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JP6560166B2 - 薬物徐放性担体及びその製造方法 - Google Patents
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Description

本発明は、新しいドラッグデリバリー技術を利用した新規薬物徐放性担体の開発に関する。
特定の塩溶液と水性高分子溶液の組み合わせ、あるいは異なる水性高分子溶液の組み合わせは、濃度や温度などの一定の条伴を満たす時、液一液相分離が見られる。分離した２つの液相系は水性二相系(Aqueous Two Phase System)と呼ばれる。この水性二相系にタンパク質などの基質を加えると、基質の拡散が二相で異なることにより不均等に分配される。これまでに水性二相系を構成する多くの水性高分子や塩の組み合わせが発見され、蛋白質医薬品の抽出技術に応用されている。
水性高分子溶液同士の水性二相系の物理化学的研究によると、高分子を構成するモノマー単位の反発が相分離の原因とされている。異種高分子が共存する環境は、モノマー単位が独立して存在する場合と比較すると、鎖状につながっているために混合エントロピーは非常に小さくなる。そのためモノマー単位間に働く斥力の効果により、相分離が生じると考えられている。水性二相系は、分離・精製の手段として広く使われている。
水性二相分配法の利点としては以下の４点が挙げられる。
(1)固相を用いないために生体物質の吸着とそれに伴う構造破壊・変性などが回避でき、かつ親水性高分子の共存により安定化され常温での操作が可能である。
(2)二相間の界面張力の差がわずかであるために、二相を混和すると比較的安定な徴細液滴の懸濁状態が得られ、分配平衡の達成が迅速かつ容易である。
(3)目的物質に親水基を導入すれば、分離の特異性が向上しうる。
(4)分配係数が系の全体積、二相の体積比、分離対象の濃度に鈍感なため、試験管規模の実験結果に基づきスケールアップを容易に行える。
一方、薬学や医学の分野において蛋白質医薬のみならず低分子薬物の徐放化は大きな課題であり、いまだ十分な解決策がないのが現状である。徐放化のための担体は、注射剤、内服剤、埋め込み製剤、マイクロニードル製剤、経皮吸収製剤、等の諸剤形においてきわめて要望が強くその実現が望まれている。
水性二相分配法を利用した徐放性ドラッグデリバリーシステム（以下「ＤＤＳ」と略記する）については、すでにいくつかの報告がある。たとえば、ポリエチレングリコール水溶液を連続相とし、架橋性デキストランポリマー水溶液を分散相とする蛋白質性医薬の徐放的投与（特許文献１）や、水溶性多糖類水溶液を連続相とし、ポリエチレングリコール ジアクリレート水溶液を分散相としてエマルジョンを形成させ、これを利用した蛋白質（サイトカイン）の徐放的投与（特許文献２）がすでに報告されている。なお、ポリエチレングリコールを以下PEGと略記する。
しかしながら、蛋白質性医薬などを体内に徐放的に投与するにあたり、ポリエチレングリコール水溶液と架橋性デキストランポリマー水溶液の相分離を利用しようとしても、分散相の大きさや２相への平衡分配比などを制御し難く、安定した薬物徐放は困難であった。
特表２００１−５０４８２８号公報 特表２００６−５１７５２３号公報
本発明は、水性二相系の原理に基づく新しいＤＤＳ用担体を提供することを目的とする。
蛋白質医薬品の徐放製剤への応用を目指した水性二相分配現象が現在研究されてはいるが、PEGをグラフトした高分子のＤＤＳ担体としての有用性はまだ明らかにはされていない。さらにその作製法は未確立でありまた、PEG相へ分配したタンパク質の分配条件制御、放出制御、などはいまだ検討されていない。本発明は、高分子にPEGの繰り返し単位構造を有する片末端アミノ化PEG(PEG-NH2)をグラフトさせた化合物の新しい製法を提供する。またその化合物を用いて蛋白質薬物の徐放のためのDDSへ応用することを目的とする。
上記課題を解決するためになされた本発明に係るＤＤＳ用担体はPEGカルボキシ基含有高分子グラフト、なかんずく、PEGカルボキシ基含有多糖類グラフトであることを特徴とする。
