JP6598766B2 - 脂質二重膜を担持する物体の調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、脂質二重膜を担持する物体、及びその調製方法に関する。

生物適応性材料は、広く開発されてきており、生体内で適用されてきた。しかしながら、生物適応性材料の移植において、適切な細胞応答が示されていない。ゆえに、すべてとは言わないまでも、大多数の生物適応性材料は、ある程度の生物的不活性を示し、その使用及び／又は働きは制限されている。

生物的不活性は、宿主組織との適切な相互作用を欠如させるが、これは、生物学的な誘因の欠如により化学的にその表面が不活性となること、又はバルクタンパク質の吸着を通した生物付着によって引き起こされる。この適切な相互作用の欠如は材料を埋め込んですぐに起こり、特異的な細胞の相互作用を妨害する。

生物的不活性に対しては、生物適応性材料の表面の構造や形態を改質すること、又は生物適応性材料に対して共有結合的又は非共有結合的に生物的に活性なリガンドを結合することによって、好適な細胞応答をもたらすように取り組まれてきた。モデルとなる細胞膜、例えば支持された脂質二重膜（ＳＬＢ）は、タンパク質の付着を減少し、表面の構成を調製することができる。ＳＬＢｓは、ベシクル（小胞）融合によって作製され、１９８５年にＭｃＣｏｎｎｅｌとＴａｍｍによって最初に報告されて以来、広く使用されてきた。ＳＬＢｓは付着しない性質を持ち、構成を調製できることから、固体材料を覆う表面として機能する理想的な候補となる。

しかしながら、ＳＬＢｓの生体内での適用は限られてきた。ＳＬＢｓは、例えば特許文献１において、説明されている。この明細書中に、支持される脂質二重膜を作製する方法が記載されている。脂質二重膜は、固体表面上に、配列して作製されることが好ましい。この方法には以下の工程が含まれる。
（ｉ）固体表面を分子フィルムで覆う工程、
（ｉｉ）分子フィルムにステロール基を共有結合的に結合する工程、
（ｉｉｉ）ステロールとして機能する分子フィルムを脂質溶液に接触させる工程。

米国特許出願公開第２００８／０２４１９４２号明細書

特許文献１に記載されているこの方法の不利な点は、分子フィルムは、例えば親水性であり、ハイドロゲルで覆われているのだが、この分子フィルムを脂質二重膜に結合可能な固体の表面に用いなければならない点である。二重膜は基板の表面に直接結合されず、分子フィルムを通してのみ固体表面に結合される。分子フィルムは、ステロール基と共有結合的に反応する反応基を含み、ステロール基はＳＬＢｓに置換される。ステロール基と分子フィルムの反応基が反応した後、ハイドロゲルには反応基が残るが、この残った反応基はＳＬＢを不安定にし、望んでいない問題を生じさせる。

さらに、脂質二重膜のサポート上に分子フィルムを適用することは、工程を追加することであり、時間を消費するだけでなく、工程の複雑さを招くことになる。ＳＬＢｓの調製に制御が必要になるだけでなく、基板と分子フィルムとの間の作用や付着、分子フィルムの安定性においても制御が必要になる。さらに、分子フィルムはすべてのタイプの固体表面に適用され得るわけではない。それゆえ、ＳＬＢの作製に用いられる基板の選択は限られている。他の不利な点としては、分子フィルムを用いることによって、固体表面の化学的、機械的な特性が変化することが挙げられる。そのため、広い範囲の生物適応性材料上において脂質二重膜を製造できるように、方法を改良する必要がある。

本発明は、表面を備える物体を供給する工程と、活性酸素を含むプラズマで、物体の表面を処理し、物体の表面にアルデヒド基である反応基Ａを供給する工程と、反応基Ａにステロール基を共有結合的に結合し、物体に結合するステロール基の量を、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）による測定で、０．０２ｎｍ ^−２ 以上５ｎｍ ^−２ 以下とする工程と、脂質溶液に、ステロール基で活性化された物体を接触させ、脂質二重膜を形成する工程と、を含むことを特徴とする脂質二重膜を担持する物体の調製方法を提供することにより、この問題を解決する。

本発明によれば、そのバルク特性（ｔｈｅ ｂｕｌｋ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）の影響をうけることなく、再生医学に用いられる物体の表面を簡単に、直接的に、そして安価に改質することができる。本発明の他の利点は、物体上に空気安定性を持った脂質二重膜を形成できることである。さらに、本発明は、異なった種類の材料から造られる物体の扱いを容易に調節することができる。さらに、本発明により得られた物体は、生体内での使用に適している。さらに本発明は、化学的及び機械的に異なる特性をもった広い範囲の材料で造られる物体に適用することができ、この物体を体内に導入することができる。また、この物体の化学的及び機械的な特性に影響を受けずに、細胞応答がなされる。

本実施の形態に係るアルデヒド基形成におけるプラズマエネルギーの影響を示している（プルパルド染色後）。 本実施の形態に係る３タイプの自然ポリマー（ＰＣＬ，ＰＡ、及びＰＧ）のｓｅｎｓｉｌｅ接触角、プラズマを含む酸素による処理後の接触角、コレステロール基末端のアミンのインキュベーション後の接触角を示している。 本実施の形態に係る３Ｄ ＰＣＬ物体上の脂質二重膜のＦＲＡＰ分析を示している。

本発明の工程により、再生医学にて使用するための物体が調製される。物体は、脂質二重膜を担持する１又はそれ以上の表面を供給する。その表面は、何にも覆われていないことが好ましい。物体を準備するために使用される材料としては、チタニウム、アルミニウム、若しくは白金等の金属、金属酸化物、合金、ガラス、セラミック、若しくは高分子化合物、又はこれらの材料の組み合せが挙げられる。高分子化合物は、ホモポリマ―、共重合体、又はブロック共重合体である。高分子化合物としては、例えば、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチレンカプロラクトン（ＰＴＭＣ）、ポリ無水物、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（オルト）エステル、ポリホスファゼンが挙げられる。物体は、ポリエステルを含むことが好ましく、ポリカプロラクトンを含むことがより好ましい。物体は、生物適応性材料で作製されていることが好ましい。

物体は、二次元又は三次元の構造をとることができる。二次元の物体としては、例えば、フィルムやメッシュが挙げられる。このような二次元の物体は、例えば、皮膚を修復したり、皮膚の代わりとなって機能したりすることができる。三次元の物体としては、例えば、移植組織や、装置が挙げられる。移植組織は、例えば、ヒトや動物の体内で、骨、軟骨、又は血管を修復したり、又はこれらの代わりとなって機能したりすることができる。装置は、例えば、ヒトや動物の体を手当や治療する間に使われる。物体は、鋳型や、コンパウンディング、押し出し成型、インフレーション成型、鋳造、又はその他の方法によって調製され得る。また、ラピッドプロトタイピング、又はエレクトロスピニングも物体を調製するために使うことができる。

物体の表面は、活性酸素を含むプラズマで処理される。活性酸素には、化合物を含む反応性の高い酸素の混合物が含まれている。活性酸素はオゾンを含むことができる。活性酸素を含むプラズマでの処理により、物体の表面は改質される。活性酸素は、物体の表面のみを改質し、物体のバルク特性（ｔｈｅ ｂｕｌｋ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）には影響を与えない。

