JP6600527B2 - 貪食能評価方法及び蛍光測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、貪食能評価方法及び蛍光測定方法に関する。

貪食（食作用）は、細菌、ウイルス、粉塵などの外来異物のみならず、死細胞、酸化ＬＤＬ、変性タンパク質などの生体内で生じる異物（不要物）に対しても働く、細胞のエンドサイトーシス（細胞内取り込み）である。マクロファージや好中球などの食細胞による異物排除は、恒常性維持（ホメオスタシス）に重要な役割を担っている。

一方、貪食能の低下による恒常性維持機能の低下が知られている。例えば、加齢による創傷治癒の遅延と創傷部に浸潤するマクロファージの貪食機能低下が相関しているとする報告（非特許文献１）、加齢による肺炎菌の感染において、遊走してくる好中球の貪食能の低下と易感性とが関連しているとする報告（非特許文献２）、加齢による脳の食細胞（マイクログリア）のアミロイドβの貪食作用低下を示す報告（非特許文献３）、マイクログリアの貪食増強によりアミロイドβの排除効果が高まるとする報告（非特許文献４）などがある。これらのことから、食細胞の異物を排除する能力（貪食能）は、創傷治癒の促進、感染症を防ぐ能力、脳機能維持などの指標となり得る。加齢によりヒトの末梢血の食細胞（単球）の貪食能が低下することが報告されており（非特許文献５）、また、ストレス（非特許文献６及び非特許文献７）により食作用が低下することが知られている。以上のことから、末梢血の貪食能評価を健康状態の指標として測定することが有用であると考えられる。

食細胞の貪食能を評価する方法として、例えば、食細胞に蛍光ラテックスビーズを取り込ませ、蛍光顕微鏡で取り込んだ細胞をカウントする方法、食細胞に蛍光ラテックスビーズを取り込ませ、フローサイトメーターで解析する方法が知られている（例えば、非特許文献８）。

Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００１年，１１７巻，ｐｐ．１０２７〜１０３５ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００１年，１２２巻，ｐｐ．１８９９〜１９１３ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１３年，１３９巻，ｐｐ．３１３〜３２６ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１年，７巻，ｐｐ．３６９〜３７２ ＡＩＤＳ，２０１２年，２６巻，ｐｐ．８４３〜８５３ 産業医科大学雑誌，１９９３年，１５巻，ｐｐ．１６１〜１７１ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，２００７年，１４巻，ｐｐ．４−７ 日衛誌，２００１年４月，第５６巻，第１号，ｐｐ．３１５

貪食能の低下は、感染症に罹患しやすくなるだけでなく、腎結石の増大化、アルツハイマー病の増悪化、筋再生の低下、肺胞蛋白症など、多くの疾患との関連性が指摘されている。また貪食能は、加齢により低下することもわかってきており、超高齢社会に突入した日本において、健康長寿社会を実現させるためには、個人レベルで貪食能を簡便に評価できる手法が必要である。

蛍光顕微鏡又はフローサイトメーターを使用する従来の貪食能の評価方法では、赤血球等が含まれている試料では測定ができないことから、食細胞を分離する必要がある。食細胞の分離には、煩雑な操作が必要である。

本発明は、煩雑な操作を要することなく、全血を含む試料を使用して食細胞の貪食能を評価できる方法の提供を目的とする。

本発明は、食細胞の貪食能評価方法に関する。本発明の貪食能評価方法は、全血を含む試料中で、食細胞に蛍光物質を取り込ませ、被測定試料を得るステップと、被測定試料を２分間以上静置するステップと、上記蛍光物質の蛍光を測定するステップと、測定された蛍光の強度に基づいて、食細胞の貪食能を評価するステップと、を備え、上記測定するステップは、載置された被測定試料の重力方向の中間領域に励起光を照射し、上記励起光により上記蛍光物質で発生した蛍光を検出することを含む。

