血/酸欠の場合、脳の代償機序は中枢神経系を損傷から保護するが、虚血の程度が重くなると、不可逆的な神経損傷が生じ、一連の臨床症状につながり、死亡に至る。臨床では、脳血管意外（たとえば卒中）、心筋梗塞、脳ショック、新生児窒息や脳外傷はいずれもニューロンの虚血性損傷を引き起こす可能性がある。そのため、脳虚血症状を緩和し、脳細胞の生存率を向上させる天然由来の物質の開発は有意義である。

本発明で使用される脳虚血症状を測定する細胞モデルは、HT-22細胞から酸素-グルコース欠乏の条件で生じた細胞（OGDモデル）である。HT-22細胞は、マウスの海馬ニューロンの細胞系で、マウスT4細胞系の一つのサブクローンで、海馬ニューロンの特性を有する。関連の内容は、たとえばJeney Ramirez-Sanchezら, Neurochemistry International 90 (2015) 215-223, “Neuroprotection by JM-20 against oxygen-glucose deprivation in rat hippocampal slices: Involvement of the Akt/GSK-3β pathway”；Xiao-Jing Liら, Journal of Ethnopharmacology 141 (2012) 927- 933, Neuroprotective effects of TongLuoJiuNao in neurons exposed to oxygen and glucose deprivation; TIAN-ZHI ZHAOら, Neuroscience 328 (2016) 117-126, “GPER1 Mediates Estrogen-Induced Neuroprotection Against Oxygen-Glucose Deprivation In The Primary Hippocampal Neurons”などを参照する。

本発明の発明者は、一般式Iの酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーまたはその混合物は、脳虚血症状を改善し、虚血・酸欠の脳細胞の生存率を増やすことができることを見出した。また、本発明の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーは天然産物由来のもので、吸収と利用が容易である。

本発明は、上記のような酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーと、任意に選ばれる薬学的に許容される賦形剤とを含む組み合わせ薬物を提供する。
様々な比率で活性成分を含有する色々な組み合わせ薬物を製造する方法は既知であるか、本発明の公開内容によって当業者に当然である。たとえばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Martin, E.W., ed., Mack Publishing Company, 19th ed. (1995)に記載の通りである。前記薬物組成物を製造する方法は、適切な薬学的賦形剤、担体、希釈剤などを配合することを含む。

既知の方法で本発明の薬物製剤を製造するが、通常の混合、溶解または冷凍乾燥の方法を含む。
本発明の薬物組成物は、患者に選ばれた施用様態に適する様々な経路、たとえば経口または胃腸外（静脈内、筋肉内、局部または皮下の経路）によって施用される。

そのため、本発明の組み合わせ薬物は薬学的に許容される担体（たとえば不活性希釈剤または食用可能な担体）と合わせて全身に、たとえば経口投与によって施用することができる。これらは硬殻または軟殻のゼラチンカプセルに封じ、錠剤にプレスすることができる。経口投与による治療の施用に対し、本発明の活性化合物は、一種または複数の賦形剤と合わせ、呑めるような錠剤、トローチ錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、丸剤などの形態で使用することができる。このような組成物および製剤は少なくとも0.1％の活性化合物を含む。もちろん、このような組成物および製剤の比率は変わるが、所定の単位剤形重量の約1％〜約99％を占めてもよい。このような治療に有用な組成物において、活性化合物の量は、有効投与量のレベルが得られるようなものである。

錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、たとえばトラガカント、アラビアゴム、コーンスターチやゼラチンのようなバインダー、たとえばリン酸水素二カルシウムのような賦形剤、たとえばコーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸のような崩壊剤、たとえばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、そしてショ糖、ペクチン、乳糖やアスパルテームのような甘味料、またはたとえばペパーミント、冬緑油やチェリーフレーバーのような矯味剤を含んでもよい。単位剤形がカプセルの場合、以上の種類の材料以外、さらに液体担体、たとえば植物油やポリエチレングリコールを含んでもよい。様々なほかの材料も存在してもよく、コーティングとして、またはほかの様態で固体の単位剤形の物理的形態を変えてもよい。たとえば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はゼラチン、ロウ、ラックや糖などでコーティングしてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物を、甘味料としてショ糖またはペクチンを、防腐剤としてp-ヒドロキシ安息香酸メチルまたはp-ヒドロキシ安息香酸プロピルを、染料および矯味剤（たとえばチェリーフレーバーやオレンジフレーバー）を含んでもよい。もちろん、いずれの単位剤形の製造に用いられるいずれの材料も薬学的に許容されるもので、かつ使用量は無毒の量である。また、活性化合物は、徐放製剤や徐放装置に配合してもよい。