物体表面のプラズマ処理は、市販で利用可能なプラズマ発生装置で行うことができる。プラズマ発生装置は、例えば、電磁放射の供給源を含んでいる。活性酸素を含むプラズマは、酸素を含むガスを活性化する電磁放射を用いることによって得られる。酸素を含むガスとしては、例えば、空気又は酸素に富んだガスを挙げることができ、例えば、少なくとも５０％の酸素を含むことが好ましく、又は少なくとも７５％の酸素を含むことが好ましく、又は少なくとも９０％の酸素を含むことが好ましい。

プラズマを生成する電子放射のエネルギーは広範囲にわたるが、５０Ｊ以上８００Ｊ以下が好ましく、１００Ｊ以上７００Ｊ以下がより好ましく、２００Ｊ以上６００Ｊ以下が最も好ましい。

活性酸素を含むプラズマは、例えばコロナ処理により得られる。コロナ処理（エアプラズマとして述べられることもある）は、表面の特徴に変化を与える際に、低温のコロナ放電プラズマを使う、表面改質技術である。コロナプラズマは、先端でプラズマを生成する電極チップを鋭利にするために、高電圧を用いることによって発生される。電極の線状配列は、コロナプラズマの幕を作るために度々用いられる。これは、工業上プラズマ発生装置の最も一般的なタイプであり、費用効率が高く、３％以上６％以下の濃度の活性酸素を作るにあたり、周囲の空気以外の酸素源を必要としない。

活性酸素を含むプラズマは、紫外線（ＵＶ）光処理、高周波（ＲＦ）プラズマ処理、冷プラズマ処理、又は活性酸素の電解生成によっても作ることができる。ＵＶ発生装置、又は、真空紫外線（ＶＵＶ）発生装置は、狭帯域の紫外線光を発生し、約０．５％以下の濃度の活性酸素のプラズマを発生する光源が備えられている。この方法の不利な点は、比較的長い時間、空気（酸素）をＵＶにさらす必要がある点である。冷プラズマ方法においては、プラズマは、純酸素ガスを誘電体バリア放電にさらすことによって作られる。二原子の酸素は単原子に分けられる。酸素原子は、例えば、三原子に組み替えられることができ、オゾンを形成する。冷プラズマ装置は、入力源として純酸素（例えば７５％以上の酸素を含む）を利用し、最大約５％の濃度の活性酸素のプラズマを作ることが好ましい。活性酸素を含むプラズマの電解生成は、プラズマ中の水分子を、例えば、Ｈ_２、Ｏ_２、Ｏ_３に分解する。たいていの電解生成方法においては、プラズマ中の唯一の反応生成物として例えば酸素やオゾンを含むガスを残すために、水素ガスは除かれる。この活性酸素を含むプラズマの生成方法は、プラズマ中で２０％以上３０％以下の活性酸素濃度を達成することができ、水が最初の基質として使われるため空気の質の影響を受けない。

活性酸素を含むプラズマで物体の表面を処理する際に、高周波（ＲＦ）プラズマ処理又は冷プラズマ処理が使われることが好ましい。

本実施の形態において、プラズマ発生装置は活性チャンバーを有しており、活性チャンバー内で物体が処理される。活性チャンバーは、プラズマ処理中は減圧下に置かれる。減圧条件としては、１バールより低い圧力が好ましく、１０トルより低い圧力がより好ましく、１トルより低い圧力が最も好ましい。本実施の形態において、活性チャンバーには、電磁放射によって活性化され得る酸素含有ガスが入れられ、活性酸素を含むプラズマを生成する。

反応基Ａは、活性酸素を含むプラズマで処理することにより、物体の表面に形成される。このような反応基Ａとしては、例えば、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エステル基、酸性基が挙げられる。表面の反応基Ａは、アルデヒド基であることが好ましい。反応基Ａは、安定ではなく、時間経過に伴い消失する。反応基Ａの安定性は、例えば水、又はアルコールのような極性溶媒下に置かれると比較的大きくなる。室温で反応基Ａは、プラズマ処理後２００時間まで安定である。非極性溶媒、又はガスのような疎水性条件下では、反応基はほんの数時間、例えば２時間、又はそれ以下でしか安定でいることができない。

物体の表面に反応基Ａが存在することは、ステロール基で共有結合を形成するために当然必要である。ステロール基への共有結合的な結合は、プラズマで物体の表面を処理してから、最大で２時間で行われることが好ましく、処理後最大で１．５時間で行われることがより好ましく、処理後最大で１時間で行われることが最も好ましい。一般的に、ステロール基への共有結合的な結合は、処理後３０分以内に起こり、処理後１５分以内に起こることがより好ましい。

物体の表面の反応基Ａの濃度は、プラズマの存在する活性酸素の量、及び物体が活性酸素にさらされる時間によって影響を受ける。プラズマ中の活性酸素の量は、広い範囲にわたり得るが、例えば、プラズマ処理で選択される方法、プラズマを生成する電子放射のエネルギー、及びプラズマ処理中の活性チャンバーにおける条件に依存している。

物体の表面に反応基Ａを生成するために必要とされる、プラズマ中の活性酸素の量は、物体のタイプ、物体の材料、及び物体を作るために用いられる材料の特性によって、変わる。

例えば、物体がポリカプロラクトンから作られており、物体の処理にコロナ処理が選択された場合、プラズマは、４００Ｊのエネルギーで電子放射によって生成され、１−１０秒継続し、好ましくは２−６秒継続し得る。同様にポリカプロラクトンの物体の処理において、ＵＶ処理が選択された場合、プラズマは、同様に４００Ｊのエネルギーで電子放射によって生成され、１０−７２００秒継続し、好ましくは１５−３６００秒継続し得る。物体の処理に高周波プラズマ、又は冷プラズマが使用された場合、プラズマは、４００Ｊのエネルギーで電子放射によって生成され、５−１２秒継続し、好ましくは６−１１秒継続し得る。

物体の表面の反応基Ａの量は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）による測定で測定され、少なくとも０．０２ｎｍ^−２であり、少なくとも０．０６ｎｍ^−２であることが好ましく、少なくとも０．１５ｎｍ^−２であることがより好ましい。反応基Ａの量は、多くとも１０ｎｍ^−２であることが好ましく、多くとも５ｎｍ^−２であることがより好ましく、多くとも２ｎｍ^−２であることが最も好ましい。反応基Ａの量は、０．１５ｎｍ^−２以上２ｎｍ^−２以下であることが好ましい。反応基Ａの量は、ｎｍ^−２の単位で与えられ、物体の表面のｎｍ^２当たりの反応基Ａの量を示している。本発明の方法によれば、ステロール基は反応基Ａに共有結合的に結合する。ステロール基としては、コレステロール、デスモステロール、カンペステロール、ラノステロール、シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール等が挙げられる。ステロール基としては、コレステロールがより好ましい。ステロールは、Ａリングの３の位置でヒドロキシル基を通して、又はスペーサー部分を通して、反応基Ａと直接反応する。本実施の好ましい形態としては、ステロール基はスペーサー部分を含み、スペーサー部分が物体の表面で反応基Ａと共有結合的に反応することができる。スペーサー部分を含むステロールは、ステロールとスペーサーから調製される。スペーサーは、一つの反応基Ｂと一つの反応基Ｃとを含むことが好ましい。反応基Ｂはステロールのヒドロキシル基と共有結合的に反応し、反応基Ｃは物体の表面の反応基Ａと共有結合的に反応する。このように、ステロールは、スペーサー部分を通して反応基Ａに共有結合的に結合することができる。スペーサーは、１から５０、好ましくは１から２０、より好ましくは１から１０の炭素原子を含む炭化水素基を含んでいることが好ましい。スペーサーはまた、酸素、硫黄、窒素のようなヘテロ原子を含むことができる。スペーサーとしては、例えば、スペルミン、ペプチド類、親水性の共重合体ポリマー又はオリゴマ―等のポリアミンが挙げられる。スペーサーは、親水性の共重合体ポリマー又はオリゴマ―であることが好ましく、スペーサーがポリエーテルを含むことがより好ましく、オリゴ（エチレングリコール）を含むことが最も好ましい。

