JP6566464B2 - 急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法、劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法およびｂ型劇症肝炎治療薬 - Google Patents

Description

本発明は、急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法、劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法およびＢ型劇症肝炎治療薬に関する。

急性肝炎の中でも特に重症の肝炎を劇症肝炎という。劇症肝炎は、高度の肝機能不全と意識障害（肝性脳症または昏睡）を特徴とする。劇症肝炎では、肝細胞が急激にかつ大量に破壊されることによって肝機能が低下し維持できなくなる。劇症肝炎の症状としては、黄疸、肝性脳症、腹水などが知られている。急性型の場合、最初の症状に気づいてから肝性脳症が現れるまでの期間が１０日以内と短く、劇症肝炎の救命率は約５０％と低い。劇症肝炎は、肝炎ウイルスの感染、薬物アレルギー、自己免疫性肝炎などが原因で起こる。特に、劇症肝炎は、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染によることが最も多く、全体の約４０％を占める。一方、劇症肝炎の約３０％については、原因が不明である。したがって、劇症肝炎の病態メカニズムの解明に寄与するモデル動物の確立と、有効な治療薬の創出とが求められている。

ＨＢＶの感染によるＢ型肝炎の動物モデルとして、非特許文献１には、ヒト肝細胞とヒト末梢血単核球とを移植したｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）−ＳＣＩＤマウスで確立した動物モデルが開示されている。

Okazaki A, Hiraga N, Imamura M, Hayes CN, Tsuge M, Takahashi S, Aikata H, Abe H, Miki D, Ochi H, Tateno C, Yoshizato K, Ohdan H, Chayama K., 「Severe necroinflammatory reaction caused by natural killer cell-mediated Fas/Fas ligand interaction and dendritic cells in human hepatocyte chimeric mouse.」, Hepatology. 2012 Aug;56(2):555-566. Ando K, Moriyama T, Guidotti LG, Wirth S, Schreiber RD, Schlicht HJ, Huang SN, Chisari FV., 「Mechanisms of class I restricted immunopathology. A transgenic mouse model of fulminant hepatitis.」, J Exp Med. 1993 Nov 1;178(5):1541-1554 Cote PJ, Toshkov I, Bellezza C, Ascenzi M, Roneker C, Ann Graham L, Baldwin BH, Gaye K, Nakamura I, Korba BE, Tennant BC, Gerin JL., 「Temporal pathogenesis of experimental neonatal woodchuck hepatitis virus infection: increased initial viral load and decreased severity of acute hepatitis during the development of chronic viral infection.」, Hepatology. 2000 Oct;32(4 Pt 1):807-817

Ｂ型劇症肝炎における肝細胞の急激な破壊は、ＨＢＶに感染した肝細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の活性化によるものと考えられている（非特許文献２および非特許文献３参照）。

一方、上記非特許文献１に記載されたＢ型肝炎の動物モデルでは、ヒト末梢血単核球がほとんど体内に維持されず、ＨＢＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が検出されなかった。このため、当該動物モデルは、ヒト肝細胞の急激な傷害が生じる動物モデルであるとは言い難い。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、ヒト肝細胞の急激な傷害を進行させることができる急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法、劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法およびＢ型劇症肝炎治療薬を提供することを目的とする。

本発明の第１の観点に係る急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法は、
ヒト肝細胞を肝臓に生着させた超免疫不全非ヒト動物に、ヒトＢ型肝炎ウイルスを投与する第１の投与工程と、
前記ヒトＢ型肝炎ウイルスを投与した前記超免疫不全非ヒト動物に、急性肝炎の治癒後患者から単離されたヒト末梢血単核球を投与する第２の投与工程と、
を含む。

また、前記急性肝炎は、
Ｂ型急性肝炎である、
こととしてもよい。

また、前記第２の投与工程では、
サイトカインをさらに投与する、
こととしてもよい。

また、前記第２の投与工程では、
１×１０^５個から１×１０^７個の前記ヒト末梢血単核球を投与する、
こととしてもよい。

また、前記超免疫不全非ヒト動物は、
超免疫不全マウスである、
こととしてもよい。

本発明の第２の観点に係る劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法は、
上記本発明の第１の観点に係る急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法で作製された急性重症肝炎モデル非ヒト動物に、被験物質を投与する工程と、
前記急性重症肝炎モデル非ヒト動物における肝炎関連マーカーを評価する工程と、
前記肝炎関連マーカーを評価した結果に基づいて、前記被験物質を劇症肝炎治療薬として選択する工程と、
を含む。

本発明の第３の観点に係るＢ型劇症肝炎治療薬は、
ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域との融合タンパク質を含む。

本発明によれば、ヒト肝細胞の急激な傷害を進行させることができる急性重症肝炎モデル非ヒト動物を提供できる。また、当該急性重症肝炎モデル非ヒト動物を用いて被験物質を劇症肝炎治療薬として選択することができるため、有効な劇症肝炎治療薬を提供できる。

