JP6545926B2 - 手足症候群治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、手足症候群（ｈａｎｄ−ｆｏｏｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を治療または予防するための組成物に関する。

手足症候群は、抗癌剤等の化学療法薬の投与に起因して発症する皮膚疾患である。一般的な症状は、手のひらおよび足の裏の限定された範囲に現れ、チクチクするような感覚異状から、多くの場合に疼痛、発疹、紅斑を伴う。何ら対処をしない場合は重症化して、患者のＱＯＬの低下に伴って原因薬剤による治療継続が難しくなるなど、本来の治療に支障をきたす場合も少なくない。

手足症候群の治療方法として、手足の安静；保湿を目的とした尿素軟膏；ヘパリン類似物質製剤またはビタミン含有軟膏などの外用剤を用いた局所治療；全身療法としてプロドニゾロンやデキサメタゾン、または塩酸ピリドキシン（ビタミンＢ６）の内服（非特許文献１）などが提案されているが、これらはいずれも対処療法であり、手足症候群の根治を図るものではない。

現在までに、手足症候群の発症メカニズムとして、皮膚基底細胞の増殖能の阻害、血管からの抗癌剤漏出（特許文献１）、エクリン汗腺からの抗癌剤分泌（非特許文献２）などがその原因の一つである可能性も示されているが、抗癌剤とその発症との因果関係は不明である。

多くの抗癌剤はＤＮＡ損傷を引き起こし、癌細胞のアポトーシスを誘導する。癌のアポトーシスは、抗癌剤によって直接的または間接的に生じた活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；以下、「ＲＯＳ」とも称する）によって誘導されることが報告されている（非特許文献３〜８）。さらに、ＲＯＳによる酸化損傷は、ヒト全骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０細胞およびＨＬ−６０由来カタラーゼ過剰発現ＨＰ１００細胞を用いた実験において、銅（ＩＩ）イオンの存在下で増幅されたことが報告されている（非特許文献６および９）。

米国特許第６０６００８３号

Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ，８巻，ｐ５７−６３，１９９０年 Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６巻、１２１０〜１２１１、２００５年 Ｈｉｒａｏｋａ Ｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２，１９６１−１９６８ Ｔａｄａ−Ｏｉｋａｗａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４４２，６５−６９ Ｖａｒｂｉｒｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３１，５４８−５５８ Ｍｕｒａｔａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００４） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３７，７９３−８０２ Ｓａｄｚｕｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５） ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ，１２５，１４９−１５７ Ｇｅｗｉｒｔｚ．Ｄ．Ａ．，（１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，７２７−７４１ Ｍｕｒａｔａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００４） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３７，７９３−８０２．

上記のとおり、原因薬剤の継続や患者のＱＯＬ向上などの点で重大な手足症候群の治療または予防ニーズの存在にも関わらず、その発症機序は不明であり、有効な対処法が存在しない状況にある。そこで本発明は、手足症候群の治療または予防に有効な新規組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、抗癌剤等の化学療法剤の投与に伴って発生するＲＯＳが、手足症候群の炎症症状の発現に密接に関与していることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は以下の特徴を包含する。

（１）活性酸素を捕捉または除去する物質を有効成分とする、手足症候群を治療または予防するための組成物。

（２）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキシドジスムターゼ、ビリルビン、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸若しくはその誘導体、システイン、グルタチオン、リノール酸、トコフェロール若しくはその誘導体、α−カロテン、β−カロテン、フラボノイド、尿酸、チオレドキシン、またはフィトケミカルから選択される少なくとも１種である前記（１）記載の組成物。

（３）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキサイドアニオンを標的とするものであることを特徴とする、前記（１）記載の組成物。

（４）活性酸素を捕捉または除去する物質として、少なくともスーパーオキシドジスムターゼを含んでいることを特徴とする、前記（１）記載の組成物。

（５）手足症候群はドキソルビシンのリポソーム化製剤の投与に起因して発症したものであることを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれか記載の組成物。