ここにPEGカルボキシ基含有高分子（多糖類）グラフトとは、カルボキシ基含有高分子（多糖類）を主鎖としてPEGがグラフト化したものをいう。好適には、PEGにアミノ基を導入し、高分子（多糖類）にカルボキシ基を導入する、あるいは、カルボキシ基含有高分子（多糖類）を用いて無水環境下において塩基あるいは酸触媒によるエステル化により、高分子（多糖類）のカルボキシ基とPEG末端水酸基とを縮合させてできる化合物をいう。PEGカルボキシ基含有高分子グラフトの構造は、１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルにより確認することができる。
PEGとカルボキシ基含有高分子とを水に溶解させると水性二相系が形成される。そこへ蛋白質性医薬を溶解させると、蛋白質性医薬はPEG相に極めて多く分配される。しかし、この水性二相系を利用して蛋白質性医薬をPEG相に濃縮して体内へ投与しようとしても、PEGが体液（血液、細胞間液）中に拡散し、蛋白質性医薬は直ちにすべて放出されるため徐放性製剤とすることは不可能であった。
そこでPEGをカルボキシ基含有高分子にグラフトさせて全体の分子量を著しく上げ、水中あるいは体液中で溶解物でなく膨潤体とすれば体液中での拡散を抑えることができる。この系を利用すれば、蛋白質性医薬の徐放が可能となる。すなわち本発明は、水相二相系では蛋白質性医薬がPEG相に濃縮される原理を利用し、それを実際のDDS製剤として使用可能とするため、PEGをカルボキシ基含有高分子にグラフトさせてPEGの体液中への拡散を防止したことに特徴がある。PEGカルボキシ基含有高分子グラフトにおける高分子は、水溶性のものが好ましい。水溶性高分子の中でも、ポリアクリル酸やその共重合体、あるいは多糖類を好適に用いることができる。カルボキシ基含有多糖類としては、分子内にカルボキシ基を有するキサンタンガム、ゲランガム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸等が好適に用いられる。
カルボキシ基含有水溶性高分子の分子量は、約5×10４〜5×10６ダルトンの範囲が好ましい。分子量がこの範囲内であれば、異なるカルボキシ基含有水溶性高分子を混合してもよく、また同一カルボキシ基含有水溶性高分子の分子量の異なるものを混合して用いてもよい。また、この範囲の分子量のものとこの範囲より分子量が小さいものを混合して用いることもできる。
カルボキシ基含有多糖類としてはヒアルロン酸（以下「HA」と略記する）を特に好適に用いることができる。この時ヒアルロン酸はナトリウム塩またはカリウム塩等の金属塩であってもよい。以下PEGカルボキシ基含有ヒアルロン酸グラフトを「PEG-graft-HA」と略記する。
カルボキシ基含有多糖類とPEGを縮合反応によって化学結合させる方法は数多く提案されている。それらの方法を用いてもよいが、本発明においてはアミノ化されたPEGを用いると、縮合反応を好適に進めることができることを見出した。PEGカルボキシ基含有ヒアルロン酸グラフトは、このPEGのアミノ基とヒアルロン酸のカルボキシ基とを、水を主とする溶媒中において縮合剤存在下で縮合反応させて合成する。一方、非水状態でヒアルロン酸をエステル化によりPEGをグラフトさせることも極めて有効なグラフト法であることを見出した。この場合は、酸共存下でPEGとカルボキシ基含有多糖類とを縮合反応することによって、PEGカルボキシ基含有多糖類グラフトを製造することができる。カルボキシ基含有多糖類（好適には、ヒアルロン酸）とPEGの結合はエステル結合となるのが特徴である。非水状態でヒアルロン酸をエステル化するに際しては、触媒として硫酸、過塩素酸等の酸存在下でエステル化することができる。非水溶媒としてはTHF、クロロホルム、DMA、等を用いうるが、全く溶媒を用いずPEG中で酸存在下、ヒアルロン酸を懸濁させてグラフト反応を行ってもよい。
縮合反応の縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）, エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（EDC）等を用いることもできるが、次の化学式（１）で表されるトリアジン系化合物がよく用いられる。ここにＲ１、Ｒ２は短鎖（炭素数１−６）アルキル基であり、Ｘはハロゲン原子である。Ｒ１、Ｒ２がメチル基であり、Ｘが塩素である場合は4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMTMM）であり、最もよく用いられる縮合剤である。
（化１）
