JP6579588B2 - 乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料及びその製造方法とバイオプロステーシス - Google Patents

Description

本発明は医学生物材料分野に属するものであり、具体的には乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料及びその製造方法とバイオプロステーシスに関わるものである。

現在、臨床で常用される生体弁及び経カテーテル大動脈弁、並びに生物学的パッチ（例えば、ウシの心膜、小腸粘膜下組織等）に使用される動物由来コラーゲン繊維組織材料は、通常、化学試薬（例えば、グルタルアルデヒド及び／又はホルムアルデヒド等）を使用して保存され、又は前記化学試薬を使用して架橋固定処理が行われる。組織は、通例、グルタルアルデヒド及び／又はホルムアルデヒドを含む希釈水溶液中で保存され、組織成分を無菌環境下に留め、その水和状態を維持する。しかしながら、多数の研究において弁膜組織が移植された後に残留したグルタルアルデヒドが弁膜の石灰化を促すことが証明されている。保存過程においてアルデヒド類試薬を除去できれば、弁膜組織の石灰化を有効に低減し得る。Ｍｉｒｚａｉｅらの研究において、人の血清を用いた保存溶液をグルタルアルデヒド溶液に代替してブタの大動脈弁を保存すると、弁膜中のカルシウム含量を５０％前後に減少し得ることが確認されている。また、グルタルアルデヒドは比較的高い毒性を有し、極めて低い残留量であっても、人体に毒性を生じ、内皮の形成に悪影響を及ぼす。具体的には、Ｍｉｒｚａｉｅ Ｍ，Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｅ，Ｍａｈｂｕｂ−ｕｌ Ｌａｔｉｆ ＡＨ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｗ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ａｏｒｔｉｃ ｖａｌｖｅｓ．Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ，２００７，１３：１０２‐１０９を参照されたい。以上より、グルタルアルデヒドによって処理及び保存された生物組織プロステーシスを移植する前には複数回にわたって大量の洗浄を行い、グルタルアルデヒドを除去する必要がある。同様に、生産労働者、医療従事者及び患者がアルデヒド類保存溶液を暴露すれば、その身体に顕著な危害が生じることから、追加的な防護措置を講じる必要が生じ、これにより費用の増加と不便が生じる。しかしながら、考慮すべきは、生物組織材料と生物組織材料によって構成されるプロステーシスを移植する時に、医療従事者が、術前の準備を最小限に留め、すぐに使用できる組織とプロステーシスを得ることができれば、コンタミネーションや誤差の確率を減少させ得るのみならず、移植時間をも短縮し得る点である。以上に鑑み、新たな生物組織の乾燥状態での保存方法の開発は、広範な発展の見通しと重要な利用価値を有する。

現在、よく見られる生物組織の保存方法は低温冷凍乾燥保存であって、その原理は、生物組織中の水分を−８０℃で氷結化させ、更に低圧下で冷凍乾燥（真空乾燥）して乾燥状態の組織を得る。しかしながら、この冷凍乾燥された生物組織は、水分や親水性の溶剤が失われ柔軟性が無く、断裂を防止できず、生産コストも割高である。また氷結晶の形成は組織の構造を破壊し、かつ該乾燥状態生物組織の再水和能力は弱く、通常、元の水和状態を回復するには数日を要する。

中国特許ＣＮ１３０６４４５Ａは、組織の溶液処理の方法について説明するものであり、まず生物組織を（濃度）勾配が増加する極性有機溶液（メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトンから選択する）に浸漬し、その後、グリセロール水溶液中、又は低分子量（＜１０００Ｄ）ポリエチレングリコール及び６０００〜１５０００Ｄのポリエチレングリコールとヘパリン溶液中に浸漬する。更に、生物組織をヘパリン水溶液中に短時間浸漬し凍結及び冷凍乾燥を行う。しかしながら、この脱水手順は、組織全体のサイズを顕著に減少させ、かつ使用する化学試薬（アセトニトリル、アセトン等）は一定の毒性を有することは元より、当該脱水手順を経た生物組織は、うまく再水和できず、元のサイズに回復し得ない。

Ｆｕｍｏｔｏらは、５７％グリセロール水溶液を用いて組織を処理し、相対湿度２８％未満の環境において６〜８時間乾燥させ、エチレンオキシド（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ，ＥＯ）で滅菌した後における組織のサイズ、形状及び弁膜の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での脈動流性能に顕著な変化が認められないことを報告している。具体的にはＦｕｍｏｔｏ Ｈ，Ｃｈｅｎ ＪＦ，Ｚｈｏｕ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｖａｌｖｅｓ ａｆｔｅｒ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ，ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（Ｐｈｉｌａ），２０１１，６（１）：３２−３６．を参照されたい。

