JP6598396B2 - ホウ素アミノ酸製剤 - Google Patents

Description

本発明はホウ素アミノ酸製剤に係り、特にヒト（人）や動物のがん等へのホウ素アミノ酸の集積技術に関する。

近年、国民の２人に１人ががんになると言われており、がん治療対策は緊急の課題となっている。また、獣医学領域をはじめ様々な分野で、動物（特に、犬や猫）の放射線照射によるがん治療について関心が高まっている。

がん治療の一つとして、放射線治療の一例であるホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ：Boron Neutron Capture Therapy）がある（特許文献１）。

ホウ素中性子捕捉療法は、がん細胞に取り込まれ易いホウ素-１０(^１０Ｂ）を含んだホウ素アミノ酸を静脈注射や点滴等によりがん患者に投与してがん細胞に集積させた後、がん細胞へ中性子線を照射することによりがん治療を行うものである。ホウ素の同位体は、ホウ素-１０とホウ素-１１の２種類が存在し、ホウ素-１１が天然のホウ素の約８０％を占めているが、ホウ素-１０の方が中性子の吸収でα線・リチウム原子核に分裂し易く、少ない投与量及び少ない中性子照射で効果を奏する。

ホウ素-１０が取り込まれたがん細胞に中性子線を照射することにより、中性子線とホウ素-１０との核反応で生じたα線・リチウム原子核ががん細胞だけを選択的に破壊することによりがんを治療する。

ホウ素中性子捕捉療法は、学術や技術の多分野で構成されているが、ホウ素中性子捕捉療法に使用する優秀なホウ素アミノ酸製剤の開発が最も重要となる技術といえる。

ホウ素中性子捕捉療法において、ホウ素アミノ酸は、ホウ素原子ががん患者のがん細胞に移行し、ホウ素中性子捕捉療法における治療有効濃度以上でがん細胞に集積し易いことが治療効果を高める上で要求される。

したがって、ホウ素アミノ酸製剤はがんに選択的に且つ確実に取り込まれることが重要である。ちなみにがんへのホウ素アミノ酸の治療有効濃度は、^１０Ｂ濃度として２０ｐｐｍ以上、好ましくは４０ｐｐｍ以上が好ましいとされている。

これまで、多様なホウ素アミノ酸製剤が開発され評価されてきたが、臨床研究に実用化されてきたホウ素アミノ酸製剤は１９８７年頃からの第一世代のｐ-ボロノフェニルアラニン（以下、ＢＰＡという）である。

このＢＰＡには、フェニルアラニン部分が天然のフェニルアラニンと同じ型の立体配置であるＬ体（左型）のＢＰＡ（Ｌ-ＢＰＡ）と、Ｌ体のＢＰＡとは光学異性の関係にあるＤ体（右型）のＢＰＡ（Ｄ-ＢＰＡ）と、Ｌ-ＢＰＡとＤ-ＢＰＡとが等分に混合したラセミ体（Ｌ体５０％、Ｄ体５０％）の３種類がある。

上記した３種類のＢＰＡのうち、人間の身体の構成要素であるアミノ酸がＬ体であり、生体機構への親和性のあるＬ体のＢＰＡが細胞組織に最も取り込まれ易いとされている。

図７は、Ｌ-ＢＰＡとＤ-ＢＰＡとについて生体機構への親和性を比較したものであり、マウス正常臓器（脳、血液、膵臓）への投与後時間に対する相対取込量ＰＳＬ（輝尽発光）／ｍｍ^２をグラフ化したものである。グラフから分かるようにＬ-ＢＰＡは、Ｄ-ＢＰＡに比べて臓器への高い集積性を有することが分かる。

一方、図７に見られるように、Ｌ-ＢＰＡの臓器への高い集積に比べてＤ-ＢＰＡの集積は極めて低い。このことから、Ｄ-ＢＰＡは上記した治療有効濃度には達しないと考えられ、ホウ素中性子捕捉療法には適さないとされており、従来、Ｄ-ＢＰＡはホウ素中性子捕捉療法から除外されていた。

このため、従来のホウ素アミノ酸製剤は、主としてＬ体のＢＰＡを使用している（例えば特許文献２）。

このような背景から、主としてＬ体のホウ素アミノ酸製剤の組成等について改良が行われてきた（例えば、特許文献２、特許文献３）。一方、Ｄ体のホウ素アミノ酸は、その性質の実態が明らかでなかったために、これに注目した体内動態（吸収、分布、代謝、排泄）の制御法（体内動態制御法）の開発は行われてこなかった。

