JP6594661B2

JP6594661B2 - Production method of new dyeing materials

Info

Publication number: JP6594661B2
Application number: JP2015105309A
Authority: JP
Inventors: 寛之山中; 幸宏中村; 洋二秦
Original assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd
Current assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd
Priority date: 2015-05-25
Filing date: 2015-05-25
Publication date: 2019-10-23
Anticipated expiration: 2035-05-25
Also published as: JP2016214185A

Description

本発明は、システイニルドーパ(cysteinyldopa、Cys-DOPA)を含むメラニン前駆体の製造方法に関する。さらに、本発明は、フェオメラニン(pheomelanin)を含むメラニンの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a melanin precursor containing cysteinyldopa (Cys-DOPA). Furthermore, the present invention relates to a method for producing melanin including pheomelanin.

メラニンは、動物及び植物に広く存在する黄色〜黒色の色素であり、紫外線吸収機能、ラジカル捕獲機能、酸化防止機能などを有することが知られている。メラニンは、生体由来の物質であり安全性が高いことから、化粧品、食品等の添加剤として広く使用されている。 Melanin is a yellow to black pigment widely present in animals and plants, and is known to have an ultraviolet absorption function, a radical capture function, an antioxidant function, and the like. Melanin is widely used as an additive for cosmetics, foods and the like because it is a biologically derived substance and has high safety.

例えば、メラニンは、日焼け防止クリーム、サングラス等に配合することにより、これらに紫外線吸収機能を持たせるために用いられている。また、食品やプラスティックの酸化防止剤としても使用されている。さらに、色素として白髪染めなどにも添加されている。 For example, melanin is used in order to give an ultraviolet absorbing function to sunscreen creams, sunglasses and the like. It is also used as an antioxidant for foods and plastics. Furthermore, it is also added to white hair dyeing as a pigment.

メラニンとしては、主に、ユウメラニン(eumelanin)とフェオメラニンの2種類が存在する。 There are two main types of melanin: eumelanin and pheomelanin.

ユウメラニンは、黒色又は褐色のメラニンであり、メラニンといえば、ユウメラニンのことを意味する場合が多い。生体内において、ユウメラニンは、メラニン生成酵素であるチロシナーゼが、基質であるチロシン又は３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニン(DOPA)の酸化を触媒することによりドーパキノンを経て生成するメラニン前駆体、特にユウメラニン前駆体(ドーパクロム、５，６−ジヒドロキシインドール(DHI)、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸(DHICA)など)が重合することにより生合成される。このようにして生成するユウメラニンは、皮膚や髪等のメラニン産生細胞内に小粒となって存在しており、水に不溶で、熱濃硫酸や強アルカリを用いなければ溶解しない高分子化合物である。 Eumelanin is black or brown melanin, and melanin often refers to eumelanin. In vivo, eumelanin is a melanin precursor that is produced via dopaquinone by catalyzing the oxidation of tyrosine or 3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine (DOPA), which is a substrate by tyrosinase, which is a melanin-producing enzyme. In particular, eumelanin precursors (dopachrome, 5,6-dihydroxyindole (DHI), 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA), etc.) are biosynthesized. The melanin produced in this way is a high molecular compound that exists in small particles in melanin-producing cells such as skin and hair, is insoluble in water, and does not dissolve unless hot concentrated sulfuric acid or strong alkali is used. is there.

フェオメラニンは、赤色又は黄色のメラニンであり、ユウメラニンとは異なり希アルカリに可溶である。人や動物の赤毛や鳥類の赤い羽などにも含まれている。フェオメラニンは、チロシナーゼの作用によりチロシンからドーパキノンが生じるまではユウメラニンと同様の経路で生合成されるが、ドーパキノンにシステイン(Cys)が付加することによってシステイニルドーパが生じた後、更に下流に反応が進むことによりフェオメラニンが合成される。 Pheomelanin is red or yellow melanin, and unlike melanin, it is soluble in dilute alkali. It is also included in redheads of humans and animals and red feathers of birds. Pheomelanin is biosynthesized by the same pathway as eumelanin until dopaquinone is produced from tyrosine by the action of tyrosinase. However, cysteinyl dopa is formed further downstream by the addition of cysteine (Cys) to dopaquinone. As the reaction proceeds, pheomelanin is synthesized.

ユウメラニンは水に不溶であるため、繊維や皮革などの染料として利用する場合、組織に浸透することができず、対象を染めることはできない。しかし、特許文献１には、水溶性であるメラニン前駆体(メラニンの構成モノマーの混合物)の効率的な製造方法が開示されている。かくして調製されるメラニン前駆体は水溶性であるため、染色対象物に浸透しやすく、メラニン前駆体を染色対象物内に浸透させた後に重合させてメラニンを生成することにより効率良く対象物を染色することができる。 Since eumelanin is insoluble in water, when used as a dye for fibers, leather, etc., it cannot penetrate into tissues and cannot dye objects. However, Patent Document 1 discloses an efficient method for producing a water-soluble melanin precursor (a mixture of constituent monomers of melanin). Since the melanin precursor thus prepared is water-soluble, it easily penetrates into the object to be dyed, and after the melanin precursor has penetrated into the object to be dyed, it is polymerized to produce melanin efficiently. can do.

しかしながら、特許文献１の実施例で実際に製造されているのはユウメラニン前駆体のみであり、フェオメラニン前駆体については実際に製造した実施例は存在しない。 However, only the eumelanin precursor is actually produced in the examples of Patent Document 1, and there is no example actually produced for the pheomelanin precursor.

また、特許文献２に記載されているように、特許文献１に記載のメラニン前駆体の製造方法では、pHが一定の範囲となるように、pHの制御が必要となる。 Further, as described in Patent Document 2, in the method for producing a melanin precursor described in Patent Document 1, it is necessary to control the pH so that the pH falls within a certain range.

さらに、特許文献１に記載のメラニン前駆体の製造方法では、反応液に酸素を供給する際に発泡するため、反応槽への仕込み量を増加させるためには、特許文献３に記載されているように、閉鎖系を利用し、酸素を供給する必要がある。 Furthermore, in the method for producing a melanin precursor described in Patent Document 1, since foaming occurs when oxygen is supplied to the reaction solution, Patent Document 3 describes a method for increasing the amount charged to the reaction tank. Thus, it is necessary to supply oxygen using a closed system.

特開2006-158304号公報JP 2006-158304 A 特開2011-45306号公報JP 2011-45306 特開2011-45307号公報JP 2011-45307

本発明は、効率的なシステイニルドーパを含むメラニン前駆体の製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、効率的なフェオメラニンを含むメラニンの製造方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the manufacturing method of the melanin precursor containing an efficient cysteinyl dopa. Furthermore, an object of this invention is to provide the manufacturing method of the melanin containing an efficient pheomelanin.

本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、DOPA又はチロシンとシステインとを一定の範囲の割合で配合した混合物中で、チロシナーゼでDOPA又はチロシンを酸化させることにより、システイニルドーパに高変換することができる上に、pH制御が不要であり且つ空気を通気しても発泡しないため、効率よくシステイニルドーパを製造できるという知見を得た。さらに、アルカリ条件と酸素の添加との2つの条件が揃うことで、効率よくシステイニルドーパが下流の反応へ進みフェオメラニンを製造することができるという知見も得た。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventor oxidised DOPA or tyrosine with tyrosinase in a mixture containing DOPA or tyrosine and cysteine in a certain ratio. The present inventors have found that cysteinyl dopa can be efficiently produced because it can be highly converted into nildopa and does not require pH control and does not foam even when air is passed through. Furthermore, it was also found that cysteinyl dopa can efficiently proceed to the downstream reaction and produce pheomelanin by combining the two conditions of alkaline conditions and oxygen addition.

本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のシステイニルドーパを含むメラニン前駆体の製造方法、及びフェオメラニンを含むメラニンの製造方法を提供するものである。 The present invention has been completed based on these findings and has been completed and provides the following method for producing a melanin precursor containing cysteinyl dopa and a method for producing melanin containing pheomelanin. is there.

項１．以下の工程(1)を含む、システイニルドーパを含むメラニン前駆体の製造方法：
(1)カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素又は当該酵素を含有する微生物、システイン、並びにDOPA (３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニン)及び／又はチロシンを含み、DOPA及び／又はチロシンとシステインとがモル比(DOPA及び／又はチロシン：システイン) 1：0.5〜4で配合された混合物中で、DOPA及び／又はチロシンを酸化してシステイニルドーパに変換する工程。 Item 1. A method for producing a melanin precursor containing cysteinyl dopa, comprising the following step (1):
(1) An enzyme having catechol oxidase activity or a microorganism containing the enzyme, cysteine, and DOPA (3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine) and / or tyrosine, wherein DOPA and / or tyrosine and cysteine are A step of oxidizing DOPA and / or tyrosine to cysteinyl dopa in a mixture formulated with a molar ratio (DOPA and / or tyrosine: cysteine) 1: 0.5-4.

項２．前記モル比(DOPA及び／又はチロシン：システイン)が1：1.0〜3である、項１に記載の方法。 Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the molar ratio (DOPA and / or tyrosine: cysteine) is 1: 1.0-3.

項３．前記モル比(DOPA及び／又はチロシン：システイン)が1：1.0〜2.0である、項１又は２に記載の方法。 Item 3. Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the molar ratio (DOPA and / or tyrosine: cysteine) is 1: 1.0 to 2.0.

項４．前記工程(1)において、システイニルドーパに加えてユウメラニン前駆体も生成される、項１又は２に記載の方法。 Item 4. Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein in the step (1), a eumelanin precursor is also generated in addition to cysteinyl dopa.

項５．前記工程(1)において、前記混合物中に空気が供給される、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 Item 5. Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein in the step (1), air is supplied into the mixture.

項６．前記工程(1)において、前記混合物中に酸素が供給される、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 Item 6. Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein in the step (1), oxygen is supplied into the mixture.

項７．更に以下の工程(2)を含む、項１〜６のいずれか一項に記載の方法：
(2)工程(1)で得られたシステイニルドーパを反応液から回収する工程。 Item 7. The method according to any one of Items 1 to 6, further comprising the following step (2):
(2) A step of recovering the cysteinyl dopa obtained in the step (1) from the reaction solution.

項８．更に以下の工程(2’)を含む、項７に記載の方法：
(2’)工程(2)で回収されたシステイニルドーパを濃縮する工程。 Item 8. Item 8. The method according to Item 7, further comprising the following step (2 ′):
(2 ′) A step of concentrating the cysteinyl dopa recovered in step (2).

項９．以下の工程(3)を含む、フェオメラニンを含むメラニンの製造方法：
(3)項１〜８のいずれか一項に記載の方法により得られたシステイニルドーパを含むメラニン前駆体を、アルカリ条件下且つ酸素の存在下で処理して、フェオメラニンに変換する工程。 Item 9. A method for producing melanin containing pheomelanin, comprising the following step (3):
(3) A step of converting a melanin precursor containing cysteinyl dopa obtained by the method according to any one of items 1 to 8 into pheomelanin under alkaline conditions and in the presence of oxygen .

項１０．前記アルカリ条件下が、pH 8以上である、項９に記載の方法。 Item 10. Item 10. The method according to Item 9, wherein the alkaline condition is pH 8 or higher.

項１１．前記工程(3)において、フェオメラニンに加えてユウメラニンも生成される、項９又は１０に記載の方法。 Item 11. Item 11. The method according to Item 9 or 10, wherein in the step (3), eumelanin is also generated in addition to pheomelanin.

項１２．以下の工程(4)を含む、メラニンの製造方法：
(4)項１〜８のいずれか一項に記載の方法により得られたシステイニルドーパを含むメラニン前駆体と、別途調製したユウメラニン前駆体とを混合し、アルカリ条件下且つ酸素の存在下で処理して、フェオメラニンとユウメラニンに同時変換する工程。 Item 12. A method for producing melanin, comprising the following step (4):
(4) A melanin precursor containing cysteinyl dopa obtained by the method according to any one of items 1 to 8 and a separately prepared eumelanin precursor are mixed, and the presence of oxygen under alkaline conditions The process of converting to pheomelanin and eumelanin at the same time.