マウスの血清中のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の濃度およびＨＢＶのＤＮＡのタイターの経時変化を示す図である。 マウスから採取した肝臓サンプルの組織学的検査の結果を示す図である。 マウスから単離した肝臓の単核球について、ヒトＣＤ４５およびマウスＣＤ４５に対する抗体を用いたフローサイトメトリー法で解析した結果を示す図である。 マウスの血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の濃度の経時変化を示す図である。 マウスの血清中のグランザイムＡの濃度およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γの濃度の経時変化を示す図である。 マウスから単離した肝臓の単核球について、各種ヒト細胞表面マーカーに対する抗体を用いたフローサイトメトリー法で解析した結果を示す図である。 マウスから単離した肝臓の単核球について、各種ヒト細胞表面マーカーを有する単核球の割合を示す図である（ｎ＝６）。 マウスの血清中のＢ型肝炎表面抗原およびＢ型肝炎表面抗体の濃度を示す図である。 ＣＴＬＡ４Ｉｇを投与したマウスの血清中のＨＳＡの濃度およびＨＢＶのＤＮＡのタイターの経時変化を示す図である。 ＣＴＬＡ４Ｉｇを投与したマウスから採取した肝臓サンプルの組織学的検査の結果を示す図である。 ＣＴＬＡ４Ｉｇを投与したマウスの血清中のＡＬＴの濃度、グランザイムＡの濃度およびＩＦＮ−γの濃度の経時変化を示す図である。 ＣＴＬＡ４Ｉｇを投与したマウスから単離した肝臓の単核球について、各種ヒト細胞表面マーカーに対する抗体を用いたフローサイトメトリー法で解析した結果を示す図である。 異なる用量でＣＴＬＡ４Ｉｇを投与したマウスの血清中のＨＳＡの濃度およびＨＢＶのＤＮＡのタイターの経時変化を示す図である。

本発明に係る実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
まず、実施の形態１について詳細に説明する。本実施の形態に係る急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法は、ヒト肝細胞を肝臓に生着させた超免疫不全非ヒト動物に、免疫刺激物質を投与する第１の投与工程と、免疫刺激物質を投与した超免疫不全非ヒト動物に、ヒト末梢血単核球を投与する第２の投与工程と、を含む。

第１の投与工程で用いる超免疫不全非ヒト動物は、例えば、超免疫不全マウスである。本実施の形態では、非ヒト動物の例示としてマウスを用いた場合について説明する。ここで、「超免疫不全」とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞／マクロファージを欠損していることをいう。つまり、超免疫不全マウスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞／マクロファージを欠損したマウスである。超免疫不全マウスの一例として、ＮＯＧマウスが挙げられる。ＮＯＧマウスは、ｓｃｉｄ遺伝子が導入された自己免疫型糖尿病を自然発症する痩せ型糖尿病ＮＯＤ（ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス）に、ＩＬ−２受容体γ鎖（ＩＬ−２Ｒγ）ノックアウトマウスの免疫不全形質が付加されたマウスである。ＮＯＧマウスは、Ｐｒｋｄｃ遺伝子変異（ｓｃｉｄ）によってＴ細胞およびＢ細胞が欠損し、ＩＬ−２Ｒγ遺伝子ノックアウトによってＮＫ細胞が欠損し、樹状細胞のＩＦＮ−γ産生障害を有している。

ヒト肝細胞は、公知の方法で超免疫不全マウスの肝臓に生着させることができる。超免疫不全マウスの肝臓にヒト肝細胞を生着させるために、肝傷害を発症する改良型の超免疫不全マウスを用いてもよい。改良型の超免疫不全マウスにヒト肝細胞を移植することで、ヒト肝細胞がマウスの肝臓に生着し、肝臓を再構築できる。改良型の超免疫不全マウスは、例えば、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ−ｔｋ）を発現させたＴＫ−ＮＯＧマウスである。ＴＫ−ＮＯＧマウスは、抗ウイルス薬であるガンシクロビル（ＧＣＶ）を投与することで肝傷害を誘導できる。この他、改良型の超免疫不全マウスとして、マウスｕＰＡを発現させた自然発症型の肝傷害ｕＰＡ−ＮＯＧマウスを用いてもよい。ＮＯＧマウスおよびＴＫ−ＮＯＧマウスは、例えば、公益財団法人実験動物中央研究所より入手できる。

ＴＫ−ＮＯＧマウスにヒト肝細胞を生着させる場合、１×１０^５〜１×１０^７個、好適には１×１０^６〜２×１０^６個のヒト肝細胞を脾臓に注射すればよい。ヒト肝細胞は、公知の方法で単離したヒト肝細胞であればよい。例えば、ヒト肝細胞が移植されたｕＰＡ−ＳＣＩＤキメラマウスからコラゲナーゼかん流法によって得たヒト肝細胞を用いるのが好ましい。