ここで、体内動態制御を具体的に説明すると、がんへの集積性改善、がんと周辺正常組織とのコントラスト改良、一定時間の体内対流性と速やかな尿中排泄性の何れかを指す。これらは、代謝安定性、血中ｐＨ領域での溶解性などに影響される。

特開２０１６−１５９１０７号公報 特開２００８−１００９２５号公報 特開２００９―０５１７６６号公報

しかしながら、従来のＬ体のホウ素アミノ酸製剤は、体内動態制御の改善、特にがんへの集積性改善とがんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラスト改良の点で未だ不十分なままであった。

即ち、Ｌ体のＢＰＡを被験体であるがん患者に投与すると、天然の栄養素であるＬ体のアミノ酸と同様に正常組織にも取り込まれるため、がんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラストが悪くなる。そのため、中性子線が周辺正常組織に照射されると正常組織にも多く分布するホウ素の核反応による被ばくが大きいという問題がある。

このような背景から、ＢＰＡ投与によるがんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラストを従来よりも改良して正常組織の被ばくをできるだけ少なくするホウ素アミノ酸製剤が要望されている。このコントラスト改良においては、ホウ素中性子捕捉療法による治療有効濃度までがんに対するＢＰＡ濃度を高められることが大前提となる。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、がんへの高い集積選択性が可能となるので、ホウ素中性子捕捉療法の投与液として用いればがんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラストを従来よりも改良でき、正常組織の被ばくを従来よりも少なくすることが可能なホウ素アミノ酸製剤を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、Ｌ体のホウ素アミノとＤ体のホウ素アミノ酸のうち、Ｄ体が６０％以上であることを特徴とする。

本発明の好ましい態様として、Ｄ体が１００％である。また、ホウ素アミノ酸はｐ-ボロノフェニルアラニンであることが好ましい。

本発明は、ホウ素アミノ酸製剤はホウ素中性子捕捉療法において被験体にホウ素アミノ酸を投与する投与液として使用されることが好ましい。

本発明のホウ素アミノ酸製剤によれば、ＢＰＡのがんへの高い集積選択性が可能となる。

したがって、本発明のホウ素アミノ酸製剤をホウ素中性子捕捉療法に使用すれば、ＢＰＡ投与によるがんと周辺正常組織とのコントラストを従来よりも顕著に改良できるので、正常組織の被ばくを従来よりも少なくすることができる。

^１４Ｃ標識体のＬ-ＢＰＡとＤ-ＢＰＡの合成方法を説明する説明図 ＢＰＡ投与によるがんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラストを示すオートラジオグラムオートラジオグラム（画像写真） ＢＰＡ集積相対比試験の試験結果を示す表図 ＢＰＡ治療有効濃度試験の試験結果を示す表図 Ｌ-ＢＰＡとＤ-ＢＰＡの集積性試験の試験結果を示すグラフ 図５のグラフを基にホウ素アミノ酸製剤におけるＤ体の比率を検討する表図 Ｌ-ＢＰＡとＤ-ＢＰＡのマウス正常臓器への集積性を調べたグラフ

以下添付図面に従って、本発明に係るホウ素アミノ酸製剤の好ましい実施の形態について詳述する。

[本発明の構成]
本発明のホウ素アミノ酸製剤は、Ｌ体のホウ素アミノとＤ体のホウ素アミノ酸のうち、Ｄ体が６０％以上（好ましくはＤ体が１００％）であることを主たる発明とする。

また、本発明のホウ素アミノ酸製剤は、ホウ素中性子捕捉療法において被験体にホウ素アミノ酸を投与する投与液として使用されることが好ましい。

[本発明の経緯]
本発明者は、従来、細胞への集積性がＬ体のｐ-ボロノフェニルアラニン（ｐ-phenylalanine:以下、Ｌ-ＢＰＡという）よりも極めて低く、ホウ素中性子捕捉療法には適さないと定説になっていたＤ体のｐ-ボロノフェニルアラニン（ｐ-phenylalanine:以下、Ｄ-ＢＰＡという）について見直しを行った結果、次の知見を得た。

