JP6548060B2 - ホウ素中性子捕捉療法のための新規ｂｓｈ複合体 - Google Patents

Description

本発明は、がん治療のための薬剤およびその製造方法に関する。詳細には、本発明は、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）のためのメルカプトウンデカハイドロデカボレート（ＢＳＨ）とペプチドとの複合体、その製造方法、およびそれを用いた癌の治療に関する。

ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）は、ホウ素同位体^１０Ｂをがん細胞に導入し、中性子線を照射してがん細胞のみを殺傷する優れたがん治療法であり、術後のＱＯＬも優れている。ＢＮＣＴにとってがん細胞内に十分量のホウ素薬剤を安全かつ容易に送達することは、最大の課題である。従来は、ホウ素原子１個を含むアミノ酸誘導体であるＢＰＡが主剤として使われ、がん細胞を含めた細胞自体には入らないＢＳＨが副次的に使われてきた（非特許文献１、２参照）。

ＢＰＡは細胞膜に存在するアミノ酸輸送体により細胞内に取り込まれる。しかし、正常細胞でも粘膜上皮や発毛細胞など増殖の強い細胞はＰＢＡを良く取り込んでしまうので、中性子照射によりこれらの正常細胞も障害される。加えて、アミノ酸輸送体（主に関与するものはＬＡＴ１と推定される）を介して細胞内に取り込まれるＢＰＡは、当該アミノ酸輸送体が「交換輸送体（非特許文献３参照）」であることから細胞内、がん細胞内にＢＰＡを大量に滞留させることが難しく、更に一分子当たりホウ素を一原子しか有していないので中性線との衝突効率が悪く、がん細胞内に必要なホウ素を送達、滞留するためには大量に投与（成人１名当り数十ｇ）する必要がある。

ＢＳＨは一分子当たりホウ素原子１２個の結晶体であり効率が良い。しかしながら、細胞膜を透過できないのでそのままでは細胞内には入らない。ＢＳＨはがん組織の脆弱な血管から漏れ出して間質液に入り細胞周囲に貯留するのみである。そのため、中性子照射して発生する２次粒子（α粒子、Ｌｉ核）が影響遺伝子ＤＮＡの存在する細胞核まで届くことが難しく、十分ながん殺傷効果が得られない。更には、ＢＳＨにはがん細胞特異性が無いことも問題である。

臨床で使用されてきた既存のホウ素薬剤ＢＰＡ、ＢＳＨに加え、現在、様々なナノキャリアが提案されている。これらは、リポソーム（脂質二重膜ベシクル）、高分子ミセル（両親媒性ポリマーベシクル）、カーボンナノチューブに分類されるが、以下のような問題点を有する。リポソームは、薬剤を持続的に放出し、毒性は低いが、物理的に不安定である。高分子ミセルは、生体適合性・生分解性に優れるが、体内半減期が短い。カーボンナノチューブは、表面積が広いが、カーゴ選択性がなく、毒性がある。

Ｋａｔｏ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａｔ．Ｉｓｏｔ．２００４；６１：１０６９−７３ Ｈａｔａｎａｋａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９７５；２０９：８１−９４ 生化学 第８６巻第３号、ｐｐ３３８−３４４（２０１４））

本発明が解決しようとする課題は、ＢＳＨをがん細胞に直接送達し滞留できる薬剤を提供し、ＢＮＣＴを効率良く行うことを可能にすることである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、水溶液中で疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを混合することによって得られる上記ペプチドとＢＳＨを含む複合体が、直径約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの球形という細胞導入にとり理想的な形状であり、がん細胞中に直接送達され滞留することを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下のものを提供する：
（１）水溶液中で疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとメルカプトウンデカハイドロデカボレート（ＢＳＨ）を混合することを特徴とする、上記ペプチドとＢＳＨを含む複合体の製造方法；
（２）上記ペプチド１モルに対してＢＳＨ１モル〜１０００モルの割合で混合する、（１）記載の方法；
（３）複合体の直径を調節することをさらに特徴とする、（１）または（２）記載の方法；
（４）複合体が直径約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの球状である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）上記ペプチドが下式（１）：
［式中、ｍ個のアミノ酸残基Ｘはそれぞれ独立してアラニン、バリン、ロイシンまたはグリシンであり、ｎ個のアミノ酸残基Ｚはそれぞれ独立して−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）Ｒ^１であり、Ｒ^１は−（ＣＨ_２）_ｐＮＨＲ^２であり、Ｒ^２は−Ｈまたは−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ_２であり、ｍは４〜１０、ｎは１〜２、ｐは１〜６である。］にて示されるものである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（６）Ｘがアラニンであり、ｍが６であり、Ｚがリジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、２，７−ジアミノヘプタン酸、２，４−ジアミノブタン酸、または２−アミノ−４−グアニジノブタン酸であり、ｎが１である、（５）記載の方法；
（７）Ｘがアラニンであり、ｍが６であり、Ｚがリジンまたはアルギニンであり、ｎが１である、（６）記載の方法；
（８）疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体；
（９）直径が約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの球形である（８）記載の複合体；
（１０）上記ペプチドが下式（１）：
［式中、ｍ個のアミノ酸残基Ｘはそれぞれ独立してアラニン、バリン、ロイシンまたはグリシンであり、ｎ個のアミノ酸残基Ｚはそれぞれ独立して−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）Ｒ^１であり、Ｒ^１は−（ＣＨ_２）_ｐＮＨＲ^２であり、Ｒ^２は−Ｈまたは−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ_２であり、ｍは４〜１０、ｎは１〜２、ｐは１〜６である。］にて示されるものである（８）または（９）記載の複合体；
（１１）Ｘがアラニンであり、ｍが６であり、Ｚがリジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、２，７−ジアミノヘプタン酸、２，４−ジアミノブタン酸、または２−アミノ−４−グアニジノブタン酸であり、ｎが１である、（１０）記載の複合体；
（１２）Ｘがアラニンであり、ｍが６であり、Ｚがリジンまたはアルギニンであり、ｎが１である、（１１）記載の複合体；
（１３）（８）〜（１２）のいずれかに記載の複合体を含む、がんのホウ素中性子捕捉療法のための薬剤。
（１４）（８）〜（１２）のいずれかに記載の複合体をがん患者に投与し、該がん患者に中性子線を照射することを含む、がんの治療方法。
（１５）がんのホウ素中性子捕捉療法に用いられる、（８）〜（１２）のいずれかに記載の複合体。
（１６）がんのホウ素中性子捕捉療法のための薬剤を製造するための、（８）〜（１２）のいずれかに記載の複合体の使用。

