JP6579956B2 - 神経変性疾患および他の疾患の治療のための併用治療薬および方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１２年１１月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７３０，７６１号の利益を請求するものであり、その全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府の支援に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）助成金番号１Ｒ４４ＡＧ０３４７６０−０１Ａ１を含む連邦政府の支援を受けて成された。

本出願の発明は、ハッチンソン病、パーキンソン病、ダウン症候群、およびアルツハイマー病等の神経変性疾患、ならびにＨＩＶおよびヘルペス等のウイルス潜伏感染（ｖｉｒａｌ ｌａｔｅｎｃｙ）疾患、前立腺癌、黒色腫、リンパ腫、および腎臓癌等の癌、食道疾患および緑内障等の眼疾患の治療を対象とする。

アルツハイマー病、ハッチンソン病、パーキンソン病、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、および他の海綿状脳症等の神経変性疾患は、依然として大きな健康問題である。アルツハイマー病、ハッチンソン病、およびパーキンソン病に関して、これらの疾患は、高齢者において兆候が現れる傾向があり、疾患が進行するにつれて、罹患者は自らの面倒を見られなくなる。限定されないが、例として、前立腺癌等の癌に関して、ブリオスタチン１は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）δ転座を差次的に調節し、ＰＫＣδ媒介性の腫瘍壊死因子αの放出を防止することによって、前立腺癌細胞においてホルボールエステルによって誘導されるアポトーシスを阻害する。ＨＩＶ潜伏感染等のウイルス潜伏感染疾患に関して、ブリオスタチン−１、および多くのＰＫＣアゴニストは、ＨＩＶ−１プロモーターに結合してその転写活性を調節するＮＦ−ｋＢ等の細胞転写因子を活性化する。ＨＩＶ−１潜伏感染において、ウイルス性プロモーターを取り囲む核ヒストンが脱アセチル化されるため（クロマチンの圧縮）、ウイルス性プロモーターは、細胞転写因子に接近しづらい。よって、ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンのアセチル化（クロマチンの弛緩）を増加することができ、次いで、転写因子がＨＩＶプロモーターに容易に接近できる。限定されないが、例として、緑内障等の眼疾患に関して、βアミロイドの存在が眼内圧の上昇と関連している。現在、これらの疾患を治療する手段は非常に限定されている。

したがって、有効な治療薬、相乗的に作用する併用治療薬、有効な製剤化の方法、および特別に訓練された医療提供者を必要としない単純な投与方法（例えば、経口製剤）を有することが非常に望ましい。

本発明の実施形態は、単剤療法および併用療法、薬物送達システム、剤形、ならびに神経変性疾患、癌、ウイルス潜伏感染、および眼性疾患の治療を対象とする。本発明の治療の対象である神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハッチンソン病、パーキンソン病、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および海綿状脳症によって例示される。他の疾患は、前立腺癌等の癌、ならびにＨＩＶおよびヘルペス等のウイルス潜伏感染を含む。製造物品を対象とする実施形態は、有効量のレチノイドとともに有効量のブリオスタチンまたはＢｒｙｏｉｄを含む剤形を含む。本明細書で使用される場合、「剤形」という用語は、限定されないが、例として、カプセル剤、錠剤、丸剤、フィルム剤、軟膏、クリーム剤、溶剤、懸濁剤、エアロゾル剤、ペースト剤、ドロップ剤、坐剤、再構成用の散剤、注射剤、靜注液等の薬物を投与するための手段を指す。

本明細書で使用される場合、「ブリオスタチン」または「Ｂｒｙｏｉｄ」という用語は、あらゆるブリオスタチンおよびその誘導体を指す。２０個のブリオスタチンが同定されており、特定の例は、ブリオスタチン−１であるブリオスタチンを特徴とする。本発明の実施形態は、約５０％の純度〜結晶形成純度を有し、約８９６〜８９８Ａｍｕの分子量（質量＋ナトリウム）を有する第１のＢｒｙｏｉｄ組成物を特徴とする。第１のＢｒｙｏｉｄ組成物はまた、約５０％の純度〜結晶形成純度を有し、約８７３〜８７５Ａｍｕの分子量（モノアイソトピック質量）を有するＢｒｙｏｉｄ化合物として特徴付けることもできる。第１のＢｒｙｏｉｄ組成物は、８９７．２Ａｍｕの測定質量＋ナトリウムおよび８７４．２Ａｍｕの測定モノアイソトピック質量を有する。以下の詳細な議論では、このＢｒｙｏｉｄをＢ１０と称する。