ヒト肝細胞の超免疫不全マウスの肝臓への生着は、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色およびＨＳＡ抗体ならびに抗サイトケラチン８／１８抗体などによる肝臓の免疫組織染色で確認できる。

第１の投与工程で超免疫不全マウスに投与する免疫刺激物質は、ヒトを含む哺乳動物に投与した場合に体内において何らかの免疫反応を惹起、誘導または増強する任意の物質である。免疫刺激物質は、例えば、ＨＢＶ、ヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトＣ型肝炎ウイルス、ヒトＤ型肝炎ウイルスおよびヒトＥ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス、ならびに抗生物質、解熱剤、鎮痛剤、中枢神経作用薬、抗がん剤、抗アレルギー薬および免疫抑制剤などの薬物である。好適には、免疫刺激物質は、ＨＢＶである。

第１の投与工程で超免疫不全マウスに投与する免疫刺激物質がＨＢＶである場合を例に、より詳細に説明する。ＨＢＶは、超免疫不全マウスに接種することで投与される。超免疫不全マウスに接種するＨＢＶは、例えば、肝炎患者から採取した血清中のＨＢＶである。特に血清がＨＢｅＡｇ陽性である慢性肝炎患者由来のＨＢＶが好ましい。ＨＢＶの遺伝子型は、特に限定されないが、例えばＣ型である。当該血清は、好ましくは、ＨＢＶのＤＮＡを１×１０^４〜１×１０^８コピー／ｍＬで含む。ＨＢＶは、肝炎患者から採取した血清から単離して、適切な溶媒に加えて使用してもよい。１匹あたり１×１０^４〜１×１０^７コピー、より好ましくは、１×１０^５〜１×１０^６コピーのＨＢＶが超免疫不全マウスに接種される。

ＨＢＶは、例えば、ＨＢＶを含むヒト血清を腹腔内に注射することで、超免疫不全マウスに接種することができる。ヒト肝細胞が生着してから所定期間経過後にＨＢＶを接種するのが好ましい。ＨＢＶは、例えば、肝細胞の移植から６〜１０週間経過後、好適には８週間経過後に接種される。

免疫刺激物質が上記薬物の場合の投与量は、免疫反応を惹起、誘導または増強するように適宜設定されるが、例えば、マウスの体重１ｇあたり、１μｇ〜１００ｍｇである。

次に第２の投与工程について説明する。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法を用いてヒトの血液から単離できる。好ましくは、ヒトＰＢＭＣは、急性肝炎の治癒後患者から単離される。この場合、第１の投与工程で超免疫不全マウスに投与された免疫刺激物質に起因する急性肝炎の治癒後患者から単離されたヒトＰＢＭＣが好適である。例えば、免疫刺激物質がヒトＢ型肝炎ウイルスの場合、ヒトＰＢＭＣは、Ｂ型急性肝炎の治癒後患者から単離されたものが好ましい。

ヒトＰＢＭＣの投与量は、マウス１匹あたり、例えば１×１０^５〜１×１０^７個である。好ましくは５×１０^５〜８×１０^６個、より好ましくは４×１０^６〜６×１０^６個のヒトＰＢＭＣを、マウスに投与してもよい。ヒトＰＢＭＣは、生理食塩水などの適切な溶媒とともにマウスの腹腔内に注射されることでマウスに投与されてもよい。

ヒトＰＢＭＣは、上記第１の投与工程における免疫刺激物質の投与から６〜１２週間経過後、好ましくは８、９または１０週間経過後にマウスに投与される。

マウスにおける免疫応答を効率よく誘導するため、マウスに生着させたヒト肝細胞のＨＬＡ型とヒトＰＢＭＣのＨＬＡ型とが同一であることが好ましい。例えば、マウスに生着させたヒト肝細胞のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ２４の場合、ＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ２４であるヒトＰＢＭＣを用いればよい。ＨＬＡ型は、公知のＤＮＡタイピング法で同定することができる。

第２の投与工程では、免疫応答を増強するために、サイトカインをさらに投与してもよい。サイトカインとして、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αなどから１種あるいは複数種を選択して投与すればよい。サイトカインの投与量は、例えば、マウスの体重１ｇあたり、１〜１００ｍｇまたは１〜１００μｇである。

免疫刺激物質としてＨＢＶを用いた本実施の形態に係る方法で作製された急性重症肝炎モデルマウスでは、血清中のＨＳＡの濃度およびＨＢＶのＤＮＡ濃度が、ヒトＰＢＭＣの投与後に減少する。これは、ＨＢＶ感染肝細胞の急激な傷害を示している。ＨＢＶ感染肝細胞の傷害は、ＨＥ染色および免疫組織化学染色でも確認できる。急性重症肝炎モデルマウスの肝臓では、広範囲にわたってヒト肝細胞が消失する。さらに、ヒト肝細胞の領域に多くの単核球の集簇が見られる。

