JP6554099B2

JP6554099B2 - ｐ５３変異体を再活性化することの可能なペプチド

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Publication number: JP6554099B2
Application number: JP2016532782A
Authority: JP
Inventors: オーレン，モーシェ; ロッター，ヴァルダ; タール，ペリー
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2013-08-07
Filing date: 2014-08-07
Publication date: 2019-07-31
Anticipated expiration: 2034-08-07
Also published as: JP2019214573A; RU2693487C2; AU2016200713B2; US11028127B2; BR112016002721A2; ES2795982T3; US20200095282A1; US9856289B2; US10550152B2; US20160215019A1; EP3030571B1; HUE049292T2; IL268355A; IL243944B; AU2016200713A1; IL243944A0; AU2017202806B2; CN105579464B; CA2920147A1; US10336789B2

Description

本発明は、変異体ｐ５３タンパク質を再活性化することの可能なペプチド、および治療におけるその使用に関する。

癌は先進国において死亡の主な原因であり、母集団の平均年齢が上昇し続けるにつれて、診断された症例数および経済的影響も増加する。癌は単一の疾患ではなく、異常細胞の制御できない増殖および伝播を特徴とする、２００を超える疾患の群である。癌は、同じ種類およびグレードの癌患者間でさえ腫瘍細胞表面マーカー発現および分布の分子差の大きい、異種性の高い疾患である。さらに、癌が進行するにつれて細胞突然変異が蓄積する傾向があり、腫瘍不均一性をさらに増加させる。大部分の腫瘍細胞は、癌遺伝子の発現増加および腫瘍抑制遺伝子の不活性化によるゲノム不安定性を示す。

ｐ５３遺伝子は、癌の進行に対する主要な障壁として働く最も重要な腫瘍抑制遺伝子であると考えられている。ｐ５３タンパク質は、様々な種類の細胞のストレスに応答し、細胞周期停止、アポトーシス、または老化を誘発する（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ａ．，ｐ５３，ｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｇａｔｅｋｅｅｐｅｒｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｉｖｉｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，１９９７．８８：ｐ．３２３−３３１）。これは、ｐ５３ＤＮＡ結合モチーフを有する特異的標的遺伝子の転写トランス活性化によって実現される。ｐ５３経路がほとんど全てのヒト癌において損なわれることは広く同意されている。ｐ５３の突然変異は悪性形質転換プロセスの重要なステップとみなされ、癌症例の５０％超がそのｐ５３遺伝子に突然変異を有する。これらの突然変異の大部分は、ｐ５３のＤＮＡ結合コアドメイン（ＤＢＤ）を標的にするミスセンス点突然変異であり、それによりｐ５３のその標的部位への特異的ＤＮＡ結合を消失させる。これらの突然変異は、ｐ５３依存性転写および結果的にｐ５３に媒介される腫瘍抑制を妨げる。多様な種類のヒト腫瘍における例外的に高い頻度のｐ５３突然変異は、腫瘍成長に関与する遺伝子の中でｐ５３を独特にし、変異型ｐ５３（Ｍｕｔ−ｐ５３）を新規癌治療の魅力的な標的にする。

構造研究により、ｐ５３のＤＢＤにおける腫瘍由来のミスセンス突然変異が共通する影響：生理的温度でのＤＢＤフォールディングの不安定化を生じることが明らかになった（Ｊｏｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｍ．Ｄ．Ａｌｌｅｎ，ａｎｄＡ．Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｓｕｐｅｒｓｔａｂｌｅｍｕｔａｎｔｏｆｈｕｍａｎｐ５３ｃｏｒｅｄｏｍａｉｎ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｓｃｕｉｎｇｏｎｃｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４．２７９（２）：ｐ．１２９１−６）。一部の変異体は野生型立体構造に戻り、低い温度でＤＮＡに結合することができるので、この不安定化は可逆性でありうる。従って、ｐ５３の大部分の突然変異はｐ５３タンパク質フォールディングを不安定化し、生理的温度で部分的変性を引き起こす。

変異体ｐ５３タンパク質は、主にそれらがｐ５３自体のデストラクタＭｄｍ２の発現をアップレギュレートすることができないことに起因して、高いレベルで腫瘍細胞に蓄積する。さらに、多くのｐ５３活性化ストレスシグナル（低酸素、ゲノム不安定性および腫瘍遺伝子発現など）が、癌細胞において恒常的に誘発される。そのため、Ｍｕｔ−ｐ５３の再活性化は、主要な抗腫瘍効果を発揮すると期待される。さらに、マウスモデルにおいて、ｐ５３機能の回復は正常組織で十分に許容され、目に見える有毒作用を生じないことが示された（Ｖｅｎｔｕｒａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｐ５３ｆｕｎｃｔｉｏｎｌｅａｄｓｔｏｔｕｍｏｕｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７．４４５（７１２８）：ｐ．６６１−５）。

ｐ５３は進化して動的で立体構造的に不安定となった。ｐ５３タンパク質に強固な構造がないことは、結果として、ストレスの種類および細胞の状況に応じて異なる活性を提示するいくつかのｐ５３立体配座異性体を生じうる。簡略化されたモデルにおいて、ｐ５３は、野生型の活性立体構造か、または変異体のミスフォールドされた不活性立体構造のいずれかであると想定され得る。ｐ５３のこれらの２つの立体構造状態は、２つの特異的モノクローナル抗体、ＰＡｂ２４０およびＰＡｂ１６２０によって識別されることができる（Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｌ．，Ｆ．Ｓａｉｔ，ａｎｄＧ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｔｈｅ ‘ｗｉｌｄｔｙｐｅ’ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐ５３：ｅｐｉｔｏｐｅｍａｐｐｉｎｇｕｓｉｎｇｈｙｂｒｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１．２０（１８）：ｐ．２３１８−２４）。ＰＡｂ２４０は、ｐ５３のＤＢＤ中の残基２１２〜２１７と結合する。この領域は野生型（ＷＴ）立体構造では抗体（Ａｂ）に近づきづらい。しかし、変性もしくは変異体ｐ５３では、それは露出される（Ｖｏｊｔｅｓｅｋ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｐ５３ａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｎｅｗａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｔｈｅｃｏｒｅＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９５．１０（２）：ｐ．３８９−９３）。ＰＡｂ１６２０は、ｐ５３の２つの別個の領域からなり、残基Ｒ１５６、Ｌ２０６、Ｒ２０９およびＮ２１０を含む、ＤＢＤ中の立体構造的な非線形エピトープを認識する（Ｃｏｏｋ，Ａ．ａｎｄＪ．Ｍｉｌｎｅｒ，Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｌｌｏｓｔｅｒｉｃｖａｒｉａｎｔｓｏｆｗｉｌｄ−ｔｙｐｅｐ５３，ａｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，１９９０．６１（４）：ｐ．５４８−５２）。ＷＴ立体構造では、タンパク質は、ループを互いに非常に近接して保持するようにフォールドされ（Ｒａｖｅｒａ，Ｍ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎａｌｌｏｓｔｅｒｉｃｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｐ５３ｕｓｉｎｇａｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８．１６（１５）：ｐ．１９９３−９）、ＰＡｂ１６２０によって認識される完全なエピトープを形成する。ｐ５３タンパク質がミスフォールドされる場合（突然変異、温度、変性などの結果として）、これらの２つのループはより遠くに移動し、エピトープは破壊され、そのために変異体立体構造はＰＡｂ１６２０陰性である。ｐ５３は立体構造的に柔軟なタンパク質であることが示されている。しかし、そのような変異体でのフォールディングの欠点は、は不可逆性でないことである：一部のｐ５３変異体は残留ＤＮＡ結合能を維持し、３７℃でＤＮＡに結合できない変異体は、生理的温度以下（３２℃または２５℃）で結合することができ、２６℃でｐ５３−応答性プロモーターからの転写を活性化する。その上、変異体タンパク質Ｒ２４５Ｓ、Ｒ２８２Ｗ、Ｖ１４３Ａなどの単離されたＤＢＤは、２０℃で残留（３０〜６０％）ＤＮＡ結合活性を有することが示された。

構造研究は、ミスフォールディングの程度が変異体間で異なることを示す；しかし、定義された代わりのフォールドがあるのではなく、むしろ部分的変性がある。このことは、ｐ５３突然変異のフォールディングへの影響を逆転させるための「小分子」アプローチが、広範囲の変異形態に適用可能であり得ることを示唆する。構造研究からの別の重要な予測は、タンパク質の適切にフォールドされた部分に結合するリガンドが、質量作用の法則に従って天然のフォールドの方に平衡を変えると見られることである。

ｐ５３は最初にＳＶ４０ラージＴ抗原（ＬＴ）と相互作用する細胞タンパク質として同定された。ＬＴとｐ５３との間の界面領域は大きい：合計２３のＬＴ残基および１９ｐ５３残基がこの界面に埋もれているか、またはこれらの２つの分子間の相互作用に直接関与することが見出された。ｐ５３／ＤＮＡ相互作用残基は隣接し、ｐ５３／ＬＴ界面と重なり合っている。ＬＴとこれらのｐ５３残基との結合は、癌において最も一般的な３つの変異型ｐ５３残基：Ｒ２７３、Ｒ２４８、およびＧ２４５を含む、ｐ５３の全ＤＮＡ結合表面を効果的に覆うことができる。このことは、ｐ５３依存性プロモーターのトランス活性化を阻害する。ｐ５３／ＬＴ界面はいくつかの異なるｐ５３領域およびループを含むので、ＬＴとの結合状況を形成するためにアミノ酸を正確な位置および配向に整列させるために、ｐ５３タンパク質は正確にフォールドされなくてはならない。そのため、ＬＴと結合しているｐ５３は、ｐ５３立体構造状態へのマーカーとして役立ち得る。

いくつかの矯正アプローチがｐ５３立体構造領域において試みられた。立体構造を安定化するペプチドの原理の証明は、Ｆｒｉｅｄｌｅｒおよび同僚によって提供された（Ｆｒｉｅｄｌｅｒ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ａｐｅｐｔｉｄｅｔｈａｔｂｉｎｄｓａｎｄｓｔａｂｉｌｉｚｅｓｐ５３ｃｏｒｅｄｏｍａｉｎ：ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｒｅｓｃｕｅｏｆｏｎｃｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２．９９（２）：ｐ．９３７−４２）。９残基のペプチド、ＣＤＢ３をｐ５３ＤＢＤとＡＳＰＰとの間の複合体の結晶構造に基づいて設計した（Ｓａｍｕｅｌｓ−Ｌｅｖ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＡＳＰＰｐｒｏｔｅｉｎｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐ５３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００１．８（４）：ｐ．７８１−９４）。このペプチドは、Ｍｕｔ−ｐ５３と結合し、シャペロンとして機能することが示され、ＰＡｂ１６２０に対する反応性の増加によって示されるように、ＷＴ立体構造の方に平衡を移動した。しかし、Ｍｕｔ−ｐ５３／ＣＤＢ３複合体の立体構造は、ＷＴと変異体との間の中間の状態であるので、ＣＤＢ３の生物学的効果（Ｉｓｓａｅｖａ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅｏｆｍｕｔａｎｔｓｏｆｔｈｅｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｐ５３ｉｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｙａｄｅｓｉｇｎｅｄｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３．１００（２３）：ｐ．１３３０３−７）は、部分的なものにすぎない。

Ｍｕｔ−ｐ５３を標的にする小分子化合物は、タンパク質に基づくかまたは細胞に基づくアッセイのいずれかを用いて同定された（Ｐｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅｏｆｍｕｔａｎｔｐ５３ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３．２２（２９）：ｐ．４４７８−８７）。ＣＰ−３１３９８は、タンパク質加熱時のＰＡｂ１６２０反応性の維持によって評価される、単離されたｐ５３ＤＢＤを熱変性から保護する分子のスクリーニングによって同定された。（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｃｕｅｏｆｍｕｔａｎｔｐ５３ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９．２８６（５４４９）：ｐ．２５０７−１０）。ＣＰ−３１３９８の作用機序は不明なままである。ＮＭＲ研究は、ＣＰ−３１３９８とｐ５３ＤＢＤのどんな結合も検出できなかった（Ｒｉｐｐｉｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔａｌ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐ５３−ｒｅｓｃｕｅｄｒｕｇＣＰ−３１３９８ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２．２１（１４）：ｐ．２１１９−２９）。ＣＰ−３１３９８は、遺伝子発現に影響を及ぼし、ｐ５３依存性および非依存性の両方の様式で細胞死を誘導する。従って、ＣＰ−３１３８は、その細胞毒性の原因となりうるｐ５３以外の細胞標的を有すると思われる。

生きている癌細胞においてｐ５３機能を奪回する他の２種類の小分子、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１は、細胞に基づくスクリーニングアッセイによって発見された。ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１は同様の活性プロフィールを有する（Ｂｙｋｏｖ，Ｖ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔｐ５３ａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｂｙｍａｌｅｉｍｉｄｅａｎａｌｏｇｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００５．２８０（３４）：ｐ．３０３８４−９１）が、構造的に無関係である。これまで、Ｍｕｔ−ｐ５３との直接結合は実証されていない。この機構はＪＮＫ経路を伴う可能性があると思われる。

抗癌剤の創薬および設計の分野では、２つの異なる、時には補完的な戦略が用いられることがある。生物学的、数学的または計算的なツールを使用して特定の目的のための分子を設計する合理的設計がＣＤＢ３の例で使用された。しかし、異なるタンパク質とその環境との間の相互作用は複雑であるので、これは極めて困難であり、多くの場合、中程度の生物学的影響をもつ分子を生じる。２番目の戦略は、最良の形質をもつ化合物を単離するための、分子ライブラリーの高スループットスクリーニングである。かかるスクリーニングは、化学的な小分子ライブラリーかまたはペプチドライブラリーのいずれかを用いることができる。現在までに利用可能な大部分の薬物は、細胞膜を通過するその能力のため、小分子である。化学ライブラリーは通常１０^４〜１０^５の異なる化合物からなる；かかるライブラリーをスクリーニングすることは、個々の分子の機能評価を必要とし、小規模の研究所には非実際的となる。それはロボット工学および／または人的資源への大規模な投資を必要とするためである。ペプチドディスプレイライブラリーは非常に大きい。ペプチドの選択は、ペプチド（および、そのためにファージ）の固定化された標的との結合、溶出および増幅、その後のシークエンシングによる同定に基づく。

ファージディスプレイ手順において、ペプチドを提示するファージの濃縮は、固定化された標的でのファージライブラリーの親和性選択によって達成される。この「パニング」（ｐａｎｎｉｎｇ）プロセスでは、結合しているファージが捕獲されるが、結合していないものは洗い落とされる。次のステップでは、結合したファージを溶離し、大腸菌細胞の再感染により増幅させた。増幅したファージ集団は、次に、パニングの次のラウンドを受けることができる。ファージディスプレイライブラリーからの選択は、選択的濃縮および増幅の周期的プロセスである。数ラウンドの選択の後、個々のファージクローンの単離を許容する方法でファージを希釈する。次に、個々のクローンを選び取り、大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）で培養し、ファージＤＮＡを抽出し、その後シークエンシングに送る。最近開発された次世代シークエンシング技術は、ファージディスプレイの有効性を大いに増加させるものであり、より少ない選択ラウンドを実施して、全ての選択されたペプチドレパートリーの分析を許容する。

ファージディスプレイは他のスクリーニング法に勝る重要な利点をいくつか提供する；ファージディスプレイの主な利点は、表現され得る配列の多様性であり、非常に高い親和性および生物学的効果で分子を見出すことを可能にする。コンセンサスペプチド配列が見出されると、それは定向進化法かまたは合理的設計のいずれかによってさらに改良することができる。

Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ａ．，ｐ５３，ｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｇａｔｅｋｅｅｐｅｒｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｉｖｉｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，１９９７．８８：ｐ．３２３〜３３１Ｊｏｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｍ．Ｄ．Ａｌｌｅｎ，ａｎｄＡ．Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｓｕｐｅｒｓｔａｂｌｅｍｕｔａｎｔｏｆｈｕｍａｎｐ５３ｃｏｒｅｄｏｍａｉｎ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｓｃｕｉｎｇｏｎｃｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４．２７９（２）：ｐ．１２９１−６Ｖｅｎｔｕｒａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｐ５３ｆｕｎｃｔｉｏｎｌｅａｄｓｔｏｔｕｍｏｕｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７．４４５（７１２８）：ｐ．６６１−５Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｌ．，Ｆ．Ｓａｉｔ，ａｎｄＧ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｔｈｅ ‘ｗｉｌｄｔｙｐｅ’ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐ５３：ｅｐｉｔｏｐｅｍａｐｐｉｎｇｕｓｉｎｇｈｙｂｒｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１．２０（１８）：ｐ．２３１８−２４Ｖｏｊｔｅｓｅｋ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｐ５３ａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｎｅｗａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｔｈｅｃｏｒｅＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９５．１０（２）：ｐ．３８９−９３Ｃｏｏｋ，Ａ．ａｎｄＪ．Ｍｉｌｎｅｒ，Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｌｌｏｓｔｅｒｉｃｖａｒｉａｎｔｓｏｆｗｉｌｄ−ｔｙｐｅｐ５３，ａｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，１９９０．６１（４）：ｐ．５４８−５２Ｒａｖｅｒａ，Ｍ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎａｌｌｏｓｔｅｒｉｃｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｐ５３ｕｓｉｎｇａｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８．１６（１５）：ｐ．１９９３−９Ｆｒｉｅｄｌｅｒ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ａｐｅｐｔｉｄｅｔｈａｔｂｉｎｄｓａｎｄｓｔａｂｉｌｉｚｅｓｐ５３ｃｏｒｅｄｏｍａｉｎ：ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｒｅｓｃｕｅｏｆｏｎｃｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２．９９（２）：ｐ．９３７−４２Ｓａｍｕｅｌｓ−Ｌｅｖ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＡＳＰＰｐｒｏｔｅｉｎｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐ５３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００１．８（４）：ｐ．７８１−９４Ｉｓｓａｅｖａ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅｏｆｍｕｔａｎｔｓｏｆｔｈｅｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｐ５３ｉｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｙａｄｅｓｉｇｎｅｄｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３．１００（２３）：ｐ．１３３０３−７Ｐｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅｏｆｍｕｔａｎｔｐ５３ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３．２２（２９）：ｐ．４４７８−８７Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｃｕｅｏｆｍｕｔａｎｔｐ５３ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９．２８６（５４４９）：ｐ．２５０７−１０Ｒｉｐｐｉｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔａｌ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐ５３−ｒｅｓｃｕｅｄｒｕｇＣＰ−３１３９８ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２．２１（１４）：ｐ．２１１９−２９Ｂｙｋｏｖ，Ｖ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔｐ５３ａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｂｙｍａｌｅｉｍｉｄｅａｎａｌｏｇｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００５．２８０（３４）：ｐ．３０３８４−９１

それにもかかわらず、当技術分野において、ｐ５３変異体タンパク質を効率的におよび特異的に再活性化することのできる薬剤に対する未だ対処されていない必要性がある。そのような特異的かつ効率的な薬剤は、特に、変異体ｐ５３タンパク質の天然のフォールディングおよび活性を回復させることによって、ｐ５３が変異している様々な状態を処置するための効率的な手段としてさらに使用することができる。

本発明は、理想的には変異体ｐ５３タンパク質の立体構造および／または活性を変化させて野生型の機能性ｐ５３タンパク質の立体構造および／または活性に似せることによって、ｐ５３立体構造変異体を効率的に再活性化することのできる非常に強力なペプチドおよび修飾ペプチド薬を提供する。従って本発明は、存在しているが立体構造的に不完全なｐ５３タンパク質の活性化が有益でありうる、変異体ｐ５３に関連する状態を処置する際のペプチドおよびそれらの使用を提供する。

本発明は、ｐ５３立体構造変異体を効率的に、この用途で特定された既に知られているペプチドよりも効率的に再活性化することのできる非常に強力なペプチドおよびペプチドに基づく薬剤の驚くべき同定に基づく。従って本発明は、一態様において、配列番号３２１〜２８６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる組換えもしくは合成ペプチドを提供する。

本発明は、もう一つの態様において、配列番号３２１〜２８６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む組換えもしくは合成ペプチドをさらに提供し、この際、前記ペプチドは変異体ｐ５３タンパク質を少なくとも部分的に再活性化させる。

本発明は、さらにもう一つの態様において、配列番号３１４、２６８、２８２、３４０、３７６、２９８、３７７、３７８、２５３、２０、３７９、３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のコンセンサスモチーフを含む組換えもしくは合成ペプチドをさらに提供し、この際、前記ペプチドは、変異体ｐ５３タンパク質を少なくとも部分的に再活性化させる。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３２１、配列番号３１４、配列番号３１３、配列番号３１０または配列番号３０７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３０２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３２１、配列番号３１４、配列番号３１３、配列番号３１０または配列番号３０７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３０２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの脂肪酸部分とコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸およびステアリン酸からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリストイル脂肪酸である。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、前記変異体ｐ５３タンパク質の立体構造を野生型（ＷＴ）ｐ５３タンパク質の立体構造に少なくとも部分的に変化させる。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、前記変異体ｐ５３タンパク質がＷＴｐ５３タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識されるように、前記変異体ｐ５３タンパク質の立体構造を少なくとも部分的に変化させる。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体はＡｂ１６２０である。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、前記変異体ｐ５３タンパク質の活性をＷＴｐ５３タンパク質の活性に少なくとも部分的に戻す。

ある特定の実施形態では、活性は、前記変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞の生存率を低下させることである。ある特定の実施形態では、活性は、前記変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞のアポトーシスを促進することである。ある特定の実施形態では、活性は、前記変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞のアポトーシス促進性遺伝子を活性化させることである。ある特定の実施形態では、アポトーシス促進性の遺伝子は、ＣＤ９５、Ｂａｘ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、Ｂｉｄ、５３ＡＩＰ１およびＰＥＲＰからなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、活性は、前記変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞のｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合エレメントとの結合である。ある特定の実施形態では、コンセンサスＤＮＡ結合エレメントは、配列番号３３９に示されるアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、結合の結果、内在性のｐ５３標的遺伝子の少なくとも部分的な活性化がもたらされる。ある特定の実施形態では、内在性の標的遺伝子は、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＰＵＭＡからなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質は、ＷＴｐ５３タンパク質とは異なる立体構造をもつ。ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質は、ＷＴｐ５３タンパク質と比較して、少なくとも部分的に不活性である。

ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質は、ＷＴｐ５３タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識されない。ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質は、前記ペプチドと結合すると、ＷＴｐ５３タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識される。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体はＡｂ１６２０である。

ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質は、Ｒ１７５Ｈ、Ｖ１４３Ａ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２８０Ｋ、Ｐ３０９Ｓ、Ｐ１５１Ｓ、Ｐ１５１Ｈ、Ｃ１７６Ｓ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｌ、Ｑ１９２Ｒ、Ｒ２１３Ｑ、Ｙ２２０Ｃ、Ｙ２２０Ｄ、Ｒ２４５Ｓ、Ｒ２８２Ｗ、Ｄ２８１Ｇ、Ｓ２４１Ｆ、Ｃ２４２Ｒ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｄ２８１Ｇ、Ｒ２７３ＣおよびＶ２７４Ｆからなる群から選択される突然変異を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３１４で示されるコンセンサスモチーフを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３２１、配列番号３１４、配列番号３１３、配列番号３１０または配列番号３０７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３２１、配列番号３１４、配列番号３１３、配列番号３１０または配列番号３０７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号２６８、２８２、３４０、３７６、２９８、３７７、３７８、２５３、２０、３７９、３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３７９、３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