本発明のシステイニルドーパを含むメラニン前駆体の製造方法は、DOPA又はチロシンをシステイニルドーパに高変換することができるという優れた特性を有している。また、本発明の方法によれば、ユウメラニン前駆体の製造とは異なりpHの制御をほとんど行わなくてもよい上に、空気を通気してもほとんど発泡しないため反応槽容積を有効に利用することができるため、効率よくシステイニルドーパを製造することが可能である。 The method for producing a melanin precursor containing cysteinyl dopa of the present invention has an excellent characteristic that DOPA or tyrosine can be highly converted into cysteinyl dopa. In addition, according to the method of the present invention, unlike the production of the eumelanin precursor, it is not necessary to control the pH, and since the foam is hardly foamed even when air is ventilated, the reaction vessel volume is effectively used. Therefore, cysteinyl dopa can be produced efficiently.

本発明のフェオメラニンを含むメラニンの製造方法によれば、効率よくシステイニルドーパを下流の反応へ進ませることができ、効率よくフェオメラニンを製造することが可能である。 According to the method for producing melanin containing pheomelanin of the present invention, cysteinyl dopa can be efficiently advanced to a downstream reaction, and pheomelanin can be produced efficiently.

以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

なお、本発明において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「からなる(consist of)」という意味をも包含する。 In the present invention, “comprise” includes the meaning of “essentially consist of” and the meaning of “consist of”.

また、本発明において「メラニン」とは、ユウメラニン及びフェオメラニンの両方の意味を包含し、「メラニン前駆体」とは、ユウメラニン前駆体及びフェオメラニン前駆体の両方の意味を包含する。 In the present invention, “melanin” includes both the meanings of eumelanin and pheomelanin, and “melanin precursor” includes both the meanings of eumelanin precursor and pheomelanin precursor.

＜システイニルドーパを含むメラニン前駆体の製造方法＞
本発明のシステイニルドーパを含むメラニン前駆体の製造方法は、以下の工程(1)を含むことを特徴とする。
(1)カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素又は当該酵素を含有する微生物、システイン、並びにDOPA及び／又はチロシンを含み、DOPA及び／又はチロシンとシステインとがモル比(DOPA及び／又はチロシン：システイン) 1：0.5〜4で配合された混合物中で、DOPA及び／又はチロシンを酸化してシステイニルドーパに変換する工程。 <Method for producing melanin precursor containing cysteinyl dopa>
The method for producing a melanin precursor containing cysteinyl dopa according to the present invention includes the following step (1).
(1) An enzyme having catechol oxidase activity or a microorganism containing the enzyme, cysteine, and DOPA and / or tyrosine, wherein DOPA and / or tyrosine and cysteine are in a molar ratio (DOPA and / or tyrosine: cysteine) 1: A step of oxidizing DOPA and / or tyrosine to convert to cysteinyl dopa in a mixture of 0.5 to 4.

・システイニルドーパ
本発明の製造方法が対象とするシステイニルドーパは、基質化合物であるDOPA及び／又はチロシンから、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素を用いた酸化反応により得られるドーパキノンにシステインが付加することにより製造される化合物である。システイニルドーパは、酸化重合しフェオメラニンを形成するので、すなわち、フェオメラニン前駆体である。 Cysteinyl dopa The cysteinyl dopa targeted by the production method of the present invention adds cysteine to the dopaquinone obtained from the substrate compound DOPA and / or tyrosine by an oxidation reaction using an enzyme having catechol oxidase activity. It is a compound manufactured by doing. Cysteinyl dopa is a pheomelanin precursor because it undergoes oxidative polymerization to form pheomelanin.

・DOPA、チロシン
本発明のシステイニルドーパの製造において、基質化合物としては、DOPA及びチロシンのいずれか、又はそれらの混合物を用いても構わないが、好ましくはDOPAである。DOPAは、L体(３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン)(以下、「L-DOPA」とも称する)又はD体(３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｄ−アラニン)のいずれであってもよい。中でも、天然型システイニルドーパが得られる点で、L-DOPAを用いることが好ましく、酵素に対する親和性の点でもL-DOPAを用いることが好ましい。また、チロシンについてはL-チロシンが好ましい。 -DOPA, tyrosine In the production of the cysteinyl dopa of the present invention, as the substrate compound, either DOPA or tyrosine or a mixture thereof may be used, but DOPA is preferred. DOPA is L-form (3- (3,4-dihydroxyphenyl) -L-alanine) (hereinafter also referred to as “L-DOPA”) or D-form (3- (3,4-dihydroxyphenyl) -D-alanine. ). Among these, L-DOPA is preferably used from the viewpoint of obtaining natural cysteinyl dopa, and L-DOPA is also preferably used from the viewpoint of affinity for the enzyme. As for tyrosine, L-tyrosine is preferable.

なお、後述する酸化反応に使用する場合の基質化合物の濃度は、混合物中の濃度として通常1〜120 mM程度を挙げることができる。好ましくは5〜100 mM程度であり、更に好ましくは10〜80 mM程度である。システイニルドーパを製造する場合、上記範囲であれば、未反応の基質化合物の残存が少なく、十分量のシステイニルドーパを得ることができる。 In addition, the density | concentration of the substrate compound in the case of using for the oxidation reaction mentioned later can mention about 1-120 mM normally as a density | concentration in a mixture. Preferably it is about 5-100 mM, More preferably, it is about 10-80 mM. When producing cysteinyl dopa, the amount of cysteinyl dopa can be obtained with a small amount of unreacted substrate compound within the above range.

・システイン
システインは、L体又はD体のいずれであってもよい。中でも、天然型システイニルドーパが得られる点で、L-システインを用いることが好ましい。 -Cysteine cysteine may be either L-form or D-form. Of these, L-cysteine is preferably used in that natural cysteinyl dopa is obtained.

・酵素
本発明のシステイニルドーパを含むメラニン前駆体の製造方法に使用する酵素は、DOPA及び／又はチロシンを酸化する作用を有するものであればよい。具体的には、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素である。 Enzyme used in the production process of melanin precursors comprising cysteinyldopa enzymes present invention may as long as it has the effect of oxidizing DOPA and / or tyrosine. Specifically, it is an enzyme having catechol oxidase activity.

ここでカテコールオキシダーゼ活性とは、カテコールの酸化によるｏ−キノンの生成を触媒する活性をいい、かかるカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素としては、モノフェノールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、ｏ−ジフェノラーゼ、チロシナーゼ等が含まれる。 Here, the catechol oxidase activity refers to the activity of catalyzing the production of o-quinone by the oxidation of catechol. Examples of the enzyme having such catechol oxidase activity include monophenol oxidase, diphenol oxidase, o-diphenolase, and tyrosinase. It is.

システイニルドーパを製造する場合において、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素として、より好ましくはチロシナーゼを挙げることができる。チロシナーゼは、L-DOPAに対して親和性が高いため、これを基質化合物とすることで、天然型のシステイニルドーパを効率よく製造することができる。 In the case of producing cysteinyl dopa, tyrosinase is more preferable as an enzyme having catechol oxidase activity. Since tyrosinase has a high affinity for L-DOPA, natural cysteinyl dopa can be efficiently produced by using it as a substrate compound.

本発明で用いる酵素は、どのような生物に由来する酵素であってもよいが、特に、発現効率が良く、且つ宿主細胞内で安定であることから、糸状菌に由来する酵素が好ましい。より好ましくは糸状菌に由来するチロシナーゼである。 The enzyme used in the present invention may be an enzyme derived from any organism, but an enzyme derived from a filamentous fungus is particularly preferable because of its high expression efficiency and stability in the host cell. More preferred is tyrosinase derived from filamentous fungi.

かかる糸状菌としては、アスペルギルス(Aspergillus)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、リゾムコール(Rhizomucor)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ペニシリウム(Penicillium)属等が挙げられる。中でも、熱に対して比較的安定であり、且つ安全性が確かめられている点で、アスペルギルス属糸状菌のチロシナーゼが好ましく、具体的には、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)のmelB遺伝子（特開2002-191366号公報）、melD遺伝子(特開2004-201545号公報)若しくはmelO遺伝子(Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells. Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14;1261(1):151-154)でコードされるチロシナーゼ又はかかるチロシナーゼと実質的に同一である酵素を挙げることができる。なお、上記チロシナーゼと「実質的に同一」とは、これらの遺伝子(melB遺伝子、melD遺伝子又はmelO遺伝子)によってコードされるチロシナーゼのアミノ酸配列と、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上が同一のアミノ酸配列を有し、且つカテコールオキシダーゼ活性、好ましくはチロシナーゼ活性を有している酵素をいう。特に好ましくは、melB遺伝子によってコードされるチロシナーゼである。このような酵素は、DOPAからドーパキノンへの反応収率が高く、効率的に酸化反応を行うことができるため、反応液中のDOPA残存量を低くすることができる。 Examples of such filamentous fungi include the genus Aspergillus, the genus Neurospora, the genus Rhizomucor, the genus Trichoderma, the genus Penicillium, and the like. Among them, tyrosinase of Aspergillus genus fungus is preferable because it is relatively stable against heat and has been confirmed to be safe. Specifically, melB gene of Aspergillus oryzae 2002-191366), melD gene (JP 2004-201545) or melO gene (Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells.Biochim Biophys Acta. Mention may be made of the tyrosinase encoded in 1995 Mar 14; 1261 (1): 151-154) or an enzyme substantially identical to such tyrosinase. Note that `` substantially identical '' to the above tyrosinase means that the amino acid sequence of tyrosinase encoded by these genes (melB gene, melD gene or melO gene) is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more refers to an enzyme having the same amino acid sequence and having catechol oxidase activity, preferably tyrosinase activity. Particularly preferred is tyrosinase encoded by the melB gene. Such an enzyme has a high reaction yield from DOPA to dopaquinone and can efficiently carry out an oxidation reaction, so that the residual amount of DOPA in the reaction solution can be reduced.

なお、上記酵素は、そのままの状態で反応に使用することができるが、酵素の安定性向上、使用後の分離の容易さ、反応系へのタンパク質混入の回避の点から、固定化酵素の形態で使用することもできる。酵素の固定化方法は特に限定されず、例えば、固定化担体により酵素分子間を架橋する方法、アルギン酸ゲルのようなゲルに内包させる方法等の公知の固定化方法が挙げられる。酵素は、生物由来の夾雑物を含む粗標品でもよく、精製酵素でもよいが、固定化する場合は精製されたものであることが望ましい。 The enzyme can be used in the reaction as it is, but the form of the immobilized enzyme is improved in terms of enzyme stability, ease of separation after use, and avoidance of protein contamination in the reaction system. Can also be used. The enzyme immobilization method is not particularly limited, and examples thereof include known immobilization methods such as a method of cross-linking enzyme molecules with an immobilization carrier and a method of encapsulating in a gel such as an alginate gel. The enzyme may be a crude sample containing contaminants derived from living organisms or a purified enzyme, but it is preferably purified when immobilized.

・微生物
本発明の製造方法には、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素に代えて上記酵素を含有する微生物を使用することもできる。 -Microorganism In the production method of the present invention, a microorganism containing the above enzyme can be used instead of the enzyme having catechol oxidase activity.

本発明で使用される微生物は、少なくともカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素、好ましくはチロシナーゼを含有するものであればよく、この限りにおいて特に制限されない。すなわち、 (a)本来的に「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」を産生し得る微生物であってもよいし、また、(b)「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」を産生し得る能力が外来的に付与された微生物であってもよい。さらに、(c)内在性又は外来性の別を問わず、「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」活性を高める処理が施された微生物であってもよい。好ましくは(b)又は(c)の微生物である。 The microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it contains at least an enzyme having catechol oxidase activity, preferably tyrosinase. That is, the microorganism may be (a) inherently capable of producing an “enzyme having a catechol oxidase activity”, or (b) the ability to produce an “enzyme having a catechol oxidase activity” is exogenous. It may be a given microorganism. Further, (c) a microorganism that has been subjected to a treatment for enhancing the “enzyme having catechol oxidase activity” activity, whether endogenous or exogenous. The microorganism (b) or (c) is preferred.