急性重症肝炎モデルマウスは、ヒトＰＢＭＣの投与後に、血清中のＡＬＴの濃度が有意に増加した。ＡＬＴは主に肝細胞内に存在する酵素で、肝細胞が破壊されることによって血液中に放出される。このため、血清中のＡＬＴの濃度は、肝炎または肝傷害のマーカーである。よって、上記急性重症肝炎モデルマウスは、肝傷害を呈する。

免疫刺激物質としてＨＢＶを用いた場合、急性重症肝炎モデルマウスの血清中の免疫応答に関与するＢ型肝炎表面抗体（ＨＢｓＡｂ）ならびにＩＦＮ−γおよび細胞傷害性Ｔ細胞に主に含まれるヒトグランザイムＡの濃度が、ヒトＰＢＭＣの投与後に増加する。さらに当該急性重症肝炎モデルマウスの肝臓に浸潤した肝細胞のヒト細胞表面マーカーを、フローサイトメトリー法で解析すると、ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻細胞の割合が減少し、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋である制御性Ｔ細胞も減少する。一方、ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋細胞の割合が増加する。このため、当該急性重症肝炎モデルマウスでは、ヒトＰＢＭＣの投与によって、ＨＢＶに対する免疫応答が誘導され、ＨＢＶに感染した肝細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞が活性化することで、急性重症肝炎が引き起こされる。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る急性重症肝炎モデルマウスは、ヒトＰＢＭＣを投与することで、免疫刺激物質に対する免疫応答が誘導されるため、細胞傷害性Ｔ細胞によるヒト肝細胞の急激な傷害を進行させることができる。

なお、本実施の形態では、免疫刺激物質は、ＨＢＶであってもよいこととした。こうすることで、上記急性重症肝炎モデルマウスは、劇症肝炎の原因の約４０％を占めるＨＢＶ感染に起因する急激なヒト肝細胞の傷害をより忠実に再現することができる。

なお、本実施の形態では、急性肝炎の治癒後患者から単離されたヒトＰＢＭＣを用いてもよいこととした。当該ヒトＰＢＭＣには、急性肝炎に関与したＴ細胞およびメモリーＴ細胞などが含まれると考えられ、免疫刺激物質に対する細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答を、より確実に誘導することができる。特に、免疫刺激物質としてＨＢＶを使用した場合、Ｂ型急性肝炎の治癒後患者から単離されたヒトＰＢＭＣを用いることで、ＨＢＶ感染に対する細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答を、極めて確実に誘導することができる。

また、上記第２の投与工程では、サイトカインをさらに投与してもよいこととした。こうすることで、免疫刺激物質に対する免疫応答を増強することができるので、急性重症肝炎を効率よく発症させることができる。

なお、本実施の形態では、超免疫不全非ヒト動物として超免疫不全マウスを用いた。マウスは飼育が容易であるうえに、免疫機能を欠く各種マウスが開発されているため、超免疫不全のマウスが入手しやすい。このため、急性重症肝炎モデル非ヒト動物をより簡便に作製することができる。なお、非ヒト動物は、マウスに限らない。非ヒト動物は、ヒトを除く哺乳動物が好ましく、特にラット、イヌ、モルモットなどであってもよい。

なお、別の実施の形態では、急性重症肝炎モデル非ヒト動物が提供される。当該急性重症肝炎モデル非ヒト動物は、免疫刺激物質に対する細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答が誘導される。つまり、当該急性重症肝炎モデル非ヒト動物は、免疫刺激物質に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を有している。例えば、免疫刺激物質としてＨＢＶを使用した場合、当該急性重症肝炎モデル非ヒト動物は、ＨＢＶの感染に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を有しているため、ＨＢＶの感染に対する細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答が誘導される。当該急性重症肝炎モデル非ヒト動物は、例えば、上記記載の急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法で作製される。

（実施の形態２）
次に、実施の形態２について説明する。本実施の形態に係る劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法は、上記実施の形態１に記載の急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法で作製された急性重症肝炎モデル非ヒト動物を使用する。より詳細には、当該劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法は、上記急性重症肝炎モデル非ヒト動物に、被験物質を投与する工程と、当該急性重症肝炎モデル非ヒト動物における肝炎関連マーカーを評価する工程と、肝炎関連マーカーを評価した結果に基づいて、上記被験物質を劇症肝炎治療薬として選択する工程と、を含む。

被験物質は、化合物、抗体、融合タンパク質、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸などである。急性重症肝炎モデル非ヒト動物への投与の方法は、特に限定されないが、被験物質に適切な方法を選択すればよい。例えば、被験物質が化合物の場合には、経口投与であってもよいし、腹腔内投与または静脈内投与であってもよい。また、被験物質が抗体、ペプチド、融合タンパク質、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸等の場合は、静脈注射、皮下注射等であってもよい。被験物質の投与は、単回でもよいし、複数回であってもよい。被験物質の濃度は、被験物質の種類によって適宜決定すればよい。また、被験物質の濃度を段階希釈した複数の濃度の被験物質を投与してもよい。