中国特許ＣＮ１０１９６５２０５Ａは、７５％グリセロール／２５％エタノールで脱水乾燥する生物組織又はプロステーシスの（製造）方法について説明している。

中国特許ＣＮ１０３９３３６１２Ａは、外科的移植式の生物組織に関わるものであり、多価アルコール（以下の一種又は二種以上の組み合わせを選択する：グリセロール、プロピレングリコール、グリセロールの誘導体、プロピレングリコールの誘導体）とＣ１−Ｃ３アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ノルマルプロピルアルコールから選択する）を含む非水性処理溶液を前記生物組織に接触させ、溶液処理された生物組織から一部の処理溶液を除去する。この処理方法は組織の乾燥状態を基本的に維持し得る。しかしながら、この処理を経た後の組織は、一部の処理溶液を除去した後に屈曲が生じ易く、また残留した一部の処理試薬を除去することが困難であるため、滅菌効果に影響を及ぼす。更に単にアルコール類の脱水処理を用いるだけでは、「基本的に乾燥状態」にある組織中の残留含水量（含水量が３０％を上回ると、ＥＯ滅菌効果に影響を及ぼし、滅菌の不徹底を引き起こす）を効果的に制御できない。

総じて、既存類の生物組織保存方法（例えば、アルデヒド類の溶液を用いた保存や冷凍乾燥による保存等）には、残留試薬の毒性、組織の形態学的変化、高額な費用等の欠点があり、その使用においては改善と改良の余地がある。グリセロール類の組織乾燥脱水方法は一定の優位性を有するが、その生物組織の形態学的変化、残留試薬と組織含水量の変化等の面において更に改善を図る必要がある。

本発明が解決しようとする技術的課題は、製造する乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料が良好な柔軟性を有し、試薬の残留が無く、組織材料の含水量が１０％〜２５％の間に制御され、後続の滅菌に寄与する、乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料及びその製造方法とバイオプロステーシスを提供することである。

本発明が、上述の技術的課題を解決するために採用する技術的解決手段は、以下の手順を含む乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料の製造方法を提供することである。（１）架橋剤によって架橋処理した後の動物由来コラーゲン繊維組織材料の洗浄を行う。（２）洗浄後の前記組織材料を非水性アルコール溶液中に浸漬して脱水を行う。（３）非水性アルコール溶液によって脱水処理された前記組織材料を、順次、濃度の異なる勾配の糖溶液中に浸漬し勾配脱水を行う。（４）勾配脱水後の前記組織材料を取り出して乾燥を行う。（５）乾燥後の前記組織材料を密封包装した後、滅菌を行う。

更に、前記手順（１）の動物由来コラーゲン繊維組織材料が異種の動物又は同種の動物（由来）の生物組織材料である。

更に、前記生物組織材料が心膜、心臓弁膜、腹膜、胸膜、小腸粘膜下組織、硬膜、脊髄硬膜、靭帯又は皮膚である。

更に、前記手順（１）の架橋剤が、グルタルアルデヒド、ゲニピン、プロシアニジン、カルボジイミドの内の１種又は数種である。

更に、前記手順（１）の洗浄手順が以下の通りである。体積百分率５％〜３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール及び／又はエタノールの塩溶液を用いて４〜２５℃下で３〜６０分間、振とう洗浄し、振とう速度を５０〜１５０ｒｐｍとする。

更に、前記塩溶液が生理食塩水、ｐＨ６．８〜８．６のリン酸塩緩衝液又はｐＨ６．８〜８．６のＤ−Ｈａｎｋｓ溶液である。

更に、前記手順（２）の非水性アルコール溶液が分子量１０００Ｄ未満の脂肪族アルコール溶液である。

更に、前記非水性アルコール溶液がポリエーテルジオール及び／又はＣ２〜Ｃ６脂肪族アルコール溶液である。

更に、前記非水性アルコール溶液がポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２，６−ヘキサントリオール、１，２，４−ブタントリオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、グリセロール、イソプロパノールおよびエタノールの内の一種又は数種である。

更に、前記非水性アルコール溶液中の成分にポリエチレングリコール又はグリセロールが含まれ、かつ前記ポリエチレングリコール又はグリセロールの体積百分率が２０％〜９０％であるか、又は、前記非水性アルコール溶液中の成分にポリエチレングリコール及びグリセロールが含まれ、かつ前記ポリエチレングリコールとグリセロールの体積の和の百分率が２０％〜９０％である。