本発明の実施形態は、約５０％の純度〜結晶形成純度を有し、約９１０〜９１２Ａｍｕの分子量（質量＋ナトリウム）を有する第２のＢｒｙｏｉｄ組成物を特徴とする。第２のＢｒｙｏｉｄ組成物はまた、約５０％の純度〜結晶形成純度を有し、約８８８〜８９０Ａｍｕの分子量（モノアイソトピック質量）を有するＢｒｙｏｉｄ化合物として特徴付けることもできる。第２のＢｒｙｏｉｄ組成物は、測定質量に加えて、９１１．５Ａｍｕのナトリウムおよび８８８．９Ａｍｕの測定モノアイソトピック質量を有する。以下の詳細な議論では、このＢｒｙｏｉｄをＢ１２と称する。

本発明の実施形態は、約５０％の純度〜結晶形成純度を有し、約８６８〜８７０Ａｍｕの分子量（質量＋ナトリウム）を有する第３のＢｒｙｏｉｄ組成物を特徴とする。第３のＢｒｙｏｉｄ組成物はまた、約５０％の純度〜結晶形成純度を有し、約８４６〜８４８Ａｍｕの分子量（モノアイソトピック質量）を有するＢｒｙｏｉｄ化合物として特徴付けることもできる。第３のＢｒｙｏｉｄ組成物は、測定質量に加えて、８６９．５Ａｍｕのナトリウムおよび８４６．６Ａｍｕの測定モノアイソトピック質量を有する。以下の詳細な議論では、このＢｒｙｏｉｄをＢ１４Ｂと称する。

本発明の実施形態は、約５０％の純度〜結晶形成純度を有し、約８９５〜８９７Ａｍｕの分子量（質量＋ナトリウム）を有する第４のＢｒｙｏｉｄ組成物を特徴とする。第４のＢｒｙｏｉｄ組成物はまた、約５０％の純度〜結晶形成純度を有し、約８７２〜８７４Ａｍｕの分子量（モノアイソトピック質量）を有するＢｒｙｏｉｄ化合物として特徴付けることもできる。第４のＢｒｙｏｉｄ組成物は、測定質量に加えて、８９５．５Ａｍｕのナトリウムおよび８７２．６Ａｍｕの測定モノアイソトピック質量を有する。以下の詳細な議論では、このＢｒｙｏｉｄをＢ１４Ｃと称する。

本発明のこれらのＢｒｙｏｉｄ化合物は、ブリオスタチン１〜２０の分子量とは異なる分子量を有する。

本明細書で使用される場合、結晶形成純度は、組成物が結晶を形成することを可能にする純度を組成物が有することを意味する。通常、そのような純度は、９０％を超える、より多くの場合は９５％を超える純度である。本出願に存在する例は、９９％を超える純度を有する組成物を特徴とする。結晶純度は、一切の不純物を検出することができない組成物を含むが、そのように限定されない。

前述の第１のＢｒｙｏｉｄ、第２のＢｒｙｏｉｄ、第３のＢｒｙｏｉｄ、および第４のＢｒｙｏｉｄは、本発明の同時係属特許出願の主題であり、出願者は、２０１２年１１月２７日に米国出願第６１／７３０，２２７号を出願した。同時係属出願の全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の実施形態は、αセクレターゼの産生を刺激する量で存在するＢｒｙｏｉｄを特徴とする。例えば、Ｂｒｙｏｉｄは、１週間当たり１平方メートルの表面積当たり０．１〜５０マイクログラムの用量の投与のために存在する。本発明の別の実施形態は、１週間当たり１平方メートルの表面積当たり５〜１０マイクログラムの用量の投与のために存在するＢｒｙｏｉｄを特徴とする。

製造物品のさらなる実施形態は、レチノイドを含む。レチノイドは、経口形態で生体利用可能であり、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、１３−シス−レチノイン酸、およびベキサロテンを含む群から選択される。その例は、レチノイド、レチノイン酸を特徴とする。例は、αセクレターゼの発現を増加させる量のレチノイドを特徴とする。例えば、限定されないが、レチノイドは、１日当たり１．０〜２４０ｍｇの用量で存在する。

本発明の実施形態は、耐酸性のバイオポリマーを含むナノ粒子を特徴とする。例えば、限定されないが、１つのバイオポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）である。このバイオポリマーは、２つの成分を有する。本発明の実施形態は、２５〜７５％がラクチドで、残りがグリコシドを含むラクチドとグリコシドの比率を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）を特徴とする。一般的な比率は、重量によって決定される５０：５０のラクチド対グリコシドである。このバイオポリマーは、胃酸分解に耐性であり、吸収のために小腸への薬物の経口送達を可能にする。ナノ粒子は、約１〜１０００ナノメートルの直径である。

本発明の実施形態は、水溶液中で再構成するために凍結乾燥された球を特徴とする。別の実施形態は、経口投与のために懸濁液中に保持された球、および／または錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、および散剤からなる群から選択される経口剤形中に保持された球を特徴とする。経口投与のための懸濁液は、好ましくは、患者の受容性を改善するために風味づけされる。