本発明によれば、疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを水溶液中で混合するという簡単な操作により、極めて容易かつ多量にがん細胞内にＢＳＨを送達し滞留できる複合体を得ることができる。当該ペプチドとＢＳＨの比率は、等量からＢＳＨが１０００倍モル比までの過剰量の範囲が望ましい。本発明の複合体を用いれば、ＢＮＣＴの効果を飛躍的に高めることができる。例えば１回の注射でがん細胞内へ確実にＢＳＨを送達、滞留することも可能となる。

図１は、水溶液中のＡ６Ｋ（トリフルオロ酢酸塩、以下ＴＦＡ塩という）（濃度５０μＭ）の走査型電子顕微鏡写真である。右下のバーは２ミクロンである。 図２は、水溶液中のＡ６Ｋ（ＴＦＡ塩）（濃度２００μＭ）のＤｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｎｎｉｎｇ（ＤＬＳ）試験の結果を示すチャートである。 図３は、Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）（１０μＭ）とＢＳＨ（１０００μＭ）を水溶液中で混合することにより得られた複合体の走査型電子顕微鏡写真である。右下のバーは５００ｎｍである。 図４は、Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）（２００μＭ）とＢＳＨ（２０００μＭ）を水溶液中で混合することにより得られた複合体のＤＬＳ試験の結果を示すチャートである。 図５は、Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨの混合時間および複合体とＵ８７ΔＥＧＦＲ細胞とのインキュベーション時間が複合体の細胞内送達量に及ぼす影響を、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を用いて調べたグラフである。＊＊＊はｐ＜０．００５であることを示す。 図６は、Ａ６Ｒ（ＴＦＡ塩）（１０μＭ）とＢＳＨ（１０００μＭ）を水溶液中で混合することにより得られた複合体の走査型電子顕微鏡写真である。右下のバーは１ミクロンである。 図７は、Ａ６Ｒ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨを水溶液中で混合することにより得られた複合体の濃度依存的な細胞導入を示すグラフである。複合体の細胞内送達量は、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を用いて調べた。＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。 図８は、Ａ６Ｒ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨを水溶液中で混合することにより得られた複合体とＵ８７ΔＥＧＦＲ細胞とのインキュベーション時間が複合体の細胞内送達量に及ぼす影響を、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を用いて調べたグラフである。 図９は、ＢＳＨを認識する特異的抗体を用い、Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨを水溶液中で混合することにより得られた複合体に含まれるＢＳＨのＵ８７ΔＥＧＦＲ細胞内分布を示す画像である。 図１０は、Ａ６Ｋ（塩酸塩）（１６６μＭ）とＢＳＨ（１．６６ｍＭ）を水溶液中で混合することにより得られた複合体の走査型電子顕微鏡写真である。右下のバーは５００ｎｍである。 図１１は、Ａ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨを水溶液中で混合することにより得られた複合体の細胞導入を示すグラフである。複合体の細胞内送達量は、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を用いて調べた。 図１２は、ＢＳＨを認識する特異的抗体を用い、Ａ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨを水溶液中で混合することにより得られた複合体に含まれるＢＳＨのＵ８７ΔＥＧＦＲ細胞内分布を示す画像である。左欄は核染色像であり細胞が存在していることを示す。中欄は抗ＢＳＨ抗体によるＢＳＨの局在を示す。染色像、右欄は左欄と中欄の重ね合わせの図である。図の左の数字はＡ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨの混合割合を示す。各画像の左下のバーは１００ミクロンである。 Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨを含む複合体を含むがん細胞に中性子を照射した場合の、当該がん細胞の生存率を示すグラフである。ｎｏｎ Ｂ１０は複合体もＢＳＨも細胞に添加しなかった系、ＢＳＨはＢＳＨのみを細胞に添加した系、ＢＳＨ／Ａ６ＫはＡ６Ｋ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨを含む複合体を細胞に添加した系である。 本発明の剤によってＢＳＨが腫瘍部位特異的に導入されることを示す図である。上の図（ＢＳＨ ｏｎｌｙと表示）はＢＳＨのみを投与した場合、下の図（Ａ６Ｋ／ＢＳＨ（実施例４（１）に記載の化合物）は本発明の剤（Ａ６ＫとＢＳＨを含む複合体）を投与した場合の腫瘍組織を示す。Ｈｏｅｃｈｓｔは核染色像、ＨＬＡ−ＡはＨＬＡ−Ａの免疫染色像、ＢＳＨはＢＳＨの免疫染色像、Ｍｅｒｇｅはこれらの３重の染色を同一画面上で合体させた像を示す。

