JP6619983B2 - Ｈｅａｄ−ｔｏ−Ｈｅａｄ架橋を用いるｍＲＮＡディスプレイ法 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子型−表現型対応付け技術である、ｍＲＮＡディスプレイ法のうち、ｍＲＮＡの３’末端とタンパク質のＣ末端との結合（tail-to-tail）を利用しない新規なmRNAディスプレイ法に関する。より詳細には、脱メチル化酵素とその基質とが共有結合する性質を利用したリボソームを代謝回転させることが可能なHead-to-Head架橋を用いるmRNAディスプレイ法に関する。

進化工学では、ランダムな配列を有する膨大な数のペプチド又はタンパク質のライブラリの中から、特定の分子に特異的に結合するペプチド等を選択するため、種々の技術が用いられる。こうした技術の中でも、「遺伝子型−表現型対応付け技術」の一種であるディスプレイ技術は重要である。

タンパク質、ペプチドを用いる創薬のために用いられているディスプレイ技術としては、例えば、in vivoのディスプレイ技術としての細胞ディスプレイ及びファージディスプレイ、in vitroのディスプレイ技術としてのリボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ及びｃＤＮＡディスプレイ等を挙げることができる（非特許文献１参照）。そして、それらのディスプレイ技術で扱えるライブラリーサイズは、図１に示すようにin vivoのディスプレイ技術で10⁷、in vitroのディスプレイ技術で10¹²とされている。

こうしたディスプレイ技術は、「機能のあるペプチド分子を選択するために、ペプチド分子に対応する配列情報（ＤＮＡ、ＲＮＡ）をこれらの分子に連結させ、スクリーニングされた分子を機能によって選別し、それらの配列情報部分をＰＣＲによって増幅した後、シーケンシングによって読み取る」という技術と定義づけられる。

そして、上述したｍＲＮＡディスプレイ法及びｃＤＮＡディスプレイ法では、リンカー（分子間連結のための分子）が使用される。ここで使用するリンカーは、遺伝子をコードするｍＲＮＡと連結するｍＲＮＡ連結部位と、このｍＲＮＡから合成されたタンパク質を連結するタンパク質連結部位とを有しており、タンパク質連結部位として、ピューロマイシン（Puromycin）等のアミノアシルｔＲＮＡアナログが用いられている。

そして、上記のｍＲＮＡディスプレイ法は、ｍＲＮＡを用いて、一般的に、以下のような工程で進められる。まず、ＤＮＡライブラリを作製し、このＤＮＡライブラリからｍＲＮＡへの転写と、そのリンカーへの連結とを行う。ここでは、リンカーの５’末端と、ｍＲＮＡの３’末端（ｍＲＮＡのtail）とが連結される。次に、リンカーに連結されたｍＲＮＡを翻訳してタンパク質（ペプチド）を生成し、生成されたタンパク質をリンカーに連結させる（特許文献１及び２参照、以下、順に、それぞれを「従来技術１」及び「従来技術２」という）。この場合、リンカーを介してタンパク質のＣ末端のtailとｍＲＮＡのtailとが結合されるため、以下、従来技術１又は２の結合を、tail-to-tail結合という。

ここで、リンカーに結合したｍＲＮＡ上には幾つものリボソームが結合しており、リボソームは、ｍＲＮＡを順次読み取りながらタンパク質やペプチドを合成してゆく。そして、あるタンパク質やペプチドの全長が合成されると、そのタンパク質やペプチドはリンカーのタンパク質連結部位にディスプレイされる。

ＷＯ２００６／０７２７７３ 特許第４３１８７２１号

Patrick Amstutz, Patrik Forrer, Christian Zahnd and Andreas Plueckthun, Current Opinion in Biotechnology 2001, 12:400-405

従来技術１は、目的のタンパク質をディスプレイしたｍＲＮＡ−リンカー−ペプチド連結体を得ることができるという点では、優れた技術である。従来技術１で使用するｍＲＮＡは、タンパク質合成が完了した時点でそのＣ末端をリンカーの端にあるピューロマイシンと連結させるための時間を稼ぐために、合成終了後のリボソームがｍＲＮＡから解離しないように終止コドンを除いている。このため、リボソームは自然に解離することなく、いつまでもｍＲＮＡと結合し続け、後続のリボソームが、丁度駅で立ち往生した電車の後ろに後続の電車が連なるようなポリソーム状態が出現する（図２参照）。
このため、ｍＲＮＡに結合しているリボソームについては、最終的には、強制的に解離させる必要があり、この翻訳反応としては、リボソームを高濃度で使用しなければならないという問題があった。

そして、タンパク質を合成途中のリボソームはｍＲＮＡ上に滞留して、代謝回転して再利用することができない。このため、高価なリボソームを十分に活用できないという問題点があり、リボソームの再利用については強い社会的・経済的な要請があった。

またインビトロ合成系では、ウサギ網状赤血球及び小麦胚芽の抽出物を用いるが、これらの中にはRNaseが含まれているため、ｍＲＮＡが分解されて収率が低下するという問題があった。こうした問題を解決するために、Pure System（ジーンフロンティア（株）製）が開発された。Pure Systemはヌクレアーゼを含んでいないため、使用するヌクレオチド鎖が分解されないが、高価である。このPure systemを使用して、収率を維持するためには、代謝回転系とすることが必要である。

ところで、ｍＲＮＡディスプレイ法では、10¹²という大きなサイズのライブラリを扱うことができる。アフィニティの高い分子を取得するためには、通常のｍＲＮＡディスプレイ法だけで、最終的に数種の分子にまで絞り込むことができる。これによって目的が達成される一方、機能（一般的には、酵素阻害や、レセプターのアゴニスト等のようなアフィニティ以外の様々な機能）で淘汰を行なうためには、個々の候補分子の機能アッセイが必要となる。

ペプチドやタンパク質の機能は一分子では検出されないため、増幅する必要がある。この場合、従来の終止コドンを有さないタイプのｍＲＮＡディスプレイ法用のコンストラクトでは検出可能となるような量のタンパク質やペプチドの増幅を行なうことができず、本発明の終止コドンを有するコンストラクトを用いて初めてこのような増幅が可能となる。さらに、近年開発された新型マイクロアレイMMVを応用すれば、10³〜10⁶種の異なるペプチドやタンパク質の機能を並行的にアッセイすることができる。このためにも、ｍＲＮＡには終止コドンが導入され、リボソームが代謝回転する必要がある（図２（Ａ）及び図２（Ｂ）参照）。

このため、リンカーをｍＲＮＡの３’末端側につけるのではなく、逆に５’末端側に連結させる必要があった。一方、タンパク質の方もＣ末端側ではなく、Ｎ末端側で連結する必要がある。すなわち、Head-to-Headの連結が必要とされる。ピューロマイシンを使用したリンカーを使用した方式とは全く異なる方式で、リボソームの再利用が可能なディスプレイ法に対する強い社会的要請があった。

本願発明は、以上のような状況の下で完成されたものである。
すなわち、本願発明のある実施態様は、標的ドメイン結合部位及び蛍光標識を含むリンカーを作製するリンカー作製工程と；少なくとも、標的ドメイン、可変領域、終止コドンの塩基配列を含むＤＮＡコンストラクトを作製する、ＤＮＡコンストラクト作製工程と；前記ＤＮＡコンストラクトから転写によって対応するｍＲＮＡを調製する、転写工程と；前記ｍＲＮＡの５’末端を酵素処理して、前記リンカーの３’末端と結合させるｍＲＮＡ−リンカー連結工程と；前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体に含まれる前記ｍＲＮＡに１個のリボソームが結合して翻訳により前記標的ドメインを生成する翻訳工程と；前記翻訳された標的ドメインが、前記リンカーの前記標的ドメイン結合部位に結合し、ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体を形成するとともに、前記リボソームが前記終止コドンを認識して前記ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体から自動的に遊離するリボソーム遊離工程と；を備える、リボソームの代謝回転が可能なｍＲＮＡディスプレイ法である。

ここで、前記ＤＮＡコンストラクト作製工程で使用する所望のドメインは、Ｏ^６-メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）及びＭＧＭＴの機能性変異体タンパク質からなる群から選ばれるいずれかのものであることが好ましい。これらの中でも、Ｏ^６-メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼであることが、さらに好ましい。

また、前記ＤＮＡコンストラクトは、前記塩基配列の下流側に、所望の長さのスペーサー、所望の長さのαへリックス構造を有するαスタンドペプチド、及び精製用タグを含み、さらに可変ペプチド配列又は可変タンパク質のいずれか一方を含むことが好ましい。前記スペーサーの長さは３〜５アミノ酸長であり、前記αスタンドペプチドの長さは１７〜２１アミノ酸長であることが好ましく、前記精製用タグが、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ及びビオチン様ペプチドからなる群から選ばれるいずれかのものであることが好ましい。

前記酵素処理に使用する酵素は、ｍＲＮＡの５’末端から三リン酸を除去する三リン酸除去酵素、および三リン酸が除去されたｍＲＮＡの５’末端にリン酸を付加するキナーゼであることが好ましく、前記三リン酸除去酵素がアンタークティックホスファターゼであり、前記キナーゼがポリヌクレオチドキナーゼであることがさらに好ましい。より好ましくは、前記ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼである。

本発明のさらに別の態様は、標的ドメイン結合部位及び蛍光標識を含むリンカーを作製するリンカー作製工程と；少なくとも、可変ペプチド配列又は可変タンパク質配列のいずれか一方、及び終止コドンに先行して標的ドメインの塩基配列を含む目的ＤＮＡコンストラクトを作製する、目的ＤＮＡコンストラクト作製工程と；前記目的ＤＮＡコンストラクトから転写によって対応するｍＲＮＡを調製する、転写工程と；前記ｍＲＮＡの５’末端を酵素処理して、前記リンカーの３’末端と結合させるｍＲＮＡ−リンカー連結工程と；前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体に含まれる前記ｍＲＮＡに１個のリボソームが結合して翻訳により前記標的ドメインを生成する翻訳工程と；前記翻訳された標的ドメインが、前記リンカーの前記標的ドメイン結合部位に結合してｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体を形成するとともに、前記リボソームが前記終止コドンを認識して前記ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体から自動的に遊離するリボソーム遊離工程と；前記ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体中の前記ｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを合成する逆転写工程と；を備える、リボソームの代謝回転が可能なｍＲＮＡディスプレイ法である。

前記ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体を固相に結合させる固相結合工程をさらに備える物であることが好ましい。また、前記逆転写工程で得られた（ｍＲＮＡ+ｃＤＮＡ）−リンカー−タンパク質連結体を精製する精製工程をさらに備えるものであることが好ましい。

前記コンストラクト作製工程で使用する所望のドメインは、Ｏ^６-メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）及びＭＧＭＴの機能性変異体タンパク質からなる群から選ばれるいずれかのものであることが好ましく、これらの中でもＯ^６-メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼであることがさらに好ましい。

また、前記コンストラクトは、前記塩基配列の下流側に所望の長さのスペーサー、所望の長さのαへリックス構造を有するαスタンドペプチド、及び精製用タグを含み、可変ペプチド配列又はタンパク質配列のいずれかの配列をさらに含むことが好ましい。さらに、前記スペーサーの長さは３〜５アミノ酸長であり、前記αスタンドペプチドの長さは１７〜２１アミノ酸長であることが好ましい。

前記精製用タグは、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、及びビオチン様ペプチドからなる群から選ばれるいずれかのものであることが好ましい。また、前記酵素処理工程で使用する酵素は、ｍＲＮＡの５’末端から三リン酸を除去する三リン酸除去酵素、三リン酸が除去されたｍＲＮＡの５’末端にリン酸を付加するキナーゼ、及びリンカーとｍＲＮＡの５’三リン酸状態の末端とを直接連結するＴ４ ＲＮＡリガーゼなどの酵素の組合せであることが好ましい。また、前記三リン酸除去酵素がアンタークティックホスファターゼであり、前記キナーゼがポリヌクレオチドキナーゼであることが好ましい。