本発明のさらなる実施形態は、神経変性疾患を治療する方法を対象とする。該方法は、複数の球中に保持された有効量のブリオスタチンを投与するステップを含み、各球はバイオポリマーおよびブリオスタチンを含み、各球は１〜１０００ナノメートルの直径を有する。

本発明の実施形態は、ブリオスタチン１〜２０からなる群から選択されるブリオスタチンを特徴とする。特定の例は、ブリオスタチン−１であるブリオスタチンを特徴とする。効力の高いいくつかのブリオスタチンは、ブリオスタチン−３、ならびに先述の第１のＢｒｙｏｉｄ、第２のＢｒｙｏｉｄ、および第３のＢｒｙｏｉｄである。

本発明の実施形態は、αセクレターゼの産生を刺激する量で投与されるブリオスタチンを特徴とする。例えば、ブリオスタチンは、１週間当たり１平方メートルの表面積当たり０．１〜５０マイクログラムの用量で投与される。本発明の別の実施形態は、１週間当たり１平方メートルの表面積当たり５〜１０マイクログラムの用量で投与されるブリオスタチンを特徴とする。

本方法のさらなる実施形態は、レチノイドの同時投与を含む。レチノイドは、経口形態で生体利用可能であり、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、１３−シス−レチノイン酸、およびベキサロテンを含む群から選択される。その例は、レチノイド、レチノイン酸を特徴とする。例は、αセクレターゼの発現を増加させる量のレチノイドを特徴とする。例えば、限定されないが、レチノイドは、１日当たり１．０〜２４０ｍｇの用量で投与される。

本発明の一実施形態は、耐酸性のバイオポリマーを特徴とする。例えば、限定されないが、１つの耐酸性バイオポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）である。ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）は、ラクチドおよびグリコシドの比率を有する。好ましい比率は、２５〜７５％がラクチドで、残りがグリコシドを含む。

好ましくは、微粒子は、水溶液中で再構成するために凍結乾燥されるか、または経口投与のために懸濁液中に保持されるか、または錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、および散剤からなる群から選択される経口剤形中に保持される。

さらなる製造物品として、本発明の実施形態は、神経変性疾患を治療するための経口投与のために薬学的に許容される油に溶解された有効量のブリオスタチンを特徴とする。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される油」という用語は、５〜１０ミリリットルという少量の経口摂取にある程度良好な耐容性を示す油を指す。本発明の実施形態は、オリーブ油を特徴とする。他の実施形態は、限定されないが、例として、綿実油、タラ肝油、ヒマシ油、ベニバナ油、落花生油、ゴマ油、トウモロコシ油、植物油、動物性油、および食品産業で一般的に使用される油を含む含む。油は、好ましくは、ゲルキャップで投与される。

ヒトに有効な量のブリオスタチンは、薬学的に許容される油中に１日当たり０．１〜３．０ｍｇであり、微粒子中として１日当たり約１００マイクログラム〜２ｍｇである。

製造物品のさらなる実施形態は、神経変性疾患、癌、およびウイルス潜伏感染を治療するための経口投与のために薬学的に許容される油に溶解されたレチノイドを含む。好ましくは、薬学的に許容される油は、経口形態で生体利用可能であり、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、１３−シス−レチノイン酸、およびベキサロテンを含む群から選択されるレチノイドを含む。その例は、レチノイド、レチノイン酸を特徴とする。例は、αセクレターゼの発現を増加させる量のレチノイドを特徴とする。例えば、限定されないが、レチノイドは、１日当たり１．０〜２４０ｍｇの用量で存在する。

製造物品のさらなる実施形態は、神経変性疾患、癌、ウイルス潜伏感染、および眼性疾患の治療するための経口投与のために薬学的に許容される油に溶解されたブリオスタチンおよびレチノイドを含む。

本発明のさらなる実施形態は、薬学的に許容される油に溶解された有効量のブリオスタチンを経口投与するステップを含む、神経変性疾患癌、ウイルス潜伏感染、および／または眼性疾患を治療する方法を対象とする。

よって、神経変性疾患の治療として、本発明の実施形態は、レチノイドを含むおよび含まない、有効量のブリオスタチンの経口投与のための剤形および方法を特徴とする。本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下の詳細な説明の本文を読み、添付の図面を参照することにより明白となるであろう。