本発明は、もう一つの態様において、上記のペプチドを発現する能力のある発現ベクターをさらに提供する。

本発明は、さらにもう一つの態様において、上記のペプチドを含む医薬組成物をさらに提供する。

本発明は、さらにもう一つの態様において、上記の発現ベクターを含む医薬組成物をさらに提供する。

一態様では、上記の医薬組成物は、変異体ｐ５３タンパク質に関連する疾患、障害または状態の治療に使用される。

一部の実施形態では、疾患は癌である。一部の実施形態では、癌は、乳癌、結腸癌および肺癌からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

一部の実施形態では、癌の細胞は変異体ｐ５３タンパク質を発現する。

本発明は、もう一つの態様において、治療上有効な量の上記の医薬組成物を、治療を必要とする被験体に投与し、それにより前記疾患、障害または状態を治療する工程を含む、変異体ｐ５３タンパク質に関連する疾患、障害または状態を治療する方法をさらに提供する。

本発明は、さらにもう一つの態様において、上記の医薬組成物を含むキットをさらに提供する。

一態様では、上記のキットは、変異体ｐ５３タンパク質に関連する疾患、障害または状態の治療に使用される。

その他の目的、特徴および本発明の利点は、以下の説明および図面から明らかになる。

標的分子の立体構造または構造へのその影響によって、間接的な方法で、結合パートナー（ペプチドなど）の選択をもたらす、スクリーニング法の工程のブロック図である。変異体ｐ５３再活性化ペプチドの同定、スクリーニングおよび選択の方法の略図である。この方法は、ファージディスプレイ法を利用することによる、変異体ｐ５３再活性化ペプチドをスクリーニングおよび同定するための、増加するストリンジェンシーでの交互の様々な選択戦略を含む。戦略Ａ（左）：立体構造による選択：変異体ｐ５３タンパク質（例えば、Ｒ１７５ＨＭｕｔ−ｐ５３）と結合することのできるファージによって発現および提示されるペプチドの選択。Ｍｕｔ−ｐ５３タンパク質は、基板に固定化された特異的ｐ５３抗体（例えば、ＰＡｂ１６２０）と結合し、それにより結合したファージの選択を可能にする。戦略Ｂ（右）：機能による選択：Ｍｕｔ−ｐ５３（例えば、Ｒ１７５ＨＭｕｔ−ｐ５３）を再活性化することができ、それにより、Ｍｕｔ−ｐ５３タンパク質がＤＮＡコンセンサス結合エレメントと結合するその能力によって活性化が求められる、ファージによって発現および提示されるペプチドの選択。ＤＮＡ結合エレメント（例えば、ＷＴｐ５３−ＲＥ）は、基板に固定化される。Ｍｕｔ−ｐ５３は、それと結合した再活性化ペプチドによって少なくとも部分的に再活性化されない限り、ＷＴｐ５３−ＲＥと結合することができない。この方法は、同定されたペプチドの配列を決定し、所望により再活性化ペプチドのコンセンサス配列を同定するために、同定されたペプチドのシークエンシング（例えば、ディープシークエンシング）をさらに含むことができる。抗体（ＰＡｂ１６２０またはＰＡｂ２４０）またはタンパク質（ＡＳＰＰ２またはＢｃｌ２）と共有結合的に架橋したアガロースビーズを、ＷＴｐ５３タンパク質、変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈタンパク質または変異体ｐ５３Ｖ１４３Ａ（各々は、それぞれのタンパク質を発現するバキュロウイルスでトランスフェクトしたｓｆ９細胞より生成）とともに４℃で３時間インキュベートした、免疫沈降（ＩＰ）実験のウエスタンブロット分析のピクトグラムを示す図である。結果として得られる免疫沈降物、ならびに上清（ｓｕｐ）を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗ｐ５３（αｐ５３）抗体を用いるウエスタンブロット実験に付し、各試料中のｐ５３タンパク質レベルを求めた。ＰＡｂ１６２０またはＰＡｂ２４０抗体と共有結合的に架橋したビーズを、様々な溶液（Ａ−ＩおよびＩＰ緩衝液）でＷＴｐ５３または変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈとともに４℃で３時間インキュベートした、ＩＰ実験のウエスタンブロット分析のピクトグラムを示す図である。結果として得られる免疫沈降物、ならびに上清（ｓｕｐ）を、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ｐ５３（αｐ５３）抗体を用いるウエスタンブロット実験に付し、各試料中のｐ５３タンパク質レベルを求めた。溶液Ａ−５０ｍＭＴｒｉｓ；溶液Ｂ−Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ；溶液Ｃ−Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ；溶液Ｄ−Ｔｒｉｓ、０．５％グリシン；溶液Ｅ−４０ｍＭＮａ_４Ｏ_７Ｐ_２；溶液Ｆ−４００ｍＭグアニジン−ＨＣｌ；溶液Ｇ−８００ｍＭグアニジン−ＨＣｌ；溶液Ｈ−１Ｍ尿素；溶液Ｉ−３Ｍ尿素；ＩＰ−ＩＰ緩衝液。ｐ５３タンパク質の結合エレメントとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。オリゴヌクレオチド（配列番号６１）は、５’ビオチン標識、それに続いてＨｉｎｄＩＩＩ認識部位（下線）、それに続いてＥｃｏＲＩ認識部位（下線）、それに続いてｐ５３コンセンサス結合エレメント（下線、ｐ５３結合部位は２つの半分の部位からなり、各々の半分の部位は、ｐ５３の二量体（ｄｉｍｍｅｒ）と結合し、この部位と一緒にＤＮＡおよびｐ５３四量体の複合体を形成する）、それに続いて２コピーのｐ２１プロモーターのｐ５３認識エレメント（下線）を含む。結合実験には、このオリゴヌクレオチドを相補オリゴヌクレオチドにアニールして、二重鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドを形成する。事前のプレクリアリング（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）工程をＰＡｂ１６２０ビーズによるファージプールのインキュベーションにより実施して、ＰＡｂ１６２０と共有結合的に架橋したビーズを、全長Ｍｕｔ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ（１７５）かまたは組換えＭｕｔ−ｐ５３Ｒ２４９Ｓ（２４９ＤＢＤ）のいずれかによるファージディスプレイ選択によって得たファージの存在下、精製した変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈとともにインキュベートした、ＩＰ実験のウエスタンブロット分析のピクトグラムを示す図である。選択されなかったファージ（ＮＳ）を対照として使用した。インキュベーションは４℃で３時間行った。免疫沈降物中の結合したｐ５３を、ｐ５３に対する抗体（αｐ５３）を用いてウエスタンブロット分析により分析した。選択されなかったファージ（ＮＳ）を対照として使用した。「Ｉｎ」は、直接にゲルの上に添加したＩＰ入力材料の１０％を表す。この抗体はｐ５３タンパク質の立体構造にかかわらずＣ末端のｐ５３エピトープに結合するので、ＰＡｂ−４２１による免疫沈降を、陽性対照および免疫沈降したｐ５３の基準として使用した。ビオチン標識したｐ５３−ＲＥ−ＤＮＡかまたは対照−ＲＥ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかと結合したストレプトアビジンコートビーズを、交互の選択ラウンドでＳＶ−４０ラージＴ抗原（Ｔ−ａｇ）とＰＡｂ１６２０の組合せを用いる、Ｍｕｔ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ（１７５）、クローン２７（１７５選択から単離した単一のクローン、配列番号３２８）；ＷＴおよびＭｕｔ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈで選択されたプール＃６９および＃９４によるファージディスプレイ選択によって得たファージの存在下、精製ＷＴ−ｐ５３−ＤＢＤまたは変異体ｐ５３−Ｒ２４９Ｓ−ＤＢＤとともにインキュベートした、ＩＰ実験のウエスタンブロット分析のピクトグラムを示す図である。非選択ファージ（ＮＳ）を対照として使用した。インキュベーションは４℃で３時間実施した。結合したｐ５３を、ｐ５３に対する抗体（αｐ５３）を用いるウエスタンブロット分析によって視覚化した。本明細書に記載される通り同定された、いくつかのコンセンサスペプチドモチーフの略図である。イムノアッセイにより求められるようにＭｕｔ−ｐ５３（Ｒ１７５Ｈｐ５３）を安定に過剰発現しているＨ１２９９細胞におけるＭｕｔ−ｐ５３の立体構造変化への被試験ペプチドの影響を決定する代表的なＥＬＩＳＡ実験を実証する棒グラフを示す図である。Ｍｕｔ−ｐ５３へのペプチドの立体構造的影響を測定するために、マイクロタイタープレートを、ＰＡｂ２４０、ＰＡｂ１６２０またはＰＡｂ４２１（使用した抗体はＷＴと変異体の立体構造の両方を認識するため陽性対照および全ｐ５３タンパク質の基準として）のいずれかでコーティングし、一晩インキュベートし、洗浄し、ブロッキングし、細胞抽出物（ペプチドを含むまたは含まない）をさらに２時間添加した。抽出物を除去した後、プレートを洗浄し、ｐ５３レベルの検出のためのαｐ５３−ＨＲＰコンジュゲートＡｂとともにインキュベートした。ＴＭＢ（ＨＲＰの基質）アッセイを実施し、４５０ｎｍでの光学濃度を求めた。ＷＴｐ５３は、ＰＡｂ１６２０との反応性の陽性対照として働き、Ｍｕｔ−ｐ５３は陰性対照として働く。結果は、ＰＡｂ１６２０またはＰＡｂ２４０試料および対照ＰＡｂ２４１試料間の吸光度の比として表される。ＭＣＦ７およびＨ１２９９−Ｍｕｔ−ｐ５３（ｔｓ）Ａ１３５Ｖ（ＴＳ）細胞をＷＴｐ５３立体構造の陽性対照として使用した（１６２０／２４０比は５：１に等しいかまたはそれを上回る）。イムノアッセイにより求められるようにＭｕｔ−ｐ５３（Ｒ１７５Ｈｐ５３）を安定に過剰発現しているＨ１２９９細胞におけるＭｕｔ−ｐ５３の立体構造変化への被試験ペプチドの影響を決定する代表的なＥＬＩＳＡ実験を実証する棒グラフを示す図である。Ｍｕｔ−ｐ５３へのペプチドの立体構造的影響を測定するために、マイクロタイタープレートを、ＰＡｂ２４０、ＰＡｂ１６２０またはＰＡｂ４２１（使用した抗体はＷＴと変異体の立体構造の両方を認識するため陽性対照および全ｐ５３タンパク質の基準として）のいずれかでコーティングし、一晩インキュベートし、洗浄し、ブロッキングし、細胞抽出物（ペプチドを含むまたは含まない）をさらに２時間添加した。抽出物を除去した後、プレートを洗浄し、ｐ５３レベルの検出のためのαｐ５３−ＨＲＰコンジュゲートＡｂとともにインキュベートした。ＴＭＢ（ＨＲＰの基質）アッセイを実施し、４５０ｎｍでの光学濃度を求めた。ＷＴｐ５３は、ＰＡｂ１６２０との反応性の陽性対照として働き、Ｍｕｔ−ｐ５３は陰性対照として働く。結果は、ＰＡｂ１６２０またはＰＡｂ２４０試料および対照ＰＡｂ２４１試料間の吸光度の比として表される。ＭＣＦ７およびＨ１２９９−Ｍｕｔ−ｐ５３（ｔｓ）Ａ１３５Ｖ（ＴＳ）細胞をＷＴｐ５３立体構造の陽性対照として使用した（１６２０／２４０比は５：１に等しいかまたはそれを上回る）。Ｍｕｔ−ｐ５３（Ｒ１７５Ｈｐ５３）を安定に過剰発現しているＨ１２９９細胞におけるＭｕｔ−ｐ５３のＤＮＡ結合活性への被試験ペプチドの影響を決定する代表的なＥＬＩＳＡ実験を実証する棒グラフを示す図である。市販のｐ５３／ＤＮＡ結合キット（Ｒ＆Ｄ）を製造業者の使用説明書に従って使用した。手短に言えば、９６ウェルプレートを抗ｐ５３抗体で一晩コーティングした。ｐ５３を含有する細胞抽出物を、試験ペプチドの存在下または不在（ＮＴ）下、ビオチンで標識したｐ５３コンセンサス結合部位を含有するオリゴヌクレオチドと反応させた。ＷＴｐ５３は、プレートの試験ウェルをコーティングする抗体と同様にこのＤＮＡ結合部位と結合することが予期される。過剰なｐ５３およびオリゴを洗い流し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して、ｐ５３が結合したＤＮＡに比例する、ウェル中のオリゴの量を定量する。ＴＭＢアッセイを実施してＨＲＰレベル（４５０ｎｍ）を求めた。結果は、各々の被試験試料の（４５０ｎｍでの）相対吸光度（Ｙ軸）として表される。ＭＣＦ７およびＨ１２９９−Ｍｕｔ−ｐ５３（ｔｓ）Ａ１３５Ｖ細胞は、ＷＴｐ５３の陽性対照として役立つ。被試験ペプチドと組換えＷＴｐ５３およびＭｕｔ−ｐ５３との結合を求めるための代表的なＥＬＩＳＡ実験を表す棒グラフである。市販のペプチド−タンパク質結合キット（ＴＡＫＡＲＡ）を製造業者の使用説明書に従って使用した。手短に言えば、９６ウェルプレートをペプチドで２時間コーティングした。可溶性ペプチドを、競合対照として働く対応するウェルに添加して、ｐ５３（＋ｃｏｍｐ）とのペプチド結合の特異性を確認した。ｐ５３−ＲＥＤＮＡオリゴを他のウェルに添加して（＋ＤＮＡ）、それがペプチドとｐ５３との結合に影響を及ぼすかどうかを調べた。組換えタンパク質を除去した後、プレートを洗浄し、ｐ５３の定量化のためにαｐ５３−ＨＲＰコンジュゲートＡｂとともにインキュベートした。最後にＴＭＢ（ＨＲＰの基質）アッセイを実施し、４５０ｎｍでの光学濃度を求めた。結果は、各々の被試験試料の４５０ｎｍでの相対吸光度（Ｙ軸）として表される。以下のαｐ５３モノクローナル抗体は、内部対照として働くＰＡｂ１８０１；ＰＡｂ１６２０およびＰＡｂ２４０。生細胞における代表的なｐ５３標的遺伝子のプロモーターとＭｕｔ−ｐ５３との結合を実証する棒グラフである。変異体ｐ５３^{Ｒ２４９Ｓ}を内因的に発現しているＢＴ−５４９乳癌細胞を、３つのｐＣＡＰ−２５０、３０８および３２５の混合物で５時間処理した。対照ペプチド（不活性ペプチド）の混合物で処理した細胞は、陰性対照として働いた。細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、回収し、ＤＮＡを超音波処理によって剪断した。ｐ５３と架橋したＤＮＡを、ポリクローナル抗ｐ５３抗体（Ｈ４７）を用いて免疫沈降させた。ＤＮＡを精製し、ＰＵＭＡ、ｐ２１、ＣＤ９５およびＭＤＭ２遺伝子プロモーターのｐ５３応答配列との結合を、ｑＰＣＲによって定量した。結果を、全ＤＮＡレベルを表す入力試料に標準化した。陰性対照として、抗体を含まないビーズで抽出物を免疫沈降させた（ビーズ）。ｐ５３結合エレメントを含有しないゲノム部位は、陰性対照として働く（黒色）。様々な被試験試料で測定される相対ルシフェラーゼ活性（ｃＬｕｃ／ｇＬｕｃ）を説明する棒グラフである。Ｈ１２９９ｐ５３−／−細胞の一過性トランスフェクションを、ルシフェラーゼ発現が複数のｐ５３応答配列のタンデムアレイの制御下である、ＴＫ−ＲＧＣ−ｌｕｃとともに、ＷＴｐ５３、Ｒ１７５Ｈｐ５３、Ｒ２４９Ｓｐ５３または対照として空のベクターを発現するプラスミドで実施した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を試験ペプチドで処理した。トランスフェクションの４８時間後、培養液の試料を生物発光測定のために取り出した。クリスタルバイオレットアッセイにより求められる、Ｍｕｔ−ｐ５３を発現している細胞の生存率への様々な被試験ペプチドの影響を説明する棒グラフである。内在性ＷＴｐ５３を発現しているＷＩ−３８線維芽細胞を、非特異的対照としてのマウスＮｏｘａｓｈＲＮＡ（ＷＩ３８−ｍ−Ｎｏｘａ−ｉ）かまたは変異体ｐ５３の安定な過剰発現のためのＲ１７５Ｈｐ５３変異体（ＷＩ３８−１７５）のいずれかを発現しているレトロウイルスに感染させた。細胞（ＷＩ３８−ｍ−Ｎｏｘａ−ｉまたはＷＩ３８−１７５）を９６ウェルプレートにウェル当たり３０００細胞で播種した。被試験ペプチドを細胞に添加した。異なる濃度のエトポシド（細胞傷害性薬物、４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９−［４，６−Ｏ−（Ｒ）−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］、４’−（リン酸二水素）を、細胞死の陽性対照として、さらに被試験ペプチドの影響を評価するための基準曲線として使用した。処置の４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄して死細胞およびデブリを除外し、プレートに付着して残っていた細胞をクリスタルバイオレットで３０分間染色した。クリスタルバイオレットを除去し、細胞をＰＢＳで４回洗浄して、残りのクリスタルバイオレットを除去した。次に、染色した細胞を１０％酢酸に溶解し、プレートを５９５ｎＭ（クリスタルバイオレットに最適）での光学濃度測定のために取り出した。図１３Ａおよび１３Ｂの棒グラフは、非処理（ＮＴ）試料に標準化された、処理後のプレート中の細胞の数を反映する、５９５ｎｍでの光学濃度読取値を示す。クリスタルバイオレットアッセイにより求められる、Ｍｕｔ−ｐ５３を発現している細胞の生存率への様々な被試験ペプチドの影響を説明する棒グラフである。内在性ＷＴｐ５３を発現しているＷＩ−３８線維芽細胞を、非特異的対照としてのマウスＮｏｘａｓｈＲＮＡ（ＷＩ３８−ｍ−Ｎｏｘａ−ｉ）かまたは変異体ｐ５３の安定な過剰発現のためのＲ１７５Ｈｐ５３変異体（ＷＩ３８−１７５）のいずれかを発現しているレトロウイルスに感染させた。細胞（ＷＩ３８−ｍ−Ｎｏｘａ−ｉまたはＷＩ３８−１７５）を９６ウェルプレートにウェル当たり３０００細胞で播種した。被試験ペプチドを細胞に添加した。異なる濃度のエトポシド（細胞傷害性薬物、４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９−［４，６−Ｏ−（Ｒ）−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］、４’−（リン酸二水素）を、細胞死の陽性対照として、さらに被試験ペプチドの影響を評価するための基準曲線として使用した。処置の４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄して死細胞およびデブリを除外し、プレートに付着して残っていた細胞をクリスタルバイオレットで３０分間染色した。クリスタルバイオレットを除去し、細胞をＰＢＳで４回洗浄して、残りのクリスタルバイオレットを除去した。次に、染色した細胞を１０％酢酸に溶解し、プレートを５９５ｎＭ（クリスタルバイオレットに最適）での光学濃度測定のために取り出した。図１３Ａおよび１３Ｂの棒グラフは、非処理（ＮＴ）試料に標準化された、処理後のプレート中の細胞の数を反映する、５９５ｎｍでの光学濃度読取値を示す。ｑＲＴ−ＰＣＲにより求められるｐ５３標的遺伝子のトランス活性化を測定することによる、Ｍｕｔ−ｐ５３の活性化への被試験ペプチドの影響を説明する棒グラフである。Ｈ１２９９細胞は、ｐ５３ヌルであり、ｐ５３研究に広く使用されている。Ｍｕｔ−ｐ５３（ｔｓ）Ａ１３５Ｖで安定にトランスフェクトしたＨ１２９９細胞を使用した。細胞を１２ウェルディッシュに播種し、示したペプチドを５ｕｇ／ｍｌの濃度で培養液に直接に添加し、その後、細胞を３２℃にするかまたは３７℃に戻した。１８時間後、細胞を回収し、それに続いてＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ分析を行った。３つの代表的なｐ５３標的遺伝子、ｐ２１、ＰＵＭＡおよびＭｄｍ２の発現レベルを調べた。図１４に示される棒グラフは、非処理細胞におけるその転写レベルと比較した、様々な試料中の被試験遺伝子の転写の相対誘導倍数を説明する。クリスタルバイオレットアッセイにより求められる、異なるＭｕｔ−ｐ５３イソ型を発現している乳癌細胞の生存率への様々な示したペプチドの影響を説明する棒グラフである。図１５Ａ：ＤＢＤの位置２８０に突然変異のある、Ｍｕｔ−ｐ５３を発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞。図１５Ｂ：ＤＢＤの位置１７５に突然変異のある、Ｍｕｔ−ｐ５３を発現しているＳＫＢＲ３細胞。図１５Ａおよび１５Ｂの棒グラフは、非処理（ＮＴ）試料に標準化された、処理後のプレート中の細胞の数を反映する、各被試験ペプチドについての５９５ｎｍでの光学濃度読取値を示す。クリスタルバイオレットアッセイにより求められる、異なるＭｕｔ−ｐ５３イソ型を発現している乳癌細胞の生存率への様々な示したペプチドの影響を説明する棒グラフである。図１５Ａ：ＤＢＤの位置２８０に突然変異のある、Ｍｕｔ−ｐ５３を発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞。図１５Ｂ：ＤＢＤの位置１７５に突然変異のある、Ｍｕｔ−ｐ５３を発現しているＳＫＢＲ３細胞。図１５Ａおよび１５Ｂの棒グラフは、非処理（ＮＴ）試料に標準化された、処理後のプレート中の細胞の数を反映する、各被試験ペプチドについての５９５ｎｍでの光学濃度読取値を示す。ｑＲＴ−ＰＣＲにより求められるｐ５３標的遺伝子のトランス活性化を測定することによる、Ｍｕｔ−ｐ５３の活性化への示したペプチドの影響を説明する棒グラフである。ｐ５３発現をノックダウンしたＳＫＢＲ３ＳｈＣｏｎ細胞およびＳＫＢＲ３Ｓｈｐ５３細胞を使用した。細胞を１２ウェルディッシュに播種し、示したペプチドを５ｕｇ／ｍｌの濃度で培養液に直接に添加した。１８時間後、細胞を回収し、それに続いてｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ｐ２１、ＰＵＭＡおよびＭｄｍ２の発現レベルを評価した。図１６は、非処理細胞におけるその転写レベルと比較した、様々な試料中の被試験遺伝子の転写の相対誘導倍数を説明する。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡを対照として並行に測定した。ＤＢＤ内の位置２４１で突然変異したＭｕｔ−ｐ５３を発現しているＥＳ２卵巣癌細胞で実施した代表的な実験を説明する図である。要するに、細胞を６ｃｍディッシュで平板培養し、示したペプチドを示した時点に１２ｕｇ／ｍｌの濃度で直接に培養液に添加した。細胞を回収し、アネキシン−Ｖ染色キット（Ｒｏｃｈｅ、ＲＥＦ１１９８８５４９００１）を用いてアポトーシスアッセイ（図１７Ａおよび１７Ｂ）を実施した。非固定細胞を、アポトーシス細胞を検出するための抗アネキシンＦＩＴＣコンジュゲート抗体と、死細胞を染色するためのＰＩ（ヨウ化プロピジウム）の両方で、製造業者の使用説明書に従って染色した。次に、染色細胞をフローサイトメトリーにより分析した。合計１０，０００細胞を各試料についてカウントし、染色強度に従って４つの亜集団に分割した；ＰＩとアネキシンの両方に陰性の細胞（−ＰＩ、−アネキシン）は生と名付けられ；ＰＩに陰性でアネキシンに陽性の細胞（−ＰＩ、＋アネキシン）はアポトーシスの初期段階初期段階を通過中であり；ＰＩおよびアネキシンに陽性の細胞（＋ＰＩ、＋アネキシン）は、アポトーシスプロセスを経た死細胞であり；ＰＩに陽性でアネキシンに陰性の細胞（＋ＰＩ、−アネキシン）は、壊死などの非アポトーシスプロセスにより死んだ死細胞と想定される。ＤＢＤ内の位置２４１で突然変異したＭｕｔ−ｐ５３を発現しているＥＳ２卵巣癌細胞で実施した代表的な実験を説明する図である。要するに、細胞を６ｃｍディッシュで平板培養し、示したペプチドを示した時点に１２ｕｇ／ｍｌの濃度で直接に培養液に添加した。細胞を回収し、アネキシン−Ｖ染色キット（Ｒｏｃｈｅ、ＲＥＦ１１９８８５４９００１）を用いてアポトーシスアッセイ（図１７Ａおよび１７Ｂ）を実施した。非固定細胞を、アポトーシス細胞を検出するための抗アネキシンＦＩＴＣコンジュゲート抗体と、死細胞を染色するためのＰＩ（ヨウ化プロピジウム）の両方で、製造業者の使用説明書に従って染色した。次に、染色細胞をフローサイトメトリーにより分析した。合計１０，０００細胞を各試料についてカウントし、染色強度に従って４つの亜集団に分割した；ＰＩとアネキシンの両方に陰性の細胞（−ＰＩ、−アネキシン）は生と名付けられ；ＰＩに陰性でアネキシンに陽性の細胞（−ＰＩ、＋アネキシン）はアポトーシスの初期段階初期段階を通過中であり；ＰＩおよびアネキシンに陽性の細胞（＋ＰＩ、＋アネキシン）は、アポトーシスプロセスを経た死細胞であり；ＰＩに陽性でアネキシンに陰性の細胞（＋ＰＩ、−アネキシン）は、壊死などの非アポトーシスプロセスにより死んだ死細胞と想定される。ＤＢＤ内の位置２４１で突然変異したＭｕｔ−ｐ５３を発現しているＥＳ２卵巣癌細胞で実施した代表的な実験を説明する図である。要するに、細胞を６ｃｍディッシュで平板培養し、示したペプチドを示した時点に１２ｕｇ／ｍｌの濃度で直接に培養液に添加した。細胞を回収し、アネキシン−Ｖ染色キット（Ｒｏｃｈｅ、ＲＥＦ１１９８８５４９００１）を用いてアポトーシスアッセイ（図１７Ａおよび１７Ｂ）を実施した。非固定細胞を、アポトーシス細胞を検出するための抗アネキシンＦＩＴＣコンジュゲート抗体と、死細胞を染色するためのＰＩ（ヨウ化プロピジウム）の両方で、製造業者の使用説明書に従って染色した。次に、染色細胞をフローサイトメトリーにより分析した。合計１０，０００細胞を各試料についてカウントし、染色強度に従って４つの亜集団に分割した；ＰＩとアネキシンの両方に陰性の細胞（−ＰＩ、−アネキシン）は生と名付けられ；ＰＩに陰性でアネキシンに陽性の細胞（−ＰＩ、＋アネキシン）はアポトーシスの初期段階初期段階を通過中であり；ＰＩおよびアネキシンに陽性の細胞（＋ＰＩ、＋アネキシン）は、アポトーシスプロセスを経た死細胞であり；ＰＩに陽性でアネキシンに陰性の細胞（＋ＰＩ、−アネキシン）は、壊死などの非アポトーシスプロセスにより死んだ死細胞と想定される。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｍｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。処置の開始から３５日後、実験は終了した。図１８Ａは、処置（ペプチド注射）の開始後の時間の関数としての、各腫瘍におけるルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図１８Ｂは、処置の開始時点のマウスのライブイメージング画像（７〜１０）を示す。図１８Ｃは、実験終了時の３５日目の処置マウスのライブイメージング画像（７〜９）を示す。マウス１０は、大きな腫瘍サイズのために２８日後に屠殺しなければならなかった。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｍｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。処置の開始から３５日後、実験は終了した。図１８Ａは、処置（ペプチド注射）の開始後の時間の関数としての、各腫瘍におけるルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図１８Ｂは、処置の開始時点のマウスのライブイメージング画像（７〜１０）を示す。図１８Ｃは、実験終了時の３５日目の処置マウスのライブイメージング画像（７〜９）を示す。マウス１０は、大きな腫瘍サイズのために２８日後に屠殺しなければならなかった。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｍｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。処置の開始から３５日後、実験は終了した。図１８Ａは、処置（ペプチド注射）の開始後の時間の関数としての、各腫瘍におけるルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図１８Ｂは、処置の開始時点のマウスのライブイメージング画像（７〜１０）を示す。図１８Ｃは、実験終了時の３５日目の処置マウスのライブイメージング画像（７〜９）を示す。マウス１０は、大きな腫瘍サイズのために２８日後に屠殺しなければならなかった。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ１５９、１５５および１７４；各ペプチド２ｍｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。処置の開始から３５日後、実験は終了した。図１９Ａは、処置（ペプチド注射）の開始後の時間の関数としての、各腫瘍におけるルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図１９Ｂは、処置の開始時点のマウス１〜６のライブイメージング画像を示す。図１９Ｃは、実験終了時の３５日目の処置マウス１〜６のライブイメージング画像（７〜９）を示す。腫瘍のうちの２つ（マウス１およびマウス４）は、３５日後のルシフェラーゼシグナルのそれぞれ５０％および６５％の低下で測定されるように、処置に対する部分的な応答を示した。マウス２および５は完全寛解を示し、処置の２１日後でさえＩＶＩＳシステムのバックグラウンド閾値検出レベル（５×１０^６光子）と同程度かまたはそれに近い生物発光読取値に達した。３５日後の処置の停止の後、２番および５番のマウスを生かして、さらに２１日間モニターした；腫瘍の再出現は視覚によってもライブイメージングによっても検出されなかった。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ１５９、１５５および１７４；各ペプチド２ｍｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。処置の開始から３５日後、実験は終了した。図１９Ａは、処置（ペプチド注射）の開始後の時間の関数としての、各腫瘍におけるルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図１９Ｂは、処置の開始時点のマウス１〜６のライブイメージング画像を示す。図１９Ｃは、実験終了時の３５日目の処置マウス１〜６のライブイメージング画像（７〜９）を示す。腫瘍のうちの２つ（マウス１およびマウス４）は、３５日後のルシフェラーゼシグナルのそれぞれ５０％および６５％の低下で測定されるように、処置に対する部分的な応答を示した。マウス２および５は完全寛解を示し、処置の２１日後でさえＩＶＩＳシステムのバックグラウンド閾値検出レベル（５×１０^６光子）と同程度かまたはそれに近い生物発光読取値に達した。３５日後の処置の停止の後、２番および５番のマウスを生かして、さらに２１日間モニターした；腫瘍の再出現は視覚によってもライブイメージングによっても検出されなかった。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ１５９、１５５および１７４；各ペプチド２ｍｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。処置の開始から３５日後、実験は終了した。図１９Ａは、処置（ペプチド注射）の開始後の時間の関数としての、各腫瘍におけるルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図１９Ｂは、処置の開始時点のマウス１〜６のライブイメージング画像を示す。図１９Ｃは、実験終了時の３５日目の処置マウス１〜６のライブイメージング画像（７〜９）を示す。腫瘍のうちの２つ（マウス１およびマウス４）は、３５日後のルシフェラーゼシグナルのそれぞれ５０％および６５％の低下で測定されるように、処置に対する部分的な応答を示した。マウス２および５は完全寛解を示し、処置の２１日後でさえＩＶＩＳシステムのバックグラウンド閾値検出レベル（５×１０^６光子）と同程度かまたはそれに近い生物発光読取値に達した。３５日後の処置の停止の後、２番および５番のマウスを生かして、さらに２１日間モニターした；腫瘍の再出現は視覚によってもライブイメージングによっても検出されなかった。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ１５９、１５５および１７４；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２０Ａおよび２０Ｂは、図１８Ａは、処置（ペプチド注射）の開始前（１８日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２０Ｃおよび２０Ｄは、処置の開始時（１８日、左側）および処置に入って１２日（３０日、右側）のマウスのライブイメージング画像を示す。４０％のマウスが完全寛解を示し、ＩＶＩＳシステム（５×１０^６光子）のバックグラウンド閾値検出レベルと同程度かまたはそれに近い生物発光読取値に達した。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ１５９、１５５および１７４；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２０Ａおよび２０Ｂは、図１８Ａは、処置（ペプチド注射）の開始前（１８日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２０Ｃおよび２０Ｄは、処置の開始時（１８日、左側）および処置に入って１２日（３０日、右側）のマウスのライブイメージング画像を示す。４０％のマウスが完全寛解を示し、ＩＶＩＳシステム（５×１０^６光子）のバックグラウンド閾値検出レベルと同程度かまたはそれに近い生物発光読取値に達した。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ１５９、１５５および１７４；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２０Ａおよび２０Ｂは、図１８Ａは、処置（ペプチド注射）の開始前（１８日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２０Ｃおよび２０Ｄは、処置の開始時（１８日、左側）および処置に入って１２日（３０日、右側）のマウスのライブイメージング画像を示す。４０％のマウスが完全寛解を示し、ＩＶＩＳシステム（５×１０^６光子）のバックグラウンド閾値検出レベルと同程度かまたはそれに近い生物発光読取値に達した。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ１５９、１５５および１７４；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２０Ａおよび２０Ｂは、図１８Ａは、処置（ペプチド注射）の開始前（１８日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２０Ｃおよび２０Ｄは、処置の開始時（１８日、左側）および処置に入って１２日（３０日、右側）のマウスのライブイメージング画像を示す。４０％のマウスが完全寛解を示し、ＩＶＩＳシステム（５×１０^６光子）のバックグラウンド閾値検出レベルと同程度かまたはそれに近い生物発光読取値に達した。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＳＷ−４８０結腸癌細胞を、ＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ２５０、３０８および３２５；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃは、処置（ペプチド注射）の開始前（０日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅは、それぞれ腫瘍体積および腫瘍重量のボックスプロットを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅからわかるように、ペプチド混合物かまたはｐＣＡＰ−３２５単一ペプチドで処置されたマウスから抽出された腫瘍は、対照ペプチドで処置されたマウスから抽出した腫瘍と比較して、サイズおよび重量が著しく小さい（ｐ値＜０．０５）。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＳＷ−４８０結腸癌細胞を、ＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ２５０、３０８および３２５；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃは、処置（ペプチド注射）の開始前（０日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅは、それぞれ腫瘍体積および腫瘍重量のボックスプロットを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅからわかるように、ペプチド混合物かまたはｐＣＡＰ−３２５単一ペプチドで処置されたマウスから抽出された腫瘍は、対照ペプチドで処置されたマウスから抽出した腫瘍と比較して、サイズおよび重量が著しく小さい（ｐ値＜０．０５）。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＳＷ−４８０結腸癌細胞を、ＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ２５０、３０８および３２５；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃは、処置（ペプチド注射）の開始前（０日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅは、それぞれ腫瘍体積および腫瘍重量のボックスプロットを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅからわかるように、ペプチド混合物かまたはｐＣＡＰ−３２５単一ペプチドで処置されたマウスから抽出された腫瘍は、対照ペプチドで処置されたマウスから抽出した腫瘍と比較して、サイズおよび重量が著しく小さい（ｐ値＜０．０５）。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＳＷ−４８０結腸癌細胞を、ＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ２５０、３０８および３２５；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃは、処置（ペプチド注射）の開始前（０日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅは、それぞれ腫瘍体積および腫瘍重量のボックスプロットを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅからわかるように、ペプチド混合物かまたはｐＣＡＰ−３２５単一ペプチドで処置されたマウスから抽出された腫瘍は、対照ペプチドで処置されたマウスから抽出した腫瘍と比較して、サイズおよび重量が著しく小さい（ｐ値＜０．０５）。マウス異種移植片モデルにおける示したペプチドのインビボでの影響を説明する図である。内在性の変異体ｐ５３を発現し、ルシフェラーゼを安定に発現するＳＷ−４８０結腸癌細胞を、ＣＤ１ヌード／ヌードマウスの左臀部に注射した。腫瘍が目に見えるサイズに達したら、生物発光（癌細胞の数を示す）をＩＶＩＳ２００システムで測定した。次に、マウスを、インビトロで表現型を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２；各ペプチド２ｕｇ）の混合物か、または変異体ｐ５３−再活性化能力を示した３つの試験ペプチド（ｐＣＡＰ２５０、３０８および３２５；各ペプチド２ｕｇ）の混合物で週３回の腫瘍内注射により処理した。図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃは、処置（ペプチド注射）の開始前（０日まで）および開始後の時間の関数としての、腫瘍における平均ルシフェラーゼ読取値を示す対数スケールグラフを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅは、それぞれ腫瘍体積および腫瘍重量のボックスプロットを示す。図２１Ｄおよび２１Ｅからわかるように、ペプチド混合物かまたはｐＣＡＰ−３２５単一ペプチドで処置されたマウスから抽出された腫瘍は、対照ペプチドで処置されたマウスから抽出した腫瘍と比較して、サイズおよび重量が著しく小さい（ｐ値＜０．０５）。