活性化合物は、注入または注射によって静脈内または腹膜内に施用してもよい。活性化合物またはその塩の水溶液を調製し、任意に無毒な界面活性剤を配合してもよい。グリセリン、液体ポリエチレングリコール、グリセリン三酢酸エステルおよびその混合物ならびに油における分散剤を調製してもよい。通常の貯蔵・使用の条件で、微生物の生長を防止するために、これらの製剤は防腐剤を含む。

注射または注入に適する薬物剤形は、無菌の注射または注入が可能な溶液または分散剤の即座製剤に適する活性成分（任意にリポソームに封じられる）を含有する無菌水溶液または分散剤または無菌粉末を含む。すべての場合、最終の剤形は生産および保存の条件で無菌で、液体で、かつ安定したものでなければならない。液体担体は、溶媒または液体分散媒体でもよいが、たとえば水、エタノール、多価アルコール（たとえば、クリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、無毒なグリセリンエステルおよびこれらの適切な混合物を含む。たとえば、リポソームの形成、分散剤の場合所要の粒子の大きさを維持すること、または界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。様々な抗細菌剤や抗真菌剤（たとえばp-ヒドロキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって微生物を予防する作用を果たすことができる。多くの場合、たとえば糖、緩衝剤や塩化ナトリウムのような等張化剤を含むことが好ましい。吸収遅延剤を使用した組成物（たとえば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチン）によって注射が可能な組成物の吸収を遅延させることができる。

適切な溶媒における所要量の活性化合物を必要な以上で挙げられた様々なほかの成分と配合した後、ろ過滅菌を行い、注射が可能な無菌溶液を調製する。無菌注射溶液の無菌粉末の製造に使用される場合、好適な製造方法は真空乾燥および冷凍乾燥の技術で、活性成分および任意のほかに必要な前の無菌ろ過溶液に存在した成分の粉末が得られる。

有用な固体担体は、粉砕された固体（たとえばタルク、クレー、微晶質セルロース、シリカ、酸化アルミニウムなど）を含む。有用な液体担体は、水、エタノールまたはエチレングリコールまたは水-エタノール/エチレングリコール混合物を含み、本発明の組み合わせ薬物は任意に無毒な界面活性剤によって有効な含有量でそれに溶解または分散させることができる。補助剤（たとえばフレーバー）およびほかの抗微生物剤を入れることによって所定の使用に適する性質を最適化することができる。

増ちょう剤（たとえば合成された重合体、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪族アルコール、変性セルロースまたは変性無機材料）は液体担体とコーティングが可能なペースト剤、ゲル、軟膏、石鹸などの形成に使用し、直接使用者の皮膚に使用することもできる。

化合物またはその混合物の治療に必要な量は、化合物自身だけでなく、投与形態、治療すべき疾患の本質および患者の年齢と状態にもよるが、最終的に現場の医師または臨床医師の決定によって決まる。

上記製剤は単位剤形で存在してもよく、当該単位剤形は単位製剤量を含有する物理的分散単位で、ヒトおよびほかの哺乳動物への投与に適する。単位剤形はカプセルまたは錠剤でもよく、多くのカプセルまたは錠剤でもよい。関連の具体的な治療によって、活性成分の単位製剤量は約0.1〜約1000 mgまたはそれ以上の間で変化または調整することができる。

下記実施例に記載の実験方法は、特に説明しない限り、いずれも通常の方法で、前記試薬および材料は、特に説明しない限り、いずれも市販品として入手できるものである。
実施例1 酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの製造方法
（1）1 gのMCC粉末を量って、50 mlの10％NaOH溶液でマーセル化処理を行い、マーセル化されたMCC溶液を得た。

（2）工程（1）で得られたマーセル化されたMCC溶液に順に5 mgのTEMPOおよび50 mgの臭化ナトリウムを入れ、10％のNaOH溶液でpHを10に調整し、活性次亜塩素酸ナトリウムに換算した濃度が5重量％になるように5mlの次亜塩素酸ナトリウム溶液を入れ、55℃の条件で5時間反応させ、無水エタノールを入れて反応を終止させた。

（3）500Daの透析バッグにおいて透析し、濃縮し、冷凍乾燥して酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを得た。
実施例2 酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの製造方法
（1）1 gのMCC粉末を量って、50 mlの10％NaOH溶液でマーセル化反応を行い、マーセル化されたMCC溶液を得た。

（2）工程（1）で得られたマーセル化されたMCC溶液に順に20 mgのTEMPOおよび250 mgの臭化ナトリウムを入れ、10％のNaOH溶液でpHを10に調整し、活性次亜塩素酸ナトリウムに換算した濃度が5重量％になるように10mlの次亜塩素酸ナトリウム溶液を入れ、40℃の条件で8時間反応させ、無水エタノールを入れて反応を終止させた。