前記酵素処理工程で用いる、三リン酸除去酵素及びキナーゼという２つの酵素を用いることなく、前記リンカーと５’三リン酸状態のｍＲＮＡとを直接的にＴ４ ＲＮＡリガーゼで連結することもできる。

本発明によれば、ｍＲＮＡの５’末端と新生タンパク質のアミノ末端側領域を連結するリンカーを創生することにより、ピューロマイシンを使用した方式とは全く異なる方式で、リボソームの代謝回転利用に対する強い潜在的要請を満たすことができるｍＲＮＡディスプレイ法が提供される。
そして、所望の配列のｍＲＮＡの５’末端に結合させたリンカーに、このｍＲＮＡと対応付けしたいタンパク質の配列を含めておくことにより、前記所望の配列（ｍＲＮＡ）と翻訳された前記対応付けしたいタンパク質とを共有結合させ、情報と機能とを対応付けることが可能となる。

さらに、ｍＲＮＡの３’末端にプライマーが張り付く領域が含まれているため、逆転写によってｃＤＮＡを得ることができ、ｃＤＮＡディスプレイ法としても応用することができる。

本発明によれば、リボソームの代謝回転が可能なHead-to-Head結合したｍＲＮＡディスプレイ法及びｃＤＮＡディスプレイ法が提供される。これらの方法では、合成に使用したリボソームを代謝回転利用することができるため、従来法（Tail-to-Tail）に比べて、試薬の使用量は１桁近く減少する。同時に、このままのコンストラクトでタンパク質の試験管内翻訳（in vitro translation）を行なうことができる。

図１は、in vitro selectionのための種々のディスプレイ方法と、それぞれの方法で取り扱うことができるライブラリーサイズとを示した図である。 図２は、従来のディスプレイ法の１例（Ａ）及び本発明のディスプレイ法（Ｂ）を模式的に示す図である。 図３は、本発明で使用するリンカーを表す図である。図３（Ａ）はリンカーを表す模式図、図３（Ｂ）に上記リンカーの具体的な構造を示す。

図４は、ＭＧＭＴコード配列を含むＤＮＡコンストラクトの作製例を示す模式図である。図４（Ａ）はコンストラクト１、同（Ｂ）はコンストラクト２の模式図をそれぞれ示す。 図５は、脱メチル化の成否とＰＣＲ増幅を示す図である。 図６は、本発明のリンカーを用いた場合のリボソームの代謝回転及びリボソームが合成するタンパク質領域を示す模式図である。（Ａ）はリボソームの代謝回転を、（Ｂ）は翻訳タンパク質の全体構造をそれぞれ示す。

図７は、Head-to-head結合を行なう方法を示す模式図である。 図８は、αヘリックス構造のペプチドを設計する基としたミオグロビンの構造を示す模式図である。

図９は、αへリックス構造を有するスペーサー（以下、「αスタンドスペーサー」という。）を所望のペプチドアプタマーに結合させる様式を示す模式図（１）である。 図10は、αスタンドスペーサーを所望のペプチドアプタマーに結合させる様式を示す模式図（２）である。

図11は、ＭＧＭＴの配列をＰＣＲによって増幅した結果を示すゲル電気泳動像である。

図12は、ＭＧＭＴの上流にＴ７プロモーター領域の配列をオーバーラップＰＣＲによってつないだＴ７プロモーター- ＭＧＭＴのＤＮＡ断片を増幅させた結果を示すゲル電気泳動像である。 図13は、ランダム領域の上流にＭＧＭＴの下流の一部とＨｉｓタグ配列を付加するプライマーを用いてＰＣＲを行なった結果を示すゲル電気泳動像である。 図14は、Ｔ７プロモーター-ＭＧＭＴ配列と、Ｈｉｓタグ-ランダム領域配列とを、オーバーラップＰＣＲを用いてつないで得られたフルコンストラクトＤＮＡのゲル電気泳動像である。

図15は、図14で得られたフルコンストラクトＤＮＡを精製した結果を示すゲル電気泳動像である。

図16は、図15で得られたフルコンストラクトＤＮＡをＰＣＲで増幅させ、鎖長を確認した結果を示すゲル電気泳動像である。 図17は、図16で得られたフルコンストラクトＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡのゲル電気泳動像である。

図18は、ｍＲＮＡの５’末端にリンカーを結合させたときのゲル電気泳動像である。（Ａ）はSyber Green 2で、また、（Ｂ）はFITCで、それぞれラベルしたときの検出結果を示すゲル電気泳動像である。 図19は、ｍＲＮＡの脱リン酸化後にリンカーとのライゲーションを行なったときの結果を示すゲル電気泳動像である。（Ａ）FITCによる検出結果を、また、（Ｂ）はSYBER Green 2による検出結果をそれぞれ示す。 図20は、リンカー同士の結合ではなく、ｍＲＮＡの５’末端とリンカーの３’末端とで結合が形成されたことを示すゲル電気泳動像である。（Ａ）はｍＲＮＡを図19に示すゲル電気泳動から切出した後のゲル電気泳動像、（Ｂ）は脱リン酸化後のｍＲＮＡのゲル電気泳動像、（Ｃ−１）はＢＧリンカー-ｍＲＮＡのライゲーション産物のゲル電気泳動像のFITCによる検出結果、（Ｃ−２）はＢＧリンカー-ｍＲＮＡのライゲーション産物のゲル電気泳動像のSYBER Green 2による検出結果をそれぞれ示す。

図21は、別のＴ４ ＲＮＡリガーゼ（タカラバイオ(株)製）を用いたときのｍＲＮＡの三リン酸の５’末端と、リンカーの３’末端の-OHとの結合の結果を示すゲル電気泳動像である。（Ａ）はFITCによる検出結果を、また、（Ｂ）SYBER Green 2による検出結果をそれぞれ示す。 図22は、インビトロ翻訳の時間を変化させた場合の各結合体の生成量の変化を示すゲル電気泳動像である。 図23は、インビトロ翻訳産物をプロテイナーゼＫ（以下、「PNK」ということがある。Invitrogen社製）で処理した結果を示すゲル電気泳動像である。

図24は、インビトロ翻訳産物をRNase Aで処理した結果を示すゲル電気泳動像である。 図25は、Ｈｉｓタグ精製の結果を示すゲル電気泳動像である。 図26は、SWISS-MODELによる構造予測に基づくコンストラクトのＭＧＭＴ-スペーサー（４アミノ酸-αスタンド）-Ｈｉｓタグ構造を模式的に示す図である。（Ａ）はコンストラクト１、（Ｂ）はコンストラクト２の構造をそれぞれ模式的に示す。 図27は、スペーサー導入後のＨｉｓタグ精製の結果を示すゲル電気泳動像である。

以下に、図１〜２７を参照しつつ、本発明をさらに詳細に説明する。
図２（Ｂ）に示すように、本発明は、リボソームの代謝回転利用が可能なｍＲＮＡディスプレイ法であり、（ａ１）標的ドメイン結合部位及び蛍光標識を含むリンカーを作製するリンカー作製工程と；（ａ２）少なくとも、可変領域、終止コドン、及び標的ドメインの塩基配列を含むＤＮＡコンストラクトを作製する、ＤＮＡコンストラクト作製工程と；（ａ３）前記ＤＮＡコンストラクトから転写によって対応するｍＲＮＡを調製する、転写工程と；（ａ４）前記ｍＲＮＡの５’末端を酵素処理して、前記リンカーの３’末端と結合させるｍＲＮＡ−リンカー連結工程と；（ａ５）前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体に含まれる前記ｍＲＮＡに１個のリボソームが結合して翻訳により前記標的ドメインを生成する翻訳工程と；（ａ６）前記翻訳された標的ドメインが、前記リンカーの前記標的ドメイン結合部位に結合し、前記リボソームが前記終止コドンを認識してｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体から自動的に遊離するリボソーム遊離工程と；を備えている。

次に、上記（ａ１）前記リンカーに含まれる標的ドメインとしては、特に限定はされないが、例えば、Ｏ^６-メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（以下、「ＭＧＭＴ」ということがある。）、及びそれらの機能性変異体タンパク質からなる群から選ばれるいずれかのものであることが、これらのドメインが結合する対象ペプチドを、的確に捕捉し、共有結合させることができることから好ましい。

ここでいう「機能性変異体タンパク質」とは、あるタンパク質、例えば、ＭＧＭＴ、が突然変異したにもかかわらず、突然変異前に有していた機能を維持しているものを指す。

例えば、ＭＧＭＴを用いる場合を例に挙げて説明する。ＭＧＭＴは、本来、塩基対のミスマッチを修復する酵素であり、メチル転移活性を有する。例えば、脳腫瘍の中でも悪性のグリオブラストーマの治療剤として知られているテモゾロミド（アルキル化剤）にＭＧＭＴが作用すると、この薬剤の効果が低下する。また、基質の１つであるＯ^６-メチルグアニンに作用すると、これを脱メチル化してグアニンにする。このような作用をするＭＧＭＴを、ペプチド又はタンパク質の探索のためのｍＲＮＡディスプレイに使用することができる（図６（Ａ）参照）。

一方、Ｏ^６-ベンジルグアニン（以下、「Ｏ^６ＢＧ」ということがある。）は、ＭＧＭＴの阻害剤でありＭＧＭＴに強く共有結合する。このためにＭＧＭＴとの連結に利用することができる。

上記（ａ１）のリンカーに含まれる前記蛍光標識としては、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ等を挙げることができ、ＦＩＴＣを使用することが検出器のフィルター普及度の点から好ましい。可変領域としては、種々の酵素阻害ペプチド、レセプターのアゴニスト等を挙げることができる。

ＭＧＭＴの配列を含むコンストラクトを作製する場合には、ＭＧＭＴとその基質アナログであるＯ^６ＢＧが共有結合を形成することを利用したリンカーを作製することができる。例えば、ｍＲＮＡの５’末端にＯ^６ＢＧを修飾したリンカーを結合させ、ｍＲＮＡにＭＧＭＴの配列と対応付けしたいタンパク質の配列を入れることにより、翻訳されたＭＧＭＴとＯ^６ＢＧとが共有結合を形成し、これらの配列が有する情報と、これらの配列で表されるペプチドの機能とを対応付けすることができる。

さらに、ｍＲＮＡの３’末端にプライマーが張り付く領域（プライマーハイブリダイゼーション領域）を入れておくことにより（図４（Ａ）及び（Ｂ）参照）、ｍＲＮＡディスプレイ構造が完成した後に逆転写を行ってｃＤＮＡを得ることができるようになる。この状態のディスプレイをｃＤＮＡディスプレイと称する。ｍＲＮＡとタンパク質とは、ｍＲＮＡの先頭の５’末端とタンパク質の先頭のＮ末端側とが結合することになるため、以下、Head-to-Head Linking（Ｈ２Ｈ）型ｍＲＮＡディスプレイと呼ぶ。

具体的なリンカーの塩基配列としては、配列表の配列番号１に示すものを挙げることができる。また、リンカーは、主鎖と側鎖とを有しており、側鎖の先端部には標的ドメインを含むペプチドが結合できるペプチド結合部位を備えるとともに、検出用のＦＩＴＣが結合されている（図３参照）。

次いで、上記（ａ２）ＤＮＡコンストラクト作製工程では、例えば、オーバーラップＰＣＲ法を用いて、標的ドメインを含む所望のＤＮＡ断片をつなぎ、以下のような配列を有するコンストラクトを作製することができる。標的ドメインは、例えば、Ｏ⁶−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、ＭＧＭＴの誘導体等の酵素の配列を使用することができる。

