JP6548293B2

JP6548293B2 - ｂＦＧＦの精製方法およびｂＦＧＦの製造方法

Info

Publication number: JP6548293B2
Application number: JP2015193175A
Authority: JP
Inventors: 寛之北川; 昌城安達; 敬亨大谷
Original assignee: Katayama Chemical Industries Co Ltd
Current assignee: Katayama Chemical Industries Co Ltd
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2019-07-24
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: JP2017066082A

Description

本発明は、ｂＦＧＦの精製方法およびｂＦＧＦの製造方法に関する。

ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor、ＦＧＦ−２）は、線維芽細胞の増殖因子として同定されたタンパク質である。近年、前記ｂＦＧＦは、ヒト人工多能性幹細胞等の多能性幹細胞の未分化状態の維持に必要な因子であることが明らかとなった。再生医療の発展と共にｂＦＧＦの需要の増大が見込まれるが、ｂＦＧＦをカラムクロマトグラフィーにより精製する場合、多数回のカラムクロマトグラフィーを実施する必要があり、煩雑であるという問題があった。このため、ｂＦＧＦを簡便に精製可能なｂＦＧＦの精製方法が求められている。

そこで、本発明は、簡便なｂＦＧＦの精製方法およびｂＦＧＦの製造方法の提供を目的とする。

前記本発明の課題を解決するために、本発明のｂＦＧＦの精製方法は、ｂＦＧＦを含むサンプルを陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、ｂＦＧＦを含む粗精製サンプルを取得する工程と、
前記粗精製サンプルの塩濃度を調整する工程と、
前記調整後の粗精製サンプルを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、精製ｂＦＧＦを取得する工程とを含み、
前記調整後の粗精製サンプルにおける塩濃度が、１．５ｍｏｌ／Ｌを超えることを特徴とする。

本発明のｂＦＧＦの製造方法は、ｂＦＧＦを含むサンプルから精製ｂＦＧＦを精製する工程を含み、
前記精製工程が、前記本発明のｂＦＧＦの精製方法により実施されることを特徴とする。

本発明によれば、簡便なｂＦＧＦの精製方法およびｂＦＧＦの製造方法の提供できる。

図１は、精製サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図２は、固体画分のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。

本発明の精製方法は、例えば、前記塩濃度が、２．５ｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは、１．８〜２．５ｍｏｌ／Ｌである。

本発明の精製方法は、例えば、前記塩が、硫酸アンモニウムである。

本発明の精製方法は、例えば、前記陽イオン交換クロマトグラフィーの充填剤の官能基が、スルホプロピル基である。

本発明の精製方法は、例えば、前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの充填剤の疎水性リガンドが、ブチル基である。

本発明の精製方法は、例えば、前記ｂＦＧＦを含むサンプルが、還元剤を含む。

本発明の精製方法は、例えば、前記調整後の粗精製サンプルから液体画分を回収する工程を含み、
前記精製ｂＦＧＦの取得工程において、前記液体画分を前記疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記精製ｂＦＧＦを取得する。

本発明の精製方法は、例えば、前記ｂＦＧＦを含むサンプルが、ｂＦＧＦを発現する大腸菌の破砕物でもよいし、ｂＦＧＦを発現する大腸菌の破砕物の液体画分でもよい。

本発明の精製方法は、例えば、さらに、ｂＦＧＦ遺伝子が形質導入された大腸菌を培養し、前記大腸菌にｂＦＧＦを発現させる工程と、
得られたｂＦＧＦを発現する大腸菌からｂＦＧＦを含むサンプルを調製する工程とを含む。

本発明の精製方法は、例えば、さらに、大腸菌にｂＦＧＦ遺伝子を形質導入する工程を含む。

本発明の製造方法は、例えば、前記精製工程で得られたｂＦＧＦの純度が、９６％以上である。

＜ｂＦＧＦの精製方法＞
本発明のｂＦＧＦの精製方法（以下、「精製方法」ともいう。）は、前述のように、ｂＦＧＦを含むサンプル（以下、「ｂＦＧＦサンプル」ともいう。）を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、ｂＦＧＦを含む粗精製サンプルを取得する工程（粗精製工程）と、前記粗精製サンプルの塩濃度を調整する工程（塩濃度調整工程）と、前記調整後の粗精製サンプル（以下、「調整サンプル」ともいう。）を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、精製ｂＦＧＦを取得する工程（ｂＦＧＦ取得工程）とを含み、前記調整後の粗精製サンプルにおける塩濃度が、１．５ｍｏｌ／Ｌを超えることを特徴とする。本発明の精製方法は、前記調整サンプルにおける塩濃度が、１．５ｍｏｌ／Ｌを超えることを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。

本発明者らは、鋭意研究の結果、前記調整サンプルにおける塩濃度を、１．５ｍｏｌ／Ｌを超える濃度とすることにより、前記粗精製サンプル中のｂＦＧＦ以外の夾雑物を効率良く析出できることを見出した。このため、本発明の精製方法は、クロマトグラフィーを使用する精製工程として、前記粗精製工程と前記ｂＦＧＦ取得工程との２工程で、例えば、後述する純度のｂＦＧＦを精製できる。したがって、本発明の精製方法によれば、簡便にｂＦＧＦを精製できる。また、本発明の精製方法は、簡便にｂＦＧＦを精製できるため、例えば、精製に要する時間を短縮できる。前記ｂＦＧＦは、例えば、精製開始から時間経過と共に活性が低下するが、本発明の精製方法によれば、例えば、精製に要する時間が短縮されているため、より活性の高い状態のｂＦＧＦを精製できる。また、本発明の精製方法は、例えば、前記ｂＦＧＦと結合するヘパリンを使わず、精製できる。前記ヘパリンは、抗凝血作用を有するため、例えば、前記ヘパリンを含むｂＦＧＦが、生体に入った場合、前記ヘパリンによる副作用が生じる。しかしながら、本発明の精製方法は、ヘパリンを使用しないでも精製できるため、例えば、前記ヘパリンの混入による副作用をなくすことができる。

本発明において、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor、ＦＧＦ−２）のアイソフォームは、特に制限されない。前記アイソフォームは、例えば、１６．５ＫＤａ、１８ＫＤａ、２２ＫＤａ、２２．５ＫＤａ、２４ＫＤａ、３４ＫＤａ等のアイソフォーム等があげられる。前記ｂＦＧＦの由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、モルモット、ウシ、ブタ等があげあれる。具体例として、前記ｂＦＧＦは、例えば、下記（Ｂ１）、（Ｂ２）、および（Ｂ３）からなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質があげられる。下記（Ｂ１）、（Ｂ２）、および（Ｂ３）において、前記線維芽細胞は、例えば、Ｂａｌｂ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１細胞である。

（Ｂ１）配列番号１〜５および６からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ２）前記（Ｂ１）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質
（Ｂ３）前記（Ｂ１）のアミノ酸配列に対して、所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質

前記（Ｂ１）における配列番号１〜６のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｂ１）は、例えば、ヒトから得ることができる。

ｂＦＧＦアイソフォーム１６．５ＫＤａ（配列番号１）
MPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS

ｂＦＧＦアイソフォーム１８ＫＤａ（配列番号２）
MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS

ｂＦＧＦアイソフォーム２２ＫＤａ（配列番号３）
LGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAAPRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS

ｂＦＧＦアイソフォーム２２．５ＫＤａ（配列番号４）
LPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAAPRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS

ｂＦＧＦアイソフォーム２４ＫＤａ（配列番号５）
LGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAAPRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS

ｂＦＧＦアイソフォーム３４ＫＤａ（配列番号６）
MVGVGGGDVEDVTPRPGGCQISGRGARGCNGIPGAAAWEAALPRRRPRRHPSVNPRSRAAGSPRTRGRRTEERPSGSRLGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAAPRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS

前記「１または数個」は、例えば、１〜５８個、１〜４４個、１〜２９個、１〜１５個、１〜１２個、１〜９個、１〜６個、１〜３個、１個または２個である。

前記「所定の同一性」は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。

前記ｂＦＧＦサンプルは、前記ｂＦＧＦを含めばよい。前記ｂＦＧＦサンプルは、例えば、ｂＦＧＦが形質導入された形質転換体、ｂＦＧＦを発現する細胞、組織、臓器または培養細胞等があげられる。前記形質転換体を作製するための宿主は、特に制限されず、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられる。具体的に、前記形質転換体は、例えば、ｂＦＧＦが形質導入された細胞または培養細胞、ｂＦＧＦが形質導入された大腸菌等があげられる。前記ｂＦＧＦサンプルは、例えば、ｂＦＧＦの回収率を向上できることから、前記形質転換体等の破砕物が好ましく、前記形質転換体等の破砕物の液体画分がより好ましい。具体例として、前記ｂＦＧＦサンプルは、例えば、ｂＦＧＦを発現する大腸菌（ｂＦＧＦ発現大腸菌）の破砕物があげられ、好ましくは、前記ｂＦＧＦ発現大腸菌の破砕物の液体画分である。前記ｂＦＧＦサンプルは、例えば、１種類のｂＦＧＦを含んでもよいし、２種類以上のｂＦＧＦを含んでもよい。

前記ｂＦＧＦサンプルは、例えば、液体サンプルが好ましい。前記ｂＦＧＦサンプルは、例えば、前記ｂＦＧＦサンプルの未希釈液をそのまま液体サンプルとして使用してもよいし、前記ｂＦＧＦサンプルを媒体に、懸濁、分散または溶解した希釈液を液体サンプルとして使用してもよい。前記ｂＦＧＦサンプルが固体の場合、例えば、前記ｂＦＧＦサンプルを前記媒体に懸濁、分散または溶解した希釈液を液体サンプルとして使用してもよい。前記媒体は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。

前記ｂＦＧＦサンプルは、例えば、精製時の前記ｂＦＧＦの活性を維持できることから、還元剤を含むことが好ましい。前記還元剤は、特に制限されず、公知のタンパク質用の還元剤が使用でき、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、システイン、グルタチオン等があげられる。前記還元剤は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記還元剤の濃度は、例えば、０．００１〜０．００５ｍｏｌ／Ｌである。前記還元剤は、例えば、後述する平衡化液、洗浄液、および溶出液に含まれてもよい。

前記塩は、特に制限されず、例えば、塩析に使用可能な塩があげられる。前記塩は、例えば、クエン酸塩、酒石酸塩、硫酸塩、酢酸塩、塩化物塩等があげられる。具体例として、前記塩は、例えば、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム等があげられ、好ましくは、硫酸アンモニウムである。前記塩は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。

陽イオン交換クロマトグラフィーの充填剤（第１の充填剤）は、特に制限されず、公知の陽イオン交換クロマトグラフィー用の充填剤を使用できる。前記第１の充填剤は、例えば、担体と官能基とを含む。前記担体は、特に制限されず、前記官能基の種類に応じて、適宜設定できる。前記担体は、例えば、スチレンビーズ、アガロースビーズ（例えば、セファロース）、シリカ、デキストラン、ポリマー樹脂等があげられる。前記担体の径は、例えば、２０〜３００μｍである。前記官能基は、特に制限されず、例えば、カルボキシメチル基、カルボキシル基、リン酸基、スルホ基、スルホメチル基、スルホエチル基、スルホプロピル基等があげられ、好ましくは、スルホプロピル基である。具体例として、前記第１の充填剤は、例えば、TOYOPEARL（登録商標）SP-550、TOYOPEARL（登録商標）SP-650（東ソー株式会社製）、SP Sepharose Fast Flow（GEヘルスケア社製）等があげられる。

疎水性相互作用クロマトグラフィー充填剤（第２の充填剤）は、特に制限されず、公知の疎水性相互作用クロマトグラフィー用の充填剤を使用できる。前記第２の充填剤は、例えば、担体と疎水性リガンドとを含む。前記担体は、例えば、前述の第１の充填剤における担体の説明を援用できる。前記疎水性リガンドは、特に制限されず、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、tert-ブチル基、ヘキシル基、オクチル基等の直鎖または分枝アルキル基、フェニル基等のアリール基、ポリプロピレングリコール基等があげられ、好ましくは、ブチル基である。具体例として、前記第２の充填剤は、例えば、TOYOPEARL（登録商標）Butyl-600、TOYOPEARL（登録商標）Butyl-650（東ソー株式会社製）、Butyl-S Sephalose Fast Flow（GEヘルスケア社製）等があげられる。

以下、本発明の精製方法の各工程について、説明する。各工程において使用する試薬等は、例えば、動物由来成分を含まない試薬、いわゆるアニマルフリーグレードの試薬を使用してもよい。

本発明の精製方法は、前記粗精製工程に先立ち、前記粗精製工程で使用するｂＦＧＦサンプルを調製する工程（サンプル調製工程）を含んでもよい。前記サンプル調製工程は、例えば、ｂＦＧＦ遺伝子が形質導入された大腸菌を培養し、前記大腸菌にｂＦＧＦを発現させる工程と、得られたｂＦＧＦを発現する大腸菌からｂＦＧＦを含むサンプルを調製する工程とを含む。

前記ｂＦＧＦが形質導入された大腸菌は、例えば、大腸菌にｂＦＧＦ遺伝子を形質導入することで取得できる。このため、本発明の精製方法は、例えば、前記大腸菌にｂＦＧＦ遺伝子を形質導入する工程を含んでもよい。

前記ｂＦＧＦ遺伝子がコードするｂＦＧＦのアイソフォームは、特に制限されず、例えば、前述のｂＦＧＦのいずれのアイソフォームでもよい。前記ｂＦＧＦ遺伝子の由来は、特に制限されず、例えば、前記ｂＦＧＦの説明を援用できる。具体例として、前記ｂＦＧＦ遺伝子は、例えば、下記（ｂ１）〜（ｂ６）および（ｂ７）からなる群から選択された少なくとも１つのポリヌクレオチドがあげられる。下記（ｂ１）〜（ｂ６）および（ｂ７）において、前記線維芽細胞は、例えば、Ｂａｌｂ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１細胞である。

（ｂ１）配列番号７〜１１および１２からなる群から選択された少なくとも１つの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ２）前記（ｂ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）前記（ｂ１）の塩基配列に対して、所定の同一性を有する塩基配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ４）前記（ｂ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ５）配列番号１〜５および６からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ６）配列番号１〜５および６からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ７）配列番号１〜５および６からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列に対して、所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

配列番号７〜１１および１２の塩基配列は、以下の通りである。配列番号７〜１１および１２の塩基配列は、それぞれ、前記配列番号１〜５および６のアミノ酸配列からなるｂＦＧＦアイソフォームのコード配列である。前記（ｂ１）は、例えば、ヒトから得ることができる。

ｂＦＧＦアイソフォーム１６．５ＫＤａｃＤＮＡ（配列番号７）
5’-atgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggccgagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaagagagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaagatggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattggaatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactgaaacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatactttttcttccaatgtctgctaagagctga-3’

ｂＦＧＦアイソフォーム１８ＫＤａｃＤＮＡ（配列番号８）
5’-atggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggccgagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaagagagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaagatggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattggaatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactgaaacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatactttttcttccaatgtctgctaagagctga-3’

ｂＦＧＦアイソフォーム２２ＫＤａｃＤＮＡ（配列番号９）
5’-ctggggggccggggccggggccgtgccccggagcgggtcggaggccggggccggggccgggggacggcggctccccgcgcggctccagcggctcggggatcccggccgggccccgcagggaccatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggccgagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaagagagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaagatggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattggaatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactgaaacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatactttttcttccaatgtctgctaagagctga-3’

ｂＦＧＦアイソフォーム２２．５ＫＤａｃＤＮＡ（配列番号１０）
5’-ctgccgggcgggaggctggggggccggggccggggccgtgccccggagcgggtcggaggccggggccggggccgggggacggcggctccccgcgcggctccagcggctcggggatcccggccgggccccgcagggaccatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggccgagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaagagagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaagatggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattggaatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactgaaacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatactttttcttccaatgtctgctaagagctga-3’

ｂＦＧＦアイソフォーム２４ＫＤａｃＤＮＡ（配列番号１１）
5’-ctgggggaccgcgggcgcggccgcgcgctgccgggcgggaggctggggggccggggccggggccgtgccccggagcgggtcggaggccggggccggggccgggggacggcggctccccgcgcggctccagcggctcggggatcccggccgggccccgcagggaccatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggccgagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaagagagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaagatggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattggaatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactgaaacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatactttttcttccaatgtctgctaagagctga-3’

ｂＦＧＦアイソフォーム３４ＫＤａｃＤＮＡ（配列番号１２）
5’-ctggtgggtgtggggggtggagatgtagaagatgtgacgccgcggcccggcgggtgccagattagcggacgcggtgcccgcggttgcaacgggatcccgggcgctgcagcttgggaggcggctctccccaggcggcgtccgcggagacacccatccgtgaaccccaggtcccgggccgccggctcgccgcgcaccaggggccggcggacagaagagcggccgagcggctcgaggctgggggaccgcgggcgcggccgcgcgctgccgggcgggaggctggggggccggggccggggccgtgccccggagcgggtcggaggccggggccggggccgggggacggcggctccccgcgcggctccagcggctcggggatcccggccgggccccgcagggaccatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaaggaccccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggccgagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaagagagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaagatggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattggaatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactgaaacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatactttttcttccaatgtctgctaagagctga-3’

前記（ｂ２）において、「１または数個」は、例えば、前記（ｂ２）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記線維芽細胞の増殖活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ２）の「１もしくは数個」は、前記（ｂ１）の塩基配列において、例えば、１〜１７４個、１〜１３１個、１〜８７個、１〜４３個、１〜３５個、１〜２７個、１〜１８個、１〜９個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。

前記（ｂ３）において、「所定の同一性」は、例えば、前記（ｂ３）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記線維芽細胞の増殖活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ３）の同一性は、前記（ｂ１）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。

前記（ｂ４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｂ１）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ２^ｎｄＥｄ．）」〔（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。

前記（ｂ４）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ２^ｎｄＥｄ．）」〔（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。

前記（ｂ５）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｂ５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記線維芽細胞の増殖活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｂ５）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記配列番号１〜５および６のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。

前記（ｂ６）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ６）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記線維芽細胞の増殖活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ６）の「１もしくは数個」は、例えば、前記配列番号１〜５および６のアミノ酸配列において、例えば、１〜５８個、１〜４４個、１〜２９個、１〜１５個、１〜１２個、１〜９個、１〜６個、１〜３個、１個または２個である。

前記（ｂ７）において、アミノ酸配列に関する「所定の同一性」は、例えば、前記（ｂ７）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記線維芽細胞の増殖活性を有する範囲であればよい。前記（ｂ７）の同一性は、前記配列番号１〜５および６のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。

前記大腸菌へのｂＦＧＦ遺伝子の導入方法は、特に制限されず、公知の方法により実施できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。

前記ｂＦＧＦ遺伝子は、例えば、前記ｂＦＧＦをコードするポリヌクレオチドにより、前記大腸菌に導入されてもよいし、前記ｂＦＧＦをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより前記大腸菌に導入されてもよい。前記ベクターは、特に制限されず、公知のベクターが使用できる。前記ベクターは、例えば、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社）、ｐＥＴ−３ａ（ノバジェン社）、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）等があげられる

前記大腸菌の培養は、例えば、培地で培養することにより実施できる。前記大腸菌の培養に使用する培地は、例えば、固体培地、液体培地等、従来公知の培地を適宜使用できる。前記培地は、例えば、市販培地を含んでもよい。前記市販培地としては、特に制限されず、例えば、ＬＢ培地、スーパーブロス培地、Ｍ９培地等が挙げられる。これらは、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記培地のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ６〜８、ｐＨ６．５〜７．５である。前記培地は、例えば、前記ｂＦＧＦの発現誘導剤を含んでもよい。前記発現誘導剤は、特に制限されず、前記ｂＦＧＦ遺伝子のプロモーターに応じて適宜決定できる。具体例として、前記プロモーターとしてｌａｃプロモーターを使用する場合、前記発現誘導剤は、例えば、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等が使用できる。

前記大腸菌の培養方法は、特に制限されず、前記固体培地を用いた場合には、例えば、平板培養法、斜面培養法等があげられる。また、前記液体培地を用いた場合にも、特に制限されず、例えば、静置培養法、通気培養法、振とう培養法等があげられる。

前記大腸菌の培養温度は、特に制限されず、例えば、１５〜４０℃、３０〜３７℃等があげられる。前記大腸菌の培養時間は、特に制限されず、例えば、前記大腸菌を含む培養液の吸光度により決定できる。前記吸光度は、例えば、ＯＤ_６００＝０．４〜０．８である。

前記ｂＦＧＦを含むサンプルの調製方法は、特に制限されない。前記調製方法は、例えば、前記ｂＦＧＦ発現大腸菌を前記ｂＦＧＦサンプルとして調製してもよいし、前記ｂＦＧＦ発現大腸菌を破砕することで得られた破砕物を前記ｂＦＧＦサンプルとして調製してもよいし、前記破砕物の液体画分を前記ｂＦＧＦサンプルとして調製してもよい。前記ｂＦＧＦ発現大腸菌の破砕方法は、特に制限されず、公知の破砕方法が使用でき、例えば、ガラスビーズによる破砕、フレンチプレス、超音波処理、リゾチウム処理、凍結融解処理等の破砕方法があげられる。前記液体画分を回収する場合、前記液体画分の回収方法は、特に制限されず、例えば、公知の固液分離方法を実施し、得られた液体画分を回収することで実施できる。前記固液分離方法は、例えば、ろ過処理、遠心分離処理、沈殿処理、膜分離処理、吸着処理、凍結乾燥処理等の処理方法があげられる。前記ｂＦＧＦ発現大腸菌は、例えば、前記大腸菌を培養した培地を含んでもよい。

つぎに、前記粗精製工程では、前述のように、前記ｂＦＧＦサンプルを陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、ｂＦＧＦを含む粗精製サンプルを取得する。具体的に、前記粗精製工程は、例えば、前記ｂＦＧＦサンプルを前記第１の充填剤と接触させ、前記ｂＦＧＦと前記第１の充填剤とを結合させる工程と、第１の洗浄液により、前記ｂＦＧＦと前記第１の充填剤との結合物を洗浄する工程と、第１の溶出液により、前記結合物から前記ｂＦＧＦを解離させ、ｂＦＧＦを含む粗精製サンプルを取得する工程とを含む。

前記ｂＦＧＦサンプルと前記充填剤との接触は、例えば、前記第１の充填剤を第１のカラムに充填し、前記第１のカラムに前記ｂＦＧＦサンプルを負荷することで実施できる。前記第１のカラムの容量、材質等は、特に制限されず、例えば、前記第１の充填剤の種類、充填量等に応じて適宜決定できる。前記第１のカラムに充填する前記第１の充填剤の充填量は、特に制限されず、例えば、前記ｂＦＧＦサンプルの量、前記第１の充填剤の結合容量等に応じて、適宜決定できる。前記第１の充填剤を含む第１のカラムは、例えば、前記ｂＦＧＦサンプルの負荷に先立ち、第１の平衡化液により、前記第１の充填剤を平衡化してもよい。前記平衡化は、例えば、室温（例えば、２５℃前後）条件下で、２〜１０℃、４〜８℃の前記第１の平衡化液を用いて実施する。前記平衡化液は、例えば、前記第１の充填剤の種類に応じて、適宜決定できる。前記第１の平衡化液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８、ｐＨ７〜７．５である。前記第１の平衡化液は、例えば、緩衝液であり、好ましくは、リン酸緩衝液である。前記緩衝液の濃度は、例えば、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。前記第１の平衡化液は、例えば、前記塩を含んでもよい。前記塩は、例えば、塩化ナトリウムである。前記第１の洗浄液における塩濃度は、例えば、０．１〜０．４ｍｏｌ／Ｌ、０．２〜０．４ｍｏｌ／Ｌである。

前記ｂＦＧＦサンプルの負荷後、例えば、前記第１の洗浄液を前記第１のカラムに負荷し、前記ｂＦＧＦと前記第１の充填剤との結合物を洗浄する。前記洗浄は、例えば、室温（例えば、２５℃前後）条件下で、２〜１０℃、４〜８℃の前記第１の洗浄液を用いて実施する。前記第１の洗浄液は、例えば、前記第１の充填剤の種類に応じて、適宜決定できる。前記第１の洗浄液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８、ｐＨ７〜７．５である。前記第１の洗浄液は、例えば、緩衝液であり、好ましくは、リン酸緩衝液である。前記緩衝液のモル数は、例えば、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。前記第１の洗浄液は、例えば、前記塩を含んでもよい。前記塩は、例えば、塩化ナトリウムである。前記第１の洗浄液における塩濃度は、例えば、前記第１の平衡化液における塩濃度と同じ濃度でもよく、具体的には、０．１〜０．４ｍｏｌ／Ｌ、０．２〜０．４ｍｏｌ／Ｌである。

前記洗浄後、例えば、前記第１の溶出液を前記第１のカラムに負荷し、前記結合物から前記ｂＦＧＦを解離させ、ｂＦＧＦを含む粗精製サンプルを取得する。前記粗精製サンプルは、例えば、前記第１の溶出液で溶出された溶液の一部を取得してもよいし、全部を取得してもよい。前者の場合、例えば、前記第１の溶出液により溶出された溶液を複数の画分に分画し、前記ｂＦＧＦを含む画分を前記粗精製サンプルとして取得する。前記粗精製サンプルの取得は、例えば、室温（例えば、２５℃前後）条件下で、２〜１０℃、４〜８℃の前記第１の溶出液を用いて実施する。前記第１の溶出液は、例えば、前記第１の充填剤の種類に応じて、適宜決定できる。前記第１の溶出液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８、ｐＨ７〜７．５ある。前記第１の溶出液は、例えば、緩衝液であり、好ましくは、リン酸緩衝液である。前記緩衝液のモル数は、例えば、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。前記第１の溶出液は、例えば、前記塩を含んでもよい。前記塩は、例えば、塩化ナトリウムである。前記第１の溶出液における塩濃度は、例えば、前記第１の洗浄液における塩濃度より高い濃度であり、具体的には、０．５〜２ｍｏｌ／Ｌ、０．６〜０．８ｍｏｌ／Ｌである。

つぎに、前記塩濃度調整工程では、前述のように、前記粗精製サンプルの塩濃度を調整する。前記調整は、特に制限されず、例えば、前記粗精製サンプルへの前記塩の添加、前記粗精製サンプルの希釈等により実施できる。前記塩の添加は、例えば、前記塩を含む溶液の添加でもよい。前記塩濃度は、例えば、前記塩濃度調整工程において添加した塩由来の塩の濃度でもよいし、前記調整前に粗精製サンプルに存在する塩と調整時に添加した塩との両者由来の塩の濃度でもよい。前記調整サンプルにおける塩濃度は、１．５ｍｏｌ／Ｌを超えればよく、例えば、前記夾雑物を効率良く析出でき、且つより収率よくｂＦＧＦを精製できることから、好ましくは、２．５ｍｏｌ／Ｌ以下、２．３ｍｏｌ／Ｌ以下であり、前記夾雑物をより効率良く析出でき、且つ前記ｂＦＧＦをより収率よく精製できることから、より好ましくは、１．５ｍｏｌ／Ｌを超え、２．５ｍｏｌ／Ｌ以下、１．８〜２．５ｍｏｌ／Ｌ、１．８〜２．３ｍｏｌ／Ｌ、２．１〜２．３ｍｏｌ／Ｌ、１．８〜２．１ｍｏｌ／Ｌである。前記塩濃度は、例えば、１種類の塩の塩濃度でもよいし、２種類以上の塩の塩濃度の合計の塩濃度でもよい。具体例として、前記塩として硫酸アンモニウムを添加する場合、前記調整サンプルにおける硫酸アンモニウムの濃度は、例えば、１．８〜２．３ｍｏｌ／Ｌ、１．８〜２．１ｍｏｌ／Ｌ、１．８〜２ｍｏｌ／Ｌである。また、前記調整サンプルが前記塩として塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウムを含む場合、前記調整サンプルにおける塩化ナトリウムの濃度は、例えば、０．２〜０．４ｍｏｌ／Ｌであり、硫酸アンモニウムの濃度は、例えば、１．８〜２．３ｍｏｌ／Ｌ、１．８〜２．１ｍｏｌ／Ｌ、１．８〜２ｍｏｌ／Ｌである。

つぎに、前記ｂＦＧＦ取得工程では、前述のように、前記調整サンプルを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、精製ｂＦＧＦを取得する。具体的に、前記ｂＦＧＦ取得工程は、例えば、前記調整サンプルを前記第２の充填剤と接触させ、ｂＦＧＦと前記第２の充填剤とを結合させる工程と、第２の洗浄液により、前記ｂＦＧＦと前記第２の充填剤との結合物を洗浄する工程と、第２の溶出液により、前記結合物から前記ｂＦＧＦを解離させ、精製ｂＦＧＦを取得する工程とを含む。

前記調整サンプルと前記充填剤との接触は、例えば、前記第２の充填剤を第２のカラムに充填し、前記第２のカラムに前記調整サンプルを負荷することで実施できる。前記第２のカラムの容量、材質等は、特に制限されず、例えば、前記第２の充填剤の種類、充填量等に応じて適宜決定できる。前記第２のカラムに充填する前記第２の充填剤の充填量は、特に制限されず、例えば、前記調整サンプルの量、前記第２の充填剤の結合容量等に応じて、適宜決定できる。前記第２の充填剤を含む第２のカラムは、例えば、前記調整サンプルの負荷に先立ち、第２の平衡化液により、前記第２の充填剤を平衡化してもよい。前記平衡化は、例えば、室温（例えば、２５℃前後）条件下で、１０〜３０℃、１５〜２５℃の前記第２の平衡化液を用いて実施する。前記第２の平衡化液は、例えば、前記第２の充填剤の種類に応じて、適宜決定できる。前記第２の平衡化液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８、ｐＨ７〜７．５である。前記第２の平衡化液は、例えば、緩衝液であり、好ましくは、リン酸緩衝液である。前記緩衝液の濃度は、例えば、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。前記第２の平衡化液は、例えば、前記塩を含んでもよい。前記塩は、例えば、硫酸アンモニウムである。前記第２の平衡化液における塩濃度は、例えば、１．５〜２．５ｍｏｌ／Ｌ、１．９〜２．１ｍｏｌ／Ｌである。

前記調整サンプルの負荷後、例えば、前記第２の洗浄液を前記第２のカラムに負荷し、前記ｂＦＧＦと前記第２の充填剤との結合物を洗浄する。前記洗浄は、例えば、室温（例えば、２５℃前後）条件下で、１０〜３０℃、１５〜２５℃の前記第２の洗浄液を用いて実施する。前記第２の洗浄液は、例えば、前記第２の充填剤の種類に応じて、適宜決定できる。前記第２の洗浄液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８、ｐＨ７〜７．５である。前記第２の洗浄液は、例えば、緩衝液であり、好ましくは、リン酸緩衝液である。前記緩衝液のモル数は、例えば、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。前記第２の洗浄液は、例えば、前記塩を含んでもよい。前記塩は、例えば、硫酸アンモニウムである。前記第２の洗浄液における塩濃度は、特に制限されず、例えば、前記第２の平衡化液の塩濃度以下の塩濃度であり、具体的には、１．５ｍｏｌ／Ｌを超え、２．３ｍｏｌ／Ｌ以下、１．８〜２．３ｍｏｌ／Ｌ、１．８〜２ｍｏｌ／Ｌである。

前記洗浄後、例えば、前記第２の溶出液を前記第２のカラムに負荷し、前記結合物から前記ｂＦＧＦを解離させ、精製ｂＦＧＦを取得する。前記精製ｂＦＧＦは、例えば、前記第２の溶出液で溶出された溶液の一部を取得してもよいし、全部を取得してもよい。前者の場合、例えば、前記溶出液により溶出された溶液を複数の画分に分画し、前記ｂＦＧＦを含む画分を前記精製ｂＦＧＦとして取得する。前記精製ｂＦＧＦの取得は、例えば、室温（例えば、２５℃前後）条件下で、１０〜３０℃、１５〜２５℃の前記第２の溶出液を用いて実施する。前記第２の溶出液は、例えば、前記第２の充填剤の種類に応じて、適宜決定できる。前記第２の溶出液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８、ｐＨ７〜７．５である。前記第２の溶出液は、例えば、緩衝液であり、好ましくは、リン酸緩衝液である。前記緩衝液のモル数は、例えば、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。前記第２の溶出液は、例えば、前記塩を含んでもよい。前記塩は、例えば、硫酸アンモニウムである。前記第２の溶出液における塩濃度は、特に制限されず、例えば、前記第２の洗浄液の塩濃度未満の塩濃度であり、具体的には、０．９〜１．４ｍｏｌ／Ｌ、１〜１．３ｍｏｌ／Ｌである。

このようにして、精製ｂＦＧＦを精製できる。本発明の精製方法により得られるｂＦＧＦの純度は、例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記純度は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、質量分析等により測定できる。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて純度を測定する場合、例えば、デンシメトリーにより算出できる。また、前記ＲＰ−ＨＰＬＣおよび前記質量分析を用いて純度を測定する場合、例えば、得られたクロマトチャートの積分値（ピーク面積）に基づき、算出できる。

本発明の精製方法において、前記調整サンプルでは、例えば、前記粗精製サンプルに含まれるｂＦＧＦ以外の夾雑物が、効率良く析出される。このため、本発明の精製方法は、例えば、前記ｂＦＧＦの純度をより高くできることから、前記調整サンプルから液体画分を回収する工程を含み、前記精製ｂＦＧＦの取得工程において、前記液体画分を前記疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記精製ｂＦＧＦを取得してもよい。前記調整サンプルから液体画分を回収する方法は、特に制限されず、例えば、前述の液体画分の回収方法の説明を援用できる。また、前記液体画分から前記精製ｂＦＧＦを取得する方法は、例えば、前記ｂＦＧＦ工程の説明において、前記調整サンプルに代えて、前記液体画分を用いることにより実施できる。

＜ｂＦＧＦの製造方法＞
本発明のｂＦＧＦの製造方法（以下、「製造方法」ともいう。）は、前述のように、ｂＦＧＦを含むサンプルから精製ｂＦＧＦを精製する工程を含み、前記精製工程が、前記本発明のｂＦＧＦの精製方法により実施されることを特徴とする。本発明の製造方法は、前記精製工程が、前記本発明の精製方法により実施されることが特徴であり、その他工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法によれば、簡便に精製されたｂＦＧＦを製造できる。本発明の製造方法において、前記精製工程は、例えば、前記本発明の精製方法の説明を援用できる。