本発明の貪食能評価方法は、被測定試料を２分間以上静置したうえで、載置された被測定試料の重力方向の中間領域に励起光を照射して蛍光を検出するため、血球分離等の煩雑な操作を要することなく、全血を含む試料を使用して食細胞の貪食能を評価できる。蛍光の測定前に被測定試料を２分間以上静置することで、被測定試料の透明性が向上し、微弱な蛍光の検出が可能となる。また、載置された被測定試料の重力方向の中間領域に励起光を照射することで、食細胞に貪食された蛍光物質からの蛍光の強度をより一層正確に測定することが可能になる。

上記貪食能評価方法は、上記被測定試料を得るステップにおいて、上記蛍光物質の取り込みを１２０分間以上行うことが好ましい。これにより、食細胞による貪食が飽和するため、食細胞の最大の貪食能をより簡便に評価することができる。

上記貪食能評価方法は、上記静置するステップの前に、上記被測定試料を混和するステップを更に含むことが好ましい。これにより、食細胞に貪食された蛍光物質からの蛍光をより一層正確に測定することができる。

上記貪食能評価方法は、必要な検体量（血液量）が微量でよいことから、上記被測定試料に含まれる上記全血の量が、０．５〜１０μＬであってもよい。このような微量の血液（全血）は、例えば、糖尿病患者が日々の血糖値評価のために用いる痛みが少ない自己採血機器（ランセット）で採血することができる。すなわち、医療関係者による採血は不要となり、個人レベルで貪食能を簡便に評価できる。

本発明はまた、全血を含む試料を使用して、細胞に取り込まれた蛍光物質の蛍光を測定する蛍光測定方法と捉えることもできる。本発明の蛍光測定方法は、全血を含む試料中で、細胞に蛍光物質を取り込ませ、被測定試料を得るステップと、被測定試料を２分間以上静置するステップと、上記蛍光物質の蛍光を測定するステップと、を備え、上記測定するステップは、載置された被測定試料の重力方向の中間領域に励起光を照射し、上記励起光により上記蛍光物質で発生した蛍光を検出することを含む。

上記蛍光測定方法は、上記静置するステップの前に、上記被測定試料を混和するステップを更に含むことが好ましい。

本発明によれば、血液から食細胞を分離する等の煩雑な操作を要することなく、全血を含む試料を使用して食細胞の貪食能を評価できる方法の提供が可能となる。

細胞に取り込まれた蛍光物質の蛍光測定方法の一実施形態を示す説明図である。 貪食時間に対する貪食能の評価結果を示すグラフである。 蛍光測定前の静置時間による蛍光強度の変化を示すグラフである。

以下、場合により図面を参照しつつ、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は適宜省略する。

本実施形態に係る食細胞の貪食能評価方法は、全血を含む試料中で、食細胞に蛍光物質を取り込ませ、被測定試料を得るステップ（以下、「調製ステップ」ともいう。）と、被測定試料を２分間以上静置するステップ（以下、「静置ステップ」ともいう。）と、上記蛍光物質の蛍光を測定するステップ（以下、「蛍光測定ステップ」ともいう。）と、測定された蛍光の強度に基づいて、食細胞の貪食能を評価するステップ（以下、「評価ステップ」ともいう。）と、を備える。

食細胞は、異物をエンドサイトーシスにより細胞内へと取り込み（貪食）、細胞内で当該異物等を分解するなどの食作用を担う細胞である。食細胞の貪食能とは、この食作用の能力（すなわち、異物を排除する能力）を意味する。異物には、細菌、ウイルス及び粉塵等の外来異物、並びに死細胞、酸化ＬＤＬ及び変性タンパク質等の生体内で生じる異物（不要物）も含まれる。食細胞の具体例としては、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞等が挙げられる。

調製ステップは、全血を含む試料中で、食細胞に蛍光物質を取り込ませ、被測定試料を得るステップである。本実施形態に係る貪食能評価方法は、食細胞を分離する必要がないため、全血を含む試料を使用して貪食能を評価することができる。

全血を含む試料は、全血そのものであってもよく、また全血を希釈した試料であってもよい。全血の希釈には、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液、トリス緩衝液、ヘペス緩衝液等の一般的な生理的等張緩衝液を使用することができる。全血を希釈する場合の希釈率は、特に制限されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。通常１０〜２０００倍であることが好ましいが、１００〜１０００倍であることがより好ましい。