反応基Ｂ、及び反応基Ｃは、スペーサーの末端に結合していることが好ましい。反応基Ｂ、及び反応基Ｃとしては、例えば、アミン類、アミド、カルボン酸、エステルが挙げられる。

物体の表面のステロール基の量は、重要である。ステロール基の量は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）により測定され、少なくとも０．０２ｎｍ^−２であり、少なくとも０．０５ｎｍ^−２であることが好ましく、少なくとも０．１ｎｍ^−２であることがより好ましい。ステロール基の量は、多くとも５ｎｍ^−２であることが好ましく、多くとも２ｎｍ^−２であることがより好ましく、多くとも１ｎｍ^−２であることが最も好ましい。ステロール基の量は、ｎｍ^−２の単位で与えられ、物体の表面のｎｍ^２当たりのステロール基の量を示している。

ステロール基の量が少なすぎると、脂質二重膜を形成するために、脂質溶液中の脂質ベシクルが開かず、又は不安定な脂質二重膜が形成される。物体のステロール基の量が多すぎると、単なる脂質単分子膜や脂質二重膜でない膜が物体上に形成され、又は下層が流動膜でない脂質二重膜が形成される。

物体の表面のステロール基の量は、一般的に、反応基Ａの量よりも少ない。これは、反応基Ａは安定でなく、一部の反応基Ａは時間経過と伴って消失するためである。

ステロール基が結合した反応基Ａで活性化された物体のインキュベーション時間は重要である。ステロール基が反応基Ａと反応するために、十分な時間をとらなければならない。室温では、ステロール基のインキュベーション時間は、０．２５時間以上４時間以下であることが好ましく、０．５時間以上３時間以下であることがより好ましく、０．７５時間以上２．５時間以下であることが最も好ましい。

本発明の方法によれば、ステロール基で活性化された物体は、脂質二重膜を形成するために、脂質溶液に接触される。ステロール基は物体の表面全体に存在するため、脂質二重膜は物体の周り全体に存在する。本発明の方法の利点は、脂質二重膜が物体の表面全体を覆う点である。このように、複雑な構造の物体も、脂質二重膜で覆うことができる。

脂質溶液は、合成又は自然発生の脂質、及びリン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、ステロール等のような両親媒性の分子を含む溶液である。脂質溶液は、ベシクル、リポソーム、ミセル、単分子膜又は二重膜の断片を含んでいる。脂質溶液はさらに、膜貫通タンパク質、表在性膜タンパク質、ペプチド類、糖脂質等を含んでいる。異なる脂質を混合して用いることができる。適当な脂質の特徴的な例としては、自然又は合成のリン脂質等が挙げられる。自然のリン脂質誘導体としては、例えば、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）、卵ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ダイズＰＣ、水素化ダイズＰＣ、スフィンゴミエリン等が挙げられる。

合成のリン脂質誘導体としては、例えば、以下のものが挙げられる。
・ホスファチジン酸誘導体としては、例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸塩（１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＭＰＡ））、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸塩（１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＰＰＡ））、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸塩（１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＳＰＡ））
・ホスファチジルコリン誘導体としては、例えば、１，２−ジデカノイルーｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−Ｄｉｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＤＰＣ））、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＬＰＣ））、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＭＰＣ））、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＰＰＣ））、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＳＰＣ））、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＯＰＣ））、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＯＰＣ））、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−Ｄｉｅｒｕｃｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＥＰＣ））
・ホスファチジルグリセロール誘導体としては、例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホーｒａｃ−（１−グリセリン）（１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３［Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−（１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＤＭＰＧ））、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホーｒａｃ−（１−グリセリン）（１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３［Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−（１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＤＰＰＧ））、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホーｒａｃ−（１−グリセリン）（１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３［Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−（１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＤＳＰＧ））、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスホーｒａｃ−（１−グリセリン）（１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３［Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−（１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＰＯＰＧ））
・ホスファチジルエタノールアミン誘導体としては、例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＭＰＥ））、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＰＰＥ））、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ））、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ））
・ホスファチジルセリン誘導体としては、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ（ＤＯＰＳ））
・ＰＥＧリン脂質誘導体としては、例えば、ｍＰＥＧ−リン脂質（ｍＰＥＧ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリグリセリン−リン脂質（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｉｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、官能化されたリン脂質（ｆｕｎｃｉｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、末端活性―リン脂質（ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）
・Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム メチル−硫酸塩（Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆａｔｅ（ＤＯＴＡＰ））

リン脂質は、親水性の頭部と、２つの疎水性の尾部を持っている。リン脂質が水にさらされると、二層のシート（二重膜）を形成し、シートの中心部にすべての尾部を向ける。この二重膜の中心は、ほとんど水を含んでおらず、水に溶けるが油に溶けない砂糖や塩のような分子を遮断する。

ある一定の温度で、脂質二重膜は、液体段階、又はゲル（固体）段階で存在する。すべての脂質には、ゲル段階から液体段階へ変化する（溶ける）特徴的な温度がある。どちらの段階においても、脂質分子は、二重膜を横切ることが妨げられている。しかし、液体段階の二重膜においては、ある脂質は、一秒間に何百万回も近隣に位置を変える。液体段階の二重膜と違って、ゲル段階の二重膜は、位置が固定されている。

脂質の尾部がまず二重膜の段階の動きを調節する一方、二重膜の表面化学を決定するのは脂質の頭部である。リン脂質の最も一般的な頭部はホスファチジルコリン（ＰＣ）である。ホスファチジルコリンは双性イオン性頭部を有し、リン酸基の負の電荷とアミンの正の電荷を有しているが、これらの電荷はバランスを保っているため、生理的ｐＨでは正味電荷がない状態となる。生理的ｐＨで正味の電荷がないもう一つの頭部としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。

他の頭部、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、及び、ホスファチジルグリセロールは、生理的ｐＨで負の電荷を有している。

双性イオン性の観点から、ホスファチジルコリン誘導体が用いられることが好ましい。ホスファチジルコリン誘導体の１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＯＰＣ））、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＰＰＣ））、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＳＰＣ））が用いられることがより好ましい。