更に、前記ポリエチレングリコールの数平均分子量が２００〜１０００である。

更に、前記手順（２）の非水性アルコール溶液の温度が２０〜３７℃であって、前記組織材料の遮光条件下での浸漬時間が３０分間〜２４時間である。

更に、前記手順（３）の糖類が吸水性を有し、かつ保湿型の単糖類、二糖類、三糖類、多糖類又は糖アルコール類の糖水溶液である。

更に、前記糖類がフルクトース、サッカロース、トレハロース、非結晶性ラフィノース、キトサン及びキトサン改性的多糖、ソルビトール又はマンニトールである。

更に、前記手順（３）の勾配脱水の手順が以下の通りである。非水性アルコール溶液によって脱水処理された前記組織材料を、順次、異なる濃度勾配の糖溶液中に浸漬し、前記糖溶液の温度を４〜３７℃とし、遮光条件下における毎回の浸漬時間を５分間〜４８時間とする。

更に、前記手順（３）の異なる濃度勾配の糖溶液が、それぞれ濃度３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％（ｗ／ｖ）のサッカロース水溶液であるか、又はそれぞれ濃度５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％（ｗ／ｖ）のフルクトース、トレハロース、非結晶性ラフィノース、キトサン、キトサン修飾多糖類、ソルビトール又はマンニトールの水溶液である。

更に、前記手順（４）において、勾配脱水後の前記組織材料を取り出した後、繊維乾燥剤を投入して乾燥を行うか、又は遮光環境下で温度を２０℃〜３７℃に制御して、１０分間〜２４時間、乾燥させる。

更に、前記繊維乾燥剤が繊維乾燥剤の未加工シート、折り畳まれた繊維乾燥剤、袋状の繊維乾燥剤、柱状の繊維乾燥剤又はラミネートされた繊維乾燥剤である 。

更に、前記密封包装の手順が、相対湿度３０％未満の環境又は不活性ガス環境下において乾燥後の前記組織材料を包装容器に投入して密封包装を行う手順である。

更に、前記滅菌にＥＯ滅菌、電子ビーム照射滅菌又はガンマ線照射滅菌が採用される。

本発明が上述の技術的課題を解決するために採用する第二の技術的解決手段は、上述の製造方法によって製造された乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料を提供することである。

本発明が上述の技術的課題を解決するために採用する第三の技術的解決手段は、上述の乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料によって製造されたバイオプロステーシスを提供することである。

本発明は、既存技術に比べ、以下の有益な効果を有する。本発明が提供する乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料及びその製造方法とバイオプロステーシスは、既存技術と比べ、以下の効果を有する。
１）製造方法が簡便であり、原料の由来は広範かつ低廉であって、大規模生産によって医療コストを低減し得る。
２）イソプロパノール又はエタノールを用いた塩水洗浄固定後の生物組織では、組織中に遊離する架橋剤（例えばグルタルアルデヒドやホルムアルデヒド）溶液を予備的に除去することができ、アルデヒド類等の架橋剤の残留によって引き起こされる毒性を低減し得る。
３）非水性アルコール溶液による脱水、糖類による高浸透圧性吸水及び繊維乾燥剤による吸水といった化学及び物理的乾燥を併用する方法を用いて得られた生物組織材料は、良好な柔軟性を有し、屈曲し難く、組織含水量を有効に制御し得ると同時に、生物組織中に残留する多価アルコール化学試薬が除去され得ることから、組織の生体適合性をより良好なものとすることが可能である。
４）糖類（特にサッカロース）による高浸透圧性吸水を採用することで、生物組織中の水分を除去できるのみならず、更に生物組織中に残留する架橋剤（例えば、ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒド）をも除去することができ、生物組織の生体安全性を向上させ、組織石灰化の可能性を低減する。またこれら組織中に浸透できる低分子量の糖と勾配脱水方法を採用することで、水分の急速な損失によって形成される組織中の空洞や断裂を防止し、組織を構成する成分と構造を強力に保護する作用を有する。
５）乾燥処理手順において採用する遮光条件は、生物組織の元の構成成分と構造の維持に有用であって、乾燥組織の酸化や構造の破壊を防止する。
６）製造する生物組織材料及びそれによって構成されるプロステーシスは、生体適合性が良好である、材料が柔軟である、良好な力学的性能を有する、安全かつ信頼できる使用が可能である、臨床手術操作が容易である、生理食塩水中での再水和速度が迅速である（通常、５分前後で元の水和状態に回復する）等のメリットがある。

本発明の実施例における乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料の製造フローチャートである。 乾燥処理後のウシの心膜組織の電子顕微鏡画像（１２００ｘ）である。 本発明の実施例１において未乾燥処理対照ウシの心膜組織片をＷｉｓｔａｒラットの皮下に移植し４週間後に摘出した組織学的（ＨＥ）染色結果の画像である。 本発明の実施例１において製造した乾燥処理したウシの心膜組織片をＷｉｓｔａｒラットの皮下に移植し４週間後に摘出した組織学的（ＨＥ）染色結果の画像である。

以下、図面と実施例を組み合わせて、本発明について更に詳細に説明する。

図１を参照するに、本発明が提供する乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料の製造方法には、以下の手順が含まれる。