ヒアルロン酸は、長鎖多糖類であるグリコサミノグリカンの一種である。グルクロン酸とアセチルグルコサミンがβ-1,4とβ-1,3のグリコシド結合により交互に結合している。ヒドロキシ基、カルボキシ基、隣接する糖と結合しているアノメリック炭素といった、かさ高い置換基がすべて立体的に有利なエクアトリアルになる一方で、全ての小さい水素原子が立体的により不利なアキシアルを占めた構造をしている。エクアトリアル位の置換基は極性の強い親水性の面を形成し、アキシアル位の水素原子は非極性であり、比較的疎水性の面を形成する。その結果、生理的溶液中のヒアルロン酸分子の骨格全体がリボン状とランダムコイル構造を形成し、非常に大きな容積をとる。
ヒアルロン酸水溶液は無色透明で粘度が高く、ゲル状である。人の身体の中では、関節液や関節軟骨に含まれ、骨と骨との間の動きを滑らかにする潤滑作用や、クッションの役割を果たす緩衝作用により、関節の働きを助ける働きをもつ。その他にも、眼球の硝子体の中に存在し形状を保つと共に、細菌の侵入を防ぐ働きもする。また、皮膚においては水分を保持しみずみずしい張りを保つ働きもしている。
PEGはエチレングリコールが重合した高分子化合物である。工業的にも古くから製造され、非イオン性界面活性剤、潤滑剤、ウレタン合成用中間体、接着剤や化粧品などの用途で広く利用されている。さらに人体に無毒であることから、"マクロゴール"といった名称で医薬品添加物として実用化されている。また、肝臓や脾臓を中心とする細胞内皮系組織の貪食細胞に捕捉されず、血中に長時間循環滞留する特性(ステルス性)が得られることから、タンパク質医薬品やリポソームにPEGを付加する、PEG化が行われている。PEGの分子量は本発明においては特に制約はないが、分子量1,000以上100万以下が望ましい。また、分子量がかかる範囲内であれば、PEGの構造は特に限定されるものではない。
本発明のPEGカルボキシ基含有多糖類グラフトはタンパク質性医薬や低分子薬物のＤＤＳ用担体として用いることができる。特に分子内に親水基と疎水基を共に有する化合物でありPEGとの親和性が高い化合物に対し好適に用いることができる。
PEGカルボキシ基含有多糖類グラフトにおけるPEGとカルボキシ基含有多糖類との重量比は特に制限はないが、PEG：カルボキシ基含有多糖類＝１：２０〜１：０．１（重量比）が望ましい。カルボキシ基含有多糖類にグラフトするPEGの量が少なすぎるとPEGのタンパク質性医薬や低分子薬物に対する親和性の効果を発現しにくい。またカルボキシ基含有多糖類にグラフトするPEGの量が多すぎるようなグラフト物は製造が困難である。
PEGカルボキシ基含有多糖類グラフトの分子量は、本発明においては特に制約はなく、目的に応じて適切な範囲のものを選択することができるが、医薬品のDDS用担体の場合、分子量２００以上２０，０００万以下が望ましく、かつ分子量の異なるPEGのブレンド物であってもよい。
本発明が適用できる薬物には以下に記載するようなものがある。
蛋白質性医薬としては、例えば、インスリン、エクセンジン−４、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ｈＰＴＨ（１→３４）、セクレチン、オキシトシン、アンギオテンシン、β−エンドルフィン、グルカゴン、バソプレッシン、ソマトスタチン、ガストリン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、エンケファリン、ニューロテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ブラジキニン、サブスタンスＰ、ダイノルフィン、甲状腺刺激ホルモン、プロラクチン、インターフェロン、インターロイキン、Ｇ−ＣＳＦ、グルタチオンパーオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、デスモプレシン、ソマトメジン、エンドセリン、及びこれらの塩等が挙げられる。抗原蛋白質ないしはウイルス断片としては、インフルエンザ抗原、破傷風抗原、ジフテリア抗原、ＨＢｓ表面抗原、ＨＢｅ抗原等が挙げられる
低分子薬物としては、従来から使用されている薬物及び化粧品の原料であれば特に限定されない。例えば、解熱鎮痛消炎剤、ステロイド系抗炎症剤、血管拡張剤、不整脈用剤、血圧降下剤、局所麻酔剤、ホルモン剤、抗ヒスタミン剤、全身麻酔剤、睡眠鎮痛剤、抗癲癇剤、精神神経用剤、骨格筋弛緩剤、自律神経用剤、抗パーキンソン剤、利尿剤、血管収縮剤、呼吸促進剤、麻薬等が挙げられる。