配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するコンストラクト（以下、「コンストラクト１」という。）を作製する場合を例に挙げて説明する。コンストラクト１は８３９ｂｐで、図４（Ａ）に模式的に示したように、６つのスペーサー、Ｔ７プロモーター、リンカーハイブリダイゼーション領域、ＲＢＳ（リボソーム結合部位）、ＭＧＭＴコード配列、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、可変領域配列、終止コドン及びプライマーハイブリダイゼーション領域を含んでおり、上記プライマーハイブリダイゼーション領域としてはｃＮｅｗＹＴａｇを用いている。

本発明のコンストラクトはオーバーラップＰＣＲ法を用いて作製する。上記のようにＭＧＭＴの塩基配列を含むコンストラクトの場合には、ＭＧＭＴプライマー１及び２、Ｔ７プライマー、ビオチン-ｃＮｅｗ Ｙｔａｇプライマー、逆転写プライマー等のプライマーを用いてオーバーラップＰＣＲを行なう。こうしたプライマーは、例えば、下記の配列番号２〜７に示す塩基配列を有するものとすることができる。

（１）ＰＣＲによる標的ドメインの増幅
例えば、所望の量のTaqポリメラーゼ、Taq反応バッファー、dNTP混合物及び２種類のプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、テンプレート、スキーム１の反応産物を、及び蒸留水を含むＰＣＲミックスを調製する。こうしたＰＣＲミックスとしては、例えば、後述するような組成の混合液を使用することが、反応効率の面から好ましい。本明細書においては、ＭＧＭＴの本来の機能である脱メチル化反応を用いるのではなく、単に、基質アナログに共有結合する性質を利用している。このため、スキーム１の反応では、作製したコンストラクトで翻訳まで行ったときに、ＭＧＭＴが正しく発現されているかどうかを確認している。

次いで、上記のＰＣＲミックスを、約95℃で約1.5〜2.5分、その後、約95℃で約15〜25秒、次いで、約66℃で約25〜35秒、約72℃で約25〜35秒インキュベートするというサイクルを25〜35回行い、その後、約72℃で約３〜７分間し、次いで約４℃に冷却して反応を止めるという条件で、サーマルサイクラー中で行なうことができる。

（２）オーバーラップＰＣＲによる標的ドメインへのＴ７領域の付加
所望の量のプライムスター、プライムスター反応バッファー、dNTP混合物及び２種類のプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、テンプレート、標的ドメインのＰＣＲ産物及び蒸留水を含む、オーバーラップＰＣＲ用溶液を調製する。こうしたオーバーラップＰＣＲ用溶液としては、例えば、プライムスター（タカラバイオ(株)製）に添付された説明書に従って調製することが、反応効率の面から好ましい。

次いで、この増幅用溶液を、95℃で1.5〜2.5分、95℃で10〜30秒、65℃で３〜７秒、72℃で15〜45秒インキュベートするというサイクルを25〜35回行い、72℃で４〜６分、ついで４℃に冷却し、標的ドメイン−Ｔ７領域増幅産物を得る。得られたこの増幅産物を、所望の量、例えば、１μLとって、所望の量の蒸留水と２ｘSTR（Promega社製）、例えば、７μLの蒸留水及び８μLの２ｘSTRを混ぜ、95℃で約２〜４分間加熱し、ゲル電気泳動に供する。

例えば、ミニゲル（６〜９Ｍ尿素を含む３〜５％アクリルアミドゲル）に試料をアプライし、ランニングバッファーとして0.25〜１ｘTBEバッファーを用いて、150〜250Ｖ、60℃にて60〜120分間、という条件で電気泳動を行なうことができる。泳動後、染色試薬を使用して染色しイメージャーで検出することができる。こうした試薬としては、例えば、SYBR Green II Nucleic Acid Gel Stains （以下、「SYBR Green 2」と略すことがある。タカラバイオ(株)製）、エチジウムブロマイド等の染色試薬を挙げることができる。

（３）ランダム領域の増幅
所望の量のＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー、硫酸マグネシウム及び２種類のプライマー（標的ドメイン−タグプライマー（例えば、配列表の配列番号８）及びビオチンタグプライマー（例えば、配列表の配列番号６））、ランダムテンプレート（例えば、配列表の配列番号14）、標的ドメインのＰＣＲ産物及び蒸留水を含む、ランダム領域増幅用溶液を調製する。こうした溶液としては、後述する実施例２（１）（１−３）に示すようなランダム領域増幅用バッファーを使用することが、反応効率の面から好ましい。

次いで、このランダム領域増幅溶液を、例えば、95℃で1.5〜2.5分、95℃で10〜30秒、65℃で15〜45秒インキュベートするというサイクルを25〜35回行い、その後、75℃で0.5〜２分、72℃で４〜６分、ついで４℃に冷却し、ランダム領域の増幅産物を得ることができる。所望の量のＰＣＲ産物、例えば、１μL及び等量の２ｘSTRを混合し、95℃で２〜４分間加熱し、ゲル電気泳動に供する。

次いで、例えば、マイクロゲル（６〜９Ｍ尿素を含む６〜10％アクリルアミドゲル）に試料をアプライし、ランニングバッファーとして１ｘTBEバッファーを用い、100Ｖ、55℃で５〜15分間という条件で電気泳動を行なう。ゲル電気泳動終了後に、上記と同様の染色試薬を用いて、一本鎖ＤＮＡを染色し、イメージャーで検出する。

引き続き、生成されたＤＮＡの濃度を測定するために、例えば、1/10倍容のQuick-Precip（登録商標）Plus Solution (EdgeBio社製；10mMトリス塩酸(pH 7.5〜8.5)、１mMのEDTA、5M NaClを含む)と2.5倍容の99％エタノールとＰＣＲ産物とを混合し、所望のｇ、例えば、13,000rpm（ロータの直径：60mm）で10〜20分間遠心する。得られた白い沈殿を残して上清を捨て、70％エタノールを加えて混合し、再度、同じｇで5〜15分間遠心する。上清を捨て、エバポレーターを用いてエタノールを完全に揮発させ、ＤＮＡのペレットを得る。得られたＤＮＡのペレットを蒸留水に溶解させ、ＤＮＡ濃度を測定する。ＤＮＡ濃度の測定には、例えば、ナノドロップ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）等を使用することができる。

（４）ランダム領域のビーズを用いた精製
所望量、例えば、50μL、のストレプトアビジンビーズ（タカラバイオ(株)製）を低吸着チューブ（(株)バイオメディカルサイエンス製）に入れ、磁石に付けて上清を捨てる。次いで、所望量、例えば、100μL、の１ｘ結合バッファーを加えて混合する。このチューブを磁石に付けて、上清を捨てる。この操作をさらに２〜３回繰り返す。次いで、所望量、例えば、20μL（約37μg）のランダム領域のＰＣＲ産物と、所望量、例えば30μLの蒸留水、所望量、例えば50μLの２ｘ結合バッファーとを混合する。

ローテーター（タイテック社製）に入れ、約４℃で回転させて一晩置く。その後、磁石に付けて上清を捨てるという操作を３回繰り返す。この後に、所望量、例えば、50μL、の解離バッファー(10mMのEDTAを含む93〜98％ ホルムアルデヒド)を加えて、65〜75℃にて、15分間ローテーター中でインキュベートし、磁石に付けて上清を回収する。再び、所望量、例えば50μLの解離バッファーを加え、65〜75℃にて、10〜20分間ローテーター中でインキュベートし、磁石に付けて上清を回収する。回収した上清から、上記と同様の操作によってＤＮＡを得て、その濃度を上記と同様に測定する。

（５）フルコンストラクト作製
所望の量のＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー、硫酸マグネシウム及びdNTP混合物、上記のようにして得られた標的ドメイン−Ｔ７付加産物及びタグ付きのランダム領域、及び蒸留水を含む、フルコンストラクト作製用溶液を調製する。こうした溶液としては、例えば、後述する実施例２（１）（１−５）に示す組成のコンストラクト作製用バッファーを使用することが、反応効率の面から好ましい。

次いで、この溶液をサーマルサイクラーに入れ、例えば、95℃で1.5〜2.5分、75℃で5〜7分インキュベートする。次いで、例えば、所望量のＴ７プライマー及び同量のBiotin-cNew Ytagプライマーを加えてサーマルサイクラー中に入れ、95℃で5〜15秒、65℃で15〜45秒、75℃で１分というサイクルを25〜35回繰り返し、75℃で3〜7秒でインキュベートした後に４℃に冷却して、増幅産物を得る。

この後、得られた増幅産物に、1/10倍容のQuick-Precip Plus Solution (10mMトリス塩酸(pH7.5〜8.5),0.5〜２mM EDTA及び4〜6M NaClを含む。QIAGEN社製)と2.5倍容の99％エタノールとを加えて混合し、10,000〜15,000rpm（7,000〜14,000ｘｇ）で10〜20分間遠心するという操作を繰り返し、蒸留水で溶かしたペレットを用いて、上記と同様の操作でＤＮＡ濃度を測定する。その後、例えば、ミニゲル（６〜９Ｍ尿素を含む２〜６％アクリルアミドゲル）に試料をアプライし、ランニングバッファーとして0.25〜0.75ｘTBEバッファーを用い、約200Ｖ、約60℃で60〜120分間という条件で電気泳動を行ない、ゲル電気泳動終了後に上記と同様の染色試薬で一本鎖ＤＮＡを染色し、イメージャーで検出する。

ついで、所望の位置、例えば、839bpの位置にあるバンドを、メスを用いてゲルから切出す。所望の大きさのチューブ、例えば、1.5mLのチューブに切り出したゲルを入れてスパーテル等ですり潰し、所望量、例えば、600〜1,000μLの希釈バッファー(5〜15mM 酢酸マグネシウム、0.25〜0.75M 酢酸アンモニウム、0.5〜２mM EDTA、及び0.05〜0.2％SDSを含む、pH7.5〜8.5)をこのチューブに加え、65〜75℃で一晩インキュベートする。

この後、上述したと同様に、1/10倍容のQuick-Precip Plus Solutionと2.5倍容の99%エタノールを加えて混合し、例えば、10,000〜15,000rpmで10〜20分遠心し、白い沈殿残して上清を捨て、70％エタノールを加えて混合し、再度同様に遠心を行なう。白い沈殿を残して上清を捨て、エタノールをエバポレートさせて完全に揮発させ、このＤＮＡペレットを蒸留水で溶解させて上記と同様にＤＮＡ濃度を測定する。また、切り出して精製した後のＤＮＡを、上記のような条件下にてミニゲルを用いた電気泳動に供し、単一のバンドになっているか否かを確認する。引き続き、ダイレクトシーケンス解析を行ない、配列が正しいかどうかを確認する。

（６）ｍＲＮＡへの転写
上記のようにして得られたＤＮＡフルコンストラクト、rNTP混合物、Ｔ７トランスバッファー、Ｔ７酵素ミックス及びRNaseインヒビターを所望の量で含む転写用溶液を調製する。こうした転写用溶液としては、例えば、後述する実施例２（１）（１−６）に示す組成の転写用バッファーを使用することが転写効率の点から好ましい。

次いで、この転写用溶液をサーマルサイクラーに入れて、例えば、37℃で1.5〜2.5時間インキュベートする。次いで、ＲＮＡの精製を行なう。例えば、0.5〜2μLのRQ1 RNase-Free DNase (0.5〜２Ｕ/μL)を加え、37℃で10〜20分間インキュベートし、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を使用してＲＮＡの精製を行うことができる。