（１）Ｄ-ＢＰＡは、人間の身体の構成要素であるＬ体のアミノ酸構造と異なるＤ体であるため、正常組織への生理的集積性が小さく血中から速やかに消失するが、がんには徐々に集積されていく。これにより、がんと正常組織とにおけるＤ-ＢＰＡの集積相対比（がん/正常組織）を顕著に高めることができる。なお、ここで、がんには、腫瘍（癌、肉腫）、悪性黒色腫などが含まれる。

（２）中性子捕捉療法における治療有効濃度（^１０Ｂ濃度として２０ｐｐｍ以上、好ましくは４０ｐｐｍ以上）で見たときに、Ｄ-ＢＰＡは投与持続時間が２０分を超えると、Ｌ-ＢＰＡと略同等のがんへの治療有効濃度に達する。

（３）上記（１）及び（２）のＤ-ＢＰＡの特性により、画像や映像等におけるがんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラストを顕著に改良できる。これにより、ホウ素中性子捕捉療法の際に、がんと周辺正常組織とを明瞭に判別できるので、正常組織の被ばくを従来よりも顕著に低減できる。

なお、本実施の形態では、以下にホウ素アミノ酸として、主として使用されているＢＰＡの例で説明するが、ＢＰＡ以外のアミノ酸構造を有するホウ素アミノ酸についても適用できると考えられる。

次に上記知見に至った試験及びその結果を以下に説明する。

（Ａ）コントラスト試験
^１４Ｃ標識体を有する^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡと^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡとをがんを有するマウスにそれぞれ投与したときに、がんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラストをオートラジオグラム（画像写真）により対比した。

（Ｂ）集積相対比試験
^１４Ｃ標識体を有しないＤ-ＢＰＡと^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡとをがんを有するマウスにそれぞれ投与したときに、がんと正常組織へのホウ素量を高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ法）で分析し、がんと正常組織とにおけるＢＰＡの集積相対比（がん/正常組織）を調べた。

(Ｃ)がんへの治療有効濃度試験
^１４Ｃ標識体を有しないＤ-ＢＰＡとＬ-ＢＰＡとをがんを有するマウスにそれぞれ投与したときに、がんへのホウ素量を高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ法）で分析した。そして、投与時間とがんへの集積濃度を対比し、Ｄ-ＢＰＡがＬ-ＢＰＡと同様にホウ素中性子捕捉療法によるがんへの治療有効濃度まで集積されるかを調べた。合わせて、がんが存在する脳のＢＰＡ濃度、及びＢＰＡをがんへ運ぶ血液のＢＰＡ濃度を調べた。

[プロトコール]
（がん細胞の培養）
試験に供するがん（がん細胞）の培養方法としては、７５ｃｍ^２（ｔ７５）のフラスコ１２個にそれぞれ、１０％のウシ胎児血清とＬ-glutamine(３．５ｍＭ)を含む細胞培養液ＤＭＥＭ〔（Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Sigma-Aldrich)）を２０ｍＬ入れた。そして、がんとしてマウス神経膠腫ＧＬ２６１細胞株を細胞培養液の入ったそれぞれのフラスコに８．０×１０^５cellsずつ播種し、温度３７℃、ｐＨ７．４、ＣＯ_２濃度５％の培養条件下のインキュベータで４日間培養した。

（担がんマウスの作成）
上記培養後に、０．１５ｍＬのリン酸緩衝溶液に懸濁したマウス神経膠腫ＧＬ２６１細胞（１．０２×１０^７個細胞／匹）を、ＫＳＮ-ｓｌｃ雄性マウスの５〜６週齢に皮下移植し、試験に供する担がんマウスを得た。そして、担がんマウスのがん直径が０．５〜１．０ｃｍ程度になったところで試験を行った。担がんマウスの飼育における餌や水は、通常のＳＰＦの環境で行った。

[コントラスト試験]
（試験方法）
＜^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ及び^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡの合成＞
図１は、^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ及び^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡの合成経路を示すものである。なお、図１では、[^１４Ｃ]Ｌ-phenylalanine（１）を出発物質とし、２，３，４，５のナンバーで示す化合物を経て目的とする^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ又は^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡが合成されていることを示す。