本発明の特徴を具現化する微粒子を示す。 本発明の１つ以上の微粒子を作製するための装置を示す。 ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞においてブリオスタチン−１が誘導したｓＡＰＰ−ａ形成が、３時間で２μＭおよび４μＭレチノイン酸によって増加することを示す。ＡＤＡＭ１０／αセクレターゼの誘導因子であるレチノイン酸が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞によるｓＡＰＰ−ａの産生を増加させた。左パネルは、ｓＡＰＰ−ａに関する６Ｅ１０を用いたウエスタンブロットを示し、右パネルは、濃度測定分析を示す。＊−ｐ＜０．０５対対照、＊＊−ｐ＜０．０１対対照、ｎ＝３ レチノイン酸（ＲＡ、２μＭ）およびブリオスタチン−１がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のｓＡＰＰαレベルに与える影響を示す。ＲＡ、ブリオスタチン−１（１０^−９Ｍ）＋ＲＡ、ブリオスタチン−１（１０^−１０Ｍ）、ＲＡ＋ブリオスタチン−１（１０^−１０Ｍ）で細胞を３時間処理した。代表的なウエスタンブロットは、細胞培地から回収されたｓＡＰＰαを示す。ブリオスタチン−１およびＲＡの両方が、対照と比較して有意にｓＡＰＰαを増加させた（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）。ＲＡとブリオスタチン−１を組み合わせることにより、細胞培地から回収されたｓＡＰＰαを有意に増加させた。

議論が他の神経変性疾患だけでなく、前立腺癌等の癌、ならびにＨＩＶおよびヘルペス等のウイルス潜伏感染にも関連するという理解の下に、本発明の実施形態は、単剤療法および併用療法、薬物送達システム、剤形、ならびにアルツハイマー病によって例示される神経変性疾患の治療のための方法に関して記載される。本発明の特徴は、その教示から逸脱することなく修正および変更することが可能であるという理解の下に、この議論は、本発明の好ましい実施形態を特徴とする。

最初に図１を参照すると、本発明の特徴を具現化する、数字の１１によって一般的に示される微粒子が示される。微粒子１１は、十分な数の同様の微粒子と組み合わされると、バイオポリマー中に有効用量のブリオスタチンを含む。各微粒子１１は、１〜１０００ナノメートルの直径を有する。微粒子として示されているが、製造物品は、不規則な形状、粗度を有してもよいか、またはフィラメント状の形態であってもよい。

本明細書で使用される場合、「ブリオスタチン」という用語は、あらゆるブリオスタチンおよびＢｒｙｏｉｄならびにその誘導体を指す。ブリオスタチンおよびＢｒｙｏｉｄは、Ｃａｓｔｏｒの米国特許第５，７５０，７０９号およびＣａｓｔｏｒの「Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１，Ｐｈａｓｅ ＩＩ Ｆｉｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔ」、ＳＢＩＲ認可番号５ Ｒ４４ ＣＡ６４０１７−０３（Ａｐｒｉｌ ２１ ２００１）に従って単離される。

特定の例は、ブリオスタチン−１であるブリオスタチンを特徴とする。ブリオスタチン−１は、当該技術分野において十分に特徴づけされているため、そのような化合物の構造を本明細書において再現する必要はない。効力の高いいくつかのブリオスタチンは、ブリオスタチン−３と、先述の第１のＢｒｙｏｉｄ、第２のＢｒｙｏｉｄ、および第３のＢｒｙｏｉｄ、ならびに参照により本明細書に組み込まれる同時係属特許出願の主題である。

ブリオスタチンは、αセクレターゼの産生を刺激する量で投与される。例えば、ブリオスタチンは、１週間当たり１平方メートルの表面積当たり０．１〜５０マイクログラムの用量で投与される。本発明の別の実施形態は、１週間当たり１平方メートルの表面積当たり５〜１０マイクログラムの用量で投与されるブリオスタチンを特徴とする。

レチノイドの同時投与を特徴とする実施形態において、レチノイドは、ブリオスタチンとの併用効果を有するように、同じバイオポリマー内に存在するか、または別個に作製されて投与前に組み合わされるか、または同時にもしくは近接した時間に投与される。

レチノイドは、経口形態で生体利用可能であり、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、１３−シス−レチノイン酸、およびベキサロテンを含む群から選択される。レチノイン酸は、経口投与薬として入手可能であり、薬品名Ｔｒｅｔｉｎｏｉｎおよび商標名Ｒｅｔｉｎ−Ａ（登録商標）の下に販売されている。特定の論理に拘束されるものではないが、レチノイドは、ブリオスタチンと相乗的に作用してαセクレターゼの発現を増加させると考えられる。この目的のために、レチノイドは、１日当たり１．０〜２４０ｍｇの用量で投与される。