Ｓ１：架橋剤によって架橋処理した後の動物由来コラーゲン繊維組織材料の洗浄を行う。

本発明によれば、前記架橋剤によって架橋処理した後の動物由来コラーゲン繊維組織材料は、架橋剤によって架橋処理した後の異種又は同種の動物の生物組織材料であって、例えば心膜、心臓弁膜、腹膜、胸膜、小腸粘膜下組織、硬膜、脊髄硬膜、靭帯、皮膚である。

本発明において動物由来コラーゲン繊維組織材料の処理に使用される架橋剤は特に限定されるものではなく、例えば、常用されるグルタルアルデヒド、又は、例えば、ゲニピン（Ｇｅｎｉｐｉｎ）、プロシアニジン、カルボジイミド等の新型架橋剤、又は上記架橋剤を混合したものを採用する。

本発明において動物由来コラーゲン繊維組織材料を架橋剤によって架橋処理する方法は特に限定されるものではなく、例えば化学的浸漬法による処理、蒸気法による処理を採用する。

本発明において動物由来コラーゲン繊維組織材料を処理する場合の架橋剤の濃度は特に限定されるものではない。

前記洗浄とは、５％〜３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール及び／又はエタノールの塩溶液を用いて、４〜２５℃下で３〜６０分間、振とう洗浄し、振とう速度を５０〜１５０ｒｐｍとすることをいう。ここで言う前記５％〜３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール及び／又はエタノールの塩溶液とは、前記塩溶液が５％〜３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール塩溶液、又は５％〜３０％（ｖ／ｖ）のエタノール塩溶液、又は５％〜３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールとエタノールの塩溶液であって、かつイソプロパノールとエタノールの割合が任意である塩溶液のことを言う。

前記塩溶液は、生理食塩水、又はｐＨが６．８〜８．６のリン酸塩緩衝液、又はｐＨが６．８〜８．６のＤ−Ｈａｎｋｓ溶液（カルシウムイオンを含まないＨａｎｋｓ液、ＧＩＢＣＯ社）である。

Ｓ２：洗浄後の組織材料を非水性アルコール溶液（非含水）に浸漬して脱水を行う。

本発明によれば、前記非水性アルコール溶液は低分子量の脂肪族アルコール（＜１０００Ｄ）であって、好ましくはポリエーテルジオール（構造式はＯＨ−（Ｒ−Ｏ−）ｎ−Ｒ−ＯＨであり、Ｒはアルキレン基であって、好ましくはＣ２〜Ｃ６アルキレン基である）及び／又はＣ２〜Ｃ６脂肪族アルコール（例えば、Ｃ２〜Ｃ６一価アルコール、Ｃ２〜Ｃ６二価アルコール、Ｃ２〜Ｃ６三価アルコール、Ｃ２〜Ｃ６四価アルコール）であって、更に好ましくはポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２，６―ヘキサントリオール、１，２，４−ブタントリオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、グリセロール、イソプロパノール、エタノール等の内の一種又は数種である。

前記ポリエチレングリコールの数平均分子量が２００〜１０００である。例えば、前記ポリエチレングリコールがポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール８００、ポリエチレングリコール１０００内の一種又は数種である。

前記非水性アルコール溶液が混合液である場合、各成分の添加量は、特に限定されるものではない。好ましくは、混合液が二種の成分を有する場合、各成分の体積百分率が５〜９５％である。混合液が三種の成分を有する場合、各成分の体積百分率が５〜９０％である。混合液が四種の成分を有する場合、各成分の体積百分率が５〜８５％である。混合液が五種の成分を有する場合、各成分の体積百分率が５〜８０％である。好ましくは、混合液中の成分にポリエチレングリコール又はグリセロールが含まれ、かつ体積百分率が２０％〜９０％である。好ましくは、混合液中の成分にポリエチレングリコール及びグリセロールが含まれ、かつポリエチレングリコールとグリセロールの体積の和が混合液の体積百分率の２０％〜９０％を占め、ポリエチレングリコールとグリセロールの割合は任意である。

本発明によれば、前記組織材料を非水性アルコール溶液中に浸漬する浸漬条件は、浸漬温度を２０〜３７℃とし、遮光条件下での浸漬時間を３０分間〜２４時間とし、好ましくは１〜１２時間とする。

Ｓ３：手順Ｓ２で処理した組織材料を順次異なる濃度勾配の糖溶液中に浸漬する。

本発明によれば、前記糖類が、単糖、二糖、三糖、多糖及び糖アルコール類等の低分子量で吸水性を有する保湿型の糖であり、例えば、フルクトース、サッカロース、トレハロース、ラフィノース（非晶質）、キトサン、キトサン改性的多糖、ソルビトール又はマンニトールである。