本発明は、１の態様において、水溶液中で疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを混合することを特徴とする、上記ペプチドとＢＳＨを含む複合体の製造方法を提供する。疎水性アミノ酸および塩基性アミノ酸は公知である。疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドも様々な種類のものが知られており、本発明に用いることができる。本発明において、好ましく用いられる疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドは下式（１）：
［式中、ｍ個のアミノ酸残基Ｘはそれぞれ独立してアラニン、バリン、ロイシンまたはグリシンであり、ｎ個のアミノ酸残基Ｚはそれぞれ独立して−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）Ｒ^１であり、Ｒ^１は−（ＣＨ_２）_ｐＮＨＲ^２であり、Ｒ^２は−Ｈまたは−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ_２であり、ｍは４〜１０、ｎは１〜２、ｐは１〜６である。］にて示される。本発明において、より好ましく用いられる疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドの例は、ＸＸＸＸＸＺ、ＸＸＸＸＸＺＺ、ＸＸＸＸＸＸＺ、ＸＸＸＸＸＸＺＺ、ＸＸＸＸＸＸＸＺ、ＸＸＸＸＸＸＸＺＺなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのペプチドの具体例としては、ＡＡＡＡＡＫ、ＡＡＡＡＡＡＫ、ＡＡＡＡＡＡＡＫ、ＡＡＡＡＡＫＫ、ＡＡＡＡＡＡＫＫ、ＡＡＡＡＡＡＡＫＫ、ＡＡＡＡＡＲ、ＡＡＡＡＡＡＲ、ＡＡＡＡＡＡＡＲ、ＡＡＡＡＡＲＲ、ＡＡＡＡＡＡＲＲ、ＡＡＡＡＡＡＡＲＲなどが挙げられる。本発明において、より好ましく用いられる疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドのさらなる具体例としては、ＡＡＡＡＡＡ−ホモアルギニン、ＡＡＡＡＡＡ−オルニチン、ＡＡＡＡＡＡ−２，７−ジアミノヘプタン酸、ＡＡＡＡＡＡ−２，４−ジアミノブタン酸、ＡＡＡＡＡＡ−２−アミノ−４−グアニジノブタン酸などが挙げられる。本発明において、より好ましく用いられる上記ペプチドの典型例としてはＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋと略称）およびＡＡＡＡＡＡＲ（Ａ６Ｒと略称）などが挙げられる。アミノ酸残基Ｘ、Ｚに修飾可能な部分が存在する場合、アミノ酸残基Ｘ、Ｚは修飾されていてもよい。また、式（１）で示されるペプチド中の１個または２個のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基または塩基性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基にて置換されていてもよい。本発明の複合体の製造方法において、ペプチドは遊離形態であってもよく、塩の形態であってもよく、溶媒和物の形態であってもよく、あるいは修飾または誘導体化されていてもよい。ペプチドの塩は様々なものが公知であり、その製法も公知である。ペプチドの塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩（ＴＦＡ塩）、クエン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などが挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドの溶媒和物も公知であり、その製法も公知である。ペプチドの溶媒和物の例としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、プロピレングリコール、アセトアミドなどの溶媒和物が挙げられるが、これらに限定されない。様々な修飾ペプチドおよびペプチド誘導体が公知である。ペプチドの修飾および誘導体化方法も公知である。ペプチドの修飾および誘導体化の例としては、アセチル化、アミド化、ビオチン化、マレイミド化、メチル化などのアルキル化、マレイミド化、ミリストイル化、エステル化、リン酸化、蛍光標識、放射性標識などでの標識化などが挙げられるがこれらに限定されない。ペプチドのＮ末端がアセチル化されているのが好ましい。また、ペプチドを構成するアミノ酸は天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であってもよく、Ｌ体であってもＤ体であってもよい。本発明において、ペプチドという場合は、上記のような修飾されたペプチド、誘導体化されたペプチド、塩の形態のペプチド、アミノ酸が置換されたペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドを包含するものとする。なお、上で例示したペプチドは慣用的な１文字アミノ酸標記で示されている。

ＢＳＨも公知であり、ホウ素同位体^１０Ｂを１分子内に１２個有する結晶体である。上述のように、ＢＳＨは１分子当たりのホウ素原子数が多く、ＢＮＣＴに用いた場合、中性子線との衝突効率が良い。しかし、ＢＳＨは細胞膜を透過できないためそのままでは細胞内には入らないので、ＢＮＣＴによるがん細胞殺傷効果は低い。本発明においては、疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体を構築し、ＢＳＨをがん細胞内にうまく送達させ滞留することができる。このことにより、ＢＮＣＴによるがん細胞殺傷効果を飛躍的に向上させ、同時に安全性を担保することができる。本発明の複合体の製造方法において、ＢＳＨは修飾または誘導体化されていてもよい。修飾されたＢＳＨおよび誘導体化されたＢＳＨは公知であり、ペプチドを結合させたＢＳＨ、糖類を結合させたＢＳＨ、チオール基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、アジド基、ハロゲン基およびリン酸基等を有するＢＳＨなどが例示されるが、これらに限定されない。修飾されたＢＳＨおよび誘導体化されたＢＳＨの製造方法も公知である。