上記解熱鎮痛消炎剤としては、例えば、イブプロフェン、フルルピプロフェン、ケトプロフェン等が挙げられ、上記ステロイド系抗炎症剤としては、例えば、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、プレドニゾロン等が挙げられる。上記血管拡張剤としては、例えば、塩酸ジルチアゼム、硝酸イソソルビド等が挙げられる。上記不整脈用剤としては、例えば、塩酸プロカインアミド、塩酸メキシレチン等が挙げられる。
上記血圧降下剤としては、例えば、塩酸クロニジン、塩酸ブニトロロール、カプトプリル等が挙げられる。上記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸テトラカイン、塩酸プロピトカイン等が挙げられる。上記ホルモン剤としては、例えば、プロピルチオウラシル、エストラジオール、エストリオール、プロゲステロン等が挙げられる。上記抗ヒスタミン剤としては、例えば、塩酸ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン等が挙げられる。
上記全身麻酔剤としては、例えば、ペントバルビタールナトリウム等が挙げられる。上記睡眠鎮痛剤としては、例えば、アモバルビタール、フェノバルビタール等が挙げられる。上記抗癲癇剤としては、例えば、フェニトインナトリウム等が例示される。上記精神神経用剤としては、例えば、塩酸クロルプロマジン、塩酸イミプラミン、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム等が挙げられる。上記骨格筋弛緩剤としては、例えば、塩酸スキサメトニウム、塩酸エペリゾン等が挙げられる。
上記自律神経用剤としては、例えば、臭化ネオスチグミン、塩化ベタネコール等が挙げられる。上記抗パーキンソン剤としては、例えば、塩酸アマンタジン等が挙げられる。上記利尿剤としては、例えば、ヒドロフルメチアジド、イソソルビド、フロセミド等が挙げられる。上記血管収縮剤としては、例えば、塩酸フェニレフリン等が挙げられる。上記呼吸促進剤としては、例えば、塩酸ロベリン、ジモルホラミン、塩酸ナロキソン等が挙げられる。上記麻薬としては、例えば、塩酸モルヒネ、塩酸コカイン、塩酸ペチジン等が挙げられる。
上記化粧品の原料としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、コウジ酸、ルシノール、トラネキサム酸、油用性甘草エキス、ビタミンＡ誘導体等の美白成分；レチノール、レチノイン酸、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等の抗しわ成分；酢酸トコフェロール、カプサイン、ノリル酸バニリルアミド等の血行促進成分；ラズベリーケトン、月見草エキス、海草エキス等のダイエット成分；イソプロピルメチルフェノール、感光素、酸化亜鉛等の抗菌成分；ビタミンＤ2 、ビタミンＤ3 、ビタミンＫ等のビタミン類などが挙げられる。
PEG-graft-HAは薬物の徐放のための種々の剤形に応用できる。たとえば、注射剤、内服剤、埋め込み製剤、経皮吸収製剤、マイクロニードル製剤；化粧品ローション、化粧品乳液、化粧品クリーム等の化粧品においての用途が期待できる。
前記注射剤は、医薬品の溶液、懸濁液、乳濁液、又は用時に溶剤に溶解もしくは懸濁して用いる医薬品で、皮膚内又は皮膚もしくは粘膜を通して体内に直接適用する製剤である。注射剤の種類には、溶剤および医薬品そのものの物性により、水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、溶解又は懸濁して用いる固形注射剤が含まれる。
前記内服剤の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、散剤、（マイクロ）カプセル剤、チュアブル剤、シロップ、ジュース、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。
前記埋め込み製剤は、皮下に埋め込むことを目的とした固形製剤であり、前記固形注射剤、その他の固形製剤が含まれる。前記（マイクロ）カプセル剤又は後述するマイクロニードル製剤を埋め込み製剤として使用してもよい。
前記経皮吸収製剤は、局部に塗布又は貼付することにより、薬物を皮膚や粘膜を透過して投与する製剤であり、薬効成分を含む液状物質、軟膏剤、クリーム製剤、テープ製剤、パッチ製剤、パップ製剤等が含まれる。