所望量のRNase free water、RLTバッファー（QIGEN社製RNeasy Mini Kit中で提供される）及び99％エタノールを含むＲＮＡ精製用溶液を調製する。こうしたＲＮＡ精製用溶液としては、例えば、後述する実施例２（２）に示す組成のＲＮＡ精製用バッファーを使用することが精製効率の点から好ましい。

RNeasy purificationカラムにこのＲＮＡ精製用溶液を入れ、所望のｇで所望の時間、例えば、10,000〜15,000rpm（7,000〜14,000ｘｇ）で10〜20秒間遠心する。カラムにRPEバッファー（上記キット中で提供される）を所望の量、例えば、500μL入れ、12,000rpmで10〜20秒間遠心する。次いで、ここに所望の量の80％エタノール、例えば、400〜600μLを加えて、10,000〜15,000rpmで１〜４分間遠心し、エタノール沈殿を行なう。引き続き、ここにRNase free waterを所望の量、例えば、10〜20μL加え、室温で２〜４分間置いた後に、所望のｇで所望の時間、例えば、10,000〜15,000 rpmで0.5〜２分間遠心する。その後、ナノドロップでＲＮＡの濃度を測定する。以上のようにして得られた試料をすぐに使用しない場合は、−80℃で保存する。

（７）リンカーのライゲーション
（７−１）一段階でのライゲーション
一段階でのライゲーションは、例えば、所望の組成のインキュベーション溶液中でｍＲＮＡとリンカーとを連結させる。こうしたインキュベーション溶液としては、例えば、後述する実施例２（３）（３−１）に示す組成の一段階結合用バッファーを使用することが反応効率の点から好ましい。反応条件は、例えば、88〜92℃で１〜３分インキュベートし、0.05〜0.15℃/秒で65〜75℃まで降温させ、約65〜75℃で１〜３分インキュベートし、引き続き、0.05〜0.15℃/秒で20〜30℃まで降温させるようにすることができる。

ここに、ライゲーション溶液を加えて混合液とし、上記の混合液を、20〜30℃で45分〜1.5時間インキュベートし、ライゲーション産物を得る。このライゲーション産物から、所望の量、例えば、0.5〜２μLを取り、同量のバッファー、例えば、２ｘSTRと混合して92〜98℃で２〜４分間加熱する。その後、上記と同様に、マイクロゲルに試料をアプライし、ゲル電気泳動を行なう。電気泳動の条件としては、例えば、ランニングバッファーとして１ｘTBEバッファーを使用し、約100Ｖ、50〜60℃で10〜15分間とすることができる。

電気泳動終了後にイメージャーでFITCを検出し、ライゲーションの成否を確認する。次いで、染色液を用いて染色を行ない、ＲＮＡの分解産物の有無を確認する。こうした染色液としては、例えば、SYBR Green 2等の一本鎖ＤＮＡを染色することができるものを使用することが好ましい。以上のようにして得られたライゲーション産物をすぐに使用しない場合には、−80℃で保存することが好ましい。

（７−２）三段階でのライゲーション
三段階でのライゲーションは、リン酸基除去バッファー中で、リン酸基の除去を行なう。こうしたリン酸基除去用溶液としては、例えば、後述する後述する実施例２（３）（３−２）に示す組成のリン酸基除去用バッファーを使用することが、反応効率の点から好ましい。反応条件としては、36〜38℃で10〜20分間インキュベートし、その後68〜72℃で４〜８分間インキュベートし、次いで３〜５℃に冷却するようにすることができる。次いで、ここにリン酸基付加用溶液を添加して所望の温度で所望の時間、混合し、インキュベートする。こうしたリン酸基付加用バッファーとしては、後述する実施例２（３）（３−２）に示すライゲーションバッファーを使用することが反応効率の点から好ましい。

反応条件としては、36〜38℃で25〜35分間インキュベートし、引き続き、所望の量、例えば、５〜15μMのリンカーを0.5〜1.5M加え、85〜95℃で１〜３分間インキュベートし、0.05〜0.15℃/秒で65〜75℃まで降温させ、同じ降温割合で20〜30℃まで降温させるようにすることができる。

ここに、所望量のＲＮＡリガーゼを加えて所望の時間インキュベートし、ライゲーション産物を得る。例えば、５〜100 unit /μLのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（New England Biolabs製）を0.05〜0.15μL加え、20〜30℃で約45分〜1.5時間インキュベートし、ライゲーション産物を得るようにすることができる。得られたライゲーション産物を所望量、例えば、0.5〜２μLとり、同量のバッファー、例えば、2ｘSTR Loading Buffer（以下、「2ｘSTR」と略すことがある、Promega社製）と混合し、90〜98℃で２〜４分間加熱する。

その後、上記と同様の条件でマイクロゲルにサンプルをアプライしてゲル電気泳動を行ない、イメージャーでFITCを検出し、ライゲーションされているか否かを確認する。次いで、上記と同様に染色液を用いて染色を行ない、ＲＮＡ分解産物の有無を確認する。こうした染色液としては、SYBR Green 2などの一本鎖ＤＮＡを染色できるものであることが、検出感度の点から好ましい。ライゲーション産物をすぐに使用しない場合には、−80℃で保存することが好ましい。

（８）試験管内翻訳
まず、ライゲーション産物、RNaseインヒビター等を含む翻訳用溶液１を調製し、36〜38℃で10分〜４時間インキュベートする。こうした翻訳用溶液１としては、例えば、後述する実施例３（１）に示す組成の翻訳用バッファーを使用することが反応効率の点から好ましい。次いで、ここに所望量のローディング用溶液を加えて、所望の時間インキュベートする。例えば、92〜96℃で１〜５分間インキュベートし、翻訳産物を得るようにすることができる。こうしたローディング溶液としては、後述する実施例３（１）に示す組成のローディングバッファーを使用することが、分離精度の点から好ましい。

得られた翻訳産物を、SDSゲル電気泳動に供して確認する。ゲル電気泳動には、例えば、後述する実施例３（１）に示す組成のSDS-PAGE用ランニングバッファー等を使用することが、分離効率の点から好ましい。次いで、スタッキングゲルとランニングゲルとを調製し、ゲル電気泳動を行なう。こうしたゲルとしては、後述する実施例３（１）に示す組成のスタッキングゲル及びランニングゲルを使用することが分離効率の点から好ましい。常法に従ってゲルを作製し、例えば、約15〜30 mAで、１〜４時間ゲル電気泳動を行なうようにすることができる。

（９）タグ精製
次いで、得られた翻訳産物を、タグを用いて精製する。まず、所望の組成のPBSと下記のような溶出バッファーとを調製し、タグ付きの磁性ビーズを用いて、低吸着チューブ中で反応させて精製を行なう。例えば、Ｈｉｓタグを利用する場合には、以下のようにして精製する。まず、130〜140mMのNaCl、2.5〜3.0mMのKCl、5〜15mMのリン酸水素二ナトリウム、1.5〜2.0mMのリン酸二水素カリウムを含む1ｘPBS（6M NaOHでpH 7.2〜7.4に調整）、及び５〜15mMのリン酸ナトリウムと450〜550mMのイミダゾールを含む2ｘHisMag溶出バッファー（6M NaOHでpH 7.2〜7.6に調整）を調製する。

例えば、所望量のHis Mag セファロース Ni（GEヘルスケアサイエンス社製；例えば、30〜50μL）をとり、所望の大きさ、例えば、1.5mLの低吸着チューブに入れ、ここに所望量、例えば、150〜250μLの1ｘPBSを入れて懸濁し、磁石でビーズを引き付けて上清を捨て、所望量の1ｘPBSを入れて懸濁するという操作を、所望の回数繰り返す。

次いで、ここに精製したい試験管内翻訳産物を加え、総容量が、例えば、100μLになるように所望のバッファー、例えば、1ｘPBS等を加える。このチューブを８〜12℃で一晩置き、上清を捨てる。その後、所望量の1ｘPBSを入れて懸濁し、磁石でビーズを引き付けて上清を捨てるという操作を所望の回数繰り返す。次いで、10〜30μLの溶出バッファーを入れて懸濁し上清を回収する。同量の溶出バッファーを入れて懸濁し、再度上清を回収する操作を行って翻訳産物を回収し、SDS-PAGEに供して翻訳産物を確認する。以上のようにして、所望の標的ドメイン結合部位を含むリンカー及び所望のドメインを含むフルコンストラクトを得ることができる。

なお、作製したコンストラクトのタグ精製が、このタグと酵素タンパク質との相互作用等が原因でうまくいかない場合には、ランダム領域と所望のタグとの間に何らかのスペーサーを含めるようにする。これによって、タグと上記酵素タンパク質本体との相互作用を防止することができ、精製を効率よく進めることができるようになる。

（10）標的ドメインと標的ドメイン結合部位との共有結合を用いた新規ディスプレイ法
以上のようにして得られたＤＮＡコンストラクトを用いてHead-to-Head結合でリンカーとｍＲＮＡとを結合させる方法を以下に説明する。

まず、アンタークティックホスファターゼ（例えば、タカラバイオ(株)製）を用いて、ｍＲＮＡの５’末端から三リン酸を除去し、ついで、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、タカラバイオ(株)製）を作用させてｍＲＮＡの５’末端にリン酸基をつけ、上述したように作製したリンカーと連結する（図７）。
もしくは、これらのホスファターゼ処理及びキナーゼ処理を省いて、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ処理を行ない、リンカーとｍＲＮＡとを直接連結することもできる。

下記の条件で翻訳を行なうと、まず、リボソームがｍＲＮＡに結合する。そして、このリボソームが標的ドメインを含むタンパク質を合成し、前記合成されたタンパク質が前記標的ドメイン結合部位に結合する。リボソームは、上記ｍＲＮＡに含まれる終止コドンを読み取ってタンパク質の合成を終了しｍＲＮＡから離れる。ｍＲＮＡから離れたリボソームは代謝回転して、次のタンパク質合成に利用される（リボソームの代謝回転、図６（Ａ）参照）。

例えば、上述したＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物である、配列表の配列番号９に示す809bpのｍＲＮＡ（以下、それぞれ、「コンストラクト１」又は「ｍＲＮＡ1」ということがある。）を得た場合を例に挙げて説明する。

ここで、Ｎは、Ｇ，Ａ，Ｕ，及び Ｃからなる群から選ばれるいずれかの塩基を表し、ＫはＧ又はＵを表す。上記ｍＲＮＡ1は、230アミノ酸で構成されるタンパク質（配列表の配列番号１０）を表している。

以上のようにして得られたＰＣＲ産物から、所望の量の産物を取り、同量の所望のバッファーと混合して測定用試料を調製し、所望の温度で所望の時間加熱する。その後、蛍光観察によってリンカーとコンストラクト１、ＰＣＲ産物（ｍＲＮＡ１）との結合を確認する。例えば、上記のＰＣＲ産物を0.5〜1.5μLを取って同量の2ｘSTRと混合して測定用試料を調製し、93〜96℃で１〜５分間加熱した後に蛍光測定を行うことで、上記のリンカーと上記のｍＲＮＡ１とが結合しているか否かを確認することができる。

次いで、合成されたタンパク質に予めスペーサー配列を仕組むことにより、後のＨｉｓタグを用いたタンパク質のつり上げ精製を容易なものとすることができる。このようなスペーサーとしては、αへリックス構造を有するもの（以下、「αスタンドスペーサー」という。）を使用することができる。

所望のタンパク質、例えば、ミオグロビンA鎖（A1〜A16、配列表の配列番号11及び図８参照）中の疎水性アミノ酸をGlnに置換し、この配列を使用して作製することができる（特許出願中）。

このペプチドのアミノ酸配列を使用して、後述するインビトロセレクションにより、下記の配列を有する、Ｎ末端フリータイプのαスタンドペプチド（配列表の配列番号12）及びＣ末端フリータイプのαスタンドペプチド（配列表の配列番号13）を得ることができる。