（６）皮膚外用剤である、前記（１）〜（５）のいずれか記載の組成物。

（７）皮膚外用医薬品である、前記（６）記載の組成物。

（６）皮膚外用剤である、前記（１）〜（５）のいずれか記載の組成物。

（７）皮膚外用医薬品である、前記（６）記載の組成物。

（８）手足症候群の治療剤または予防剤を製造するための、活性酸素を捕捉または除去する物質の使用。

（９）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキシドジスムターゼ、ビリルビン、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸もしくはその誘導体、システイン、グルタチオン、リノール酸、トコフェロールもしくはその誘導体、α−カロテン、β−カロテン、フラボノイド、尿酸、チオレドキシン、またはフィトケミカルから選択される少なくとも１種である前記（８）記載の使用。

（１０）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキサイドアニオンを標的とするものであることを特徴とする、前記（８）記載の使用。

（１１）活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキシドジスムターゼである前記（８）記載の使用。

（１２）手足症候群はリポソーム化製剤の投与に起因して発症したものであることを特徴とする、前記（８）〜（１１）のいずれか記載の使用。

本発明によれば、手足症候群の治療または予防に有効な新規組成物が提供される。

高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）または低用量（５ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＧＬ−ＤＯＸ溶液を反復投与（３日に１回を３回実施）後の、ラット後肢足底の写真図を示す。 手足症候群発症ラットの病変部位から採取した皮膚組織におけるＨ&Ｅ染色（ａ）、ピクロシリウスレッド染色（ｂ）およびＴＵＮＥＬ染色（ｃ）の結果を示す写真図である。 手足症候群発症ラットの病変部位から採取した皮膚組織において実施したサイトカインおよびケモカインの測定結果を示す。 ＨａＣａＴおよびＮＨＤＦの各培養細胞を用いた分析の結果である。（ａ）および（ｂ）は、それぞれ手足症候群発症ラットの病変部位から採取した組織で産生量増加が確認されたケモカインおよび炎症性サイトカインに関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験結果である。 ＨａＣａＴおよびＮＨＤＦの各培養細胞を用いたＤＯＸのｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験の結果である。 ＨａＣａＴ培養細胞を用いたスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）によるＤＯＸ細胞毒性からのレスキューを示す図である。 ドキソルビシン（ＤＯＸ）の皮内注射により惹起した手足症候群発症ラットにおける前肢甲皮膚のＨ&Ｅ染色像を示す。ａ〜ｃ、生理食塩水投与群；ｄ〜ｆ、１％ＳＯＤ投与群。 ドキソルビシン（ＤＯＸ）の皮内注射により惹起した手足症候群発症ラットにおける、生理食塩水処置群および１％ＳＯＤ処置群の前肢甲皮膚の表肥厚を示すヒストグラムである。

本発明は、手足症候群を治療または予防するための組成物（以下、「本発明の組成物」とも称する。）に関する。本発明において、治療または予防の対象となる手足症候群は、化学療法薬（特に抗癌剤）の投与に起因して手足指先、手掌、足底などの四肢末端に発症する皮膚症状（しびれ、皮膚知覚過敏、色素沈着、発赤、熱感、紅斑、水疱、むくみ、角化、ひび割れ、爪の変形・色素沈着などを含むがこれに限られない）をいう。また、手足症候群は、手掌・足底発赤知覚不全症候群、脚端紅斑、化学療法薬誘導性脚端紅斑、手掌・足底紅斑、手足皮膚反応としても知られているが、本発明における手足症候群という用語はこれらを全て含むものである。

また、手足症候群の発症原因となりうる化学療法薬として、結腸直腸癌および乳癌の治療に使用されるフッ化ピリミジン系抗腫瘍剤（例えばカペシタビン）；悪性固形腫瘍に対して使用されるアントラサイクリン；再発性卵巣癌に対して使用されるＰＥＧ改変型リポソームドキソルビシン製剤（ＰＥＧＬ−ＤＯＸ）；広範な癌に対して使用されるドセタキセル；腎癌に対して使用される分子標的薬であるソラフェニブやスニチニブなど、多数の薬剤が知られているが、本発明における手足症候群は、その発症原因となる薬剤によって制限されるものではなく、任意の薬剤を原因とするものを対象とする。一実施態様においては、手足症候群は、ドキソルビシンのリポソーム化製剤の投与に起因する手足症候群である。

