JP6548965B2 - 顕微鏡システムおよび顕微鏡観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡システムおよび顕微鏡観察方法に関するものである。

従来、顕微鏡による組織細胞画像をイメージデータとしてコンピュータに読み込み、画像解析処理によって個々の細胞のデータを生成するイメージサイトメータが知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。
イメージサイトメータによれば、各細胞データは組織細胞画像における位置情報を保持しており、元画像と照合することで、腫瘍組織に属する細胞のデータなのか、正常組織に属する細胞のデータなのかを明確に識別することができる。

特許第４０１１９３６号公報 特許第５４１２１４９号公報

しかしながら、イメージサイトメータにおいて用いられる細胞は、培養容器の底面に接着して成長する単層培養細胞であり、細胞画像をＸＹ平面で捉えることしかできないという問題がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、単層培養細胞よりも、より生体内に近い状態で細胞計測を効率よく実施することができる顕微鏡システムおよび顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、蛍光薬剤または発光薬剤により目的分子を標識した複数の細胞からなる１以上の細胞集塊を収容する培養容器を載置する電動ステージと、該電動ステージに載置された前記培養容器内の前記細胞集塊の低倍画像を取得する低倍画像取得部と、該低倍画像取得部により取得された低倍画像を解析して前記培養容器内の各前記細胞集塊の位置を検出する細胞集塊位置検出部と、該細胞集塊位置検出部により検出された各位置に対物レンズの光軸を一致させ、かつ、前記細胞集塊に対する前記対物レンズの距離を順次変更するよう前記電動ステージおよび／または前記対物レンズを移動させ、前記細胞集塊を構成する細胞から発せられる蛍光または発光の前記光軸方向に間隔をあけた複数のスライス画像を前記低倍画像取得部よりも高い倍率で取得する高倍画像取得部とを備え、該高倍画像取得部が、前記低倍画像取得部により取得された低倍画像に含まれる前記細胞集塊の最大直径を検出し、検出された最大直径に基づいて、使用する対物レンズの倍率を設定する顕微鏡システムを提供する。

本態様によれば、１以上の細胞集塊を収容する容器を電動ステージに載置し、低倍画像取得部を作動させて培養容器内の細胞集塊の低倍画像を取得すると、細胞集塊位置検出部により、低倍画像が解析されて各細胞集塊の位置が検出される。高倍画像取得部が、検出された細胞集塊の位置に対物レンズの光軸を一致させるよう電動ステージを移動させて細胞集塊の高倍率のスライス画像を取得するとともに、細胞集塊と対物レンズとの距離を順次変更するように電動ステージまたは対物レンズを移動させることにより、細胞集塊を較正する細胞の蛍光または発光のスライス画像が、光軸方向に間隔をあけて複数取得される。これにより、細胞集塊の３次元的な高倍率の画像を取得することができ、単層培養細胞よりも、より生体内に近い状態で細胞計測を効率よく実施することができる。

上記態様においては、前記低倍画像取得部が、前記細胞集塊の透過低倍画像を取得し、前記細胞集塊位置検出部が、前記透過低倍画像に含まれる各前記細胞集塊の輪郭形状に基づいて、各該細胞集塊の位置を検出してもよい。
このようにすることで、低倍画像取得部の作動により、培養容器を挟んで対物レンズと反対側から透過照明光が入射され、培養容器内の細胞集塊を通過した光が対物レンズにより集光され透過低倍画像が取得される。これにより、透過低倍画像には細胞集塊の輪郭形状が含まれるので、該輪郭形状を抽出することで、例えば、その重心位置等の代表的な位置を細胞集塊の位置として簡易に検出することができる。