溶媒は通常、水溶液であり、例えば、水性緩衝液、又は塩溶液が挙げられる。

脂質二重膜は、架橋されることができる。脂質二重膜の架橋は、ＵＶ光下で成される。ＵＶ光は、例えば、脂質を含む、ジエノイル（Ｄｅｎ）、ジアセチレン（Ｄｉｙｎｅ）、ソルビル（Ｓｏｒｂ）、又は、アクリロイルの光重合を開始する。これらの脂質としては、例えば、ビス−ＤｅｎＰＣ、モノ−ＤｅｎＰＣ、モノ−ＳｏｒｂＰＣ、ビス−ＳｏｒｂＰＣ、ジイン ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が挙げられる。さらに架橋は、脂質により修飾された脂肪酸を使って成される。脂質により修飾された脂肪酸としては、ジアセチレン脂質、例えば、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−ｂｉｓ（１０，１２−ｔｒｉｃｏｓａｄｉｙｎｏｙｌ）−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、又はジフィタノイル、例えば、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｙｔａｎｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）が挙げられる。

本発明の方法の次の工程では、脂質二重膜を、少なくとも１つの疎水性末端を含むペプチドに接触させる。ペプチドは、ペプチド結合により繋がれたアミノ酸モノマーの短い鎖である。ペプチド結合は、１つのアミノ酸のカルボキシル基がもう１つのアミノ基と反応した時に形成される共有結合である。ペプチドは、大きさを基準としてタンパク質と区別され、約５０以下のアミノ酸を含んでいる。ペプチドは、例えば、タンパク質のフラグメント、又は組換えタンパク質から選択される。ペプチドは、ペプチドに由来するフィブロネクチンであることが好ましく、ＲＧＤ又はＰＨＳＲＮであることがより好ましい。ＲＧＤは、Ｌ−アルギニン、グリシン、Ｌ−アスパラギン酸から構成されるトリペプチドである、アルギニルグリシルアスパラギン酸の略語である。ＰＨＳＲＮは、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎのペプチド配列の略語である。ここで、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、及びＡｓｎは、アミノ酸の略語である。Ｐｒｏはプロリン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｓｅｒはセリン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎはアスパラギンである。ペプチドは、少なくとも１つの疎水性末端を含み、１つ又は２つの疎水性末端を含むことが好ましい。疎水性末端としては、例えば、パルミトイル、ミリストイル、ゲラニル、ファルネシル、グリコシル、ホスファチジル、イノシトールが挙げられる。ペプチドは、少なくとも１つのパルミトイル疎水性末端を含むことが好ましい。また、ペプチドは、１つ又は２つのパルミトイル疎水性末端を含むことがより好ましい。（複数の）疎水性末端は、脂質二重膜の疎水性の内側部分に接している。脂質二重膜に結合されたペプチドは、脂質二重膜を担持する物体に接触する細胞の細胞付着や細胞機能に影響を与えると言われている。

疎水性末端を含むペプチドも、脂質溶液に混ぜられ、脂質溶液と一緒に、ステロール基で改質された物体に接触することができる。

本発明の物体の調製方法における好ましい形態は、表面を備えるポリカプロラクトンからなる物体を供給する工程と、高周波プラズマ又は冷プラズマを含む酸素で、物体の表面を処理し、物体の表面に反応基Ａを供給する工程と、反応基Ａに、共有結合的にオリゴ（エチレングリコール）スペーサーに結合しているコレステロールを含むステロール基を反応させる工程と、ホスファチジルコリン誘導体を含む脂質溶液に、コレステロール基で活性化された物体を接触させ、脂質二重膜を形成する工程と、１又は２のパルミトイル疎水性末端を含むＲＧＤペプチド又はＰＨＳＲＮペプチドに、脂質二重膜を接触させる工程と、を含むことを特徴とする。

本発明の脂質二重膜を担持する物体のもう一つの形態は、ポリエステル材料を含む物体と、スペーサーによって、ポリエステル材料に共有結合的に結合したステロール基と、ポリエステル材料に共有結合的に結合したステロール基を囲う脂質二重膜と、脂質二重膜に結合した少なくとも１の疎水性末端を含むペプチドと、を有することを特徴とする。

本発明の物体においては、ポリエステルがポリカプロラクトンであることが好ましい。スペーサーは上記したスペーサーから選択することができる。スペーサーはオリゴ（エチレングルコール）を含むことが好ましい。オリゴエチレングルコールは、１から２０のエチレングリコールモノマーユニットを含むことが好ましく、２から１０のユニットを含むことがより好ましく、２から６のユニットを含むことが最も好ましい。脂質二重膜は、上記した脂質を含むことが可能である。脂質二重膜は、リン脂質を含むことが好ましく、ホスファチジルコリン誘導体を含むことがより好ましく、ＤＯＰＣを含むことが最も好ましい。少なくとも１つの疎水性末端を含むペプチドは、少なくとも１つのパルミトイル疎水性末端を含むことが好ましい。ペプチドは、ペプチドに由来するフィブロネクチンであることが好ましく、ＲＧＤ又はＰＨＳＲＮであることがより好ましく、パルミトイル化されたＲＧＤ又はＰＨＳＲＮであることが最も好ましい。

本発明の脂質二重膜を担持する物体は再生医学にて使用することができる。再生医学では、適切な組織形成を可能とするために、特異的な細胞の相互作用が必要とされる。再生医学は、本発明の方法で造られる、脂質二重膜を担持する物体上で行われる。再生医学は、生体内で、試験管内で、又は対外で行われる。本発明は、表面の細胞応答から、物体のバルク材の特性を分離することを可能にする。この結果、物体は、移植可能な材料の生物不活性に取り組むと同時に、細胞の相互作用を調節することができる。二重膜の構成を変えることによって、物体上の二重膜の状態（液体又はゲル、正の電荷、負の電荷、又は電荷がない等）に影響を与えることができる。これにより、二重膜の表面における細胞の付着、及び細胞の成長が影響を受ける。このように、二重膜の構成を変えることによって、物体上の再生医学に影響を与えることができ、導くことができる。再生医学としては、例えば、組織再生が挙げられ、軟骨、血管、及び心臓弁等が移植の目的で培養されている。

本発明の物体は、また、汚染防止の特性を有している。

本発明は、この後、次の実施例により明瞭にされるが、これに限定されるものではない。

実施例１：ステロール基の合成
コレステロール基末端のアミンの合成は、文献に基づいて行った。

１．０モル当量ｉ（ｎ−Ｂｏｃ−２，２’−［エチレンジオキシ］（ｎ−Ｂｏｃ−２，２’−［ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ］ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び１．１モル当量ｉｉ（コレステリル クロロ炭酸塩（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を無水トルエン中で撹拌した溶液に対して、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の１．５モル当量、及び触媒量のＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。反応混合物は１７時間アルゴン雰囲気下で還流された。その後、溶媒は、油性残量物を得るために減圧下で除去された。溶離液（Ｒｆ＝０．２２）として、４０％エチルアセテート＋６０％ヘキサンを使って、フラッシュクロマトグラフィーがなされた。溶媒は減圧下で除去され、生成物ｉｉｉがオフホワイトの粘着性の残量物として得られた。