（3）500Daの透析バッグにおいて透析し、濃縮し、冷凍乾燥して酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを得た。
実施例3 酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの製造方法
（1）1 gのMCC粉末を量って、100mlの10％NaOH溶液でマーセル化反応を行い、マーセル化されたMCC溶液を得た。

（2）工程（1）で得られたマーセル化されたMCC溶液に順に50 mgのTEMPOおよび500 mgの臭化ナトリウムを入れ、30％のNaOH溶液でpHを11に調整し、活性次亜塩素酸ナトリウムに換算した濃度が5重量％になるように15 mlの次亜塩素酸ナトリウム溶液を入れ、70℃の条件で3時間反応させ、メタノールを入れて反応を終止させた。

（3）500Daの透析バッグにおいて透析し、濃縮し、冷凍乾燥して酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを得た。
実施例4 酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの製造方法
（1）1 gのMCC粉末を量って、100mlの10％NaOH溶液でマーセル化反応を行い、マーセル化されたMCC溶液を得た。

（2）工程（1）で得られたマーセル化されたMCC溶液に順に50 mgのTEMPOおよび600 mgの臭化ナトリウムを入れ、50％のNaOH溶液でpHを11に調整し、15 mlの次亜塩素酸ナトリウム溶液を入れ、60℃の条件で8時間反応させ、メタノールを入れて反応を終止させた。

（3）500Daの透析バッグにおいて透析し、濃縮し、冷凍乾燥して酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを得た。
実施例5 酸化型α-1,4-グルクロン酸オリゴマーの質量分析
5.1 方法
実施例1で得られた2 mgの酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを量って1 mlの純水で溶解させた後、0.22μmのミクロポアフィルターでろ過した後、超高速液体クロマトグラフィー/四重極飛行時間型質量分析（UHPLC/Q-TOF-MS）を行った。

UHPLC/Q-TOF-MS分析はAgilent 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS（アジレント社、米国）システムを使用した。そのクロマトグラフィーの条件は、ACQUITY UPLC BEH125分子排除クロマトグラフィーカラム（4.6×300 mm，Waters）、検出波長：210 nm、移動相：Aは50mMの酢酸アンモニウム水溶液で、Bはメタノールで、比率は80％Aで、流速：0.1ml/minであった。質量分析の条件は、マイナスイオンモード、走査範囲：100〜3000、乾燥ガス温度：350℃、乾燥ガス流速：8L/min、キャピラリー電圧：3500V、フラグメンター電圧：80Vであった。

5.2 結果
酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーをUHPLC/Q-TOF-MSによって分析したところ、以下のようなTIC図および紫外線スペクトル（図1に示す）を得た。図1から、各ピークは規則的な波状に分布することがわかり、使用したのは分子排除クロマトグラフィーカラムであるため、波状ピークは重合度の大きい順で分布すると推測される。さらに各クロマトグラフィーピークに相応する一段階の質量分析グラフ（図2〜11）によってその構造が推測される。図2はピーク0の一段階の質量分析グラフで、ここで、m/z 655.7744、645.7753および635.7728はいずれも3つの電荷を帯び、計算して得られたこの三つの信号で表される化合物の分子量はそれぞれ1970、1940および1910 Daで、相応する構造は11糖の酸化型グルクロン酸オリゴマーで、式Iで表される（n=10、m=0、1または2）。また、当該質量分析グラフに3つの電荷を帯びた質量分析信号m/z 597.0981、587.0991および577.0951と2つの電荷を帯びた896.1517、881.1502および866.1462があり、計算したところ、これらは分子量がそれぞれ1794、1764および1734 Daである三つの10糖の酸化型グルクロン酸オリゴマーで、式Iに該当する（n=9、m=0、1または2）。同様に、図3〜11はピーク1〜9の質量分析グラフで、分析したところ、構造はそれぞれ9糖〜1糖の酸化型グルクロン酸オリゴマーで、式Iで表される（n=8→0、m=0、1または1）。クロマトグラムでは、12〜20糖は有効に分離しなかったが、質量分析では、はっきりとした信号があり、図12に示す通りである。

実施例6 酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの核磁気共鳴による構造の確認
6.1 方法
正確に実施例1で得られたサンプル25 mgを量って0.5 mlの重水（D≧99.96％）で溶解させ、内部標準であるトリメチルシリルプロパン酸ナトリウム（TSP）の濃度は0.2μg/mlで、600MHzの核磁気共鳴装置（Agilent、米国）によって分析した。水素スペクトルの走査時間は1hで、試験温度は室温であった。炭素スペクトルの走査時間は12h以上で、試験温度は室温であった。