本発明は、抗癌剤等の化学療法薬の投与に起因する手足症候群の症状に、化学療法薬との相互作用によって発生するＲＯＳが関与していることを見出したことを基礎とするものである。したがって本発明の組成物は、活性酸素を捕捉または除去する物質を有効成分として含むことを特徴とする。

ＲＯＳには、一般的に、酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキサイドアニオン（Ｏ^２−）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、および一重項酸素（^１Ｏ_２）の４種が含まれるが、本発明においては、その少なくとも１種、２種、３種、そして４種の全てを標的とするように、有効成分を選択または組み合わせることができる。したがって、本発明において「活性酸素（ＲＯＳ）を捕捉または除去する物質」とは、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ^２−）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、および一重項酸素（^１Ｏ_２）のうちの少なくとも１種を捕捉または除去の標的とする物質（例えば抗酸化剤）をいう。

活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキサイドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシラジカルおよび一重項酸素のいずれか１種を捕捉または除去することができ、かつ、人体に有害作用を生じない限り、天然由来であっても合成由来であってもよい。本発明の一実施態様においては、活性酸素を捕捉または除去する物質は、スーパーオキサイドアニオンを捕捉または除去の標的とする物質である。

スーパーオキサイドアニオンを捕捉または除去することができる物質として、これに限定されるものではないが、スーパーオキシドジスムターゼ、ビリルビン、アスコルビン酸またはその誘導体（６−ステアリン酸アスコルビル、６−パルミチン酸アスコルビル、２，６−ジパルミチン酸アスコルビル、２，３，５，６−テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム、アスコルビン酸−２−硫酸２ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム、アスコルビル−２−グルコシドなど）などが知られており、本発明の組成物はこれらの少なくとも１種を有効成分として含むことができる。

過酸化水素を捕捉または除去することができる物質として、これに限定されるものではないが、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸またはその誘導体（６−ステアリン酸アスコルビル、６−パルミチン酸アスコルビル、２，６−ジパルミチン酸アスコルビル、２，３，５，６−テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム、アスコルビン酸−２−硫酸２ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム、アスコルビル−２−グルコシドなど）、ビタミンＥコハク酸エステルなどが知られており、本発明の組成物はこれらの少なくとも１種を有効成分として含むことができる。

ヒドロキシラジカルを捕捉または除去することができる物質として、これに限定されるものではないが、システイン、グルタチオン、リノール酸、トコフェロールまたはその誘導体（α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、ビタミンEコハク酸エステルなど）、α−カロテン、β−カロテン、フラボノイド、尿酸、チオレドキシンなどが知られており、本発明の組成物はこれらの少なくとも１種を有効成分として含むことができる。

一重項酸素を捕捉または除去することができる物質として、これに限定されるものではないが、アスコルビン酸およびその誘導体（６−ステアリン酸アスコルビル、６−パルミチン酸アスコルビル、２，６−ジパルミチン酸アスコルビル、２，３，５，６−テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム、アスコルビン酸−２−硫酸２ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム、アスコルビル−２−グルコシドなど）、トコフェロールおよびその誘導体（α−トコフェロール、酢酸トコフェロールなど）、β−カロテン、リボフラビン、尿酸、チオレドキシンなどが知られており、本発明の組成物はこれらの少なくとも１種を有効成分として含むことができる。