ＥＳＩ−ＴＯＦ：［Ｍ］^＋ ｃａｌｃｄ ６６１，［Ｍ］^＋ ｆｏｕｎｄ ６６１．^１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：５．３７（ｔ，１Ｈ，オレフィンのＨ），５．２５（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），５．１（ｔ，１Ｈ ＮＨ），４．５（ｍ，１Ｈ，Ｏ−ＣＨ コレステロール），３．６１（ｓ，４Ｈ，Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ），３．５５（ｍ，４Ｈ，２ｘＯ−ＣＨ_２），３．３７（ｍ，４Ｈ，２×ＣＨ_２ ｉｎ ＣＨ_２ＮＨ），２．５−０．８７（３４Ｈ，コレステロール），１．５（ｓ，９Ｈ ｔｅｒｔ ＢＯＣ），０．８６（ｄ，６Ｈ ２×ＣＨ_３ コレステロール），０．６８（ｓ，３Ｈ，１×ＣＨ_３ コレステロール）

生成物ｉｉｉはジクロロメタンに溶解し、ジクロロメタン中の４モル当量のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）の撹拌溶液に、液滴法で加えられた。脱保護基が、継続的な撹拌下、室温で２３時間経過後に得られた。ＴＬＣを使って、脱保護基が観察された。溶媒は減圧下で除去され、残留物はジクロロメタンに溶解し、ＴＥＡ（トリメチルアミン）で中和した。１％ＮＨ_３（水）溶液（水に２５％ＨＮ_３）、９％ＭｅＯＨ、及び９０％クロロホルム（Ｒｆ_{ｆｒａｃ１３−１６}＝０．３８，Ｒｆ_{ｆｒａｃ１７−３５}＝０．２４）を使って、フラッシュカラムクロマトグラフィーがなされた。溶媒除去後、黄色の粘着性の残留物が得られた（収率７６．３％）。精製された生成物は、使用するまで−２０℃で保存した。

ＥＳＩ−ＴＯＦ：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｃａｌｃｄ ５６１，［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｆｏｕｎｄ ５６１．^１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：５．３７（ｔ，１Ｈ，オレフィンのＨ），５．２５（ｔ，１Ｈ ＮＨ），４．５（ｍ，１Ｈ，Ｏ−ＣＨ コレステロール），３．６１（ｓ，４Ｈ，Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ），３．５６（ｍ，４Ｈ，２×ＯＣＨ_２），３．５２（ｔ，２Ｈ， ＮＨ_２），３．３７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ｉｎ ＣＨ_２ＮＨ），２．８９（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２ＮＨ_２），２．５−０．８７（３４Ｈ，コレステロール），０．８６（ｄ，６Ｈ，２×ＣＨ_３コレステロール），０．６８（ｄ，３Ｈ，１×ＣＨ_３ コレステロール）

実施例２：ポリカプロラクトンの活性酸素処理
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）は、Ｐｌａｓｍａ ｐｒｅｐ ＩＩ（ＳＰＩ ｓｕｐｐｌｉｅｓ）を使って、酸素プラズマ処理（ＯＰＴ）で、１０秒間処理された。これは、高周波プラズマ処理である。使われるＰＣＬは、クロロホルムから得られたＰＣＬシート溶媒であり、数平均分子量４５０００ダルトン（Ｓｉｇｍａ）であった。

サンプルを処理する前に、チャンバーを２０秒間クリーニングランにより洗浄した。プラズマ処理は、４００Ｊ、真空加圧２００ミリトルのエネルギーで、電磁放射を使ってなされた。

これにより、効果的にアルデヒド基が生じて、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）において、アルデヒド特有のプルパルド染色の紫の変色が示された。アルデヒド基の生成はＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）、及びＩＲ分光分析法でさらに確認された。Ｑｕａｎｔｅｒａ ＳＸＭ（物理電子工学からＸＰＳのマイクロプローブを走査する）は、特にＯ−Ｃ＝Ｏ、及び−Ｃ＝Ｏにおいて、酸素含有基の増加を示した。さらに、全反射法におけるフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ；ダイアモンド）を、偏光変調高感度反射法（ＰＭ−ＩＲＲＡＳ）と比較することによって、バルク高分子の修飾は除外された。ＰＭ−ＩＲＲＡＳのスピンコートされた金のサンブルにおいてのみ、カルボニル領域にショルダが現れた。これは、ＡＴＲスペクトルにおいては観察されなかった。ＡＴＲダイアモンドは５μｍ、及びＰＭ−ＩＲＲＡＳはｎｍ領域、というようにサンプリングの深さの違いのため、酸素プラズマ処理の表面が制限された。

プラズマ処理は、異なるエネルギーを持つ電磁放射を使って繰り返し行われた。これらの実験結果は、図１に示される。図１は、現実験条件下でのＰＣＬ処理において、４００Ｊでの電磁放射エネルギーが最適であることを示している。

実施例３：表面の改質
実施例２にてＯＰＴで改質されたポリカプロラクトンシートは、エタノール中で、コレステロール基の末端に配置されるアミン１ｍＭに接触される。溶液を振動させながら、室温で１時間連続的に接触する。改質されたカプロラクトンシートは、エタノール１０ｍＬ中に１００ｍｇの新しいＮａＢＨ_４溶液（Ｓｉｇｍａ）、及び４０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）において、直接分解された。本実施例、及び実施例４ａにおいて、ＰＢＳは、脱イオン水２００ｍＬにＰＢＳタブレット（Ｓｉｇｍａ）を溶解して調製し、０．００２７Ｍの塩化カリウム及び０．１３７Ｍの塩化ナトリウムを使って、２５℃、ｐＨ７．４で、０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水を得た。次に、サンプルは塩を取り除くためにミリＱでリンスされ、吸収されたリンカーを取り除くためにエタノール中で短時間、超音波処理され、窒素流下で乾燥された。

酸素プラズマ処理後に形成されたアルデヒド基が、コレステロール基に対して活性であるかどうかを評価するために、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）（Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴ）、及び接触角の測定が使われた。

４００Ｊのエネルギーをもつ電磁放射を使って酸素プラズマ処理（ＯＰＴ）で処理された３つの異なるバイオポリマーの表面改質が比較された。テストされたバイオポリマーは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ、Ｍｎ＝４５ｋＤａ）、分割型のブロック共重合体のポリ（エチレンオキシドテレフタレート）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＡ、Ｐｏｌｙａｃｔｉｖｅ（登録商標）１０００／７０／３０）、ブロック共重合体のポリ乳酸、及び、ポリカプロラクトン（ＰＧ、ＰＬＡ６５／ＰＣＬ３５）であった。ＯＰＴ処理後、サンプルは、上記のとおり、１時間、コレステロール基末端に配置されるアミンでインキュベーションされた。ＯＰＴ処理、及びレステロール基末端に配置されるアミンでのインキュベーション後、ｓｅｎｓｉｌｅ接触角が測定された。