かかる微生物としては、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌(アスペルギルス・オリゼを含む)等を挙げることができる。微生物としては、好ましくは大腸菌、枯草菌、及び酵母である。中でも、安全で、更に単細胞であり、且つ細胞の沈降速度が速いため、比較的低速回転の遠心分離で反応後の細胞を分離できる点で、酵母を用いることが更に好ましい。酵母の中でも、特に、菌体が堅牢であるために菌体由来のタンパク質の反応液中への流出が抑えられ、且つ遺伝子操作が容易である点で、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)が好ましい。サッカロミセス・セレビシェは、実験室株(実験室酵母)でもよいし、実用株(実用酵母)でもよいが、実用酵母が好ましい。より好ましくは、実用酵母の一種である、清酒醸造用酵母が好ましく、「きょうかい酵母」がより好ましい。また、サッカロミセス・セレビシェの倍数体に特に制限はないが、2倍体が好ましい。 Examples of such microorganisms include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, filamentous fungi (including Aspergillus oryzae) and the like. The microorganism is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, or yeast. Among them, it is more preferable to use yeast because it is safe, is a single cell, and has a high sedimentation rate, so that the cells after reaction can be separated by centrifugal separation at a relatively low speed. Among the yeasts, Saccharomyces cerevisiae is particularly preferable in that the bacterial cells are robust, so that the outflow of proteins derived from the bacterial cells into the reaction solution is suppressed and the genetic manipulation is easy. The Saccharomyces cerevisiae may be a laboratory strain (laboratory yeast) or a practical strain (practical yeast), but a practical yeast is preferred. More preferably, sake yeast is a kind of practical yeast, and “Kyokai yeast” is more preferable. The polyploid of Saccharomyces cerevisiae is not particularly limited, but a diploid is preferable.

(b)の微生物は、例えば、タンパク質の大量発現用に通常用いられているベクターに「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」をコードする遺伝子をクローニングし、当該ベクターを宿主細胞に導入することによって調製することができ、かくして上記遺伝子を宿主染色体に組み込むか、又はこれをプラスミド状態で有する微生物を取得することができる。 The microorganism (b) is prepared, for example, by cloning a gene encoding an “enzyme having catechol oxidase activity” into a vector usually used for mass expression of proteins and introducing the vector into a host cell. Thus, a microorganism having the above gene integrated into the host chromosome or having it in a plasmid state can be obtained.

上記(c)の微生物としては下記の微生物を挙げることができる：
(c-1)「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」遺伝子を本来発現させているプロモーターよりも高活性のプロモーターの下でこの遺伝子を発現させている微生物。
(c-2)「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」遺伝子を複数コピー有する微生物。
(c-3)「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」遺伝子の変異体を有することにより高い酵素活性(好ましくはチロシナーゼ活性)を示す微生物。 Examples of the microorganism (c) include the following microorganisms:
(c-1) A microorganism that expresses this gene under a promoter that is more active than the promoter that originally expresses the “enzyme having catechol oxidase activity” gene.
(c-2) A microorganism having a plurality of copies of an “enzyme having catechol oxidase activity” gene.
(c-3) A microorganism exhibiting high enzyme activity (preferably tyrosinase activity) by having a mutant of the “enzyme having catechol oxidase activity” gene.

(c-1)で使用される高活性のプロモーターとしては、制限されないが、宿主として酵母を用いる場合は、例えば、SED1プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、TDH1プロモーター、PHO5プロモーター、GAL4プロモーター、GAL10プロモーター、CUP1プロモーターなどが挙げられる。中でも、SED1プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、及びGAPDHプロモーターが好ましく、SED1プロモーターがより好ましい。宿主として大腸菌を用いる場合は、例えば、T7、lacUV5、tac、λPL、lac、trpなどのプロモーターが挙げられる。宿主として枯草菌を用いる場合は、例えば、枯草菌由来のプロテアーゼ・アミラーゼ等の加水分解酵素、シグマ因子、解糖系等の遺伝子プロモーター、枯草菌でも機能する大腸菌由来プロモーターなど、公知のプロモーターを利用することができる。宿主として糸状菌を用いる場合は、アミラーゼ、プロテアーゼ、ヒストン、解糖系、活性酸素を分解する酵素(カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼなど)などの遺伝子のプロモーターが好ましく、アスペルギルス・オリゼでは、前述に付け加え、amyA、amyB、hly、sodMプロモーター等が好ましい。 The highly active promoter used in (c-1) is not limited, but when yeast is used as the host, for example, SED1 promoter, ADH1 promoter, PGK promoter, GAPDH promoter, TDH1 promoter, PHO5 promoter, GAL4 promoter , GAL10 promoter, CUP1 promoter and the like. Among these, the SED1 promoter, ADH1 promoter, PGK promoter, and GAPDH promoter are preferable, and the SED1 promoter is more preferable. When Escherichia coli is used as the host, for example, promoters such as T7, lacUV5, tac, λPL, lac, trp and the like can be mentioned. When Bacillus subtilis is used as a host, for example, a known promoter such as a hydrolase such as a protease or amylase derived from Bacillus subtilis, a gene promoter such as a sigma factor or a glycolytic system, or a promoter derived from Escherichia coli that also functions in Bacillus subtilis is used. can do. When using a filamentous fungus as a host, a promoter of a gene such as amylase, protease, histone, glycolysis, enzyme that degrades active oxygen (catalase, superoxide dismutase, etc.) is preferable.In Aspergillus oryzae, in addition to the above, The amyA, amyB, hly, sodM promoter and the like are preferable.

(c-2)の微生物は、例えば「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」遺伝子を複数コピー保持する可能性のある2倍体以上の細胞に「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」遺伝子を導入することによって調製することができる。また、例えば、醸造用酵母やパン酵母等の実用酵母の中には、3倍体や4倍体の細胞も存在するため、これらも好適に使用できる。このようにして、微生物に導入する「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」遺伝子のコピー数を多くすることにより、より高いカテコールオキシダーゼ活性(好ましくはチロシナーゼ活性)を有する微生物とすることができる。このような微生物の製造方法としては、例えば、特開2011-45301号公報を参照することができる。 The microorganism (c-2) is prepared, for example, by introducing an “enzyme having catechol oxidase activity” gene into a diploid cell or more that may hold multiple copies of the “enzyme having catechol oxidase activity” gene. can do. In addition, for example, among practical yeasts such as brewing yeast and baker's yeast, there are triploid and tetraploid cells, and these can be suitably used. Thus, by increasing the copy number of the “enzyme having catechol oxidase activity” gene introduced into the microorganism, a microorganism having higher catechol oxidase activity (preferably tyrosinase activity) can be obtained. As such a microorganism production method, for example, JP-A-2011-45301 can be referred to.

(c-3)の微生物としては、「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」遺伝子の変異により、カテコールオキシダーゼ活性(好ましくはチロシナーゼ活性)が高くなった微生物、又はこのような変異「カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素」遺伝子を導入した微生物を使用することができる。このようにして、天然型酵素より高い活性を示す変異型酵素とすることにより、高いカテコールオキシダーゼ活性、好ましくは高いチロシナーゼ活性を示す微生物とすることができる。 Examples of the microorganism (c-3) include microorganisms having increased catechol oxidase activity (preferably tyrosinase activity) due to mutation of the “enzyme having catechol oxidase activity” gene, or such mutant “enzyme having catechol oxidase activity” A microorganism into which a gene has been introduced can be used. In this way, a mutated enzyme exhibiting higher activity than the natural enzyme can be used to obtain a microorganism exhibiting high catechol oxidase activity, preferably high tyrosinase activity.

なお、本発明では、液体培養で得られる上記微生物の培養液を水、好ましくはイオン交換水で洗浄して調製した微生物懸濁液を使用することもできる。かかる微生物懸濁液は、例えば次の手順(1)〜(4)により調製することができる。
(1)微生物を常法により液体培養した後、培養液を遠心分離して培地を除去する。
(2)この微生物を水に懸濁して遠心分離し、上清を除去する。
(3)(2)の工程を繰り返すことにより、微生物を洗浄する。
(4)(3)で得られた微生物を水に懸濁したものを微生物懸濁液とする。 In the present invention, a microorganism suspension prepared by washing the above-mentioned microorganism culture solution obtained by liquid culture with water, preferably ion-exchanged water, can also be used. Such a microorganism suspension can be prepared, for example, by the following procedures (1) to (4).
(1) After culturing the microorganisms in a conventional manner, the culture solution is centrifuged to remove the medium.
(2) Suspend this microorganism in water and centrifuge to remove the supernatant.
(3) The microorganisms are washed by repeating the step (2).
(4) A microorganism suspension obtained by suspending the microorganism obtained in (3) in water is used.

このように微生物を洗浄することにより、培養液からの不純物の混入を減少させることができる。なお、上記(1)〜(3)の手順では、遠心分離に代えて、精密ろ過処理、限外ろ過処理等で代替してもよい。また、上記(3)の手順においては、活性炭を併用してもよく、例えば活性炭ビーズなどを用いてもよい。 By washing the microorganisms in this way, the contamination of impurities from the culture solution can be reduced. In the above procedures (1) to (3), instead of centrifugation, a microfiltration process, an ultrafiltration process, or the like may be substituted. In the procedure (3), activated carbon may be used in combination, for example, activated carbon beads.

なお、微生物は、例えば、担体結合法、包括法、架橋法、光架橋法などのような公知の方法で固定化したものを用いることができ、これにより微生物を効率よく利用し、使用後は容易に反応系から分離することが可能となる。 As the microorganism, for example, a microorganism immobilized by a known method such as a carrier binding method, a comprehensive method, a crosslinking method, a photocrosslinking method, etc. can be used. It can be easily separated from the reaction system.

・酵素又は微生物の活性化処理
なお、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素、特にチロシナーゼが活性を示すためには、触媒活性中心に2価銅イオンが配位することが必要である。このため、メラニン前駆体の製造に、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素、又は当該酵素を含有する微生物のいずれを用いる場合でも、これらの酵素又は微生物を、予め2価銅イオンで処理することにより、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素の触媒活性中心に2価銅イオンを配位させることが好ましい。かかる方法として、具体的には、酵素又は微生物を0.1〜２mM程度の硫酸銅溶液等に懸濁し、30〜40℃程度で0.01〜2時間程度静置する方法を挙げることができる。また、チロシナーゼとしては、活性化補助タンパクを同時発現生産するか、あるいは前記タンパク質を添加しなくてよいチロシナーゼが好ましい。 Enzyme or microorganism activation treatment In order for an enzyme having catechol oxidase activity, particularly tyrosinase to exhibit activity, it is necessary to coordinate a divalent copper ion to the catalytic activity center. For this reason, in the case of using either an enzyme having catechol oxidase activity or a microorganism containing the enzyme for the production of the melanin precursor, catechol can be obtained by treating these enzymes or microorganisms with divalent copper ions in advance. It is preferable to coordinate a divalent copper ion to the catalytic activity center of an enzyme having oxidase activity. Specific examples of such a method include a method in which an enzyme or microorganism is suspended in a copper sulfate solution of about 0.1 to 2 mM and allowed to stand at about 30 to 40 ° C. for about 0.01 to 2 hours. Moreover, as tyrosinase, tyrosinase which co-expresses and produces an activation auxiliary protein or does not need to add the protein is preferable.

また、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素活性を示す酵素の中でもチロシナーゼ、特にアスペルギルス・オリゼ由来のチロシナーゼは、pH 2.8〜3.2程度の酸性溶液で処理することにより、成熟化し、活性化する。したがって、チロシナーゼ又は当該酵素を含有する微生物を用いる場合も、例えば、20〜200 mM程度の酢酸ナトリウム緩衝溶液(pH 3)に懸濁し、0〜40℃程度で0.5〜1時間程度静置することが好ましい。また、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素は、トリプシン等の特定のペプチド結合を選択的に切断するエンドペプチダーゼのようなプロテアーゼで処理することによっても活性化することができる。 In addition, among the enzymes having catechol oxidase activity, tyrosinase, particularly tyrosinase derived from Aspergillus oryzae, is matured and activated by treatment with an acidic solution having a pH of about 2.8 to 3.2. Therefore, when using tyrosinase or a microorganism containing the enzyme, for example, suspend it in a sodium acetate buffer solution (pH 3) of about 20 to 200 mM and leave it at 0 to 40 ° C. for about 0.5 to 1 hour. Is preferred. An enzyme having catechol oxidase activity can also be activated by treatment with a protease such as endopeptidase that selectively cleaves a specific peptide bond such as trypsin.