本発明は、ｐ５３立体構造変異体を効率的に、この用途で特定された既に知られているペプチドよりも効率的に再活性化することのできる非常に強力なペプチドおよびペプチドに基づく薬剤の驚くべき同定に基づく。

本発明は、変異体ｐ５３タンパク質の抗癌作用および／またはアポトーシス促進作用を少なくとも部分的に上昇させることのできる薬剤、および、立体構造的に異常なｐ５３タンパク質に起因するかまたはそれに相互に関連する疾患または状態の処置におけるそれらの使用を提供する。どんな機構または理論にも縛られるものではないが、本発明により提供される薬剤との結合による変異体ｐ５３タンパク質の立体構造の変化がそれらを野生型ｐ５３タンパク質の３Ｄ立体構造に近くし、従って、野生型ｐ５３タンパク質の機能の少なくとも一部を変異体ｐ５３タンパク質に少なくとも部分的に戻すと推測される。

より具体的には、本発明は、一態様において、配列番号３２１〜２８６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる組換えもしくは合成ペプチドを提供する。

本発明は、もう一つの態様において、ペプチドが変異体ｐ５３タンパク質を少なくとも部分的に再活性化させる、配列番号３２１〜２８６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む組換えもしくは合成ペプチドをさらに提供する。

本発明は、さらにもう一つの態様において、ペプチドが、変異体ｐ５３タンパク質を少なくとも部分的に再活性化させる、配列番号３１４、２６８、２８２、３４０、３７６、２９８、３７７、３７８、２５３、２０、３７９、３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のコンセンサスモチーフを含む組換えもしくは合成ペプチドをさらに提供する。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３２１、配列番号３１４、配列番号３１３、配列番号３１０または配列番号３０７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３０２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、上記のペプチドは、配列番号３２１〜３１６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つの脂肪酸部分とコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸およびステアリン酸からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、脂肪酸はミリストイル脂肪酸である。

ある特定の実施形態では、ペプチドは変異体ｐ５３の立体構造タンパク質を野生型（ＷＴ）ｐ５３タンパク質の立体構造に少なくとも部分的に変化させる。

野生型ｐ５３タンパク質だけを特異的に認識する抗体が当技術分野において公知である。かかる抗体は、野生型かまたは変異体の、ある特定のｐ５３タンパク質が、野生型の機能性ｐ５３タンパク質の立体構造を保持しているかどうかを決定する際に非常に有用である。従って、ある特定の実施形態では、ペプチドは、変異体ｐ５３タンパク質がＷＴｐ５３タンパク質に対して専ら作られたか、または、ＷＴｐ５３タンパク質立体構造を保持するｐ５３タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識されるように、変異体ｐ５３タンパク質の立体構造を少なくとも部分的に変化させる。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、Ａｂ１６２０である。

ｐ５３は両方の対立遺伝子から発現されるので、細胞内ｐ５３の総含有量は、いずれもが野生型（ｗｔ／ｗｔ）、ｗｔと変異体ｐ５３型ｐ５３の混合（ｗｔ／ｍｕｔ）または変異体ｐ５３のみ（両方の対立遺伝子が突然変異している（ｍｕｔ／ｍｕｔ）か、または１つの対立遺伝子が欠失している（ｍｕｔ／−））であり得ることは当然理解される。癌において、状況は多くの場合、ｗｔ／ｍｕｔ、ｍｕｔ／ｍｕｔまたはｍｕｔ／−である。ｐ５３は四量体として働くので、変異体ｐ５３タンパク質は、癌の細胞内に存在しうる野生型ｐ５３タンパク質の活性を抑制することがある。そのため、本発明により提供されるペプチドは、野生型ｐ５３タンパク質のレベルの増加が良い結果を生まない癌の治療に特に有用である。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、変異体ｐ５３タンパク質の活性をＷＴｐ５３タンパク質の活性の少なくとも１つに少なくとも部分的に回復させる。

ある特定の実施形態では、活性は、変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞の生存率を低下させることである。ある特定の実施形態では、活性は、変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞のアポトーシスを促進することである。ある特定の実施形態では、活性は、変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞のアポトーシス促進性遺伝子を活性化させることである。ある特定の実施形態では、アポトーシス促進性の遺伝子は、ＣＤ９５、Ｂａｘ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、Ｂｉｄ、５３ＡＩＰ１およびＰＥＲＰからなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

ある特定の実施形態では、活性は、変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞のｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合エレメントとの結合である。ある特定の実施形態では、コンセンサスＤＮＡ結合エレメントは、配列番号３３９で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質が、ＷＴｐ５３タンパク質とは異なる立体構造をもつ。ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質は、ＷＴｐ５３タンパク質と比較して少なくとも部分的に不活性である。

ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質は、ＷＴｐ５３タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識されない。ある特定の実施形態では、変異体ｐ５３タンパク質は、ペプチドと結合すると、ＷＴｐ５３タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識される。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体はＡｂ１６２０である。

ある特定の実施形態（ｅｍｂｏｄｕｍｅｎｔｓ）では、ペプチドは、配列番号３１４で示されるコンセンサスモチーフを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３２１、配列番号３１４、配列番号３１３、配列番号３１０または配列番号３０７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３２１、配列番号３１４、配列番号３１３、配列番号３１０または配列番号３０７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号２６８、２８２、３４０、３７６、２９８、３７７、３７８、２５３、２０、３７９、３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３７９、３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

本発明は、もう一つの態様において、上記のペプチドを含む医薬組成物をさらに提供する。

一部の実施形態では、疾患は癌である。一部の実施形態では、癌は、乳癌、結腸癌および肺癌からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。一部の実施形態では、癌細胞は変異体ｐ５３タンパク質を発現する。

定義
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および語句が下に定義される。本明細書の用語法または語法が、本明細書に提示される教示および手引きを考慮し当業者の知識と組み合わせて、当業者により解釈されるものであるように、これらの用語および語句は、説明を目的とするものであって制限を目的とするものでないことは当然理解される。

用語「組換えまたは合成ペプチド」とは、本明細書において、当分野で公知の標準的な生物工学的方法、例えば細菌または固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）での発現などにより生成されたペプチドをさす。

本明細書において同義的に使用される用語「変異体ｐ５３タンパク質を少なくとも部分的に再活性化する能力のある」または「変異体ｐ５３タンパク質を少なくとも部分的に再活性化する」とは、ペプチドと変異体ｐ５３タンパク質との結合によって、変異体ｐ５３タンパク質が野生型ｐ５３タンパク質の対応する活性に類似する活性を得るか増加させるペプチドをさす。

用語「コンセンサスモチーフ」とは、本明細書において、本発明により提供される複数のペプチドに見出される少なくとも３つのアミノ酸からなるアミノ酸配列をさす。

用語「脂肪酸部分」とは、本明細書において、対応する完全な脂肪酸起源分子に類似する化学的および薬理的特徴の特定のセットを示す脂肪酸の一部をさす。さらなるという用語は、脂肪酸（カルボン酸）のアシル成分を含む任意の分子種および／または分子断片をさす。

本発明による透過性増強部分は、好ましくは、ペプチド直接結合によるかまたはリンカーを介してペプチド配列と共有結合によって連結されて、ペプチドコンジュゲートを形成する。透過性増強部分は、ペプチド部分の任意の位置に、直接にまたはスペーサーによって、好ましくはペプチドのアミノ末端に連結されてよい。ある特定の実施形態によれば、透過性増強部分は脂肪酸である。

化合物の細胞への透過性を積極的にまたは消極的に促進するか、あるいは増強する、当技術分野で公知のいずれの部分も、本発明によるペプチドコアとのコンジュゲーションに使用することができる。限定されない例としては、脂肪酸、ステロイドおよび嵩の高い芳香族もしくは脂肪族化合物などの疎水性部分；細胞膜受容体または担体、例えばステロイド、ビタミンおよび糖など、天然および非天然アミノ酸ならびに輸送体ペプチド、を有していてよい部分が挙げられる。一部の実施形態によれば、疎水性部分は脂質部分またはアミノ酸部分である。

用語「透過性」とは、本明細書において、薬剤または物質が、障壁、膜、または表皮層を通じて浸透、普及、または拡散する能力をさす。「細胞透過性」または「細胞浸透」部分とは、膜を通じて分子の浸透を促進または増強することのできる当技術分野で公知のいずれの分子もさす。限定されない例としては、脂質、脂肪酸、ステロイドおよび嵩の高い芳香族もしくは脂肪族化合物などの疎水性部分；細胞膜受容体または担体、例えばステロイド、ビタミンおよび糖など、天然および非天然アミノ酸、輸送体ペプチド、ナノ粒子ならびにリポソーム、を有していてよい部分が挙げられる。

本発明による疎水性部分は好ましくは脂質部分またはアミノ酸部分を含みうる。具体的な実施形態によれば、疎水性部分は、リン脂質、ステロイド、スフィンゴシン、セラミド、オクチル−グリシン、２−シクロヘキシルアラニン、ベンゾリルフェニルアラニン、プロピオノイル（Ｃ_３）；ブタノイル（Ｃ_４）；ペンタノイル（Ｃ_５）；カプロイル（Ｃ_６）；ヘプタノイル（Ｃ_７）；カプリロイル（Ｃ_８）；ノナノイル（Ｃ_９）；カプリル（Ｃ_１０）；ウンデカノイル（Ｃ_１１）；ラウロイル（Ｃ_１２）；トリデカノイル（Ｃ_１３）；ミリストイル（Ｃ_１４）；ペンタデカノイル（Ｃ_１５）；パルミトイル（Ｃ_１６）；フタノイル（（ＣＨ_３）_４）；ヘプタデカノイル（Ｃ_１７）；ステアロイル（Ｃ_１８）；ノナデカノイル（Ｃ_１９）；アラキドイル（Ｃ_２０）；ヘンエイコサノイル（ｈｅｎｉｅｃｏｓａｎｏｙｌ）（Ｃ_２１）；ベヘノイル（Ｃ_２２）；トルシサノイル（ｔｒｕｃｉｓａｎｏｙｌ）（Ｃ_２３）；およびリグノセロイル（Ｃ_２４）；からなる群から選択され、前記疎水性部分は、前記キメラポリペプチドとアミド結合、スルフヒドリル、アミン、アルコール、フェノール基、または炭素−炭素結合によって接着されている。