6.2 結果
核磁気共鳴の結果は図13（1H-NMR）、図14（13C-NMR）に示す。水素スペクトルから、a（4.70〜4.71ppm）は開環したアルドウロン酸と直接連結するか隣接する閉環のβ配置のグルクロン酸の1位Hを表すことがわかる。領域b（4.47〜4.60ppm）は開環したアルドウロン酸と離れた閉環のβ配置のグルクロン酸の1位Hおよびグルクロン酸の還元末端が開環して2つの-CH2O-が脱去したカルボキシ基のα位Hを表すことがわかる。炭素スペクトルから、さらに、領域1はカルボキシ基の炭素ピークで、領域2は異なる化学環境における閉環グルクロン酸の1位Cであることがわかる。水素スペクトル、炭素スペクトルを合わせて分析したところ、βグルコース構造単位における6位はカルボキシ基に酸化され、かつグルクロン酸の還元末端が開環してある程度の分解が伴ったことがわかり、質量分析の結果がさらに証明された。

実施例7 酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの酸素‐グルコース欠乏（OGD）条件におけるHT-22細胞に対する影響
7.1 OGDモデルの構築および実験の群分け
正常に培養したHT-22細胞を取り、細胞数を2×104個/mlに調整し、100μl/ウェルで96ウェールプレートに接種し、各群に4つの平行ウェルを設けた（n=4）。12h予備培養した後、投与群はそれぞれ10μLの実施例1で得られた産物を培地で調製した異なる濃度のサンプル（1、10、100μM）を入れ、正常群は同じ体積の培地を入れた。培養プレートを5％ CO2、37℃の恒温インキュベーターで12h培養し、観察して細胞生存率を測定することによってサンプルの正常に培養したHT-22細胞に対する影響を確認した。

正常に培養したHT-22細胞を取り、元の培養液を吸い捨て、細胞を無糖DMEM培養液で2回洗浄し、DMEM無糖培養液を入れて細胞数を2×104個/mlに調整した。100μl/ウェルで96ウェルプレートに接種した。投与群はそれぞれ10μlの実施例1で得られた産物を培地で調製した異なる濃度のサンプル（1、10、100μM）を入れ、モデル群は同じ体積の培養液を入れた。培養プレートを酸素欠乏缶（95％N2、5％ CO2を吹き込んだもの）に置き、37℃で12h恒温培養し、観察して細胞生存率を測定することによってサンプルのOGDにおけるHT-22細胞に対する影響を確認した。

7.2 MTT法による細胞の生存率の測定
上記各群の細胞の培養が終了後、各ウェルに10μLのMTT（5mg/ml）溶液を入れ、続いて4h培養し、100μlの10％SDSを入れ、紫色の結晶が完全に溶解した後、その570nmにおけるOD値を測定し、そして細胞生存率を算出した。

7.3 結果
MTT法で算出した各群の細胞生存率は表1、2および図15、16に示す。表1および図15から、低、中、高の投与量の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを入れた後の細胞の生存率は正常群と比べ、有意差がなかったことがわかり、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーはHT-22細胞に対して毒性がないことが示された。

表2から、モデル群はコントロール群と比べ、HT-22細胞の生存率が顕著に低下した（p＜0.001）ことがわかり、OGDは細胞の生存に対して顕著な抑制作用を有することが示された。一方、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーを入れた後の細胞生存率はモデル群と比べて顕著に上昇し（p＜0.01）、かつ優れた投与量依頼性が伴い、酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーはHT-22細胞の生長・生存を促進する作用を有することが示された。

データは平均値±標準誤差で示す。

コントロール群と比べ、p＜0.05で有意差がある（LSDテスト）。

データは平均値±標準誤差で示す。

###はコントロール群と比べてp＜0.001であることを表す（LSDテスト）。
**はモデル群と比べてp＜0.01であることを表す（LSDテスト）。
***はモデル群と比べてp＜0.001であることを表す（LSDテスト）。

このように、本発明の酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマー混合物は優れた抗脳虚血作用を有することがわかる。実験から、各分離された酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーは類似の実験でも類似の結果があり、抗脳虚血薬の製造に応用することができることがわかる。

本発明はまだ多くの実施形態があり、同等の変換または同等効果の変換によるすべての技術方案はいずれも本発明の保護範囲に含まれる。

Claims

抗脳虚血薬の製造のための酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの使用であって、
重合度が３〜20糖で、一般式Iの構造を有することを特徴とする酸化型β-1,4-グルクロン酸オリゴマーの使用。

（ただし、nは２〜19から、mは0、1または2から選ばれる。）