本発明の疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体は、水溶液中で上記ペプチドとＢＳＨを混合することにより得られる。この操作は非常に簡単である。混合の際に適宜撹拌あるいは超音波処理を行ってもよい。水溶液中の上記ペプチドの濃度は特に限定されず、一般的には数μＭ〜数千μＭである。水溶液中のＢＳＨの濃度も特に限定されず、一般的には数十μＭ〜数千μＭである。混合する上記ペプチドとＢＳＨのモル比も特に限定されないが、混合割合は、ペプチド１モルに対してＢＳＨ約１モル〜約１０００モルの割合が好ましく、例えばペプチド１モルに対してＢＳＨ約１〜約１００モルの割合、ペプチド１モルに対してＢＳＨ約１００〜約１０００モルの割合などであってもよい。

疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体を混合する水溶液は水を媒体とする溶液である。水溶液は水のみであってもよく、バッファーや塩類などの他の物質が添加されていてもよい。混合の際の温度、ｐＨ、混合時間などの条件は、当業者が適宜定めうる。例えば、Ａ６ＫやＡ６ＲとＢＳＨを混合する場合は、Ａ６Ｋのリジン残基あるいはＡ６Ｒのアルギニン残基が正電荷を有し、ＢＳＨが負電荷を有するような条件下で混合することが好ましい。ＰＢＳなどのバッファーを用いて水溶液のｐＨを所望の値にしてもよい。

本発明の方法により得られる疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体の形状は、表面に角状突起を有する球形または突起を有しない球形である。球形とは真球のみならずほぼ球形であるものも包含する。具体的には、長径に対する短径の割合が約０．５以上、好ましくは約０．６以上、さらに好ましくは約０．７以上であれば球形ということができる。本発明により得られる複合体の直径は約２０ｎｍ〜約２００ｎｍである。複合体の直径は長径と短径の平均であり、突起部がある場合は突起部を含めたものである。本発明の複合体の直径は、例えば電子顕微鏡を用いて測定することができる。本明細書において例えば「複合体の直径が約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ」という場合、複合体の大部分、例えば約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上のものの直径が約２０ｎｍ〜約２００ｎｍという意味である。

様々なＤＤＳキャリアにおいて、薬剤到達に関与する大きな因子は、薬剤とキャリアの複合体の大きさである。この複合体の直径が大き過ぎると腫瘍血管からの漏出が困難となり腫瘍到達能が低くなる。また、小さ過ぎると腫瘍部における薬剤滞留性が低くなって薬剤の濃度が低値となる。これまでに報告されている薬剤とキャリアの複合体の理想値は２０〜１００ｎｍ前後とされている。即ちがん組織部位周辺での血管透過性亢進によるＥＰＲ効果を期待する場合は１００ｎｍ程度であるが、慢性炎症を併発する難治性がんの場合は２０ｍｎ〜３０ｎｍ前後と言われている。後で説明するように、本発明の複合体の直径は約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、例えば２０ｎｍ〜１００ｎｍ前後であり、この理想値に近いので、腫瘍到達度と薬剤滞留性の両方に優れている。

本発明の製造方法によれば、ペプチドとＢＳＨを混合するだけで、直径が約２０ｎｍ〜約２００ｎｍである複合体が多く得られる。したがって、本発明の製造方法によって得られた複合体をそのままＢＮＣＴに用いてもよい。混合するペプチドに対するＢＳＨの割合が小さいと、得られる複合体の直径は小さいものが多くなり、ペプチドに対するＢＳＨの割合が大きいと、複合体の直径は大きいものが多くなる。この性質を利用して、複合体の直径を調節することができる。また、所望のポアサイズのフィルターや所望のポアサイズを有するエクストルーダー等の手段を用いて複合体の直径を調節してもよい。

もう１つの態様において、本発明は、疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体を提供する。本発明の複合体は、直径が約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの球形である。

本発明は、さらにもう１つの態様において、上記複合体を含む、がんのＢＮＣＴのための薬剤を提供する。本発明の複合体は、ＢＳＨをがん細胞内に効率良く送達し滞留することができる。そのため、本発明の複合体を含む薬剤は、ＢＮＣＴの効果を格段に高めることができる。

本発明の薬剤を用いて治療可能ながんはいずれの種類のがんであってもよく、特に限定されない。本発明の薬剤を用いて治療可能ながんの例としては、食道がん、胃がん、大腸がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、腎細胞がん、消化管間質腫瘍、中皮腫、脳腫瘍（髄膜腫、神経膠腫、下垂体腫瘍、聴神経腫瘍、多型性膠芽腫等など）、頭頚部がん、喉頭がん、口腔がん、口腔底がん、歯肉がん、舌がん、頬粘膜がん、唾液腺がん、副鼻腔がん、上顎洞がん、前頭洞がん、篩骨洞がん、蝶型骨洞がん、甲状腺がん、肺がん、骨肉腫、膀胱がん、前立腺がん、精巣腫瘍、睾丸がん、陰茎がん、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、皮膚がん、横紋筋肉腫、白血病、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、これらに限らない。