下記の合成経路の説明において、ナンバーの２，３，４，５を化合物名と一緒に記載する場合には、化合物名（２）のようにナンバーにカッコを付けて記載する。

本実施の形態において、^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ及び^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡの合成は、下記の文献の合成方法に従い、保護基を一部変更して行った。
文献…Malan,C.; Morin,C.J.Org.Chem.,1998,63,801

前準備として、[^１４Ｃ]ＫＣＮからStrecker法により合成した[^１４Ｃ]ＤＬ-phenylalanineを、酒石酸を使用して光学分割し、Ｌ体のＢＰＡを合成するための出発原料である図１の[^１４Ｃ]Ｌ-phenylalanine（１）を得た。

次に、図1に示すように、得られた[^１４Ｃ]Ｌ-phenylalanine（１）をヨード化し、[^１４Ｃ]4-iodo-Ｌ-phenylalanine（２）を合成した。そして、カルボキシル基及びアミノ基をそれぞれ保護して化合物（３）を得た後、ピナコールボランとのカップリングによりボロン酸エステル（４）に変換した。また、変換したボロン酸エステル（４）を脱保護することでボロン酸（５）を得た。

最後に、酸性条件下でカルボキシル基及びアミノ基の脱保護を行い、目的とする[^１４Ｃ]Ｌ-ＢＰＡを作成した。

また、出発原料として光学分割した一方の、[^１４Ｃ]Ｄ-phenylalanineを用いることによって、上記と同様の合成方法により[^１４Ｃ]Ｄ-ＢＰＡを合成した。

<^１４Ｃ-ＢＰＡ投与液の作成>
^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ及び^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡのそれぞれについて、生理食塩水を用いて放射能濃度が１８５ｋＢｑ／１００μＬになるようにして、Ｌ-ＢＰＡとＤ-ＢＰＡとの２種類の^１４Ｃ-ＢＰＡ投与液を作成した。

<^１４Ｃ-ＢＰＡ投与液の投与及びオートラジオグラムの取得>
上記の複数の担がんマウスのうち、一方群の担がんマウスに^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ投与液を尾静脈から１００μＬ／匹を投与し、他方群の担がんマウスに^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡ投与液を尾静脈から１００μＬ／匹投与した。

投与３０分後に直ちに、それぞれの担がんマウスにセボフルラン過剰吸引させて安楽死させてから臓器を摘出し、摘出した臓器についてオートラジオグラフにより測定を行った。

オートラジオグラフィー（autoradiography）は、放射線写真法やオートラジオグラフ法とも呼ばれ、細胞組織に分布している放射性物質から放出されるベータ線粒子やガンマ線から オートラジオグラム(画像写真)を作成する方法である。生物学においては、放射性物質が特定の組織に滞留することを確認する方法として用いられる。

（試験結果）
図２の（Ａ）は、^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ投与液を担がんマウスに投与したときの臓器についてオートラジオグラフィーにより測定を行ったオートラジオグラム(画像写真)である。また、（Ｂ）は、^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡ投与液を担がんマウスに投与したときの臓器についてオートラジオグラフィーにより測定を行ったオートラジオグラム(画像写真)である。

図２の（Ａ）と（Ｂ）において、矢印で指し示す部分が、担がんマウスに移植したがん（腫瘍）の部分である。

図２の（Ａ）と（Ｂ）との画像写真比較から分かるように、^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ投与液を担がんマウスに投与した場合に比べて、^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡ投与液を担がんマウスに投与した場合の方ががんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラストが顕著に高い（（著しく改良された）結果となった。

このことから、Ｌ-ＢＰＡはがん及び正常組織の両方に集積される特性があるが、Ｄ-ＢＰＡはがんに極めて選択的に集積される特性があることが分かる。

次に、集積相対比試験及び治療有効濃度試験について説明する。

[集積相対比試験及び治療有効濃度試験]
Ｌ-ＢＰＡ（コールド化合物）とＤ-ＢＰＡ（コールド化合物）のそれぞれのホウ素アミノ酸の投与液を担がんマウスに投与して、がん（腫瘍）と脳実質（正常組織）とへの集積相対比、及び各臓器（がん、脳、血液）におけるＢＰＡ濃度と投与持続時間（以下、「投与時間」という）との関係を調べた。