インビトロ選択法は、以下のようにして行う。ここで、ｍＲＮＡとリンカーとの連結は、公知の手法を用いて、直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの３’末端にリンカーの末端と相補的な配列を設けておくと、両者をハイブリダイゼーションによって連結することができる。

本発明において、「ライゲーション」又は「ライゲーション反応」は、酵素により促進される反応をいい、具体的には、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、TS2126耐熱性ファージ由来ＤＮＡリガーゼ等のリカーゼを好適に利用することができ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（タカラバイオ(株)製）を利用することが、連結効率の理由からさらに好ましい。

ライゲーション反応前のアニーリングは、60〜100℃にて２〜60分間、ヒートブロック、アルミブロック、ウォーターバスその他の加温用器具にて温めた後、室温で約２〜60分間放置して液温を穏やかに低下させ、さらに−5〜10℃に冷却して行うことが好ましい。例えば、約90℃で約５分間アルミブロック上にて温め、次に約70℃で約５分間アルミブロック上にて温め、最後に室温で約10分間放置した後、氷上に置くようにすることが好ましい。

ライゲーション反応液の組成は、0.1〜2.5U/μLのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ(株)製）；0.4〜5U/μＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（タカラバイオ(株)製）；10〜250mMのTris-塩酸（pH約7.0〜約8.0）；2.0〜50mMの塩化マグネシウム；2.0〜50ｍMのジチオスレイトール（DTT）；0.2〜5.0のmMのATPを含むものであることが好ましい。反応効率の点から、約0.5U/μLのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ；約2.0U/μLのＴ４ ＲＮＡリガーゼ；約50mMのTris-塩酸（約pH 7.5）；約10mMの塩化マグネシウム；約10mMのDTT；約1.0mMのATPを含有するものであることが好ましい。この反応液には、必要に応じて、SUPERase・In^TM RNase inhibitor（Ambion社製）などのＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加してもよい。

ライゲーション反応を行う反応系の体積は、4.0〜100μLであることが好ましい。反応効率の点から20〜40μLとすることが好ましく、約20μLとすると最も反応効率が高い。この反応系中でのＲＮＡとリンカーとの量比は、5.0〜100pmolのリンカーに対するｍＲＮＡの量を、5.0〜100pmolとすることが好ましい。

アニーリング反応は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼを除いたライゲーション反応液中で行うことができる。そして、アニーリングの終わった反応液中に、これらの酵素を必要量投入することで、ライゲーション反応を開始させることができる。このライゲーション反応は、10〜40℃で約１分間〜数時間行うのが好ましい。作業効率及び反応効率の面から、20〜30℃で４〜12時間とすることが好ましく、約25℃で約８時間とすることが最も好ましい。

次に、連結体Ａ（ｍＲＮＡとリンカーとの連結体）を無細胞翻訳系と混合することによって、タンパク質の合成を行う。ここで、タンパク質を合成するための無細胞翻訳系は、動物由来細胞、植物由来細胞、菌類及び細菌類からなる群から選択することができる。具体的には大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などを使用することができる（Lamfrom H., Grunberg-Manago M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 27, 1 (1967)）。
生物種により翻訳に利用されるコドンの種類が異なるので、対象となる遺伝子や遺伝子の由来に合わせて無細胞翻訳系を選択することが好ましい。

本発明の実施形態においては、前記無細胞翻訳系として、ウサギの血液から得られた網状赤血球細胞のライセートを利用することが好ましい。前記ライセートは、マイクロコッカルヌクレアーゼによって細胞由来のｍＲＮＡを分解し、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）を加えてカルシウムをキレートし、前記ヌクレアーゼを不活化処理したもの（以下、「マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済」という。）とすることが、より好ましい。

翻訳反応液の組成は、４〜85μLのウサギ網状赤血球ライセート（マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済）と0.24〜10 pmolの上記連結体を含む反応バッファー（最終濃度：16〜400mMの酢酸カリウム；0.1〜2.5mMの酢酸マグネシウム；0.2〜50mMのクレアチンリン酸；各0〜0.25mMのアミノ酸を含む）を10〜100μL用いるのが好ましい。反応効率の点から、17μLのウサギ網状赤血球ライセート（同上）と1.2〜2.0pmolの上記連結体とを含む反応バッファー（最終濃度：80 mMの酢酸カリウム；0.5mMの酢酸マグネシウム；10mMのクレアチンリン酸；各0.05mMのアミノ酸（メチオニン及びロイシンは各々0.025mM））を25μL用いるのが、さらに好ましい。また必要に応じて、この反応液に、SUPERase・In^TM RNase inhibitor（Ambion社製）などのＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加してもよい。

翻訳反応は約20〜約40℃で約10〜約90分間行うことが好ましく、生成効率と作業効率の点から、約30℃で約20分間行うことが特に好ましい。

上記連結体は、あらかじめリンカーに標識化合物を結合させておくことによって、容易に検出することができる。そのような標識化合物としては、蛍光性化合物、抗原のエピトープ、放射性同位体等を挙げることができる。ただし、放射性同位体は後の実験操作を行なう上で特別な施設（放射性物質取扱施設）を要求されるため、本実験には適さない。

放射性同位体の利用が困難な場合には、蛍光性化合物を利用することが好ましい。蛍光性化合物としては、フリーの官能基（例えば、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホロアミダイトに変換可能な水酸基、又はアミノ基など）を持ち、標識された塩基としてリンカーに連結可能な種々の蛍光色素を用いることが好ましい。このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を挙げることができる。また、各種ＧＦＰ等も使用することができる。

以上のような手順で、リンカー、標的ドメイン及びαスタンドを含むフルコンストラクトを作製し、標的ドメインを含むタンパク質を合成することができる。αスタンドスペーサーの塩基配列を、標的ドメインを含むタンパク質の塩基配列とタグ精製に使用するタグ配列との間に挟み込んでおくことにより、標的ドメインを含むタンパク質の表面に、タグをうまく配置させることができる。これによって、精製効率を飛躍的に上げることができる。

さらに、本発明では、上記標的ドメインを転写したｍＲＮＡの５’末端にリンカーを結合させるため、終止コドンを入れたｍＲＮＡを設計することが可能であり、リボソームを代謝回転させることができるようになっている。

（実施例１）Ｏ⁶-メチルグアニン-ＤＮＡ-メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）を含むＤＮＡコンストラクトの作製
（１）材料及び方法
NaCl、KCl、リン酸水素二ナトリウム・12水、リン酸二水素カリウム、6M NaOH、EDTA（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム）、ホルムアミドは、和光純薬工業(株)より購入した。MgCl₂はナカライテスク(株)より購入した。HEPESは(株)同仁化学研究所より、ジチオスレイトール及びトライトンＸ-100はSIGMA社より、それぞれ購入した。

（２）ＭＧＭＴの活性の確認及びＭＧＭＴをコードするＤＮＡの増幅
（２−１）溶液の調製
まず、蛍光強度によってＭＧＭＴの活性を評価するために、10ｘD-PBS（1.37M NaCl、27mM KCl、100mM リン酸水素二ナトリウム・12水和物、18mM リン酸二水素カリウム(6M NaOHでpH7.4に調整)）、１ｘ反応バッファー（10mM MgCl₂、１mM ジチオスレイトール、100mM NaCl、18mM HEPES(pH 7.5)、50mM KCl、0.025％ トライトンＸ-100、１μg/mL BSA）、及び停止液（90％ホルムアミド及び20mM EDTA(pH8.0)）を調製した。

（２−２）酵素溶液等の準備
ついで、基質FQ（2.5pmol/μL：２μLの10μM MGMT F (FITC-MGMT23)、２μLの10μM MGMT Q (MGMT-BHQ1)、3.2μLの水及び0.8μLの10ｘD-PBS(-)を含む；合計８μL）又は基質F100（2.5pmol/μL：１μLの10μM MGMT F100、2.6μLの水及び0.4μLの10ｘD-PBS(-)を含む；合計４μL）という２種類の基質溶液を調製した。

上記の２種類の基質溶液を、それぞれ95℃で１分インキュベートし、その後、１℃/秒で37℃まで降温させた。37℃で５分インキュベートした後に、１℃/秒で４℃までさらに降温させ、４℃でハイブリダイゼーションを行った。これらの基質溶液をＭＧＭＴ基質ストック溶液として、使用まで−20℃で保存した。なお、基質の蛍光強度は時間とともに低下するため、調整した日のうちに使用した。また、ＭＧＭＴの基質アナログであるＯ⁶-ベンジルグアニン（以下、「Ｏ⁶-ＢＧ」又は、単に「ＢＧ」ということがある。）のストック溶液を、上記の１ｘ反応バッファーを用いて調製した。

（２−３）ＢＧリンカーの作製
本発明のｍＲＮＡディスプレイ法及びｃＤＮＡディスプレイ法に使用するリンカーは、つくばオリゴサービス(株)に合成を委託した。

（実施例２）２つのＤＮＡコンストラクトの調製
２つのコンストラクト（以下、「コンストラクト１」及び「コンストラクト２」という。）を以下のようにして調製した。これらのコンストラクトの模式的な全体構造を図４（Ａ）及び（Ｂ）に示す。また、コンストラクト１のＤＮＡ配列（839bp）、ｍＲＮＡ配列（809bp）及びタンパク質配列（230aa）を、配列表の配列番号２〜４に示した。同様に、コンストラクト２のＤＮＡ配列（896bp）、ｍＲＮＡ配列（866bp）及びタンパク質配列（249aa）を、配列表の配列番号５〜７に示した。

（１）コンストラクト１の調製
（１−１）ＭＧＭＴ領域の増幅
ＭＧＭＴ領域を増幅させるために、ＭＧＭＴ増幅用溶液（0.5μLのプライムスター（タカラバイオ(株)製）、10μLの５ｘプライムスター反応バッファー、４μLの2.5 mM dNTP混合物、１μLの10μM ＭＧＭＴプライマー１、１μLの10μM ＭＧＭＴプライマー２、0.5μLのSF-コンストラクト-ＭＧＭＴ及び33μLのD.D.W.（二回蒸留水）を含む。合計50μL）を調製した。次いで、95℃で２分、95℃で20秒、65℃で５秒、72℃で30秒というサイクルを30回繰り返してＰＣＲによる増幅を行ない、72℃で５分加熱した後に４℃に冷却して反応を停止させ、ＰＣＲ産物１を得た。この後、得られたＰＣＲ産物１から１μLを取り、７μLの蒸留水及び８μLの２ｘSTRと混合し、95℃で３分間加熱し、ゲル電気泳動用サンプルとした。

アクリルアミド、N,N’-メチレン-ビス(アクリルアミド)(BIS)、過硫酸アンモニウム(APS)、N,N,N’,N’-テトラメチル-エチレンジアミン(TEMED)、尿素、2−メルカプトエタノール、ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）は、和光純薬工業(株)より購入し、ポリアクリルアミドゲルの調製に使用した。また、ホウ酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンも和光純薬工業(株)より購入し、5ｘTBEバッファーの調製に使用した。

ミニゲル（８Ｍの尿素を含む４％アクリルアミドゲル）にサンプルをアプライし、ランニングバッファーとして0.5ｘTBEバッファーを用いて、200Ｖ、60℃で90分間、ゲル電気泳動を行なった。ゲル電気泳動終了後に、SYBR Green II Nucleic Acid Gel Stains（SYBR Green 2と略すことがある（タカラバイオ(株)製）で一本鎖ＤＮＡを染色し、イメージャーで検出した。結果を図11に示す。