本発明によれば、前記組織材料を順次異なる濃度勾配の糖溶液中に浸漬する、とは、組織材料を勾配脱水することであり、順次、組織材料を異なる濃度勾配の糖溶液中に浸漬し、浸漬温度を４〜３７℃とし、遮光条件下での毎回の浸漬時間を５分間〜４８時間とし、好ましくは３０分間〜２４時間とし、更に好ましくは１〜１２時間とする。一部の実施例において、前記異なる濃度勾配の糖溶液が、それぞれ濃度３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％（ｗ／ｖ）のサッカロース水溶液である。別の一部の実施例において、前記異なる濃度勾配の糖溶液が、それぞれ濃度５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％（ｗ／ｖ）のフルクトース、トレハロース、非結晶性ラフィノース、キトサン、キトサン修飾多糖類、ソルビトール又はマンニトールの水溶液である。

Ｓ４：組織材料を取り出し、繊維乾燥剤を含み、及び／又は乾燥した清潔な環境下で乾燥させる。

本発明によれば、前記繊維乾燥剤は、特に限定されるものではなく、繊維乾燥剤の未加工シート、折り畳まれた繊維乾燥剤、袋状の繊維乾燥剤、柱状の繊維乾燥剤又はラミネートされた繊維乾燥剤から選定でき、好ましくはラミネートされた繊維乾燥剤である。

本発明によれば、前記乾燥した清潔な環境とは、湿度が２０％未満のクラス１００００又はクラス１００００００のクリーンルーム環境のことを言う。前記清潔な環境下での乾燥条件は、遮光環境下での温度が２０℃〜３７℃であって、乾燥時間が１０分間〜２４時間であり、好ましくは１時間〜８時間である。本発明において清潔な環境を得る手段は、特に限定されるものではなく、乾燥剤を用いて空気中の含水量を減少させてもよいし、乾燥空気で換気を行ってもよい。

Ｓ５：密封包装後に滅菌を行う。

本発明によれば、前記密封包装とは、相対湿度が３０％未満の環境、又は、窒素ガス、アルゴンガス等の不活性ガス環境下において、上述の組織材料及び／又はそのバイオプロステーシスを液体の存在しない包装袋等の容器に包装し密封包装を行うことを言う。

本発明によれば、前記滅菌とは、ＥＯ滅菌（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｏｘｉｄｅ；エチレンオキシド）、電子ビーム照射滅菌又はガンマ線照射滅菌が採用される滅菌のことを言う。

試験方法
本発明の方法で製造された乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料の評価基準及びその方法。

１．ラットの皮下移植試験及び病理観察：
オスの若年Ｗｉｓｔａｒラットを選定し、麻酔した後、無菌条件下においてラットの背部を切開し、サイズ１５ｍｍ×１５ｍｍの組織片を移植した後、切開口を縫合し、２８日間にわたって飼育した。２８日後に、二酸化炭素ガスを用いてラットを安楽死させ、組織片を取り出し、１０％中性ホルマリンで固定を行い、パラフィンに包埋し、厚さ０．４マイクロメートルの薄片にスライスして、キシレンでの脱ロウ、一連のアルコールでの脱水、ヘマトキシリン―エオシン染色をそれぞれ行い、繊維と炎症の状況を観察した。

２．生物組織材料の含水量の測定：
湿潤状態の試料を二枚の乾燥ろ紙の間に挟み、５０ｇの物体でろ紙を３０ｓ押圧し、試料の湿潤重量を測定した。試料を２４ｈ真空冷凍乾燥し乾燥重量を測定した。含水量＝（湿潤重量−乾燥重量）／乾燥重量×１００％という公式に従い試料の含水量を計算した。

３．生物組織材料表面の形状：
組織材料を２．５％グルタルアルデヒド溶液で固定し、エタノールで段階的な脱水を行い、乾燥させ、金で真空コーティングを行い、走査型電子顕微鏡で組織表面の形状及び繊維の配列状況を観察した。

４．生物組織材料の引っ張り強度の測定：
組織材料を小片状に裁断し、ユニバーサル材料試験機で断裂するまで引っ張り、測定された最大張力を試料の断面積で除し、組織材料の引っ張り強度とし、材料の引っ張り強さを表示した。

５．生物組織材料の再水和時間：
処理後の１５ｍｍ×１５ｍｍの組織片を３７℃の生理食塩水に浸漬し、異なる時点において組織材料を取り出し、「２．生物組織材料の含水量の測定」に準じて含水量を計算し、組織の含水量が７０％以上に達した時に、対応する浸漬時間を記録した。