本発明の製造方法において、前記精製工程で得られたｂＦＧＦの純度は、特に制限されない。前記純度および純度の測定方法は、例えば、前述の説明を援用できる。

つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。

（実施例１）
本発明の精製方法により、ｂＦＧＦが精製できることを確認した。

（１）ｂＦＧＦサンプルの調製
ヒト由来ｃＤＮＡを鋳型として、ヒト由来ｂＦＧＦの１６．５ＫＤａアイソフォーム（配列番号１）をコードする下記ヒトｂＦＧＦ１６．５ＫＤａｃＤＮＡ（配列番号７）を増幅後、ｌａｃプロモーターを含むベクター（ｐＥＴ−３ａ、ノバジェン社製）に連結し、ｂＦＧＦ発現ベクターを作製した。前記ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含む。

大腸菌（T7 Express Lys Y Competent E. Coli（High Efficiency）、NEW ENGLAND Labs Inc.社製）に、前記ｂＦＧＦ発現ベクターを、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、アンピシリンを含有するＬＢ培地を用いて、ＯＤ_６００＝０．６以上となるまで３７℃で培養した。さらに、０．２ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを添加し、３７℃で３時間培養した。培養した大腸菌を集菌し、溶解バッファーに懸濁し、超音波破砕した。前記超音波破砕は、超音波破砕機（ＵＤ−２０１、ＴＯＭＹ社製）を用い、アウトプット６、Ｄｕｔｙ比８０％の条件で、１０分の超音波破砕処理を２回氷上で行なった。また、前記溶解バッファーは、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ、および１ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含む緩衝液（ｐＨ７．２）とした。そして、２００００ｇ、４℃、２０分の条件で、遠心分離を行い、得られた上清を回収した。さらに、前記上清を、ＤＩＳＭＩＣ０．８μｍセルロースアセテート膜（ADVANTEC社製）で濾過することにより、ｂＦＧＦサンプルを調製した。

（２）陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィーに使用する充填剤（第１の充填剤）としては、TOYOPEARL（登録商標）SP-550Cを使用した。１００ｍＬの前記第１の充填剤を精製水で３回洗浄後、エコノカラム（５．０×１０ｃｍ、Bio-rad社製、第１のカラム）に充填した。前記第１のカラムに、２００ｍＬの第１の平衡化バッファーを負荷し、前記第１のカラムを平衡化した。前記第１の平衡化バッファーは、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ７．２）とした。つぎに、前記第１のカラムに、前記ｂＦＧＦサンプルを負荷した。前記負荷後、８００ｍＬの第１の洗浄液を前記第１のカラムに負荷し、洗浄した。前記第１の洗浄液は、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウムおよび０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．２）とした。さらに、前記第１のカラムに、８００ｍＬの第１の溶出液を負荷し、溶出された溶液の全量を、前記粗精製サンプルとして取得した。前記第１の溶出液は、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウムおよび０．６ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．２）とした。なお、陽イオン交換クロマトグラフィーは、室温（２５℃）で行なった。

（３）塩濃度調整
前記粗精製サンプルに、等量の２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウムおよび４ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む緩衝液（ｐＨ７．２）を添加し、塩として、２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む調整サンプルを調製した。前記緩衝液の添加後、前記調整サンプルを４℃の条件下で１時間撹拌した。つぎに、前記調整サンプルを２００００ｇ、４℃、２０分の条件で、遠心分離を行い、得られた上清を回収した。さらに、前記上清を、０．４２μｍセルロースアセテート膜（ADVANTEC社製）で濾過し、前記調整サンプルの液体画分を調製した。

（４）疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィーに使用する充填剤（第２の充填剤）としては、TOYOPEARL（登録商標）Butyl-650Mを使用した。前記第２の充填剤を精製水で３回洗浄後、前記エコノカラム（第２のカラム）に充填した。前記第２のカラムに、２００ｍＬの第２の平衡化バッファーを負荷し、前記カラムを平衡化した。前記第２の平衡化バッファーは、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウムおよび２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む緩衝液（ｐＨ７．２）とした。つぎに、前記第２のカラムに、前記調整サンプルの液体画分を負荷した。なお、前記液体画分を負荷後に前記第２のカラムから得られた液体画分を、フロースルー画分として回収した。前記負荷後、８００ｍＬの第２の洗浄液を前記第２のカラムに負荷し、洗浄した。前記第２の洗浄液は、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウムおよび１．８ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む緩衝液（ｐＨ７．２）とした。さらに、前記第２のカラムに、８００ｍＬの第２の溶出液を負荷し、溶出された溶液の全量を、精製ｂＦＧＦとして取得した。前記第２の溶出液は、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウムおよび１．３ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを含む緩衝液（ｐＨ７．２）とした。そして、前記精製ｂＦＧＦについて、限外濾過にて濃縮後、２８０ｎｍの吸光度に基づき、１ｍｇ／ｍＬｂＦＧＦ（精製サンプル）となるように濃度を調整した。なお、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、室温（２５℃）で行なった。

（５）精製確認
０．５μｇのｂＦＧＦを含む精製サンプルについて、等量のサンプルバッファーで懸濁し、５分間煮沸した。前記煮沸後、２μＬの煮沸後の精製サンプルについて、１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い、電気泳動した。つぎに、前記ゲルについて、ＣＢＢ染色液を用い、３０分間染色した。前記染色後のゲルを脱色液で脱色した。前記脱色後、前記ゲルを精製水に浸漬し、１時間インキュベートし、バンドの検出を行なった。また、前記精製サンプルに代えて、前記ｂＦＧＦサンプル、前記粗精製サンプル、前記調整サンプルの液体画分、前記フロースルー画分、およびリコンビナントヒト由来ｂＦＧＦを用いた以外は同様にして、バンドの検出を行なった。前記サンプルバッファーは、６２．５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２５％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルーおよび５％（ｗ／ｖ）β−メルカプトエタノールを含む緩衝液とした。

この結果を図１に示す。図１は、前記精製サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１において、写真の左側および右側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、前記リコンビナントヒト由来ｂＦＧＦ（Ｓ）、分子量マーカー（Ｍ）、前記ｂＦＧＦサンプル（Ｌ）、前記粗精製サンプル（Ｃ）、前記調整サンプルの液体画分（Ａ）、前記フロースルー画分（Ｆ）、前記精製サンプル（Ｅ）および分子量マーカー（Ｍ）の結果である。

図１に示すように、前記ｂＦＧＦサンプルおよび前記粗精製サンプルでは、約１６．５ＫＤａ付近のバンド以外に多数のバンドが観察された。また、前記調整サンプルの液体画分では、約１６．５ＫＤａ付近のバンド以外にバンドがほとんど観察されなかった。これに対し、前記精製サンプルおよび前記リコンビナントｂＦＧＦにおいて、約１６．５ＫＤａ付近にバンドが観察された。これらのバンドは、ｂＦＧＦ１６．５ＫＤａアイソフォームの分子量と近似していた。さらに、前記フロースルー画分では、約１６．５ＫＤａ付近のバンドがほとんど観察されず、前記疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、ほぼ全てのｂＦＧＦがカラムに吸着していることが確認された。これらの結果から、本発明の精製方法により、収率よくｂＦＧＦが精製できることが確認された。

（実施例２）
前記粗精製サンプルの塩濃度の調整により、夾雑物が析出されることを確認した。

前記実施例１と同様にして、調整サンプルを調製後、遠心分離を行った。前記遠心分離後、固体画分を回収し、前記サンプルバッファーに懸濁することにより、前記調整サンプルの固体画分のサンプルを調製した。そして、前記精製サンプルに代えて、前記固体画分のサンプルを用いた以外は同様にして、バンドの検出を行った。また前記精製サンプルに代えて、前記ｂＦＧＦサンプル、前記リコンビナントヒト由来ｂＦＧＦ、前記粗精製サンプル、および前記精製ｂＦＧＦを用いた以外は同様にして、バンドの検出を行った。

この結果を図２に示す。図２は、前記固体画分のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図２において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、前記リコンビナントヒト由来ｂＦＧＦ（Ｓ）、分子量マーカー（Ｍ）、前記ｂＦＧＦサンプル（Ｌ）、前記粗精製サンプル（Ｃ）、前記精製ｂＦＧＦ（Ｉ）、および前記固体画分のサンプル（Ａ）の結果である。

図２に示すように、前記精製ｂＦＧＦおよび前記リコンビナントｂＦＧＦにおいて、約１６．５ＫＤａ付近にバンドが観察され、本発明の精製方法によりｂＦＧＦが精製できることが確認された。また、前記ｂＦＧＦサンプルと前記粗精製サンプルとを比較した場合、前記粗精製サンプルのレーンにおける約１６．５ＫＤａ付近にバンドの占める割合が上昇し、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、粗精製できることが確認された。さらに、前記ｂＦＧＦサンプルと、前記粗精製サンプルと、前記固体画分のサンプルとを比較した場合、前記固体画分のサンプルにおいて、約１６．５ＫＤａ付近にバンドは観察されず、逆に、それ以外の領域のバンドの占める割合が上昇していた。これらのことから、前記粗精製サンプルの塩濃度の調整により、前記ｂＦＧＦ以外の夾雑物が析出されることが確認された。

以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。

本発明によれば、簡便にｂＦＧＦを精製できる。このため、本発明は、例えば、ｂＦＧＦを使用する生命科学分野、医療分野等において有用といえる。

Claims

ｂＦＧＦを含むサンプルを陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、ｂＦＧＦを含む粗精製サンプルを取得する工程と、
前記粗精製サンプルの塩濃度を調整する工程と、
前記調整後の粗精製サンプルを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、精製ｂＦＧＦを取得する工程とを含み、
前記調整後の粗精製サンプルにおける硫酸アンモニウムの濃度が、２ｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする、ｂＦＧＦの精製方法。
前記調整後の粗精製サンプルにおける塩化ナトリウムの濃度が、０．３ｍｏｌ／Ｌである、請求項１記載のｂＦＧＦの精製方法。
前記陽イオン交換クロマトグラフィーの充填剤の官能基が、スルホプロピル基である、請求項１または２記載のｂＦＧＦの精製方法。
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの充填剤の疎水性リガンドが、ブチル基である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｂＦＧＦの精製方法。
前記ｂＦＧＦを含むサンプルが、還元剤を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のｂＦＧＦの精製方法。
前記調整後の粗精製サンプルから液体画分を回収する工程を含み、
前記精製ｂＦＧＦの取得工程において、前記液体画分を前記疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記精製ｂＦＧＦを取得する、請求項１から５のいずれか一項に記載のｂＦＧＦの精製方法。
前記ｂＦＧＦを含むサンプルが、ｂＦＧＦを発現する大腸菌の破砕物である、請求項１から６のいずれか一項に記載のｂＦＧＦの精製方法。
前記ｂＦＧＦを含むサンプルが、ｂＦＧＦを発現する大腸菌の破砕物の液体画分である、請求項１から６のいずれか一項に記載のｂＦＧＦの精製方法。
ｂＦＧＦ遺伝子が形質導入された大腸菌を培養し、前記大腸菌にｂＦＧＦを発現させる工程と、
得られたｂＦＧＦを発現する大腸菌からｂＦＧＦを含むサンプルを調製する工程とを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のｂＦＧＦの精製方法。
大腸菌にｂＦＧＦ遺伝子を形質導入する工程を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のｂＦＧＦの精製方法。
ｂＦＧＦを含むサンプルから精製ｂＦＧＦを取得する工程を含み、
前記精製工程が、請求項１から１０のいずれか一項に記載のｂＦＧＦの精製方法により実施されることを特徴とする、ｂＦＧＦの製造方法。
前記精製工程で得られたｂＦＧＦの純度が、９６％以上である、請求項１１記載のｂＦＧＦの製造方法。