（１−２）増幅したＭＧＭＴ領域へのＴ７領域の付加
オーバーラップＰＣＲにより、上記（１−１）で得られたＭＧＭＴ領域にＴ７領域を付加するために、Ｔ７領域付加用溶液（0.5μLのプライムスター、10μLの５ｘプライムスター反応バッファー、４μLの2.5 mM dNTP混合物、１μLの10μM Ｔ７プライマー、0.3μLの10μM Ｔ７-リンカーハイブリ-ＭＧＭＴ、１μLの10μM ＭＧＭＴプライマー２、１μLのＭＧＭＴ ＰＣＲ産物及び33μLのD.D.W.を含む、合計50μL）を調製した。

上記Ｔ７領域付加用溶液をサーマルサイクラーに入れ、95℃で２分処理した後に、［95℃で20秒、65℃で５秒、72℃で30秒］というサイクルを30回繰り返し、次いで72℃で５分加熱した後に、４℃に冷却した。１μLのＰＣＲ産物と７μLの蒸留水、及び８μLの２ｘSTRを混合し、95℃にて３分間加熱した。これをサンプルとして、ミニゲル（４％アクリルアミドゲル、８Ｍ尿素を含む。）にアプライし、ランニングバッファーとして0.5ｘTBEバッファーを用いて、200Ｖ、60℃で90分間ゲル電気泳動を行なった。ゲル電気泳動終了後に、SYBR Green 2で一本鎖ＤＮＡを染色し、イメージャーで検出した。

目的とする621 bpの位置に現れたバンドからＭＧＭＴ配列を含むＰＣＲ産物２を得た（図11参照）。次いで、ＭＧＭＴの上流にＴ７プロモーター領域の配列を、３’末端が相互にオーバーラップした２種のＤＮＡ（Ｔ７プロモーター用及びＭＧＭＴ用）を等量で混合し、通常のＰＣＲ条件でオーバーラップＰＣＲを行なって繋ぎ、733bpのＴ７-ＭＧＭＴ配列を得た（図12参照）。

（１−３）ランダム領域の増幅
次いで、ランダム領域を増幅させるために、ランダム領域増幅用バッファー（４μLのVent_R (exo-) ＤＮＡポリメラーゼ（BioLabs社製）、20μLの10ｘVent_R (exo-) ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー、４μLの100mM MgSO₄、16μLの2.5mM dNTP混合物、２μLの100μM ＭＧＭＴ-His tag Xaプライマー、２μLの100μMビオチン-cNew Ytagプライマー、１μLの10μMランダムテンプレート及び151μLのD.D.W.を含む。合計200μL）を調製した。このバッファーをサーマルサイクラーに入れ、95℃で２分処理した後に、［95℃で20秒、65℃で30秒、75℃で１分］というサイクルを30回繰り返し、72℃で５分加熱した後に、４℃に冷却してＰＣＲ産物３を得た。

上記のようにして得られたＰＣＲ産物３から１μLを取り、１μLの２ｘSTRと混合して95℃で３分間加熱した。次いで、この溶液をサンプルとしてマイクロゲル（８Ｍの尿素を含む８％アクリルアミドゲル）にアプライし、ランニングバッファーとして１ｘTBEバッファー用いて、100Ｖ、55℃で10分間ゲル電気泳動を行なった。ゲル電気泳動終了後にSYBR Green 2で一本鎖ＤＮＡを染色し、イメージャーで検出した。

次いで、上記のＰＣＲ産物３に、1/10倍容のQuick-Precip^TMPlus Solution (10mM トリス-塩酸(pH 8.0), 1mM EDTA及び５Ｍ NaClを含む。EdgeBio社製) と2.5倍容の99%エタノールとを加えて混合し、13,000rpm（12,000ｘｇ）で15分間遠心した。次いで、白い沈殿を落とさないように上清を捨て、70%エタノールを加えて混合し、再度、13,000rpmで10分間遠心した。白い沈殿を落とさないように上清を捨て、エバポレーターでエタノールを完全に飛ばし、その後、蒸留水にＤＮＡペレットを溶解させ、ナノドロップ（Thermo Fischer Scientific社製）でＤＮＡ濃度を測定した。

（１−４）ＰＣＲ増幅されたランダム領域のビーズ精製
50μLのストレプトアビジンビーズ（Dynabeads MyOne Streptavidin C1、Invtrogen社製）を低吸着チューブに入れ、このチューブを磁石に付けて、上清を捨てた。ここに、100μLの１ｘ結合バッファーを入れて混合し、磁石に付けて、上清を捨てた。100μLの１ｘ結合バッファーを入れて混合し、磁石に付けて、上清を捨てるという操作をさらに２回繰り返した。

ここに上記（１−２）で得られたＰＣＲ産物３（ランダム領域）を20μL(約37μg)、蒸留水を30μL、及び2ｘ結合バッファーを50μL加えて混合した。この溶液をローテーターに入れて４℃で回転させ、一晩置いた。このチューブを磁石に付けて、上清を捨てた。100μLの１ｘ結合バッファーを入れて混合し、磁石に付けて、上清を捨てるという操作を３回繰り返した。

50μLの解離バッファー(10 mM EDTA を含む95％ホルムアミド)を加えて、ローテーター中に入れ、70℃で15分間反応させ、磁石に付けて上清を回収した。50μLの解離バッファーを加えてローテーター中に入れ、70℃で15分間反応させ、磁石に付けて上清を回収するという操作を再度行った。

回収した上清を、上記（１−３）のＰＣＲ産物３の精製と同様に、Quick-Precip Plus Solutionを用いたエタノール沈殿法によって精製した。蒸留水に遠心で得られたＤＮＡペレットを溶解させ、ナノドロップでＤＮＡ濃度を測定した。目的とする128 bpの位置に現れたバンドから、Ｈｉｓタグ-ランダム領域配列を含むＰＣＲ増幅産物を得た（図13参照）。

（１−５）フルコンストラクトの作製
以上のようにして得られたコンストラクト１作製用の各ＰＣＲ増幅産物を用いて、コンストラクト１をフルコンストラクトとして作製するために、フルコンストラクト作製用バッファー（４μLのVent_R(exo-)ＤＮＡポリメラーゼ（BioLabs社製）、20μLの10ｘVent_R(exo-)ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー、４μLの100mM MgSO₄、16μLの2.5mM dNTP混合物、９μLのＴ７〜ＭＧＭＴ領域(15 pmol)、1.3μLのHis tag〜ランダム領域 (15pmol)及び141.7μLのD.D.W.を含む、合計196μL）を調製した。

上記フルコンストラクト作製用バッファーをサーマルサイクラーに入れ、95℃で２分間、次いで75℃で６分間インキュベートした。ここに、２μLの100μMのＴ７プライマー及び２μLの100μMのBiotin-cNew Ytagプライマーを加えた。この混合物をサーマルサイクラーに入れ、95℃で10秒、65℃で30秒、75℃で１分というサイクルを30回繰り返し、次いで75℃で５分インキュベートし、４℃に冷却してコンストラクト１をフルコンストラクトとして得た。

上記のようにして得られたＰＣＲ産物４（コンストラクト１）に、1/10倍容のQuick-Precip^TM Plus Solution (10mM トリス-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA及び5M NaCl) と2.5倍容の99％エタノールとを加えて混合し、13,000rpm（12,000ｘｇ）で15分間遠心した。次いで、白い沈殿を落とさないように上清を捨て、70%エタノールを加えて混合し、再度、13,000 rpmで10分間遠心した。白い沈殿を落とさないように上清を捨て、エバポレーターでエタノールを完全に飛ばし、その後、蒸留水にＤＮＡペレットを溶解させ、ナノドロップでＤＮＡ濃度を測定した。

１μLのＰＣＲ産物４と７μLの蒸留水及び８μLの２ｘSTRを混合し、95℃で３分間加熱した。これをサンプルとして、ミニゲル（８Ｍの尿素を含む４％アクリルアミドゲル）にアプライし、ランニングバッファーとして0.5ｘTBEバッファーを用いて、200Ｖ、60℃で90分間ゲル電気泳動を行なった。ゲル電気泳動終了後に、SYBR Green 2で一本鎖ＤＮＡを染色し、イメージャーで検出した。図14のフルコンストラクトを泳動させたレーンで見える２本のバンドのうち、下側に見えるバンドはＴ７プロモーター-ＭＧＭＴ配列（733bp）の残りで、上側に見えるバンドがランダム領域を含むフルコンストラクト（839bp）であると考えられた。鎖長を確認したところ、目的とする839bp付近にバンドが確認された。

839bpのバンドの位置でメスを使ってゲルを切り取り、これを1.5mLチューブに入れてスパーテルですり潰した。ここに、800μLの希釈バッファー(10mMの酢酸マグネシウム、0.5Mの酢酸アンモニウム、１mMのEDTA(pH 8.0)、0.1％SDS)を加え、70℃で一晩インキュベートした。

上記のＰＣＲ産物４の精製と同様にして精製し、ナノドロップでＤＮＡ濃度を測定した。ゲルから切り出して精製したＤＮＡを、ミニゲルでさらにゲル電気泳動を行ない、単一のバンドになっているかどうかを確認した。結果を図15及び図16に示す。引き続き、ダイレクトシーケンス解析を行ない、配列が正しいか否かを確認した。

（１−６）ｍＲＮＡへの転写（濃度測定用）
得られたコンストラクト１をｍＲＮＡに転写するために、転写用バッファー（２μLのＤＮＡフルコンストラクト(3.6pmol)、３μLの2.5mM rNTP混合物、２μLの５ｘＴ７トランスバッファー、２μLのＴ７酵素混合物及び１μLのRNaseインヒビターを含む。合計10μL）を調製した。上記転写用バッファーをサーマルサイクラーに入れ、37℃で２時間インキュベートした。次いで、ここに１μLのRQ1 RNase-Free DNase (１Ｕ/μL、Promega社製)を加え、37℃で15分間インキュベートしてＲＮＡ精製用試料とした。ＲＮＡの精製には、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を使用した。まず、上記ＲＮＡ精製用試料に、ＲＮＡ精製用バッファー（90μLのRNase free water、350μLのRLTバッファー及び250μLの99％エタノール）を加えて、混合液とした。

上記混合液をRNeasy 精製カラムに入れ、12,000rpmで15秒間遠心した。コレクションチューブを捨てて、新しいコレクションチューブにカラムを入れ、カラムにRPEバッファーを500μL入れ、12,000rpmで15秒間遠心した。コレクションチューブを捨てて、新しいコレクションチューブにカラムを入れ、80％エタノールを500μL加えて12,000rpmで２分間遠心した。コレクションチューブを捨てて、新しいコレクションチューブにカラムを入れ、カラムの蓋を開け、さらに12,000rpmで５分間遠心した。

コレクションチューブを捨てて、新しいコレクションチューブにカラムを入れ、15μLのRNase free waterを加えて室温で３分間置いた。12,000rpmで１分間遠心した。再度15μLのRNase free waterを加えて室温で１分間置いた。その後、12,000rpmで１分間遠心し、ナノドロップでＲＮＡの濃度を測定した。

（２）ｍＲＮＡへの転写（サイズ測定用）
上記（１−５）で得られたＤＮＡコンストラクト１をｍＲＮＡへ転写するために、転写用バッファー溶液（２μLのＤＮＡフルコンストラクト(3.6pmol)、３μLの2.5mM rNTP混合物、２μLの5ｘＴ７トランスファーバッファー、２μLのＴ７酵素ミックス、１μLのRNaseインヒビター（RNasin Plus PNase Inhibitor, Promega社製）を含む。合計10μL）を調製した。この転写用バッファーをサーマルサイクラーに入れ、37℃で２時間インキュベートした。ついで、ここにRQ1 RNase-Free DNase (1U/μL)を１μL加え、37℃で15分間インキュベートした。