本発明に従って使用されてよい脂質部分のその他の例：リポフェクタミン、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ、ＤＭＲＩＥ、ＤＬＲＩＥ、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＭＥＡＰ、ＤＯＤＭＰ、ＤＯＰＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＳＰＡ、ＥＤＬＰＣ、ＥＤＭＰＣ、ＤＰＨ、ＴＭＡＤＰＨ、ＣＴＡＢ、リシル−ＰＥ、ＤＣ−Ｃｈｏ、−アラニルコレステロール；ＤＣＧＳ、ＤＰＰＥＳ、ＤＣＰＥ、ＤＭＡＰ、ＤＭＰＥ、ＤＯＧＳ、ＤＯＨＭＥ、ＤＰＥＰＣ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｗｅｅｎ、ＢＲＩＪ、プラスマロゲン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、グリセロール−３−エチルホスファチジルコリン、ジメチルアンモニウムプロパン、トリメチルアンモニウムプロパン、ジエチルアンモニウムプロパン、トリエチルアンモニウムプロパン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、スフィンゴ脂質、スフィンゴミエリン、リゾ脂質、糖脂質、スルファチド、グリコスフィンゴ脂質、コレステロール、コレステロールエステル、コレステロール塩、油、Ｎ−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルホモシステイン、Ν，Ν’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ビス（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチル−アミノカルボニルメチレン）エチレンジアミンテトラヨージド；Ｎ，Ｎ”−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−エチルアミノカルボニルメチレンジエチレントリアミンヘキサヨージド；Ν，Ν’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ”−ビス（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）シクロヘキシレン−１，４−ジアミンテトラヨージド；１，７，７−テトラ−（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルアンモニウムエチルアミノ−カルボニルメチレン）−３−ヘキサデシルアミノカルボニル−メチレン−１，３，７−トリアザヘプタン（ｔｒｉａａｚａｈｅｐｔａｎｅ）ヘプタヨージド；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ（（−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−エチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ’−（１，２−ジオレオイルグリセロ−３−ホスホエタノールアミノカルボニルメチレン）ジエチレントリアミンテトラヨージド；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸、リゾ脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、糖脂質、グルコ脂質、スルファチド、グリコスフィンゴ脂質、ホスファチジン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ポリマーを有する脂質、スルホン化糖を有する脂質、コレステロール、トコフェロールヘミスクシネート、エーテル結合脂肪酸をもつ脂質、エステル結合脂肪酸をもつ脂質、重合脂質、リン酸ジアセチル、ステアリルアミン、カルジオリピン、６〜８炭素長の脂肪酸をもつリン脂質、不斉アシル鎖をもつリン脂質、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３ｂ−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−ａ−Ｄ−マンノピラノシド、１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチル−アミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；コレステリル）４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノエート；Ｎ−スクシニルジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニル−グリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロ−ホスホエタノールアミン、およびパルミトイルホモシステイン。

用語「変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞」とは、本明細書において、少なくとも１つの対立遺伝子から変異体ｐ５３タンパク質を発現する細胞をさす。ある特定の実施形態では、用語「変異体ｐ５３タンパク質を発現している細胞」は、「癌細胞」と相互に交換可能である。

用語「アポトーシス促進性の遺伝子」とは、直接に（例えばある特定のカスパーゼなど）または間接的に（例えば、シグナル伝達カスケードの一部として）アポトーシスに関与する１つの遺伝子、または多数の遺伝子をさす。

用語「医薬組成物」とは、本明細書において、少なくとも１つの薬学的に活性な成分を含む任意の組成物をさす。

用語「変異体ｐ５３タンパク質に関連する」とは、本明細書において、変異体ｐ５３タンパク質に起因するか、または細胞または器官における変異体ｐ５３タンパク質の存在に関連するいずれの疾患、障害または状態もさす。

ｐ５３は両方の対立遺伝子から発現されるので、細胞内ｐ５３の総含有量は、いずれもが野生型（ｗｔ／ｗｔ）、ｗｔと変異体ｐ５３の混合（ｗｔ／ｍｕｔ）または変異体ｐ５３のみ（両方の対立遺伝子が変異している（ｍｕｔ／ｍｕｔ）か、または１つの対立遺伝子が欠失している（ｍｕｔ／−））であり得ることは当然理解される。癌において、状況は多くの場合、ｗｔ／ｍｕｔ、ｍｕｔ／ｍｕｔまたはｍｕｔ／−である。ｐ５３は四量体として働くので、変異体ｐ５３タンパク質は、癌の細胞に実際に存在する野生型ｐ５３タンパク質の活性を抑制することがある。そのため、本発明により提供されるペプチドは、野生型ｐ５３タンパク質のレベルの増加が良い結果を生まない癌の治療に特に有用である。

用語「治療上有効な量」とは、本明細書において、個体において疾患、障害または状態を弱める、減少させる、および／または抑制するのに十分な本発明によるペプチドを含有する組成物の量をさす。

本明細書において用いられる、用語ｐ５３は、ＷＴｐ５３の立体構造、変異体ｐ５３の立体構造、またはＷＴと変異体のｐ５３の間の中間の立体構造を有し得るαｐ５３タンパク質に関する。

本明細書において用いられる、用語「野生型ｐ５３」、「ｗｔｐ５３」および「ＷＴｐ５３」は、同義的に使用されてよく、野生型ｐ５３タンパク質の立体構造およびそのために野生型ｐ５３タンパク質の活性を有する野生型ｐ５３タンパク質に関する。一部の実施形態では、野生型ｐ５３は、特異的モノクローナル抗体によって同定され得る。

本明細書において用いられる、用語「変異体ｐ５３」、「Ｍｕｔ−ｐ５３」、「変異型ｐ５３」、および「ｐ５３変異体」は、同義的に使用されてよく、標的細胞において効率的に機能することのできない変異型ｐ５３タンパク質に関する。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３はその標的部位に結合できない。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）領域の変異である。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３は不活性立体構造においてミスフォールドされている。一部の例となる実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３は、温度感受性（ｔｓ）ｍｕｔｐ５３Ｒ２４９Ｓ（Ｒ２４９Ｓｐ５３）、ホットスポット全長変異型ｐ５３Ｍｕｔ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ（Ｒ１７５Ｈｐ５３）、または任意のその他のＭｕｔ−ｐ５３タンパク質である。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３は、ｐ５３のミスフォールドされた立体構造（ｐ５３の突然変異により誘導された）を認識する能力のある特異的モノクローナル抗体によって同定される。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３特異的モノクローナル抗体によって同定される。

語句「変異体ｐ５３タンパク質を再活性化するペプチド」とは、本明細書において、変異体ｐ５３タンパク質とのその相互作用によって、変異体ｐ５３タンパク質がその活性の少なくとも１つを増加させるペプチドをさし、この際の活性は野生型ｐ５３タンパク質の活性である。例えば、本発明により提供されるペプチドとのその相互作用によって、変異体ｐ５３タンパク質は、野生型ｐ５３タンパク質が同様の状況で行うのに似た方法で、癌細胞のカスパーゼなどのアポトーシス促進性のタンパク質の発現を直接にまたは間接的に増加させることができる。

本明細書において、用語「再活性化ペプチド」、「Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチド」は、同義的に使用されてよく、活性をＭｕｔ−ｐ５３に少なくとも部分的に戻す能力のあるペプチド剤に関する。一部の実施形態では、再活性化剤は、Ｍｕｔ−ｐ５３の立体構造に影響を及ぼして、天然のＷＴｐ５３により類似しているかまたはそれと同一である立体構造をとることによって、Ｍｕｔ−ｐ５３を再活性化することができる。一部の実施形態では、再活性化剤はＭｕｔ−ｐ５３と標的ＤＮＡのＷＴｐ５３結合部位との結合を回復させるためにＭｕｔ−ｐ５３を再活性化することができる。一部の実施形態では、再活性化剤は、Ｍｕｔ−ｐ５３の生化学的性質を回復させることができる。一部の実施形態では、再活性化剤は、癌細胞のｐ５３−選択性抑制を示すようＭｕｔ−ｐ５３タンパク質を誘導することができる。一部の実施形態では、再活性化剤は、ＷＴｐ５３タンパク質に類似するかまたは同一の構造的性質、生化学的性質、生理学的性質および／または機能的性質を有するようにＭｕｔ−ｐ５３を再活性化することができる。一部の実施形態では、再活性化剤はペプチドである。一部の実施形態では、再活性化剤は、３〜２５アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、再活性化剤は、５〜２０アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、再活性化剤は、６〜１５アミノ酸長を有するペプチドである。一部の実施形態では、再活性化剤は、７または１２アミノ酸長を有するペプチドである。

タンパク質に関する用語「立体構造」は、空間におけるタンパク質の構造的配置（フォールディング）に関する。

用語「ディープシークエンシング」および「次世代シークエンシング」は、同義的に使用されてよく、複数の核酸配列の迅速な並行シークエンシングを可能にする増強されたシークエンシング法に関する。

「ファージディスプレイ」法には、各々が特異的な外因性分子、例えばペプチドなどを発現および提示している、ファージのライブラリーのスクリーニングが含まれる。特異的ペプチドを発現および提示するファージの濃縮は、固定化された標的についてのファージライブラリーの親和性選択によって実現される。この「パニング」プロセスにおいて、結合しているファージ（すなわち、固定化された標的と結合することのできるペプチドを発現および提示するファージ）は捕獲されるが、非結合ファージ（すなわち、固定化された標的と結合することのできるペプチドを発現および提示しないファージ）は洗い落とされる。この方法の次の工程には、大腸菌細胞の同定されたファージによる再感染による、結合したファージの溶出および増幅が含まれ得る。一部の実施形態では、ファージライブラリーはオリジナルライブラリーであってもよいし、市販のファージディスプレイライブラリーであってもよい。

用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーをさすために本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、１または複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに当てはまる。

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）ヌクレオチド、ＲＮＡ（リボ核酸）ヌクレオチドまたは両方の種類の組合せからなる一本鎖または二本鎖ポリマーに関し、それには天然のヌクレオチド、化学修飾ヌクレオチドおよび合成ヌクレオチドが含まれうる。

「アミノ酸」は、２０の天然に存在するアミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸（下記参照）、または合成アミノ酸のいずれか１つに関する。

「保存的置換」とは、１つのクラスのアミノ酸の、同クラスのアミノ酸での置換をさす、ここで、クラスとは、共通の物理化学的なアミノ酸側鎖の性質、および、標準Ｄａｙｈｏｆｆ交換頻度マトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスにより決定されるような天然に見出される相同タンパクにおける高い置換頻度によって規定される。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスが分類されている。それには、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が挙げられる。例えば、Ａｓｐの、Ａｓｎ、ＧｉｎまたはＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基での置換は、保存的置換である。

「非保存的置換」とは、１つのクラスのアミノ酸の、別のクラス由来のアミノ酸での置換、例えば、クラスＩＩ残基であるＡｌａの、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｉｎなどのクラスＩＩＩ残基での置換をさす。

「化学的に修飾された」とは、天然のプロセスによるか、または当技術分野で周知の化学修飾技法により修飾されたアミノ酸をさす。多数の公知の修飾の中で、典型的であるが、排他的でない例としては、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、グリコサミノグリカン化、ＧＰＩアンカー形成、脂質または脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリスチル化（ｍｉｒｉｓｔｌｙａｔｉｏｎ）、ペグ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｔｉｎａｔｉｏｎ）、または任意の同様のプロセスが挙げられる。

本明細書において、用語「疾患を治療すること」または「状態を治療すること」は、疾患に関連する症状を寛解させるために、重症度を和らげるかまたは疾患を治癒するために、または被験体において疾患が発生することを防ぐために効果的な少なくとも１つの薬剤を含む組成物を投与することに関する。投与にはどんな投与経路も含まれうる。一部の実施形態では、疾患は、細胞、組織、器官、身体などに変異型ｐ５３が存在することに起因するかまたはそれに関する疾患である。一部の実施形態では、疾患は癌である。一部の実施形態では、癌は、乳癌、結腸癌および肺癌からなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物、例えばヒトなどである。一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体は非哺乳動物である。

用語「発現」とは、本明細書において、標的細胞における望ましい最終産物分子の産生をさす。最終産物分子としては、例えばＲＮＡ分子；ペプチドまたはタンパク質；および同類のもの；あるいはそれらの組合せを挙げることができる。

用語「構築物」とは、本明細書において、１または複数の核酸配列でありうる、人工的に構築されたかまたは単離された核酸分子をさし、核酸配列は、コード配列（つまり、最終産物をコードする配列）、調節配列、非コード配列、またはその任意の組合せを含みうる。構築物という用語は、例えば、それに制限されるとみなされてはならないベクターを包含する。

「発現ベクター」とは、外来細胞において異種核酸断片（例えば、ＤＮＡなど）を組み込み、発現する能力をもつベクターをさす。言い換えれば、発現ベクターは、転写されることの可能な核酸配列／断片（例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）、を含む。多くの原核生物および真核生物発現ベクターが公知であり、かつ／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。

用語「上流」および「下流」とは、本明細書において、ヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列中の相対的な位置をさす。周知のように、ヌクレオチド配列は５’末端および３’末端を有し、ヌクレオチド骨格の糖（デオキシリボースまたはリボース）環状の炭素に対してそのように呼ばれる。そのため、ヌクレオチド配列の位置に対して、下流という用語は配列の３’末端に向かう領域に関する。上流という用語は鎖の５’末端に向かう領域に関する。

本明細書において用いられる、用語「導入すること」、「トランスフェクション」または「トランスフェクトすること」および「感染」または「感染させること」は、同義的に使用されてよく、分子、例えば、核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクター、および同類のものなどを１または複数の標的細胞の中に、より具体的には１または複数の標的細胞の膜で囲まれた空間の内部に移すことをさす。分子は、例えば、その内容が参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ含むＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（２００１）により教示されるような、当業者に公知のいずれかの手段によって、１または複数の標的細胞の中に「導入される」ことができる。分子を細胞に「導入する」手段としては、例えば、限定されるものではないが：熱ショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、１または複数のトランスフェクション剤、ウイルス媒介導入、および同類のもの、またはそれらの組合せが挙げられる。細胞のトランスフェクションは、任意の起源の任意の種類の細胞で実施されてよい。

本明細書において、用語「外因性遺伝子」は、外部から細胞の中に導入される遺伝子（またはその部分）に関する。一部の実施形態では、外因性遺伝子は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および同類のもの）の形態で挿入される。一部の実施形態では、外因性遺伝子は、細胞で発現させることが可能である。一部の実施形態では、外因性遺伝子は細胞内で過剰発現する。

本明細書において、用語「約」は、本明細書で述べられる数値に関して、述べられた値＋／−１０％として理解されるべきである。

一部の実施形態では、再活性化ペプチドは、Ｍｕｔ−ｐ５３をＷＴｐ５３タンパク質に類似するかまたは同一の構造的性質、生化学的性質、生理学的性質および／または機能的性質を有するように再活性化することができる。

一部の実施形態によれば、Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドが提供され、ペプチドは約３〜２５アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドは、約４〜１５アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドは、約７〜１２アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドは、７アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドは、１２アミノ酸の長さである。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

一部の実施形態では、本明細書下文の表６、７または８中のペプチド配列のいずれか１つによって表されるアミノ酸配列を有するＭｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドが提供される。

一部の実施形態によれば、Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドは、Ｍｕｔ−ｐ５３がそのプロモーターにＷＴｐ５３結合エレメントを有するレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼなど）をトランス活性化することができるように、Ｍｕｔ−ｐ５３に影響を及ぼすことができる。一部の実施形態では、レポーター遺伝子のトランス活性化は、インビトロで（例えば、試験管またはウェルで）実施されてもよいし、レポーター遺伝子構築物を含む細胞においてインビボで実施されてもよい。

一部の実施形態によれば、Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドは、変異型ｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と結合することができる。一部の実施形態では、変異型ｐ５３は、そのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に突然変異を含む。

一部の実施形態では、癌は、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、脳腫瘍、脳幹膠腫、脳腫瘍、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体腫瘍、視床下部神経膠腫、乳癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイング腫瘍（ｐｎｅｔ）、頭蓋外胚細胞性腫瘍、眼癌、眼内黒色腫、胆嚢癌、胃癌、胚細胞性腫瘍、性腺外、妊娠性絨毛腫瘍、頭頸部癌、下咽頭癌、膵島細胞癌、咽頭癌、白血病、急性リンパ性白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、小細胞型リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系（原発性）リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、転移性扁平上皮癌、多発性骨髄腫、形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症状群、骨髄増殖性疾患、上咽頭癌、神経芽腫、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、外分泌、膵臓癌、膵島細胞癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫癌、下垂体癌、形質細胞腫瘍、前立腺癌、横紋筋肉腫、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚癌、カポジ肉腫、皮膚癌、黒色腫、小腸癌、軟部組織肉腫、軟部組織肉腫、精巣癌、胸腺腫、悪性甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、肉腫、小児期の珍しい癌、膣癌、外陰癌、またはウィルムス腫瘍である。

一部の実施形態では、癌は、血液癌などの非固形腫瘍である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、白血病またはリンパ腫である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、急性単球白血病（ＡＭＯＬ）である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、ホジキンリンパ腫（４つのサブタイプのいずれか）である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、非ホジキンリンパ腫（サブタイプのいずれか）である。もう一つの実施形態では、非固形腫瘍または血液癌は、骨髄性白血病である。

本発明の方法で用いるために、再活性化ペプチドは、特にタンパク質活性剤に関して、当技術分野で公知のような医薬組成物を形成するために、１または複数の薬剤的に許容される担体、安定剤または賦形剤（溶媒）を用いて従来法で処方されてよい。１または複数の担体は、組成物のその他の成分と相溶性であるという意味で「許容される」ものであり、そのレシピエントに有害ではない。適した担体としては、一般的に、生理食塩水またはエタノールポリオール、例えばグリセロールまたはプロピレングリコールなどが挙げられる。

再活性化ペプチドは、中性または塩形態で処方されてよい。薬剤的に許容される塩には、塩酸またはリン酸などの無機酸で、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸などの有機酸で形成される酸付加塩（遊離アミノ基で形成）が含まれる。遊離カルボキシル基で形成された塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。

組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内投与用に適切に処方され、好ましくはレシピエントの血液と等張の、再活性化ペプチドの滅菌水溶液を便宜に含む。かかる製剤は、塩化ナトリウム、グリシン、および同類のものなどの生理学的に適合性の物質を含有し、水溶液を生成するための生理条件に適合する緩衝ｐＨをもつ水に固体有効成分を溶解し、前記溶液を滅菌することにより一般的に調製される。これらは単位用量または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに調製されてよい。

組成物は、安定剤、例えばポリエチレングリコール、タンパク質、糖類（例えばトレハロース）、アミノ酸、無機酸およびその混合物などを組み込むことができる。安定剤は、水溶液中で適切な濃度およびｐＨで使用される。水溶液のｐＨは、５．０〜９．０の範囲内、好ましくは６〜８の範囲内にあるように調節される。再活性化ペプチドを処方する際には、抗吸着剤を使用してよい。その他の適した賦形剤には、一般的に、アスコルビン酸など抗酸化薬が含まれてよい。

組成物は、タンパク質を複合体化または吸収するポリマーの使用によって実現されうる制御放出製剤として処方することができる。制御放出製剤に適切なポリマーとしては、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、およびメチルセルロースが挙げられる。制御放出のための別の可能性のある方法は、再活性化ペプチドを、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートなどのポリマー材料の粒子の中に組み込むことである。あるいは、これらの薬剤をポリマー粒子に組み込む代わりに、例えば、コアセルベーション法によるかまたは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルの中に、それぞれに、あるいは、コロイド薬物送達システム、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセルの中に、あるいはマクロエマルジョンの中に、これらの材料を捕捉することが可能である。

一部の実施形態では、本発明の再活性化ペプチドは、経口（ｐｅｒｏｒａｌｏｒｏｒａｌ）組成物に処方されてよく、一部の実施形態では、液体溶液、乳濁液、懸濁液、および同類のものを含む。一部の実施形態では、かかる組成物の調製に適した薬剤的に許容される担体は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、液体経口組成物は、約０．００１％〜約０．９％、または別の実施形態では、約０．０１％〜約１０％の再活性化ペプチドを含む。

一部の実施形態では、本発明の方法で用いる組成物は、溶液または乳濁液を含み、これは一部の実施形態では、安全かつ効果的な量の再活性化ペプチドおよび所望により局所鼻腔内投与用のその他の化合物を含む、水溶液または乳濁液である。

一部の実施形態では、本発明の注射溶液は、水溶液中に処方される。一実施形態では、本発明の注射溶液は、ハンクス溶液、リンゲル液、または生理学的塩緩衝液などの生理学的に適合性の緩衝液中に処方される。一部の実施形態では、経粘膜投与用に、透過する障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は、当技術分野で一般に公知である。

一実施形態では、本明細書に記載される製剤は、非経口投与（例えば、ボーラス注射または持続注入による）用に処方される。一部の実施形態では、注射用製剤は単位剤形で、例えばアンプルで、または所望により防腐剤を添加した多用量容器に提示される。一部の実施形態では、組成物は、油性または水性溶媒中の懸濁液、溶液または乳濁液であり、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙａｇｅｎｔｓ）を含有する。

本発明の再活性化ペプチドは、経口、局所、経皮または非経口投与から選択される任意の適した投与経路により投与されてよい。一部の実施形態によれば、投与経路は、経皮、膣内、直腸、吸入、鼻腔内、眼内、耳介および口内から選択される局所投与によるものである。一部の実施形態によれば、投与経路は、非経口注射によるものである。様々な実施形態では、投与する工程は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、動脈内、大脳内、脳室内、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｓｅｕｓ）およびくも膜下腔内からなる群から選択される非経口経路によって実行される。例えば、再活性化ペプチドは、例えば、非経口経路、例えば、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈（ｉ．ｖ．）、皮下、または筋肉内経路などによって全身に投与されてよい。本発明の再活性化ペプチドおよび／または随意の追加の薬剤は、例えば、鼻腔内投与によって全身に投与されてよい。本発明の再活性化ペプチドおよび／または随意の追加の薬剤は、例えば、経口投与によって、経口バイオアベイラビリティをタンパク質にもたらすことのできる特定の組成物または製剤を使用することにより、全身に投与されてよい。本発明の再活性化ペプチドおよび／または随意の追加の薬剤は局所投与されてよい。

再活性化ペプチドは、約０．１〜約２０ｍｇ／被験体体量ｋｇ、一般に約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ、多くの場合約１〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲で投与されてよい。一部の例では、多量の初回投与量とそれに続いて周期的な（例えば、毎週）維持量を処置期間にわたって投与することが有利でありうる。再活性化ペプチドは、徐放性送達系、ポンプ、および持続注入のためのその他の公知の送達系によっても送達することができる。投与計画は、特定の再活性化ペプチドのその薬物動態学に基づく望ましい循環レベルを得るために様々であってよい。従って、治療薬の望ましい循環レベルが維持されるように用量は計算される。

一般的に、有効量は、再活性化ペプチドの活性および被験体の状態、ならびに処置する被験体の体重または表面積により決定される。用量のサイズおよび投与計画は、特定の被験体における再活性化ペプチドの投与に付随する有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。

一部の実施形態では、αｐ５３関連状態を治療または予防するためのキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、適した緩衝液中のＭｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドを含む容器（バイアルなど）および再活性化ペプチドの投与のための取扱説明書を含む。

以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態をより完全に説明するために提示される。しかし、それらは本発明の広い範囲を制限すると決して解釈されるべきではない。当業者は本発明の範囲から逸脱することなく本明細書に開示される原則の多くの変形形態及び修正形態を容易に考案することができる。