全血の使用量は、特に制限されるものではないが、本実施形態に係る貪食能評価方法は、必要な検体量（血液量）が微量でよいことから、被測定試料に含まれる全血の量が、０．５〜１０μＬであってもよく、０．５〜７．５μＬであることが好ましく、０．５〜５μＬであることがより好ましい。

蛍光物質は、食細胞により貪食されるものであれば特に制限されず、従来食細胞の貪食能の評価に使用されている蛍光物質を好適に使用することができる。蛍光物質の具体例としては、例えば、蛍光ラテックスビーズ、ｐＨ感受性蛍光粒子（例えば、Ｇｒｅｅｎ Ｅ．ｃｏｌｉ（モレキュラープローブス社製）、アシッドフロー（五稜化薬社）等のｐＨ感受性蛍光色素を用いてザイモザン、大腸菌、黄色ブドウ球菌等を染色した粒子）等が挙げられる。蛍光物質は１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。

食細胞への蛍光物質の取り込みは、常法に従い行うことができる。具体的には、例えば、全血を含む試料に蛍光物質を添加し、２５〜３７℃で３０分間〜２４時間インキュベートすることで食細胞へ蛍光物質を取り込ませることができる。インキュベート時間は、１０分間以上あれば食細胞への蛍光物質の充分な取り込みが見られる。また、インキュベート時間を１２０分間（２時間）以上とすることにより、食細胞への蛍光物質の取り込みが飽和するため、食細胞の最大の貪食能をより簡便に評価することができる。

静置ステップは、被測定試料を２分間以上静置するステップである。蛍光の測定前に被測定試料を２分間以上静置することで、全血を含む試料を使用した場合であっても、被測定試料の透明性が向上し、微弱な蛍光の検出が可能となる。被測定試料を静置する時間は、１分程度でも効果が現れるが、より適切には２分間以上であれば特に制限はないが、検出効率を向上させる観点からは、２分間以上３０分間以下であることが好ましく、２分間以上１０分間以下であることがより好ましい。

静置ステップは、被測定試料を測定容器に収容した状態で２分間以上静置するのが好ましく、被測定試料を測定容器に収容し、更に測定容器を蛍光の測定装置にセットした状態で２分間以上静置するのがより好ましい。これにより、微弱な蛍光の検出感度がより向上する。

一実施形態では、静置ステップの前に、被測定試料を混和するステップ（以下、「混和ステップ」ともいう。）を更に含むことが好ましい。混和ステップを含むことにより、食細胞に貪食された蛍光物質からの蛍光をより一層正確に測定することができる。混和ステップは、例えば、被測定試料を含む容器を転倒混和する方法、被測定試料を攪拌する方法等により実施することができる。

蛍光測定ステップは、静置ステップにおいて２分間以上静置した被測定試料を用いて、蛍光物質の蛍光を測定するステップである。蛍光測定ステップは、載置された被測定試料の重力方向の中間領域に励起光を照射し、励起光により蛍光物質で発生した蛍光を検出することを含む。蛍光測定ステップは、静置ステップの後、直ちに実施するのが好ましい。

励起光は、載置された被測定試料の重力方向の中間領域に照射する。ここで、「重力方向の中間領域」とは、載置された被測定試料の重力方向に沿って、気液界面を含む第１の領域（上端領域）と、被測定試料が収容された測定容器の底面を含む第２の領域（下端領域）と、第１の領域及び第２の領域の間の第３の領域とに分けたときの第３の領域を意味する。

図１は、細胞に取り込まれた蛍光物質の蛍光測定方法の一実施形態を示す説明図である。図１に示すとおり、蛍光の測定は、蛍光物質を取り込んだ食細胞３０を含む被測定試料４０に蛍光測定装置１０から励起光を照射し、これに応じた蛍光を蛍光測定装置１０で検出することにより行われる。被測定試料４０は、通常、蛍光測定装置１０の試料部に載置可能な測定容器２０に収容されている。