６．生物組織材料の熱収縮温度：
組織片から５０ｍｍ×３ｍｍの帯状試料６本を切り取り、蒸留水を媒体として、皮革収縮温度測定機で、その熱収縮温度を測定した。

７．生物組織材料の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞毒性試験：
ＧＢ１６８８６．５−２００３及びＧＢ／Ｔ １４２３３．２−２００５＿８の方法に従い、浸出液及びＭＴＴの分析法を用いて、材料の細胞毒性の測定を行った。

実施例１
当地の屠畜場においてウシの心膜組織を入手し、脂肪剥離、トリミング及び洗浄を行った後、０．６２５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．）溶液を用いて３日以上の固定を行い、グルタルアルデヒドによって架橋処理した後のウシの心膜を得た。処理後のウシの心膜を小片（１５ｍｍ×１５ｍｍ）に裁断し、１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（国薬集団化学試薬有限公司）の生理食塩水（山東康寧薬業有限公司、ロット番号：Ａ１４１００８０７）を用いて、２０℃下で、１００ｒｐｍにてウシの心膜組織小片を振とう洗浄し、３〜５回の洗浄を行い、毎回の洗浄を３〜５分間とする。その後、ウシの心膜を７０％（ｖ／ｖ）のポリエチレングリコール２００（上海晶純生化科技股フン有限公司）と３０％（ｖ／ｖ）１，３−ブタンジオール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．）の混合アルコール溶液の入った青色キャップの試薬瓶に浸漬し、スズホイルで完全に青色キャップの試薬瓶を覆い、２０℃下で４時間の浸漬を行った。その後、ウシの心膜を、２０℃下で順次、スズホイルで完全に覆われ、かつそれぞれ濃度３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％（ｗ／ｖ）のサッカロース（上海晶純生化科技股フン有限公司）水溶液の入った青色キャップの試薬瓶中に浸漬し、毎回の浸漬時間を３０分間とした。その後、乾燥した清潔な環境において、再度ウシの心膜を取り出し、ラミネートされた繊維乾燥剤（上海衡元高分子材料有限公司）上に置き、乾燥を行った。最後に、乾燥した清潔な環境において、乾燥状態のウシの心膜を透析袋（杜邦中国集団有限公司）に入れ、密封し、ＥＯ滅菌を行った。

図２は製造された乾燥処理後のウシの心膜組織の電子顕微鏡画像である。図２から分かるように、本発明における乾燥方法で処理した後のウシの心膜組織中のコラーゲン繊維の配列は整然としており、明らかな断裂は認められず、波状の配列を呈し、構造はコンパクトかつ連続的あった。製造された乾燥状態のウシの心膜組織の含水量は１７．３±１．８％、再水和時間は５．３７±０．４２分間、熱収縮温度は８６．６７±１．３５ ℃、細胞毒性はクラス１、最大引っ張り強度は１２．５±６．６Ｎであった。未処理のウシの心膜と乾燥処理後に滅菌したウシの心膜を、Ｗｉｓｔａｒラットの皮下に移植し、４週間後に摘出した結果はそれぞれ以下の通りであった。対照ウシの心膜組織片をＷｉｓｔａｒラットの皮下に移植し４週間後に摘出した組織学的（ＨＥ）染色結果画像では、繊維の方向が概ね一致しており、連続性は良好であって、波状を呈したが、心膜組織中に炎症細胞の散在が認められ、片側疎性結合組織中に新生毛細血管と大量の炎症細胞の浸潤が認められた（図３を参照されたい）。一方、乾燥処理したウシの心膜組織片をＷｉｓｔａｒラットの皮下に移植し４週間後に摘出した組織学的（ＨＥ）染色結果においては、ウシの心膜組織中の繊維の方向が概ね一致しており、連続性は良好であって、波状を呈し、心膜組織中に目視可能な炎症細胞及び炎症細胞の浸潤は認められず、かつ心膜組織中に石灰化部位は認められなかった（図４を参照されたい）。以上より、本発明によって製造されたウシの心膜組織は、良好な生体適合性を有し、組織の従来の構造と状態を維持し得るものである。

実施例２
当地の屠畜場でブタの大動脈弁を入手した。洗浄後、０．６２５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液を用いて３日以上の固定を行い、グルタルアルデヒドによって架橋処理した後のブタの大動脈弁を得た。処理後のブタの大動脈弁を２０％（ｖ／ｖ）エタノール（国薬集団化学試薬有限公司）の生理食塩水を用いて、２０℃下で、１００ｒｐｍにて振とう洗浄し、３〜５回の洗浄を行い、毎回の洗浄を３〜５分間とした。その後、ブタの大動脈弁を１００％グリセロール（国薬集団化学試薬有限公司）溶液の入った青色キャップの試薬瓶中に浸漬し、スズホイルで完全に青色キャップの試薬瓶を覆い、２０℃下で３時間の浸漬を行った。その後、ブタの大動脈弁を、４℃下で順次、スズホイルで完全に覆われ、それぞれ濃度５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％（ｗ／ｖ）のフルクトース水溶液の入った青色キャップの試薬瓶中に浸漬し、毎回の浸漬時間を３０分間とした。その後、乾燥した清潔な環境において、再度、ブタの大動脈弁を取り出し、ラミネートされた繊維乾燥剤上に置き、乾燥を行った。最後に、乾燥した窒素ガスを含む環境において、乾燥状態のブタの大動脈弁を透析袋に入れ、密封し、ＥＯ滅菌を行った。製造された乾燥状態のブタの大動脈弁組織の含水量は１５．７±２．１％、再水和時間は４．８５±０．７８分間、熱収縮温度は８５．５９±２．４６℃、細胞毒性はクラス１、最大引っ張り強度は１１．９±４．３Ｎであった。