材料および方法
ｓｆ９細胞からの組換え全長（ＦＬ）タンパク質の精製：変異体ｐ５３Ｒ２４９Ｓ、変異型ｐ５３Ｒ１７５ＨおよびＷＴｐ５３：
対数期の２×１０^７のｓｆ９細胞を、２５ｍｌの培養液を含有する９の１７５ｃｍ^２フラスコで成長させ、２７℃で一晩インキュベートした。組換えｐ５３を含有するバキュロウイルスを各フラスコの中に添加し、７２時間インキュベートした。細胞をフラスコから擦り取り、４℃で遠心し（３２００ｇで５分間）、培養液を除去し、細胞ペレットを氷冷等張緩衝液（１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２、１３０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＰＡ−ジエチレントリアミン五酢酸）で２回洗浄した。細胞を溶解させるために、５０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２％スクロース、２ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭＰＭＳＦ、５ｍＭＤＴＴ）と０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に穏やかに反転させることによって細胞を再懸濁した。５６００Ｇで８分間遠心した核および上清を除去した。２０ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２％スクロース、２ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭＰＭＳＦ、１０ｍＭＤＴＴ＋プロテアーゼ阻害剤）と０．５ＭＮａＣｌを添加することによって核を溶解させ、激しくボルテックスし、氷上で２０分間インキュベートした。核ライセートを超遠心管に移し、４℃にて６０分間１００，０００ｇで遠心した。上清を取り出し、緩衝液Ｂで希釈してＮａＣｌ０．０４Ｍの終濃度にした後、４℃にて５分間２０，０００ｇで遠心した。核ライセートを、５０ｍｌの緩衝液Ａで予洗した、５ｍｌＨｉｔｒａｐＱＦＦ（ｆａｓｔｆｌｏｗ）（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換カラムに装入した。次に、タンパク質を溶出するためにより高い塩濃度を含有する緩衝液でカラムを洗浄した。例えば、変異体ｐ５３Ｒ２４９Ｓの場合には、タンパク質は約１５０ｍＭＮａＣｌでイオン交換カラムから溶出した。このタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．１、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０μΜ ＺｎＣｌ_２、および１０ｍＭＤＴＴで予め平衡化した、分取Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５高い読取データ数（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製タンパク質を含有する分画を一緒にプールし、６〜７ｍｇ／ｍｌに濃縮し、一定分量を取り、−８０℃で貯蔵した。各精製工程後に得た画分をドットブロットで変異型ｐ５３の存在について分析し、その後、クーマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで画分の純度を調べた。

サンドイッチＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートを、３つの異なる抗体を用いてコーティングした（各ウェルに１種類の抗体（Ａｂ））：ＰＡｂ４２１は、ｐ５３の両方の立体構造を認識し、Ｃ末端エピトープに結合する；ＰＡｂ２４０はｐ５３の変異体立体構造を識別し、タンパク質が部分的に変性した場合に（例えば、ＤＢＤが変異している場合）にＡｂに近づくことのできるコアドメイン内のエピトープ（アミノ酸２１２〜２１７）に結合する（Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄＤ．Ｐ．Ｌａｎｅ，Ｍｕｔａｎｔｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐ５３．Ｐｒｅｃｉｓｅｅｐｉｔｏｐｅｍａｐｐｉｎｇｕｓｉｎｇａｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｐｈａｇｅｅｐｉｔｏｐｅｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２．２２５（３）：ｐ．５７７−８３）；そして、ｐ５３のＷＴ立体構造を認識するＰＡｂ１６２０は、フォールディングがＷＴ立体構造にある場合に形成されるコアドメイン内のエピトープ（ａａ１５６、２０６〜２１０）に結合する（Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｌ．，Ｆ．Ｓａｉｔ，ａｎｄＧ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｔｈｅ‘ｗｉｌｄｔｙｐｅ’ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐ５３：ｅｐｉｔｏｐｅｍａｐｐｉｎｇｕｓｉｎｇｈｙｂｒｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１．２０（１８）：ｐ．２３１８−２４）。

ウェルを、１００μｌのＡｂ（５μｇ／ｍｌ）とともに一晩（ＯＮ）室温（ＲＴ）でインキュベートした。液体を廃棄し、ウェルを各洗浄につきリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、２００μｌで３回洗浄した。次に、室温（ＲＴ）で１．５時間、各ウェルでＰＢＳに希釈した５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μｌによるブロッキングを実施した。ブロッキング緩衝液を廃棄し、それに続いて上記のように、ＰＢＳ中で３回洗浄した。変異体およびＷＴのｐ５３タンパク質（１００μｌ、１０μｇ／ｍｌ）の試料を、対照ペプチドｐＣＡＰ−７１０（ＬＰＮＰＰＥＲ、配列番号３４０）およびｐＣＡＰ−１２２０（ＦＲＳＦＡＩＰＬＶＶＰＦ、配列番号３６８）（５μｇ／ｍｌ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、または試験ペプチド１〜１５３（５μｇ／ｍｌ））とともに、１．５時間一緒にインキュベートし、その後ウェルに添加した。試料を回転させ、ＲＴで１時間インキュベートした。試料を廃棄し、次に上記のように、トリスリン酸緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）（ＴＰＢＳ）を用いて４回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートストレプトアビジンｐ５３抗体（１０μｇ／ｍｌＨＡＦ１３５５（Ｒ＆Ｄ））をウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＴＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（各ウェル５０μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ、（カタログ番号ＥＳ００１−１Ｌ−Ｋ））を添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。反応を２Ｍ硫酸（５０μｌ）で停止させた。吸光度は、分光光度計を用いて４５０ｎｍで測定した。タンパク質濃度は、各試料の吸光度（ａｂｓｏｒｂｅｎｃｉｅｓ）でＡｂ４２１試料の吸光度を割ることにより求めた。

ＤＮＡ結合アッセイ
これらの実験のために、市販の「Ｒ＆Ｄ」のｐ５３／ＤＮＡ結合キット（Ｃａｔ−ＤＹＣ１３５５−５Ｌｏｔ−１２７３３６６ＦＡ）を、製造業者の手引きに従って使用した。手短に言えば、９６ウェルプレートを抗ｐ５３抗体で一晩コーティングする。ｐ５３を含有する細胞抽出物を、試験ペプチドの存在下または不在（ＮＴ）下、ビオチンで標識した、αｐ５３コンセンサス結合部位（キットに提供されている）を含有するオリゴヌクレオチドと反応させる。ＷＴｐ５３は、このＤＮＡ結合部位ならびにプレートの試験ウェルをコーティングする抗体と結合することが予期される。過剰なｐ５３およびオリゴを洗い流し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて、ｐ５３によって結合したＤＮＡに比例する、ウェル中のオリゴの量を定量化した。ＴＭＢアッセイを実施してＨＲＰ（ＥＳ００１−１Ｌ−Ｋ）レベル（４５０ｎｍ）を求めた。

クリスタルバイオレットアッセイ
細胞を、０．１ｍｌ中２５００〜４０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中で培養し、プレートに接着させるために３７℃で一晩インキュベートした。異なるペプチド（０．５μｇ／ｍｌ）の系列希釈を０．１ｍｌのアリコートに添加し、プレートを３７℃でさらに４８時間インキュベートした。その後、培養液を除去し、細胞を各ウェル５０μｌのメタノール／水（１：４、ｖ／ｖ）中のクリスタルバイオレット（０．５％）で１０分間染色することによって細胞溶解を求め、それに続いてＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０％酢酸（５０μｌ）を各ウェルに添加し、１０分間振盪した。次に、自動プレート読取を５９５ｎｍで実施した。

免疫蛍光
細胞をカバーガラス上で一晩培養し、その後Ｘ−ｆｅｃｔトランスフェクションを用いてペプチドで処理した。回収から２時間後、細胞を室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、それに続いて３回洗浄した（ＰＢＳ）。試料をＲＴで１０分間０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）で透過処理し、それに続いてブロッキングした（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡの洗浄３回）（各洗浄５分）。次に、１：５００で希釈したマウス抗ｐ５３（ＤＯ−１）抗体で細胞を１．５時間探索し、それに続いてブロッキングした（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡの洗浄３回）（各洗浄５分）。その後、１：６００で希釈したヤギ抗マウスＣｙ３および１：１０００で希釈したＤＡＰＩで細胞を４５分間探索した。試料をＥｌｖａｎｏｌとともにマウントした。

ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼ構築物の構築
配列５’−ＴＣＧＡＧＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣ−３’（配列番号３６２）を有するオリゴヌクレオチド（ＲＧＣ−Ｗ）、および配列５’−ＴＣＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＧＡＣＴＴＴＡＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＣ−３’（配列番号３６３）を有するオリゴヌクレオチド変異体ＲＧＣオリゴヌクレオチド（ＲＧＣ−Ｍ）は、両方ともＫｅｒｎら（Ｋｅｒｎ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐ５３ａｓａｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡ− ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１．２５２（５０１３）：ｐ．１７０８−１１）に由来し、ＷＴｐ５３のコンセンサス結合部位として働く。

これらのモチーフを、ｐＣＬｕｃＭｉｎｉ−ＴＫ２Ｖｅｃｔｏｒ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｎ０３２４Ｓ）のＫＰＮおよびＥｃｏ５３ＩＫ部位にクローン化した。ルシフェラーゼ構築物を用いて試験細胞におけるｐ５３の転写活性化を評価した。

ＣｈＩＰ分析
手短に言えば、クローンをホルムアルデヒド（終濃度１％）で室温にて１０分間架橋した。ホルムアルデヒドを２．５Ｍグリシン（終濃度０．２５Ｍ）で５分間中和した。１ｍｌの氷冷ＰＢＳ、緩衝液Ｉ（０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＥＧＴＡ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５）、および緩衝液ＩＩ（２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＥＧＴＡ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５）で細胞を順次洗浄し、擦り落とすことによって回収した。次に、細胞を０．３ｍｌの溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に再懸濁し、超音波処理を最大の設定で１０回（「オン」２０秒の後に「オフ」４０秒）行った後（Ｂｉｏｒｕｐｔｅｒ，Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，ＮＹ）、氷上で１０分間遠心分離して、２００〜５００ｂｐの断片を生成した。上清を収集し、ＣｈＩＰ希釈緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１）で１０倍に希釈し、それに続いて４０μｌの予めブロッキングしたプロテインＡ−セファロース（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）と２μｇの断片化サケ精子ＤＮＡ、および免疫前血清（１ｇのウサギ血清と１０μｌの１００ｍｇ／ｍＬＢＳＡで４℃にて２時間免疫クリアリング（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）した。入力試料の調製のために試料を確保した。

免疫沈降を、特異的抗体を用いて４℃で一晩実施した。免疫沈降の後、４０μｌのプロテインＡ−セファロース（サケ精子ＤＮＡで予めブロッキングしたもの）を添加し、さらに、もう１時間インキュベートした。沈殿物を、ＴＳＥＩ（０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１５０ｍＭＮａＣｌ）、ＴＳＥＩＩ（０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、５００ｍＭＮａＣｌ）、および緩衝液ＩＩＩ（０．２５ＭＬｉＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１）で各１０分間順次洗浄した。次に、沈殿物をＴＥ緩衝液で３回洗浄し、１％ＳＤＳ、０．１ＭＮａＨＣＯ_３で２回抽出した。溶出液をプールし、６５℃で最低６時間から一晩加熱してホルムアルデヒドの架橋を逆行させた。ＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋＳｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）で精製した。免疫沈降反応を、非特異的対照としてビーズだけを使用して三重反復で実施した。クローンからのＣｈＩＰ生成物の活性型および抑制型ヒストンマークの定量分析を、定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。免疫沈降（ＩＰ）の効率を標準化するために、クロマチンＩＰの標準化は、ネクチン（ｎｅｃｄｉｎ）プロモーター領域および５’領域（抑制型クロマチン領域に相当する）の特異的プライマーを用いて行った。

細胞培養およびルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ｈ１２９９ｐ５３−ヌル細胞を一晩培養した後、ＭａｘＦｅｃｔトランスフェクション剤（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を製造業者のプロトコールに従って用いてルシフェラーゼ構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの前に、細胞培養液をＯＰＴＩ−ＭＥＭに交換した。

トランスフェクション後に細胞を異なるペプチドで２４時間処理した。さらに２４時間後、増殖培養液を９６黒色プレートの上に収集した：Ｃｌｕｃアッセイ用の４０μｌ、およびＧｌｕｃアッセイ用の２０μｌ。アッセイは、ＴｕｒｎｅｒＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓＭｏｄｕｌｕｓマイクロプレートを用いて実施した。値は、Ｃｌｕｃ／ｇｌｕｃ／ＮＴ（非処理細胞）によって計算した。

ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡＩＩキットを細胞ペレットに用いて、製造業者のプロトコールに従って得た。０．４〜１μｇのアリコートを、Ｂｉｏ−ＲＴ２０００（Ｂｉｏ−Ｌａｂ）およびランダムヘキサマープライマーを用いて逆転写した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を、ＰｅｒｆｅＣＴａＳＹＢＲＧｒｅｅｎＦａｓｔＭｉｘＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ）を用いて、ＡＢＩ７３００装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。使用したＲＴ−ＰＣＲプライマーを表１に示す（プライマー配列は５’から３’へ表示される）。

ファージディスプレイライブラリー
使用したファージディスプレイライブラリーは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）により作成された市販のファージライブラリーであった。１つのライブラリーは線状ヘプタ−ペプチド（ＰｈＤ−７）のものであり、もう一方のライブラリーは、線状ドデカ−ペプチド（ＰｈＤ−１２）のものである（カタログ番号：ＰｈＤ−７、Ｅ８１００Ｓ；ＰｈＤ−１２、Ｅ８１１０Ｓ）。両方のライブラリーでランダム化されたペプチド配列はマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に発現し、その結果、ビリオンあたり５コピーの提示されたペプチドの原子価をもたらした。全てのライブラリーは、提示ペプチドとｐＩＩＩとの間に短いリンカー配列を含有する。

ディープシークエンシング
シークエンシングの前に、挿入されたライブラリーに隣接するプライマー、フォワード−５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＧ（配列番号３６４）およびリバース−５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＴＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴＧＴＧ（配列番号３６５）（各プライマーの最初の８塩基はランダム化され、４つ全ての塩基の混合物として組み込まれた）を用いて、ＰＣＲ反応を実施した。最初の塩基のランダム化は、Ｓｏｌｅｘａシークエンス装置（ｓｅｑｕｅｎｃｅｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）が、最初の数サイクルの間の繰り返し配列をシークエンシングできないために導入された。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡを必要量の５ｕｇおよび長さ（約１２０ｂｐ）で生じた。それにはＳｏｌｅｘａディープシークエンシングのための隣接するプライマーおよびクローン化されたペプチドライブラリーが含まれる。

実験条件の較正
ｐ５３タンパク質源の選定
ファージディスプレイ選択のタンパク質源を選定する場合には、いくつかの考慮事項を考慮に入れる；溶液中のファージクローンと異なるタンパク質との相互作用は非特異的偽陽性ペプチドを生じ得るので、精製タンパク質の使用が推奨される。ＳＦ９細胞（上記参照）から精製されたヒト全長ｐ５３タンパク質を、以下の実験で使用した（受託番号ＣＧ３３３６）。そのため、バキュロウイルス（上に詳述される通り）に感染したＳＦ９昆虫細胞株のｐ５３の発現系を使用した。この系で発現したｐ５３の主な利点は、それが翻訳後修飾を既に含んでいることである。

バキュロウイルス発現ＷＴｐ５３およびＭｕｔ−ｐ５３タンパク質の立体構造
Ｂａｃｕｌｏ−ｐ５３での最初の実験は、ＷＴｐ５３、ホットスポット全長変異体ｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）、または温度感受性（ｔｓ）変異型ｐ５３（Ｖ１４３Ａ）のいずれかを発現しているＳｆ９細胞の核抽出物ライセートを用いることによって行った。ＳＦ９細胞を、これら３つの発現ベクターのいずれか１つを有するウイルスに感染させた。感染の４８時間後、細胞を回収し、核を抽出し、抽出物を、ＰＡｂ１６２０、ＰＡｂ２４０、ＡＳＰＰ２（（Ｐ５３−ＢＰ２）とも命名される）および／またはＢｃｌ２を用いる４℃で３時間の免疫沈降に付した。免疫沈降物したｐ５３を、αｐ５３−ＨＲＰＡｂ（カタログ番号ＨＡＦ１３５５（Ｒ＆Ｄ））を用いるウエスタンブロット法により検出した。このＩＰ−ウエスタンブロット実験の結果を図２に示す。分かるように、温度感受性（ｔｓ）−変異体ｐ５３Ｖ１４３Ａ（４℃）およびＷＴｐ５３は両方ともＰＡｂ１６２０抗体にうまく結合するが、ＰＡｂ２４０には結合しない。他方、変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈは、ＰＡｂ１６２０よりもＰＡｂ２４０と強い結合を示す。このことは、Ｂａｃｕｌｏを発現した変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈは、変異体と野生型のｐ５３の中間の立体構造をとることを示唆する。Ｂｃｌ２はｐ５３形態のいずれとも結合を示さないが、ＡＳＰＰ２（Ｐ５３−ＢＰ２）は、全ての形態のｐ５３とほぼ同じ親和性で結合する。そのため、ＡＳＰＰ２およびＢｃｌ２は、これらの実験条件下でｐ５３立体構造のマーカーとして使用することができないと結論付けた。

溶液条件の較正
変異体ｐ５３Ｒ１７５ＨとＰＡｂ１６２０の比較的多い残余結合を減らすため、かつＷＴｐ５３とその抗体の結合を増強するために、アッセイ状態の微調整を実施した。結果は図３に示され、それは対応するバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞の核から抽出した（上記の通り）、精製変異体ｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）およびＷＴｐ５３のブロットを示す。精製ｐ５３を規定緩衝液（Ａ−Ｔｒｉｓ−５０ｍＭ；Ｂ−Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ；Ｃ−Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ、Ｔｒｉｔｏｎ０．５％；Ｄ−Ｔｒｉｓ、Ｇｌｉｃｙｎ０．５％；Ｅ−Ｎａ_４Ｏ_７Ｐ_２４０−ｍＭ；Ｆ−ＧｎｄＣｌ４００ｍＭ；Ｇ−ＧｎｄＣｌ８００ｍＭ；Ｈ−尿素１Ｍ；Ｉ−尿素３Ｍ；ＩＰ−ＩＰ緩衝液）に溶解し、その後ＰＡｂ１６２０およびＰＡｂ２４０で４℃にて３時間免疫沈降させ、αｐ５３−ＨＲＰ−Ａｂを用いるウエスタンブロット法に付した。分かるように、溶液（Ａ）は５０ｍＭＴｒｉｓだけを含有する。この溶液中で、変異体ｐ５３Ｒ１７５ＨとＰＡｂ１６２０の結合は、ＰＡｂ２４０との結合と比較してわずか約５％である。１５０ｍＭＮａＣｌ（Ｂ）、１５０ｍＭＮａＣｌ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（Ｃ）かまたは０．５％グリシン（Ｄ）のいずれかの添加により、変異体Ｒ１７５ＨとＰＡｂ１６２０の結合は増強された。３Ｍ尿素（Ｉ）は、ｐ５３変異体Ｒ１７５ＨとＰＡｂ１６２０の結合を、おそらくタンパク質の変性を引き起こすことによって減らした。尿素の低い方の濃度、１Ｍ（Ｈ）は、変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈ（Ｒ１７５Ｈｐ５３）とＰＡｂ１６２０の結合を増加させた。４０ｍＭＮａ_４Ｏ_７Ｐ_２（Ｅ）は、Ｒ１７５Ｈｐ５３とＰＡｂ１６２０の結合を最低のレベルまで減らした。最後に、ＩＰ緩衝液中では、Ｒ１７５Ｈｐ５３はＰＡｂ１６２０陰性のままであった；しかしこの緩衝液で、ＷＴｐ５３は強いＰＡｂ２４０結合を示し、ＰＡｂ１６２０との結合を減らし、ＩＰ緩衝液はＷＴ型の軽度のミスフォールディングを引き起こすことが示唆される。そのため、Ｔｒｉｓだけを含有する緩衝液をさらなる実験に使用する。

ファージディスプレイライブラリーの初期スクリーニングおよびＭｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドの選択
Ｒ１７５Ｈｐ５３タンパク質、単一のｐｈｄ−１２ファージライブラリー（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ８１１０Ｓ）およびＰＡｂ１６２０抗体による選択を用いるファージディスプレイ検査（ｓｃｒｅｅｎ）を、最初に実施した。２００ｎｇのＲ１７５Ｈｐ５３を、１０１１ファージと１時間反応させて、ファージの提示したペプチドとＭｕｔ−ｐ５３（Ｒ１７５Ｈ）を結合させた。次に、ＰＡｂ１６２０と架橋したビーズをさらに１時間添加して全ての複合体を免疫沈降させた。このパニング手順を３ラウンド繰り返し、インキュベートＭｕｔ−ｐ５３の量を減少させることによって、各ラウンド後に選択のストリンジェンシーを高めた：１回目のラウンド２００ｎｇ、２回目のラウンド１００ｎｇおよび３回目のラウンド５０ｎｇ。精製ＷＴｐ５３ＤＢＤを２μｇ／ｍｌの濃度で用いてファージを溶出した（ｐ５３ＤＢＤ（残基９４〜２９３）をｐＥＴ−２７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした）。プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換させた。タンパク質産生を、マウスｐ５３ＤＢＤについて記載された手順に従って実行した（Ｓｕａｄ，Ｏ．，ｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｏｆｒｅｓｔｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔｏｍｕｔａｎｔｐ５３ｂｙｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ，２００９．３８５（１）：ｐ．２４９−６５）。各選択ラウンドの後、溶出したファージの力価測定（ｔｉｔｔｅｒｉｎｇ）を実施して、選択されたファージの数を推定した（表２）。大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）を感染させることにより溶出したファージを増幅して、次のラウンドの選択のための約１０^１３ファージを得た。パニングの２回目のラウンドから、対照パニング実験をＰＡｂ１６２０だけで（Ｍｕｔ−ｐ５３でのインキュベーションを含まずに）実施した；この力価はパニングの特異性を示す。

表２に見られるように、１００感染性ファージ粒子／μｌを１回目の選択ラウンドで得、選択ラウンド間の典型的な濃縮値は最初の２ラウンドでより高度に濃縮され、その後３回目および４回目のラウンドのパニングではプラトーに達した。しかし、特異的選択パニング反応ならびに非特異的ＰＡｂ１６２０対照パニング反応の両方で溶出したファージの数は類似していた。かかる濃縮は、ファージが直接にＰＡｂ１６２０と結合し、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ標的との相互作用によらない可能性があることを示唆する。

バックグラウンド（非特異的結合）を減少させるために、さらなるプレクリアリング工程およびプレクリアリング時間の増加を導入した；しかし、バックグラウンド結合の割合は高いままであった。そのため、バックグラウンド結合を減少させるために、ファージディスプレイプロセス中に交互の選択工程を実行した。この目的のため、各選択ラウンドで異なる選択戦略を実施し、その一方で、実験系で共通する非特異的エレメントを最小化しようとする試み（そしてそのためにそれらの非特異的エレメントとの結合を減らすこと）を実施した。