なお、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素を含有する微生物を用いる場合は、必ずしも上記活性化処理の前に予め微生物に対して細胞障害処理を施す必要はないが、微生物に対して細胞障害処理を施したほうがよい。細胞障害処理を施した場合、生存率を91%以下、好ましくは70%以下に低下しておくことがより好ましい。活性化処理前にかかる細胞障害処理を施して生存率を低下しておくことで、より高い酸化酵素活性を有する微生物を調製することができる。また、細胞障害処理によって狭雑物が生じるが、上記高い酸化酵素活性を有する微生物をそのまま酸化反応に用いてもよいが、遠心分離、ろ過処理等で狭雑物を除くことが好ましい。このような細胞障害処理は、特開2011-45302号公報の記載に従い実施することができる。 In addition, when using a microorganism containing an enzyme having catechol oxidase activity, it is not always necessary to subject the microorganism to cell damage treatment before the activation treatment, but the microorganism has been subjected to cell damage treatment. Better. When cell damage treatment is performed, it is more preferable that the survival rate is reduced to 91% or less, preferably 70% or less. A microorganism having higher oxidase activity can be prepared by reducing the survival rate by performing such a cell damage treatment before the activation treatment. In addition, although impurities are generated by the cell damage treatment, the microorganism having the high oxidase activity may be used for the oxidation reaction as it is, but it is preferable to remove the impurities by centrifugation, filtration treatment or the like. Such cell damage treatment can be performed according to the description in JP-A-2011-45302.

後述する酸化反応に基質化合物として1 molのL-DOPAを用いる場合、カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物の割合は、通常5×10⁵ U/mol以上、好ましくは5×10⁶ U/mol以上、より好ましくは5×10⁶〜5×10⁷ U/molである。また、基質化合物として同様にL-DOPAを用いる場合、通常0.1 U/OD₆₀₀以上、好ましくは0.5 U/OD₆₀₀以上、特に好ましくは1〜5 U/OD₆₀₀となる割合でカテコールオキシダーゼ活性を有する微生物(好ましくは大腸菌又は酵母、より好ましくは酵母)を用いる。 When 1 mol of L-DOPA is used as a substrate compound for the oxidation reaction described later, the ratio of an enzyme having catechol oxidase activity or a microorganism producing the enzyme is usually 5 × 10 ⁵ U / mol or more, preferably 5 × 10 ⁶ U / mol or more, more preferably 5 × 10 ^{6 to} 5 × 10 ⁷ U / mol. Similarly, when L-DOPA is used as a substrate compound, it usually has a catechol oxidase activity at a ratio of 0.1 U / OD ₆₀₀ or more, preferably 0.5 U / OD ₆₀₀ or more, particularly preferably 1 to 5 U / OD _600. A microorganism (preferably Escherichia coli or yeast, more preferably yeast) is used.

なお、上記のカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素の活性は、酵素又は微生物と0.8μmolのDOPAを含む溶液１mLを30℃で5分間反応させた場合の475 nmにおける吸光度を1増加させる活性を1Uとする。また、微生物のカテコールオキシダーゼ活性は、これを反応に用いた菌体の密度(600 nmにおける吸光度；OD₆₀₀)で除したもの(U/OD₆₀₀)とする。 In addition, the activity of the above-mentioned enzyme having catechol oxidase activity is defined as 1U which increases the absorbance at 475 nm by 1 when 1 mL of a solution containing 0.8 μmol of DOPA and an enzyme or microorganism is reacted at 30 ° C. for 5 minutes. . In addition, the catechol oxidase activity of the microorganism is defined by dividing this by the density of the cells used in the reaction (absorbance at 600 nm; OD ₆₀₀ ) (U / OD ₆₀₀ ).

・酸化反応
カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素又は当該酵素を含有する微生物、システイン、並びにDOPA及び／又はチロシンを含む混合物中のDOPA及び／又はチロシンとシステインとのモル比(DOPA及び／又はチロシン：システイン)は、1：0.5〜4の範囲が使用できる。中でも、当該モル比は、1：1.0〜3が好ましく、1：1.0〜2.0がより好ましく、1：1.25〜1.5が更により好ましい。その他、1：1.25〜4、1：1.25〜3、1：1.25〜2.0等が挙げられる。この範囲のモル比を使用することにより、DOPA及び／又はチロシンをシステイニルドーパに高変換することができる。また、DOPA及び／又はチロシン1モルに対するシステインのモル比が1.0〜1.20の場合には、酸素供給を制限した条件下で、pH制御が不要且つ発泡せずにシステイニルドーパの蓄積が可能であり、モル比が1.25以上の場合には、酸素供給方法を制限せずとも、pH制御が不要且つ発泡せずにシステイニルドーパの蓄積が可能である。 -Molar ratio of DOPA and / or tyrosine to cysteine in a mixture containing an enzyme having oxidation reaction catechol oxidase activity or a microorganism containing the enzyme, cysteine, and DOPA and / or tyrosine (DOPA and / or tyrosine: cysteine) The range of 1: 0.5-4 can be used. Among these, the molar ratio is preferably 1: 1.0 to 3, more preferably 1: 1.0 to 2.0, and still more preferably 1: 1.25 to 1.5. In addition, 1: 1.25-4, 1: 1.25-3, 1: 1.25-2.0 etc. are mentioned. By using a molar ratio in this range, DOPA and / or tyrosine can be highly converted to cysteinyl dopa. In addition, when the molar ratio of cysteine to 1 mol of DOPA and / or tyrosine is 1.0 to 1.20, it is possible to accumulate cysteinyl dopa without the need for pH control and without foaming under conditions where oxygen supply is limited. When the molar ratio is 1.25 or more, it is possible to accumulate cysteinyl dopa without foaming without pH control without limiting the oxygen supply method.

本発明では、混合物中に配合するDOPA及び／又はチロシンとシステインのモル比を調整することにより、生成されるシステイニルドーパとユウメラニン前駆体の割合を調整することができる。DOPA及び／又はチロシン 1モルに対するシステインのモル比が1.25以上であれば、ほぼ全てシステイニルドーパに変換されるが、モル比が1より低ければ一部ユウメラニン前駆体が形成する反応に進む。結果として、得られた組成物の重合後の色の変更は、ユウメラニンとフェオメラニンとの割合を変えることに相当し、「黒色又は褐色」から「赤色又は黄色」までの色を自在に調整できる。 In the present invention, the ratio of cysteinyl dopa and eumelanin precursor to be produced can be adjusted by adjusting the molar ratio of DOPA and / or tyrosine and cysteine blended in the mixture. If the molar ratio of cysteine to 1 mol of DOPA and / or tyrosine is 1.25 or more, almost all will be converted to cysteinyl dopa, but if the molar ratio is lower than 1, it will proceed to a reaction in which some eumelanin precursors are formed. . As a result, changing the color of the resulting composition after polymerization corresponds to changing the ratio of eumelanin and pheomelanin, and freely adjust the color from “black or brown” to “red or yellow” it can.

ここで、ユウメラニン前駆体としては、ユウメラニンの構成モノマー、例えば、ドーパクロム、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５，６−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン−２−カルボン酸、及びこれらのモノマーが2〜5分子程度重合してなる水溶性オリゴマーを挙げることができる。好ましくはドーパクロム、５，６−ジヒドロキシインドール、及び５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸である。 Here, as the eumelanin precursor, constituent monomers of eumelanin, such as dopachrome, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, 5,6-dihydroxyindole, 5,6-dihydroxyindoline, 5,6- Examples thereof include dihydroxyindoline-2-carboxylic acid and water-soluble oligomers obtained by polymerizing about 2 to 5 molecules of these monomers. Preferred are dopachrome, 5,6-dihydroxyindole, and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid.

なお、本発明では、前述するようにユウメラニン前駆体も同時に製造することが可能であり、システイニルドーパ以外が製造されることを排除するものではない。 In the present invention, as described above, a eumelanin precursor can also be produced at the same time, and it is not excluded that other than cysteinyl dopa is produced.

DOPA及び／又はチロシンがシステイニルドーパ又はユウメラニン前駆体に変換された割合を%(モル)とすると、システイニルドーパ及びユウメラニン前駆体が同時に20%以上生成する反応において、システイニルドーパ及びユウメラニン前駆体への合計の変換率は60%以上が好ましく、75%以上がより好ましく、90%以上が更により好ましく、95%以上が最も好ましい。 Assuming that the percentage of DOPA and / or tyrosine converted to cysteinyl dopa or eumelanin precursor is% (mole), cysteinyl in a reaction in which 20% or more of cysteinyl dopa and eumelanin precursor are produced simultaneously. The total conversion to dopa and eumelanin precursor is preferably 60% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.

また、システイニルドーパが主として生成する反応においては、生成物中の各成分のモル濃度は、ユウメラニン前駆体：10%以下、システイニルドーパ及びシステイニルドーパが更に酸化されたもの：50%以上であることが好ましく、ユウメラニン前駆体：5%以下、システイニルドーパ及びシステイニルドーパが更に酸化されたもの：75%以上であることがより好ましく、ユウメラニン前駆体：1%以下、システイニルドーパ及びシステイニルドーパが更に酸化されたもの：90%以上であることが更により好ましく、ユウメラニン前駆体：1%以下、システイニルドーパ及びシステイニルドーパが更に酸化されたもの：95%以上であることが最も好ましい。 Further, in the reaction in which cysteinyl dopa is mainly produced, the molar concentration of each component in the product is as follows: eumelanin precursor: 10% or less, cysteinyl dopa and cysteinyl dopa further oxidized: 50% or more, eumelanin precursor: 5% or less, cysteinyl dopa and cysteinyl dopa further oxidized: more preferably 75% or more, eumelanin precursor: 1 % Or less, cysteinyl dopa and cysteinyl dopa further oxidized: more preferably 90% or more, eumelanin precursor: 1% or less, cysteinyl dopa and cysteinyl dopa further Oxidized one: Most preferably 95% or more.

なお、当該酵素酸化反応において、混合物は、基質化合物が溶解してなるものでもよいが、非溶解状態で含まれていることが好ましい。これは、高濃度の基質化合物を混合物に完全に溶解するためには、強酸を用いて反応液のpHを1〜3に調整しなくてはならず、この場合、酵素反応前に再び強アルカリを用いて中和する必要があるからである。また、この場合、必然的に反応液中に無機塩類の含有量が増加することになり、これが生成されるシステイニルドーパの夾雑物となる。また、反応液の調製に用いる水は、特に制限されないが、イオン交換水を用いることが好ましい。イオン交換水を用いることで、前述する混合物中の無機塩類の含有量をさらに減少させることができ、生成されるシステイニルドーパの夾雑物をより低減することができる。 In the enzyme oxidation reaction, the mixture may be obtained by dissolving the substrate compound, but is preferably contained in an undissolved state. In order to completely dissolve a high concentration of the substrate compound in the mixture, the pH of the reaction solution must be adjusted to 1 to 3 using a strong acid. It is because it is necessary to neutralize using. Further, in this case, the content of inorganic salts is inevitably increased in the reaction solution, and this is a contaminant of cysteinyl dopa produced. The water used for preparing the reaction solution is not particularly limited, but ion-exchanged water is preferably used. By using ion-exchanged water, the content of inorganic salts in the above-described mixture can be further reduced, and impurities of cysteinyl dopa produced can be further reduced.

上記混合物のpHは、酵素がDOPA及び／又はチロシンの酸化反応を触媒できる範囲であれば特に限定されないが、通常4〜9程度に維持することが好ましく、5〜7程度に維持することがより好ましい。上記範囲であれば、フェオメラニンの生成を抑えて混合物中に効率よくシステイニルドーパを蓄積させることができる。 The pH of the mixture is not particularly limited as long as the enzyme can catalyze the oxidation reaction of DOPA and / or tyrosine, but it is usually preferably maintained at about 4 to 9, more preferably about 5 to 7. preferable. If it is the said range, the production | generation of pheomelanin can be suppressed and cysteinyl dopa can be efficiently accumulate | stored in a mixture.