接触角の測定方法は以下の通りであった。
Ｓｅｎｓｉｌｅ水接触角は、Ｋｒｕ（ウムラウト）ｓｓ接触角測定システムＧ１０を使って測定された。接触角を測定するサンプルは測定側が上向きに水平に置かれ、測定された。自動化されたシリンジを使って、水の小滴（３０μＬの蒸留された小滴、又は超高純度のミリＱ水等）が、表面に滴下された。小滴は、５秒の間にイメージ化された。ｓｅｎｓｉｌｅ水接触角をサンプルに合わせるソフトを使って、表面が推測される。サンプルは、水接触角の信頼できる値が見つかることを確かにするために、＞ｎ＝３の様々な位置で測定される。

図２は、負の電荷のポリマー（ＰＣＬ、ＰＡ、及びＰＧ）の接触角、ＯＰＴ処理後の接触角、及びコレステロール基の末端に配置されるアミンでインキュベーション後の接触角を示している。接触角は、ＯＰＴ処理後はより低くなり、これは表面がより親水性になることを意味している。コレステロール基の末端に配置されるアミンでインキュベーション後は、ポリマーの表面は再びより疎水性になる。

さらに、ＯＰＴ処理後の接触角が、ＰＧポリマーにおいて測定された。表１に示すように、接触角は様々な時間経過後に測定された。また、ＢＳＬＢの流動性の特性が測定された。コレステロール基末端に配置されるアミンのインキュベーションは、上記の通り行われた。脂質二重膜の形成方法は、以下の実施例４のａに記載されている方法でなされた。脂質二重膜の流動性の大きさは、以下の実施例４のｂに記載されているようにＦＲＡＰ分析によって測定された。これらの測定結果は、どのくらいの時間で、反応基ＡがＰＧポリマーの表面に存在するかを決定するために使われた。表１は、ＯＰＴ処理をして（室温で）水に保存後、約９２時間、接触角は低いままであったことを示している。（室温で）空気中に保存後、約２時間、接触角は低いままであった。このように、この時間内で、ステロール基の構造は反応基Ａに結合することが可能であり、空気安定性を持った脂質二重膜（ｒＢＳＬＢ）を形成していた。

ＰＡ（Ｐｏｌｙａｃｔｉｖｅ（登録商標） １０００／７０／３０）を用いた同様の安定性の実験では、反応基Ａ（アルデヒド基）の安定性は、ずっと低いことが示され、アルデヒド基とステロール基の反応は、ＰＡ−物体の表面を活性化した後、５分以内に行うことが好ましい（表１参照）。

実施例４：
ａ．脂質二重膜の形成
大きな単ラメラのベシクル（ＬＵＶｓ）は、Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓの押し出し成形において１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、多層ベシクル（ＭＬＶ）の溶液を１１回除外することによって調製された。ＭＬＶ溶液は、Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓから得られた１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＯＰＣ））の溶液であった。ＤＯＰＣのＭＬＶｓは、新しいミリＱ（１８ＭΩ）中に１ｍｇ／ｍＬで再水和された脂質の固体をボルテックスすることによって、生成された。脂質の固体は、９９．８モル％のＤＯＰＣ、及び０．２モル％のＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１，２−ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＨＰＥ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）を、有機溶媒から乾燥させることによって調製された。この固体は、窒素流下で乾燥され、真空下で１時間乾燥して置かれた。実施例２においてＯＰＴで改質されたポリカプロラクトンのシート、及び実施例３においてＯＰＴで改質され、コレステロールで改質されたポリカプロラクトンのシートは、ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬに薄められたＬＵＶ溶液で処理された。シートは、ベシクルの吸着及び破裂が起こるように、使用される脂質のＴ_ｍ（例えば、ＤＯＰＣであれば−２０℃）より上で、４５分間、ＬＵＶ溶液を用いてインキュベーションされた。破裂したベシクルをさらに確実に高収率で得るために、任意で、−８０℃での凍結ステップを、最初のインキュベーション後に入れた。１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）において、シートをよく洗浄した後、ＰＣＬ上に蛍光でラベルした二重膜が得られ、ＰＣＬシートの蛍光イメージによって示された。

物体上に形成されたＤＯＰＣ層の厚さは、力分光法（ｆｏｒｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）の測定で４．１ｎｍ＋／−０．７ｎｍであった。

ｂ．ＦＲＡＰ、光漂白後蛍光回復
実施例４ａのＤＯＰＣ脂質二重膜は、ＰＣＬ担持の流動性を証明した。流動性は、蛍光脂質の集合が漂白された、いわゆる蛍光回復した後におこる拡散を観察することによって、推定される。

図３に示すＤＯＰＣで構成される二重膜は、０．２モル％のＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＤＨＰＥでドープし、１００ｎｍのＬＵＶを使って調製された。ａは、一成分適合、Ｒ^２０．９９９２０７を使った共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＳＬＭ）ＦＲＡＰ回復曲線である。９５％より大きい流動性フラクションを用いて、１．０１６μｍ^２／ｓ±０．０１２の拡散係数が得られた。漂白、及び取得している間、ＲＯＩ、Ｔｏｔ、及びＢＧ領域では２４μｍのωが得られた。図は、９００ミリ秒の間隔で６００反復を使って、シングルＦＲＡＰ測定をしている間の、完全な回復曲線を示している。ｂは漂白前、ｃは漂白後、ｄは１５分後の蛍光回復の落射蛍光のイメージであり、スケールバーは２００μｍを示している。ここでは、視野絞りを閉じて、単一の繊維上に１３０μｍのスポットを漂白して、蛍光層の後の拡散を質的に評価した。

上記の方法によって、ＯＰＴ処理し、その後コレステロール基末端に配置されるアミンで、それぞれ１時間、２時間、３時間インキュベートされたＰＣＬシート上に、脂質二重膜が形成された。以下の表２において、ＯＰＴ処理とともに、コレステロール基末端に配置されるアミンのインキュベーションを行うことによって、空気安定性を持った脂質二重膜（ｒＢＳＬＢ）が、ＦＲＡＰ分析による測定にて、９０％よりも大きい流動性フラクションで形成されたことが示されている。コレステロール基末端に配置されるアミンのインキュベーションを３時間継続するとき、空気安定性を持った脂質二重膜の流動性フラクションの割合は、約５０％に減少された。処理されないＰＣＬシート、及びＯＰＴ処理のみされたＰＣＬシート上には、空気安定性を持った脂質二重膜は形成されなかった。

ｃ．ｒＢＳＬＢタンパク質と細胞付着
０．５×０．５ｃｍ^２のＰＣＬフィルム（Ｓｉｇｍａ）は、実施例２、実施例３、及び実施例４ａに記載された工程により形成されたＤＯＰＣ脂質二重膜で、片方の面だけ改質され、もう片方の面は変えられなかった。これらのフィルムは、暗室、室温で２０分間、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で修飾された牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）でインキュベートされた。所定のインキュベーション、及び１時間のＳＤＳ溶液中でのタンパク質脱離の後、ＢＳＡ−Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８は、改質されたＰＣＬフィルムの非付着性を測定するために、量が測定された。二重膜を適用した後、すべてのタンパク質吸着は、約５０％まで減少した。この減少は、双性イオン性を有する脂質二重膜の非付着性のためであると期待される。すべての表面領域の半分のみを処理したので、継時的に１回、２回、又は３回、サンプルを脱水、及び再水和した後でさえ、高い程度のタンパク質抵抗（約１００％の）が推定される。１回の脱水サイクルは、物体上のすべての液体を除去し、３０分間乾燥することで、なされた。その後、ＰＢＳは、脂質二重膜を再水和するために加えられ、脱水も再水和もすべて室温で行われた。

Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８と結合したＢＳＡは、ＰＢＳにおいて基質とインキュベーションされた。吸着されたタンパク質は、ＳＤＳ溶液中で脱離された後、プレートリーダーで量が測られた。表３は、ＦＢＳを欠いたＤＭＥＭ中のＢＳＡの吸着データを示している。比較するタンパク質吸着は平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ（ｎ＝３））で表され、ポストホックテューキーテスト（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ ｔｅｓｔ）、＊ｐ＝＜０．０５を用いて１−ｗａｙ Ａｎｏｖａを使って比べられる。

ＢＳＡ吸着の数値は、ＰＣＬ物体への脂質二重膜の結合が安定であることを示す。サンプルを３回、再水和及び脱水した後でさえ、ＢＳＡ吸着の改善は起こらなかった。さらに、ＢＳＡによるタンパク質の付着は、脂質二重膜に起こらない。このことから、脂質二重膜は、他の生物付着から物体を防護することも予測される。

ｄ．ＢＳＬＢのタンパク質付着
ＢＳＬＢの非付着性において洞察を得るために、タンパク質吸着分析が行われた。ここでは、蛍光でラベルされたＢＳＡが調製され、サンプル表面に吸着されたタンパク質の量が測られた。手短に言うと、Ｄｙｌｉｇｈｔ−４８８で活性化されたＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｎ−ｈｙｄｒｏｃｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ））がＢＳＡでインキュベーションされ、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって提供されたプロトコールに従いスピンカラムを使って、精製された。０．５×０．５ ｃｍ^２（Ｓｉｇｍａ）のＰＣＬフィルムに改質されたＢＳＬＢは、２０分間ＰＢＳに共役されたＢＳＡ５０μｇ／ｍＬで、インキュベーションされた。吸着されたタンパク質は、室温で１時間、ＳＤＳ溶液で脱離され、プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、及び標準曲線を使って、量が測られた。脱水されたＢＳＬＢの場合、バッファーが除かれ、表面が空気にさらされた。次に、ＰＢＳバッファーが、ＢＳＬＢサンプルを再水和するために加えられた。表４にデータが示され、ＢＳＬＢの形成によって、吸着されたタンパク質の量は、著しく減少している。

実施例５：パルミトイル化されたペプチド合成
ａ．パルミトイル化されたペプチド前駆体の調製
ＫＧＧ−ペプチドが、マイクロ波固相ペプチド合成（ＣＥＭ）を使って、合成された。フルオレニルメチルオキシカルボニル基（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＦＭＯＣ））で保護されたアミノ酸、カップリング試薬ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、及びＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ヘキサフロロ−リン酸塩（Ｏ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｕｒｏｎｉｕｍ−ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ））が、Ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｅｃｈから得られた。リンクアミドレジン、及びＨＯＢＴ／ＨＢＴＵカップリングが使われた。アミノ酸カップリング方法の一般的な製造業者が採用された。最初のアミノ酸は、最初のダブルカップリング工程を使って、カップリングすると推測された。

ペプチドが固相マイクロ波ペプチド合成を使って合成された。

ペプチド合成試薬（使用液）
溶媒：Ｎ−メチル−２−ピロリドン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＮＭＰ））
樹脂：リンクアミド（Ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
脱保護基溶液：２０％ピぺリジン、ＮＭＰ中に０．１Ｍ ＨＯＢＴ
活性剤：ＮＭＰ中に０．５Ｍ ＨＢＴＵ
塩基性活性剤：ＮＭＰ中に２．０Ｍ ＤＩＰＥＡ
アミノ酸：０．２Ｍのアミノ酸、ＭＮＰ中に０．３Ｍ ＨＯＢＴ

アミノ酸シングルカップリング
１．樹脂をＮＭＰで洗浄した。
２．脱保護基、１０ｍＬ加えた。
３．マイクロ波ステップ；３５ワット、最大Ｔ〜４０℃、〜４０秒
４．樹脂をＮＭＰで洗浄した。
５．脱保護器、１０ｍＬ加えた。
６．マイクロ波ステップ；３５ワット、最大Ｔ〜７９℃、〜３分
７．樹脂をＮＭＰで洗浄した。
８．アミノ酸５．０ｍＬ加えた。
９．活性剤２．０ｍＬ加えた。
１０．塩基性活性剤１．０ｍＬ加えた。
１１．マイクロ波ステップ；Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ：２５ワット、Ｔ〜７９℃、〜５分
１２．ＮＭＰで洗浄した。

アミノ酸ダブルカップリング
１．樹脂をＮＭＰで洗浄した。
２．脱保護基、１０ｍＬ加えた。
３．マイクロ波ステップ；３５ワット、最大Ｔ〜４０℃、〜４０秒
４．樹脂をＮＭＰで洗浄した。
５．脱保護器、１０ｍＬ加えた。
６．マイクロ波ステップ；３５ワット、最大Ｔ〜７９℃、〜３分
７．樹脂をＮＭＰで洗浄した。
８．アミノ酸５．０ｍＬ加えた。
９．活性剤２．０ｍＬ加えた。
１０．塩基性活性剤１．０ｍＬ加えた。
１１．マイクロ波ステップ；
Ａｒｇ；０ワット、最大Ｔ〜７９℃、〜３０分
Ｌｙｓ；２５ワット、最大Ｔ〜７０℃、〜５分
１２．アミノ酸５．０ｍＬ加えた。
１３．活性剤２．０ｍＬ加えた。
１４．塩基性活性剤１．０ｍＬ加えた。
１５．マイクロ波ステップ；
Ａｒｇ；２５ワット、最大Ｔ〜７９℃、〜５分
Ｌｙｓ；２５ワット、最大Ｔ〜７０℃、〜５分
１６．樹脂をＮＭＰで洗浄した。

Ｎ末端ＫＧＧ−Ｒ_ｎが、パルミチン酸を活性化するＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）をカップリングするために使われた。ＮＨＳ−パルミチン酸塩は、文献の手順で調製された。モル当量１：１：１としたパルミチン酸（Ｓｉｇｍａ）、ＮＨＳ（Ｓｉｇｍａ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｎｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ、Ｓｉｇｍａ））が、０℃１時間撹拌され、ＴＨＦ中、室温で一晩放置された。反応溶液は濾過され、生成物は、温かいメタノール中で再結晶によって精製された。

ＩＲ分析は、パルミチン酸のアルカンの２，９１２と２，８４８ｃｍ^−１でのＣ−Ｈ伸縮、酸の２，５００−３，３００ｃｍ^−１と１，７００ｃｍ^−１でのＯ−Ｈ及び−Ｃ＝Ｏ伸縮を示した。ＮＨＳ−パルミチン酸塩は、アルカン、−Ｃ−Ｈ：２，９１２と２，８４８ｃｍ^−１、エステル、−Ｃ＝Ｏ：１，８２１ｃｍ^−１と−Ｃ−Ｏ−Ｎ：１，０７１ｃｍ^−１、スクシンイミド、対称Ｃ＝Ｏ：１，７８４ｃｍ^−１、非対称Ｃ＝Ｏ：１，７３１ｃｍ^−１、非対称Ｃ−Ｎ−Ｃ：１，２１２ｃｍ^−１でピークを示した。