本発明の複合体をそのままＢＮＣＴのための薬剤として用いてもよく、あるいは医薬上許容される担体または賦形剤を用いて、当業者に公知の方法にて様々な剤形に処方してもよい。使用する担体または賦形剤は当業者に公知であり、適宜選択することができる。本発明の薬剤は、当業者に公知の手段・方法を用い製造することができる。例えば、注射剤や輸液剤を製造する場合は、生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水などの医薬上許容される担体を用いることができる。本発明の薬剤の調製に際し、増粘剤、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、保存剤、分散剤、湿潤剤、安定剤、防腐剤、懸濁剤、界面活性剤等の医薬上許容される添加剤を用いてもよい。

本発明の薬剤の剤形は特に限定されず、治療すべき癌の部位、大きさ、種類、患者の状態等に応じて適宜選択することができる。本発明の薬剤は液状、半固形、固形のいずれであってもよい。本発明の薬剤の剤形の例としては、注射剤、輸液剤、点鼻剤、点眼剤、ローション剤、スプレー剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、座剤、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、シロップ剤、エアロゾール剤、経皮剤、経粘膜剤、吸入剤などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは本発明の薬剤は、投与時に生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水などの医薬上許容される担体に懸濁される凍結乾燥品の形態であってもよい。

本発明の薬剤の投与経路も特に限定されず、治療すべき癌の部位、大きさ、種類、患者の状態等に応じて適宜選択することができる。本発明の薬剤の投与経路の例としては、皮下注射、皮内注射、静脈注射、点滴、経口投与、経粘膜投与、経腸投与、点眼、点鼻、点耳、吸入、経皮投与、腫瘍内投与を含む局所投与、脳室内投与などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の薬剤の用量は、治療すべき癌の種類、部位、大きさ、種類、患者の状態等応じて医師が適宜用量を決定することができる。

本発明の薬剤を患者に投与し、本発明の複合体が治療すべき部位に到達するに十分な時間が経過した後、中性子を照射する。中性子の照射に際し、原子炉または加速器型中性子発生装置を用い、中性子線量と中性子スペクトル、照射時間等、治療に必要な諸条件を決定する。

本発明の薬剤の投与および中性子照射を１回ないし複数回行うことができる。上記の回数は、癌の部位や種類、癌の縮小程度、患者の状態等を考慮して、医師が定めうる。

本発明は、さらにもう１つの態様において、がんのＢＮＣＴのための薬剤を製造するための上記複合体の使用を提供する。

本発明は、さらにもう１つの態様において、がんのＢＮＣＴのための上記複合体の使用を提供する。

本発明は、さらにもう１つの態様において、がん罹患者に上記複合体を投与し、該患者に中性子を照射することを含む、がんの治療方法を提供する。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。

（１）水溶液中のＡ６Ｋ（ＴＦＡ塩）の形状
常法により合成したＡ６Ｋ（ＴＦＡ塩）の凍結乾燥品をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し（濃度１０００μＭ）、ＨＣｌにてｐＨを４に調節した。１０分間超音波処理を行い、ＮａＯＨにてｐＨを７とした。得られた溶液をポアサイズ１００ｎｍのエクストルーダーに通し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で濃度５０μＭに希釈した。そのうち１．２μＬを試料として分取し、走査型電子顕微鏡で観察した。電子顕微鏡像を図１に示す。Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）はチューブ状の形態を有していた。上と同様にして調製した濃度２００μＭのＡ６Ｋ（ＴＦＡ塩）溶液をＤＬＳ試験に供した。そのチャートを図２に示す。このチャートにおいて２峰性のピークが観察され、Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）がチューブ状であることが示された。

（２）Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨを含む複合体の製造
上記（１）と同様にしてＡ６Ｋ（ＴＦＡ塩）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水溶液（１０μＭ）を得た。ＢＳＨを添加し（濃度１０００μＭ）、室温で３分間撹拌混合し、得られた複合体を走査型電子顕微鏡にて観察した。結果を図３に示す。複合体は角状突起を有する球形（金平糖状）であり、大部分のものが直径約２０ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲であった。上と同様にしてＡ６Ｋ（ＴＦＡ塩）（２００μＭ）とＢＳＨ（２０００μＭ）を混合して得られた複合体をＤＬＳ試験に供した。結果を図４に示す。近接する２峰性のピークが観察され、複合体がほぼ球形であることが示された。これらの結果は、得られた複合体の形状やサイズが、ＢＳＨをがん細胞内に送達するのに最適なものであることを示す。

（３）複合体のがん細胞内への送達
Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）およびＢＳＨを上記（２）に記載した方法と同様の方法で撹拌混合して複合体を調製した。混合時間を１０分、３０分、１８０分とした。得られた複合体をＰＢＳ（ｐＨ７．１−７．３）にて希釈し、シャーレ中のグリオーマセルラインＵ８７ΔＥＧＦＲに添加した。複合体の添加量は、Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）の最終濃度が５０μＭ、ＢＳＨの最終濃度が５０００μＭとなるようにした。複合体とともに３７℃で３時間、１２時間、２４時間培養して得られた各細胞試料をＩＣＰ−ＡＥＳに供して細胞中のホウ素濃度を測定した。結果を図５に示す。いずれの条件下でも、複合体は細胞に取り込まれた。１２時間および２４時間の培養で、多量の複合体ががん細胞内に取り込まれることがわかった。培養時間は１２時間で十分であった。撹拌混合時間はがん細胞内への複合体の送達量に対してあまり影響しなかった。撹拌混合時間は１０分で十分であった。培養時間の延長により、細胞内ＢＳＨ量の増加が示された。これにより、本複合体にはがん細胞内滞留性があることが確認された。