前記マイクロニードル製剤は、１又は複数の微細な針状の製剤であり、複数のマイクロニードルが基板の表面に形成されたマイクロニードルアレイも含まれる。マイクロニードルの形状としては、水溶性又は水膨潤性樹脂により形成された錘状、錐台状又はコニーデ状が挙げられ、１本のマイクロニードルの大きさとしては、その根元の１辺又は直径は０．１５〜１．０ｍｍ、高さは０．１〜２．０ｍｍ程度が代表例として挙げられる。前記水溶性又は水膨潤性樹脂は、生体内で溶解又は膨潤しうる樹脂であればよく、例えば、グリコーゲン、デキストリン、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、キトサン、アルギン酸、アガロース、チキン、キトサン、プルラン、アミロペクチン、澱粉、ヒアルロン酸などの多糖類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどの蛋白質、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等の合成高分子が挙げられ、ヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールが好ましい。よって、PEG-graft-HAは、マイクロニードルを形成する樹脂として単独で使用することもできるし、前記水溶性又は水膨潤性樹脂から選ばれた高分子物質の１種以上と併用することもできる。
前記化粧品ローション、化粧品乳液又は化粧品クリームは、化粧品として使用することができる製品であり、医薬部外品又は薬用化粧品に分類される製品も含まれる。
注射剤、内服薬、埋め込み製剤、経皮吸収製剤、マイクロニードル製剤である医薬は、PEGカルボキシ基含有多糖類グラフトを担体として、有効成分とともに常法により製剤化することによって調製される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤型により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、溶剤、基剤、粘着剤等が挙げられる。
化粧品ローション、化粧品乳液又は化粧品クリームである化粧品は、PEGカルボキシ基含有多糖類グラフトを担体として、化粧品原料、任意に有価成分とともに常法により製剤化することによって調製される。PEGカルボキシ基含有多糖類グラフトの中でも、PEG-graft-HAは、ヒアルロン酸そのものが保湿効果および皮膚に対する抗しわ効果を有するので、徐放化により効果が持続することが期待できる。
PEGとカルボキシ基含有多糖類とを水に溶解させた水性二相系に蛋白質性医薬を溶解させると、蛋白質性医薬はPEG相に極めて多く分配される。しかしこのままではPEGが体液（血液、細胞間液）中に拡散するため、この水性二相系を徐放性製剤として利用することは困難であった。しかし、PEGをカルボキシ基含有多糖類にグラフトさせたPEGカルボキシ基含有多糖類グラフトを用いると、全体として分子量が大きくなり、体液中での拡散を抑えることができ、徐放性製剤として効果的に用いることができる。本効果はヒアルロン酸(HA)にPEGをグラフトさせたものに限定されず、カルボキシ基含有多糖類一般において発現する。以下においてはHAを代表例として説明する。
PEG-graft-HAは以下のようなすぐれた性質を有する。
１．蛋白質性医薬、低分子薬物に対しすぐれた保持性を有し、それゆえ薬物の徐放性担体として有効である。
２．PEGがグラフトすることによりHAの生体内分解性が抑制され担体としての作用を長期持続できる。
本発明のPEG-graft-HAの製造方法によれば、一般式（１）で表される化合物を縮合剤に用いて、水を主とする溶媒中で反応させることにより、迅速かつ高収率でPEG-graft-HAを得ることができる。
ヒアルロン酸修飾体（PEG-graft-HA-1）の１Ｈ-ＮＭＲチャート ヒアルロン酸修飾体（PEG-graft-HA-1）のゲル浸透クロマトグラム ヒアルロン酸修飾体（PEG-graft-HA-2）のマイクロニードルパッチの抗シワ効果 ヒアルロン酸修飾体各種の耐酵素性を示すグラフ。横軸は時間（hours）を表す。
本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