混合物のpHは、緩衝液を用いることにより上記範囲に維持することもできるが、塩濃度が高いと反応後の溶液保管中に塩析するため、添加量が少ないことが好ましい。更に、KOH、NaOH、アンモニアのような強アルカリは、システイニルドーパを反応させ、結果的に重合したフェオメラニンとさせてしまうため、添加量が少ないことが好ましい。また、硫酸・塩酸等の強酸は、生成したシステイニルドーパを減少させるため、添加量が少ないことが好ましい。しかしながら、本発明の方法では、メラニン前駆体の製造とは異なりpHの変動が少ないので、pHの制御をほとんど行わなくてもよい。 The pH of the mixture can be maintained in the above range by using a buffer solution. However, if the salt concentration is high, salting out occurs during storage of the solution after the reaction, so that the addition amount is preferably small. Furthermore, since strong alkalis such as KOH, NaOH, and ammonia cause cysteinyl dopa to react with each other, resulting in polymerized pheomelanin, it is preferable that the addition amount be small. Further, a strong acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid is preferably added in a small amount in order to reduce the produced cysteinyl dopa. However, in the method of the present invention, unlike the production of the melanin precursor, there is little change in pH, and therefore, it is unnecessary to control the pH.

微生物の添加量は任意であるが、微生物湿重量は混合物量の50重量%以下が好ましく、25重量%以下がより好ましく、10重量%以下が更に好ましく、5重量%以下が更により好ましい。この範囲であれば、反応後の菌体分離を容易に行えることにより、システイニルドーパの収率を高くすることができる。 The amount of microorganisms to be added is arbitrary, but the wet weight of microorganisms is preferably 50% by weight or less, more preferably 25% by weight or less, still more preferably 10% by weight or less, and still more preferably 5% by weight or less. Within this range, the yield of cysteinyl dopa can be increased by easily separating the cells after the reaction.

反応温度は、酵素が基質化合物の酸化反応を触媒できる範囲であれば特に限定されないが、通常5〜35℃程度に維持することが好ましく、15〜25℃程度に維持することがより好ましい。上記範囲内であれば、十分に酸化反応が進行するとともに、酵素が失活し難い。 The reaction temperature is not particularly limited as long as the enzyme can catalyze the oxidation reaction of the substrate compound, but it is usually preferably maintained at about 5 to 35 ° C, more preferably about 15 to 25 ° C. If it is in the said range, an oxidation reaction will fully advance and an enzyme is hard to deactivate.

反応開始直後は、酸化反応に大量の酸素が必要であるため、大量に酸素を供給することが好ましい。本発明において、供給するのは空気、純度が90%以上の酸素(高純度酸素)、又は純度100%の酸素(純酸素)であってもよい。酸素の供給方法は、特に制限されず、混合物を攪拌することで混合物に酸素を取り込む方法、及び混合物に酸素を積極的に通気する方法、及びこれらを併用する方法を挙げることができる。ただし、攪拌速度が速すぎると微生物が損傷するため、混合物中の酸素濃度を監視し、酸素濃度が低下しなくなれば通気量及び攪拌速度を減少することが好ましい。混合物中の溶存酸素濃度は0.1〜8 ppm程度に維持することが好ましく、1〜2 ppm程度に維持することがより好ましい。システイニルドーパの生成後は、速やかに混合物中の溶存酸素濃度は0〜1 ppm程度に低下させることが好ましい。 Immediately after the start of the reaction, a large amount of oxygen is required for the oxidation reaction, so it is preferable to supply a large amount of oxygen. In the present invention, the supply may be air, oxygen having a purity of 90% or more (high purity oxygen), or oxygen having a purity of 100% (pure oxygen). The method for supplying oxygen is not particularly limited, and examples thereof include a method of incorporating oxygen into the mixture by stirring the mixture, a method of actively ventilating oxygen into the mixture, and a method of using these in combination. However, if the stirring speed is too high, microorganisms are damaged. Therefore, it is preferable to monitor the oxygen concentration in the mixture and reduce the aeration rate and stirring speed if the oxygen concentration does not decrease. The dissolved oxygen concentration in the mixture is preferably maintained at about 0.1 to 8 ppm, more preferably about 1 to 2 ppm. After the production of cysteinyl dopa, it is preferable to quickly reduce the dissolved oxygen concentration in the mixture to about 0 to 1 ppm.

通気や撹拌により混合物中に泡が生じる場合は、シリコーン樹脂のような消泡剤を添加してもよいが、本発明では、空気を通気してもほとんど発泡しないため、発泡の影響を無視でき、反応槽容積を有効に利用することができる。本発明では、特開2011-45307号公報に記載されているような特殊な処理を行わなくても、ほとんど発泡しない。また、消泡剤を添加しないことにより、発泡性型の染毛剤への応用も容易になる。また、本発明では、通気をしてもほとんど発泡しないため、例えば混合物中に窒素・希ガスなどを通気し、溶存酸素濃度を速やかに低下させる制御も、より容易にできる。反応開始後あるいは反応終了後の反応液の性質は特に限定されないが、通気撹拌時に生じた気泡が消泡剤を添加せずに5分以内に消泡することが好ましく、2分以内に消泡することがより好ましい。 If bubbles are generated in the mixture by aeration or stirring, an antifoaming agent such as a silicone resin may be added. However, in the present invention, even if air is ventilated, foaming hardly occurs, so the influence of foaming can be ignored. The reaction tank volume can be used effectively. In the present invention, foaming hardly occurs even without performing special treatment as described in JP-A-2011-45307. Moreover, by not adding an antifoaming agent, application to a foaming type hair dye becomes easy. Further, in the present invention, since foaming hardly occurs even if aeration is performed, for example, it is possible to more easily control nitrogen gas or a rare gas or the like in the mixture to rapidly reduce the dissolved oxygen concentration. The nature of the reaction solution after the start of the reaction or after the end of the reaction is not particularly limited, but it is preferable that the bubbles generated during aeration and stirring are defoamed within 5 minutes without adding an antifoaming agent, and defoamed within 2 minutes. More preferably.

反応槽に仕込む混合物の量として、通常70容量%以上、好ましくは80容量%以上、より好ましくは90容量%以上に設定することができる。 The amount of the mixture charged into the reaction vessel can be usually set to 70% by volume or more, preferably 80% by volume or more, more preferably 90% by volume or more.

反応は、バッチ式又は連続式の何れであってもよい。未反応の基質化合物と生成物を分離できる点でバッチ式が好ましい。バッチ式の場合の反応時間は、通常10分〜3時間程度とするのが好ましく、30分〜1時間程度とするのがより好ましい。この程度であれば、基質化合物を十分システイニルドーパに変換できる。 The reaction may be either batch type or continuous type. The batch method is preferable in that an unreacted substrate compound and a product can be separated. In the case of the batch system, the reaction time is usually preferably about 10 minutes to 3 hours, more preferably about 30 minutes to 1 hour. At this level, the substrate compound can be sufficiently converted to cysteinyl dopa.

本発明では、反応系におけるO₂吸収量、又は混合物中の溶存酸素量のみを連続的に測定することで、測定値の経時変化の傾向により反応終点を簡便に特定できる。 In the present invention, by continuously measuring only the amount of O ₂ absorbed in the reaction system or the amount of dissolved oxygen in the mixture, the reaction end point can be easily identified by the tendency of the measured value to change over time.

・回収工程
本発明のシステイニルドーパの製造方法は、更に以下の工程(2)を含んでいてもよい。
(2)工程(1)で得られたシステイニルドーパを反応液から回収する工程。 Recovery step The method for producing cysteinyl dopa of the present invention may further include the following step (2).
(2) A step of recovering the cysteinyl dopa obtained in the step (1) from the reaction solution.

上記工程(1)で生成されたシステイニルドーパを含む反応液(Cys-DOPA含有溶液)には、システイニルドーパ(及びユウメラニン前駆体)の他に、使用した酵素又は微生物、更には通気及び撹拌により細胞が破損して生じた又は細胞から流出したタンパク質なども含まれる。したがって、必要に応じて、Cys-DOPA含有溶液からシステイニルドーパ(及びユウメラニン前駆体)以外の成分を除去してもよい。例えば、酵素や微生物細胞の除去は、限外ろ過等のろ過、遠心分離等の手段により行うことができる。また、タンパク質やアミノ酸、無機塩類、メラニン等の除去は、限外ろ過、イオン交換処理、逆浸透膜処理、ゲルろ過クロマトグラフィー等の手段により行うことができる。 In the reaction solution (Cys-DOPA-containing solution) containing cysteinyl dopa produced in the above step (1), in addition to cysteinyl dopa (and eumelanin precursor), the enzyme or microorganism used, and further Also included are proteins that are generated by rupturing or agitating cells by aeration and agitation. Therefore, components other than cysteinyl dopa (and eumelanin precursor) may be removed from the Cys-DOPA-containing solution as necessary. For example, the removal of enzymes and microbial cells can be performed by means such as ultrafiltration and centrifugation. The removal of proteins, amino acids, inorganic salts, melanin and the like can be performed by means such as ultrafiltration, ion exchange treatment, reverse osmosis membrane treatment, gel filtration chromatography and the like.

また、本発明で得られたCys-DOPA含有溶液は、発泡性が低いため、減圧濃縮などの阻害をしない。そのため、ユウメラニン前駆体よりもより短時間で濃縮できるばかりでなく、より高濃度での濃縮が可能となる。システイニルドーパの濃縮後の濃度は、好ましくは1重量%以上、より好ましくは5重量%以上、更に好ましくは15重量%以上である。濃縮後の濃度の上限は、何ら制限はないが、回収率との兼ね合いから、50重量%以下が好ましく、40%重量以下がより好ましく、30重量%以下が更に好ましい。 In addition, the Cys-DOPA-containing solution obtained in the present invention has low foaming properties, and therefore does not inhibit concentration under reduced pressure. Therefore, not only can it be concentrated in a shorter time than the eumelanin precursor, but also it can be concentrated at a higher concentration. The concentration of cysteinyl dopa after concentration is preferably 1% by weight or more, more preferably 5% by weight or more, and still more preferably 15% by weight or more. The upper limit of the concentration after concentration is not limited at all, but is preferably 50% by weight or less, more preferably 40% by weight or less, and still more preferably 30% by weight or less in view of the recovery rate.

また、上記Cys-DOPA含有溶液は、更に必要に応じて、スプレードライ、凍結乾燥等の公知の方法で乾燥することで、乾燥状態(乾燥粉末)に調製することもできる。また、上記Cys-DOPA含有溶液の保管は、そのまま又は濃縮後に行う。粉末を含む固相状態で保存するときは、気相部分を酸素以外の不活性化ガスである、窒素・二酸化炭素・希ガスなどで置換すれば、より長期間保存できる。また、溶液を含む液相で保存する場合、含まれる気相の置換だけでなく、液相に含まれる酸素を窒素・希ガスなどで置換あるいは減少させることで、より長期間保存できる。これにより、システイニルドーパ(及びユウメラニン前駆体)の酸化の進行を抑えることができ、所望の組成のシステイニルドーパ(及びユウメラニン前駆体)とすることができる。 In addition, the Cys-DOPA-containing solution can be prepared in a dry state (dry powder) by further drying by a known method such as spray drying or freeze drying, if necessary. The Cys-DOPA-containing solution is stored as it is or after concentration. When storing in a solid state containing powder, it can be stored for a longer period of time by replacing the gas phase part with an inert gas other than oxygen, such as nitrogen, carbon dioxide, or a rare gas. Further, in the case of storing in a liquid phase containing a solution, it can be stored for a longer period of time by replacing or reducing oxygen contained in the liquid phase with nitrogen / rare gas as well as replacing the gas phase contained therein. Thereby, the progress of oxidation of cysteinyl dopa (and eumelanin precursor) can be suppressed, and cysteinyl dopa (and eumelanin precursor) having a desired composition can be obtained.