肝炎関連マーカーは、例えば、急性重症肝炎モデル非ヒト動物の血清中のＨＳＡの濃度、ＡＬＴもしくはアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の濃度である。この他、肝炎関連マーカーとして、ＨＥ染色およびＨＳＡに対する抗体を用いた免疫組織化学染色などの結果を用いてもよい。特に、免疫刺激物質としてＨＢＶを使用した場合、肝炎関連マーカーは、上記の他、ＨＢＶのＤＮＡ濃度およびＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ−Ａｇ）に対する抗体を用いた免疫組織化学染色などの結果などである。

肝炎関連マーカーを評価するには、例えば、ＨＢＶ非感染の非ヒト動物を用いた予備実験の結果に基づいて、肝炎非発症時のＨＳＡの濃度の値を設定し、当該値と、被験物質を投与した急性重症肝炎モデル非ヒト動物の血清中のＨＳＡの濃度とを比較すればよい。肝炎非発症時の非ヒト動物および被験物質を投与した急性重症肝炎モデル非ヒト動物のＨＥ染色または上記免疫組織化学染色の結果を比較してもよい。また、被験物質を投与された上記急性重症肝炎モデル非ヒト動物と被験物質を投与されなかった上記急性重症肝炎モデル非ヒト動物との間で、肝炎関連マーカーを定性的に、または定量的に比較してもよい。

被験物質を劇症肝炎治療薬として選択する工程では、肝炎関連マーカーの評価した結果に基づいて、急性重症肝炎モデル非ヒト動物の病態の進行を抑制、遅延、停止、または病態を治療する被験物質が劇症肝炎治療薬として選択される。また、例えば、投与によって血清中のＨＳＡの濃度の低下を抑制する被験物質が劇症肝炎治療薬として選択される。好ましくはヒト肝細胞の傷害で低下したＨＳＡの濃度を回復させる被験物質が選択されてもよい。また、ヒト肝細胞の傷害で増加した血清中のＡＬＴまたはＡＳＴの濃度を抑制、低下あるいは回復させる被験物質が選択されてもよい。この他、ＨＥ染色および免疫組織化学染色によって、ヒト肝細胞の傷害とヒト肝組織への単核球の集簇とを抑制する被験物質が選択されてもよい。

上記実施の形態１に係る急性重症肝炎モデル非ヒト動物は、ヒト肝細胞の急激な傷害を進行させる。このため、上記選択された被験物質は、ヒト肝細胞の急激な傷害が進行し、脳症が出現する劇症肝炎治療薬として好適である。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法は、ＨＢＶなどの免疫誘導物質に対する細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答によってヒト肝細胞の急激な傷害を進行させることができる非ヒト動物を使用するため、劇症肝炎に対する被験物質の効果を評価することができる。

なお、別の実施の形態では、本実施の形態に係る劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法で選択された劇症肝炎治療薬が提供される。当該劇症肝炎治療薬は、劇症肝炎の主な原因である細胞傷害性Ｔ細胞によるヒト肝細胞の急激な傷害が進行する非ヒト動物を用いて選択されるため、劇症肝炎の治療に有効である。

（実施の形態３）
実施の形態３について説明する。本実施の形態に係る劇症肝炎治療薬は、Ｔ細胞選択的共刺激調節剤を含む。Ｔ細胞選択的共刺激調節剤は、抗原提示細胞上のＣＤ８０、ＣＤ８６からの共刺激シグナルを直接的または間接的に阻害する、Ｔ細胞活性化経路を標的とするものであれば任意である。例えば、Ｔ細胞選択的共刺激調節剤は、Ｔ細胞表面の分子であるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域との融合タンパク質（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ４ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ：以下、単に「ＣＴＬＡ４Ｉｇ」とする）である。なお、ＣＴＬＡ４Ｉｇは、アバタセプトとしても知られる。

本実施の形態に係る劇症肝炎治療薬の剤形は、限定されないが、注射剤が特に好ましい。当該劇症肝炎治療薬は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。また、当該劇症肝炎治療薬には、白糖、緩衝剤などの薬理的に許容される添加剤が含まれてもよい。必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。

上記劇症肝炎治療薬の投与方法は任意であるが、好ましくは皮下注射または静脈内注射である。劇症肝炎治療として、ＣＴＬＡ４Ｉｇを投与する場合、劇症肝炎治療薬の投与量は、患者の体重、病態など患者の状態に応じて適宜調整されるが、１回の投与量として、ひとりあたり、５００ｍｇ〜１ｇが好ましい。

ＣＴＬＡ４Ｉｇを含む劇症肝炎治療薬は、特に急激に肝傷害が進行している劇症肝炎の治療に好適である。この場合、当該劇症肝炎治療薬を、単回、あるいは１、２、３または４週間の比較的短期間において数回投与するのが好ましい。もちろん、投与回数、投与間隔などの投与方法は、患者の状態を見ながら、適宜調整することができる。