図１に示すとおり、被測定試料４０の重力方向に沿って、気液界面５０を含む第１の領域Ａと、測定容器２０の底面を含む第２の領域Ｃと、第１の領域Ａ及び第２の領域Ｃの間の第３の領域（中間領域）Ｂに分け、第３の領域Ｂに励起光を照射する。第３の領域Ｂに励起光を照射することにより、食細胞に貪食された蛍光物質からの蛍光の強度をより一層正確に測定することが可能になる。すなわち、蛍光物質を取り込んだ食細胞３０を含め、全血に含まれる細胞は、重力方向（図１中、Ｇ方向）へゆっくりと沈降する。このとき、中間領域である第３の領域Ｂは、第１の領域Ａから第３の領域Ｂに進入する細胞の数と、第３の領域Ｂから第２の領域Ｃに進出する細胞の数とが均衡しているため、食細胞に貪食された蛍光物質の数も均衡することになる。よって、蛍光の強度をより一層正確に測定することが可能になる。また、第１の領域Ａは、気液界面において光（励起光及び蛍光）が散乱が生じやすく、第２の領域Ｃは、測定容器底面において光（励起光及び蛍光）が散乱が生じやすいのに対し、第３の領域Ｂは、このような散乱が生じにくいことも正確な測定が可能になる一因である。

「重力方向の中間領域」は、例えば、載置された被測定試料の重力方向に沿って、ｎ個の領域に等分割したときの最上端の領域及び最下端の領域の間の領域であってもよい。ここで、ｎは３〜１０の自然数である。例えば、ｎが１０のときは、「重力方向の中間領域」は、最上端から最下端に向かって順に１番目〜１０番目の領域としたときの、２番目〜９番目の領域である。また、「重力方向の中間領域」は、載置された被測定試料の重力方向の略中央部であってもよい。

測定容器及び蛍光の測定装置は、蛍光の測定に使用される既存の測定容器及び測定装置を特に制限なく使用することができる。

評価ステップは、測定された蛍光の強度に基づいて、食細胞の貪食能を評価するステップである。測定された蛍光の強度が高い程、食細胞が貪食した蛍光物質の量が多いことを示す。すなわち、測定された蛍光の強度が高い程、貪食能が高いと評価される。

評価ステップでは、測定された蛍光の強度から対照蛍光強度を補正した値に基づいて、食細胞の貪食能を評価してもよい。ここで、対照蛍光強度とは、例えば、調製ステップにおいて全血を含む試料と蛍光物質を混合した直後の試料を用いて（すなわち、食細胞が蛍光物質を貪食していないか、わずかしか貪食していない時点の試料）、同様に蛍光の強度を測定した値である。対照蛍光強度をどのように設定するかは、補正の目的に応じて適宜設定してもよい。

本実施形態に係る食細胞の貪食能評価方法は、静置ステップで被測定試料を２分間以上静置すると共に、蛍光測定ステップで励起光を載置した測定容器の重力方向の中間領域に照射することにより、全血を含む試料中であっても、細胞内に取り込まれた蛍光物質からの蛍光を感度よく測定することが可能になる。したがって、本発明はまた、全血を含む試料を使用して、細胞に取り込まれた蛍光物質の蛍光を測定する蛍光測定方法と捉えることができる。

本実施形態に係る蛍光測定方法は、全血を含む試料中で、細胞に蛍光物質を取り込ませ、被測定試料を得るステップ（調製ステップ）と、被測定試料を２分間以上静置するステップ（静置ステップ）と、上記蛍光物質の蛍光を測定するステップ（蛍光測定ステップ）と、を備える。

本実施形態に係る蛍光測定方法における各ステップの具体的な態様、好ましい態様等は、貪食能評価方法で説明したとおりである。

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔食細胞の貪食能評価〕
０．２ｗ／ｖ％のｐＨ感受性蛍光粒子（Ｇｒｅｅｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，モレキュラープローブス社製）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をマイクロチューブに入れ、３７℃で保温した。次いで、ランセットで採血した人末梢血３μＬを添加し、上下に数回ゆっくりと転倒し混合した。次いで、３７℃で２分間静置した後、図１に示す光学系を有する蛍光測定装置にマイクロチューブをセットし、蛍光を測定した。蛍光は１０秒程度測定し、その測定値の平均値を算出した（対照蛍光強度）。