ｂ．モノ及びビパルミトイル化ペプチドの調製
ペプチド合成の完成後、保護されたリジン側鎖が残っているフリーのＮ末端アミンを産生するために、最終的な脱保護ステップが行われた。樹脂上で、ペプチドと、ＤＭＦ中で１０モル当量のＨＮＳ−パルミチン酸塩、及び少量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＰＥＡ））とを反応させた。ＨＮＳ−パルミチン酸塩は、５時間で反応することができた。樹脂は、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ｗａｔｅｒ ９５／２．５／２．５中でマイクロ波固相ペプチド合成（ＣＥＭ）を使ったマイクロ波開裂を、実施例５ａに記載された製造業者の説明によって行った後、ＤＭＦ及びＤＣＭで何度も洗浄された。ジエチルエーテル沈殿後、ペプチド結合体は、ＨＰＬＣで精製され、凍結乾燥された。ＨＰＬＣ精製は、水と、０．１％ＴＦＡで補充されたアセトニトリル勾配を使って行われた。ＥＳ^＋［Ｍ＋Ｈ］^＋及び［Ｍ＋Ｈ］^２＋を使って、フィブロネクチン誘導体のピークが検出された。凍結乾燥して、精製した「モノパル」ペプチドを使って、リジン残基のフリーのアミンに対して、二番目のＮＨＳ−パルミチン酸塩がカップリングされる。反応は、１０倍にモル濃度過剰のＮＨＳ−パルミチン酸塩で、ＤＭＳＯ／ＤＩＰＥＡ中で行われる。反応は、ＥＳ^＋を使って観察され、４時間後に、モノパルピークが消えたときに停止される。未精製の状態で、未反応のＮＨＳ−パルミチン酸を除去するために、ジエチルエーテルで数回洗浄された。ＤＭＳＯフラクションがミリＱで薄められ、凍結乾燥された。

実施例６：細胞実験、間葉系幹細胞
２つの異なる脂質二重膜で機能するＰＣＬ膜が使われた。機能性ＰＣＬ膜は、実施例４ａで記載された工程により得られた。脂質二重膜の機能をテストするために、パルミトイル化されたＲＧＤペプチド配列が、細胞付着に対するモデルシステムとして選択された。ここで、二重膜を、高濃度ペプチド（１０モル％）に接触させ、細胞の挙動に対する脂質側方移動性の影響を比較した。図の結果に示すように２時間のインキュベーション後において、細胞領域と同じように細胞サイズを推測した。細胞数は、むき出しのＤＯＰＣ又はＤＳＰＣ二重膜に適用すると減少した。しかしながら、ＲＧＤペプチド配列を使うと、細胞数は増加した。ＲＧＥで制御されたペプチドが選択されたとき、細胞付着は抑制された。さらに、ゲル状態の脂質（ＤＳＰＣ）に対して、細胞領域の値は、著しく高かった。

不死化間葉系幹細胞（ｉＭＳＣｓ）が、ｃｍ^２あたり５０００細胞の濃度で、２時間、基本的な培養液にまかれ、３０分後に洗浄され、弱く付着した細胞を除去した。

より詳細に、外側の細胞の影響を調べるために、ｉＭＳＣｓを１週間、十分に補充した、脂肪生成培地（脂肪細胞の形成を促進するための）、及び骨原性培地（骨細胞の形成を促進するための）で培養した。脂肪細胞の分化は軟らかい表面で促進される一方で、骨細胞の分化は硬い表面で促進された。流動性リガンド（液体ＢＳＬＢ）は、大体軟らかい材料となる一方で、非流動性リガンド（ゲルＢＳＬＢ）は硬い材料となることが仮定された。骨形成を評価するために、ＡＬＰが測定され、ＤＮＡ量に対して補正された。さらにその前に、増殖分析により、脂肪生成を測定するために使用されるＯｉｌ Ｏ Ｒｅｄサンプルの細胞密度を調べることができた。

液体状態のＢＳＬＢは脂肪形成を促進した一方で、ゲル状態のＢＳＬＢは骨形成を促進したと言える。

Claims (12)

1. 表面を備える物体を供給する工程と、
   活性酸素を含むプラズマで、前記物体の前記表面を処理し、前記物体の表面にアルデヒド基である反応基Ａを供給する工程と、
   前記反応基Ａにステロール基を共有結合的に結合し、前記物体に結合する前記ステロール基の量を、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）による測定で、０．０２ｎｍ^−２以上５ｎｍ^−２以下とする工程と、
   脂質溶液に、前記ステロール基で活性化された前記物体を接触させ、脂質二重膜を形成する工程と、を含むことを特徴とする脂質二重膜を担持する物体の調製方法。
2. 前記物体が、金属、金属酸化物、合金、ガラス、セラミック、若しくは高分子化合物、又はこれらの材料の組み合せであることを特徴とする請求項１に記載の物体の調製方法。
3. 高周波プラズマ、又は冷プラズマを含む酸素が使われることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の物体の調製方法。
4. プラズマ処理は、少なくとも９０％の酸素を含む酸素に富んだガスで実施されることを特徴とする請求項３に記載の物体の調製方法。
5. 前記物体のプラズマ処理は、５−１２秒継続することを特徴とする請求項３又は請求項４に記載の物体の調製方法。
6. 前記ステロール基の結合を、前記物体の前記表面の処理から２時間以内に行うことを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の物体の調製方法。
7. 前記ステロール基はスペーサー部分を含み、前記スペーサー部分が前記物体の前記表面で前記反応基Ａと共有結合的に反応することを特徴とする請求項１から請求項６のいずれかに記載の物体の調製方法。
8. 前記スペーサー部分はオリゴ（エチレングリコール）を含むことを特徴とする請求項７に記載の物体の調製方法。
9. 前記脂質溶液は、ホスファチジルコリン誘導体を含むことを特徴とする請求項１から請求項８のいずれかに記載の物体の調製方法。
10. 前記脂質二重膜が、少なくとも１つの疎水性末端を含むペプチドに接触されていることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれかに記載の物体の調製方法。
11. 前記ペプチドが、ＲＧＤ又はＰＨＳＲＮであることを特徴とする請求項１０に記載の物体の調製方法。
12. ａ．表面を備えるポリカプロラクトンからなる物体を供給する工程と、
    ｂ．高周波プラズマ又は冷プラズマを含む酸素で、前記物体の前記表面を処理し、前記物体の前記表面に反応基Ａを供給する工程と、
    ｃ．前記反応基Ａに、共有結合的にオリゴ（エチレングリコール）スペーサーに結合しているコレステロールを含むステロール基を反応させる工程と、
    ｄ．ホスファチジルコリン誘導体を含む脂質溶液に、コレステロール基で活性化された前記物体を接触させ、脂質二重膜を形成する工程と、
    ｅ．１又は２のパルミトイル疎水性末端を含むＲＧＤペプチド又はＰＨＳＲＮペプチドに、前記脂質二重膜を接触させる工程と、を含むことを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれかに記載の物体の調製方法。