ここでコールド化合物とは、^１４Ｃ標識体を有しない化合物を言う。なお、後記する投与後時間は、投与終了後からの時間を言い、投与持続時間（投与時間）とは区別する。

また、がんと脳実質（正常組織）とへのＢＰＡの集積相対比とは、脳実質へのＢＰＡの集積濃度を１としたときのがんへのＢＰＡの集積濃度の比で示される。また、がんへの治療有効濃度は、上述の通り、^１０Ｂ濃度として２０ｐｐｍ以上とした。

（試験方法）
<ホウ素アミノ酸製剤の作成>
Ｌ-ＢＰＡ（コールド化合物）又はＤ-ＢＰＡ（コールド化合物）に、糖を加えてホウ素アミノ酸製剤を作成した。本実施の形態では、糖としてＤ体のフルクトースを使用した。従来から、Ｄ体のフルクトースはホウ素アミノ酸製剤の水に対する溶解度を上げることができることで知られている。

コールド化合物のＬ-ＢＰＡ及びＤ-ＢＰＡについては、次に示すＭｅｒｃｋ社の市販薬剤を使用した。
・Ｌ-ＢＰＡ…4-Borono-L-phenylalanine(カタログ番号17755-250MG)
・Ｄ-ＢＰＡ…4-Borono-D-phenylalanine(カタログ番号68047-250MG)

このホウ素アミノ酸製剤の投与液の担がんマウスに投与する成分最終濃度は、Ｌ-ＢＰＡ及びＤ-ＢＰＡともに、糖５．４１W／V％、ＢＰＡ２．５１W／V％に調整した。

＜投与液の投与＞
上記の如く得られたそれぞれのＢＰＡ投与液を２０μＬ／分の投与速度で担がんマウスの尾静脈から１０分間、２０分間、３０分間で持続投与した。

＜ホウ素分析＞
投与後直ちに、それぞれの担がんマウスにセボフルランを過剰吸引させて安楽死させてから臓器を摘出した。摘出した臓器について、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＩＣＰ法）によりホウ素分析を行い、がん（腫瘍）と脳実質（正常組織）とへの集積相対比、及び各臓器（がん（腫瘍）、脳、血液）のＢＰＡ濃度と投与持続時間との関係を調べた。

なお、脳実質とは、海馬および側・後頭葉大 脳皮質、前脳大脳皮質、並びに視床からなる群から選択される少なくとも１つ部位の実質であり得る。

（集積相対比の試験結果）
集積相対比試験では、投与後時間が３０分、６０分、１２０分における集積相対比（図３では単に相対比と表示）を調べた。

図３から分かるように、投与後のいずれの時間においても、Ｌ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤よりもＤ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤の方が集積相対比（がん（腫瘍）/脳実質）が、当該治療法の達成目標とされてきた１０倍を大きく上回る２０倍を超え、顕著に高めることができた。このことは、コントラスト試験の画像に示す結果とも一致する。

このことから、Ｌ-ＢＰＡはがん及び正常組織の両方に集積される傾向にあるが、Ｄ-ＢＰＡは正常組織に集積され難い一方、がんに想定以上に集積され易いことが分かる。

（治療有効濃度の試験結果）
図４の（Ａ）はＬ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤の投与液を投与した場合であり、（Ｂ）はＤ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤の投与液を投与した場合である。

なお、治療有効濃度試験では、投与時間が１０分、２０分、３０分における各臓器の複数サンプル（表のサンプル数参照）のホウ素濃度を測定し、平均値と広がり幅とで表示した。

図４の（Ａ）と（Ｂ）との対比から分かるように、Ｄ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤はＬ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤に比べてがん（腫瘍）へ集積されるホウ素濃度は若干低いものの、投与後２０分では治療有効濃度の２０ｐｐｍ（^１０Ｂとして）に略達し、投与後３０分であれば確実に治療有効濃度に達することができる。

このことから、従来、治療有効濃度には達しないと考えられ、ホウ素中性子捕捉療法には適さないとされていたＤ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤は、十分に治療有効濃度に達することができることが分かった。

また、がん（腫瘍）を有する脳とＢＰＡを運搬する血液について投与時間１０分、２０分、３０分における集積濃度の上昇について見ると、いずれの投与時間においても脳及び血液ともに、Ｄ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤はＬ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤に比べて小さい。このことは、Ｄ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤はＬ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤に比べて脳や血液等の正常組織からは排出され易いことが考えられ、正常組織へのホウ素の集積を小さくできることが分かる。