本発明の実施形態は、耐酸性のバイオポリマーを特徴とする。本議論の目的のために、酸に対する耐性は、ｐＨ約１〜３の胃酸で約０．５〜４．０時間の期間を指す。１つのバイオポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）である。このバイオポリマーは、ラクチド成分およびグリコシド成分の２つの成分を有する。本発明の実施形態は、２５〜７５％がラクチドで、残りがグリコシドを含むラクチドとグリコシドの比率を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）を特徴とする。一般的な比率は、重量によって決定される５０：５０のラクチド対グリコシドである。このバイオポリマーは、酸による分解に耐性であり、吸収のために小腸への薬物の経口送達を可能にする。

本発明の実施形態は、水溶液中で再構成するために凍結乾燥された微粒子を特徴とする。別の実施形態は、経口投与のために懸濁液中に保持された微粒子、および／または錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、および散剤からなる群から選択される経口剤形中に保持された微粒子を特徴とする。錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、および散剤の作製方法は、当該技術分野で周知である。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」−２０^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ）。経口投与のための懸濁液は、好ましくは、患者の受容性を改善するために風味づけされる。

本発明の別の実施形態は、有効量のブリオスタチンを含有する薬学的、経口的に許容される油を特徴とする。投与のための油の量が決定され、有効量のブリオスタチンが、当該技術分野で既知の様式でそのような油に溶解される。好ましくは、経口投与を目的とする油の量は、当該技術分野で既知の様式でゲルキャップに封入される。例えば、ビタミンＤおよびビタミンＥ栄養補助食品が、ゲルキャップ製剤に封入されることが多い。

本発明の方法および装置を、数字の１３で一般的に表されるポリマー球装置を概略的な形態で示す図２に関して記載する。ポリマー球装置は、以下の主な要素からなる：ポリマー容器１５、ブリオスタチン薬注入アセンブリ１７、混合チャンバ１９、減圧容器２１、およびオリフィスノズル２３。

ポリマー容器１５は、導管２７ａ、２７ｂ、および２７ｃを介して超臨界、臨界、または臨界点近傍のシリンジポンプ２５と流体連通している。超臨界、臨界、または臨界点近傍のポンプ２５は、超臨界、臨界、または臨界点近傍の流体の源と流体連通している。

ポリマー容器１５はまた、接合点３５で導管２７ａと交差する導管３３を介して改質剤シリンジポンプ３１とも流体連通している。改質剤シリンジポンプ３１は、改質剤および／または添加溶剤の源と流体連通している（図示せず）。

ポリマー容器１５にはポリマーが装填される。このポリマー容器は、導管２７ａ、２７ｂ、および２７ｃを介して超臨界、臨界、または臨界点近傍のポンプ２５から超臨界、臨界、または臨界点近傍の流体を受け取る。ポリマー容器１５は、導管３３を介して改質剤ポンプ３１から改質剤および／または添加溶剤を受け取る。超臨界、臨界、または臨界点近傍の流体および改質剤にポリマーを溶解させてポリマー溶液を形成する。導管２７ｄ、２７ｄ、２７ｅ、２７ｆ、および２７ｇ、マスターバルブ２９、静的ミキサー３１、ならびに循環ポンプ３３を備えるループで、ポリマーと、超臨界、臨界、または臨界点近傍の流体とを循環させることによって、ポリマー溶液の形成を促進する。

ポリマー容器１５は、導管３７および３９を介して混合チャンバ１９と流体連通している。混合チャンバ１９もまた、ブリオスタチン薬注入アセンブリ１７と流体連通している。ブリオスタチン薬注入アセンブリ１７は、ブリオスタチン薬シリンジポンプ４３、ブリオスタチンの源４１、および導管４５を備える。ブリオスタチン薬シリンジポンプ４３は、ブリオスタチン材料の源と流体連通し、そのような材料を加圧して強制的に導管４５を通す。導管４５は、接合点４７で導管４５と交差する導管３９を介して混合チャンバと流体連通する。好ましくは、接合点４７は、混合する「Ｔ」である。

混合容器１９は、インラインミキサーの性質を帯びており、ポリマー容器１５およびブリオスタチン薬注入アセンブリ１７から流入する流れを完全に混合する。混合容器１９は、導管４９を介してオリフィスノズル２３と流体連通している。オリフィスノズル２３は、背圧レギュレータの性質を帯びており、導管５１を介して減圧容器２１内に排出する１つ以上のオリフィスを画定するノズルを有する。好ましくは、超臨界、臨界、または臨界点近傍の二酸化炭素が約０．４２５ｍｌ／分の速度でオリフィスに進入し、０．０７５ｍｌ／分のアセトンまたは約０．５ｍｌ／分の二酸化炭素とエタノールとが組み合わさってシステムの圧力を２，５００ｐｓｉｇに維持するように、オリフィスノズル２３は圧力および除圧速度を制御する。

