JP6548981B2 - Surface plasmon resonance measuring device and its chip - Google Patents
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Description
本発明は検出技術に関し、表面プラズモン共鳴測定装置及びそのチップに関する。 The present invention relates to detection technology, and relates to a surface plasmon resonance measurement apparatus and a chip thereof.
インフルエンザウイルスは、直径１００ｎｍのタンパク質に囲まれた球状ウイルスである。インフルエンザウイルス表面には、糖タンパク質であるヘマグルチニン（Ｈ）と、グリコシダーゼであるノイラミニダーゼ（Ｎ）と、が存在する。インフルエンザウイルスは、これらのタンパク質の種類の違いによって１４４の亜型に分類されている。例えば、鳥インフルエンザを起こすウイルスは、Ｈ５Ｎ１亜型と表記される。インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面のヘマグルチニン（Ｈ）が、細胞表面のシアル酸含有複合糖鎖を受容体として認識して結合することによると考えられている。 Influenza virus is a globular virus surrounded by proteins of 100 nm in diameter. On the surface of influenza virus, hemagglutinin (H), which is a glycoprotein, and neuraminidase (N), which is a glycosidase, are present. Influenza viruses are classified into 144 subtypes according to the difference in the type of these proteins. For example, a virus that causes avian influenza is designated H5N1 subtype. Infection of a host cell with influenza virus is thought to be due to hemagglutinin (H) on the virus surface recognizing and binding the sialic acid-containing complex sugar chain on the cell surface as a receptor.
インフルエンザはインフルエンザウイルスに起因する急性呼吸器疾患である。インフルエンザは、突然現れる高熱、頭痛、関節痛、筋肉痛など全身の症状が強いのが特徴で、併せてのどの痛み、鼻汁、咳などの症状も見られる。さらに、気管支炎、肺炎、小児では中耳炎、熱性けいれんなどを併発し、重症になることがある。 Influenza is an acute respiratory illness caused by the influenza virus. Influenza is characterized by strong systemic symptoms such as sudden onset of high fever, headache, joint pain, muscle pain, etc., along with symptoms such as sore throat, nasal discharge, cough etc. In addition, bronchitis, pneumonia, otitis media in children, febrile convulsions, etc. may be combined and become serious.
また、Ｈ５Ｎ１亜型トリインフルエンザやエボラウイルス感染は、世界中でパンデミック（感染爆発）の発生が懸念されている。特に、強毒性であるＨ５Ｎ１亜型トリインフルエンザは、感染の拡大により日本だけで３２００万人が感染し、最悪の場合６４万人が死亡すると予測されている。実際、２００９年にパンデミックが発生した新型インフルエンザは、毒性が低いにもかかわらず、死者が世界中で２，１８５人にも上った。パンデミックの発生は、企業の生産能力の低下、交通、電力などの社会機能の麻痺など深刻な経済損失をもたらすものと予測されている。 In addition, H5N1 avian influenza and Ebola virus infection is concerned about the occurrence of pandemic (infection explosion) around the world. In particular, the highly virulent H5N1 avian influenza is expected to infect 32 million people in Japan alone due to the spread of the infection, and in the worst case 640,000 people will die. In fact, the pandemic of the new pandemic in 2009 has killed 2,185 people worldwide, despite its low toxicity. The occurrence of the pandemic is predicted to cause serious economic loss such as the decline in corporate production capacity and the paralysis of social functions such as transportation and electricity.
したがって、ウイルスの脅威に対抗するためには、迅速検出法を用いた早期診断による感染者の封じ込めが不可欠である。早期診断は、感染者の封じ込めの効果が期待されるとともに、感染者への抗ウイルス薬投与などの適切な診療を早期に実施でき、感染者の生存確率を高める。例えば、タミフルやリレンザなどの抗ウイルス剤は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができ、有効な手段といえるが、最適な効果を得るためには、抗ウイルス剤を感染から４８時間以内に投与しなければならない。特に致死率が高いエボラウイルスは、３〜４個程度のウイルスが体内に侵入するだけで、増殖すると考えられている。そのため、感染者の封じ込めのためには、高感度なウイルス検出システムが必要となる。 Therefore, in order to counter the threat of viruses, it is essential to contain infected people by early diagnosis using rapid detection. Early diagnosis is expected to be effective for containment of infected persons, and appropriate medical treatment such as antiviral drug administration to infected persons can be carried out at an early stage, increasing the survival probability of infected persons. For example, antiviral agents such as Tamiflu and Relenza can suppress the growth of influenza virus, which is an effective means, but for optimal effects, antiviral agents are administered within 48 hours of infection Must. In particular, the Ebola virus, which has a high mortality rate, is considered to proliferate only when three to four viruses enter the body. Therefore, a highly sensitive virus detection system is required to contain the infected person.
しかし、これまで実用化されている免疫クロマト診断キットは、数分以内にインフルエンザウイルスの診断結果が出るが、検出感度が十分でなく、ウイルスの亜型に関しての識別能力に乏しい。そのため、ウイルスに罹患しているにもかかわらず、適切な治療が受けられずに患者が重症化したり、ウイルスを拡散させたりする原因となっている。また、免疫クロマト法は抗原抗体反応を基本としているため、熱変性に弱く、長期間保存されている間に抗体の認識能力が低下するといった問題点が生じる。そのため、このような診断キットを一般家庭や発展途上国などにおいて用いることは難しい。 However, although immunochromatographic diagnostic kits that have been put into practical use so far provide diagnostic results of influenza virus within a few minutes, detection sensitivity is not sufficient and discrimination ability regarding virus subtypes is poor. Therefore, despite being affected by the virus, it causes the patient to become serious or to spread the virus without receiving appropriate treatment. In addition, since the immunochromatography method is based on an antigen-antibody reaction, it is weak to heat denaturation, and there arises a problem that the recognition ability of the antibody decreases while it is stored for a long time. Therefore, it is difficult to use such a diagnostic kit in homes and developing countries.
また、現状、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法によるウイルスのゲノム検出が、最も高感度な検出方法であるが、検出までに数時間かかり、サーマルサイクラーなどの特殊な装置が必要である。そのため、ＲＴ−ＰＣＲ法によるゲノム検出を迅速な感染者の封じ込めに利用するには、限界がある。さらに、表面プラズモン共鳴測定装置によりデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びタンパク質を検出した例はあるものの（例えば、特許文献１から３参照。）、ウイルスそのものを高感度かつ迅速に検出した例はない。 In addition, currently, genome detection of virus by real-time PCR (RT-PCR) method is the most sensitive detection method, but it takes several hours to detect, and a special device such as a thermal cycler is required. Therefore, there are limitations in using RT-PCR genome detection for rapid containment of infected persons. Furthermore, although there are examples in which deoxyribonucleic acid (DNA) and proteins are detected by a surface plasmon resonance measuring apparatus (see, for example, Patent Documents 1 to 3), there is no example in which virus itself is detected with high sensitivity and rapidity.
ウイルスを高感度かつ迅速に検出可能な装置を提供することを目的の一つとする。 An object of the present invention is to provide a device capable of detecting a virus with high sensitivity and quickly.
本発明の態様によれば、（ａ）基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーを備えるチップと、（ｂ）チップに光を照射する光源と、（ｃ）光を照射されたチップ上における表面プラズモン共鳴による光の吸収を検出する検出器と、を備える、表面プラズモン共鳴測定装置が提供される。 According to an aspect of the present invention, (a) a chip provided with a sugar chain or an aptamer that binds to a virus, disposed on a substrate, (b) a light source for irradiating the chip with light, and (c) irradiated with light And a detector for detecting absorption of light by surface plasmon resonance on the chip.
上記の表面プラズモン共鳴測定装置は、チップ上における光の吸収スペクトルの変化を検出して、チップ上におけるウイルスの存在を検出する。 The above-described surface plasmon resonance measurement device detects a change in absorption spectrum of light on the chip to detect the presence of a virus on the chip.
上記の表面プラズモン共鳴測定装置において、アプタマーが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びペプチドからなる群から選択される一つであってもよい。糖鎖又はアプタマーが、リンカーを介して基板上に固定されていてもよい。リンカーが備えるアルキル鎖の炭素数が１以上５以下であってもよい。 In the above-described surface plasmon resonance measurement apparatus, the aptamer may be one selected from the group consisting of deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, and peptide. The sugar chain or the aptamer may be immobilized on the substrate via a linker. The carbon number of the alkyl chain with which the linker is provided may be 1 or more and 5 or less.