ｐ５３の立体構造の変化の必要条件はペプチドとｐ５３の結合であると想定されるので、ＷＴｐ５３結合のためのさらなる選択工程をＰＡｂ１６２０選択の間に導入した。ＰＡｂ１６２０は２回目のパニングラウンドに存在しないので、直接にそれと結合しているファージは除去されると仮定された。さらに、機能ペプチドの必要条件はｐ５３との結合であるので、ＷＴ形態と優先的に結合しているペプチドがこの立体構造を安定化させると予測された。１回目および３回目のパニングラウンドは、前の実験と同様であった。しかし、２回目の選択ラウンドで、ＷＴ−ｐ５３（Ｈｉｓタグ付き）に対するファージ結合の選択を実施し、ニッケルビーズ（Ｈｉｓタグと結合）を用いてｐ５３／ファージ複合体を免疫沈降させた。溶出したファージの力価を各選択ラウンドの後に評価した。表３に見られるように、２回目のサイクルを１回目と比較すると、ファージの溶出の１０倍濃縮が実現された。これはファージディスプレイ基準ではやや低いと考えられるかもしれないが、この比較的低い濃縮の理由は、おそらくパニングの各ラウンドで異なる選択戦略を使用し、特異性を高める一方で選択されたファージの全体的な収率を低下させたことであろう。２回目の選択ラウンドから３回目への濃縮は約１００倍であり、以前の１０倍と比較して、ファージ濃縮の顕著な増加を示した。この顕著な増加は、繰り返したＰＡｂ１６２０選択に起因する。重要なことに、３回目のラウンド後のファージの数は約１０^５であったが、一方、対照ＰＡｂ１６２０ではそれは４×１０^３であった。そのため、非特異的対照（すなわち、バックグラウンド）は、選択されたファージ全体の約５％しか構成しない。

スクリーニングのための方法、およびＭｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドの同定。
特異的ｐ５３再活性化ペプチドをスクリーニングし、同定し、単離するために、異なる補完的な選択戦略の組合せを用いる方法を考案し、実施した。

この実施例では、３つの選択戦略を組み合わせた。第１の選択戦略は、上記のように、ＰＡｂ１６２０との反応性に頼る。第２の選択戦略は、ＷＴｐ５３とそのコンセンサスＤＮＡ配列モチーフ：ｐ５３応答配列（ｐ５３−ＲＥ）との結合に基づく。Ｐ５３とそのコンセンサスＤＮＡのインビトロでの結合は、広範に実証されている［Ｊｏｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｍ．Ｄ．Ａｌｌｅｎ，ａｎｄＡ．Ｒ．Ｆｅｒｓｈｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｓｕｐｅｒｓｔａｂｌｅｍｕｔａｎｔｏｆｈｕｍａｎｐ５３ｃｏｒｅｄｏｍａｉｎ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｓｃｕｉｎｇｏｎｃｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４．２７９（２）：ｐ．１２９１−６）。したがって、ｄｓＤＮＡを（アニーリング後に）生成するように２つの相補オリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、ｐ５３−ＲＥコンセンサス配列の２つのタンデムコピーを含有する：１つのコンセンサス配列は、結合実験から演繹した完全なコンセンサス結合部位であり（ＡＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号３３９））、もう一方の配列はｐ２１プロモーターから導いたαｐ５３ＤＮＡ結合部位であり（ＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧ（配列番号３４０））、これは第１コンセンサス配列の下流に位置する（図４）。その上、選択後のより特異的な溶出工程を可能にする２つの制限酵素部位（ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ（配列番号３４１））およびＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ（配列番号３４２））をさらに導入した。また、１つのオリゴヌクレオチド鎖をビオチンで標識して、ストレプトアビジンコートビーズでのＤＮＡ／ｐ５３／ファージ複合体の免疫沈降を可能にした。図４は、ｐ５３−ＲＥオリゴヌクレオチドの概略的な配列およびその配列エレメントを示す。上方の鎖オリゴヌクレオチドの配列は次の通りである：
ビオチン−５’−
ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号３６１）。

ＤＮＡ結合戦略（下に詳述される通り）を用いて実施した選択手順では、０．５〜３ｐｍｏｌのビオチン−ｐ５３−ＲＥオリゴヌクレオチドを２００ｎｇの精製ＷＴｐ５３と１時間反応させて結合を可能にした。次に、ＰｈＤ−７またはＰｈＤ−１２ファージライブラリーのいずれかから１０^１０ファージをさらに１時間導入した。次に、ストレプトアビジンコートアガロースビーズを３０分間添加した。次に、５〜１２回の洗浄工程を実施し、その後制限酵素かまたは過剰の非ビオチン化ＤＮＡのいずれかを３０分間添加することによって溶出を実施した。これらの予防策が、ＤＮＡ、ビオチンおよびストレプトアビジンと結合しているファージの選択を減らすことになる。

第３の選択戦略は、ＳＶ４０ラージＴ（ＬＴ）抗原に基づく。ｐ５３とＳＶ４０ＬＴの結合は、非常に強いと考えられる。そのため、ＳＶ４０ＬＴに対する結合エピトーププラットフォームを形成するためにｐ５３は適切に折り畳まれねばならない。この目的のため、Ｓｆ９細胞を、ＳＶ４０ＬＴをコードするバキュロウイルスに感染させた。細胞を溶解し、ＰＡｂ４１９（ＳＶ４０ＬＴ特異的抗体、（Ａｂｃａｍ−ａｂ１６８４））と架橋したタンパク質−Ａビーズを用いてＳＶ４０ＬＴを単離した。ビーズを数回洗浄した後、ファージディスプレイ選択に使用した。ＳＶ４０ＬＴ結合のパニング手順は、ＰＡｂ１６２０ビーズを使用する代わりに、ＰＡｂ４１９−ＳＶ４０ＬＴビーズを選択に使用したことを除いて、立体構造に基づく戦略と同様であった。

交互のラウンドでの３つ全ての選択戦略の組合せは最善の結果を生じる。それは各サイクルが望ましい特異的ペプチドを含むファージの百分率を徐々に増加させ、その一方で非特異的バックグラウンドを減少させるためである。同定および選択の方法の略図を図１Ａおよび１Ｂに示す。

ファージディスプレイスクリーニングは、ＰｈＤ−７およびＰｈＤ−１２ファージペプチドライブラリーと並行して実施された。ファージ選択の交互のサイクルを、各工程で異なる固定化プラットフォーム（ＰＡｂ１６２０、ｐ５３−ＲＥＤＮＡまたはＳＶ４０ＬＴ）を用いて実施した。表４は、濃縮ファージライブラリーを生成するためにとられた異なる選択経路を示し、各選択ラウンド後の力価値を明記する。選択プラットフォームのかかる異なる組合せ（例えば、ＰＡｂ１６２０の後にｐ５３コンセンサスＤＮＡ、その後に再びＰＡｂ１６２０、またはＳＶ４０ＬＴの後にＰＡｂ１６２０、その後にＳＶ４０ＬＴ）、ならびに２つの異なるファージライブラリーを使用することにより、サブ−ライブラリーのパネルを得、それを次に配列決定後に比較することができた。３サイクルの選択の後、高い割合のＭｕｔ−ｐ５３−再活性化ファージを含有する、６０を超える異なるプール（サブライブラリー）（表４）を得た。

選択されたファージプールはＭｕｔ−ｐ５３とＰＡｂ１６２０の結合を誘導する
上で実施したファージディスプレイ選択法がＭｕｔ−ｐ５３を再活性化するファージを濃縮することができるかどうかを決定するために、３サイクルの選択の後に得たファージプールが、全長Ｒ１７５ＨＭｕｔ−ｐ５３（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６４３９）かまたは組換え型Ｒ２４９Ｓｐ５３ＤＢＤ（２４９ＤＢＤ）タンパク質のいずれかとＰＡｂ１６２０との結合を誘導する能力を試験した。ｐＡｂ１６２０との直接結合を示す汚染ファージの望ましくない作用を減らすため、プレクリアリング工程を含め、試験反応に添加される前に、ファージプールを最初にＰＡｂ１６２０だけでインキュベートした。ＰＡｂ１６２０と共有結合的に架橋されたビーズを、ファージプールをＰＡｂ１６２０ビーズでインキュベートすることによって実施される事前のプレクリアリング工程を行わずに、または行って、Ｍｕｔ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ（１７５）かまたはＭｕｔ−ｐ５３Ｒ２４９Ｓ（２４９）によるファージディスプレイ選択によって得たファージの存在下で、精製変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈとともにインキュベートした。非選択ファージ（ｎｓ）を対照として使用した。インキュベーションを４℃で３時間実施した。結合したｐ５３を、ｐ５３に対する抗体を用いるウエスタンブロット分析によって視覚化した。図５に示される結果を見て分かるように、一部の選択されたファージプールは、ファージまたは非選択入力ファージ（ｎｓ）と比較して、Ｍｕｔ−ｐ５３とＰＡｂ１６２０の結合を実際に誘導した。

選択されたファージプールはＭｕｔ−ｐ５３とｐ５３コンセンサスＤＮＡの結合を誘導する
選択されたファージプールがＭｕｔ−ｐ５３とｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合エレメントの結合を促進することができるかどうかをさらに試験するために、ｐ５３コンセンサス応答配列に対応するビオチン標識オリゴヌクレオチド（ｐ５３−ＲＥ）ビオチン−ＡＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＴＡＴＡＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号３６６）または、ｐ５３結合に決定的な主要残基が変異した対照オリゴヌクレオチド（Ｃｏｎ−ＲＥビオチン−ＡＧＡａＡＴＧＣＣＣＡＧＡａＡＴＧＴＣＣＴＴＡＴＡＧＡａＡＴＧＣＣＣＡＧＡａＡＴＧＴＣＣ（配列番号３６７）を、これらのオリゴとストレプトアビジンコートビーズとを反応させることによって固定化した。ｐ５３−ＲＥまたはＣｏｎ−ＲＥビーズを、ＷＴｐ５３ＤＢＤかまたは変異体２４９ＤＢＤとともに、３サイクルの選択の後に得たファージプールと一緒にインキュベートした。ビオチン標識した、ｐ５３−ＲＥ−ＤＮＡかまたはＣｏｎ−ＲＥ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかと結合したストレプトアビジンコートビーズを、Ｍｕｔ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈ（１７５）、クローン２７（ＬＰＮＰＰＥＲ、配列番号３２８）（Ｒ１７５Ｈ選択から単離した単一のクローン）；ＷＴおよびＭｕｔ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈで選択されたプール＃６９および＃９４によるファージディスプレイ選択によって得たファージの存在下、精製ＷＴｐ５３−ＤＢＤまたは変異体ｐ５３Ｒ２４９Ｓ−ＤＢＤとともに、Ｔ−ＡＧおよびＰＡｂ１６２０の組合せを使用して交互選択ラウンドでインキュベートした。非選択ファージ（ＮＳ）を対照として使用した。インキュベーションは４℃で３時間であった。結合したｐ５３を、ウエスタンブロット分析によって視覚化した。図６に示される結果を見て分かるように、予測したように、ＷＴｐ５３ＤＢＤは、Ｃｏｎ−ＲＥとよりもｐ５３−ＲＥに十分に結合した。２４９ＤＢＤはｐ５３−ＲＥと結合せず、配列特異的ＤＮＡ結合能のその知られている消失に一致した。重要なことに、選択されたファージプールは、Ｍｕｔ−ｐ５３とｐ５３−ＲＥの結合を誘導することができ、Ｍｕｔ−ｐ５３の失われた機能を実際に再活性化および回復することが可能であることを示す。

選択されたファージプールのディープシークエンシング
ファージディスプレイの有効性を大いに増加させ、全ての選択されたペプチドレパートリーの抽出および分析を可能にする、次世代配列決定を、より少ない選択サイクルで実施した。８つのファージプールを、選択ラウンド間の濃縮の増加および機能活性という判定基準を用いるディープシークエンシング用に選択した。シークエンシングの前に、挿入されたライブラリーに隣接しているプライマー、フォワード−５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＧ（配列番号３６４）およびリバース−５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＴＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴＧＴＧ（配列番号３６５）（各プライマーの最初の８塩基はランダム化され、４つ全ての塩基の混合物として組み込まれた）で、ＰＣＲ反応を実施した。最初の塩基のランダム化を導入して、シークエンシングの効率および正確さを向上させた。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡを必要量の５ｕｇおよび長さ（約１２０ｂｐ）で生じた。それにはＳｏｌｅｘａディープシークエンシングのための隣接プライマーおよびクローン化されたペプチドライブラリーが含まれる。

ディープシークエンシングにより３６００万読取データのデータベースを得た。配列の９５％は、ライブラリーを抽出する時にＰＣＲで使用したプライマー配列を含んだ。次に、データの予備的バイオインフォマティクス分析を実施した。この分析には、最初のプライマーを含まない配列の除去、正しい読み枠に入っていない配列の除去、挿入長さによる最初の１２アミノ酸および７アミノ酸ライブラリーへのデータベースの分離、ならびに最後に特有の配列を数え、それらをデータベースでの出現数に従って分類することが含まれた。大部分の配列はデータベースに１回または２回しか出現しないことが見出され、おそらくバックグラウンドファージに一致した。１２の読取データをカットオフと規定し、それよりも下では配列の濃縮は無意味であるとみなした。次に、データベース中のＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳した。

内部品質対照として、反対方向からシークエンシングされ、そのためにその５’に異なるプライマーを含む、２つの鎖間の全ライブラリーからの百分率としての配列およびそれらの存在量を比較した。この比較により、配列およびそれらの存在量が２つの鎖間で同様であることが示され、得られた配列データベースが妥当であることが示された。

表５は、５’鎖のディープシークエンシングデータベースから得たペプチド配列のリストを示す。このデータベースは、不適切な配列を濾過した後に、合計で１０７の配列を含む。次に、カットオフカウンティング（ｃｕｔ−ｏｆｆｃｏｕｎｔｉｎｇ）および翻訳を実施した。列（＃読取データ）は、記載されるデータベース中に配列が繰り返す回数を示し、そのため、その特異的配列の濃縮に相当する。バイオインフォマティクス分析はＤＮＡ配列で実施し、個々のペプチドは遺伝暗号の縮重のためにいくつかの異なるＤＮＡ配列によってコードされ得るので、表に複数回出現するペプチドはかなり多数である。ある特定のペプチドが異なるＤＮＡ配列によってコードされる場合、それはそれが異なるファージクローンの中で独立に選択されたことを意味する。

あるいは、同じペプチドをコードするいくつかのＤＮＡ配列は、シークエンシングエラーの結果であり得る：しかし、この例では、そのような誤りはランダムな塩基にあり、そのために高い読取データ数を濃縮しないことが予期される。そのため、＃繰返しが３０読取データ未満のＤＮＡ配列を除外した。列（＃繰返し）は、同じペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の数を示し、そのため、選択の特異性および強度をさらに示す。

表５に見られるように、配列は、その２つの起源のライブラリーに分離されることがあり得る。ペプチド配列は中央の列に表され、配列は各ライブラリーの濃縮に相当する読取データの数に従って降順に分類される。１２ａａライブラリーは、単一配列−ＫＰＰＤＲＬＷＨＹＴＱＰ（配列番号３２２）によって支配されていることが見出された、それは配列の総数のほぼ２０％を構成する。７ａａライブラリーはそれよりも多様で、より多くの配列を含むが、濃縮値は低い。

表５は、ディープシークエンシングデータベースの分析を表す−配列はその２つの起源のライブラリーに分割され、ペプチド配列は中央の列に表され、配列は各ライブラリーの濃縮に相当する読取データの数に従って降順に分類される。列（＃繰返し）は、同じペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の数を示す。

ディープシークエンシングデータベースのバイオインフォマティクスモチーフ分析
次に、コンセンサスモチーフを同定するために、より包括的なバイオインフォマティクス分析を実施した。かかるモチーフは、いくつかの方法で解明することができた。第１に、１２ａａおよび７ａａライブラリーで同定されたペプチド配列間の比較。両方のライブラリーでの共通のモチーフの出現は、それが２つの完全に非依存性の実験で明白に選択されたものであるので、そのようなモチーフの強度を裏付けることになる。第２に、特定の位置のある特定のアミノ酸の存在量およびモチーフの同じ位置でのその他のアミノ酸に対するその類似度は、この特定の位置のかかるアミノ酸の重要度の指標として役立ち得る。第３に、モチーフの位置は、その機能に非常に重要であることがある：短いモチーフは、その他のアミノ酸配列において変動性を伴って長い方のペプチド配列に沿って移動することができ、ペプチドの遊離Ｎ末端からの距離は、その活性に対する重要性を知らせることができる。アルゴリズムを開発して、ペプチド長の増殖窓の中のアミノ酸配列を以下の通りチェックした：
１．各ペプチドのスコア化、同じペプチドに翻訳される異なるヌクレオチド配列の数を、かかる各種類のヌクレオチド配列の出現率で積分；
２．異なるペプチドのクラスター化、異なるペプチド間の配列類似性をスコア化；
および
３．関連するペプチド配列の群の同定、およびそれからコンセンサスを抽出。

候補ペプチドは、トップ出現率≧０．２％のものであった：７ａａライブラリーから４０個、１２ａａライブラリーから３２個あった。これらは、そのＢｌａｓｔｐ類似性および短いアミノ酸（ａａモチーフ）の出現率によって４０の群にクラスター化することができた。大部分の群は、単一のペプチドを含んだが、９の群は２〜１３ペプチドを含み、これらの群のうちの６が７ａａと１２ａａペプチドの両方を含んだ。

これらの群を、ブロックマルチプルアラインメントに変換した（出現率％は配列重みである）。これらのブロックを使用して７ａａおよび１２ａａペプチド−クラスター化配列ファイルを検索し、上位の結果を同じ方法で再びブロックに変換した。一部のブロックでは、全てではないが、２つのライブラリーからの結果は互いに類似していた。

ディープシークエンシング出力結果（すなわち、従来のシークエンシングによる数百の配列に対して数百万のペプチド配列のデータベースの作成）により、コンセンサスモチーフの非常に詳細かつ包括的な分析が可能になった。全体的に見て、著しく濃縮された配列の約１３０個のモチーフが同定された；これらのペプチドモチーフはいくつかのＤＮＡ配列によって表され、これらのモチーフのうちの１６個は７ａａと１２ａａライブラリーの両方で共有される。図７は、いくつかのそのようなモチーフを示す。一部のモチーフは、重複する配列を組み合わせることによって生じたものであり、そのために最初のペプチドライブラリーよりも長い。

ペプチドの合成
上記のように同定されたペプチドモチーフの得られたリストから、１２８個のペプチドを、９６ウェルフォーマットを利用する粗純度でＰＥＰＴＩＤＥ２．０により化学的に合成した。このセミハイスループット合成により、比較的低コストの各ペプチドが可能になった。下の表６は、合成したペプチドを一覧表にしたものである。このリストには、文献からｐ５３と相互作用することが公知であるタンパク質から誘導した一部のペプチドも含まれる。このリストには、ポリアルギニンＣ末端付加を含まないものと含むもの両方の、２種類に合成された１０個のペプチドも含まれる。このポリ−Ａｒｇ付加は、ペプチドが細胞膜を通過することを可能にすることが報告された。このことは、ポリＡｒｇＣ末端付加が細胞内へのペプチド送達を可能にする能力と、それがインビボでこれらの特定のペプチドの活性に干渉するかどうかの両方を評価することを可能にする。ポリＡｒｇには、０〜１０Ａｒｇ残基が含まれてよく、それはＲ_０−１０と指定される。

化学的に合成されたペプチドと、ファージディスプレイライブラリーから選択されたペプチドには違いが起こることがある。特に、選択されたペプチドは、ファージの状況において、ｐＩＩＩファージコートタンパク質を含む融合タンパク質として提示された。そのため、合成ペプチドへのこの移行は些細なことではなく、いくつかの場合には、ファージに提示された場合に活性であると示されたペプチドが、同じ配列が遊離ペプチドとして合成される場合にその活性を失うことは公知である。

リード試験ペプチドの機能的スクリーニング
リードペプチド候補をＭｕｔ−ｐ５３への立体構造的影響および機能的影響についてスクリーニングするためのいくつかの交互の補完的な方法を使用した。細胞膜を横切る各試験ペプチドの浸透に関する情報は不明であるので、評価のためのインビトロに基づくアッセイを最初に実施した：ｐ５３立体構造およびｐ５３の配列特異的ＤＮＡ結合の評価のためのＥＬＩＳＡ。その後、ペプチドの活性を生存率アッセイによる生細胞で、ｐ５３転写活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子で、およびインビボｐ５３標的遺伝子の調査で調べた。これらのアッセイの組合せ（全て９６ウェルフォーマットで実施）が、異なるｐ５３活性へのペプチドの影響、およびペプチドがそのような能力をＭｕｔ−ｐ５３タンパク質に付与する能力の同定および検証を可能にした。

ｐ５３立体構造への影響についてのペプチドのスクリーニング
最初のスクリーニング戦略は、ＥＬＩＳＡに基づいた。サンドイッチＥＬＩＳＡの１つの種類を使用して、リード試験ペプチドのｐ５３立体構造への影響を調べた。Ｍｕｔ−ｐ５３へのペプチドの立体構造的影響を測定するため、マイクロタイタープレートをＰＡｂ２４０、ＰＡｂ１６２０またはＰＡｂ４２１（陽性対照として）でコーティングし、その後、ｐ５３とこれらの抗体との反応を調べた。ＷＴｐ５３は、ＰＡｂ１６２０との反応性のための陽性対照として働き、Ｍｕｔ−ｐ５３は、陰性対照として働く。被試験ペプチドの影響を調べるために、それをＭｕｔ−ｐ５３を含有する溶液に添加し、いずれかのＡｂとの反応性の変化を試験した。ペプチドの添加後にＭｕｔ−ｐ５３のＰＡｂ１６２０に対する反応性の増加およびＰＡｂ２４０に対する反応性の低下が観察されたならば、それは被試験ペプチドがＭｕｔ−ｐ５３のＷＴ立体構造を再活性化したことを示した。異なる細胞抽出物を用いるいくつかのＥＬＩＳＡ実験を実施した。結果を、Ｍｕｔ−ｐ５３を安定に過剰発現しているＨ１２９９細胞の抽出物（Ｒ１７５Ｈｐ５３）で実施した代表的な実験を示す図８に示す。抽出物は、生理的ｐＨおよび塩濃度の標準的な免疫沈降緩衝液中７５０ｎｇ／μｌの濃度で調製され、ブロッキングのために３％ＢＳＡを添加し、その後５０ｎｇ／ｍｌの濃度の異なるペプチドと２時間反応させた。プレートを、様々な抗体（Ａｂｓ）で一晩コーティングし、洗浄し、ブロッキングし、細胞抽出物（ペプチドを含むまたは含まない）をさらに２時間添加した。抽出物を除去した後、プレートを洗浄し、ｐ５３レベルの検出のためにαｐ５３−ＨＲＰコンジュゲートＡｂとともにインキュベートした。最後に、ＴＭＢ（ＨＲＰの基質）アッセイを実施し、４５０ｎｍでの光学濃度を求めた（上記の通り）。ＭＣＦ７およびＨ１２９９−Ｍｕｔ−ｐ５３（ｔｓ）Ａ１３５Ｖ（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ａｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｔａｎｔｏｆｈｕｍａｎｐ５３．ＥｍｂｏＪ，１９９４．１３（１１）：ｐ．２５３５−４４）細胞を、ＷＴｐ５３立体構造の陽性対照として使用した（１６２０／２４０比は、５：１以上）。Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈｐ５３抽出物は、より多くの変異体ｐ５３立体構造を示しているが、ＰＡｂ４２１よりもＰＡｂ１６２０またはＰＡｂ２４０のＰＡｂ１６２０に対する反応性（１６２０／２４０比は１：２）をなお維持した。しかし、分析の結果を考察する場合、立体構造変化の程度をより良く捕らえる、ＰＡｂ１６２０／ＰＡｂ２４０計算比が言及される。これが抗体とのバックグラウンド結合であるかまたは実際のＷＴフォールディング立体構造であるかどうかを調べるため、異なる時間長の間、抽出物を加熱し、ＰＡｂ１６２０およびＰＡｂ２４０とのそれらの反応性をモニターすることによって変性のレベルの増加を誘発した。図８Ａおよび８Ｂに見られるように、熱処理の増加は、ＰＡｂ２４０との反応性の増加およびＰＡｂ１６２０との反応性の低下を誘発し、これらの抽出物中のＲ１７５Ｈｐ５３がこれらの実験条件下で一部ＷＴ立体構造のままであったことが示された。特に、一部の被試験ペプチドでのインキュベーションの後、Ｒ１７５ＨＭｕｔ−ｐ５３のＰＡｂ１６２０に対する反応性の増加およびＰＡｂ２４０に対する反応性の低下が検出された。これは、例えば、ペプチド２４、３６、４７、６０、６８（表６）の例にあたり、これらのペプチドが変異体ｐ５３タンパク質において立体構造変化を誘発することを示した。