（１）Ａ６Ｒ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨを含む複合体の製造
常法により合成したＡ６Ｒ（ＴＦＡ塩）の凍結乾燥品をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し（濃度１０００μＭ）、ＨＣｌにてｐＨを４に調節した。１０分間超音波処理を行い、ＮａＯＨにてｐＨを７とした。得られた溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で濃度１０μＭに希釈した。このようにして得られたＡ６Ｒ（ＴＦＡ塩）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水溶液（１０μＭ）にＢＳＨを添加し（濃度１０００μＭ）、室温で３分間撹拌混合および１０分超音波処理した後、ポアサイズ５０ｎｍのエクストルーダーに通して複合体を得た。得られた複合体を走査型電子顕微鏡にて観察した。結果を図６に示す。複合体は球形であり、大部分のものが直径約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲であった。また、Ａ６Ｒ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨのモル比を１：１（２０μＭ：２０μＭ）として上記と同様にして複合体を調製した場合は、複合体のサイズが小さくなり、直径約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍのものが多く、直径２０ｎｍ前後のものも見られた。

（２）複合体のがん細胞内への送達
Ａ６Ｒ（ＴＦＡ塩）およびＢＳＨを上記（１）に記載した方法と同様の方法で撹拌混合して複合体を調製した。得られた複合体をＰＢＳ（ｐＨ７．１−７．３）にて希釈し、シャーレ中のグリオーマセルラインＵ８７ΔＥＧＦＲに添加した。複合体の添加量は、図７および図８に示すＡ６Ｒ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨの最終濃度となるようにした。複合体とともに３７℃で６時間、１２時間、２４時間培養して得られた各細胞試料をＩＣＰ−ＡＥＳに供して細胞中のホウ素濃度を測定した。結果を図７および図８に示す。図７に示すように、Ａ６Ｒ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨの複合体は濃度依存的に細胞内に導入されることが確認された。また図８に示すように、培養は６時間で十分であった。１２時間培養後、２４時間培養後にもかなりの複合体が細胞に残存しており、本複合体にはがん細胞内滞留性があることが確認された。

本発明の複合体の細胞内分布について調べた。
（１）実験方法
Ｕ８７ΔＥＦＧＲ細胞を２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ製）内、ガラスプレート（ＰＬＬコート、１２ｍｍ：ＩＷＡＫＩ製）に播種し（３０００個／ウェル、各ウェルに１ｍｌ）、ＣＯ_２インキュベータ内、３７℃で２４時間培養後、実施例１の（２）と同様の方法で調製したＡ６Ｋ（ＴＦＡ塩）とＢＳＨを含む複合体を添加した。複合体の添加量は、Ａ６Ｋ（ＴＦＡ塩）の最終濃度が２０μＭ、ＢＳＨの最終濃度が２０００μＭとなるようにした。複合体を添加して９０分培養した後、細胞培養液を除去して、室温下ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を１ｍｌ加え５分間静置後除去し、３回（各１ｍｌ、５分間）洗浄した。次いで、パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液（４％、１ｍｌ）を加え、３０分間インキュベートして固定した。これをＰＢＳで３回洗浄（同上）した。次いで、Ｔｒｉｔｏｎ（０．２５％）を含むＰＢＳ溶液（１ｍｌ）を加えて、３７℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄（同上）した。ついで、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、１％）を含むＰＢＳ溶液（１ｍｌ）を加え、室温下１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで３回洗浄（同上）した。

十分量の一次抗体染色液（０．１％ＢＳＡ ＰＢＳ中のＢＳＨ抗体〔１：２００〕（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ））を、陰性コントロール以外のサンプルに添加して覆った。陰性コントロールは一次抗体を含まないが抗体の希釈に使用したのと同じ液を用いた。それぞれ２時間室温でインキュベートした。サンプルから一次抗体染色液を除去し、次いでＰＢＳで３回洗浄（同上）した。十分量の二次抗体染色溶液（０．１％ＢＳＡ ＰＢＳ中のロバ抗−マウスＩｇＧ（Ａｌｅｘａ ４８８）〔１：１００〕）をサンプルに添加して覆い、室温で２時間インキュベートした。二次抗体を含まない陰性コントロールも同様に行った。サンプルから二次抗体染色液を除去し、次いでＰＢＳで３回洗浄（同上）した。

ガラスプレパラート上に封入液（ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄ：Ｔｈｅｒｍｏ）を加え、サンプルを定着した。このようにして、がん細胞Ｕ８７ΔＥＧＦＲの細胞免疫染色ガラスプレパラートを調製した。

（２）実験結果
染色画像を図９に示す。細胞質のみならず、核内にも染色が見られたことから、本発明の複合体は、細胞内だけでなく核内にまで移行することが示された。これらの結果から、本発明の複合体を含む細胞に中性子線を照射することで、当該細胞を選択的に破壊することができ、効率的ながん治療が可能であるといえる。