上記の表面プラズモン共鳴測定装置において、チップが、基板上に設けられた酸化膜と、酸化膜上に設けられた、金からなるパターン構造と、をさらに備えていてもよい。パターン構造が、格子状に配置されたドットパターン構造等のパターン構造であってもよい。 In the above-described surface plasmon resonance measurement apparatus, the chip may further include an oxide film provided on the substrate and a pattern structure made of gold provided on the oxide film. The pattern structure may be a pattern structure such as a dot pattern structure arranged in a lattice.
上記の表面プラズモン共鳴測定装置において、パターン構造の表面、及びパターン構造の開口から露出する酸化膜の表面の両方に、糖鎖又はアプタマーが配置されていてもよい。 In the above-described surface plasmon resonance measurement apparatus, a sugar chain or an aptamer may be disposed on both the surface of the pattern structure and the surface of the oxide film exposed from the opening of the pattern structure.
上記の表面プラズモン共鳴測定装置が、ウイルスを含み得る検査液がチップに接触するよう、検査液を貯蔵する検査液セルをさらに備えていてもよい。 The above-mentioned surface plasmon resonance measuring device may further include a test solution cell storing the test solution so that the test solution which may contain a virus comes in contact with the chip.
また、本発明の態様によれば、（ａ）基板と、（ｂ）基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーと、を備える、表面プラズモン共鳴測定装置のチップが提供される。 Moreover, according to an aspect of the present invention, there is provided a chip of a surface plasmon resonance measurement device, comprising (a) a substrate, and (b) a sugar chain or an aptamer that binds to a virus, which is disposed on the substrate. .
上記のチップにおいて、アプタマーが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びペプチドからなる群から選択される一つであってもよい。糖鎖又はアプタマーが、リンカーを介して基板上に固定されていてもよい。リンカーが備えるアルキル鎖の炭素数が１以上５以下であってもよい。 In the above chip, the aptamer may be one selected from the group consisting of deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, and peptide. The sugar chain or the aptamer may be immobilized on the substrate via a linker. The carbon number of the alkyl chain with which the linker is provided may be 1 or more and 5 or less.
上記のチップが、基板上に設けられた酸化膜と、酸化膜上に設けられた、金からなるパターン構造と、をさらに備えていてもよい。また、パターン構造が、格子状に配置されたドットパターン構造等のパターン構造であってもよい。 The above chip may further include an oxide film provided on the substrate and a pattern structure made of gold provided on the oxide film. The pattern structure may be a pattern structure such as a dot pattern structure arranged in a lattice.
上記のチップにおいて、パターン構造の表面、及びパターン構造の開口から露出する酸化膜の表面の両方に、糖鎖又はアプタマーが配置されていてもよい。 In the above chip, a sugar chain or an aptamer may be disposed on both the surface of the pattern structure and the surface of the oxide film exposed from the opening of the pattern structure.
本発明によれば、ウイルスを高感度かつ迅速に検出可能な表面プラズモン共鳴測定装置及びそのチップを提供可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a surface plasmon resonance measuring device capable of detecting a virus sensitively and quickly and a chip thereof.
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. In the following description of the drawings, the same or similar parts are denoted by the same or similar symbols. However, the drawings are schematic. Therefore, specific dimensions and the like should be determined in light of the following description. Moreover, it is a matter of course that portions having different dimensional relationships and ratios among the drawings are included.
本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置は、斜視図である図１、透過上面図である図２及びＩＩＩ−ＩＩＩ方向から見た断面図である図３に示すように、基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーを備えるチップ１０と、チップ１０に光を照射する光源２０と、光を照射されたチップ１０上における表面プラズモン共鳴による光の吸収を検出する検出器３０と、を備える。 The surface plasmon resonance measurement apparatus according to the embodiment of the present invention is, as shown in FIG. 1 as a perspective view, FIG. 2 as a transmission top view and FIG. 3 as a cross-sectional view seen from III-III. And a light source 20 for irradiating the chip 10 with light, and a detection for detecting light absorption by surface plasmon resonance on the chip 10 irradiated with light. And a vessel 30.
表面プラズモン共鳴測定装置は、さらに、光源２０、チップ１０、及び検出器３０を格納する筐体４０と、筐体４０内部に設けられた、検査液を格納する検査液セル４１と、検査液セル４１の導入口に設けられた漏斗状の導入ガイド４２と、を備える。チップ１０は、検査液セル４１内に配置される。検査液セル４１は、少なくとも一部が、光源２０が発する光に対して透明であり、光源２０が発した光がチップ１０に到達することと、チップ１０を透過した光が検出器３０に到達することを妨げない。 The surface plasmon resonance measuring apparatus further includes a case 40 for storing the light source 20, the chip 10, and the detector 30, a test solution cell 41 provided in the case 40 for storing a test solution, and a test solution cell And 41 a funnel-shaped introduction guide 42 provided at the introduction port. The chip 10 is disposed in the test solution cell 41. The test liquid cell 41 is at least partially transparent to the light emitted from the light source 20, and the light emitted from the light source 20 reaches the chip 10, and the light transmitted through the chip 10 reaches the detector 30. Do not disturb.
チップ１０は、図４に示すように、基板１１と、基板１１上に設けられた酸化膜１２と、酸化膜１２上に設けられた、金（Ａｕ）からなるパターン構造１３と、を備える。さらに、チップ１０は、パターン構造１３の表面及びパターン構造１３で覆われていない酸化膜１２の表面に固定されたリンカー１４と、リンカー１４に接続された糖鎖又はアプタマー１５と、を備える。チップ１０は、基板１１が図３に示す光源２０と対向し、図４に示す糖鎖又はアプタマー１５が検査液と接するよう、図３に示す検査液セル４１内に配置される。 As shown in FIG. 4, the chip 10 includes a substrate 11, an oxide film 12 provided on the substrate 11, and a pattern structure 13 made of gold (Au) provided on the oxide film 12. Furthermore, the chip 10 includes the linker 14 immobilized on the surface of the pattern structure 13 and the surface of the oxide film 12 not covered with the pattern structure 13, and a sugar chain or aptamer 15 connected to the linker 14. The chip 10 is disposed in the test solution cell 41 shown in FIG. 3 such that the substrate 11 faces the light source 20 shown in FIG. 3 and the sugar chain or aptamer 15 shown in FIG. 4 is in contact with the test solution.
図４に示す基板１１は、光源２０が発する光に対して透明であり、例えば結晶石英等からなる。酸化膜１２は、例えば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）、酸化クロム（Ｃｒ2Ｏ3）、酸化ニッケル（ＮｉＯ）、又は酸化チタン（ＴｉＯ2）等の誘電体からなる。金（Ａｕ）からなるパターン構造１３は、図３に示す光源２０が発する光に対して不透明であり、例えば斜方格子、六角格子、正方格子、矩形格子、及び平行格子等の格子状に規則的に配置されたドットパターンを備えるが、これに限定されない。図４に示すパターン構造１３の膜厚は、例えば１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、パターン構造１３の個々の円形のドットの直径は、例えば１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるが、特に限定されない。 The substrate 11 shown in FIG. 4 is transparent to the light emitted from the light source 20, and is made of, for example, crystalline quartz. The oxide film 12 is made of, for example, a dielectric such as silicon dioxide (SiO 2 ), chromium oxide (Cr 2 O 3 ), nickel oxide (NiO), or titanium oxide (TiO 2 ). The pattern structure 13 made of gold (Au) is opaque to the light emitted from the light source 20 shown in FIG. 3 and is regularly arranged in a lattice shape such as an orthorhombic lattice, a hexagonal lattice, a tetragonal lattice, a rectangular lattice, and a parallel lattice, for example. The dot pattern may be arranged in a similar manner, but is not limited thereto. The film thickness of the pattern structure 13 shown in FIG. 4 is, for example, 10 nm or more and 100 nm or less, and the diameter of each circular dot of the pattern structure 13 is, for example, 100 nm or more and 500 nm or less.