システムの動作圧力は、シリンジポンプの一部であるコンピュータ化制御装置（図示せず）を介して正確なレベルで事前に設定することができる。システムの温度制御は、システム全体を通して均一な温度を維持するように、熱交換器（図示せず）に連結されたＮｅｓｌａｂ加熱／冷却システムを用いる一方で、１／４インチのＬｅｘａｎシートに装置１１を封入することによって達成される。

動作において、ポリマー材料が最初にポリマー容器１５に充填される。超臨界、臨界、または臨界点近傍の流体と、１つ以上のブリオスタチン化合物のエタノール溶液とが、超臨界、臨界、または臨界点近傍のシリンジポンプ２５および３１にそれぞれ投入され、所望の動作圧力に到達する。代替として、１つ以上のブリオスタチン化合物のエタノール溶液は、生体活性シリンジポンプ４３に投入される。

１つ以上のブリオスタチン化合物および１つ以上のレチノイド化合物を特徴とする製剤では、超臨界、臨界、または臨界点近傍の流体と、ブリオスタチンのエタノール溶液と、レチノイド化合物とが、超臨界、臨界、または臨界点近傍のシリンジポンプ２５および３１にそれぞれ投入され、所望の動作圧力に到達する。代替として、ブリオスタチンのエタノール溶液およびレチノイド化合物は、生体活性シリンジポンプ４３に投入される。

システムは、超臨界、臨界、または臨界点近傍のシリンジポンプ２５を介して超臨界、臨界、または臨界点近傍の流体によって、改質剤シリンジポンプ３１および生体活性シリンジポンプ４３に設定されたものと等しい圧力レベルまで加圧され、ノズルオリフィス２３を用いてこのレベルで維持される。全てのポンプの動的動作モードは、各ポンプがその独自の所望の流速で動作できるように設定される。超臨界、臨界、または臨界点近傍の流れは、ポリマー容器１５を通って流れ、接合点４７でポリマーを溶解し、１つ以上のブリオスタチン化合物、または１つ以上のブリオスタチンおよびレチノイド化合物に接触する。超臨界、臨界、臨界点近傍の流体、ブリオスタチン薬、またはブリオスタチンおよびレチノイド、またはレチノイド単独およびポリマー材料の混合物は、次いで、混合チャンバ１９を通過してさらに混合される。最後に、混合溶液がオリフィスノズル２３に進入し、減圧容器２１内で０．１％ポリビニルアルコール、微量の酢酸を含む４０％エタノールを含有する１０％ショ糖溶液中に注入される。超臨界流体の除圧の結果として、１つ以上のブリオスタチン化合物を含有するポリマー球、または１つ以上のブリオスタチンおよびレチノイド化合物を含有するポリマー球、またはレチノイド化合物を含有するポリマー化合物が、１０％ショ糖溶液、０．１％ポリビニルアルコール、微量の酢酸を含む４０％エタノール中に形成される。膨脹した超臨界流体は、減圧容器２１の通気管路を介してシステムから出る。

ポリマーナノ粒子は、微粒子１１の性質を帯びている。これらの微粒子１１は、摂氏−８０℃で冷凍され、凍結乾燥される。

レチノイン酸は、ブリオスタチン−１によって媒介されるαセクレターゼ活性を増強する。図３は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞においてブリオスタチン−１が誘導したｓＡＰＰ−ａ形成が、３時間で２μＭおよび４μＭのレチノイン酸によって増加することを示す。ＡＤＡＭ１０／αセクレターゼの誘導因子であるレチノイン酸が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞によるｓＡＰＰ−ａの産生を増加させた。左パネルは、ｓＡＰＰ−ａに関する６Ｅ１０を用いたウエスタンブロットを示し、右パネルは、濃度測定分析を示す。＊−ｐ＜０．０５対対照、＊＊−ｐ＜０．０１対対照、ｎ＝３

ブリオスタチン−１は、我々のＡＤモデルにおいて記憶および認識を増強することが可能であり、またＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞においてαセクレターゼの活性を強力に刺激することが可能であったため、我々は、ａ−セクレターゼ（ＡＤＡＭ１０、および（また場合によってはＡＤＡＭ１７、−９、−１９）の発現を増加させるためのレチノイン酸（ＲＡ、２または４ｕＭ）を用いたこれらの細胞の同時処理が、ＡＰＰプロセシングの全体的な増強をもたらすかどうかを調査した。実際に、我々は、ブリオスタチン−１および２μＭまたは４μＭのＲＡの両方で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が、より多くのｓＡＰＰ−α放出を示すことを発見した（ｓＡＰＰ−α放出によって測定）。