RNeasy Mini Kitを使用し、ＲＮＡの精製を行った。まず、ＲＮＡ精製用バッファー（90μLのRNase free water、350μLのRLTバッファー及び250μLの99％エタノールを含む。合計700μL）を調製し、これをRNeasy Mini Kit中に入れ、12,000rpmで15秒間遠心した。コレクションチューブを捨てて、新しいコレクションチューブにカラムを入れ、このカラムに500μLのRPEバッファーを入れて、再度、12,000rpmで15秒間遠心した。遠心後、このコレクションチューブを捨てて、新しいコレクションチューブにカラムを入れ、このカラムに500μLの80％エタノールを入れて、12,000rpmで２分間遠心した。遠心終了後にコレクションチューブを捨てて、新しいコレクションチューブにカラムを入れ、カラムの蓋を開けて、さらに12,000rpmで５分間遠心した。

遠心終了後に、このコレクションチューブを捨てて新しいコレクションチューブにカラムを入れ、ここに15μLのRNase free waterを入れて、室温にて３分間静置し、その後、12,000rpmで１分間遠心した。遠心終了後に、このコレクションチューブを捨てて新しいコレクションチューブにカラムを入れ、ここに15μLのRNase free waterを入れ、室温で１分間静置し、12,000rpmで１分間遠心した。その後、ＲＮＡの濃度を測定した。

以上のようにして得られたｍＲＮＡのおよそのサイズをゲル電気泳動によって確認した（図17参照）後に、809nts（塩基数）ｍＲＮＡとして、以下の実験に用い、後続の実験でその正当性を確認した。この段階で厳密な測定はｍＲＮＡの量が少なく、また不安定であることから、極めて困難であることによる。

（３）リンカーのライゲーション
（３−１）一段階での結合
次いで、得られた809 bpのｍＲＮＡの５’末端に、上記（２）で得たFITCラベルしたＢＧリンカー配列を、ハイブリダイゼーション法で相補結合させ、その後、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼで酵素的に結合した。ｍＲＮＡに結合したリンカーを、ゲル電気泳動後にFITCの蛍光で検出した。以下、手順に従って詳細を述べる。

リンカーのライゲーション用に、下記表１に示す濃度のｍＲＮＡとＢＧリンカーとを用いて、４種類の一段階結合用バッファー（ｘμLのｍＲＮＡ(ｘpmol)、ｙμLの10μM ＢＧ-PEG-リンカー(20ｘpmol)、及び21.5−(ｘ＋ｙ)μLのRNase free waterを含む。合計21.5μL）を調製した。このバッファーをサーマルサイクラーに入れ、90℃で２分間インキュベートし、0.1℃/秒で70℃まで降温させ、70℃で２分間インキュベートし、0.1℃/秒で25℃まで降温させた。次いで、ライゲーションバッファー（２μLのRNase インヒビター(40ユニット/μL)、2.5μLの10ｘＴ４ ＲＮＡリガーゼバッファー及び１μLのＴ４ ＲＮＡリガーゼ(10〜50ユニット/μL)を含む。合計5.5μL）を調製してここに加え、混合物とした。

上記混合物を25℃で１時間インキュベートして、リンカーをライゲーションさせた。得られたライゲーション産物から１μLを取り、１μLの2ｘSTRと混合して、95℃で３分間加熱した。この溶液をサンプルとして、上記と同様のマイクロゲル（８Ｍの尿素を含む８％アクリルアミドゲル）にアプライし、ランニングバッファーとして1ｘTBEバッファーを用いて、100Ｖ、55℃で10〜15分間ゲル電気泳動を行なった。

ゲル電気泳動終了後、イメージャーでFITCを検出し、ライゲーションされているか否かを確認した。次いで、SYBR Green 2で一本鎖ＤＮＡを染色し、ＲＮＡの分解産物があるか否かを確認した。結果を図18に示す。

図18に示すように、FITCによる検出でバンドは見られず、ライゲーション産物が確認されなかったことから、ライゲーションがされていないことが示された。これは、Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼが５’リン酸末端のオリゴヌクレオチドと３’-OHのオリゴヌクレオチドとを連結させる酵素であることから、ｍＲＮＡの三リン酸の５’末端がＢＧ-リンカーと結合されないことによるものと思われた。

（３−２）三段階での結合
リンカーのライゲーション用にリン酸基除去用バッファー（８μLのｍＲＮＡ (8pmol)、１μLの10ｘアンタークティックリン酸バッファー及び１μLのアンタークティックホスファターゼ（New England Biolabs社製）を含む。合計10μL）を調製した。このバッファーをサーマルサイクラーに入れ、37℃で15分間インキュベートした。次いで70℃で５分間インキュベートし、４℃に冷却してｍＲＮＡの５’末端からリン酸基を除去した。この溶液に、ライゲーションバッファー（10.5μLのRNase free water、2.5μLの10ｘＴ４ ＲＮＡリガーゼバッファー及び１μLのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(10ユニット/μL)を含む。合計24μL）を調製して加え、混合物とした。

この混合物を37℃で30分間インキュベートし、次いで、１μLの10μMのＢＧ-リンカーを加えて、サーマルサイクラーに入れ、90℃で２分間インキュベートした。0.1℃/秒で70℃まで降温し、70℃で２分間インキュベートした後に、0.1℃/秒で25℃まで降温させた。

この試料に、１μLのＴ４ ＲＮＡリガーゼ(10〜50ユニット/μL)を加え、25℃で１時間インキュベートしてライゲーション産物を得た。得られたライゲーション産物から１μLを取り、１μLの２ｘSTRと混合し、95℃で３分間加熱した。このサンプルを上記（２）と同様にマイクロゲルにアプライし、ランニングバッファーとして１ｘTBEバッファーを用いて、100Ｖ、55℃で10〜15分間ゲル電気泳動を行なった。結果を図19に示す。

図19に示すように、約200塩基付近にFITCラベルのバンドが見られた。SYBER Green2で染色した場合も、同様の位置にバンドが検出され、さらに、809塩基に相当する位置にバンドが検出された。809塩基のｍＲＮＡと50塩基のｍＲＮＡ断片とが結合すると859塩基のバンドが見られるはずであるが、今回見られたバンドはそれよりもはるかに遅く移動しているように見えるのは、リンカーが分枝構造を有する、かさばった構造となっているためと考えられた。

また、転写して得られたｍＲＮＡには、150塩基又は180塩基程度の大きさのｍＲＮＡ断片が含まれていた。こうした断片のｍＲＮＡにリンカーが結合すると、FITCで見られたバンドの大きさと一致することから、染色で検出されたバンドは、これらのｍＲＮＡ断片にリンカーが結合したものであるか、又はリンカー同士が結合したものではないかと考えられた。

リンカー同士の結合ではなく、ｍＲＮＡの５’末端とリンカーの３’末端との結合が形成されたことを確認するために、上記のゲル電気泳動結果から、ｍＲＮＡのバンドを切り出して上記と同様の条件にて精製を行ない、ｍＲＮＡをシングルバンドにして、上記と同様の条件でライゲーションを行った。結果を図20に示す。

図20に示すように、リンカー・ｍＲＮＡのライゲーション産物は、実際にはｍＲＮＡより50塩基程大きいはずだが、400〜500ntsに見られるのは、ｍＲＮＡの一部が分解しているものと考えられた。逆に言えば、リンカー（50nts）同士の結合物としてはサイズが大きすぎて説明がつかない。このことから、リンカーとｍＲＮＡとが結合していることが確認された。
一方で、反応を進めていく過程でｍＲＮＡが徐々に短くなっていることが明らかになり、引き続く反応で使用するためには、ｍＲＮＡの分解を防ぐ必要があることが示された。ｍＲＮＡが短くなった原因としては、ｍＲＮＡが不安定な物質であり、RNaseによる分解や加熱による加水分解等が起こりやすいこと、及び脱リン酸化酵素の反応溶液に亜鉛イオンが含まれているため、加熱時の加水分解が促進されてしまった可能性があること等が考えられた。

（３−３）転写及びリンカーとの結合−その２
別のロットのＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、再度、ｍＲＮＡの５’末端の三リン酸とリンカーの３’末端の-OHとの結合を試みた。今回は、ｍＲＮＡに対してＢＧ-リンカーが過剰量となるように加えてハイブリダイズさせ（表２参照）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを100ユニット/μL加えて反応させたところ、ｍＲＮＡにＢＧ-リンカーが結合したことが確認できた。結果を図21に示す。

通常、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、５’リン酸末端のオリゴヌクレオチドと３’-OHのオリゴヌクレオチドとを連結させるが、ここで用いた別のロットの酵素は先に使用したものよりも活性が高いため、スター活性的にｍＲＮＡの三リン酸の５’末端とリンカーの３’-OHとを結合したものと考えられた。さらに、１段階の反応でリンカーとｍＲＮＡとを結合させることができたため、ｍＲＮＡの分解も抑えられた。したがって、この方法がリンカーとｍＲＮＡとの連結に適していることが確認された。

（実施例３）PUREflexを用いたin vitro 翻訳
（１）in vitro 翻訳
上記実施例１で作製したＢＧリンカー・ｍＲＮＡのライゲーション産物を、PUREflex（日本ミリポア(株)社製）を用いて翻訳した。まず、ｘμLのライゲーション産物（ｘpmol）、25μLの溶液１、2.5μLの溶液２、2.5μLの溶液３、５μLのRNase インヒビター(40ユニット/μL)及び（15−ｘ）μLのRNase free waterを含む翻訳用バッファー（合計50μL）を調製し、37℃で、１〜４時間インキュベートして翻訳産物を得た。

次に、６μLの翻訳産物、４μLの0.5M EDTA及び10μLの２ｘローディングバッファーを含むゲル電気泳動用溶液を調製し、95℃で３分間インキュベートした。以上のようにしてゲル電気泳動用サンプルを得た。

ゲル電気泳動用に、1.5Mトリス−塩酸(pH8.8)、0.5Mトリス−塩酸(pH6.8)、2ｘSDS-PAGE用ランニングバッファー（25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、192mMのグリシン及び0.1％SDSを含む）、2ｘSDSローディングバッファー（0.1MのTris-HCl (pH6.8)、４％のSDS、20％グリセロール、色素BPB及びXCを含む）、PBS-Tバッファー（137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄・12H₂O、1.8mM K₂HPO₄(6M NaOHでpH7.4に調整)及び0.1％のTween 20を含む）、及び40％アクリルアミドストック（アクリルアミド/ビスアクリルアミド＝19/1；38％(w/v)のアクリルアミド及び２％(w/v)のN,N’-メチレン-ビスアクリルアミドを含む）を調製した。

0.5mLの40％アクリルアミドストック、1.25mLの0.5Mトリス−塩酸(pH6.8)、250μLの２％SDSを含み（必要に応じて、16μLの20％APS及び５μLのTEMEDを加える）、蒸留水で５mLにメスアップして、スタッキングゲルを調製した。また、1.5mLの40％アクリルアミドストック、2.5mLの1.5Mトリス−塩酸(pH8.8)、500μLの２％SDSを含み（必要に応じて、33μLの20％APS及び10μLのTEMEDを加える）、蒸留水で10mLにメスアップして、ランニングゲルを調製した。

以上のようにして得られたゲル電気泳動用サンプルをゲルの各ウェルにアプライし、20mAで２時間、ゲル電気泳動を行なった。ゲル電気泳動終了後にイメージャーでFITCを検出し、ライゲーションされているか否かを確認した。引き続き、SYBR Green 2で一本鎖ＤＮＡを染色し、ＲＮＡの分解産物があるか否かを確認した。