パターン構造１３に固定されるリンカー１４は、パターン構造１３に固定される前において、一方端にパターン構造１３の金と反応する基と、他方端に糖鎖又はアプタマー１５の基と反応する基と、を備えていれば、特に限定されない。また、パターン構造１３で覆われていない酸化膜１２に固定されるリンカー１４は、酸化膜１２に固定される前において、一方端に酸化膜１２の表面に存在する水酸基（−ＯＨ）と反応する基と、他方端に糖鎖又はアプタマー１５の基と反応する基と、を備えていれば、特に限定されない。ただし、リンカー１４の長さが短いほど、表面プラズモン共鳴測定装置の感度が良くなる傾向にあるため、リンカー１４は有機低分子であることが好ましい。有機低分子が備えるアルキル鎖の炭素数は、例えば１以上５以下、４以下、３以下、又は２以下である。 The linker 14 fixed to the pattern structure 13 has a group reactive with gold of the pattern structure 13 at one end and a group reactive with a group of sugar chain or aptamer 15 at the other end before being fixed to the pattern structure 13. , And is not particularly limited. Further, the linker 14 fixed to the oxide film 12 not covered with the pattern structure 13 reacts with the hydroxyl group (-OH) present on the surface of the oxide film 12 at one end before being fixed to the oxide film 12 It is not particularly limited as long as it has a group and a group that reacts with the sugar chain or the group of the aptamer 15 at the other end. However, since the sensitivity of the surface plasmon resonance measuring apparatus tends to be improved as the length of the linker 14 is shorter, the linker 14 is preferably an organic low molecule. The carbon number of the alkyl chain of the organic low molecule is, for example, 1 or more, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less.
金（Ａｕ）と反応する基としては、メルカプト基（−ＳＨ）等が挙げられる。糖鎖又はアプタマー１５の基と反応する基としては、アミノ基（−ＮＨ2）、アミノオキシ基（−ＯＮＨ2）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アセチレン基、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基、ハロゲン基（−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ，−Ｆ）、ニトロ基（−ＮＯ2）、及びアジド基（−Ｎ3）などが挙げられる。酸化膜１２の表面に存在する水酸基と反応する基としては、加水分解されて水酸基となるメトキシ基（−ＯＣＨ3）及びエトキシ基（−ＯＣ2Ｈ5）等が挙げられる。 Examples of the group that reacts with gold (Au) include mercapto group (-SH) and the like. Examples of the group that reacts with the sugar chain or the group of the aptamer 15 include amino group (-NH 2 ), aminooxy group (-ONH 2 ), carboxyl group (-COOH), acetylene group, hydroxyl group (-OH), N- hydroxysuccinimide ester (NHS) group, a halogen group (-Cl, -Br, -I, -F ), nitro group (-NO 2), and an azide group (-N 3), and the like. Examples of the group capable of reacting with a hydroxyl group existing on the surface of the oxide film 12, such as hydrolyzed the hydroxyl group methoxy group (-OCH 3) and ethoxy group (-OC 2 H 5) can be mentioned.
パターン構造１３に固定されるリンカー１４の具体例としては、γアミノオキシプロピルメルカプタン、及び２−アミノエタンチオールが挙げられる。また、酸化膜１２に固定されるリンカー１４の具体例としては、γアミノオキシプロピルトリエトキシシラン、及びアミノプロピルトリエトキシシランが挙げられる。 Specific examples of the linker 14 fixed to the pattern structure 13 include γ-aminooxypropyl mercaptan and 2-aminoethanethiol. Further, specific examples of the linker 14 fixed to the oxide film 12 include γ-aminooxypropyltriethoxysilane and aminopropyltriethoxysilane.
糖鎖又はアプタマー１５は、ウイルスと特異的に結合する物質であれば、特に限定されない。アプタマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）アプタマー、リボ核酸（ＲＮＡ）アプタマー、及びペプチドアプタマーを含む。図４においては、糖鎖の一例として、インフルエンザウイルスと特異的に結合する６’−シアリルラクトースを示している。 The sugar chain or the aptamer 15 is not particularly limited as long as it is a substance that specifically binds to a virus. Aptamers include deoxyribonucleic acid (DNA) aptamers, ribonucleic acid (RNA) aptamers, and peptide aptamers. In FIG. 4, 6'-sialyllactose which specifically binds to influenza virus is shown as an example of a sugar chain.
なお、検査対象ウイルスが例えばインフルエンザウイルスである場合は、インフルエンザウイルスの亜型に応じて、糖鎖又はアプタマー１５の種類を変えることが好ましい。例えば、高病原性鳥インフルエンザを起こすインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１亜型）は、末端にＮ−アセチルノイラミン酸α２，３ガラクトースを有する糖鎖に高い結合親和性を示す。また、ヒトインフルエンザウイルスは、Ｎ−アセチルノイラミン酸α２，６ガラクトースを有する糖鎖に高い結合親和性を示す。したがって、インフルエンザウイルスの亜型による糖鎖の認識能力の違いにより、インフルエンザウイルスの亜型を識別することが可能である。インフルエンザウイルス以外のウイルスについても同様である。 When the test target virus is, for example, an influenza virus, it is preferable to change the type of sugar chain or aptamer 15 according to the influenza virus subtype. For example, influenza virus (H5N1 subtype) causing highly pathogenic avian influenza exhibits high binding affinity to a sugar chain having N-acetylneuraminic acid α2,3 galactose at the end. In addition, human influenza virus exhibits high binding affinity to a sugar chain having N-acetylneuraminic acid α2,6 galactose. Therefore, it is possible to distinguish influenza virus subtypes by the difference in their ability to recognize sugar chains by influenza virus subtypes. The same is true for viruses other than influenza virus.
また、リンカー１４及び糖鎖又はアプタマー１５を、パターン構造１３の表面及びパターン構造１３で覆われていない酸化膜１２の表面の両方に固定することにより、酸化膜１２の表面への、検査非対象物質の非特異的な付着を抑制することが可能となる。 In addition, by immobilizing the linker 14 and the sugar chain or the aptamer 15 on both the surface of the pattern structure 13 and the surface of the oxide film 12 not covered with the pattern structure 13, the test object is not detected on the surface of the oxide film 12. It is possible to suppress nonspecific adhesion of substances.
図２及び図３に示す光源２０が発する光は、例えば可視光又は近赤外光である。パターン構造１３を備えるチップ１０に光が照射されると、パターン構造１３において局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）が発生し、チップ１０を透過した光のスペクトルに吸収ピークが現れる。吸収ピークは、チップ１０の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合することによって、波長シフトする。波長シフトの大きさは、可視光領域よりも近赤外領域の方が大きい傾向にある。したがって、ウイルスが微量である場合は、例えば、近赤外光を発する光源２０を用いると、ウイルスを高感度に検出し得る。 The light emitted from the light source 20 shown in FIGS. 2 and 3 is, for example, visible light or near infrared light. When the chip 10 having the pattern structure 13 is irradiated with light, localized plasmon resonance (LSPR) is generated in the pattern structure 13 and an absorption peak appears in the spectrum of the light transmitted through the chip 10. The absorption peak is wavelength shifted by the binding of the virus to the sugar chain or aptamer 15 of the chip 10. The magnitude of the wavelength shift tends to be larger in the near infrared region than in the visible light region. Therefore, when the amount of virus is small, for example, using the light source 20 that emits near infrared light, the virus can be detected with high sensitivity.
チップ１０と検出器３０の間には、局在プラズモン共鳴による吸光度変化が大きい波長帯域の光を透過させるバンドパスフィルタ５０を配置してもよい。検出器３０としては、電荷結合素子（ＣＣＤ）等が使用可能である。検出器３０には、例えば処理装置３００が接続されている。処理装置３００は、チップ１０に検査液が接触する前後において、検出器３０が検出した、チップ１０を透過した光のスペクトルにおける吸収ピークの有意な波長シフトの有無を判定する。処理装置３００は、例えば、所定の波長帯域における光の強度が所定の値以上に変化した場合、チップ１０表面の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合したと判定する。また、処理装置３００は、所定の波長帯域における光の強度が所定の値以上に変化しなかった場合、チップ１０表面の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合しなかったと判定する。 A band pass filter 50 may be disposed between the chip 10 and the detector 30. The band pass filter 50 transmits light in a wavelength band where the absorbance change due to localized plasmon resonance is large. As the detector 30, a charge coupled device (CCD) or the like can be used. For example, a processing device 300 is connected to the detector 30. The processing apparatus 300 determines the presence or absence of a significant wavelength shift of the absorption peak in the spectrum of the light transmitted through the chip 10 detected by the detector 30 before and after the test liquid contacts the chip 10. The processing apparatus 300 determines that the virus has bound to the sugar chain or the aptamer 15 on the surface of the chip 10, for example, when the light intensity in the predetermined wavelength band changes to a predetermined value or more. Further, when the light intensity in the predetermined wavelength band does not change to the predetermined value or more, the processing apparatus 300 determines that the virus has not bound to the sugar chain or the aptamer 15 on the surface of the chip 10.