また、上記態様においては、前記低倍画像取得部が、前記細胞集塊を構成する複数の細胞からの蛍光または発光の低倍画像を取得し、前記細胞集塊位置検出部が、前記低倍画像の蛍光または発光画像に含まれる近接する細胞に基づいて各前記細胞集塊の位置を推定してもよい。
このようにすることで、低倍画像取得部の作動により、細胞集塊を構成する複数の細胞からの蛍光または発光の低倍画像が取得される。蛍光または発光は細胞集塊を構成する全ての細胞から発せられるとは限られないが、蛍光または発光を発している近接する細胞は同じ細胞集塊に属していると考えられるので、低倍画像に含まれる近接する細胞に基づいて細胞集塊全体の輪郭形状を推定することができ、細胞集塊の位置を簡易に推定することができる。

また、上記態様においては、前記高倍画像取得部が、前記低倍画像取得部により取得された低倍画像に含まれる前記細胞集塊の最大直径を検出し、検出された最大直径に基づいて、使用する対物レンズの倍率を設定する。
このようにすることで、細胞集塊の最大直径に基づいて設定された倍率の対物レンズを使用して、適正な大きさに拡大された高倍画像を取得して、高精度の観察を行うことができる。

また、本発明の他の態様は、培養容器内に収容された、蛍光薬剤または発光薬剤により目的分子を標識した複数の細胞からなる１以上の細胞集塊の低倍画像を取得する低倍画像取得ステップと、該低倍画像取得ステップにより取得された低倍画像を解析して前記培養容器内の各前記細胞集塊の位置を検出する位置検出ステップと、該位置検出ステップにより検出された各位置に対物レンズの光軸を一致させて、各前記細胞集塊に対する前記対物レンズの距離を順次変更しながら、前記低倍画像取得ステップよりも高倍率の前記細胞集塊の発光または蛍光の複数のスライス画像を取得する高倍画像取得ステップとを含み、該高倍画像取得ステップが、前記低倍画像取得ステップにより取得された低倍画像に含まれる前記細胞集塊の最大直径を検出し、検出された最大直径に基づいて、使用する対物レンズの倍率を設定する顕微鏡観察方法を提供する。

本発明によれば、単層培養細胞よりも、より生体内に近い状態で細胞計測を効率よく実施することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムを示す全体構成図である。 図１の顕微鏡システムにより観察される細胞を収容するマルチウェルプレートの一例を示す平面図である。 図２のマルチウェルプレートの各ウェル内に設けられた複数のホールと、いくつかのホールに存在する細胞集塊の一例を示す平面図である。 図３のウェル全体を撮影して取得された透過画像の一例を示す図である。 図１の顕微鏡システムを用いた顕微鏡観察方法を説明するフローチャートである。 図５に続く工程を示すフローチャートである。 図６のスライス画像取得工程を説明するホール内の細胞集塊と走査軌跡とを示す平面図である。 図６のスライス画像取得工程を説明するホール内の細胞集塊とスライス画像の取得平面とを示す縦断面図である。 図１の顕微鏡システムの変形例を示す全体構成図である。

以下、本発明の一実施形態に係る顕微鏡システム１および顕微鏡観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図１に示されるように、顕微鏡２と、顕微鏡２を制御する顕微鏡制御部３と、該顕微鏡制御部３に対する指令を行うとともに、顕微鏡２により取得された画像を処理する全体制御部４と、該全体制御部４により処理された画像を表示するモニタ５および全体制御部４に対してユーザが入力を行う入力部１９とを備えている。図中符号６はインタフェース部（Ｉ／Ｆ）である。

顕微鏡２は、倒立型顕微鏡であって、蛍光薬剤または発光薬剤によって標識された細胞Ａを収容するマルチウェルプレート（培養容器）７を水平に載置する電動ステージ８と、該電動ステージ８の下方に配置され倍率の異なる複数の対物レンズ９を交換可能に保持するレボルバ１０と、透過観察光学系（低倍画像取得部）１１と、落射観察光学系（高倍画像取得部）１２とを備えている。