ブリオスタチン−１および２μＭレチノイン酸（赤いバー）または４μＭレチノイン酸（ＲＡ）（青いバー）は、αセクレターゼによるＡＰＰからｓＡＰＰ−αへのプロセシングの増強を２４時間示した。これらの知見は、ＲＡおよびブリオスタチン−１を用いたニューロン培養物の同時処理が、ｓＡＰＰ−αへのＡＰＰプロセシングの増強を示したことを示しており、ＲＡとブリオスタチン−１のインビボでの組み合わせが、αセクレターゼ活性を相乗的に増強し得ることを示唆するものである（図１）。

このデータは、ＲＡおよびブリオスタチン−１が、（１）αセクレターゼレベルを増加させ、（２）より大量のαセクレターゼを活性化して（３）ｓＡＰＰ−αへのＡＰＰプロセシングのより高い全体的なレベルを達成する、画期的な組み合わせを意味することを示している。

レチノイン酸およびブリオスタチン−１
図２は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞において、１０^−９Ｍブリオスタチン−１と同様に、２μＭレチノイン酸によってもｓＡＰＰ形成が増加する（ｐ＜０．０１）ことを示す。１０^−９Ｍおよび１０^−１０Ｍのブリオスタチン−１とともに２μＭ濃度のレチノイン酸（ＲＡ）を加えた時に相加効果が観察された。

興味深いことに、図２は、ＲＡおよびブリオスタチン−１の両方が、それぞれ、ＡＤＡＭ１０（α−セクレターゼの主な形態）の発現を有意に増加させることができること、また、それらを組み合わせると、発現に対して少なくとも相加効果があることを示す。これは、ブリオスタチン−１が−セクレターゼの発現を増加させるという最初の証拠であり、それはブリオスタチン−１の新規かつ予期せぬ効果である。したがって、ブリオスタチン−１は、２つの独立した機構によって−セクレターゼによるプロセシングを増加させることができる：（ｉ）セクレターゼを刺激するＰＫＣの活性化、および（ｉｉ）−セクレターゼの発現の増加。

また、ＡＤＡＭ１０の存在量の増加は、必ずしもより多くのタンパク質合成を反映するのではなく、ＡＤＡＭ１０の安定性の増加を反映し得るということも考えられる。いずれの場合も、ＡＤＡＭ１０に対する効果は今までにないものである。ＡＤＡＭ１０ ｍＲＮＡの合成は、ブリオスタチン−１によって増加することができ、最終的により多くのα−セクレターゼがもたらされる。

油性ブリオスタチン溶液
油性ブリオスタチン溶液は、保存剤としてのビタミンＥ、ならびに生物学的利用率を高めるためのレシチンおよび中鎖脂肪酸トリグリセリド乳化剤を含むオリーブ油に溶解した所望の量のブリオスタチンを用いて作製される。溶解したブリオスタチンを含む油は、窒素パージおよびヘッドによりゲルカプセルに封入される。代替として、溶解したブリオスタチンを含む油は、液体剤形として投与される。代替として、溶解したブリオスタチンを含む油はまた、乳化されて液体製剤として投与されてもよい。乳化は、油性経口製剤に伴うあまり望ましくない味および舌触りをいくらか遮蔽することができる。

油性ブリオスタチンおよびレチノイン酸の溶液
油性ブリオスタチンおよびレチノイン酸の溶液は、保存剤としてのビタミンＥ、ならびに生物学的利用率を高めるためのレシチンおよび中鎖脂肪酸トリグリセリド乳化剤を含むオリーブ油に溶解した所望の量のブリオスタチンおよびレチノイン酸を用いて作製される。ブリオスタチンおよびレチノイン酸を含む油は、窒素パージおよびヘッドによりゲルカプセルに封入される。代替として、溶解したブリオスタチンおよびレチノイン酸を含む油は、液体剤形として投与される。さらなる代替として、溶解したブリオスタチンおよびレチノイン酸を含む油はまた、乳化されて液体製剤として投与されてもよい。乳化は、油性経口製剤に伴うあまり望ましくない味および舌触りをいくらか遮蔽することができる。

ブリオスタチン微粒子
前述の方法に従って、ポリマーおよびブリオスタチン１を含む微粒子を調製した。その結果を下の表１に要約する。

ナノ粒子は、４〜２５℃（摂氏）で少なくとも１週間の期間安定であると考えられる。さらに、ナノ粒子は、胃内環境と類似した３７℃（摂氏）の約ｐＨ１．１３の溶液中で安定であると考えられる。

結果はさらに、ブリオスタチンおよびブリオスタチン１を含むナノ粒子が、特に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞株において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からｓ−ＡＰＰαへのαセクレターゼによるプロセシングを誘導し、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソフォームα、δ、およびεを活性する（膜輸送によって測定される）ことを示唆している。これらの事象は、ヒトのアルツハイマー病およびアルツハイマー病のｓｗｅＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおける認知症の推定原因であるβセクレターゼ媒介性のβアミロイド形成の予防に関連する、十分に記載された細胞事象および薬理学的事象である。