筐体４０の外側には、例えば、検査液中のウイルスの有無を表示する表示部７０が設けられている。表示部７０は、処理装置３００に接続されている。例えば処理装置３００がチップ１０表面の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合したと判定した場合、表示部７０は赤色のライトを発光させ、処理装置３００がチップ１０表面の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合しなかったと判定した場合、表示部７０は青色のライトを発光させる。 On the outside of the case 40, for example, a display unit 70 for displaying the presence or absence of a virus in the test liquid is provided. The display unit 70 is connected to the processing device 300. For example, when the processing device 300 determines that the virus is bound to the sugar chain or aptamer 15 on the surface of the chip 10, the display unit 70 causes red light to be emitted, and the processing device 300 causes the sugar chain or aptamer 15 on the surface of the chip 10 to When it is determined that the light source is not coupled, the display unit 70 emits a blue light.
筐体４０内の検査液セル４１の下方には、廃液タンク６０が設けられている。また、検査液セル４１と廃液タンク６０の間には、バルブ６１が設けられている。検査液セル４１内の検査液をチップ１０と所定の時間接触させた後、バルブ６１が開かれ、検査液セル４１内の検査液が、廃液タンク６０に流れ落ちる。 Below the test solution cell 41 in the housing 40, a waste liquid tank 60 is provided. In addition, a valve 61 is provided between the test solution cell 41 and the waste liquid tank 60. After the test solution in the test solution cell 41 is brought into contact with the chip 10 for a predetermined time, the valve 61 is opened, and the test solution in the test solution cell 41 flows down to the waste liquid tank 60.
次に、実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の使用方法を説明する。まず、図５に示すように、検査液セル４１に検査液を入れる前の状態で、光源２０から光を発して、チップ１０を透過した光を検出器３０で検出する。処理装置３００は、検出器３０が検出した光のスペクトルを、チップ１０に検査液が接触する前の光のスペクトルとして記憶する。 Next, a method of using the surface plasmon resonance measurement apparatus according to the embodiment will be described. First, as shown in FIG. 5, light is emitted from the light source 20 in a state before the test liquid is put in the test liquid cell 41, and the light transmitted through the chip 10 is detected by the detector 30. The processor 300 stores the spectrum of the light detected by the detector 30 as the spectrum of the light before the test liquid contacts the chip 10.
その後、図６に示すように、導入ガイド４２から検査液セル４１に、ウイルスを含有する可能性のある検査液を入れる。検査液の例としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による、被験者のうがい液、及び鼻液等の溶解液が挙げられる。図７に示すように、チップ１０が検査液に十分に浸ったら、例えば５分から１０分静置し、チップ１０上の糖鎖又はアプタマー１５と、検査液に含まれ得るウイルスと、を結合させる。 Thereafter, as shown in FIG. 6, a test solution which may contain a virus is put into the test solution cell 41 from the introduction guide 42. Examples of the test solution include phosphate buffered saline (PBS) solutions such as a subject's mouthwash and nasal solutions. As shown in FIG. 7, when the chip 10 is sufficiently soaked in the test solution, for example, it is allowed to stand for 5 to 10 minutes to bind the sugar chain or aptamer 15 on the chip 10 with the virus that may be contained in the test solution. .
静置後、図８に示すように、バルブ６１を開いて、検査液セル４１中の検査液を、廃液タンク６０に落下させる。さらに、図９に示すように、導入ガイド４２から検査液セル４１に、水等の洗浄液を複数回流し込んで、チップ１０表面及び検査液セル４１の内壁を洗浄する。 After standing, as shown in FIG. 8, the valve 61 is opened to drop the test solution in the test solution cell 41 into the waste liquid tank 60. Further, as shown in FIG. 9, a washing liquid such as water is poured into the test liquid cell 41 from the introduction guide 42 multiple times to wash the surface of the chip 10 and the inner wall of the test liquid cell 41.
チップ１０表面及び検査液セル４１の内壁が乾いた後、図１０に示すように、光源２０から光を発して、チップ１０を透過した光を検出器３０で検出する。処理装置３００は、検出器３０が検出した光のスペクトルを、チップ１０に検査液が接触した後の光のスペクトルとして記憶する。 After the surface of the chip 10 and the inner wall of the test liquid cell 41 are dried, as shown in FIG. 10, light is emitted from the light source 20 and the light transmitted through the chip 10 is detected by the detector 30. The processor 300 stores the spectrum of the light detected by the detector 30 as the spectrum of the light after the test liquid contacts the chip 10.
さらに、処理装置３００は、チップ１０に検査液が接触する前の光のスペクトルと、チップ１０に検査液が接触した後の光のスペクトルと、を比較し、吸収ピークの有意な波長シフトがあれば、表示部７０に、ウイルスを検出したことを表示させる。また、吸収ピークの有意な波長シフトが無ければ、表示部７０に、ウイルスを検出しなかったことを表示させる。 Furthermore, the processing apparatus 300 compares the spectrum of the light before the test liquid comes in contact with the chip 10 with the spectrum of the light after the test liquid comes in contact with the chip 10, and there is a significant wavelength shift of the absorption peak. For example, the display unit 70 displays that a virus has been detected. Also, if there is no significant wavelength shift of the absorption peak, the display unit 70 displays that no virus has been detected.
次に、ナノインプリントリソグラフィー法を採用したチップ１０の製造方法について説明する。図１１に示すように、複数のウェルが設けられたモールド１００を用意する。モールド１００は、例えばニッケル（Ｎｉ）等の金属からなる。例えば、ウェルの径は５００ｎｍ、深さは５００ｎｍ、ピッチは１０００ｎｍであるが、これらに限定されない。モールド１００において、複数のウェルは格子状に配置されている。複数のウェルの配置の態様は、製造されるチップのパターン構造の態様に相似する。 Next, a method of manufacturing the chip 10 employing the nanoimprint lithography method will be described. As shown in FIG. 11, a mold 100 provided with a plurality of wells is prepared. The mold 100 is made of, for example, a metal such as nickel (Ni). For example, the diameter of the well is 500 nm, the depth is 500 nm, and the pitch is 1000 nm, but is not limited thereto. In the mold 100, the plurality of wells are arranged in a grid. The aspect of the arrangement of the plurality of wells is similar to the aspect of the pattern structure of the manufactured chip.
紫外線（ＵＶ）硬化樹脂からなる樹脂シートの平坦な表面に、モールド１００を押しつけた後、樹脂シートにＵＶを照射し、図１２に示すように、反転レプリカモールド１１０を作製する。 After pressing the mold 100 against the flat surface of a resin sheet made of an ultraviolet (UV) curing resin, the resin sheet is irradiated with UV, and as shown in FIG. 12, a reverse replica mold 110 is produced.
図１３に示すように、表面に蒸着膜１１９が形成された基板１１を用意する。基板１１は、例えば結晶石英等からなる。蒸着膜１１９は、例えば、ケイ素（Ｓｉ）、クロム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、又はチタン（Ｔｉ）等の、半金属又は金属からなる。さらに、図１４に示すように、下地層としての蒸着膜１１９上に樹脂をコーティングし、樹脂層１２０を形成する。樹脂層１２０は、例えば、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂からなる。 As shown in FIG. 13, a substrate 11 having a vapor deposition film 119 formed on the surface is prepared. The substrate 11 is made of, for example, crystalline quartz. The vapor deposition film 119 is made of, for example, a semimetal or metal such as silicon (Si), chromium (Cr), nickel (Ni), or titanium (Ti). Further, as shown in FIG. 14, a resin is coated on a vapor deposition film 119 as a base layer to form a resin layer 120. The resin layer 120 is made of, for example, a thermoplastic resin such as polymethyl methacrylate (PMMA).