溶液として保存する場合は、防腐を目的としてエタノール等の低級アルコールを添加することもできる。なお、この場合、エタノールの濃度が高いほど、高い防腐効果が得られる。なお、上記Cys-DOPA含有溶液には、本発明の効果が妨げられない限りにおいて、水及びエタノール以外の極性溶媒が添加されてもよい。かかる極性溶媒としては、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール等の炭素数1〜6の低級アルコール、アセトン等を挙げることができる。また、主成分がシステイニルドーパの場合は、無機塩類の析出がないことから、40重量%以上のエタノールを含む極性溶媒でも保存することが可能である。また、システイニルドーパは溶解度が高いことから、1重量%以上のエタノールを含む極性溶媒で保存できるが、より好ましくは防腐効果のある5〜20重量%のエタノールを含む極性溶媒での保存である。 When storing as a solution, a lower alcohol such as ethanol can be added for the purpose of preserving. In this case, the higher the ethanol concentration, the higher the antiseptic effect. Note that a polar solvent other than water and ethanol may be added to the Cys-DOPA-containing solution as long as the effects of the present invention are not hindered. Examples of such a polar solvent include lower alcohols having 1 to 6 carbon atoms such as methanol, propanol, butanol, and hexanol, and acetone. In addition, when the main component is cysteinyl dopa, since there is no precipitation of inorganic salts, it can be stored even in a polar solvent containing 40% by weight or more of ethanol. Since cysteinyl dopa has high solubility, it can be stored in a polar solvent containing 1% by weight or more of ethanol, but more preferably in a polar solvent containing 5 to 20% by weight of ethanol having an antiseptic effect. is there.

また、システイニルドーパを溶液で保管又は保存するときは、システイニルドーパの濃度は、通常0.1重量%以上、好ましくは1重量%以上、より好ましくは5重量%以上、更に好ましくは15重量%以上である。濃度の上限に限定はないが、50重量%以下が好ましく、40重量%以下がより好ましく、30重量%以下が更に好ましい。 When storing or preserving cysteinyl dopa as a solution, the concentration of cysteinyl dopa is usually 0.1% by weight or more, preferably 1% by weight or more, more preferably 5% by weight or more, and further preferably 15% by weight. % Or more. The upper limit of the concentration is not limited, but is preferably 50% by weight or less, more preferably 40% by weight or less, and still more preferably 30% by weight or less.

また、Cys-DOPA含有溶液は、塩化物イオン濃度が300 ppm以下になるように調整することが好ましい。塩化物イオン濃度を300 ppm以下にすることで、これを金属製の容器に収納した場合でも金属を腐食させる危険性を低下させることができる。塩化物イオン濃度は、好ましくは100 ppm以下、より好ましくは50 ppm以下、更に好ましくは20 ppm以下である。当該塩化物イオン濃度は、HPLC分析法により測定することができる。このような塩化物イオン濃度を得る手順としては、特開2011-46849号公報の記載を参考にすることができる。 The Cys-DOPA-containing solution is preferably adjusted so that the chloride ion concentration is 300 ppm or less. By setting the chloride ion concentration to 300 ppm or less, the risk of corroding the metal can be reduced even when it is housed in a metal container. The chloride ion concentration is preferably 100 ppm or less, more preferably 50 ppm or less, and still more preferably 20 ppm or less. The chloride ion concentration can be measured by HPLC analysis. As a procedure for obtaining such a chloride ion concentration, the description in JP-A-2011-46849 can be referred to.

＜フェオメラニンを含むメラニンの製造方法＞
本発明のフェオメラニンを含むメラニンの製造方法は、以下の工程(3)を含むことを特徴とする。
(3) 上記の製造方法により得られたシステイニルドーパを含むメラニン前駆体を、アルカリ条件下且つ酸素の存在下で処理して、フェオメラニンに変換する工程。 <Method for producing melanin including pheomelanin>
The method for producing melanin containing pheomelanin of the present invention is characterized by including the following step (3).
(3) A step of converting a melanin precursor containing cysteinyl dopa obtained by the above production method into pheomelanin by treating it under alkaline conditions and in the presence of oxygen.

システイニルドーパは、アルカリ条件と酸素の存在という2つの条件が揃うことで、効率良く下流の反応に進ませることが可能となる。 Cysteinyl dopa is able to efficiently proceed to the downstream reaction by satisfying two conditions of alkaline conditions and the presence of oxygen.

アルカリ条件下としては、好ましくはpH 7以上であり、より好ましくはpH 8以上であり、更に好ましくはpH 9以上ある。pHをアルカリ側に調整するには、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、グアニジン、アルカノールアミン、塩基性アミノ酸、炭酸塩等のアルカリ剤を用いることができる。アルカノールアミンの具体例としてはモノエタノールアミン等が挙げられ、塩基性アミノ酸の具体例としては、アルギニン、リジン、ヒスチジン等が挙げられ、炭酸塩の具体例としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸グアニジン、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。また、前記アルカリ剤と併用して、pHを調製する場合は、塩酸、硫酸、リン酸、クエン酸、乳酸等の無機あるいは有機酸を適宜用いることができる。前記pH調整剤は、2種以上を併用してもよく、またその含有量は、全組成の0.01〜20重量%、特に0.1〜10重量%が好ましい。 The alkaline conditions are preferably pH 7 or higher, more preferably pH 8 or higher, and still more preferably pH 9 or higher. In order to adjust the pH to the alkali side, for example, an alkali agent such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, guanidine, alkanolamine, basic amino acid, carbonate or the like can be used. Specific examples of alkanolamines include monoethanolamine and the like. Specific examples of basic amino acids include arginine, lysine and histidine. Specific examples of carbonates include sodium carbonate, potassium carbonate and guanidine carbonate. And sodium hydrogen carbonate. Moreover, when adjusting pH by using together with the said alkali agent, inorganic or organic acids, such as hydrochloric acid, a sulfuric acid, phosphoric acid, a citric acid, and lactic acid, can be used suitably. Two or more pH adjusters may be used in combination, and the content is preferably 0.01 to 20% by weight, particularly preferably 0.1 to 10% by weight, based on the total composition.

酸素の供給方法は、特に制限されず、Cys-DOPA含有溶液に酸素を積極的に通気する方法等を挙げることができる。本発明において、供給するのは空気、純度が90%以上の酸素(高純度酸素)、又は純度100%の酸素(純酸素)であってもよい。Cys-DOPA含有溶液中の溶存酸素濃度は0.1〜8 ppm程度とすることが好ましい。 The method for supplying oxygen is not particularly limited, and examples thereof include a method of actively ventilating oxygen through a Cys-DOPA-containing solution. In the present invention, the supply may be air, oxygen having a purity of 90% or more (high purity oxygen), or oxygen having a purity of 100% (pure oxygen). The dissolved oxygen concentration in the Cys-DOPA-containing solution is preferably about 0.1 to 8 ppm.

反応温度は、特に限定されないが、通常、室温を含む、5〜40℃である。 Although reaction temperature is not specifically limited, Usually, it is 5-40 degreeC including room temperature.

工程(1)においてシステイニルドーパに加えてユウメラニン前駆体も同時に生成される場合には、酸素の存在によりフェオメラニンに加えてユウメラニンも同時に生成されることになる。 When a eumelanin precursor is simultaneously generated in addition to cysteinyl dopa in step (1), eumelanin is simultaneously generated in addition to pheomelanin due to the presence of oxygen.

より好ましいフェオメラニン製造形態としては以下のものが挙げられる。 More preferable pheomelanin production forms include the following.

(i)脱酸素条件あるいは低酸素条件下で、アルカリ剤をCys-DOPA溶液に添加して、アルカリ条件とした後、
(ii)酸素を積極的に通気する。 (i) An alkaline agent is added to the Cys-DOPA solution under deoxygenation conditions or low oxygen conditions to obtain alkaline conditions,
(ii) Actively ventilate oxygen.

また、好ましい別形態としては以下のものが挙げられる。 Moreover, the following are mentioned as a preferable another form.

(i)脱酸素条件あるいは低酸素条件下でCys-DOPA溶液に、
(ii)アルカリ剤添加と酸素通気を同時に行う。 (i) Cys-DOPA solution under deoxygenated or hypoxic conditions
(ii) Add the alkali agent and vent oxygen simultaneously.

＜染料溶液＞
本発明のCys-DOPA含有溶液を配合し、染色性能及び保存性に優れた染料溶液を調製することができる。染色性能の観点から、染料溶液に含まれるシステイニルドーパ(及びユウメラニン前駆体)濃度は、通常0.01〜20重量%、好ましくは0.05〜10重量%、特に好ましくは0.2〜5.0重量%を挙げることができる。この含有量は、染料溶液の使用目的によって適宜変えることができ、染色回数が一回で染色対象物が綿繊維の場合は0.05〜20.0重量%で、染色対象物がヒトの毛髪の場合は0.05〜20.0重量%程度、好ましくは0.1〜15.0重量%程度で染色することができる。染色回数が2回以上である場合は、より低濃度で染色効果が得られ、0.05〜18.0重量%程度、好ましくは0.1〜12.0重量%程度、特に好ましくは0.1〜8.0重量%程度である。 <Dye solution>
A dye solution excellent in dyeing performance and storage stability can be prepared by blending the Cys-DOPA-containing solution of the present invention. From the viewpoint of dyeing performance, the concentration of cysteinyl dopa (and eumelanin precursor) contained in the dye solution is usually 0.01 to 20% by weight, preferably 0.05 to 10% by weight, particularly preferably 0.2 to 5.0% by weight. be able to. This content can be appropriately changed according to the purpose of use of the dye solution, and is 0.05 to 20.0% by weight when the number of times of dyeing is one and the dyeing object is cotton fiber, and 0.05 when the dyeing object is human hair. It can be dyed at about ˜20.0% by weight, preferably about 0.1 to 15.0% by weight. When the number of times of dyeing is 2 times or more, a dyeing effect is obtained at a lower concentration, and it is about 0.05 to 18.0% by weight, preferably about 0.1 to 12.0% by weight, particularly preferably about 0.1 to 8.0% by weight.

上記染料溶液のpHは、染色性能と保存性の観点から、使用時にpH 7〜12、好ましくはpH 7.5〜11に調整することが好ましい。また、予めアルカリ条件に調整しておけば、空気中に取り出しただけで空気酸化を受けることにより染色することが可能となる。本発明の染料溶液には防腐剤として、エタノールを5〜20重量%程度添加するのが好ましい。 The pH of the dye solution is preferably adjusted to pH 7 to 12, preferably pH 7.5 to 11, at the time of use, from the viewpoint of dyeing performance and storage stability. Moreover, if it adjusts beforehand to alkali conditions, it will become possible to dye | stain by receiving air oxidation only by taking out in air. It is preferable to add about 5 to 20% by weight of ethanol as a preservative to the dye solution of the present invention.

上記染料溶液は、不活性ガス雰囲気下ステンレスタンク等の密閉可能な容器に封入し、常温で保管することができる。また、不活性ガスで加圧しておくと、使用時にコックを開くだけで必要量の染料溶液を取り出すことができて便利である。 The dye solution can be sealed in a sealable container such as a stainless steel tank under an inert gas atmosphere and stored at room temperature. In addition, pressurizing with an inert gas is convenient because a necessary amount of the dye solution can be taken out simply by opening the cock at the time of use.

上記染料溶液は、常温においては、通常1時間以内にシステイニルドーパ(及びユウメラニン前駆体)が空気酸化により全量消費され、メラニンに変換される。 In the above dye solution, cysteinyl dopa (and eumelanin precursor) is consumed by air oxidation and converted into melanin usually within 1 hour at room temperature.

上記染料溶液は、それ自体で染色性能を有し、染料として使用可能であるが、更に使用感を向上させるため、染色を意図した各種商品の原料として使用することもできる。例えば、染料成分として、界面活性剤、安定化剤、緩衝剤、香料、感触向上剤、キレート剤、可溶化剤、防腐剤等を含む染毛剤に配合することができる。 The dye solution itself has dyeing performance and can be used as a dye. However, in order to further improve the feeling of use, it can also be used as a raw material for various products intended for dyeing. For example, it can mix | blend with the hair dye containing a surfactant, a stabilizer, a buffering agent, a fragrance | flavor, a touch improvement agent, a chelating agent, a solubilizer, an antiseptic | preservative, etc. as a dye component.