電動ステージ８は、載置したマルチウェルプレート７を対物レンズ９の光軸Ｓに直交するＸＹ方向に水平移動させることができる。
レボルバ１０にはＺ方向移動機構２５が設けられ、対物レンズ９を光軸Ｓに沿うＺ方向に移動させることができるようになっている。

透過観察光学系１１は、電動ステージ８の上方に配置される透過照明光源１３と、該透過照明光源１３からの照明光を集光するコンデンサレンズ１４と、マルチウェルプレート７を透過し、対物レンズ９によって集光された光を撮影するＣＣＤ等の撮像素子を有する透過画像撮像部１５とを備えている。

落射観察光学系１２は、レーザ光を発生するレーザ光源１６と、該レーザ光源１６から発せられたレーザ光を対物レンズ９の光軸Ｓに直交する方向に２次元的に走査するスキャナ１７と、マルチウェルプレート７から戻る蛍光または発光を検出する光検出器を有し、蛍光／発光画像を生成する蛍光／発光画像取得部１８とを備えている。

顕微鏡制御部３は、透過観察光学系１１と落射観察光学系１２の駆動を切り替える撮像制御部２０および光源制御部２１と、マルチウェルプレート７のＸＹ方向位置を制御するステージ制御部２２と、レボルバ１０を作動させて対物レンズ９の倍率を切り替えるレボルバ制御部２３とを備えている。また、顕微鏡制御部３は、透過画像撮像部１５により取得された画像を解析して、画像内に含まれる細胞集塊Ｂの位置を検出する画像解析部（細胞集塊位置検出部）２４を備えている。

入力部１９を介してユーザが観察開始の入力を行うと、全体制御部４がレボルバ制御部２３に指令を送り、レボルバ１０が作動させられて、まず、低倍率の対物レンズ９が観察光軸Ｓ上に配置されるようになっている。対物レンズ９の倍率としては、マルチウェルプレート７の各ウェル７ａ全体を一度に撮影できる倍率が選択されるようになっている。

また、全体制御部４が撮像制御部２０に指令を送り、透過画像撮像部１５が作動させられるとともに、全体制御部４が透過照明光源１３を作動させて照明光を射出させるようになっている。
そして、全体制御部４は、予め設定された動作パターンで電動ステージ８を作動させ、例えば、図２に示されるように、マルチウェルプレート７のいずれかのウェル７ａを順次、観察光軸Ｓ上に配置して透過画像を取得させるようになっている。

各ウェル７ａには、例えば、図３に示されるように、底面を凹ませて形成された多数のホール７ｂが設けられており、細胞集塊Ｂは、いくつかのホール７ｂ内において形成されるようになっている。そして、このようなウェル７ａ全体を撮影して得られた透過画像は、例えば、図４に示されるものである。透過画像は、ウェル７ａの中心位置を中心として取得されている。

各ウェル７ａを撮影することにより取得された透過低倍画像は、画像解析部２４に送られて、画像認識処理により、透過低倍画像内に存在する細胞集塊Ｂの輪郭形状が認識される。そして、画像解析部２４においては、認識された各細胞集塊Ｂの輪郭形状から、その重心位置のＸＹ座標が、細胞集塊Ｂの位置として算出され、全体制御部４に送られるようになっている。

全てのウェル７ａについて、細胞集塊Ｂの位置が算出され、全体制御部４に送られると、全体制御部４は、レボルバ制御部２３に指令して、より高倍率の対物レンズ９を観察光軸Ｓ上に載置させ、光源制御部２１に指令して、透過照明光源１３を停止させる一方、レーザ光源１６を作動させるようになっている。
そして、全体制御部４は、ステージ制御部２２に指令して、各ウェル７ａの細胞集塊Ｂの位置を観察光軸Ｓに一致させるように電動ステージ８を作動させるようになっている。また、レボルバ制御部２３に指令して、対物レンズ９の焦点位置を細胞集塊ＢのＺ方向のいずれかの端部近傍に配置するようになっている。