このことから、Ｌ体のホウ素アミノ酸はがん以外の正常組織にも高い集積性を示す一方、Ｄ体のホウ素アミノ酸はがんに対して極めて選択的な集積性を示す。

以上のコントラスト試験、集積相対比試験、及び治療有効濃度試験の試験結果から、Ｄ-ＢＰＡは、Ｌ-ＢＰＡと略同等の治療有効濃度を具備し、且つＬ-ＢＰＡを用いたホウ素中性子捕捉療法に比べてがんと正常組織とのホウ素集積量のコントラストを顕著に改良できることが分かった。

したがって、ホウ素中性子捕捉療法において、がんと周辺正常組織とのホウ素集積量のコントラストを最大にするには、ホウ素アミノ酸はＤ体が１００％であることが理想的である。しかし、Ｄ-ＢＰＡ１００％のホウ素アミノ酸を単離することは、ホウ素アミノ酸製剤の製造コストアップにつながる。

そこで、本発明者は、がん細胞にＬ-ＢＰＡとＤ-ＢＰＡとを等量投与したときの取込時間（投与後時間と同じ）と細胞への取込率とを調べ、取込時間を考慮した場合のホウ素アミノ酸製剤におけるＤ体とＬ体の好ましい比率を検討した。

（Ｄ）^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡと^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡのがん細胞への取込性試験
^１４Ｃ標識体のＬ-ＢＰＡとＤ-ＢＰＡとをがん細胞に等量投与したときに、細胞内への取込性（取り込まれ易さ）を、取込率と取込時間との関係で調べた。

（試験方法）
上記のがん細胞の培養で使用した細胞培養液のＤＭＥＭをディッシュ（シャーレ）から取り除いた。そして、３７℃、ｐＨ７．４のＣａ²⁺を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）２ｍＬの条件下で１０分間インキュベートした。

次に、そのディッシュ（シャーレ）からリン酸緩衝液を除去し、放射能１８．５ｋＢｑの^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ又は^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡを含むリン酸緩衝液２ｍＬの存在下で０分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、９０分間、１２０分間インキュベートした。即ち、取込時間を０分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、９０分間、１２０分間とした。

その後、それぞれの取込時間が経過したディッシュ（シャーレ）から放射能を含むリン酸緩衝液を除去し、４℃のリン酸緩衝液で細胞表面を２回洗浄し、１Ｎ-ＮａＯＨの２ｍＬを加え、２４時間置いて細胞を溶解して測定サンプルとした。

これにより、同じ放射能１８．５ｋＢｑを有する^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡと^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡとのそれぞれについて、取込時間が異なる９個ずつ合計１８個の測定サンプルを得た。

そして、１８個の測定サンプルについて、液体シンチレーションカウンタにより、測定サンプル２００μＬの放射線量を計測した。

即ち、同じ放射能１８．５ｋＢｑを有する^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡと^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡとをそれぞれ培養細胞に接触させて放射能量の経時変化を見ることで、Ｌ体とＤ体のがん細胞への取込率と取込時間との関係を調べた。

（試験結果）
図５は、横軸の取込時間（投与後時間と同じ）に対する^１４Ｃ-ＢＰＡの細胞への取込率を縦軸し示して、取込時間に対する取込率をグラフ化したものである。図５のグラフにおいて、菱形（◆）のプロットが^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡであり、四角（■）のプロットが^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡである。また、縦軸の取込率は、^１４Ｃ-ＢＰＡの投与量全体を１００としたときの各取込時間における取込量を比率（％）で示したものである。また、取込時間は分で示した。図６は、各取込時間における^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡ又は^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡの取込率の具体的数値を示したものである。

図５に示すように、^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡのがん細胞への取込率の推移は、取込時間５分で最大値近傍まで上昇し、取込時間１５分で最大値となった後、次第に減少する。一方、^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡのがん細胞への取込率の推移は、取込時間１２０分まで緩やかに上昇し続ける。

図５のグラフから分かるように、^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡはがん細胞への取込速度は速いが、一度がん細胞内に取り込まれた^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡは時間の経過とともにがん細胞外へ流出していく性質があることが分かる。一方、^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡは、がん細胞への取込速度は遅いが、一度がん細胞内に取り込まれた^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡは時間が経過してもがん細胞外へ流出せずにがん細胞内に集積していく性質があることが分かる。