次に、図１５に示すように、加熱した樹脂層１２０に反転レプリカモールド１１０を押しつけ、樹脂層１２０に、格子状に配置された複数のウェルを形成する。さらに、樹脂層１２０を冷却後、樹脂層１２０をマスクとして、アルゴン（Ａｒ）ガス等により異方性エッチングを施し、図１６に示すように、樹脂層１２０に設けられた複数のウェルのそれぞれの底面から基板１１表面を露出される。またさらに、図１７に示すように、樹脂層１２０表面及び基板１１表面の露出した部分に、ケイ素、クロム、ニッケル、又はチタン等の、半金属又は金属を蒸着し、蒸着膜１２１を形成する。蒸着膜１２１の厚さは、例えば蒸着膜１１９の厚さと同じである。 Next, as shown in FIG. 15, the reverse replica mold 110 is pressed against the heated resin layer 120 to form a plurality of wells arranged in a lattice shape in the resin layer 120. Furthermore, after the resin layer 120 is cooled, anisotropic etching is performed with argon (Ar) gas or the like using the resin layer 120 as a mask, and as shown in FIG. 16, each of the plurality of wells provided in the resin layer 120 The surface of the substrate 11 is exposed from the bottom. Furthermore, as shown in FIG. 17, a semimetal or metal such as silicon, chromium, nickel, or titanium is vapor-deposited on exposed portions of the surface of the resin layer 120 and the surface of the substrate 11 to form a vapor deposition film 121. The thickness of the vapor deposition film 121 is, for example, the same as the thickness of the vapor deposition film 119.
その後、図１８に示すように、蒸着膜１２１上に金を蒸着して金からなる堆積膜１２２を形成する。さらに、図１９に示すように、樹脂層１２０をリフトオフすることにより、蒸着膜１２１上に、金からなるパターン構造１３を形成する。次に、基板１１、蒸着膜１１９、１２１、及びパターン構造１３を、４５０℃から１０００℃で加熱する。例えば蒸着膜１１９、１２１がケイ素からなる場合は、ガラスの軟化点（５００℃から６００℃）以上で加熱することが好ましい。加熱により、ケイ素、クロム、ニッケル、又はチタン等からなる蒸着膜１１９、１２１が酸化され、図２０に示すように、二酸化ケイ素、酸化クロム、酸化ニッケル、又は酸化チタンからなる酸化膜１２が、基板１１とパターン構造１３との間、及び基板１１上のパターン構造１３から露出する部分に形成される。 Thereafter, as shown in FIG. 18, gold is vapor-deposited on the vapor-deposited film 121 to form a deposited film 122 made of gold. Further, as shown in FIG. 19, the resin layer 120 is lifted off to form a pattern structure 13 made of gold on the vapor deposition film 121. Next, the substrate 11, the vapor deposited films 119 and 121, and the pattern structure 13 are heated at 450 ° C. to 1000 ° C. For example, when the vapor deposition films 119 and 121 are made of silicon, it is preferable to heat the glass at a softening point (500 ° C. to 600 ° C.) or higher of the glass. By heating, the deposited films 119 and 121 made of silicon, chromium, nickel, titanium or the like are oxidized, and as shown in FIG. 20, the oxide film 12 made of silicon dioxide, chromium oxide, nickel oxide or titanium oxide is a substrate 11 and the pattern structure 13 and a portion exposed from the pattern structure 13 on the substrate 11.
例えば、結晶石英からなる基板上に、熱酸化膜を介さずに、金からなるパターン構造を形成すると、アンモニア過酸化水素水による洗浄で、パターン構造が基板上から消失する場合がある。これに対し、実施の形態に係るチップの製造方法によれば、加熱により、酸化膜１２とパターン構造１３の界面が粗面化され、酸化膜１２とパターン構造１３の密着性が向上する。そのため、アンモニア過酸化水素水による洗浄で、基板１１表面からパターン構造１３が消失することを抑制することが可能となる。 For example, when a pattern structure made of gold is formed on a substrate made of crystalline quartz without a thermal oxide film, the pattern structure may disappear from the substrate by cleaning with ammonia hydrogen peroxide solution. On the other hand, according to the method of manufacturing a chip according to the embodiment, the interface between the oxide film 12 and the pattern structure 13 is roughened by heating, and the adhesion between the oxide film 12 and the pattern structure 13 is improved. Therefore, it is possible to suppress the disappearance of the pattern structure 13 from the surface of the substrate 11 by the cleaning with the ammonia hydrogen peroxide solution.
また、ケイ素、クロム、ニッケル、又はチタン等の半金属又は金属は、屈折率が高いため、図１９に示す蒸着膜１１９、１２１の厚さが薄くても、局在プラズモン共鳴のスペクトル分解能を劣化させる。そのため、微量物質の検出が困難となる。これに対し、二酸化ケイ素、酸化クロム、酸化ニッケル、又は酸化チタンは、非酸化物よりも屈折率が低いため、局在プラズモン共鳴のスペクトル分解能を劣化させず、微量物質の検出を妨げない。 In addition, since a metalloid or metal such as silicon, chromium, nickel, or titanium has a high refractive index, the spectral resolution of localized plasmon resonance is degraded even if the thickness of the vapor deposition films 119 and 121 shown in FIG. Let Therefore, detection of trace substances becomes difficult. On the other hand, silicon dioxide, chromium oxide, nickel oxide or titanium oxide has a lower refractive index than non-oxides, so it does not degrade the spectral resolution of localized plasmon resonance and does not disturb the detection of trace substances.
次に、図２１に示すように、パターン構造１３の表面及びパターン構造１３で覆われていない酸化膜１２の表面にリンカー１４を固定する。パターン構造１３上において、リンカー１４は、金−硫黄（Ａｕ−Ｓ）結合により、パターン構造１３上に固定される。また、酸化膜１２上においては、リンカー１４は、ケイ素−酸素―ケイ素（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）結合により、酸化膜１２上に固定される。リンカー１４は、例えば、パターン構造１３の表面及びパターン構造１３で覆われていない酸化膜１２の表面上で、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成する。その後、図２２に示すように、開環した糖のアルデヒド基と、リンカーのアミノオキシ基と、を反応させて、リンカーに糖を結合し、図４に示すチップ１０が得られる。 Next, as shown in FIG. 21, the linker 14 is fixed to the surface of the pattern structure 13 and the surface of the oxide film 12 not covered with the pattern structure 13. On the pattern structure 13, the linker 14 is fixed on the pattern structure 13 by a gold-sulfur (Au-S) bond. Also, on the oxide film 12, the linker 14 is fixed on the oxide film 12 by a silicon-oxygen-silicon (Si-O-Si) bond. The linker 14 forms, for example, a self-assembled monolayer (SAM) on the surface of the pattern structure 13 and the surface of the oxide film 12 not covered with the pattern structure 13. Thereafter, as shown in FIG. 22, the aldehyde group of the ring-opened sugar and the aminooxy group of the linker are reacted to bind the sugar to the linker, whereby the chip 10 shown in FIG. 4 is obtained.
従来、生体物質を基板上に捕捉するためには、標的となる生体物質と特異的に結合する抗体等のタンパク質を基板上に固定している。タンパク質と標的となる生体物質との特異的な結合は、タンパク質の三次元構造による。そのため、基板上にタンパク質を固定する際には、タンパク質の構造が変化しないようにする必要がある。したがって、基板に接触することによってタンパク質の構造が変化しないよう、基板とタンパク質の間に、長いリンカーを挟んでいる。 Conventionally, in order to capture a biological substance on a substrate, a protein such as an antibody that specifically binds to a target biological substance is immobilized on the substrate. Specific binding between a protein and a target biological substance is due to the three-dimensional structure of the protein. Therefore, when immobilizing a protein on a substrate, it is necessary to prevent the structure of the protein from changing. Therefore, a long linker is sandwiched between the substrate and the protein so that the structure of the protein is not changed by contacting the substrate.