PEG-graft-HAの製造には、末端をアミノ化したPEGが必要である。実験室的に製造してもよいが末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールの市販品を好適に用いうる（日本油脂(株)SUNBRIGHT（MEPA−50H）分子量5000）。
PEG-graft-HAの製造には、HA水溶液に末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコール(MEPA−50H)を加えてよく攪拌して混合水溶液とする。そこへ適量のDMTMMを加えて数時間縮合反応を行う。反応後の低分子生成物は透析によって除くことができる。あるいは、反応系に過剰のアセトンを加えて反応生成物であるPEG-graft-HAを沈殿させ、上澄みを除いて精製してもよい。その後凍結乾燥、室温下乾燥により乾燥粉末とする。
（PEG-graft-HA-1の調製）
500mlフラスコに水100mlを入れ、ヒアルロン酸（FCH-SU, 分子量 ８〜11万,(株)キッコーマンバイオケミファ）0.1gを加えて室温で撹拌して溶解させた。末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコール(SUNBRIGHT（MEPA-50H）)0.1gを添加して攪拌し一様な溶液とした。さらに室温下でDMTMMを0.1g添加して縮合反応を開始し５時間反応させた。反応終了後、低分子生成物を24時間の透析により除き精製した。その後凍結乾燥してPEG-graft-HA-1の粉末を得た。
得られたPEG-graft-HA-1を0.01Mリン酸緩衝液（pH7.5：以下「PBS」という）に溶解して4WT％水溶液を調製した。その650nmにおける透過率は28％であった。原料のヒアルロン酸およびSUNBRIGHTの4WT％水溶液の透過率（650nm）は、それぞれ95, 100%であった。この差はヒアルロン酸にPEG鎖がグラフトされたことによるミクロ相分離構造に起因すると考えられ、これによりPEG-graft-HAであると確認した。なおWT％は重量％を意味し、以下同様である。
（ヒアルロン酸のグラフト反応後の生成物の特性化）
実施例１により作製し乾燥させたPEG-graft-HA-1を、重水を用いて1重量％になるよう溶解させて試験溶液とした。核磁気共鳴（NMR）装置はJEOL-LA300FTNMR SYSTEM（日本電子（株））を用いた。データ解析はJEOL NMR DataProcessing Software ALICE2を用いた。
得られたNMRチャートを図１に示す（1H-NMR(400 MHz, D2O)。図１において、: δ (ppm) = 1.97のピークはヒアルロン酸の NHCO-CH 3 におけるHAのメチル末端由来である。δ (ppm) =3.5-3.7のピークは -CH 2CH 2O- におけるメチレン基由来である。本NMRチャートからヒアルロン酸に PEGがグラフトされていることが分かる。両ピークの面積からのPEGのヒアルロン酸へのグラフト率（重量比換算のグラフト率）は４１％と算出された。
上記グラフト率は、HAのメチル基とPEGのエチレン基における水素原子との数の比をNMR測定結果から算出したものである。すなわち、グラフト率は、グラフト化されたPEGとHAとの重量比を百分率で示した値である。
1H-NMRのケミカルシフト（TMS基準）において、PEGのエチレン基のケミカルシフトはδ (ppm) =約3.5-3.7に位置する。カルボキシ基含有高分子（多糖類）に固有のケミカルシフトにおけるピーク面積と、PEGのエチレン基のケミカルシフトにおけるピーク面積とを算出し、その比率を計算することによって、カルボキシ基含有高分子（多糖類）へのPEGのグラフト率を求めることができる。
（PEG-graft-HA-1 のゲル浸透クロマトグラフィー（GPC））
多角光散乱検出器付きサイズ排除クロマトグラフ（SEC-MALS）によるグラフト反応物の単一性確認及び分子量測定を行った。実施例１により作製し乾燥させたPEG-graft-HAの0.1 WT％水溶液を試料とした。測定条件は以下のようであった。
カラム: Shodex PROTEIN GF-710HQ(7.6mmI.D. x 300mm)＋Shodex Asahipak GS-510 HQ (7.5mmI.D. x 300mm)
注入量：150μL
溶離液： 0.1M Phosphate buffer(pH7.0)
流量： 1.0mL/min
検出： MALS(Multi angle laser light scattering), 90度