本発明の複合体を含むがん細胞に中性子を照射してコロニー形成阻害を調べた。

（１）Ａ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨを含む複合体の製造
常法により合成したＡ６Ｋ（塩酸塩）の凍結乾燥品をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、１０分間超音波処理を行った。得られたＡ６Ｋ（塩酸塩）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水溶液の一部を分取し、走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡にて観察した。Ａ６Ｋ（塩酸塩）はチューブ状の形態を有していた。Ａ６Ｋ（塩酸塩）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水溶液にＢＳＨを添加し、室温で３分間撹拌混合および１０分超音波処理した。Ａ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨのモル比を１：１０（１６６μＭ：１．６６ｍＭ）および１：２５（１６６μＭ：４．１５ｍＭ）とした場合に、球形の複合体が得られた。得られた複合体の大部分のものは直径１００ｎｍ前後であった。Ａ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨのモル比を１対１０とした場合の複合体の走査型電子顕微鏡写真を図１０に示す。

（２）複合体のがん細胞内への送達
実施例２（２）に記載したのと同様の手順にて、上記（１）で得られたＡ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨを含む複合体（Ａ６Ｋ（塩酸塩）：ＢＳＨのモル比１：１０）をグリオーマセルラインＵ８７ΔＥＧＦＲに添加した。複合体の添加量は、図１１に示すＡ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨの最終濃度となるようにした。複合体とともに３７℃で２４時間培養後、ＩＣＰ−ＡＥＳにて細胞中のホウ素濃度を測定した。図１１に示すように、ＢＳＨ（２ｍＭ）のみを添加した群では細胞内ホウ素濃度が５９５．２±１０５．１ｎｇ／細胞１０^６個であったのに対し、Ａ６Ｋ（塩酸塩）（２００μＭ）とＢＳＨ（２ｍＭ）の複合体を添加した群では細胞内ホウ素濃度は１１２６２±３８９０ｎｇ／細胞１０^６個であった。これらの結果から、本複合体はがん細胞内に特異的に取り込まれ、２４時間培養後にも高濃度の複合体が細胞内に滞留していることがわかった。

（３）複合体の細胞内局在
実施例３（１）に記載したのと同様の手順にて、細胞内に送達されたＡ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨの複合体の細胞内分布について調べた。ＢＳＨ特異抗体で染色したがん細胞の顕微鏡像を図１２に示す。これらの結果から、Ａ６Ｋ（塩酸塩）／ＢＳＨ複合体 ４０μＭ／４００μＭ投与群および２００μＭ／４００μＭ投与群の両方においてホウ素薬剤ＢＳＨの細胞内導入が確認された。本発明の複合体を含む細胞に中性子線を照射することで、当該細胞を選択的に破壊することができ、効率的ながん治療が可能であるといえる。

本発明の複合体を含むがん細胞に中性子を照射して、コロニー形成試験を行った。

実施例２（２）に記載したのと同様の手順にて、実施例４（１）で得られたＡ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨを含む複合体を舌扁平上皮癌由来細胞株（ＳＡＳ）に添加した。複合体の添加量は、Ａ６Ｋ（塩酸塩）が２０μＭ、ＢＳＨが２０００μＭとなるようにした（Ｂ１０として０．２４ｍｇ／ｍｌ）。ＢＳＨ（２０００μＭ）のみを添加した系（Ｂ１０として０．２４ｍｇ／ｍｌ）、および複合体もＢＳＨも添加しなかった系についても実験を行った。いずれの系においても３７℃で２４時間培養を行った。中性子線照射は、２０分、４５分および９０分行った。コロニー形成法にて細胞の生存率を算出した。各系において試料数（Ｎ）は３であった。結果を図１３に示す。Ａ６Ｋ（塩酸塩）とＢＳＨを含む複合体を含むがん細胞の生存率はＮｅｕｔｒｏｎ ｆｌｕｅｎｃｙ（中性子フルエンス）の増加に伴って顕著に低下することが確認された。中性子フルエンスが６．７×１０^１１ｎ／ｃｍ^２の場合、複合体もＢＳＨも含まないがん細胞およびＢＳＨのみを含むがん細胞の生存率は１０〜２０％であるのに対し、上記複合体を含むがん細胞の生存率はわずか２％未満であった。これらの結果から、本発明の複合体を含む細胞に中性子線を照射することで、当該細胞を選択的に破壊することができ、効率的ながん治療が可能であることが示された。

脳腫瘍のモデル動物（Ｕ８７ΔＥＧＦＲを移植したｉｎ ｖｉｖｏモデル）に本発明の剤を投与し、特異的に腫瘍にＢＳＨが導入されているかどうかを調べた。

本実験に関する動物の飼育、保管、使用は岡山大学動物実験委員会に承認された （承認番号：ＯＫＵ−２０１６４７５）手順に従い行った。担がんモデルマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ，メス，６−８週齢，２５ｇ，日本エスエルシー，静岡）はＵ８７ΔＥＧＦＲ細胞懸濁液（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／μＬ）３μＬを脳内に直接注入して作製した。２週間後、Ａ６ＫとＢＳＨを含む複合体（Ａ６Ｋ ２ｍＭ／ＢＳＨ ２０ｍＭ）を２００μＬ、対照実験としてＢＳＨ ２０ｍＭを２００μＬをそれぞれ尾静脈より投与した（マウス体重を２０ｇとすると、Ａ６Ｋ・ＨＣｌは８ｍｇ／ｋｇ，ＢＳＨは３３．４ｍｇ／ｋｇと換算された）。