本実施の形態に係る劇症肝炎治療薬は、下記実施例２に示すように、例えば、ＨＢＶの感染に起因してヒト肝細胞の急激な傷害を抑制する。このため、当該肝炎治療薬は、Ｂ型劇症肝炎などの劇症肝炎の治療に使用されるのが好適である。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る劇症肝炎治療薬は、肝炎の重症化に重要な細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を抑制するため、劇症肝炎を治療することができる。

また、別の実施の形態は、上記Ｔ細胞選択的共刺激調節剤を患者に投与することにより劇症肝炎を治療する方法である。さらに別の実施の形態は、劇症肝炎の治療薬として使用するためのＴ細胞選択的共刺激調節剤である。また、他の実施の形態は、劇症肝炎を治療するための医薬の製造のためのＴ細胞選択的共刺激調節剤の使用である。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

（実施例１：Ｂ型急性重症肝炎モデルマウスの作製）
ヒト肝細胞キメラマウスを用いて、次のようにＢ型急性重症肝炎モデルマウスを作製した。まず、ＴＫ−ＮＯＧマウス（公益財団法人実験動物中央研究所より入手）に、ＨＬＡ−Ａ２４のヒト肝細胞を移植した。詳細には、８週齢のＴＫ−ＮＯＧマウス（以下、単に「マウス」ともいう）の腹腔内に、１日２回、６ｍｇ／ｋｇでＧＣＶを注射した。注射の２日後、同量のＧＣＶを再度、マウスに注射した。１回目のＧＣＶの注射から７日後、１×１０^６または２×１０^６個のヒト肝細胞を脾臓に注射することでマウスに移植した。移植されたヒト肝細胞は、ヒト肝細胞が移植されたｕＰＡ−ＳＣＩＤキメラマウスからコラゲナーゼかん流法によって得た。肝細胞の移植から８週間経過後、マウスの静脈内に５×１０^５コピーのＨＢＶ陽性のヒト血清を注射した。なお、マウスの感染、血清試料の採取および安楽死はエーテル麻酔下で行った。上記ヒト血清は、提供に同意した慢性肝炎患者から採取され、ＨＢｅＡｇ陽性で遺伝子型ＣのＨＢＶのＤＮＡ（１０．２×１０^６コピー／ｍＬ）の高いタイターを有する。ヒト血清は、使用するまで液体窒素内で保管した。

次に、ＨＢＶの接種から８〜１０週間経過後、５×１０^６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内に注射することでマウスに移植した。ヒトＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４を有する、Ｂ型急性重症肝炎が治癒した患者から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法を用いて単離した。なお、対照として、ＨＢＶを接種していないマウスにも同様にヒトＰＢＭＣを注射した。

ＨＳＡは移植されたヒト肝細胞で生成されるため、ＨＳＡの濃度は正常なヒト肝細胞のマーカーとなる。５μＬの血液試料を所定期間ごとに尾静脈から採取した。血液試料のＨＳＡの濃度を、Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．製）で決定した。

血清におけるＨＢＶのＤＮＡ濃度は、ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅ／ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＢＶ ＴＥＳＴ，ｖ２．０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）を用いて、製造者が提供するプロトコールに従って定量した。リアルタイムＰＣＲにおけるＨＢＶのＤＮＡの検出下限は、４．４ｌｏｇコピー／ｍＬであった。

組織学的検査のために、ヒトＰＢＭＣの注射から２週間後に採取したマウスの肝臓標本を、１０％の緩衝化パラホルムアルデヒドで固定化し、パラフィンブロックに組み込んだ。内在性ペルオキシダーゼの活性は、０．３％Ｈ_２Ｏ_２およびメタノールでブロックし、ＨＥ染色に加え、ＨＳＡに対する抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．製）およびＨＢｃ−Ａｇに対する抗体（ＤＡＫＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ社製）を用いた免疫組織化学染色を行った。免疫反応物質は、ストレプトアビジン−ビオチン染色キット（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ ＳＡＢＰＯキット、ニチレイ社製）およびジアミノベンジジンを用いて可視化した。

ヒトＰＢＭＣの注射から２週間後のマウスから単離したヒトＰＢＭＣをフローサイトメトリー法で解析した。使用した抗体は、ＡＰＣ−Ｈ７抗ヒトＣＤ３（クローンＳＫ７）、ＡＰＣコンジュゲーテッド抗ＣＤ４（クローンＳＫ）、ＢＤ Ｈｏｒｉｚａｏｎ（商標） Ｖ４５０ 抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８）、ＨＵ ＨＲＺＮ Ｖ５００ ＭＡＢコンジュゲーテッド抗ヒトＣＤ４５（クローンＨ１３０）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲーテッド抗ヒトＣＤ５６（クローンＢ１５９）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ヒトＦｏｘＰ３（クローン２３６ａ）、ＰＥコンジュゲーテッド抗ヒトＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１）およびＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲーテッド抗マウスＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１）である（すべてＢＤバイオサイエンス社製）。ＰＥコンジュゲーテッドＨＢＶ Ｃ１１７−１２６およびＰ７５６−７６３−誘導免疫優勢ＣＴＬエピトープは、医学生物学研究所から入手した。光散乱およびプロピジウムイオダイド染色で同定した死細胞は、解析から除外した。細胞内の染色では、細胞が透過処理され、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて表面染色後に固定された。フローサイトメトリー法は、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社製）で行い、結果はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で解析した。制御性Ｔ細胞およびヒトＢ細胞は、それぞれヒトＣＤ４５^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋の細胞およびＣＤ４５^＋ＣＤ３⁻ＣＤ１９^＋の細胞として定義した。