実施例３
当地の屠畜場でブタの小腸粘膜下組織を入手し、剥離、トリミング及び洗浄を行った後、０．６２５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液を用いて３日以上の固定を行い、グルタルアルデヒドによって架橋処理したブタの小腸粘膜下組織を得た。処理後のブタの小腸粘膜下組織裁を小片（３０ｍｍ×５０ｍｍ）に裁断し、１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールの生理食塩水を用いて、２５℃下で、１００ｒｐｍにて、ブタの小腸粘膜下組織小片を振とう洗浄し、３〜５回の洗浄を行い、毎回の洗浄を３〜５分間とした。その後、ブタの小腸粘膜下組織を５０％（ｖ／ｖ）の１，２，６―ヘキサントリオール（上海晶純生化科技股フン有限公司）、３０％（ｖ／ｖ）エタノールと２０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール４００（上海晶純生化科技股フン有限公司）の混合アルコール溶液の入った青色キャップの試薬瓶中に浸漬し、スズホイルで完全に青色キャップの試薬瓶を覆い、２０℃下で２時間の浸漬を行った。その後、ブタの小腸粘膜下組織を、２０℃下で順次、スズホイルで完全に覆われ、それぞれ濃度３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％（ｗ／ｖ）のサッカロース水溶液の入った青色キャップの試薬瓶中に浸漬し、毎回の浸漬時間を２０分間とした。その後、乾燥した清潔な環境において、再度、ブタの小腸粘膜下組織を取り出し、ラミネートされた繊維乾燥剤上に置き、乾燥を行った。最後に、乾燥した清潔な環境において、乾燥状態のブタの小腸粘膜下組織を透析袋に入れ、密封し、ＥＯ滅菌を行った。製造された乾燥状態ブタの小腸粘膜下組織の含水量は１６．５±１．６％、再水和時間は４．７３±０．９１分間、熱収縮温度は８７．３４±１．１５℃、細胞毒性はクラス１、最大引っ張り強度は１２．７±５．２Ｎであった。

実施例４
当地の屠畜場でブタの心膜組織を入手し、脂肪剥離、トリミング及び洗浄を行った後、０．６２５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液を用いて３日以上の固定を行った。固定後のブタの心膜を小片（３０ｍｍ×５０ｍｍ）に裁断し、１５％（ｖ／ｖ）イソプロパノールの生理食塩水を用いて、２０℃下で、１００ｒｐｍにてブタの心膜を振とう洗浄し、３〜５回の洗浄を行い、毎回の洗浄を３〜５分間とした。その後、ブタの心膜を７５％のグリセロールと２５％イソプロパノールの混合アルコール溶液の入った青色キャップの試薬瓶中に浸漬し、スズホイルを用いて完全に青色キャップの試薬瓶を覆い、２０℃下で３時間の浸漬を行った。その後、ブタの心膜を、２０℃下で順次、スズホイルで完全に覆われ、それぞれ濃度３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％（ｗ／ｖ）のサッカロース水溶液の入った青色キャップの試薬瓶中に浸漬し、毎回の浸漬時間を１０分間とした。その後、乾燥した清潔な環境において、再度、ブタの心膜を取り出し、ラミネートされた繊維乾燥剤上に置き、乾燥を行った。最後に、乾燥した清潔な環境において、乾燥状態のブタの心膜を包装瓶に入れ、密封し、電子ビーム照射滅菌を行った。製造された乾燥状態ブタの心膜組織の含水量は１８．０±１．２％、再水和時間は５．１５±０．３６分間、熱収縮温度は８７．８４±１．６６℃、細胞毒性はクラス１、最大引っ張り強度は１４．２±５．８Ｎであった。

本発明の好適な実施例を上に例示したが、これらの実施例は、本発明を限定するものではなく、本分野の技術者ならば、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、修正や改良を行うことが可能であるため、本発明の保護の範囲は請求の範囲において画定される範囲を基準とする。

Claims (20)