ブリオスタチンおよびレチノイド微粒子
前述の方法に従って、ポリマーと１つ以上のブリオスタチンおよびレチノイド化合物とを含む微粒子を調製する。

水迷路試験
早期発症型アルツハイマー病と関連するスウェーデン変異型アミロイド前駆体タンパク質（ｓｗｅＡＰＰ）およびＰＳ１（プレセニリン−１）遺伝子を担持するマウス系統Ｂ６Ｃ３−Ｔｇを、５〜６月齢で水迷路試験に供した。これらの試験は、油性製剤中５マイクログラム／マウスの用量でブリオスタチン−１を隔日経口投与されたマウスが、ＡＰＰ／ＰＳ１変異によって引き起こされるアルツハイマー病によってもたらされる記憶喪失に対して、対照動物に見られた記憶獲得能力と比較して有意な保護を示したことを示唆するものである。

したがって、我々は、これらの実施形態が、その教示から逸脱することなく修正および変更が可能であるという理解の下に、本発明を好ましい実施形態に関して記載してきた。したがって、本発明は、正確な詳細に限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲の主題および均等物を包含するべきである。

Claims (18)

1. 有効量のブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）および有効量のレチノイドを含む、αセクレターゼによるプロセシングの増強が有益である１つ以上の疾患の治療のための、または、αセクレターゼ活性の上昇に応答性の疾患の治療のための製剤であって、
   前記ブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）およびレチノイドが、１〜１０００ナノメートルの直径を有しかつバイオポリマーを含む複数の微粒子に保持され、
   前記ブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）が、ブリオスタチン１〜２０からなる群に、さらに第１のブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）、第２のブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）および第３のブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）を含む群から選択され、ここで、前記第１のブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）は、測定モノアイソトピック質量として８７４．２Ａｍｕを有するブリオイドＢ１０であり、前記第２のブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）は、測定モノアイソトピック質量として８８８．９Ａｍｕを有するブリオイドＢ１２であり、および、前記第３のブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）は、測定モノアイソトピック質量として８４６．６Ａｍｕを有するブリオイドＢ１４Ｂであり、ならびに
   前記バイオポリマーが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）である、
   前記製剤。
2. 前記レチノイドが、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、１３−シス−レチノイン酸およびベキサロテンからなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。
3. 前記レチノイドが、αセクレターゼの発現を増加させる量で存在する、請求項１または２に記載の製剤。
4. 前記ブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）が、αセクレターゼの産生を刺激する量で存在する、請求項１から３のいずれか１項に記載の製剤。
5. 前記ブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）が、１週間当たり１平方メートルの表面積当たり０．１〜５０マイクログラムの投与量で存在する、請求項１から４のいずれか１項に記載の製剤。
6. 前記ブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）が、１週間当たり１平方メートルの表面積当たり５〜１０マイクログラムの投与量で存在する、請求項５に記載の製剤。
7. 前記レチノイドが、１日当たり１．０〜２４０ｍｇの投与量で存在する、請求項１から６のいずれか１項に記載の製剤。
8. 前記レチノイドが、レチノイン酸である、請求項１から７のいずれか１項に記載の製剤。
9. 前記バイオポリマーが、耐酸性である、請求項１から８のいずれか１項に記載の製剤。
10. 前記ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）が、２５〜７５％がラクチドであり、残りがグリコシドである、ラクチドとグリコシドの比率を有する、請求項１から９のいずれか１項に記載の製剤。
11. 前記微粒子が、水溶液中で再構成するために凍結乾燥される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の製剤。
12. 前記微粒子が、経口投与のために懸濁液中に保持される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の製剤。
13. 前記微粒子が、錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、および散剤からなる群から選択される経口剤形中に保持される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の製剤。
14. αセクレターゼによるプロセシングの増強が有益である１つ以上の疾患、または、αセクレターゼ活性の上昇に応答性の疾患が、神経変性疾患、癌、ウイルス潜伏感染、および眼性疾患からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の製剤。
15. 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハッチンソン病、パーキンソン病、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および海綿状脳症からなる群から選択される、請求項１４に記載の製剤。
16. 前記癌が、前立腺癌、黒色腫、リンパ腫、腎臓癌、および食道癌からなる群から選択される、請求項１４に記載の製剤。
17. 前記ウイルス潜伏感染が、ＨＩＶまたはヘルペスに関連する疾患である、請求項１４に記載の製剤。
18. 前記有効量のブリオイド（Ｂｒｙｏｉｄ）が、１日当たり体重１キログラム当たり３〜１０ｕｇの投与量で存在する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の製剤。

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