カラム温度： 26℃
得られたクロマトグラムを図２に示す。ピークは単一ピークであり、PEG-graft-HAのみが検出されている。未反応のPEG及びヒアルロン酸は検出されなかった。分子量は44.3万と算定された。
（PEG-graft-HA-2を用いるインスリンの徐放性放出）
HAとしてFCH-SU の代わりにFCH-80LE（分子量 60〜100万、(株)キッコーマンバイオケミファ）を用いた以外は全て実施例１と同様にして合成されたPEG-graft-HA-2（49.7mg)とHA-80LE（28.9 mg）とをPBS 0.7 mlに溶解し、HA濃度4wt％の溶液を調製した。溶液は白濁していた。
FITC-Insulin(インスリンにFITCラベルして蛍光測定を容易化したもの、自家製) 0.87mgを上記溶液に溶解させ、黄芭透明の溶液を得た。 透析チューブ（分画分子量3,000の透析膜、スペクトラムラボ社製）に溶液をうつし、ビーカー(500 ml)に満たした試験液(500 ml )に浸し、透析チューブを動かないよう固定した。試験液にはPBSを用いた。 PBSはあらかじめ１日以上静置し室温とした。ビーカー内には攪拌子を入れマグネティックスターラーを用いて145 rpm で回転させた。実験系の上部はラップで覆い、試験液が蒸発し液量が変化しないようにした。10時間毎にビーカーの中心付近から試験液1 mLを素早く披き取った。抜き取り直後に1 mLのPBSを静かに加え、試験液の液量は常に一定に保った。採取した試験液は、励起波長495 nm、測定波長510〜600 nm、温度25 ℃で蛍光を測定した。 520 nmでの蛍光強度によりFITC-Insulinの量を求め放出率を算出した。結果を実施例２として表１に示す。
同様なFITC-Insulinの放出実験をPEG-graft-HA-2の代わりにHAを用いて行った。結果を比較例１として表１に示した。
（表１）
インスリンの放出率（％）
PEG-graft-HA-2に貯留されたインスリンは、ヒアルロン酸内部へ貯留されたインスリンに比べてその外部への放出が極めて遅い。従って、PEG-graft-HAはインスリンの徐放作用が強く、徐放性DDSに適した担体である。
（PEG-graft-HA-2を用いる酵素分解性抑制の確認）
実施例２で合成したPEG-graft-HA-2を2WT％になるよう0.15mole％PBSに溶解させた。HAも同様に2WT％になるよう0.15mole％PBSに溶解させた。ヒアルロニダーゼ（ヒアルロニダーゼ”アマノ“、和光純薬）をそれぞれの溶液中に30units/mgHA になるように添加し、ヒアルロン酸の分子量低下を測定することによりヒアルロン酸の分解を測定した。
ヒアルロニダーゼ添加後8時間の分子量低下率（8時間後の分子量/最初の分子量）は、PEG-graft-HA-2の場合70％であり、ヒアルロン酸の場合9％であった。ヒアルロン酸単独系では8時間後に分子量は1/10 以下に下がってしまったが、PEG-graft-HA-2での分子量低下率は70%であり、PEGをグラフトしたことによりヒアルロン酸の酵素分解は極めて抑制されることが判明した。
（マイクロニードルへの利用）
PEG-graft-HA-2を用いてマイクロニードルを作製し、社内ボランティアの額のしわ部に適用し、抗しわ効果の持続性を検証試験した。効果を肉眼で観察しやすいよう医療用マイクロニードル（針長さ800μm）を用いた。マイクロニードルの成型は鋳型法により行い、長径1.0cm、短径0.6cmの楕円形マイクロニードルパッチを作製し、額のしわ部位に貼付し経時変化を観察し、図３の結果を得た。
マイクロニードルを図３の破線で囲った深いしわに沿って適用し5時間後に剥離した。ここに、(a)が使用前の状態、(b)が３日後の状態、（c）が７日後の状態、(ｄ)が１２日後の状態を示している。
1日に1回を3日間継続して適用し、翌週再度1回適用し適用部のシワの経時変化を観察した。図３に示したように、3日連続適用によりシワ伸ばし効果が明瞭に見られた。またその効果は経時とともに若干低下しているが、2週間観察の間に使用前と比べて持続することが分かる。これまでの試験においては、通常のヒアルロン酸パッチであれば適用停止の7日後には少しずつシワが戻ることに対し、PEG-graft-HAは代謝が遅く持続的な抗シワ化粧品としての可能性を有することが明らかになった。
（エステル化によるヒアルロン酸−PEGグラフト物の製造）