1. （１）架橋剤によって架橋処理した後の動物由来コラーゲン繊維組織材料の洗浄を行い、
   （２）洗浄後の前記組織材料を、遮光条件下において、非水性アルコール溶液中に浸漬して脱水を行い、
   （３）非水性アルコール溶液によって脱水処理された前記組織材料を、遮光条件下において、順次、濃度が高くなるように、濃度の異なる糖溶液中に浸漬して勾配脱水を行い、
   （４）勾配脱水後の前記組織材料を取り出して乾燥を行い、
   （５）乾燥後の前記組織材料を密封包装した後、滅菌を行う、
   という各手順を含む、
   ことを特徴とする乾燥状態動物由来コラーゲン繊維組織材料の製造方法。
2. 前記手順（１）の動物由来コラーゲン繊維組織材料が異種の動物又は同種の動物（由来）の生物組織材料である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
3. 前記生物組織材料が、心膜、心臓弁、腹膜、胸膜、小腸粘膜下組織、硬膜、脊髄硬膜、靭帯又は皮膚である、
   ことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
4. 前記手順（１）の架橋剤が、グルタルアルデヒド、ゲニピン、プロシアニジン、カルボジイミドの内の１種又は数種である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
5. 前記手順（１）の洗浄手順が、体積百分率５％〜３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール及び／又はエタノールの塩溶液を用いて４〜２５℃下で、３〜６０分間、振とう洗浄し、振とう速度が５０〜１５０ｒｐｍである、
   ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
6. 前記塩溶液が生理食塩水、ｐＨ６．８〜８．６のリン酸塩緩衝液又はｐＨ６．８〜８．６のＤ−Ｈａｎｋｓ溶液である、
   ことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
7. 前記手順（２）の非水性アルコール溶液が分子量１０００Ｄ未満の脂肪族アルコール溶液である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
8. 前記非水性アルコール溶液がポリエーテルジオール及び／又はＣ２〜Ｃ６脂肪族アルコール溶液である、
   ことを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
9. 前記非水性アルコール溶液がポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２，６−ヘキサントリオール、１，２，４−ブタントリオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、グリセロール、イソプロパノール及びエタノールの内の一種又は数種である、
   ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
10. 前記非水性アルコール溶液中の成分にポリエチレングリコール又はグリセロールが含まれ、かつ前記ポリエチレングリコール又はグリセロールの体積百分率が２０％〜９０％であるか、又は、前記非水性アルコール溶液中の成分にポリエチレングリコール及びグリセロールが含まれ、かつ前記ポリエチレングリコールとグリセロールの体積の和の百分率が２０％〜９０％である、
    ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
11. 前記ポリエチレングリコールの数平均分子量が２００〜１０００である、
    ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の製造方法。
12. 前記手順（２）の非水性アルコール溶液の温度が２０〜３７℃であって、前記組織材料の遮光条件下での浸漬時間が３０分間〜２４時間である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
13. 前記手順（３）の糖溶液が、吸水性を有し、かつ保湿型の単糖類、二糖類、三糖類、多糖類又は糖アルコール類糖水溶液である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
14. 前記糖溶液がフルクトース、サッカロース、トレハロース、非結晶性ラフィノース、キトサン、キトサン修飾多糖類、ソルビトール又はマンニトール水溶液である、
    ことを特徴とする請求項１３に記載の製造方法。
15. 前記手順（３）の勾配脱水手順が、非水性アルコール溶液によって脱水処理された前記組織材料を順次異なる濃度勾配の糖溶液中に浸漬し、前記糖溶液の温度を４〜３７℃とし、遮光条件下における毎回の浸漬時間を５分間〜４８時間とする、
    ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
16. 前記手順（３）の異なる濃度勾配の糖溶液が、それぞれ濃度３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％（ｗ／ｖ）のサッカロース水溶液であるか、又はそれぞれ濃度５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％（ｗ／ｖ）のフルクトース、トレハロース、非結晶性ラフィノース、キトサン、キトサン修飾多糖類、ソルビトール又はマンニトールの水溶液である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
17. 前記手順（４）において勾配脱水後の前記組織材料を取り出した後、繊維乾燥剤を投入して乾燥を行うか、又は遮光環境下で温度を２０℃〜３７℃に制御して、１０分間〜２４時間、乾燥させる、
    ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
18. 前記繊維乾燥剤が繊維乾燥剤の未加工シート、折り畳まれた繊維乾燥剤、袋状の繊維乾燥剤、柱状の繊維乾燥剤又はラミネートされた繊維乾燥剤である、
    ことを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
19. 前記密封包装の手順が、相対湿度３０％未満の環境又は不活性ガス環境下において乾燥後の前記組織材料を包装容器に投入して密封包装を行う手順である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
20. 前記滅菌にＥＯ滅菌、電子ビーム照射滅菌又はガンマ線照射滅菌が採用される、
    ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
    

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