ｐ５３−ＲＥＤＮＡとのＭｕｔ−ｐ５３の結合へのペプチドの影響についてのスクリーニング
Ｍｕｔ−ｐ５３のＤＮＡ結合への被試験ペプチドの影響を測定するため、市販のＥＬＩＳＡキット、（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＤＹＣ１３５５−５、Ｌｏｔ−１２７３３６６ＦＡ）を高スループットアッセイとして使用して、ｐ５３活性化を定量化した。このキットは９６ウェルプレート形式を使用する。キットは製造業者の使用説明書に従って使用した。ウェルを抗ｐ５３抗体で一晩コーティングした。ｐ５３を含有する細胞抽出物を、ｐ５３コンセンサス結合部位（キットに含まれる）を含有するビオチン標識オリゴヌクレオチドと反応させた。ＷＴｐ５３は、ウェルをコーティングする抗体だけでなくこのオリゴと結合することが予期される。過剰なｐ５３およびオリゴを洗浄緩衝液で洗い流した（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２〜７．４；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＷＡ１２６）。次に、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｒｔ８９０８０３、キットに提供される）を１５〜４５分間添加して、ｐ５３によって結合されたＤＮＡに比例するウェル中のオリゴの量を定量化した。ペプチドをＭｕｔ−ｐ５３抽出物に添加することが、バックグラウンドと比較してＥＬＩＳＡ読取値を増加させるのであれば、このペプチドは機能上効果的であるとみなされ、さらなる分析のために選択されうる。図９は、代表的な実験を示す：立体構造ＥＬＩＳＡと同様に、細胞抽出物を、試験ペプチドの存在下または不在下（ＮＴ）で、ビオチン−ｐ５３−ＲＥとともにインキュベートした。立体構造スクリーニングと同様に、ＭＣＦ７およびＨ１２９９−Ｍｕｔ−ｐ５３（ｔｓ）Ａ１３５Ｖ細胞はＷＴｐ５３の陽性対照として働く。抽出物を、αｐ５３−Ａｂでコーティングしたウェルに添加し、数回の洗浄工程の後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを１時間添加し、その後プレートを再び洗浄して、ＴＭＢ（ＨＲＰに対する基質）アッセイを実施した。図９に見られるように、Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈｐ５３抽出物は、ｐ５３−ＲＥオリゴに対していくらかのバックグラウンド結合を提示し、それは非標識競合オリゴによってさらに減少した。陽性対照は、バックグラウンドと比較して３〜４倍高いシグナルを示した。いくつかのペプチド、例えば：６８、７５、８３、９３、９７は、Ｈ１２９９−Ｒ１７５Ｈｐ５３抽出物とｐ５３−ＲＥＤＮＡの結合を高めると思われる。

ペプチドのＷＴｐ５３および変異体ｐ５３との結合
ペプチドのＭｕｔ−ｐ５３およびＷＴｐ５３との結合を測定するため、「ＴＡＫＡＲＡ」より市販されているＥＬＩＳＡキット（ＭＫ１００ＬｏｔＡＫ４０１）を高スループットアッセイとして使用して、異なるペプチドのタンパク質または抗体との結合を定量化した。キットは製造業者の使用説明書に従って使用した。ペプチドのＣ末端をプレートに接着させる化学反応を実施することにより、ウェルにペプチドを播種した。

組換えＷＴｐ５３またはＭｕｔ−ｐ５３Ｒ１７５Ｈを１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳおよびブロッキング緩衝液に溶解した後、ペプチドコートプレートに２時間添加した。可溶性ペプチドを対応するウェルに添加して、ｐ５３（＋ｃｏｍｐ）とのペプチド結合の特異性を示す競合対照として使用し、ｐ５３−ＲＥＤＮＡオリゴをその他のウェル（＋ＤＮＡ）に添加して、それがペプチドとｐ５３との結合に影響を及ぼすかどうかを調べた。組換えタンパク質を除去した後、プレートを洗浄し、αｐ５３−ＨＲＰコンジュゲートＡｂとともにインキュベートしてｐ５３レベルを定量化した。最後にＴＭＢ（ＨＲＰの基質）アッセイを実施し、４５０ｎｍでの光学濃度を求めた。図１０は、対応するペプチドおよび抗体で実施した代表的な実験を示す。わかるように、ウェルにαｐ５３モノクローナル抗体を接着させてアッセイの内部対照として使用した；ＰＡｂ１８０１は予測したように両方のｐ５３形態と結合する；ＰＡｂ１６２０はＷＴｐ５３に特異的であり、ＰＡｂ２４０は、変異体形態で反応性が高い。（ブロックされた）ウェルはペプチドでコーティングされておらず、ｐｅｐ７６は対照ペプチド配列である。分かるように、図に示される大部分のペプチドは、変異体ｐ５３と比較して、組換えＷＴｐ５３により高い親和性で結合する。

生細胞におけるＭｕｔ−ｐ５３のその応答配列との結合へのｐＣＡＰの影響
次に、ｐ５３がその標的遺伝子のクロマチンとも結合することができるかどうかを調べた。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを使用して、ｐＣＡＰがｐ５３応答配列（ｐ５３−ＲＥ）に対するＭｕｔ−ｐ５３ＤＮＡ結合能を回復させることができるかどうかを調べた。変異体ｐ５３Ｒ２４９Ｓを内因的に発現している乳癌細胞ＢＴ−５４９を、３つのｐＣＡＰ；２５０、３０８および３２５の混合物で５時間処理した。対照ペプチドの混合物で処理した細胞は、陰性対照として働く。次に、細胞を固定し、ＤＮＡを超音波処理によって剪断した。ｐ５３と架橋したＤＮＡを、ポリクローナル抗ｐ５３抗体を用いて免疫沈降させた。ＤＮＡを精製した後、異なるｐ５３標的遺伝子のｐ５３応答配列を、ｑＰＣＲ反応において異なるプライマーを用いて定量化した。結果を、全ＤＮＡ入力に標準化した。陰性対照として、抗体を含まないビーズ（ビーズ）で抽出物を免疫沈降させた。図１１に見られるように、クロマチンと対照ビーズとの結合は、入力ＤＮＡの０．００５％の基底レベルであった。ｐＣＡＰ混合物はｐ５３と非特異的ゲノムＤＮＡ対照配列との結合を増加させなかったが、ＰＵＭＡ、ｐ２１およびＣＤ９５遺伝子中の応答配列とのｐ５３結合は、対照ペプチドと比較してｐＣＡＰによって、それぞれ２．３４、９．７８および４．５４倍増加させた。

ｐ５３転写活性への影響についてのペプチドのスクリーニング
再活性化ペプチドを同定するために使用されるさらなるスクリーニング戦略がインビボで実施された。これはレポーター遺伝子アッセイに基づく。それは、１７反復のｐ５３コンセンサス結合部位（ＲＧＣ）を含有するプロモーターの制御下に置かれた、レポーター遺伝子の活性を定量化することによって、ｐ５３転写活性を測定する。ルシフェラーゼアッセイは生きている細胞で実施され、そのために、無傷の細胞の状況でＭｕｔ−ｐ５３機能への試験ペプチドの影響の指標を提供する。分泌されたルシフェラーゼレポーターの上流でクローン化されたＲＧＣに基づくプロモーター（ＴＫ−ＲＧＣ−ｌｕｃ）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（カタログ番号Ｎ０３２４Ｓ））を使用した。それは細胞の溶解を必要とせず、９６ウェルフォーマットの使用を可能にするためである。

図１２は、ペプチドが変異体ｐ５３に対する転写活性を回復させる能力を評価するために実施した代表的なルシフェラーゼアッセイ実験を示す。インビボでのルシフェラーゼに基づくスクリーニングには、Ｈ１２９９細胞を使用した。これらのｐ５３−／−細胞の一過性トランスフェクションを、ＷＴｐ５３、Ｒ１７５Ｈｐ５３、Ｒ２４９Ｓｐ５３を発現しているベクターまたは対照として空のベクターで実施した（Ｓｕａｄ，Ｏ．，ｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｏｆｒｅｓｔｏｒｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔｏｍｕｔａｎｔｐ５３ｂｙｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９．３８５（１）：ｐ．２４９−６５）。また、細胞を、ＴＫ−ＲＧＣ−ｌｕｃ（カタログ番号ＮＥＢ、Ｎ０３２４Ｓ）で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を試験ペプチドで処理した。トランスフェクションの４８時間後、培養液の試料を生物発光測定のために取り出した。図１２に見られるように、非処理試料において、ＷＴｐ５３（陽性対照）のトランスフェクションは、ＴＫ−ＲＧＣ−ｌｕｃ単独と比較して２０〜３０倍のＴＫ−ＲＧＣ−ｌｕｃからの転写を誘導した。ペプチド処理試料を調査すると、ペプチドはＷＴｐ５３活性にあまり影響を持たなかったことが分かる；ＷＴｐ５３活性を非常に増大させるペプチドは正常細胞に有毒作用を有すると予測されるため、これは励まされる結果である。被試験ペプチドのうちの２つ、つまりｐＣＡＰ−６８およびｐＣＡＰ−７５は、Ｒ１７５Ｈｐ５３およびＲ２４９Ｓｐ５３の存在下で、ＴＫ−ＲＧＣ−ｌｕｃからの転写を誘導する。

変異型ｐ５３発現細胞の生存率への影響についてのペプチドのスクリーニング
再活性化ペプチド活性の重要な指標は、Ｍｕｔ−ｐ５３を発現する癌細胞へのインビボでのそれらの影響である。特に、正常細胞への有毒作用が最小の、癌細胞の特異的Ｍｕｔ−ｐ５３依存性死を引き起こすことのできる再活性化ペプチドが望ましい。クリスタルバイオレットを用いてプレートに接着する細胞を染色するので、染料の量が細胞数に比例する、クリスタルバイオレットに基づく生存率アッセイを用いて、Ｍｕｔ−ｐ５３依存性死への様々な試験ペプチドの影響を求めた。クリスタルバイオレットアッセイは複雑でなく、迅速で、信頼でき、安価であり、試料の複雑な調製を必要としない。

細胞がコンフルエンスに達することなく４８時間増殖することを可能にする、較正された密度で細胞を９６ウェルプレートに播種した。ペプチドを６時間後に添加した。異なる濃度のエトポシド（細胞傷害性薬物）を、細胞死の陽性対照として、さらに被試験ペプチドの影響を評価するための基準曲線として使用した。処置の４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄して死細胞およびデブリを除外し、プレートに付着して残っていた細胞をクリスタルバイオレットで３０分間染色した。クリスタルバイオレットを除去し、細胞をＰＢＳで４回洗浄して、残りのクリスタルバイオレットを除去した。次に、染色した細胞を１０％酢酸に溶解し、プレートを５９５ｎＭ（クリスタルバイオレットに特異的）での光学濃度測定のために取り出した。

図１３Ａおよび１３Ｂは、１２８の合成ペプチドで実施したスクリーニングの代表的な実験を示す。この実験では、ＷＩ−３８線維芽細胞を使用した。これらの細胞は、内在性ＷＴｐ５３を発現し、さらに、非特異的対照としてマウスＮｏｘａｓｈＲＮＡか、または変異体ｐ５３の安定な過剰発現のためにＲ１７５Ｈｐ５３変異体のいずれかを発現しているウイルスに感染させた。これらの亜系統（ｍＮｏｘａまたはＲ１７５Ｈｐ５３）の両方を、ウェル当たり３０００細胞で播種し、上記のように処理した。光学濃度読取データ（５９５ｎｍ）は、処置後のプレート中の細胞の数を反映する、１００％生存可能とみなされる非処理試料に標準化される。分かるように、ＷＩ−３８細胞は死滅に対して比較的抵抗性であるが、漸増濃度のエトポシドは、細胞死および増殖停止の良い陽性対照として役立ち、最も高い濃度は４８時間後に細胞数を５０％減少させた。

被試験ペプチドのいくつかは、実際に細胞数のかなりの減少をもたらした；この減少は、ｍＮｏｘａ−ｉ対照細胞と比較してＲ１７５Ｈｐ５３発現細胞で非常に顕著であったので、変異型ｐ５３依存性であった。これらのペプチドには、例えば、ｐＣＡＰ−３６、ｐＣＡＰ−４６、ｐＣＡＰ−４７、ｐＣＡＰ−６０、ｐＣＡＰ−９７が含まれる。他方、一部のペプチドが両方の細胞亜系統に有毒作用を及ぼすことが見出された；１つの例はｐＣＡＰ−６８である。同様のアッセイをいくつかの異なるＭｕｔ−ｐ５３発現ヒト癌細胞株で実施し、異なるペプチドについての結果を表７に要約する。

既知のｐ５３結合タンパク質と配列とのリードペプチドの相同性
ファージディスプレイによって予測されたペプチドモチーフの機能的スクリーニングを行った後、２０のペプチドは、多様なアッセイおよび細胞株において変異型ｐ５３に機能的影響を及ぼすことが確認された。次に、これらのペプチドと、一般にヒトタンパク質の配列との、特にｐ５３と相互作用することが知られているタンパク質との類似性を調べた。これは、ｐ５３と相互作用するタンパク質との類似性が高いことは、特定のモチーフの生物学的意義の指標として用いることができ、人工インビトロ条件下で選択されたペプチドが実際にｐ５３と相互作用することができるという仮説の確認を得ることができるためである。さらに、タンパク質構造および周辺配列が、選択および合理的設計の両方に基づいている改良されたペプチドを設計する上で役に立つかもしれない。ペプチド配列と既知のヒトタンパク質との類似性を見つけるため、ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）アルゴリズムを使用した。ペプチドモチーフを、ヒトタンパク質配列を含有する配列データベースに対してクエリー配列として導入した。ＢＬＡＳＴは、クエリー内の部分配列と類似しているデータベース内の部分配列を見つける。ＢＬＡＳＴの主な考え方は、多くの場合、１つの統計学的に有意なアラインメントには複数の高スコアセグメント対（ＨＳＰ）が含まれるというものである。ＢＬＡＳＴは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに近似するヒューリスティックアプローチを用いてクエリー配列とデータベース内配列との間の高スコア配列アラインメントを検索する。ペプチドモチーフと既知のヒトタンパク質との類似性およびこれらのタンパク質の構造データに基づいて、新たなペプチド配列のリストを設計した（下の表８に示す）。それらの配列では、ペプチドモチーフに類似したアミノ酸には、そのモチーフに隣接するいずれか一方のタンパク質配列に由来するか、または三次元結晶学的データによる相同モチーフに物理的に近い構造エレメントに由来する、他のアミノ酸が隣接している。

選択されたペプチドモチーフに対する類似度が様々である、７０を超える異なるタンパク質を同定した。これらのタンパク質の多くは、ｐ５３と物理的に相互作用することが以前に示されており、一方、その他のものは、ｐ５３の上流または下流のいずれかで、ｐ５３シグナル伝達経路に関与することが報告された。いくつかのモチーフが、既知のｐ５３相互作用タンパク質との相同性の程度が非常に高いことが見出された；例えば、ｐＣＡＰ−９７（ＷＮＨＨＨＳＴＰＨＰＡＨ、配列番号１０）は、ｐ５３と相互作用し、活性化することが示されたＲＡＤ９Ａと１００％相同性を有する（ｐ値は１０^−８である）；ｐＣＡＰ−６０（ＳＦＩＬＦＩＲＲＧＲＬＧ、配列番号３０２）およびｐＣＡＰ−６３（ＨＮＨＨＨＳＱＨＴＰＱＨ、配列番号２２６）は、これらのモチーフが２つのアミノ酸によって分離されているＧＡＳ２タンパク質配列（ＫＩＬＦＩＲＬＭＨＮＫＨ、配列番号３６９）と９０％相同性を有する（ペプチドモチーフに類似しているアミノ酸を太字で強調）。

リードペプチド候補をＭｕｔ−ｐ５３への立体構造的および機能的影響についてスクリーニングするためのいくつかの交互の補完的な方法を用いた。ペプチドの細胞膜透過を増加させるために、各ペプチドは、３〜６個のアルギニン残基を、その配列の一部として、またはそのＮ末端またはそのＣ末端のいずれかに付加されたものとして含む。また、潜在的に細胞へのより良好な送達を導くことになる、細胞膜との融合を強化するために、４０のペプチドをミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｉｌ）脂肪酸（ｍｙｒ）とコンジュゲートさせた。評価のためのインビトロに基づくアッセイ、例えばｐ５３立体構造およびｐ５３の配列特異的ＤＮＡ結合の評価のためにＥＬＩＳＡなどを最初に実施した。続いて、ペプチドの活性を生細胞において生存率アッセイ、ルシフェラーゼレポーター遺伝子でのｐ５３転写活性、およびｐ５３標的遺伝子のインビボ試験により調べた。これらのアッセイ（全てを９６ウェルフォーマットで実施した）を組合せることにより、異なるｐ５３活性およびＭｕｔ−ｐ５３タンパク質にそのような能力を付与する能力に及ぼすペプチドの影響の同定および検証することができた。表８から分かるように、１２のペプチドは、総活性スコアが３０を上回ることが見出された；これらの１２のペプチドの全てが、ｐ５３立体構造および配列特異的ＤＮＡ結合、Ｍｕｔ−ｐ５３発現細胞の生存率低下ならびにｐ５３標的遺伝子の活性化を含む多様な異なるアッセイにおいて有効であることが示された。既知のタンパク質の付加配列（ｐＣＡＰ２０１〜３２６）とともにファージディスプレイ由来コアモチーフを有するこれらのリードペプチドのいくつかは、ファージディスプレイ由来ペプチド単独（ｐＣＡＰ１〜１８０）と比較して、大幅に増加した影響を示し、一方、その他のものは、ｐＣＡＰ１〜１８０と同等であった。

アッセイの組合せで最も顕著な影響を示したペプチド配列を精査した後、リードペプチドは、それらのコンセンサスモチーフに従っていくつかの主要なグループに分類され得ることが見出された。コンセンサスモチーフは、ｐ５３変異体の連続した結合部位または立体構造結合部位を仮想的に形成する少なくとも３つの連続するアミノ酸で構成されている。これらのコンセンサスモチーフは、ＨＳＴＰＨＰ、ＦＰＧＨＴＩＨ、ＩＲＧＲＩＩＲ、ＬＰＮＰＰＥＲ、ＳＦＩＬＦＩＲ、ＨＡＮＬＨＨＴ、ＹＰＴＱＧＨＬ、ＷＮＨＨＨＳＴＰＨＰ、ＴＬＹＬＰＨＷＨＲＨ、ＹＲＲＬＬＩＧＭＭＷ、ＩＲＩＬＭＦＬＩＧＣＧ、ＳＦＩＬＦＩＲＲＧＲＬＧ、ＬＲＣＬＬＬＬＩＧＲＶＧ、ＳＷＱＡＬＡＬＹＡＡＧＷ、ＩＲＩＬＭＦＬＩＧＣＧＲ、ｇｌｒｇｒｒｉｆｌｉｆｓ、ＨＳＳＨＨＨＰＶＨＳＷＮ、ＬＲＣＬＬＬＬＩＧＲＶＧＲＫＫＲＲＱ（それぞれ、配列番号３１４、２６８、２８２、３４０、３７６、２９８、３７７、３７８、２５３、２０、３７９、３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０および３８２）であることが見出された。

ｐ５３標的遺伝子への試験ペプチドの影響
ＷＴｐ５３タンパク質は主に転写因子として機能する。異なる形のストレスによって活性化されると、それは蓄積され、多くの標的遺伝子中のその応答配列と結合し、それらの転写をトランス活性化する。これらの標的遺伝子の産物であるタンパク質はその機能を実行する；例えば、ｐ２１のトランス活性化は、成長停止を導くが、ＰＵＭＡのトランス活性化はアポトーシスを導くことになる。そのため、ｐ５３の機能的活性化の最も重要な指標の１つは、その異なる標的遺伝子の誘導である。そのため、ｐ５３標的遺伝子への様々な試験ペプチドの影響をインビボで試験した。

インビボでの機能的スクリーニングのために、いくつかの実験系を使用した。１つの系はｐ５３ヌルであり、ｐ５３研究に広く使用されているＨ１２９９細胞に基づく。Ｍｕｔ−ｐ５３（ｔｓ）Ａ１３５Ｖで安定にトランスフェクトしたＨ１２９９細胞を使用した。この型のｐ５３は、温度感受性変異体であり、３７℃で変異体立体構造を有し、３２℃でＷＴ立体構造を有する。図１４は、代表的な実験を示す。要するに、細胞を１２ウェルディッシュに播種し、示したペプチドを５ｕｇ／ｍｌの濃度で培養液に直接に添加し、その後、細胞を３２℃にするかまたは３７℃に戻した。１８時間後、細胞を回収し、続いて、ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ分析を行った。３つの代表的なｐ５３標的遺伝子；ｐ２１、ＰＵＭＡおよびＭｄｍ２の発現レベルを調べた。３７℃のＨ１２９９−ｔｓでの遺伝子の発現をバックグラウンドレベルとみなし、全ての結果をそれに対して標準化し、また、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対しても正規化する。３２℃のＨ１２９９−ｔｓでの遺伝子の発現は、ＷＴｐ５３立体構造を表し、そのため、陽性対照としての役割を果たす。分かるように、３２℃への温度変化は３つの標的遺伝子全ての発現を大きく増加させた。

図１４に見られるように、陰性対照ペプチドｐＣＡＰ−７６はｐ５３標的の誘導を引き起こさなかった。いくつかの被試験ペプチドは実際にｐ２１、ＰＵＭＡおよびＭｄｍ２の発現の大幅な増加を引き起こした。これはｐＣＡＰ−１３０、ｐＣＡＰ−１３５、ｐＣＡＰ−１４２、ｐＣＡＰ−１４４およびｐＣＡＰ−１４８の場合であった。これらのペプチドは、陽性対照、オーセンティック野生型ｐ５３の９〜１１倍と比較して、標的遺伝子の転写を２〜４倍に誘導した。ペプチドによる処理は、対照Ｈ１２９９（ｐ５３−／−）細胞において３つの遺伝子全てを誘導したが、これらの遺伝子の発現への影響はなかったという事実は、この誘導がｐ５３依存的であることを意味する。

ペプチドの送達は治療薬としてのそれらの使用において大きな障害であるため、この障害を克服するために異なるアプローチを行った。第１に、被試験リード配列に基づいて、短いペプチド配列モチーフ（最大６アミノ酸）を解明し、合成した。これは、これらの小型ペプチドが拡散によって細胞膜を通過することができたためである。第２のアプローチは、ポリアルギニンＣ末端テールを有する被試験ペプチドを合成して、エンドサイトーシスに基づく機構によるそれらの能動的取り込みを容易にすることであった。