これに対し、本発明者は、鋭意研究の末、パターン構造を有する基板上に長いリンカーを挟んでタンパク質を固定したチップにおける局在プラズモン共鳴の分解能が低いことを見出した。さらに本発明者は、パターン構造を有する基板上に短いリンカーを挟んで糖鎖又はアプタマーを固定したチップにおける局在プラズモン共鳴の分解能が高いことを見出した。 On the other hand, the inventors of the present invention have found that resolution of localized plasmon resonance is low in a chip in which a protein is immobilized by sandwiching a long linker on a substrate having a pattern structure through intensive research. Furthermore, the present inventors have found that the resolution of localized plasmon resonance is high in a chip in which a sugar chain or an aptamer is immobilized with a short linker sandwiched on a substrate having a pattern structure.
理論に拘束されるものではないが、タンパク質のような複雑な三次元構造をとらない糖鎖又はアプタマーは、長いリンカーを用いずに基板上に固定しても、ウイルスとの特異性が失活しないものと考えることができる。また、抗体等のタンパク質は一般的に長さが１０ｎｍから１５ｎｍあるのに対し、糖鎖及びアプタマーは一般的に長さが１ｎｍから２ｎｍである。そのため、理論に拘束されるものではないが、リンカーと糖鎖又はアプタマーの合計長が短くなることにより、パターン構造近傍の局在プラズモン増強場に、糖鎖又はアプタマーに結合されたウイルスが近づくため、局在プラズモン共鳴の分解能が高くなるものと考えることができる。 Without being bound by theory, sugar chains or aptamers that do not have a complex three-dimensional structure such as proteins lose their specificity for viruses even if they are immobilized on a substrate without using a long linker. It can be thought that it does not do. Moreover, proteins such as antibodies generally have a length of 10 nm to 15 nm, whereas sugar chains and aptamers generally have a length of 1 nm to 2 nm. Therefore, without being bound by theory, the virus linked to the sugar chain or the aptamer approaches the localized plasmon enhanced field in the vicinity of the pattern structure by shortening the total length of the linker and the sugar chain or the aptamer. The resolution of localized plasmon resonance can be considered to be high.
よって、以上説明した実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置は、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーを備えるチップを用いて、ウイルスを短時間で高感度に検出することが可能である。また、糖鎖及びアプタマーは、高温環境下でも変性しにくい。そのため、実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置は、高温環境下でもウイルスを短時間で高感度に検出することが可能である。 Therefore, the surface plasmon resonance measurement apparatus according to the embodiment described above can detect a virus with high sensitivity in a short time by using a chip provided with a sugar chain or an aptamer that binds to the virus. In addition, sugar chains and aptamers are unlikely to be denatured even in a high temperature environment. Therefore, the surface plasmon resonance measuring apparatus according to the embodiment can detect a virus with high sensitivity in a short time even in a high temperature environment.
（実施例１）
石英基板、石英基板上に配置された酸化ケイ素膜、及び酸化ケイ素膜上に斜方格子上に配置された金からなるドットパターン構造を備えるチップを用意した。ドットパターン構造のぞれぞれのドットの厚さは４０ｎｍ、直径は４００ｎｍ、間隔は８００ｎｍであった。用意したチップを炉に入れ、室温から０．１時間で４５０℃まで昇温後、１時間４５０℃加熱した。次に、チップを１０分間オゾン酸化処理し、さらにチップを５分間、７５℃でアンモニア過水（ＮＨ3／Ｈ2Ｏ2／Ｈ2Ｏ＝１０／１０／５０ｍＬ）処理し、不純物を除去した。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータ（Ｓｌｏｐｅ ０．１秒、回転数５０００ｒｐｍ、１０秒）で乾燥させた。
Example 1
A chip was prepared having a quartz substrate, a silicon oxide film disposed on the quartz substrate, and a dot pattern structure made of gold disposed on an orthorhombic lattice on the silicon oxide film. The thickness of each dot in the dot pattern structure was 40 nm, the diameter was 400 nm, and the distance was 800 nm. The prepared chip was placed in a furnace and heated from room temperature to 450 ° C. in 0.1 hour, and then heated at 450 ° C. for 1 hour. Next, the chip was subjected to ozone oxidation treatment for 10 minutes, and the chip was further treated for 5 minutes at 75 ° C. with ammonia peroxide (NH 3 / H 2 O 2 / H 2 O = 10/10/50 mL) to remove impurities. . Thereafter, the chip was rinsed with water and dried with a spin coater (Slope 0.1 sec, rotation speed 5000 rpm, 10 sec).
再度、チップを１０分間オゾン酸化処理した後、アミノオキシシランカップリング剤（３−ａｍｉｎｏｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ ＨＣｌ ｓａｌｔ、医化学創薬株式会社）０．１ｗ／ｗ％水溶液に室温で１時間浸漬させ、チップの酸化ケイ素膜表面の水酸基と、リンカーとしてのアミノオキシシランカップリング剤と、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させ、さらに１００℃の恒温槽で１時間加熱した。 The chip is again subjected to ozone oxidation treatment for 10 minutes, and then immersed in an aqueous solution of 0.1 w / w% of an aminooxysilane coupling agent (3-aminooxypropyl triethoxysilane HCl salt, Medicinal Drug Discovery Co., Ltd.) at room temperature for 1 hour. The hydroxyl group on the silicon oxide film surface was reacted with the aminooxysilane coupling agent as a linker. Thereafter, the chip was rinsed with water, dried with a spin coater, and further heated in a thermostat of 100 ° C. for 1 hour.
次に、チップをγ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンＨＣｌ（Carbosynth Limited）０．１ｗ／ｗ％メタノール溶液に室温で４１時間浸漬させ、チップのパターン構造の金と、リンカーとしてのγ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンと、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。 Next, the chip is immersed in a 0.1 w / w% methanol solution of γ- (aminooxy) propyl mercaptan HCl (Carbosynth Limited) at room temperature for 41 hours, gold of the chip pattern structure and γ- (aminooxy as a linker ) And propyl mercaptan were reacted. The chips were then rinsed with water and dried with a spin coater.
その後、チップを３’−シアリルラクトース酢酸水溶液（フナコシ、０．１ｍＭ、ｐＨ５．３）に６０℃で１．５時間浸漬させ、酸化ケイ素膜及びドットパターン構造上のリンカーのアミノオキシ基と、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスと結合する３’−シアリルラクトースと、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。 Thereafter, the chip is immersed in an aqueous solution of 3'-sialyllactose acetic acid (Funakoshi, 0.1 mM, pH 5.3) at 60 ° C. for 1.5 hours, and the aminooxy group of the linker on the silicon oxide film and the dot pattern structure and H5N1. It reacted with the 3'-sialyllactose which couple | bonded with avian influenza virus. The chips were then rinsed with water and dried with a spin coater.
３’−シアリルラクトースが固定されたチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。次に、３’−シアリルラクトースが固定されたチップのドットパターン構造上に、Ｈ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスを１ｐｇ／ｍＬで含む検査液を滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２３に示すように、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。 The chip on which 3 '-sialyllactose was immobilized was irradiated with light, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. Next, a test solution containing H1N1 subtype seasonal influenza virus at 1 pg / mL was dropped on the dot pattern structure of the chip on which 3 <'>-sialyllactose is immobilized, and left at room temperature for 10 minutes. After that, it was rinsed with water and naturally dried, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 23, the absorption peak in the spectrum of the light transmitted through the chip was hardly shifted.
次に、３’−シアリルラクトースが固定されたチップのドットパターン構造上に、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを１ｆｇ／ｍＬで含む検査液１０μＬをドットパターン構造上に滴下し、１０分間室温で放置した。当該検査液には、個数にして、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを１０個程度含んでいるものと考えられる。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２３に示すように、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、高波長側にシフトした。 Next, 10 μL of the test solution containing H5N1 avian influenza virus at 1 fg / mL was dropped onto the dot pattern structure of the chip on which the 3'-sialyllactose is immobilized, and left at room temperature for 10 minutes. . It is considered that the test solution contains about 10 H5N1 avian influenza viruses in number. After that, it was rinsed with water and naturally dried, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 23, the absorption peak in the spectrum of light transmitted through the chip was shifted to the high wavelength side.
実施例１の結果は、実施例１に係る表面プラズモン共鳴測定装置が、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを短時間に高感度で検出可能であること、Ｈ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスを誤検出しないことを示している。 The result of Example 1 is that the surface plasmon resonance measurement apparatus according to Example 1 is capable of detecting H5N1 avian influenza virus with high sensitivity in a short time, and not erroneously detecting H1N1 subtype seasonal influenza virus Is shown.