フェオメラニンは金髪の色素であるので、本発明の製造方法で得られたシステイニルドーパは、金髪染毛剤の成分として利用できる。また、本発明の製造方法によりシステイニルドーパとユウメラニン前駆体の量比をコントロールでき、これはフェオメラニンとユウメラニンとの割合を変えることに相当し、「黒色又は褐色」から「赤色又は黄色」までの色を自在に調整して製造できる。 Since pheomelanin is a blonde pigment, cysteinyl dopa obtained by the production method of the present invention can be used as a component of a blonde hair dye. Further, the production method of the present invention can control the amount ratio of cysteinyl dopa and eumelanin precursor, which corresponds to changing the ratio of pheomelanin to eumelanin, from “black or brown” to “red or Can be produced by freely adjusting the color up to "yellow".

また、本発明で得られたシステイニルドーパ溶液を、別途調製したユウメラニン前駆体溶液と混合比を調整して混合することで、フェオメラニンとユウメラニンとの中間的な染毛剤を調製することができる。システイニルドーパ溶液とユウメラニン前駆体溶液は、同時調製してもよいし、又は別途調製したユウメラニン前駆体溶液を混合してもよいが、別途調製したユウメラニン前駆体溶液を混合して、フェオメラニンとユウメラニンに同時変換することが好ましい。 Also, an intermediate hair dye between pheomelanin and eumelanin is prepared by adjusting the mixing ratio of the cysteinyl dopa solution obtained in the present invention with a separately prepared eumelanin precursor solution. can do. The cysteinyl dopa solution and the eumelanin precursor solution may be prepared at the same time, or a separately prepared eumelanin precursor solution may be mixed, or a separately prepared eumelanin precursor solution may be mixed. It is preferable to convert pheomelanin and eumelanin simultaneously.

＜染色＞
上記で調製された染色剤は、塗装など工業用途を含めて用途を制限されることはないが、好ましくは繊維質を染色する用途に用いる。繊維質としては、紙・ろ紙などを含むセルロース系高分子繊維質、毛髪・羊毛などを含むタンパク質高分子系繊維質、化学合成繊維(合成繊維(ナイロンなどを含む)、半合成繊維(例えば、セルロースアセテート)、再生繊維(例えば、レーヨンなど))などの繊維質であればいずれであってもよい。更により好ましくは、毛髪である。 <Dyeing>
The dyeing agent prepared above is not limited in use including industrial applications such as painting, but is preferably used for dyeing fibers. Examples of fibers include cellulosic polymer fibers including paper and filter paper, protein polymer fibers including hair and wool, chemically synthesized fibers (including synthetic fibers (including nylon)), semi-synthetic fibers (for example, Any fibrous material such as cellulose acetate) and regenerated fibers (for example, rayon) may be used. Even more preferred is hair.

以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these.

＜酵素剤の調製方法＞
アスペルギルス・オリゼ由来チロシナーゼ遺伝子(melB)を、酵母SED1遺伝子プロモーターの下流に接続した発現カセットを作製し、実用清酒酵母(サッカロミセス・セレビシェ)へ導入した。得られた遺伝子組換え酵母を培養し、細胞障害処理及び活性化処理をして、チロシナーゼ酵素剤として用いた。 <Method for preparing enzyme agent>
An expression cassette in which the Aspergillus oryzae-derived tyrosinase gene (melB) was connected downstream of the yeast SED1 gene promoter was prepared and introduced into a practical sake yeast (Saccharomyces cerevisiae). The obtained genetically modified yeast was cultured, subjected to cell damage treatment and activation treatment, and used as a tyrosinase enzyme agent.

大腸菌でもmelB (cDNA)を発現生産させ、活性化処理をして、チロシナーゼ酵素剤として試験例１２のみ用いた。 In Escherichia coli, melB (cDNA) was expressed and produced, subjected to activation treatment, and only Test Example 12 was used as a tyrosinase enzyme agent.

試験例１＜予備試験＞
10 mM DOPA、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)、及び67 U/mLチロシナーゼ含有酵母を含む混合液に、0〜20 mMとなるようCysの添加量を変え、500μLスケールで混合し、室温で20分間反応を行った。 Test Example 1 <Preliminary test>
In a mixture containing 10 mM DOPA, 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), and 67 U / mL tyrosinase-containing yeast, change the addition amount of Cys to be 0 to 20 mM, and mix on a 500 μL scale, The reaction was performed at room temperature for 20 minutes.

各成分の測定は、下記条件に従ってHPLCを用いて測定した。
HPLC装置：Waters社製HPLC Alliance 2695-2996
移動相：リン酸／メタノール
カラム：Imtakt社製 Unison UK−C18(75 x 4.6 mm)
結果を表１に示す。 Each component was measured using HPLC according to the following conditions.
HPLC apparatus: HPLC Alliance 2695-2996 manufactured by Waters
Mobile phase: Phosphoric acid / methanol column: Unison UK-C18 (75 x 4.6 mm) manufactured by Imtakt
The results are shown in Table 1.

試験例２＜反応液のpH制御の必要性＞
20 mM DOPA、20 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)、及び68 U/mLチロシナーゼ含有酵母を含む混合液に、0〜30 mMとなるようCysの添加量を変え、1 mLスケールで混合し、室温で20分間反応を行った。結果を表２に示す。 Test Example 2 <Necessity of pH control of reaction solution>
In a mixture containing 20 mM DOPA, 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), and 68 U / mL tyrosinase-containing yeast, change the addition amount of Cys to 0 to 30 mM and mix on a 1 mL scale. The reaction was performed at room temperature for 20 minutes. The results are shown in Table 2.

試験例３＜Cys-DOPAでの反応の停止＞
20 mMとなるよう基質であるDOPAを添加し、且つ0.36 kU/mLとなるようチロシナーゼ含有酵母を加えて2 Lとし、20又は30 mMとなるようCysの添加量を変えて反応液を調製した。20℃で、酸素を0.3 L/minで通気し、撹拌速度500 rpmで反応させた。酸素は必要分だけ供給し、30分間反応を行った。各成分の測定は、試験例１と同様に行った。結果を表３に示す。 Test Example 3 <Stop of reaction with Cys-DOPA>
The reaction solution was prepared by adding DOPA as a substrate to 20 mM, adding 2 liters of tyrosinase-containing yeast to 0.36 kU / mL, and changing the amount of Cys to be 20 or 30 mM. . At 20 ° C., oxygen was bubbled at 0.3 L / min, and the reaction was carried out at a stirring speed of 500 rpm. Oxygen was supplied as much as necessary and the reaction was performed for 30 minutes. Each component was measured in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in Table 3.

試験例４＜反応液の色調＞
試験例３と同じ条件で、20 mMとなるようDOPAを添加し、0〜30 mMとなるようCysの添加量を変えて反応液を調製した。得られた反応液について、除菌、除タンパク処理を施した後、一部は酸素を遮断して保管し(O₂遮断)、残りの反応液をフラスコに入れ、120 rpmで一晩浸透した(O₂曝気)。 Test Example 4 <Color of reaction solution>
Under the same conditions as in Test Example 3, DOPA was added to 20 mM, and the amount of Cys added was changed to 0 to 30 mM to prepare a reaction solution. The obtained reaction solution was subjected to sterilization and protein removal treatment, partly stored after blocking oxygen (O ₂ blocking), and the remaining reaction solution was placed in a flask and permeated at 120 rpm overnight. (O ₂ aeration).

結果を表４に示す。表４には、目視で判断した生成された溶液の色を示し、右側の数値は色の濃さの順位を示している(一番濃いものを1とする)。 The results are shown in Table 4. Table 4 shows the color of the generated solution visually judged, and the numerical value on the right side shows the order of the color intensity (the darkest one is 1).

試験例５＜反応液のpH制御の必要性と発泡度合＞
20 mMとなるよう基質であるDOPAを添加し、0.36 kU/mLとなるようチロシナーゼ含有酵母を加え2 Lとし、ここに0〜80 mMとなるようCysの添加量を変えて反応液を調製し、20℃で、酸素を0.5 L/minで通気し、撹拌速度500 rpmで反応させた。酸素は必要分だけ供給し、20分間反応を行った。このときのpH制御の必要性と発泡を観察した。 Test Example 5 <Necessity of pH control of reaction solution and degree of foaming>
Add DOPA as substrate to 20 mM, add tyrosinase-containing yeast to 0.36 kU / mL to make 2 L, and change the amount of Cys added to 0 to 80 mM here to prepare a reaction solution. At 20 ° C., oxygen was bubbled at 0.5 L / min, and the reaction was carried out at a stirring speed of 500 rpm. Oxygen was supplied as much as necessary and the reaction was carried out for 20 minutes. The necessity of pH control and foaming at this time were observed.

pH変化については、Cys濃度がDOPA の1.25倍以上あれば、反応終了までほぼ変化がないことが明らかとなった。また、酸素通気により発生する気泡量は、0 mM Cysを基準とすると、Cys濃度がDOPAと等量のときには、前記量と比較して半分程度、1.25倍以上の濃度比があれば全く発生しないことが明らかとなった。 Regarding the pH change, it was clarified that there was almost no change until the end of the reaction when the Cys concentration was 1.25 times or more of DOPA. In addition, the amount of bubbles generated by oxygen aeration is not generated at all when the Cys concentration is equivalent to DOPA, if the concentration ratio is about 1.25 times or more compared to the above amount when the Cys concentration is equivalent to DOPA. It became clear.

試験例６＜フェオメラニンの製造試験＞
試験例３の条件で、30 mM Cysで反応させた反応液を用いた。反応直後のサンプリング液をAとした。一部小分けして、空気を200 mL/minで10分間通気したサンプリング液をBとした。A液に窒素を通気撹拌し、溶存酸素濃度を0%にし、NaOHを添加してpH 9.0に調整したサンプリング液をCとした。C液に空気を通気撹拌し、溶存酸素濃度を20〜30%としたサンプリング液をDとした。引き続き、撹拌を継続したまま通気量を調節し、溶存酸素濃度を20〜30%としたサンプリング液をEとした。その後、撹拌を継続したまま通気を停止し、溶存酸素濃度が7%となったサンプリング液をFとした。各サンプリング液を用いて、市販ろ紙を含む繊維質を染色した。 Test Example 6 <Peomelanin production test>
The reaction solution reacted with 30 mM Cys under the conditions of Test Example 3 was used. The sampling solution immediately after the reaction was designated as A. A sampling solution, which was partly divided and aerated with air at 200 mL / min for 10 minutes, was designated as B. Nitrogen was bubbled into the solution A, the dissolved oxygen concentration was 0%, and NaOH was added to adjust the pH to 9.0. D was a sampling solution in which air was stirred in solution C and the dissolved oxygen concentration was 20 to 30%. Subsequently, the amount of aeration was adjusted while stirring was continued, and a sampling solution having a dissolved oxygen concentration of 20 to 30% was designated E. Thereafter, aeration was stopped while stirring was continued, and the sampling solution having a dissolved oxygen concentration of 7% was designated as F. Each sampling solution was used to dye a fiber containing a commercially available filter paper.

市販ろ紙の染色結果を表５に示す。表５では、全く色がないものを-とし、色があるものについて、色の濃さを+の数で示した(濃い+++〜+薄い)。 Table 5 shows the dyeing results of commercially available filter paper. In Table 5, “−” indicates that there is no color at all, and “+” to “+ light” indicates the color intensity of the color.