ヒトＰＢＭＣの注射前および注射２週間後のマウスの血清中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＨＢｓＡｂを、Ａｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ（Ａｂｏｔｔ社製）を用いて定量した。血清中のＡＬＴ濃度は、Ｆｕｊｉ ＤＲＩ−ＣＨＥＭ（富士フィルム社製）を用いて、製造者によって提供された説明書に従って測定した。また、血清中のヒトのＩＦＮ−γおよびグランザイムＡの濃度は、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、製造者によって提供された説明書に従って測定した。検出上限および検出下限は、それぞれ１０および２５００ｐｇ／ｍＬであった。

マウスの血清中のＨＳＡならびにＨＢＶのＤＮＡの濃度およびマウスの肝臓におけるヒトＰＢＭＣの割合は、マン−ホイットニーＵ検定および対応のないｔ検定で統計的に比較した。０．０５未満のｐ値を有意なものと見なした。

（結果）
図１は、マウスのＨＳＡの濃度およびＨＢＶのＤＮＡ濃度の経時変化を示す。ヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ感染マウスでは、ＨＳＡの濃度およびＨＢＶのＤＮＡ濃度の短時間かつ有意な減少が見られた。一方、ヒトＰＢＭＣを移植しなかったＨＢＶ感染マウスでは、ＨＳＡの濃度およびＨＢＶのＤＮＡ濃度の減少は見られなかった。よって、ヒトＰＢＭＣが、ＨＢＶ感染肝細胞を傷害することが示された。

図２は、ＨＥ染色および免疫組織化学染色で得られた画像を示す。「Ｈ」はヒト肝細胞を示し、「Ｍ」はマウス肝細胞を示す。ヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ感染マウスの肝臓では、広範囲にわたってヒト肝細胞が消失し、ヒト肝細胞の領域に多くの単核球の集簇が見られた。

図３は、フローサイトメトリー法の結果を示す。ヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ感染マウスでは、ヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ非感染マウスと比較して、ヒトＣＤ４５陽性の単核球の割合が有意に増加していた。よって、ヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ感染マウスでは、ヒトＰＢＭＣの生着率が上昇したことが示された。

図４に示すように、ヒトＰＢＭＣの注射２週間後において、ヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ感染マウスのみのＡＬＴの濃度が有意に増加した。このため、ヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ感染マウスは、肝炎を呈していることが示された。

また、図５に示すように、ＩＦＮ−γおよびヒトグランザイムＡの濃度は、ヒトＰＢＭＣの注射２週間後において、ヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ感染マウスのみで有意に増加した。図６および図７は、ヒトＰＢＭＣを注射したマウスにおける肝臓に浸潤した肝細胞のヒト細胞表面マーカーを解析したフローサイトメトリー法の結果を示す。ヒトＰＢＭＣの注射２週間後、ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻細胞の割合がＨＢＶ感染マウスで有意に減少した。ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻細胞において、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋である制御性Ｔ細胞がＨＢＶ感染マウスで有意に減少したことは、急性肝炎の発症と整合する。一方、ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋細胞の割合がＨＢＶ感染マウスで有意に増加した。ＣＤ８陽性かつテトラマー陽性であるＨＢＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞がヒトＰＢＭＣを注射したＨＢＶ感染マウスのみで検出された。

ヒトＰＢＭＣを注射したＨＢＶ感染マウスの血清中のＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｂの濃度を図８に示す。ヒトＰＢＭＣ注射前のＨＢｓＡｇの濃度は、ヒトＨＢＶ感染患者と同様に高かった。一方、ヒトＰＢＭＣ注射２週間後には、ＨＢｓＡｇの濃度は検出できないほどに減少した。ＨＢｓＡｂの濃度は、ヒトＰＢＭＣの注射２週間後に増加していた。

以上により、ヒト肝細胞を生着させたＴＫ−ＮＯＧマウスに、ＨＢＶを接種し、Ｂ型急性重症肝炎が治癒した患者由来のヒトＰＢＭＣを注射することで、肝傷害を起こすことができた。当該マウスでは、ＨＢＶ感染に対する細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答が誘導されることが確認された。このように、本実施例のヒトＰＢＭＣを移植したＨＢＶ感染マウスは、ＨＢＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による急激な肝傷害を示すため、Ｂ型急性重症肝炎を呈する。