（実施例２）
糖鎖としてＨ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスと結合する６’−シアリルラクトースを固定した以外は、実施例１と同様のチップを用意した。用意したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。次に、ＰＢＳ１０μＬをドットパターン構造上に滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定したところ、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
(Example 2)
A chip similar to that of Example 1 was prepared except that 6′-sialyllactose which binds to H1N1 seasonal influenza virus was fixed as a sugar chain. The prepared chip was irradiated with light, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. Next, 10 μL of PBS was dropped on the dot pattern structure, and left at room temperature for 10 minutes. After that, it was rinsed with water, naturally dried, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, the absorption peak in the spectrum of light transmitted through the chip was hardly shifted.
また、６’−シアリルラクトースが固定されたチップのドットパターン構造上に、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを１ｐｇ／ｍＬで含む検査液を滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２４に示すように、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。 In addition, a test solution containing H5N1 avian influenza virus at 1 pg / mL was dropped on the dot pattern structure of the chip to which 6'-sialyllactose is fixed, and left at room temperature for 10 minutes. After that, it was rinsed with water and naturally dried, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 24, the absorption peak in the spectrum of the light transmitted through the chip was hardly shifted.
次に、６’−シアリルラクトースが固定されたチップのドットパターン構造上に、Ｈ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスを１ｐｇ／ｍＬで含む検査液を滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２４に示すように、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、高波長側にシフトした。 Next, a test solution containing H1N1 subtype seasonal influenza virus at 1 pg / mL was dropped on the dot pattern structure of the chip on which 6'-sialyllactose is immobilized, and left at room temperature for 10 minutes. After that, it was rinsed with water and naturally dried, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 24, the absorption peak in the spectrum of light transmitted through the chip was shifted to the high wavelength side.
実施例２の結果は、実施例２に係る表面プラズモン共鳴測定装置が、Ｈ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスを短時間に高感度で検出可能であること、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを誤検出しないことを示している。 The result of Example 2 is that the surface plasmon resonance measurement apparatus according to Example 2 can detect H1N1 subtype seasonal influenza virus with high sensitivity in a short time, and does not misdetect H5N1 subtype avian influenza virus Is shown.
（比較例１）
石英基板、石英基板上に配置された酸化ケイ素膜、及び酸化ケイ素膜上に斜方格子上に配置された金からなるドットパターン構造を備えるチップを用意した。ドットパターン構造のぞれぞれのドットの厚さは４０ｎｍ、直径は４００ｎｍであった。用意したチップを炉に入れ、室温から０．１時間で４５０℃まで昇温後、１時間４５０℃加熱した。次に、チップを１０分間オゾン酸化処理し、さらにチップを５分間、７５℃でアンモニア過水（ＮＨ3／Ｈ2Ｏ2／Ｈ2Ｏ＝１０／１０／５０ｍＬ）処理し、不純物を除去した。
(Comparative example 1)
A chip was prepared having a quartz substrate, a silicon oxide film disposed on the quartz substrate, and a dot pattern structure made of gold disposed on an orthorhombic lattice on the silicon oxide film. Each dot in the dot pattern structure had a thickness of 40 nm and a diameter of 400 nm. The prepared chip was placed in a furnace and heated from room temperature to 450 ° C. in 0.1 hour, and then heated at 450 ° C. for 1 hour. Next, the chip was subjected to ozone oxidation treatment for 10 minutes, and the chip was further treated for 5 minutes at 75 ° C. with ammonia peroxide (NH 3 / H 2 O 2 / H 2 O = 10/10/50 mL) to remove impurities. .
再度、チップを１０分間オゾン酸化処理した後、チップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。 After the chip was again subjected to ozone oxidation treatment for 10 minutes, the chip was irradiated with light, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured.
また、オゾン酸化処理されたチップを水ですすぎ、スピンコータ（Ｓｌｏｐｅ ０．１秒、回転数５０００ｒｐｍ、１０秒）で乾燥させた。乾燥後、図２５に示すようにアルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオール（ProChimia Surfaces Sp. z o.o.）９９ｗ／ｗ％エタノール溶液に室温で１時間浸漬させ、図２６に示すようにチップのパターン構造の金と、リンカーとしてのＮＨＳチオールと、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。 In addition, the ozone-oxidized chip was rinsed with water and dried with a spin coater (Slope 0.1 sec, rotation speed 5000 rpm, 10 sec). After drying, as shown in FIG. 25, it is immersed in an NHS thiol (ProChimia Surfaces Sp. Z oo) 99 w / w% ethanol solution having 10 carbon atoms in the alkyl chain at room temperature for 1 hour at room temperature, as shown in FIG. The patterned gold was reacted with NHS thiol as a linker. The chips were then rinsed with water and dried with a spin coater.
アルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを固定したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２７に示すように、ＮＨＳチオールのみが固定された段階であるにもかかわらず、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、高波長側にシフトした。 The chip was fixed with NHS thiol having 10 carbon atoms in the alkyl chain, and the spectrum of the light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 27, the absorption peak in the spectrum of the light transmitted through the chip was shifted to the high wavelength side even though only the NHS thiol was fixed.
次に、アルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを固定したチップをＨ１抗体（アブカム）溶液に２５℃で約１０分間浸漬させ、図２８に示すように、ドットパターン構造上のリンカーのＮＨＳ基と、Ｈ１抗体のアミノ基と、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。 Next, the chip fixed with NHS thiol having 10 carbon atoms in the alkyl chain is immersed in the H1 antibody (Abcam) solution for about 10 minutes at 25 ° C., and as shown in FIG. Group was reacted with the amino group of the H1 antibody. The chips were then rinsed with water and dried with a spin coater.
Ｈ１抗体を固定したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２７に示すように、ＮＨＳチオールのみが固定された段階と比べて、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。 The chip on which the H1 antibody was immobilized was irradiated with light, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 27, the absorption peak in the spectrum of the light transmitted through the chip was hardly shifted as compared with the stage where only NHS thiol was immobilized.
次に、アルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを介してＨ１抗体を固定したチップをＨ１抗原（アブカム）溶液に２５℃で約１０分間浸漬させ、図２９に示すように、Ｈ１抗体と、Ｈ１抗原と、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。 Next, the chip on which the H1 antibody is immobilized via NHS thiol having a carbon number of alkyl chain of 10 is immersed in the H1 antigen (Abcam) solution at 25 ° C. for about 10 minutes, and as shown in FIG. , And H1 antigen. The chips were then rinsed with water and dried with a spin coater.
Ｈ１抗原を固定したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２７に示すように、ＮＨＳチオールのみが固定された段階と比べて、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。 The chip on which the H1 antigen was immobilized was irradiated with light, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 27, the absorption peak in the spectrum of the light transmitted through the chip was hardly shifted as compared with the stage where only NHS thiol was immobilized.
別途、アルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを固定したチップをエタノールアミン（和光純薬工業）溶液に２５℃で約６０分間浸漬させ、ドットパターン構造上のリンカーのＮＨＳ基と、エタノールアミンのアミノ基と、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。 Separately, the chip fixed with NHS thiol having 10 carbon atoms in the alkyl chain is immersed in an ethanolamine (Wako Pure Chemical Industries) solution at 25 ° C. for about 60 minutes, and the NHS group of the linker on the dot pattern structure and ethanolamine Was reacted with the amino group of The chips were then rinsed with water and dried with a spin coater.
エタノールアミンを固定したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２７に示すように、ＮＨＳチオールのみが固定された段階と比べて、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。 The chip on which ethanolamine was fixed was irradiated with light, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 27, the absorption peak in the spectrum of the light transmitted through the chip was hardly shifted as compared with the stage where only NHS thiol was immobilized.
比較例１の結果から、リンカーとしてアルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを固定すると、それだけでチップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークが大きくシフトしてしまい、その後、リンカーにさらに物質を固定しても、吸収ピークは大きくシフトしないことが明らかになった。 According to the result of Comparative Example 1, when NHS thiol having 10 carbon atoms in the alkyl chain is immobilized as the linker, the absorption peak in the spectrum of light transmitted through the chip is largely shifted, and then the substance is further added to the linker. It was found that the absorption peak did not shift significantly even if fixed.