図６の表から分かるように、取込時間５分における^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡの取込率は１５．９３３％であるのに対して、^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡの取込率は１．５５５％となる。即ち、取込時間５分では、^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡは^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡの１０．２４６倍の集積速度比（Ｌ／Ｄ）でがん細胞に取り込まれる。換言すると、取込時間５分では、^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡは^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡの１／１０．２４６の集積速度であり、がん細胞内集積効果が小さい。

したがって、取込時間５分の取込率で見た場合、^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡが^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡと同等以上のがん細胞内集積効果を得るには、^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡは^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡの１０．２４６倍以上の濃度を必要とする。即ち、取込時間５分で従来のＬ-ＢＰＡ単独なホウ素アミノ酸製剤と同等以上のがん細胞内集積効果を有するホウ素アミノ酸製剤を得るには、Ｌ体とＤ体のＢＰＡのうちＤ体の比率が０.９１１１（９１．１１％）以上なければならないことが分かる。

ただし、図５から分かるように、一度がん細胞内に集積した^１４Ｃ-Ｄ-ＢＰＡは、^１４Ｃ-Ｌ-ＢＰＡと異なってがん細胞外へ流出し難く取込時間の経過とともに取込率が増加するので、取込速度の遅さを取込時間で補うことも可能である。この場合、ホウ素中性子捕捉療法において、ホウ素アミノ酸製剤の投与液の被験体への投与時間及び投与後の中性子の放射時間を考慮すると、１２０分以上の取込時間は実用上考え難い。したがって、取込時間１２０分、好ましくは６０分でのＤ体の比率を計算すると、５９．５５％（取込時間１２０分）、６８．５％（取込時間６０分）となる。

即ち、従来からホウ素中性子捕捉療法に使用されていたＬ-ＢＰＡのホウ素アミノ酸製剤と同等以上のがん細胞内集積効果を有し、且つがんと正常組織とのホウ素集積量のコントラストを改良した実用的なホウ素アミノ酸製剤を得るには、５９．５５％（取込時間１２０分）以上、きりのよい数値として６０％以上のＤ体の比率を有することが好ましいと言える。

ちなみに、ラセミ体（Ｌ体５０％、Ｄ体５０％）の場合には、上述の実用的な取込時間１２０分以内では効果的ながん細胞内集積効果を得ることができないと考えられる。

[本発明の効果のまとめ]
（I）本発明のホウ素アミノ酸製剤をホウ素中性子捕捉療法の投与液として用いることによって、正常組織へのホウ素の集積を小さくでき、がんと正常組織とのホウ素集積量のコントラストが従来よりも顕著に明確になる。これにより、ホウ素中性子捕捉療法による中性子線を略がんにのみ照射することが可能となるので、中性子線による正常組織への被ばくを顕著に小さくすることができる。

（II）本発明のホウ素アミノ酸製剤は、正常組織へのホウ素の集積を小さくできるので、その分、従来よりもＢＰＡの投与量を少なくでき、ＢＰＡ薬剤のコスト削減になる。

（III）Ｄ-ＢＰＡはＬ-ＢＰＡに比べて代謝されにくく、代謝により多種類の代謝物が生成されるＬ-ＢＰＡに比べて体内分布が非常に単純で薬物動態を把握し易い。これにより、Ｄ-ＢＰＡはＬ-ＢＰＡよりも治療効果を予測し易い。

なお、マウス以外の他の動物やヒト（人）への応用の際には、例えば^１１Ｃ標識Ｄ-ＢＰＡや^１８Ｆ標識Ｄ-ＢＰＡを用いた陽電子断層撮影などにより体内分布を画像化し、ホウ素１０を用いた製剤がその適用予定の個体でがんに集積され得るかを事前に診断するとよい。

Claims (2)

1. ホウ素中性子捕捉療法に使用するためのホウ素アミノ酸製剤であって、
   ホウ素アミノ酸としてｐ-ボロノフェニルアラニンを含み、
   前記ｐ-ボロノフェニルアラニンは、Ｌ体とＤ体のうち、Ｄ体が６０％以上であり、
   被験体の静脈に持続投与して用いられることを特徴とするホウ素アミノ酸製剤。
2. 前記Ｄ体が１００％である請求項１に記載のホウ素アミノ酸製剤。