また上記の他、本発明の組成物は、有効成分として高い抗酸化作用が知られている物質、例えばα−リポ酸、コエンザイムＱ１０、キサントフィル類（アスタキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチンなど）、カロテノイド（αカロテン、βカロテン、リコペンなど）、ポリフェノール（クロロゲン酸、エラグ酸、リグナン、セサミン、クルクミン、クマリン、オレオカンタール、オレウロペイン、レスベラトロールなど）、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、フェルラ酸、カフェ酸、５−（ジエチルホスホノ）−５−メチル−１−ピロリンＮ−オキシド、フラボノイド（フラバノン、フラボン、カルコン、カテキン、没食子酸エピガロカテキン、フラバノノール、オーロン、フラバン−３４−ジオール（ロイコアントシアン）、イソフラボン、アントシアニン、タンニン、ルチンなど）、植物抽出物（ビワ葉エキス、籐茶エキス、エイジツエキス、ローズマリーエキスなど）、マンガンＮ，Ｎ’−ビス（サリチリジエン）エチレンジアミンクロライド、（ａｃｅｔａｔｏ−κＯ）［［２，２−［１，２’−ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌｂｉｓ［（ｎｉｔｒｉｌｏ−κＮ）ｍｅｔｈｙｌｉｄｙｎｅ］］ｂｉｓ［３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌａｔｏ−κＯ］］（２−）］−ｍａｎｇａｎｅｓｅ、２，６−ビス（１，１−ジメチルエチル）−４−［［（１−エチル）アミノ］メチル］フェノール塩酸塩、３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン、ＳＯＤミメティック化合物（マンガン（III）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンクロライド、マンガン（III）テトラキス（１−メチル−２−ピリジル）ポルフィリン、マンガン（III）メソ−テトラキス（Ｎ−メチル−２−ピリジル）ポルフィリンペンタクロライドなど）、７−ヒドロキシフラボン−マンガン複合体、ノルジヒドログアヤレチン酸、２１−（４−（２，６ Ｄｉ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）−ｐｒｅｇｎａ−１，４，９（１１）−ｔｒｉｅｎｅ−３，２０−ｄｉｏｎｅ，（Ｚ）−２−Ｂｕｔｅｎｅｄｉｏｎａｔｅ、（−）−２−（（４−（２，６−Ｄｉ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ）−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２，３，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−６−ｏｌ， ２ＨＣｌ、フィトケミカル（アントシアニン、イソフラボン、セサミノール、クルクミン、スルフォラハン、メチルシステインスルホキシド、アリシン、ルテイン、リコペン、リモネン、フィトステロール、βグルカン、サポニン、カプサイシン、ジンゲロールなど）を含んでもよい。

本発明において、標的とするＲＯＳの種類に依らず、上述したＲＯＳを捕捉または除去することができる物質のうち、１種〜複数種を選択して本発明の組成物を調製することができる。

本発明において、組成物の投与ルートおよび剤型は、手足症候群の治療または予防効果が発揮される限り特に制限されないが、手足症候群の発症原因となることが既に知られている化学療法薬の投与を予定している対象、手足症候群の発症原因となった化学療法薬の投与を継続している対象への適用に際しては、化学療法剤の効果を損なわないようにすることが好ましい。すなわち、上記のとおり、癌のアポトーシスは、抗癌剤によって直接的または間接的に生じた活性酸素（以下、「ＲＯＳ」とも称する）によって誘導されることが報告されており（Ｈｉｒａｏｋａ Ｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）前掲；Ｔａｄａ−Ｏｉｋａｗａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）前掲；Ｖａｒｂｉｒｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（２００１）前掲；Ｍｕｒａｔａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００４）前掲；Ｓａｄｚｕｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）前掲；Ｇｅｗｉｒｔｚ．Ｄ．Ａ．，（１９９９）前掲）、抗癌剤によるそのような本来的役割に鑑みれば、ＲＯＳの全身性の除去は化学療法薬の有効性を著しく減じる可能性があるからである。

したがって、本発明の組成物は、一実施態様において、ＲＯＳを捕捉または除去する物質を、手足症候群病変部位に局所的に送達する剤形、例えば皮膚外用剤の形態とすることができる。そのような皮膚外用剤は、例えば皮膚外用医薬品として提供することができる。

本発明の皮膚外用医薬品において、ＲＯＳを捕捉または除去する物質の配合量は、効果的に手脚症候群の症状を改善することができ、かつ、他の有害な副作用を生じない範囲であれば特に制限されないが、例えば０．００１〜３０（ｗ／ｗ）％、好ましくは０．０１〜１０（ｗ／ｗ）％、例えば５（ｗ／ｗ）％とすることができる。

本発明の皮膚外用医薬品には、有効成分の他、皮膚外用剤に一般的に用いられる成分、例えば、これに限定されるものではないが、水、界面活性剤（アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面活性剤）、液体または固体油脂、ロウ、炭化水素油、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル油、シリコーン油、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルション、ｐＨ調整剤、皮膚栄養剤、酸化防止剤、香料等を適宜配合し、目的とする製品形態に応じて常法に従って製造することができる。

本発明の皮膚外用医薬品の形態は特に制限されず、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、液剤、ローション剤、エアゾール剤、パップ剤、化粧用シート剤などの形態で提供することができる。