翻訳後、ＢＧリンカー・ｍＲＮＡのライゲーション産物よりも大きなサイズの位置にバンドが見られ、翻訳されたＭＧＭＴがリンカーのＢＧに結合したものと考えられた。さらに、ｍＲＮＡと未反応の残存するＢＧリンカーが翻訳されたタンパク質と結合してできたタンパク質・ＢＧリンカー結合体のバンドも確認された。これは、ＭＧＭＴの合成の成功と、リンカーのＢＧとＭＧＭＴとが結合したことを示していた。

翻訳時間を、0.5時間、１時間、3.5時間として、試験管内翻訳産物の変化を調べたところ、インビトロ翻訳の時間が長くなるにつれて、タンパク質・ＢＧリンカー結合体の量が増加していた。これは、リボソームが代謝回転して過剰量のＭＧＭＴタンパク質が作られたためと考えられた（図22参照）。

また、得られた翻訳産物500pgに0.1μｇのプロテイナーゼＫを作用させたところ、ＭＧＭＴタンパク質-ＢＧリンカー・ｍＲＮＡ結合体と思われるバンド及びＭＧＭＴタンパク質・ＢＧリンカー結合体のバンドが薄くなった。このことから、いずれのバンドも、タンパク質との結合体であることが確認された。また、ＭＧＭＴとＢＧリンカーとを、上記のリンカー−ｍＲＮＡ結合体を翻訳するときの反応の条件で反応させ、タンパク質・ＢＧリンカー結合体のバンドの位置を確認した（図23参照）。

得られた翻訳産物0.5pmolを6μｇのRNase Aで37℃にて30分間処理したところ、タンパク質-ＢＧリンカー・ｍＲＮＡ結合体と思われるバンド及びＢＧリンカー・ｍＲＮＡ結合体のバンドがいずれも消失した。このため、これら２つのバンドはいずれもＲＮＡ結合体であることが確認された。さらに、タンパク質（ＭＧＭＴ）-ＢＧリンカー結合体のバンドのみが残ることも確認された（図24参照）。このことはＢＧリンカーが目的どおり、ｍＲＮＡおよびタンパク質（ＭＧＭＴ）の両者と結合していることを表している。

（２）翻訳産物のＨｉｓタグ精製
次に、Ｈｉｓタグ精製用に、137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM リン酸二ナトリウム・12水和物及びリン酸二水素カリウムを含む１ｘPBS（6M NaOHでpH 7.4に調整）及び20mM リン酸ナトリウム及び500mMのイミダゾール（6M NaOHでpH 7.4に調整）を含むHisMag溶出バッファーを調製した。

His Magセファロース Niを40μL取って、1.5mLの低吸着チューブに入れた。ここに、200μLのPBSを入れて懸濁し、磁石に付けて上清を捨てた。200μLのPBSを入れて懸濁し、磁石に付けて上清を捨てるという操作を２回繰り返した。次いで、精製したいインビトロ翻訳産物を入れ、全量が100μLとなるようにPBSを加え、ローテーターに入れ、10℃で一晩置いた。PBSを入れて懸濁し、上清を捨てるという上記と同じ操作を２回繰した。ここに20μLの溶出バッファーを加えて懸濁し、磁石に付けて上清を回収した。上清を回収する操作を再度行い、回収した産物をSDS-PAGEで確認した。その結果、Ｈｉｓタグ精製の溶出液をゲル電気泳動に供しても、バンドは見られず、Ｈｉｓタグ精製ができないことが明らかになった。結果を図25に示す。

（実施例４）コンストラクトの改良によるＨｉｓタグの提示の改善
（１）コンストラクト１の立体構造の予測
既に述べた通り、実施例１で得られたコンストラクト１は、ＭＧＭＴの後ろに４アミノ酸長のスペーサーを挟んでＨｉｓタグ配列が来るように設計されている。このため、本来ならば、ＨｉｓタグがNi-NTAビーズに結合して、翻訳産物が回収されるはずである。しかし、逆の結果が出たことから、SWISS-MODEL構造予測にもとづき、コンピューターシミュレーションでＨｉｓタグ部分がどのようにフォールディングしているかを検討した。

上記コンストラクト１では、ＨｉｓタグがＭＧＭＴのβシートと相互作用しているものと推定され、これによってＨｉｓタグ精製が上手くいかなかったと考えられた。これは、立体障害、又はタンパク質のフォールディングの際にＨｉｓタグがタンパク質の内部に巻き込まれてしまい、精製用のタグとしての役割を果たしていないこと、その結果、Ni-NTAビーズに結合しないことに起因することによるものと考えられた。

（２）コンストラクト２の立体構造の予測
そこで、ＭＧＭＴとＨｉｓタグ配列との間に、４アミノ酸長のスペーサーと、19アミノ酸長のαスタンドペプチドとを挟んだ構造を、SWISS-MODEL構造予測法にもとづいて、コンピューターシミュレーションした（図26（Ａ）及び（Ｂ）参照）。この結果、このコンストラクト２では、Ｈｉｓタグ部分はタンパク表面に出ており、Ｈｉｓタグ精製に好適な構造をとることが明らかになった。このため、以下のようにしてＤＮＡコンストラクト２を作製し、Ｈｉｓタグ精製を試みた。

（３）コンストラクト２の作製と実践評価
コンストラクト１の作製と同様にして、コンストラクト２を構成する各領域を増幅させ、最後にこれらを連結し、オーバーラップＰＣＲ法を用いて896bpのコンストラクト２（コンストラクト２に挿入されたHis Tag提示用部分（57nts）の配列については、配列表の配列番号15を参照）を作製した。

すなわち、ＭＧＭＴ領域をコンストラクト１を作製した場合と同様にＰＣＲで増幅させた。次いで、上記と同様にオーバーラップＰＣＲ法を用いて、ＭＧＭＴ領域にＴ７領域を付加した。その後、ランダム領域をビーズにて精製し、Ｔ７領域を付加したＭＧＭＴ領域、及びスペーサーを含むＨｉｓ-タグを付加したランダム領域を、上記と同様にしてＰＣＲで増幅させ、コンストラクト２（フルコンストラクト）を得た。

上述したのと同じ方法で上記コンストラクト２をｍＲＮＡに転写させ、866merのｍＲＮＡ（配列表の配列番号16）を得た。ここで、Ｎは、Ｇ，Ａ，Ｕ，及びＣからなる群から選ばれるいずれかの塩基を表し、ＫはＧ又はＵを表す。

このｍＲＮＡを、上記コンストラクト１と同様に処理したところ、先ず、in vitro 翻訳のレーンから、“タンパク質・ＢＧリンカー・ｍＲＮＡ”の三者結合体、及び過剰に翻訳されたタンパク質と余剰なＢＧリンカーとが結合してできる“タンパク質・ＢＧリンカー”の結合体とがそれぞれ確認された。そのＨｉｓタグ精製物からＨｉｓタグによって釣り上げられたことを示すバンド（三者結合体）は精製前から痕跡的で、ゲルのトップにわずかに検出される。この写真では確認できないが、一方で、His-tag精製溶出液（左から3番目及び4番目のレーン）では、過剰に翻訳されてできた“タンパク質−ＢＧリンカー”の結合体が鮮明に現れており、一方、Ｈｉｓタグを含まないＢＧリンカー・ｍＲＮＡ連結体は消失しており、これは、明らかにＨｉｓタグで精製されるタンパク質配列の存在を意味していた。

この結果、コンストラクト２がうまくいっていることが示された。なお、ここで得られたタンパク質は249アミノ酸で構成されるタンパク質（配列表の配列番号１７）と推定された（図27参照）。ここで、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す。

（４）結果
以上より、ｍＲＮＡの５’末端側にＢＧリンカーを結合させること、さらにそのＢＧリンカーに翻訳されたタンパク質が結合することを確認し、Head-to-Head Linking（H-to-H 結合）を形成させることができた。この技術では、大量のリボソームを使用することなく、インビトロ翻訳が可能である。なお、H-to-H 結合を実際のインビトロセレクションに使用する際には、翻訳前に未反応のリンカーを取り除くステップを加えることで、この方法が改善されることが期待された。

本発明は、進化工学分野、ペプチド創薬スクリーニング分野、医療分野、及び診断分野で有用である。

配列番号１：Ｈ２Ｈリンカーの塩基配列
配列番号２：ＭＧＭＴのＤＮＡ配列
配列番号３：ＭＧＭＴ ＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号４：ＭＧＭＴ ＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号５：Ｔ７プライマー
配列番号６：ビオチン−ｃＮｅｗ Ｙｔａｇプライマー

配列番号７：逆転写用プライマー
配列番号８：Ｈｉｓ ｔａｇ−ＸａＲ プライマー
配列番号９：ＰＣＲで増幅されたＭＧＭＴのｍＲＮＡ
配列番号１０：配列番号９から翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：人工的なミオグロビンタンパク質のアミノ酸配列

配列番号１２：Ｎ末端遊離型スタンドペプチド
配列番号１３：Ｃ末端遊離型スタンドペプチド
配列番号１４：ランダムプライマー
配列番号１５：コンストラクト２に挿入されたＨｉｓ−ｔａｇ提示配列
配列番号１６：コンストラクト２のｍＲＮＡ
配列番号１７：配列番号１６から翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列

Claims (6)

1. 標的ドメイン結合部位及び蛍光標識を含むリンカーを作製するリンカー作製工程と；
   少なくとも、標的ドメイン、可変領域、及び終止コドンの塩基配列を含むＤＮＡコンストラクトを作製する、ＤＮＡコンストラクト作製工程と；
   前記ＤＮＡコンストラクトから転写によって対応するｍＲＮＡを調製する、転写工程と；
   前記ｍＲＮＡの５’末端を酵素処理して、前記リンカーの３’末端と結合させるｍＲＮＡ−リンカー連結工程と；
   前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体に含まれる前記ｍＲＮＡに１個のリボソームが結合して翻訳により前記標的ドメインを生成する翻訳工程と；
   前記翻訳された標的ドメインが、前記リンカーの前記標的ドメイン結合部位に結合し、ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体を形成するとともに、前記リボソームが前記終止コドンを認識して前記ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体から自動的に遊離するリボソーム遊離工程と；
   を備える、リボソームの代謝回転が可能なｍＲＮＡディスプレイ法。
2. 前記ＤＮＡコンストラクト作製工程で使用する所望のドメインは、Ｏ^６-メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）及びＭＧＭＴの機能性変異体タンパク質からなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする、請求項１に記載のリボソームの代謝回転が可能なｍＲＮＡディスプレイ法。
3. 前記ＤＮＡコンストラクトは、前記塩基配列の下流側に、所望の長さのスペーサー、所望の長さのαへリックス構造を有するαスタンドペプチド、及び精製用タグを含み、さらに可変ペプチド配列又は可変タンパク質のいずれか一方を含むことを特徴とする、請求項２に記載のリボソームの代謝回転が可能なｍＲＮＡディスプレイ法。
4. 前記スペーサーの長さは３〜５アミノ酸長であり、前記αスタンドペプチドの長さは１７〜２１アミノ酸長であることを特徴とする、請求項３に記載のリボソームの代謝回転が可能なｍＲＮＡディスプレイ法。
5. 前記精製用タグが、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ及びビオチン様ペプチドからなる群から選ばれるいずれかのものであることを特徴とする、請求項３又は４に記載のリボソームの代謝回転が可能なｍＲＮＡディスプレイ法。
6. ｍＲＮＡの５’三リン酸とリンカーを、ｍＲＮＡの５’末端から三リン酸を除去する三リン酸除去酵素、三リン酸が除去されたｍＲＮＡの５’末端にリン酸を付加するキナーゼ、及びリンカーとｍＲＮＡの５’三リン酸状態の末端とを直接連結するＴ４ ＲＮＡリガーゼにより連結するか、または直接Ｔ４ ＲＮＡリガーゼで連結することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のリボソームの代謝回転が可能なｍＲＮＡディスプレイ法。

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