（実施例２：Ｔ細胞選択的共刺激調節剤の投与）
本実施例では、上記実施例１で作製したＢ型急性重症肝炎モデルマウスにＴ細胞選択的共刺激調節剤であるＣＴＬＡ４Ｉｇを投与して、肝傷害への影響を調べた。なお、マウスのＨＳＡの濃度、ＨＢＶのＤＮＡ濃度、ならびにＡＬＴなどの濃度の測定方法、組織学的検査、およびフローサイトメトリー法の方法は、上記実施例１と同じである。

ヒトＰＢＭＣの注射１日前およびヒトＰＢＭＣの注射７日後に、マウスの腹腔内に１．５ｍｇ、１．２ｍｇまたは０．２ｍｇのＣＴＬＡ４Ｉｇ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社製）を注射した。ＣＴＬＡ４Ｉｇの溶媒として、生理食塩水を用いた。

（結果）
図９に示すように、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（１．５ｍｇを２回投与）は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ非投与のＨＢＶ感染マウス（コントロール）と比較して、ＨＳＡの濃度およびＨＢＶのＤＮＡ濃度の減少を著しく阻害した。ＨＥ染色および免疫組織化学染色においても、ＣＴＬＡ４Ｉｇを投与したＨＢＶ感染マウスの肝臓では、ＨＢＶ非感染マウスと同様に、ヒト肝細胞の傷害と、ヒト肝組織への単核球の集簇とが見られなかった（図１０）。すなわち、ＣＴＬＡ４Ｉｇの投与によって肝炎が抑制されたことが示された。

組織学的検査における肝炎が抑制されたとの結果は、図１１に示すように、血清中のＡＬＴ、ＩＦＮ−γおよびヒトグランザイムＡの各濃度にも反映されている。ＣＴＬＡ４Ｉｇを投与することで、ヒトＰＢＭＣの注射によるＡＬＴ、ＩＦＮ−γおよびヒトグランザイムＡの各濃度の増加は、ＨＢＶ非感染マウスと同程度に抑えられていた。また、図１２に示すように、ＨＢＶ感染マウスの肝臓におけるヒトＣＤ４５陽性の単核球、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性および制御性Ｔ細胞の割合は、ＣＴＬＡ４Ｉｇの投与によって非感染マウスと同程度になっていた。

異なる用量のＣＴＬＡ４Ｉｇを投与した結果を図１３に示す。なお、本実験では、ヒトＰＢＭＣの注射１４日後にもＣＴＬＡ４Ｉｇをさらに投与した。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、濃度依存的にヒトＰＢＭＣを注射したＨＢＶ感染マウスにおけるＨＳＡの濃度の減少を抑制した。また、ＣＴＬＡ４Ｉｇは、ＣＴＬＡ４Ｉｇの非投与群（０ｍｇ）と比べて、ＨＢＶのＤＮＡ濃度の減少を阻害した。

以上の結果より、ＣＴＬＡ４Ｉｇは、Ｂ型劇症肝炎の治療に有効であることが示された。

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、急性重症肝炎を発症する非ヒト動物の作製に好適である。本発明に係る急性重症モデル非ヒト動物は、劇症肝炎の治療薬のスクリーニングにも利用可能である。また、本発明に係る劇症肝炎治療薬は、劇症肝炎患者の治療ひいては生活の質の向上に寄与する。

Claims (7)

1. ヒト肝細胞を肝臓に生着させた超免疫不全非ヒト動物に、ヒトＢ型肝炎ウイルスを投与する第１の投与工程と、
   前記ヒトＢ型肝炎ウイルスを投与した前記超免疫不全非ヒト動物に、急性肝炎の治癒後患者から単離されたヒト末梢血単核球を投与する第２の投与工程と、
   を含む急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法。
2. 前記急性肝炎は、
   Ｂ型急性肝炎である、
   請求項１に記載の急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法。
3. 前記第２の投与工程では、
   サイトカインをさらに投与する、
   請求項１または２に記載の急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法。
4. 前記第２の投与工程では、
   １×１０^５個から１×１０^７個の前記ヒト末梢血単核球を投与する、
   請求項１から３のいずれか一項に記載の急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法。
5. 前記超免疫不全非ヒト動物は、
   超免疫不全マウスである、
   請求項１から４のいずれか一項に記載の急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法。
6. 請求項１から５のいずれか一項に記載の急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法で作製された急性重症肝炎モデル非ヒト動物に、被験物質を投与する工程と、
   前記急性重症肝炎モデル非ヒト動物における肝炎関連マーカーを評価する工程と、
   前記肝炎関連マーカーを評価した結果に基づいて、前記被験物質を劇症肝炎治療薬とし
   て選択する工程と、
   を含む劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法。
7. ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域との融合タンパク質を含む、
   Ｂ型劇症肝炎治療薬。