本発明の皮膚外用医薬品は、単剤で使用してもよいし、手足症候群の治療に用いられる他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。そのような薬剤として、例えば、保湿剤、抗生物質、ステロイド外用剤、ステロイド内服薬、非ステロイド性消炎鎮痛剤等が挙げられる。

本発明の皮膚外用医薬品は、化学療法薬の投与に起因して手足症候群を発症している患者の他、化学療法薬の投与を予定している癌患者に対して予防的に使用してもよい。

以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．手足症候群発症モデルの作製
薬剤の種類に応じた手足症候群の発症頻度については次のような報告がある：ＰＥＧＬ−ＤＯＸ（最高で約７８％）；カペシタビン（５１〜７８％）；ソラフェニブ（約５５％）（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｌａｂｏｕｒ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ，２０１０）。そこで手足症候群発症モデルの作製のために、発症頻度の最も高いＰＥＧＬ−ＤＯＸを採用することとした。

（１）ＰＥＧＬ−ＤＯＸ（ドキソルビシンＰＥＧ化リポソーム製剤）の調製
粒子径を統一するためのフィルターによる分割および作製後の平均粒子径の確認を行わなかったこと以外は、既報（Ｓａｄｚｕｋａ Ｙ．，２００５、前掲）に従ってＰＥＧ化リポソーム製剤を作製した。

すなわち、Ｌ−α−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ＤＬ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＥＧ修飾レシチン；ＤＳＰＧ）およびレシチン（それぞれ日油株式会社製）を、メタノールおよびクロロホルムを１：４に混合した溶媒に溶解し、３５℃の温浴中でロータリーエバポレーターにて溶媒を除去し、ナスフラスコ面に薄膜を形成した。フラスコ内にＤＯＸ水溶液（２０％水溶液；日本化薬株式会社製）とソルビトール／乳酸溶液を添加し、６０℃の温浴中で１５分撹拌した。その後超音波照射を３分間実施し０．２ｗ／ｖ％のＰＥＧＬ−ＤＯＸ溶液を得た。

（２）手足症候群モデルの作製
（２−１）ＰＥＧＬ−ＤＯＸの尾静注モデル
高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）または低用量（５ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＧＬ−ＤＯＸ溶液を、日本ＳＬＣ株式会社より購入した７週齢の雌ＳＤラットに単回または反復投与（３日に１回投与を３回）した（尾静注）。

単回投与群では、ＰＥＧＬ−ＤＯＸ投与直後から前肢掌、肢底、耳介、鼻先に発赤が出現したが、生じた発赤は一過性で５〜１０分で消失した。一方、ＰＥＧＬ−ＤＯＸの反復投与群では５ｍｇ／ｋｇの低用量で四肢末梢部の炎症所見が観察され、高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）ではその傾向が顕著であった（図１）。

また反復投与群では、手足に障害が生じることが観察されたが、全身の皮膚への影響は顕著ではなく若干の乾燥状態が観察されたのみであった。これはヒトにＤｏｘｉｌ（登録商標）を投与した際に観察される症状に酷似していた（Ｇｅｗｉｒｔｚ．Ｄ．Ａ．，１９９９、前掲）。したがって、ＰＥＧＬ−ＤＯＸの投与により、前肢掌および後肢足底に手足症候群が発症したと判断した。

（２−２）ドキソルビシンの局所注射モデル
ＰＥＧＬ−ＤＯＸ尾静注による場合、重篤な手足症候群を惹起するためには比較的高濃度のＰＥＧＬ−ＤＯＸの投与が必要であるため、手足症候群の症状を発症する前に動物が死亡してしまうという問題があった。そこで、ドキソルビシンをラットの肢底部に皮内投与することによる手足症候群の惹起を試みた。
０．０８％に調製したドキソルビシン生理食塩水溶液を、日本ＳＬＣ株式会社より購入した８週齢の雌ＳＤラットの前肢および後肢足底部に４０μｌずつ皮内投与したところ、投与後２日でラット足底部および甲に炎症性の発赤や腫脹、落屑など、手足症候群の症状と酷似する所見が観察された。
そこで、本モデルを手足症候群発症の第２のモデルとして使用した。