試薬類はいずれも和光純薬（株）より購入、試薬特級を使用した。
THFの１００ｇ、PEG400の５０ｇ中にヒアルロン酸（FCH-SU, 分子量 ８〜11万,(株)キッコーマンバイオケミファ）の６．０ｇを懸濁させ、濃硫酸１ｍｌを加えて５０℃で攪拌しつつ１０時間反応させた。１０時間後に取り出し精製し乾燥した（PEG-HA−５という）。
（エステル化によるヒアルロン酸−PEGグラフト物の製造−２）
PEG400の７０ｇ中にヒアルロン酸（FCH-SU）の６．０ｇを懸濁させ、過塩素酸１ｍｌを加えて５０℃で攪拌しつつ１０時間反応させた。２０時間後に取り出し精製し乾燥した（PEG-HA−６という）。
（赤外スペクトルによるグラフト率の測定）
PEG-HA−５、PEG-HA−６のPEGグラフト率は赤外スペクトルにより定量した。PEGの２８７０ｃｍ−１ピークとヒアルロン酸の１０２５ｃｍ−１ピークに着目し、PEGとヒアルロン酸の種々のブレンド物の赤外スペクトルを測定し（２８７０ｃｍ−１の強度／１０２５ｃｍ−１ ）と両高分子の組成比からなる検量線を作成した。ついで、PEG-HA−５、PEG-HA−６の赤外スペクトルを測定し検量線からグラフト率を算出した。赤外分光計は、高速FT-IRイメージングシステム（型式：Spectrum100FT-IR/Spotlight400,(株)パーキンエルマージャパン製）を用いた。算出されたPEGグラフト率はPEG-HA−５においては ０．２７、PEG-HA−６においては ０．２９であった。
（PEG-graft-HAを用いる酵素分解性抑制の確認）
PEG-HA−５、PEG-HA−６、Q社製耐酵素性付与ヒアルロン酸、及び参照のためのHA(FCH-SU９)を用いて酵素分解抑制試験を行った。各試料を2WT％になるよう0.15mole％PBSに溶解させた。ヒアルロニダーゼ（ヒアルロニダーゼ”アマノ“、和光純薬）をそれぞれの溶液中に２units/mgHA になるように添加し、０、８、１６、２４、３２時間後の分子量低下から分解率を算出しプロットしたのが図４である。ヒアルロン酸の分子量低下を測定することによりヒアルロン酸の分解を測定した。
PEG-HA−５及びPEG-HA−６は、ヒアルロン酸はもとより、耐酵素性を謳って市場にある修飾ヒアルロン酸に比べて、はるかに耐酵素性が高かった。

Claims (14)

  1. 非水溶媒又は無溶媒下及び酸共存下でPEGとカルボキシ基含有多糖類とを縮合反応する工程を含む、PEGと多糖類のカルボキシ基とがエステル結合によりグラフトしているPEGカルボキシ基含有多糖類グラフトの製造方法。
  2. カルボキシ基含有多糖類がヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
  3. PEGカルボキシ基含有多糖類グラフトから構成されるDDS用担体であって、多糖類のカルボキシ基とPEGとがエステル結合によりグラフトしていることを特徴とするDDS用担体。
  4. カルボキシ基含有多糖類がヒアルロン酸であることを特徴とする請求項３に記載のDDS用担体。
  5. 請求項３又は４に記載のDDS用担体を含有する注射剤。
  6. 請求項３又は４に記載のDDS用担体を含有する内服剤。
  7. 請求項３又は４に記載のDDS用担体を含有する埋め込み製剤。
  8. 請求項３又は４に記載のDDS用担体を含有する経皮吸収製剤。
  9. 請求項３又は４に記載のDDS用担体を含有する化粧品。
  10. 請求項３又は４に記載のDDS用担体を含有するマイクロニードル製剤。
  11. インスリンと、PEGと多糖類のカルボキシ基とがエステル結合によりグラフトしているPEGカルボキシ基含有多糖類グラフトから構成される徐放性インスリン。
  12. カルボキシ基含有多糖類がヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１１に記載の徐放性インスリン。
  13. エクセンジン−４と、PEGと多糖類のカルボキシ基とがエステル結合によりグラフトしているPEGカルボキシ基含有多糖類グラフトから構成される徐放性エクセンジン−４。
  14. カルボキシ基含有多糖類がヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１３に記載の徐放性エクセンジン−４。
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