これにより、落射観察光学系１２において、レーザ光源１６から発せられたレーザ光が、スキャナ１７によって対物レンズ９の光軸Ｓに直交する方向に２次元的に走査され、マルチウェルプレート７から戻る蛍光または発光が蛍光／発光画像取得部１８の光検出器によって検出され、蛍光または発光のスライス画像が取得されるようになっている。スライス画像が取得された後には、Ｚ方向移動機構２５が作動させられて対物レンズ９がＺ方向に微動させられ、その位置でスライス画像が取得されることが繰り返されるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡システム１を用いた顕微鏡観察方法について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１を用いてマルチウェルプレート７内に収容された細胞Ａの観察を行うには、図５に示されるように、蛍光薬剤または発光薬剤によって標識された細胞Ａを収容するマルチウェルプレート７を電動ステージ８にセットする（ステップＳ１）。ユーザは入力部１９から観察条件を入力する（ステップＳ２）。

観察条件としては、マルチウェルプレート７の種類、観察倍率、Ｚ方向移動機構２５の送り量、各照明光の波長等を入力することができる。
そして、ユーザが入力部１９から観察開始の指示を入力すると（ステップＳ３）、まず、透過観察光学系１１が選択されて、全体制御部４から、撮像制御部２０、光源制御部２１、ステージ制御部２２およびレボルバ制御部２３に指令が送られる。

レボルバ制御部２３には低倍率の対物レンズ９を選択する指令が送られ、対物レンズ９が低倍対物レンズに切り替えられる（ステップＳ４）。また、レボルバ制御部２３はＺ方向移動機構２５を制御して、細胞集塊ＢのＺ方向の平均的な中心位置に対物レンズ９の焦点面を設定する。

光源制御部２１は透過照明光源１３を作動させ（ステップＳ５）、撮像制御部２０は透過画像撮像部１５を作動させる（ステップＳ６）。また、ステージ制御部２２は電動ステージ８を制御して、観察対象ウェル７ａの中心が観察光軸Ｓに一致するようにマルチウェルプレート７をＸＹ方向に移動させる（ステップＳ７）。

透過照明光源１３から発せられた照明光は、コンデンサレンズ１４によって集光されてマルチウェルプレート７を透過し、対物レンズ９によって集光されて透過画像撮像部１５により撮影される。これにより、観察光軸Ｓ上に配置されているウェル７ａ全体の透過画像が取得される（低倍画像取得ステップＳ８）。取得された透過画像は画像解析部２４に送られ、各細胞集塊Ｂの輪郭形状が認識され（ステップＳ９）、認識された各細胞集塊Ｂの輪郭形状の重心位置のＸＹ座標が算出される（位置検出ステップＳ１０）。算出された各細胞集塊ＢのＸＹ座標は、全体制御部４に送られ（ステップＳ１１）、全てのウェル７ａについて処理されていない場合には、次のウェル７ａに切り替えてステップＳ７からの工程が繰り返される（ステップＳ１２）。

全てのウェル７ａについて、各ウェル７ａ内に存在している細胞集塊Ｂの位置が検出された場合には、全体制御部４は、落射観察光学系１２に切り替える指令を、撮像制御部２０、光源制御部２１、ステージ制御部２２およびレボルバ制御部２３に送る。

まず、図６に示されるように、レボルバ制御部２３にはより高倍率の対物レンズ９を選択する指令が送られ、対物レンズ９が高倍対物レンズに切り替えられる（ステップＳ１３）。また、レボルバ制御部２３はＺ方向移動機構２５を制御して、細胞集塊ＢのＺ方向の端部位置近傍に対物レンズ９の焦点面を設定する。