（実施例３）
実施例１と同様の方法で、リンカー及び糖鎖が固定される前のオゾン酸化処理されたチップを用意し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。次に、実施例１と同様の方法で、チップのパターン構造に、アルキル鎖の炭素数が３であるγ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンを固定した。γ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンを固定したチップを透過した光のスペクトルを測定したところ、図３０に示すように、吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
(Example 3)
In the same manner as in Example 1, a chip subjected to ozone oxidation treatment before the linker and the sugar chain were immobilized was prepared, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. Next, in the same manner as in Example 1, γ- (aminooxy) propyl mercaptan having 3 carbon atoms in the alkyl chain was immobilized on the pattern structure of the chip. When the spectrum of light transmitted through a chip fixed with γ- (aminooxy) propyl mercaptan was measured, as shown in FIG. 30, the absorption peak was hardly shifted.
次に、実施例１と同様の方法で、チップのパターン構造上のγ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンに、６’−シアリルラクトースを固定した。６’−シアリルラクトースを固定したチップを透過した光のスペクトルを測定したところ、図３０に示すように、吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。 Next, 6′-sialyllactose was fixed to γ- (aminooxy) propyl mercaptan on the chip pattern structure in the same manner as in Example 1. When the spectrum of the light transmitted through the chip fixed with 6'-sialyllactose was measured, the absorption peak was hardly shifted as shown in FIG.
実施例３の結果から、鎖長の短いリンカー及び糖鎖は、チップを透過した光のスペクトルに大きな影響を与えないことが示された。 From the results of Example 3, it was shown that the linker and sugar chain having a short chain length do not greatly affect the spectrum of light transmitted through the chip.
（比較例２）
チップの酸化ケイ素膜表面をアミノオキシシランカップリング剤で修飾しなかった以外は、実施例２と同様のＨ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスと結合する６’−シアリルラクトースを固定したチップを用意した。用意したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。
(Comparative example 2)
The chip | tip which fixed 6'- sialyl lactose couple | bonded with the H1N1 subtype seasonal influenza virus similar to Example 2 was prepared except the silicon oxide film surface of a chip | tip was not modified with the aminooxy silane coupling agent. The prepared chip was irradiated with light, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured.
次に、チップ上に、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを１０μｇ／ｍＬで含む検査液を滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図３１に示すように、６’−シアリルラクトースはＨ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスと結合しないにもかかわらず、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、高波長側にシフトした。 Next, a test solution containing H5N1 avian influenza virus at 10 μg / mL was dropped on the chip, and left at room temperature for 10 minutes. After that, it was rinsed with water and naturally dried, and the spectrum of light transmitted through the chip was measured. As a result, as shown in FIG. 31, although 6'-sialyllactose did not bind to H5N1 avian influenza virus, the absorption peak in the spectrum of light transmitted through the chip was shifted to the higher wavelength side.
理論に拘束されるものではないが、比較例２の結果は、図３２に示すように、アミノオキシシランカップリング剤で修飾されずに露出したチップの酸化ケイ素膜表面に、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスが非特異的に吸着したことによると考えられる。 While not being bound by theory, the results of Comparative Example 2 show that, as shown in FIG. 32, H5N1 avian influenza virus was applied to the silicon oxide film surface of the chip exposed without being modified with the aminooxysilane coupling agent. It is believed that the virus is nonspecifically adsorbed.
（実施例４）
実施例２と同様に、６’−シアリルラクトースを固定したチップを複数用意し、それぞれ、１μｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、１ｆｇ／ｍＬのＨ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルス検査液と反応させた。リンカーを結合する前のオゾン酸化処理した後のチップを透過した光のスペクトルに対する、１μｇ／ｍＬのＨ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルス検査液と反応した後のチップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークの波長シフトを１００％として、図３３に示すように、リンカーのみを結合した場合、リンカーに糖鎖のみを結合した場合、及び糖鎖に各濃度のウイルスを結合した場合における波長シフトをグラフにした。
(Example 4)
As in Example 2, a plurality of chips fixed with 6'-sialyllactose are prepared and reacted with 1 μg / mL, 1 ng / mL, 1 pg / mL, 1 fg / mL H1N1 subtype seasonal influenza virus test solution, respectively. I did. Of the absorption peak in the spectrum of light transmitted through the chip after reaction with the 1 μg / mL H1N1 subtype seasonal influenza virus test solution relative to the spectrum of light transmitted through the chip after ozone oxidation treatment prior to linker attachment Assuming that the wavelength shift is 100%, as shown in FIG. 33, the wavelength shift was graphed when only the linker was attached, when only the sugar chain was attached to the linker, and when each concentration of virus was attached to the sugar chain .
実施例４の結果から、鎖長の短いリンカー及び糖鎖は、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークの波長シフトに大きな影響を与えないが、糖鎖に特異的なウイルスが結合すると、ウイルスの濃度が１ｆｇ／ｍＬのような極めて低い濃度でも、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークが大きく波長シフトすることが示された。 From the results of Example 4, the linker and sugar chain having a short chain length do not greatly affect the wavelength shift of the absorption peak in the spectrum of light transmitted through the chip, but when a specific virus is bound to the sugar chain, the virus It has been shown that the absorption peak in the spectrum of light transmitted through the chip undergoes a large wavelength shift even at a very low concentration such as 1 fg / mL.
（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、実施の形態では、ナノインプリントリソグラフィー法を用いたチップの製造方法を説明したが、電子線リソグラフィー法を用いてチップを製造してもよい。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
(Other embodiments)
Although the present invention has been described by the embodiment as described above, it should not be understood that the description and the drawings, which form a part of this disclosure, limit the present invention. Various alternative embodiments, examples and operation techniques should be apparent to those skilled in the art from this disclosure. For example, in the embodiment, the method for manufacturing a chip using a nanoimprint lithography method has been described, but the chip may be manufactured using an electron beam lithography method. As such, it should be understood that the present invention includes various embodiments and the like not described herein.
１０ チップ
１１ 基板
１２ 酸化膜
１３ パターン構造
１４ リンカー
１５ アプタマー
２０ 光源
３０ 検出器
４０ 筐体
４１ 検査液セル
４２ 導入ガイド
５０ バンドパスフィルタ
６０ 廃液タンク
６１ バルブ
７０ 表示部
１００ モールド
１１０ 反転レプリカモールド
１１９ 蒸着膜
１２０ 樹脂層
１２１ 蒸着膜
１２２ 堆積膜
３００ 処理装置
Reference Signs List 10 chip 11 substrate 12 oxide film 13 pattern structure 14 linker 15 aptamer 20 light source 30 detector 40 case 41 test solution cell 42 introduction guide 50 band pass filter 60 waste liquid tank 61 valve 70 display portion 100 mold 110 reverse replica mold 119 deposited film 120 resin layer 121 deposited film 122 deposited film 300 processing apparatus
Claims (14)
前記チップに光を照射する光源と、
前記光を照射されたチップ上における表面プラズモン共鳴による前記光の吸収を検出する検出器と、
を備え、
前記糖鎖又は前記アプタマーが、リンカーを介して前記基板上に固定され、
前記基板と前記糖鎖又は前記アプタマーとを結合する前記リンカーが備えるアルキル鎖の炭素数が１以上５以下である、
表面プラズモン共鳴測定装置。 A chip comprising a sugar chain or an aptamer that binds to a virus, disposed on a substrate;
A light source for irradiating the chip with light;
A detector for detecting the absorption of the light by surface plasmon resonance on the chip irradiated with the light;
Equipped with
The sugar chain or the aptamer is immobilized on the substrate via a linker,
The carbon number of the alkyl chain provided in the linker which links the substrate and the sugar chain or the aptamer is 1 or more and 5 or less.
Surface plasmon resonance measurement device.
前記基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーと、
を備え、
前記糖鎖又は前記アプタマーが、リンカーを介して前記基板上に固定され、
前記基板と前記糖鎖又は前記アプタマーとを結合する前記リンカーが備えるアルキル鎖の炭素数が１以上５以下である、
表面プラズモン共鳴測定装置のチップ。 A substrate,
A sugar chain or an aptamer that binds to a virus, disposed on the substrate;
Equipped with
The sugar chain or the aptamer is immobilized on the substrate via a linker,
The carbon number of the alkyl chain provided in the linker which links the substrate and the sugar chain or the aptamer is 1 or more and 5 or less.
Chip of surface plasmon resonance measurement device.
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