次いで、マイクロチューブを３７℃で所定時間（６０分間、８０分間、１２０分間、１８０分間）インキュベートして食細胞にｐＨ感受性蛍光粒子を貪食させた後、上下に数回ゆっくりと転倒し混合した。次いで、３７℃で２分間静置し、対照蛍光強度と同様に蛍光を測定した。得られた測定値（平均値）から対照蛍光強度を減じた値を図２に示した。

図２に示したとおり、貪食時間１２０分間までは蛍光強度が増加したことから、貪食が進んでいることがわかる。また、貪食時間１２０分間及び１８０分間では蛍光強度に大きな差がないことから、貪食時間１２０分間以上で貪食が飽和していることが分かる。この結果から、貪食時間１２０分間以内での測定値を食細胞の貪食能として評価できることが明らかとなった。また、貪食時間１２０分間（又は１２０分間以上）での測定値は、貪食が飽和していることから、食細胞の最大の貪食能として評価できることが明らかとなった。

〔細胞内蛍光物質の蛍光測定〕
０．２ｗ／ｖ％のｐＨ感受性蛍光粒子（Ｇｒｅｅｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をマイクロチューブに入れ、３７℃で保温した。次いで、ランセットで採血した人末梢血３μＬを添加し、上下に数回ゆっくりと転倒し混合した。次いで、３７℃で所定時間（０分間、１分間、２分間、３分間、４分間又は５分間）静置した後、図１に示す光学系を有する蛍光測定装置にマイクロチューブをセットし、蛍光を測定した。蛍光は１０秒程度測定し、その測定値の平均値を算出した。

結果を図３に示す。蛍光測定前の静置時間を２分間以上とることにより、蛍光の測定値が安定した。すなわち、蛍光測定前の静置時間を２分間以上とることにより、食細胞に貪食されたｐＨ感受性蛍光粒子からの蛍光を正確に測定できることが明らかとなった。

１０…蛍光測定装置、２０…測定容器、３０…蛍光物質を取り込んだ食細胞、４０…被測定試料、５０…気液界面、Ａ…第１の領域、Ｂ…第３の領域（中間領域）、Ｃ…第２の領域、Ｇ…重力方向。

Claims (6)

1. 食細胞の貪食能評価方法であって、
   全血を含む試料中で、食細胞に蛍光物質を取り込ませ、前記全血を含む被測定試料を得るステップと、
   前記被測定試料を２分間以上静置するステップと、
   前記蛍光物質の蛍光を測定するステップと、
   測定された蛍光の強度に基づいて、食細胞の貪食能を評価するステップと、を備え、
   前記測定するステップは、載置された前記被測定試料の重力方向の中間領域に励起光を照射し、前記励起光により前記蛍光物質で発生した蛍光を検出することを含む、
   貪食能評価方法。
2. 前記被測定試料を得るステップにおいて、前記蛍光物質の取り込みを１２０分間以上行う、請求項１に記載の貪食能評価方法。
3. 前記静置するステップの前に、前記被測定試料を混和するステップを更に含む、請求項１又は２に記載の貪食能評価方法。
4. 前記被測定試料に含まれる前記全血の量が、０．５〜１０μＬである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の貪食能評価方法。
5. 全血を含む試料を使用して、細胞に取り込まれた蛍光物質の蛍光を測定する蛍光測定方法であって、
   全血を含む試料中で、細胞に蛍光物質を取り込ませ、前記全血を含む被測定試料を得るステップと、
   前記被測定試料を２分間以上静置するステップと、
   前記蛍光物質の蛍光を測定するステップと、を備え、
   前記測定するステップは、載置された前記被測定試料の重力方向の中間領域に励起光を照射し、前記励起光により前記蛍光物質で発生した蛍光を検出することを含む、
   蛍光測定方法。
6. 前記静置するステップの前に、前記被測定試料を混和するステップを更に含む、請求項５に記載の蛍光測定方法。

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