光源制御部２１はレーザ光源１６を作動させ（ステップＳ１４）、撮像制御部２０は蛍光／発光画像取得部１８を作動させる（ステップＳ１５）。また、ステージ制御部２２は、電動ステージ８を制御して、観察対象のウェル７ａに観察光軸Ｓが一致するように移動させるとともに（ステップＳ１６）、対象ウェル７ａの対象細胞集塊Ｂの位置に観察光軸Ｓに一致するように、マルチウェルプレート７をＸＹ方向に移動させる（ステップＳ１７）。

そして、Ｚ方向移動機構２５を作動させて、レーザ光の焦点面のＺ方向位置を調節し（ステップＳ１８）、細胞集塊Ｂの設定されたＺ方向位置において、図７に示されるように、レーザ光をスキャナ１７によってＸＹ方向に２次元的に走査させる。図中の矢印はレーザ光の走査軌跡を示している。各走査位置において発生した蛍光または発光は、対物レンズ９によって集光され、蛍光／発光画像取得部１８の光検出器によって検出され、各走査位置と対応づけて記憶されることにより、細胞集塊Ｂのスライス画像が取得される（高倍画像取得ステップＳ１９）。取得されたスライス画像はＺ位置と対応づけて記憶される（ステップＳ２０）。

Ｚ位置が細胞集塊Ｂの他端のＺ方向位置であるか（全てのＺ方向位置についてスライス画像が取得されたか）否かが判定され（ステップＳ２１）、他端に達していない場合には、Ｚ方向移動機構２５を作動させて、対物レンズ９の焦点面をＺ方向に所定の送り量だけ微動させるステップＳ１８からの工程が繰り返される。これにより、図８に示されるように、１つの細胞集塊Ｂについて、Ｚ方向の複数位置においてＸＹ方向のスライス画像が取得されるので、細胞集塊Ｂを３次元的に評価することが可能となる。取得された画像は全体制御部４に送られて記憶されるとともに、モニタ５に表示される。

同一ウェル７ａ内の全ての細胞集塊Ｂについて全スライス画像が取得されたか否かが判定され（ステップＳ２２）、取得されていない場合にはステップＳ１７からの工程が繰り返される。同一ウェル７ａ内の全ての細胞集塊Ｂについて全スライス画像が取得された場合には、マルチウェルプレート７内の全てのウェル７ａに対して画像取得が行われたか否かが判定され（ステップＳ２３）、終了していない場合には、ステップＳ１６からの工程が繰り返される。

このように、本実施形態に係る顕微鏡システム１および顕微鏡観察方法によれば、立体的に培養された細胞集塊Ｂの３次元的な高倍率の画像を取得することができ、単層培養細胞よりも、より生体内に近い状態で細胞計測を効率よく実施することができるという利点がある。また、本実施形態に係る顕微鏡観察方法によれば、透過観察光学系１１で全てのウェル７ａについて細胞集塊Ｂの位置を算出した後に落射観察光学系１２に切り替えてスライス画像の取得を行うので、光学系の切替が１回で済み、効率的に細胞集塊Ｂのスライス画像を取得することができる。

なお、本実施形態に係る顕微鏡システム１においては、透過観察光学系１１により取得した低倍画像に基づいて、細胞集塊Ｂの位置を算出することとしたが、これに代えて、透過観察光学系１１を用いることなく、落射観察光学系１２のみを用いて細胞集塊Ｂの位置を算出してもよい。
すなわち、図１に示される顕微鏡システム１の透過観察光学系１１を用いずに観察を行ってもよいし、図９に示されるように、透過観察光学系１１を有しない顕微鏡２６を用いて観察を行うことにしてもよい。

この場合には、蛍光／発光画像取得部１８によりウェル７ａ全体の低倍画像を取得し、該低倍画像内において蛍光または発光を発している細胞Ａに基づいて、細胞集塊Ｂの位置を算出することにすればよい。
すなわち、細胞集塊Ｂを構成している細胞Ａの全てが蛍光または発光を発生していない場合には、所定の範囲内で近接して蛍光または発光を発生している複数の細胞Ａに基づいて、細胞集塊Ｂの重心位置を推定することができる。これによれば、透過観察光学系１１と落射観察光学系１２とを切り替えることなく落射観察光学系１２のみを用いて細胞集塊Ｂの３次元的な評価を行うことができるという利点がある。

本実施形態においては、蛍光／発光画像取得部１８は、前段で取得された低倍の透過画像または低倍の蛍光画像に基づいて、細胞集塊Ｂの最大直径を検出し、レーザ光の走査範囲が適正となるように、高倍率の対物レンズ９の倍率を設定する。細胞集塊Ｂの最大直径に基づいて設定された倍率の対物レンズ９を使用して、適正な大きさに拡大された高倍画像を取得して、高精度の観察を行うことができるという利点がある。

１ 顕微鏡システム
７ マルチウェルプレート（培養容器）
８ 電動ステージ
９ 対物レンズ
１１ 透過観察光学系（低倍画像取得部）
１２ 落射観察光学系（高倍画像取得部）
２４ 画像解析部（細胞集塊位置検出部）
Ｓ８ 低倍画像取得ステップ
Ｓ１０ 位置検出ステップ
Ｓ１９ 高倍画像取得ステップ
Ａ 細胞
Ｂ 細胞集塊

Claims (4)

1. 蛍光薬剤または発光薬剤により目的分子を標識した複数の細胞からなる１以上の細胞集塊を収容する培養容器を載置する電動ステージと、
   該電動ステージに載置された前記培養容器内の前記細胞集塊の低倍画像を取得する低倍画像取得部と、
   該低倍画像取得部により取得された低倍画像を解析して前記培養容器内の各前記細胞集塊の位置を検出する細胞集塊位置検出部と、
   該細胞集塊位置検出部により検出された各位置に対物レンズの光軸を一致させ、かつ、前記細胞集塊に対する前記対物レンズの距離を順次変更するよう前記電動ステージおよびまたは前記対物レンズを移動させ、前記細胞集塊を構成する細胞から発せられる蛍光または発光の前記光軸方向に間隔をあけた複数のスライス画像を前記低倍画像取得部よりも高い倍率で取得する高倍画像取得部とを備え、
   該高倍画像取得部が、前記低倍画像取得部により取得された低倍画像に含まれる前記細胞集塊の最大直径を検出し、検出された最大直径に基づいて、使用する対物レンズの倍率を設定する顕微鏡システム。
2. 前記低倍画像取得部が、前記細胞集塊の透過低倍画像を取得し、
   前記細胞集塊位置検出部が、前記透過低倍画像に含まれる各前記細胞集塊の輪郭形状に基づいて、各該細胞集塊の位置を検出する請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記低倍画像取得部が、前記細胞集塊を構成する複数の細胞からの蛍光または発光の低倍画像を取得し、
   前記細胞集塊位置検出部が、前記低倍画像の蛍光または発光画像に含まれる近接する細胞に基づいて各前記細胞集塊の位置を推定する請求項１に記載の顕微鏡システム。
4. 培養容器内に収容された、蛍光薬剤または発光薬剤により目的分子を標識した複数の細胞からなる１以上の細胞集塊の低倍画像を取得する低倍画像取得ステップと、
   該低倍画像取得ステップにより取得された低倍画像を解析して前記培養容器内の各前記細胞集塊の位置を検出する位置検出ステップと、
   該位置検出ステップにより検出された各位置に対物レンズの光軸を一致させて、各前記細胞集塊に対する前記対物レンズの距離を順次変更しながら、前記低倍画像取得ステップよりも高倍率の前記細胞集塊の発光または蛍光の複数のスライス画像を取得する高倍画像取得ステップとを含み、
   該高倍画像取得ステップが、前記低倍画像取得ステップにより取得された低倍画像に含まれる前記細胞集塊の最大直径を検出し、検出された最大直径に基づいて、使用する対物レンズの倍率を設定する顕微鏡観察方法。

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