２．手足症候群モデルラットの病理解析
手足症候群発症部位の病理解析を行うために、上記（２−１）に従って手足症候群が発症した高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）ＰＥＧＬ−ＤＯＸ反復投与ラットから採取した皮膚組織を組織学的に評価した。組織学的評価は、Ｈ&Ｅ染色、ピクロシリウスレッド染色およびＴＵＮＥＬ染色を用い、それぞれ無投与コントロール群と比較することにより行った。

（１）ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ&Ｅ）染色
ホルマリン固定してパラフィン包埋した皮膚組織を４μｍの厚さで切片を作製した。脱パラフィンした後、再水和し、Ｈ&Ｅ染色を行い、前肢手掌および後肢足底部の組織像を光学顕微鏡にて観察を行った。

（２）ピクロシリウスレッド染色
真皮の膠原線維の様子を詳細に観察するため、ピクロシリウスレッド染色を行い、偏光顕微鏡にて観察を行った。

（３）ＴＵＮＥＬ染色
アポトーシスを検出するためにＴＵＮＥＬ染色を行った。ＤｅａｄＥｎｄ^ＴＭ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ株式会社製）を使用してＴＵＮＥＬ染色し、蛍光顕微鏡にて観察を行った。

結果を図２に示す。高用量ＰＥＧＬ−ＤＯＸ反復投与ラットの肢底部皮膚のＨ&Ｅ染色では、無投与コントロール群に比較して、顆粒層が菲薄化または消失し、基底層から有棘層にかけて細胞数が減少し、細胞間は粗な配列を呈しており、表皮層の菲薄化が顕著であった（図２ａ）。一方、真皮層の線維芽細胞は正常状態とほぼ同等であった。

図２ｂにピクロシリウスレッド染色（コラーゲン線維の染色）結果を示す。赤く高輝度で観察される程太いコラーゲン線維束が多く、黄色〜緑で低輝度になるほど配列の乱れもしくは断裂状態を示す。図２ｂから明らかな通り、ＰＥＧＬ−ＤＯＸ反復投与ラットでは真皮層のコラーゲン線維の配列が乱れ、線維の断裂が顕著であった。

図２ｃにＴＵＮＥＬ染色結果を示す。緑色はアポトーシスが誘導されている細胞を示している。ＰＥＧＬ−ＤＯＸ投与モデルでは、表皮基底細胞のアポトーシスが誘導されていた。

以上の結果は、手足症候群発症部位においては、表皮層の細胞減少に伴う菲薄化、真皮層のコラーゲン破壊、表皮基底細胞のアポトーシスが認められることを示しており、その結果、炎症症状が引き起こされていると考えられる。

３．手足症候群発症原因の解析
（１）ｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン分析
手足症候群が発症する原因を解明するために、上記（２−１）に従うＰＥＧＬ−ＤＯＸ投与後の後肢の皮膚組織を採取し、発現しているサイトカインおよびケモカインを測定した。採取した皮膚組織をホモジナイズした後、遠心して上清を回収しＲａｔ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）にて検出を行った。

その結果を図３に示す。ケモカインであるＣＩＮＣ３やＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅの発現およびＩＬファミリーの産生抑制に働くＩＬ−１０産生が顕著で、同時に炎症系サイトカインであるＩＬ−１βやＩＬ−６の発現亢進も確認された。

（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン分析
ＤＯＸによる皮膚組織内細胞への影響を確認するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験をさらに実施した。表皮層および真皮層への影響を比較するために、それぞれＨａＣａＴ細胞（ヒトケラチノサイト由来株化細胞；神戸大学医学部より受領）と正常ヒト真皮線維芽細胞であるＮＨＤＦ（倉敷紡績株式会社製）とを用いた。具体的には、各培養細胞にＤＯＸ（１．５μＭ）を添加して２４時間培養した後、培地中のサイトカインをＬｕｍｉｎｅｘ２００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）（図４ａ）またはＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）（図４ｂ）にて検出を行った。検出対象のサイトカインは、ｉｎ ｖｉｖｏで産生が亢進していたケモカインであるＩＬ−８、ＧＲＯ（いずれもラットＣＩＮＣ３に相当する）およびＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、並びに炎症性サイトカインＩＬ−１およびＩＬ−６とした。

また、サイトカイン産生量への活性酸素（ＲＯＳ）の関与を評価するために、銅（ＩＩ）イオンとして塩化銅（ＩＩ）（和光純薬社製）を培地にさらに添加した系においても同様の実験を行った。

結果を図４に示す。ＨａＣａＴにおいて、ＤＯＸ １．５μＭの存在だけでは、３種のケモカイン産生は増加しなかった（図４ａ）。一方、ＤＯＸと銅（ＩＩ）イオン共存下（５０および３７５μＭ）では、各ケモカインの産生量は増加し、ＧＲＯおよびＩＬ−８は、Ｃｕ（ＩＩ）イオン濃度が高いほどその産生量は増加した。一方、ＮＨＤＦにおいては、ＤＯＸ添加やＣｕ（ＩＩ）イオン共存による変化はほとんどなく、むしろＤＯＸ存在下で各種ケモカイン産生量は抑制される傾向が観察された。

炎症性サイトカインについても、ＤＯＸおよび／または銅（ＩＩ）イオンによる影響は細胞種によって変化した（図４ｂ）。ＨａＣａＴ細胞はＤＯＸの存在下ではＩＬ−１αおよびＩＬ−６の産生を増加し、その産生はＤＯＸ存在下でＣｕ（ＩＩ）イオンの添加によってさらに増強された。ＩＬ−１βの産生は高濃度の銅（ＩＩ）イオンとＤＯＸの併存下で上昇した。対照的に、ＮＨＤＦ細胞はＤＯＸのみの場合には考慮すべき反応を示さなかったが、銅（ＩＩ）イオンの併存下ではＩＬ−１βの産生増加を刺激した。

以上のとおり、ＤＯＸが表皮細胞においてケモカインＩＬ−８、ＧＲＯおよびＦｒａｃｔａｌｋｉｎｅ、炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αの産生を増強し、真皮細胞においてＩＬ−１βの産生を増強すること、並びにこの産生増強は銅（ＩＩ）イオン依存的に認められることが示された。これらの結果は、ＤＯＸと銅（ＩＩ）イオン共存下で産生が増強されるＲＯＳが、これらのサイトカインの産生増強に関与している可能性を示唆している。

（３）ＤＯＸ毒性評価試験
ＤＯＸの毒性評価のために、培養細胞ＨａＣａＴとＮＨＤＦ（前掲）を使用した毒性評価試験を行った。すなわち、培地に１．５μＭ ＤＯＸを添加し、２４時間後の生細胞の割合をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（ＣＣＫ８）（ＤＯＪＩＮＤＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を使用して測定した。銅（ＩＩ）イオン共存下の毒性試験は、１．５μＭのＤＯＸを含む培地に、５０μＭまたは３７５μＭの塩化銅（和光純薬社製）を添加した。

また、ＤＯＸによる皮膚組織破壊とＲＯＳの関与を調べるために、１．５μＭ ＤＯＸ、５０μＭ塩化銅（ＩＩ）および１００μｇ／ｍｌ スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をＨａＣａＴ培養培地に添加して、１２時間後の生存率を測定した。

ＤＯＸを添加しなかった場合には、ＨａＣａＴ細胞の生存率は５０μＭ塩化銅（ＩＩ）添加時に約２０％低下したが、高濃度の３７５μＭを添加した場合でも同程度であった。ＤＯＸの存在下では、細胞の生存率は銅（ＩＩ）イオン濃度の増加に伴って急速に低下した（図５）。これは、ＤＯＸと銅（ＩＩ）イオンが共存することによるＲＯＳの産生促進が、細胞の生存率を低下させたことを示唆している。一方、ＮＨＤＦ細胞はＤＯＸおよび銅（ＩＩ）イオンの組み合わせによる生存率への顕著な影響は認められなかった。ＨａＣａＴとＮＨＤＦの間において、ＲＯＳによる細胞障害に差が見られたことは、手足症候群モデル動物の皮膚組織像とよく相関していた。

また、ＲＯＳを捕捉することが知られているＳＯＤの添加は、ＨａＣａＴ細胞の生存率を改善した（図６）。

以上の結果から、手足症候群の病態は、抗癌剤と皮膚内に存在する銅（ＩＩ）イオンとの相互作用により発生したＲＯＳが、表皮細胞におけるケモカインおよび炎症性サイトカイン類の産生を促進し、その結果、血管拡張、発赤、熱感が現れ、血管透過性が亢進し膨張する手足症候群の炎症症状が発現されることが示された。

一方、ＨａＣａＴを用いた細胞毒性試験において、ＳＯＤの添加によって、細胞生存率の改善が認められたことから、ＲＯＳを捕捉または除去する成分が、手足症候群の治療または予防に有効であることが示された。

４．手足症候群の発症抑制試験
本試験には、上記（２−２）ドキソルビシンの局所注射による手足症候群発症動物モデルを用いた。
１％スーパーオキシドジスムターゼ生理食塩水溶液（ＳＯＤ）を、８週齢の雌ＳＤラット前肢および後肢足底部に４０μｌずつ皮内投与した。陰性対照としてＳＯＤを含まない生理食塩水のみの投与群も用意した。ＳＯＤ投与２４時間後、０．０８％ドキソルビシンを同じ部位に皮内投与した。ＳＯＤまたは生理食塩水、およびドキソルビシンの投与はそれぞれ１回のみとし、手足症候群の発症とその経過を１７日間観察した。観察最終日に前肢・後肢の掌および甲の皮膚を採取してホルマリン固定し、パラフィン包埋を行って組織切片を作製した。Ｈ&Ｅ染色を行って、肢皮膚の状態を観察した。表皮の厚さは、画像処理ソフトウェアＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ４．８（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）によって計測し、群間の比較はＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔによる統計処理を行った。

０．０８％ドキソルビシンをラット足底部に投与することで足底部に炎症性の発赤や腫脹、落屑などの手足症候群でみられる症状が、ＳＯＤ投与群および生理食塩水投与群において異なる程度で観察された。陰性対照の生理食塩水投与群（ｎ＝２、（前肢ｎ＝４、後肢ｎ＝４））に比較して、１％ＳＯＤ投与群（ｎ＝２、（前肢ｎ＝４、後肢ｎ＝４））は発赤や腫脹の程度はやや弱く、正常状態への回復が早いことが観察された。生理食塩水投与群では、前肢甲にも発赤や腫脹が確認された。これに対し、１％ＳＯＤ投与群では前肢甲における諸症状は著しく軽減された。

Ｈ&Ｅ染色による前肢甲の皮膚組織像を観察したところ、陰性対照の生理食塩水投与群は炎症性の表皮肥厚が観察された（図７ａ〜ｃ）。１％ＳＯＤ投与群は有意に炎症性の表皮肥厚を抑制しており、その程度はわずかであった（図７ｄ〜ｆ）。表皮の厚さを染色組織像６０〜８０か所で測定したところ、１％ＳＯＤ投与群において有意な抑制効果が認められた（ｐ<０．００１）（図８）。

このように、ＲＯＳを捕捉または除去することが可能な抗酸化剤を事前に投与しておくことで、手足症候群の発症またはその症状を効果的に低減することができた。したがって、ＲＯＳを捕捉または除去する物質は、手足症候群の治療または予防に有用であることが示された。

本発明によれば、手足症候群の治療または予防に有用な組成物が提供される。本発明の組成物は、手足症候群の患者向けの皮膚外用剤、例えば手足症候群治療用医薬品として提供される点で産業上の利用可能性を有している。

Claims (6)

1. 活性酸素を捕捉または除去することができる物質を有効成分とする、手足症候群を治療または予防するための組成物であって、
   ここで、活性酸素を捕捉または除去することができる物質が、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、尿酸、および、チオレドキシンから選択される少なくとも１種である、組成物。
2. 手足症候群はドキソルビシンのリポソーム化製剤の投与に起因して発症したものであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 皮膚外用剤である、請求項１または２に記載の組成物。
4. 皮膚外用医薬品である、請求項３記載の組成物。
5. 手足症候群の治療剤または予防剤を製造するための、活性酸素を捕捉または除去することができる物質の使用であって、
   ここで、活性酸素を捕捉または除去することができる物質が、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、尿酸、および、チオレドキシンから選択される少なくとも１種である、使用。
6. 手足症候群はリポソーム化製剤の投与に起因して発症したものであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。