試験例７＜DOPAとCysが等量近傍でのCys-DOPA製造試験＞
試験例５と同様に試験を行った。DOPAに対するCysのモル比率が1.25以上の場合は、酸素供給方法に何ら制限されることなく、Cys-DOPAを蓄積することができ、pH制御は不必要であり、発泡も見られなかった。他方、DOPAに対するCysのモル比率が1〜1.20の場合は、溶存酸素濃度をモニターしつつ酸素供給を制御した酸素供給律速条件下でCys-DOPAが蓄積でき、pH制御は不必要であり、発泡も見られなかった。 Test Example 7 <Cys-DOPA production test with DOPA and Cys in the vicinity of equal amounts>
The test was conducted in the same manner as in Test Example 5. When the molar ratio of Cys to DOPA was 1.25 or more, Cys-DOPA could be accumulated without any limitation on the oxygen supply method, pH control was unnecessary, and no foaming was observed. On the other hand, when the molar ratio of Cys to DOPA is 1-1.20, Cys-DOPA can accumulate under oxygen supply rate-determining conditions where oxygen supply is controlled while monitoring the dissolved oxygen concentration, pH control is unnecessary, and foaming Was also not seen.

試験例８＜チロシンとCysによるCys-DOPA製造試験＞
20 mMリン酸緩衝液(pH 6.0)を含む0.05%チロシン溶液1 mLにCys 1 mgを溶解した(モル比、チロシン：Cys＝1：3)。ここに0.36 kU/mlとなるようチロシナーゼ含有酵母を添加し、よく混合して反応させた。反応液を試験例１と同様にHPLCを用いて分析したところ、Cys-DOPAが蓄積していることが確認できた。 Test Example 8 <Cys-DOPA production test using tyrosine and Cys>
1 mg of Cys was dissolved in 1 mL of 0.05% tyrosine solution containing 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) (molar ratio, tyrosine: Cys = 1: 3). Tyrosinase-containing yeast was added to 0.36 kU / ml, and mixed well to react. When the reaction solution was analyzed using HPLC in the same manner as in Test Example 1, it was confirmed that Cys-DOPA was accumulated.

試験例９＜高濃度DOPAでのCys-DOPA製造試験＞
80 mMとなるよう基質であるDOPAを添加し、0.36 kU/mLとなるようチロシナーゼ含有酵母を加え2 Lとし、ここに120 mMとなるようCysを加えて、20℃で、酸素を0.5 L/minで通気し、撹拌速度500 rpmで反応させた。酸素は必要分だけ供給し、60分間反応を行った。反応液を試験例1と同様にHPLCを用いて分析したところ、基質のDOPA由来のピークは消失し、Cys-DOPAが蓄積していることが確認できた。また、その面積はDOPA 20 mMで反応させたときの3.86倍であり、加えた基質の量にほぼ比例していた。 Test Example 9 <Cys-DOPA Production Test with High Concentration DOPA>
Add DOPA as a substrate to 80 mM, add 2 L of tyrosinase-containing yeast to 0.36 kU / mL, add Cys to 120 mM, and add oxygen to 0.5 L / 20 at 20 ° C. Aeration was performed at min, and the reaction was performed at a stirring speed of 500 rpm. Oxygen was supplied only for the required amount, and the reaction was performed for 60 minutes. When the reaction solution was analyzed using HPLC in the same manner as in Test Example 1, it was confirmed that the DOPA-derived peak of the substrate disappeared and Cys-DOPA was accumulated. The area was 3.86 times that when reacted with DOPA 20 mM, which was almost proportional to the amount of added substrate.

試験例１０＜Cys-DOPA溶液とメラニン前駆体溶液混合による色合いの異なる染色剤の調製＞
試験例５で調製したCys-DOPA溶液(DOPAに対するCysのモル比1.25)と、別途調製したユウメラニン前駆体(試験例５でシステインを加えなかった条件で調製)を下表の比率で混合し、アルカリ処理後、ろ紙に滴下して空気中の酸素で酸化させた。乾燥後、色彩色差計でLabの測定を行った。 Test Example 10 <Preparation of stains with different shades by mixing Cys-DOPA solution and melanin precursor solution>
The Cys-DOPA solution prepared in Test Example 5 (Cys molar ratio to 1.25 DOPA) and the separately prepared eumelanin precursor (prepared under the condition in which Cysteine was not added in Test Example 5) were mixed at the ratio shown in the table below. After the alkali treatment, the solution was dropped on a filter paper and oxidized with oxygen in the air. After drying, Lab was measured with a color difference meter.

結果を表６に示す。混合比(容量比)を変えることにより、異なる彩色差をもつ染料を調製することができた。 The results are shown in Table 6. By changing the mixing ratio (volume ratio), dyes with different color differences could be prepared.

試験例１１＜Cys-DOPA溶液の濃縮＞
試験例５と同じ試験系で、DOPA 20 mM、Cys 30 mMで反応させて得られたCys-DOPA溶液を減圧式濃縮機で濃縮を行った。また、比較対象として、DOPA 20 mM、Cys 0 mM(ユウメラニン前駆体溶液)を同様に減圧式濃縮機で濃縮した。 Test Example 11 <Concentration of Cys-DOPA Solution>
In the same test system as in Test Example 5, a Cys-DOPA solution obtained by reacting with DOPA 20 mM and Cys 30 mM was concentrated using a vacuum concentrator. For comparison, DOPA 20 mM and Cys 0 mM (eumelanin precursor solution) were similarly concentrated using a vacuum concentrator.

ユウメラニン前駆体溶液は30 Torrまで真空度を下げると、発泡が激しく、泡に紛れて凝集液側に有効成分が逃げてしまい、欠減となる現象が見られた。そのため、発泡を避けて減圧濃縮するためには、100 Torrまで真空度を緩める必要があった。しかしながら、真空度を緩めることは、空気が存在し、ユウメラニン前駆体溶液が酸素に触れることと同義であるため、濃縮処理中に酸化を受けることとなった。結果、重量として6.1倍、有効成分濃度として1.3重量%まで濃縮した。 When the vacuum degree of the eumelanin precursor solution was lowered to 30 Torr, foaming was intense, and the active ingredient escaped to the agglomerated liquid side due to foaming, resulting in a phenomenon of loss. Therefore, in order to concentrate under reduced pressure while avoiding foaming, it was necessary to loosen the vacuum to 100 Torr. However, loosening the degree of vacuum is synonymous with the presence of air and the eumelanin precursor solution coming into contact with oxygen, and is therefore subject to oxidation during the concentration process. As a result, it was concentrated to 6.1 times as the weight and 1.3% by weight as the active ingredient concentration.

これに対し、Cys-DOPA溶液は30 Torrまで真空度を下げても発泡は確認されず、欠減なく安定して濃縮作業を行うことができた。結果、ユウメラニン前駆体ではできなかった、重量として30.3倍、有効成分濃度として約18重量%以上にも濃縮することができた。 On the other hand, the Cys-DOPA solution was not foamed even when the vacuum level was lowered to 30 Torr, and the concentration operation could be performed stably without loss. As a result, it was able to be concentrated to 30.3 times the weight and about 18% by weight or more as the active ingredient concentration, which was not possible with the eumelanin precursor.

試験例１２＜大腸菌でのCys-DOPA溶液の生産＞
30 mM DOPA、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)、及び50 mM Cysを含む溶液1 mLに、チロシナーゼ活性を持つ活性化大腸菌150 mgを添加混合し、15℃で撹拌した。反応20分後にDOPAが消失したことを、試験例１と同様にHPLCにて確認した。 Test Example 12 <Production of Cys-DOPA Solution in E. coli>
To 1 mL of a solution containing 30 mM DOPA, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) and 50 mM Cys, 150 mg of activated Escherichia coli having tyrosinase activity was added and mixed, and the mixture was stirred at 15 ° C. It was confirmed by HPLC as in Test Example 1 that DOPA had disappeared 20 minutes after the reaction.

試験例１３＜Cys-DOPA溶液による毛髪染色＞
人由来のブリーチした白髪(商品名：人毛毛束[白毛]、毛束屋社販売品)の染色試験を行った。試験例５で調製したCys-DOPA溶液(20 mM DOPA、30 mM Cysの組成)を約10倍に濃縮した。次に前記濃縮液4.5 mL、99.5%エタノール0.5 mL、6N NaOH 10μLの組成物を調製した。白髪を前記組成物に5分間浸漬し、水洗し、乾燥を行った。浸漬から乾燥までの操作を、合計3回繰り返した。得られた染色白髪と染色前の白髪のLabを、それぞれ色彩色差計で測定した。染色後の白髪は、染色前の白髪と比較して、やや赤みのかかった茶色に染色された。 Test Example 13 <Hair dyeing with Cys-DOPA solution>
A staining test was performed on bleached gray hair derived from humans (trade name: human hair bundle [white hair], a product sold by Hair Bundle Company). The Cys-DOPA solution (composition of 20 mM DOPA, 30 mM Cys) prepared in Test Example 5 was concentrated about 10 times. Next, a composition of 4.5 mL of the concentrated solution, 0.5 mL of 99.5% ethanol, and 10 μL of 6N NaOH was prepared. The white hair was immersed in the composition for 5 minutes, washed with water, and dried. The operation from immersion to drying was repeated a total of 3 times. Labs of the obtained white hair before dyeing and white hair before dyeing were each measured with a color difference meter. The gray hair after dyeing was dyed in a slightly reddish brown compared to the white hair before dyeing.

Claims

A method for producing a melanin precursor containing cysteinyl dopa, comprising the following steps (1) and (2) :
(1) Yeast containing tyrosinase derived from Aspergillus filamentous fungi , cysteine, and DOPA (3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine) and / or tyrosine, and DOPA and / or tyrosine and cysteine are moles the ratio (DOPA and / or tyrosine: cysteine) 1: 1.25 in a mixture formulated in to 4, the step of converting by oxidation of DOPA and / or tyrosine in cysteinyldopa and,
(2) A step of recovering the cysteinyl dopa obtained in the step (1) from the reaction solution .

The method according to claim 1, wherein the molar ratio (DOPA and / or tyrosine: cysteine) is from 1: 1.25 to 3. 3.

The method according to claim 1 or 2, wherein the molar ratio (DOPA and / or tyrosine: cysteine) is from 1: 1.25 to 2.0.

A method for producing a melanin precursor containing cysteinyl dopa, comprising the following steps (1) and (2):
(1) Yeast containing tyrosinase derived from Aspergillus filamentous fungi, cysteine, and DOPA and / or tyrosine, DOPA and / or tyrosine and cysteine molar ratio (DOPA and / or tyrosine: cysteine) 1: 1.0 A step of oxidizing DOPA and / or tyrosine to cysteinyl dopa in a mixture formulated at -1.2 under conditions where oxygen control is limited so that pH control is not required or foaming; and
(2) A step of recovering the cysteinyl dopa obtained in the step (1) from the reaction solution.

The method according to any one of claims 1 to 4 , wherein a eumelanin precursor is also generated in addition to cysteinyl dopa in the step (1).

In the step (1), said air mixture is fed, the method according to any one of claims 1-5.

In the step (1), the oxygen in the mixture is fed, the method according to any one of claims 1-5.

The method according to any one of claims 1 to 7 , further comprising the following step (2 '):
(2 ′) A step of concentrating the cysteinyl dopa recovered in step (2).

A method for producing melanin containing pheomelanin, comprising the following step (3):
(3) The melanin precursor containing cysteinyl dopa obtained by the method according to any one of claims 1 to 8 is permeated into the object to be dyed and treated under alkaline conditions and in the presence of oxygen. The process of converting to pheomelanin.

The method according to claim 9, wherein the alkaline condition is pH 8 or higher.

The method according to claim 9 or 10, wherein in the step (3), eumelanin is also produced in addition to pheomelanin.

A method for producing melanin, comprising the following step (4):
(4) A melanin precursor containing cysteinyl dopa obtained by the method according to any one of claims 1 to 8 and a separately prepared eumelanin precursor are mixed, under alkaline conditions and oxygen The process of converting into pheomelanin and eumelanin by processing in the presence.

A method for producing a melanin precursor containing cysteinyl dopa, comprising the following steps (1) and (2):
(1) It contains yeast containing tyrosinase derived from Aspergillus filamentous fungi, cysteine, and DOPA and / or tyrosine, and cysteine was blended at 0.5 mol or more and less than 1.0 mol with respect to 1 mol of DOPA and / or tyrosine. Oxidizing DOPA and / or tyrosine to cysteinyl dopa in the mixture, wherein the DOPA and / or tyrosine concentration in the mixture is 1-120 mM; and
(2) A step of recovering the cysteinyl dopa and eumelanin precursor obtained in step (1) from the reaction solution.