実験に用いた複合体（実施例４（１）記載の化合物）を以下のようにして調製した。Ａ６Ｋ １０ｍＭ ７０μＬにＭＱ水７０μＬを加えＡ６Ｋ ５ｍＭに調整した。Ａ６Ｋ ５ｍＭ １４０μＬにＢＳＨ ２００ｍＭ ３５μＬとＭＱ水１７５μＬを加えＡ６Ｋ ２ｍＭ／ＢＳＨ ２０ｍＭ溶液を調製した。Ａ６Ｋは株式会社スリー・ディー・マトリックス社から、ＢＳＨはステラファーマ株式会社から入手した。

投与後、１２時間にてマウス脳を凍結組織切片作成用包埋剤ティシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドで包埋した。脳を凍結後１０μｍの厚さに薄切し、凍結切片を作製した。４％（ｗ／ｖ） パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ，和光純薬工業） を用いて、室温で１０分、凍結切片を固定した。ＰＢＳで洗浄後、１％（ｗ／ｖ） ＢＳＡでブロッキングし、０．３％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む抗ＢＳＨマウスモノクローン抗体（５μ９／ｍＬ）およびラビット製抗ＨＬＡ−Ａ抗体溶液に室温で２時間浸した。洗浄後、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ４８８（緑色蛍光）を標識したロバ製抗マウス抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液 （２０μｇ／ｍＬ）およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ５５５（赤色蛍光）を標識したヤギ製抗ラビット抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液（２μｇ／ｍＬ）に室温で２時間浸した。洗浄後、ヘキスト３３２５８で核染色し、プレパラートを作製後、共焦点レーザー顕微鏡でＢＳＨの局在を観察した。抗ＢＳＨ抗体は大阪府立大学切畑教授より供与されたものを希釈し、凍結しておいたものを使用時に解凍して用いた。

ＨＬＡ−Ａはヒトの主要組織適合抗原で、移植し増殖したヒト由来の悪性膠芽腫Ｕ８７ΔＥＧＦＲには発現するが、マウスの正常脳組織には発現していない。本実験ではＨＬＡ−Ａを赤色蛍光で検出した。赤色蛍光を有する細胞の集団があり、かつ境界が明瞭である事から、ヒト由来の悪性膠芽腫Ｕ８７ΔＥＧＦＲがヌードマウス脳内で増殖し、ヒト脳腫瘍モデルができている事が確認できた。
これらの脳腫瘍モデル動物に対し実施例４（１）記載の化合物（Ａ６Ｋ／ＢＳＨ）を尾静脈から１回投与し、１２時間後にこの脳腫瘍組織を摘出して抗ＢＳＨマウスモノクローン抗体で免疫組織染色し、緑色蛍光によってＢＳＨの存在を検出した。対照実験としてＢＳＨ単独を同量投与した。結果を図１４にまとめ示す。

実施例４（１）記載の化合物（Ａ６Ｋ／ＢＳＨ）を投与したマウスでは、ＢＳＨの存在を示す強い緑色を検出し、しかもそれはＨＬＡ−Ａ陽性（赤）の腫瘍組織に一致していた。ＢＳＨのみを投与した対照実験では緑色は弱く、ＢＳＨの細胞内取り込みが低いことが確認され、かつその存在部位は腫瘍組織とマウスの正常脳組織とで差がなかった。

本実験において、ヌードマウス脳内にヒト由来の神経膠芽腫を移植して脳腫瘍モデル動物を作製し、実施例４（１）記載の化合物の投与により、脳腫瘍部位に特異的にＢＳＨを導入できることが確認された。

本発明は、がん治療剤の製造、特にがんの放射線治療剤の分野において利用可能である。

Claims (10)

1. 水溶液中で疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとメルカプトウンデカハイドロデカボレート（ＢＳＨ）を混合することを特徴とする、上記ペプチドとＢＳＨを含む複合体の製造方法であって、上記ペプチドがＡ６ＫまたはＡ６Ｒであり、上記ペプチド１モルに対してＢＳＨ１モル〜１０００モルの割合で混合するものである方法。
2. 複合体の直径を調節することをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 複合体が直径約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの球状である請求項１または２記載の方法。
4. 疎水性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基を含むペプチドとＢＳＨを含む複合体であって、上記ペプチドがＡ６ＫまたはＡ６Ｒであり、直径が約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの球形であり、がん細胞中に送達され滞留する複合体。
5. 請求項４記載の複合体を含む、がんのホウ素中性子捕捉療法のための薬剤。
6. がんのホウ素中性子捕捉療法に用いられる、請求項４記載の複合体。
7. がんのホウ素中性子捕捉療法のための薬剤を製造するための、請求項４記載の複合体の使用。
8. 静脈注射剤または輸液剤である請求項５記載の薬剤。
9. 静脈注射または輸液により投与される請求項６記載の複合体。
10. 薬剤が静脈注射または輸液により投与される請求項７記載の使用。