ポリアルギニンテールをペプチドに付加することは、疎水性アミノ酸の含有量が高いペプチドの溶解度を劇的に増加させる。一部の例では、それはまた、インビトロでもインビボでもペプチドの活性を大幅に増加させた；例えば、ｐＣＡＰ−２５は１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに不溶性であり、立体構造変化または生存率のいずれかについて試験した場合に、ｐ５３活性への影響を示さなかった。それに対して、同じアミノ酸配列に９Ｒテールを付加したｐＣＡＰ−６８は、ＰＡｂ１６２０へのＭｕｔ−ｐ５３立体構造の大幅なシフトだけでなく、大量の細胞死ももたらした。リードペプチドを、Ｍｕｔ−ｐ５３特異的な細胞生存率への影響の厳密な調査にさらに付した。

内因的に異なるｐ５３変異体アイソフォームを発現している異なる癌細胞株を用いて実験を行った。図１５Ａおよび１５Ｂは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）内でそれぞれ２８０位または１７５位に突然変異を有するＭｕｔ−ｐ５３を発現している、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１５Ａ）およびＳＫＢＲ３（図１５Ｂ）乳癌細胞で実施した２つの代表的な実験を示す。Ｍｕｔ−ｐ５３に対するペプチドの特異性を調べるために、使用した対照はＭｕｔ−ｐ５３のノックダウンを受けた上記細胞（ｓｈｐ５３）であった。図１５Ａおよび１５Ｂに見られるように、被試験ペプチドの多くはＭｕｔ−ｐ５３特異的に細胞生存率の低下を示し、非処理Ｍｕｔ−ｐ５３発現細胞によって表される１００％生存率に対して有意な読取値は３０％〜８０％であった。ｓｈｐ５３細胞で分かるように、一部のペプチドは、一般に細胞生存率に対してある程度の有毒作用を示す。例えば、ｐＣＡＰ−１５５は２つのｓｈｐ５３感染細胞亜系において生存率の３０％〜４０％低下を示した。さらに、一部のペプチドが、その他のペプチドの最小活性と比較して、細胞数、特に細胞種の特異的な減少を示すことも分かる。例えば、ｐＣＡＰ−１４６は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｓｈＣｏｎ細胞において大幅な減少をもたらしたが、ＳＫＢＲ３ｓｈＣｏｎ細胞への特異的な影響はほとんどもたらさなかった。

被試験ペプチドを、内在性Ｒ１７５Ｈｐ５３を発現しているＳＫＢＲ３細胞でのｐ５３標的遺伝子発現へのその影響についてさらに試験した。結果を図１６に示す。この図は、ｐ５３発現についてノックダウン処理したＳＫＢＲ３ＳｈＣｏｎ細胞およびＳＫＢＲ３Ｓｈｐ５３細胞で実施した代表的な実験の棒グラフを示す。要するに、これらの細胞を１２ウェルディッシュに播種し、示したペプチドを５ｕｇ／ｍｌの濃度で培養液に直接に添加した。１８時間後、細胞を回収し、続いて、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ｐ２１、ＰＵＭＡおよびＭｄｍ２の発現レベルを評価した。非処理細胞のそれらの遺伝子の発現をバックグラウンドとみなし、全ての結果をそれに対して標準化し、ＧＡＰＤＨに対しても標準化した。分かるように、一部のリードペプチドはｐ５３標的遺伝子の著しいトランス活性化を示した。この影響は、ＳＫＢＲ３ｓｈｐ５３細胞では観察されなかったため、Ｍｕｔ−ｐ５３を介してもたらされた。ｐＣＡＰ−１５５、ｐＣＡＰ−１４４およびｐＣＡＰ−１４８は最大のトランス活性化レベルの間で現れた。

アポトーシスに及ぼす試験ペプチドの影響およびｐ５３標的遺伝子の活性化との相関
図１７Ａおよび１７Ｂは、ＤＢＤ内の２４１位に突然変異をもつＭｕｔ−ｐ５３を発現しているＥＳ２卵巣癌細胞（図１７Ａ〜Ｄ）で実施した代表的な実験を示している。手短に言えば、細胞を６ｃｍディッシュに播種し、示したペプチドを示した時点で１２ｕｇ／ｍｌの濃度で培養液に直接に添加した。細胞を回収し、細胞の６０％をアネキシン−ＰＩアポトーシスアッセイのために採取し、４０％をＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ分析のために採取した。アポトーシスは、アネキシン−Ｖ染色キット（Ｒｏｃｈｅ、ＲＥＦ１１９８８５４９００１）を用いてアッセイした。非固定細胞を製造業者の使用説明書に従って、アポトーシス細胞を検出する抗アネキシンＦＩＴＣコンジュゲート抗体、およびその化合物に対して透過性の死細胞を染色するＰＩ（ヨウ化プロピジウム）の両方で染色した。次いで、染色した細胞をフローサイトメトリーにより分析した。各試料に対して合計１０，０００個の細胞を計数し、染色強度に応じて４つの亜集団に分割した：ＰＩおよびアネキシンの両方に陰性の細胞（−ＰＩ、−アネキシン）は生と名付けられ；ＰＩに陰性でアネキシンに陽性の細胞（−ＰＩ、＋アネキシン）はアポトーシスの初期段階を通過中であり；ＰＩおよびアネキシンに陽性の細胞（＋ＰＩ、＋アネキシン）はアポトーシスプロセスを経た死細胞であり；ＰＩに陽性でかつアネキシンに陰性の細胞（＋ＰＩ、−アネキシン）は壊死などの非アポトーシス死で死んだ死細胞であるとみなされる。図１７Ａ、１７Ｂで分かるように、非処理細胞（０時時点）は、大部分（９４％）がＰＩおよびアネキシンの両方に対して陰性であり、その細胞は生存能力があり健康であることを意味している。ｐＣＡＰ２４２および２５０での処理はアポトーシス細胞の急速な増加、続いて細胞死を引き起こし、処理の５時間後に細胞の１２％はアネキシン陽性であり、約７％は死滅している。ｐＣＡＰ２５０での処理の１６時間および２４時間後に、アポトーシス集団は約２７％まで増加し、死細胞は１６時間後に２９％、２４時間後に３６％まで蓄積する。この傾向はｐＣＡＰ２４２にも同様に当てはまるが、その影響は弱まり、より遅い。図１７Ｃおよび１７Ｄで分かるように、細胞生存率へのペプチドの影響はｐ５３標的遺伝子の著しいトランス活性化を伴い、４つの代表的な標的の発現を示す。分かるように、全ての遺伝子はペプチド処理後に活性化され、ｐ２１およびＰＵＭＡのｍＲＮＡ発現はｐＣＡＰ２５０およびｐＣＡＰ２４２での処理後に経時的にそれぞれ１０倍および６倍まで増加する。ＣＤ９５およびＢｔｇ−２の発現は、非処理細胞に対して６倍まで上昇する。

Ｍｕｔ−ｐ５３再活性化ペプチドのインビボ（前臨床）試験
インビボ（前臨床）実験を２種類のモデル：ヌードマウスおよびＭｕｔ−ｐ５３「ノックイン」マウスのヒト異種移植モデルで実施した。各モデルにおいて、被試験ペプチドの腫瘍内注射の腫瘍増殖および動物生存への影響を判定する。

異種移植前臨床モデルにおいて、腫瘍細胞にルシフェラーゼ発現ベクターをトランスフェクトし、ライブイメージングによる腫瘍モニタリングを可能にする。

Ｍｕｔ−ｐ５３「ノックイン」マウスモデルでは、肺特異的コンディショナルＭｕｔ−ｐ５３ノックインマウスを使用する（Ｋｉｍ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓｏｆｈｕｍａｎｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ：ｒａｉｓｉｎｇｔｈｅｂａｒ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，２００５．７０：ｐ．２４１−５０．Ｏｌｉｖｅ，Ｋ．Ｐ．，ｅｔａｌ，Ｍｕｔａｎｔｐ５３ｇａｉｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｗｏｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓｏｆＬｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｅｌｌ，２００４．１１９（６）：ｐ．８４７−６０）。このモデルは、３つのｐ５３対立遺伝子：Ｒ２７３Ｈ、Ｒ１７５Ｈ、またはｐ５３−ヌル対立遺伝子のうちの１つと組み合わせてＫ−ｒａｓの突然変異を有する複合コンディショナルノックインマウスを提供する。ＡｄｅｎｏＣｒｅの感染は、コンディショナル対立遺伝子の組換えを誘導し、早ければ腫瘍形成開始から６週間後にＫ−ｒａｓ誘発性肺腺癌を生じることが示された。このモデルは、進行性のヒト肺腺癌のいくつかの側面を厳密に再現し、正確な空間的および時間的プロフィールで、生理学的レベルで内在性ｐ５３プロモーターから２つの異なる変異体（１７５および２７３）を発現させる。このモデルは、インビボでの被試験再活性化ペプチドの特徴を、いくつかの重要事項に関して示すことが可能である；安全性−正常マウス組織または非感染マウスへの影響は軽微；有効性−対照と比較して処置マウスの腫瘍のサイズおよび数の減少；ならびに、ｐ５３ノックアウトマウスと比較してＭｕｔ−ｐ５３発現マウスでの腫瘍縮小の特異性。その上に、用量漸増実験を、陽性対照ペプチドを用いて実施して最小有効濃度および最大耐用量を評価する。

異種移植モデルにおける前臨床試験
ｐ５３Ｒ２８０Ｋを内因的に発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、ルシフェラーゼ発現ベクターと、ｐ５３ノックダウンについてのｓｈｐ５３か、または非特異的対照としてのマウスＮＯＸＡｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＮＯＸＡ）のいずれかを感染させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は高度腫瘍形成性であり、浸潤性の、急速に増殖する腫瘍を形成し、また、ヒトでは転移性である。全体で１０匹のマウスに注射した。各マウスに、ｓｈｐ５３を発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞２×１０^６個を右脇腹に、ｓｈｍＮＯＸＡを発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞２×１０^６個を左側に皮下注射した。腫瘍を、目に見える大きさに達するように１４日間増殖させた。ＩＶＩＳ２００システムを使用し、ライブイメージングにより増殖をモニターした。このシステムでは、ルシフェラーゼ生物発光は癌細胞数に比例する。結果は図１８Ａ〜１８Ｃおよび図１９Ａ〜１９Ｃに示す。細胞注射の１４日後、４匹のマウス（マウス７〜１０）を対照群に割り当て（図１８Ａ〜１８Ｃ）、６匹のマウス（マウス１〜６）を処置群に割り当てた（図１９Ａ〜１９Ｃ）。対照の処置は、インビトロでｐ５３に影響（表現型）を示さなかった３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２）の混合物で構成された。処置群マウスには、インビトロでｐ５３に最良の表現型作用を示した３つのペプチド（ｐＣＡＰ１７４、１５５および１５９）の混合物を注射した。ｐＣＡＰ−１５９（配列番号３１２）は、アルギニン残基が付加されたｐＣＡＰ−６０（配列番号３０２）と類似した配列を有する。そのペプチドは、Ｄ−アミノ酸で構成され、「レトロ−インベルソ」戦略により、ｐＣＡＰ−６０：ＳＦＩＬＦＩＲＲＧＲＬＧ、（配列番号３０２）とは逆の順序で合成されている（ｐＣＡＰ−１５９：ｒｒｒｒｒｒｒｒｇｌｒｇｒｒｉｆｌｉｆｓ（配列番号３１２））（小文字はＤ−アミノ酸を表す）。ペプチドを、週３回腫瘍あたり４０μｌの量および混合物中各ペプチドの濃度５μｇ／ｍｌで腫瘍内に直接注射した（腫瘍内注射）。従って、対照ペプチドかまたは処置用ペプチドのいずれかの混合物合計６μｇを各時点で各マウスに投与した。マウスは、ペプチド処置開始から合計５週間モニターした。生物発光は７日ごとに測定した。図１８Ａに示すように、内在性Ｍｕｔ−ｐ５３を発現しているｓｈｍＮＯＸＡ腫瘍は、対照ペプチド混合物で処置した場合に、実験の時間経過にわたってルシフェラーゼ強度の６〜１５倍（対数目盛）の増加を示した。マウス１０は、腫瘍が大きな限界サイズに達したために、処置の２８日後に屠殺しなければならなかった。図１９Ａは、３つのＭｕｔ−ｐ５３活性化ペプチドの混合物で並行して処置したマウスの分析を示す。図１９Ａで分かるように、３５日間の実験にわたって癌細胞数の著しい増加を示した腫瘍はなかった。腫瘍のうちの２つ（マウス−１およびマウス−４）は、それぞれ、生物発光の５０％〜６５％の減少として明白な、処置に対する部分寛解を示した。マウス２番および５番は完全寛解を示し、ルシフェラーゼ読取値は、処置の２１日後でさえＩＶＩＳシステムのバックグラウンド閾値検出レベル（５×１０^６光子）と同程度かまたはそれに近かった。ペプチドの投与は３５日後に中止し、マウス２番および５番は、さらなる処置を一切行わずに放置し、さらに２１日間モニターした。それらのマウスでは視覚的にもライブイメージングによっても腫瘍再出現は検出されなかった。

前臨床試験＃２
ｐ５３Ｒ２８０Ｋを内因的に発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ルシフェラーゼ発現ベクターに感染させ、１５匹のマウスに、両方の腰にＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞１×１０^６個を皮下注射した。腫瘍は、目に見える大きさに達するために１０日間増殖させ、その時点以降、腫瘍増殖をライブイメージングによってモニターした。結果を図２０Ａ〜２０Ｃに示す。細胞注射の１８日後、６匹のマウスを対照群に割り当て、９匹のマウスを処置群に割り当てた。前と同様に、対照の処置は、３つの対照ペプチド（ｐＣＡＰ７６、７７および１２）の混合物を含んだ。処置群マウスに３つのペプチド（ｐＣＡＰ１７４、１５５および１５９）の混合物を注射した。ペプチドは、週３回腫瘍あたり４０μｌの量および混合物中各ペプチドの濃度５μｇ／ｍｌで腫瘍内に直接注射した（腫瘍内注射）。図２０に示すように、対照群および処置群はいずれも処置前に類似した反応；ルシフェラーゼ強度の約２〜３倍（対数目盛）の増加（第１０日〜第１８日）を示した。図２０Ａは、３つの対照ペプチドの混合物で並行して処置したマウスの分析を示す：分かるように、対照の処置は、腫瘍増殖に対して非常に軽度の影響しかなく、処置前の期間と比較すると増殖速度を低下させている。しかし、図２０Ｂで分かるように、３つのｐ５３再活性化ｐＣＡＰの混合物での処置は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の発光の著しい減少を引き起こした。ｐＣＡＰ混合物の１回の注射後、平均発光は７０％減少し、１８の腫瘍のうち７は、ライブイメージング読取値がバックグラウンド検出閾値に近く、完全退縮を示した（データは示していない）。図２０Ｂに示すように、処置開始から１２日（４回注射）後、平均腫瘍発光は９３％減少し、１８の腫瘍のうち１１は完全寛解を示した。１８の腫瘍のうち１つだけが不変または弱い寛解を示した。この腫瘍は処置開始前に比較的大きかったため、顕著な応答を引き起こすにはｐＣＡＰの用量が不十分であった可能性である。

前臨床試験＃３−ＳＷ−４８０結腸癌細胞
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１実験で高度に有意な結果を観察した後、観察を拡張し、異なるｐ５３点突然変異を保有する異なる起源の細胞を調べるために、追加の研究を計画した。ＳＷ−４８０結腸癌細胞株は２つの内在性ｐ５３突然変異：Ｒ２７３ＨおよびＰ３０９Ｓを保有する。ＳＷ−４８０細胞をルシフェラーゼレポーター遺伝子に感染させ、細胞１０６個をヌードマウスに皮下注射した。実験には１５匹のマウスを含め、実験中それらをランダムに３群：これまでに影響のないことが判明している３つのｐＣＡＰのカクテルで処置される対照群、３つの有効なｐＣＡＰ（２５０、３０８、３２５）のカクテルで処置される群および最後に、単一のペプチド、ｐＣＡＰ−３２５で処置される群に分けた。ＳＷ−４８０実験の期間は、細胞移植時点から４２日であった。タイムラインは、０日目と表示した初日の処置を基準とする。図２１は、ＩＶＩＳでのライブイメージングによって測定した３群全ての経時的腫瘍増殖を示す。分かるように、経時的に対照腫瘍は腫瘍サイズの２．７５倍の平均増加を示す（図２１Ａに示される、０日目の９．２４から３５日目の９．６８への発光強度平均の対数変化から推測される通り）。混合物処置群の腫瘍は９６．７％の腫瘍サイズ減少に相当する縮小を示す（図２１Ｂに示される、０日目の９．１３から３５日目の７．６５への発光強度平均の対数変化から推測される通り）。同様に、ｐＣＡＰ３２５群の腫瘍は、９５．６％の腫瘍サイズ減少に相当する０．０４３の平均倍率変化を示した（図２１Ｃに示される、０日目の８．９７から３５日目の７．６１への発光強度平均の対数変化から推測される通り）。

前臨床実験の要約
ここまでに、ライブイメージングによる腫瘍モニタリングを可能にするルシフェラーゼ発現ベクターでトランスフェクトしたＭｕｔ−ｐ５３発現細胞の異種移植モデルを使用して、４つの前臨床実験を既に行ってきた。２つの実験は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌細胞（ｐ５３Ｒ２８０Ｋ）で実施し、１つの実験はＳＷ−４８０結腸癌細胞（ｐ５３Ｒ２７３Ｈ）を使用し、もう１つの実験はＳＫＢＲ３乳癌細胞（ｐ５３Ｒ１７５Ｈ）を使用した。各実験では、対応する細胞株由来の細胞を皮下注射し、肉眼でもライブイメージングでも観察できる十分に確立された腫瘍を形成させた（一般的には、２〜３週間）。その後、３日ごとに最大４２日間の有効なリードペプチドかまたは対照ペプチド（インビトロで活性を示さない）のいずれかの腫瘍内注射からなる処置計画を行った。

行った全ての前臨床実験では、リードペプチドで処置したマウスは、それらの腫瘍パラメーター；平均発光シグナル（ＩＶＩＳにより測定した場合、８１％〜９９％）、腫瘍重量および体積（腫瘍摘出後の測定では、７２％〜９３％）の全てにおいて非常に著しい減少を示した（パーセンテージは異なる実験間で変動する）。一方、対照ペプチドで処置したマウスの腫瘍は増殖し続けたが、処置前の増殖速度と比べて速度は低下していた。リードペプチドで処置した腫瘍のほとんど全ては処置に反応し、処置した腫瘍の３５％〜７０％は完全寛解を示し、腫瘍は閾値検出レベル未満に退縮していた。完全寛解を示したマウスのうち６匹は、実験完了後（処置を行わずに）２ヶ月間生かしたが、腫瘍の再発は検出されなかった。

ペプチドの毒性のインビボ試験
全体で、６匹のマウスを使用して、ペプチド混合物の毒性を試験した：各ペプチド濃度に対してマウス２匹。この実験に使用したペプチド混合物は上記のものと同じであった（図１９Ａ〜１９Ｃ）（ｐＣＡＰ１７４、１５５および１５９）。マウスに、１００ｕｇ／ｍｌの濃度で調製したペプチド混合物を週３回３週間腹腔内注射した。２匹のマウスには、前臨床試験でマウスが受けた総量に似た４０μｌの量を注射した。２匹のマウスには１２０μｌを注射し、残りの２匹のマウスには４００μｌを注射した。マウスの平均重量が２０ｇであることを考えると、これらの量はそれぞれ、０．６ｍｇ／Ｋｇ、１．８ｍｇ／Ｋｇおよび６ｍｇ／Ｋｇの濃度を表す。マウスは、注射後毎日検査した。いずれのマウスにおいても目に見える変化は検出されなかった。さらに、前臨床実験で使用したマウスの腫瘍の周囲組織（図１８Ａ〜１８Ｃおよび図１９Ａ〜１９Ｃ）を、マウスを屠殺した後に、壊死または炎症の徴候について調べた。しかし、腫瘍の周囲組織は全ての場合で正常に見え、ｐＣＡＰペプチドでの処置には大きな有毒作用がないことを示した。

表１０に本発明で試験したペプチドの活性を要約する。
表２．Ｒ１７５Ｈｐ５３の選択
表３．Ｍｕｔ−ｐ５３およびＷＴｐ５３の交互選択
＊ＡＳ−活性スコア
＊ＡＳ−活性スコア

特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的本質を完全に明らかにすることになるので、他者は、現在の知識を当てはめることによって、過度の実験を行うことなく、さらに上位概念から逸脱することなく、かかる特異的実施形態を様々な適用に容易に変更および／または適合させることができる、そのために、かかる適合および変更は、開示される実施形態の等価物の意味および範囲の中に包含されることが意図される。本明細書において用いられる語法または用語法は、説明を目的とするものであり、制限を目的とするものでないことは当然理解される。開示される様々な機能を実行するための手段、材料、および工程は、本発明から逸脱することなく、多様な代替形態をとってよい。

Claims

配列番号３１４、２６８、２８２、３４０、３７６、２９８、３７７、３７８、２５３、２０、３７９、３０２、２７５、３８０、２７３、３８１、２８０または３８２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む組換えもしくは合成ペプチドであって、
前記ペプチドが、Ｒ１７５Ｈｐ５３である変異型ｐ５３タンパク質を少なくとも部分的に再活性化させ；かつ
前記ペプチドが、６〜１５のアミノ酸の長さである、ペプチド。
配列番号３１４で示される前記アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
配列番号３２１、配列番号３１４、配列番号３１３、配列番号３１０または配列番号３０７で示される前記アミノ酸配列を含む、請求項２に記載のペプチド。
少なくとも１つの細胞浸透性部分とコンジュゲートした、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドが、
（ｉ）前記変異型ｐ５３タンパク質の立体構造を野生型（ＷＴ）ｐ５３タンパク質の立体構造に少なくとも部分的に変化させる、または
（ｉｉ）前記変異型ｐ５３タンパク質がＷＴｐ５３タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識されるように、前記変異型ｐ５３タンパク質の立体構造を少なくとも部分的に変化させる、または
（ｉｉｉ）前記変異型ｐ５３タンパク質が、ＷＴｐ５３タンパク質に対して作られたモノクローナル抗体に認識されない、
請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドが、前記変異型ｐ５３タンパク質の前記活性をＷＴｐ５３タンパク質の活性まで少なくとも部分的に回復させる、請求項１に記載のペプチド。
前記活性が、
前記変異型ｐ５３タンパク質を発現している細胞の生存率を低下させることである、または
前記変異型ｐ５３タンパク質を発現している細胞のアポトーシスを促進することである、または
前記変異型ｐ５３タンパク質を発現している細胞のｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合エレメントとの結合である、請求項６に記載のペプチド。
コンセンサスＤＮＡ結合エレメントが、配列番号３３９で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のペプチド。
結合の結果、内在性のｐ５３標的遺伝子の少なくとも部分的な活性化がもたらされる、請求項６に記載のペプチド。
配列番号２８６〜２８９および２９１〜３２１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む組換えもしくは合成ペプチドであって、前記ペプチドが、最大３０アミノ酸の長さを有し、前記ペプチドが、Ｒ１７５Ｈｐ５３を少なくとも部分的に再活性化させる、ペプチド。
配列番号３２１で示されるアミノ酸配列を含む組換えもしくは合成ペプチドであって、前記ペプチドが、Ｒ１７５Ｈｐ５３を少なくとも部分的に再活性化させる、ペプチド。
癌の治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチド。