JP6640311B2 - 軟骨細胞の細胞外基質由来ペプチド - Google Patents

Description

本発明は、新規なペプチド及びその用途に関する。

細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）は、組織で細胞を
除いた残りの成分であって、細胞が分泌した多様な構造的・機能的分子の３次元的な組合
わせからなっており、いまだにその特性及び機能が完全には判明しておらず、人工的な製
作は不可能である。細胞外基質は、組織の形状を成しながら、組織の物理的性質、すなわ
ち、伸延力、圧縮強度と弾力性とを決定し、浸透圧、イオンの透過などを調節しながら、
細胞の環境を保持する重要な役割を果たす。

また、多い成長因子とサイトカインとを保有しており、細胞の機能を決定する役割を行
うが、特に、胎児、成長期には、細胞の分化を調節するか、細胞の接着、代謝活動を増減
させながら、組織成長の方向を提示する。

細胞外基質は、膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）のような
タンパク質で組織の物理的性質を決定し、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）
、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）のような糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が、
細胞と細胞外基質とを貼り付ける接着剤のような役割を行い、コンドロイチン硫酸（ｃｈ
ｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）のような多くのタンパク糖（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙ
ｃａｎ）があって、組織の形状と体積とを保持し、組織内で細胞と活発な相互作用を行っ
て、組織や臓器固有の機能を保持し、行うように体積を保持する支持体の役割を果たして
いるが、細胞外基質の成分と構造は、いまだに完全に究明されていない。

本発明は、角膜の血管新生、混濁化、纎維化及び炎症による病理学的変化を抑制または
改善して、眼球表面疾患を予防または治療することができる新規なペプチドを提供するこ
とである。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有
する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有
する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有
する黄斑変性の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有
する黄斑変性の予防または改善用健康食品を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分を含む乾性
眼の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分を含む乾性
眼の予防または改善用健康食品を提供する。

本発明の新規なペプチドは、アルカリ火傷で眼球表面の病理学的変化が誘導された動物
モデルで、角膜混濁、血管新生及び纎維化を減少させ、炎症誘発因子の発現を抑制する効
果を示し、組織変化が誘導された網膜及び脈絡膜で血管新生を効果的に抑制して、黄斑変
性を予防及び改善し、眼球の涙量の減少、角膜表面の不規則性及び結膜杯状細胞の損失の
ような角膜上皮細胞の病理学的変化を抑制または改善すると確認されることによって、そ
れを有効成分として含有する組成物を眼球疾患の予防または治療用薬学組成物及び健康食
品として提供することができる。

合成されたヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの結果報告書である。 ＨＰＬＣを用いてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの純度を分析した結果である。 Ｉｏｎ−Ｍａｓｓを通じてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの分子量を確認した結果である。 アルカリ火傷のウサギの角膜でＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、図４の（Ａ）は、アルカリ火傷後、０、７及び１７日目のウサギの角膜を顕微鏡（ＳＺＸ７、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真であり（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１０ｍｍ）、図４の（Ｂ）は、角膜血管新生の程度を示すグラフであり、図４の（Ｃ）は、角膜混濁化の程度を示すグラフであって、グラフ値は、各実験群（ｎ＝５）の平均±標準偏差を示したものであり、ｔ−テストを通じて^＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ アルカリ火傷群値を有意な値として見た。 アルカリ火傷のウサギの角膜の厚さ変化に対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、図５の（Ａ）は、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した組織切片写真であり（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１ｍｍ）、図５の（Ｂ）は、角膜の厚さを示すグラフである。 アルカリ火傷のウサギで纎維化の変化に対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認するために、眼球線維芽細胞をＭａｓｓｏｎ´ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法で免疫染色し、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）であって、褐色で表われた部分が線維芽細胞である。 アルカリ火傷のウサギで血管新生マーカーに対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、特異的抗体であるＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦで免疫染色された組織切片を仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真である（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝３００μｍ）。 アルカリ火傷のウサギで炎症マーカーに対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、組織切片を大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＭＰ−９のような特異的抗体で免疫染色した後、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真である（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝３００μｍ）。 コラーゲン、ＧＤＲＧＤ（ＣＰＩ）及びヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）が処理されたＨＵＶＥＣ細胞で血管形成の抑制効果を確認した結果である。 レーザ照射１４日後、レーザ照射による組織崩壊及び新生血管の形成の程度を確認した結果である。 動物モデルにレーザ照射後、２、１０及び２０μｇ濃度のコラーゲンまたは２〜２０μｇ濃度のＧＤＲＧＤ（ＣＰＩ）及びヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理して、脈絡膜新生血管の抑制効果を確認した結果である。 動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理して、脈絡膜新生血管の抑制効果を確認した結果である。 動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理し、レーザ照射１４日後、網膜及び脈絡膜からＲＮＡを抽出して、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ及びＭＣＰ−１遺伝子発現レベルを確認したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果である。 動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理し、レーザ照射１４日後、網膜及び脈絡膜抽出物でＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＲ−２（Ｆｌｋ−１）及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２タンパク質の発現レベルを確認したウェスタンブロット結果である。 乾燥ストレスが除去されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに、それぞれ生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理による各マウスの涙量の変化を確認した結果であって、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに３、５、７及び１０日間生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡを眼球に投与した後、マウスの涙量を測定し、平均±標準偏差で定量的結果を示した。^＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＤＳ １０Ｄ群、^＃Ｐ＜０．０５ ｖｓ．生理食塩水群、^§Ｐ＜０．０５ ｖｓ．Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群、^¶Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＣｓＡ処理群、^†Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＤＱＳ処理群、^＆Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＣｓＡ処理群。 Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの角膜表面屈曲性に及ぼす影響を確認した結果であって、図１６の（Ａ）は、乾燥ストレスが除去されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウス（ＤＳ）に３、５、７及び１０日間生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが処理された各グループの眼球イメージ結果（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１ｍｍ）であり、図１６の（Ｂ）は、生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが処理されたマウスの角膜表面滑らかさ点数の変化を確認した結果であって、平均±標準偏差で定量的結果を示した。^＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＤＳ １０Ｄ群、^＃Ｐ＜０．０５ ｖｓ．生理食塩水群、^§Ｐ＜０．０５ ｖｓ．Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群、^¶Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＣｓＡ処理群、^＆Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＣｓＡ処理群。 角膜上皮細胞の剥離に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認した結果であって、図１７の（Ａ）は、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの角膜に生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ投与し、１０日後、角膜上皮細胞の剥離程度を確認したヘマトキシリン＆エオシン染色結果（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）であり、図１７の（Ｂ）は、角膜上皮細胞の剥離程度を平均±標準偏差で表わした定量的結果である（^＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＤＳ １０Ｄグループ）。 結膜杯状細胞の分布に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド影響を確認した結果であって、図１８の（Ａ）は、生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが投与されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの結膜をＰＡＳ染色した結果（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝２００μｍ）であり、図１８の（Ｂ）は、結膜杯状細胞の分布程度を平均±標準偏差で表わした定量的結果である（^＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＤＳ １０Ｄグループ）。 ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの涙腺でＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９発現程度を確認した免疫組織化学の分析結果であって、乾燥ストレスを除去させたマウスに生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡを投与し、１０日後、マウスの涙腺で前記炎症性因子の発現程度を確認した結果である（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。

前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙ ｐｒｏｌｉ
ｎｅ；Ｈｙｄ）であり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（Ｈ
ｙｄｒｏｘｙ ｐｒｏｌｉｎｅ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ）であり得る。

前記ペプチドは、コラーゲンタイプII α１由来であり、前記コラーゲンタイプII α
１は、動物軟骨細胞由来の細胞外基質から分離される。

前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由来軟骨細胞から
分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたものであり、前記動物は
、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これらに限定されるも
のではない。

本発明の「ペプチド」は、一般的に２個以上のα−アミノ酸がペプチド結合で連結され
た形態の化合物であって、構成アミノ酸の数によってジペプチド、トリペプチド、テトラ
ペプチドなどと言い、約１０個以下のペプチド結合があるものをオリゴペプチド、多数の
ペプチド結合からなるものをポリペプチドと言う。

本発明のペプチドは、化学方法（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ．Ｍｉｋｏｓ Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ．）を用いて製造される。例えば、ペプチドは、固相技術（Ｒ
ｏｂｅｒｇｅ ＪＹ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４
）によって合成され、樹脂から切断され、高性能液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒ
ｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ ＮＹ）によって精製されうる。

また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とし
て含有する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

前記眼球表面疾患は、角膜混濁、角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化からなる群か
ら選択される何れか１つであり得る。

本発明の一実施例によれば、アルカリ火傷が誘導された動物モデルは、図４の（Ａ）の
ように、アルカリ火傷後、即時角膜混濁が表われ、アルカリ火傷７日後、角膜血管新生及
び混濁が増加したが、角膜血管新生及び混濁が確認された動物モデルに生理食塩水または
Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドをそれぞれ１０日間処理した結果（アルカリ火傷１
７日後）、図４の（Ｂ）及び図４の（Ｃ）のように、対照群の角膜混濁点数が３．０±０
．０に相当増加した一方、図４の（Ｂ）のように、ペプチドが処理された実験群で混濁化
の減少が表われることを確認することができた。

本発明の他の一実施例によれば、アルカリ火傷によって誘導された角膜の纎維化に及ぼ
すＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ´ｓ ｔ
ｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行った結果、図６のように、アルカリ火傷対照群の場合、アルカ
リ火傷によってストロマ部分に褐色線維芽細胞の形成が増加したことを確認することがで
きたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、線維芽細胞の増
加が抑制されたことを確認することができた。また、Ｈ＆Ｅ染色を行って、アルカリ火傷
による角膜の組織学的変化を確認した結果、図７の上部を参考すれば、アルカリ火傷によ
って角膜に上皮増殖、炎症性細胞侵入、癲癇浮腫及び新生血管の形成が誘導されたことが
確認された。

しかし、前記組織学的変化に対して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理実験
群では、向上した改善効果が表われ、図５の（Ａ）のように、Ｈ＆Ｅ染色結果でも、ペプ
チドが処理された組織で新生血管の形成が有意に改善されたことを確認することができた
。

本発明のさらに他の一実施例によれば、炎症マーカー発現に対する各ペプチドの効果を
確認するために、角膜切片に大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６
及びＭＭＰ−９のような炎症特異的マーカーで免疫染色を行った結果、図８のように、ア
ルカリ火傷は、上皮と上皮下及び増殖性基質で大食細胞の発現を増加させた一方、Ｈｙｐ
−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、大食細胞の発現が効果的に抑制
されたことを確認することができた。また、アルカリ火傷群では、ＴＮＦα、ＩＬ−１β
及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインとＩＣＡＭ−１付着分子の発現増加が確認された
が、ペプチドが処理された実験群では、前記炎症性因子の発現が減少したことを確認する
ことができた。追加的に、アルカリ火傷群の角膜では、ＭＭＰ−９の発現が強く表われた
一方、ペプチドが処理された実験群で、ＭＭＰ−９の発現が抑制されたことを確認するこ
とができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドは、眼球表面疾患は、角膜混濁、
角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化の予防または治療に効果的であることが確認され
た。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基
質（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒ
ｉｘ；ＣＤＥＭ）から分離されたコラーゲンタイプII α１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐ
ｅ II α１）由来であり得る。

より詳細には、前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由
来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたものであ
り、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これら
に限定されるものではない。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロ
キシプロリンであるペプチドであり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬ
ＡＧＰＫであり得る。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、薬学組成物総１００重量
部に対して、０．１〜５０重量部で含有されうる。

前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロッ
プ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であり
得る。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有
する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品を提供することができる。

また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とし
て含有する黄斑変性の予防または治療用薬学組成物を提供することができる。

前記ペプチドは、コラーゲンタイプII α１由来であり得る。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロ
キシプロリンであるペプチドであり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬ
ＡＧＰＫであり得る。

前記ペプチドは、眼球の新生血管の形成を抑制して黄斑変性を予防または治療し、前記
黄斑変性は、老人性黄斑変性であり得るが、これに限定されるものではない。

本発明の一実施例によれば、マウスの眼球内にレーザを照射して損傷を被らせ、１４日
後、眼球を摘出して、Ｈ＆Ｅ染色を行った。

その結果、図１０のように、レーザ照射部位の組織が崩壊されながら、新生血管が形成
されたことを確認することができた。一方、図１１のように、レーザ照射後、コラーゲン
、ＣＰＩ及びＣＰIIをそれぞれ処理した実験群では、いずれも２μｇに処理された時、Ｃ
ＮＶ病変が減少したことを確認することができた。

また、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ実験で最も優れた抗血管形成
能を示したヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）の脈絡膜新生血管の抑制
効果を陽性対照群であるアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）と比較した結果、図１１のように
、ＣＰII処理群の病変サイズが対照群の病変サイズよりも有意に減少し、同じ濃度のアバ
スチンが処理された陽性対照群の病変サイズと類似したレベルであると確認された。

前記結果から、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドは、血管新生によっ
て発病される老人性黄斑変性に優れた治療効果を示すことができる。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、薬学組成物総１００重量
部に対して、０．１〜５０重量部で含有されうる。

前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロッ
プ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であり
得る。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有
する黄斑変性の予防または改善用健康食品を提供することができる。

また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とし
て含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物を提供する。

前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、コラーゲンタイプII α
１由来であるものである。

より詳細には、前記ペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基質（ＣＤＥＭ）から分離され
たペプチドであり、前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨
由来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたもので
あり、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これ
らに限定されるものではない。

前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリンであるペプチドであり、より望
ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫであり得る。

前記ペプチドは、乾燥ストレスによる涙の生成の減少及び角膜表面の不均衡を回復させ
、角膜上皮細胞の剥離及び炎症性因子の生成を抑制することができる。

本発明の一実施例によれば、図１５のように、乾燥ストレスに露出させたマウスの涙量
が正常群（０．２２±０．０１μＬ）よりも約８５．５％減少（ＤＳ １０Ｄ ｇｒｏｕ
ｐ、０．０３±０．０１μＬ、ｐ＜０．０５）したが、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−Ｇ
ＱＤＧＬＡＧＰＫが処理されたマウス群（０．２３±０．０２μＬ）で処理後、１０日目
で涙量が７．９倍（ｐ＜０．０５）増加し、陰性対照群である生理食塩水処理群（０．０
８±０．０１μＬ）よりも約２．８倍（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコラーゲン処
理群（０．１３±０．０２μＬ）よりも涙量が約１．７倍（ｐ＜０．０５）増加したと確
認された。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処置群（０．１３±０．０２μＬ；
０．１６±０．０２μＬ；０．１４±０．０１μＬ）と比較して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡ
ＧＰＫ処理群の涙量は、それぞれ１．７倍（ｐ＜０．０５）、１．４倍（ｐ＜０．０５）
及び１．６倍（ｐ＜０．０５）増加したと確認されることによって、涙量の改善に対する
Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果は、現在販売される乾性眼治療剤よりも効果的である
ことを確認することができた。

前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有され
うる。

前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロッ
プ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であり
得る。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有
する乾性眼の予防または改善用健康食品を提供することができる。

本発明の他の具体例で、前記ペプチドを有効成分として含む眼球表面疾患の予防または
治療用薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤、崩壊剤、甘味剤
、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、香味剤、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤、希釈剤、分散
剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさら
に含みうる。

具体的に、担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソ
ルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカ
シアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、
メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸
メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を
使用し、経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが
含まれ、このような固型製剤は、前記組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例を挙げれ
ば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤す
ることができる。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのよ
うな潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤
、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以
外に、さまざまな賦形剤、例を挙げれば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ
うる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍
結乾燥製剤、座剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール
、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのよう
な注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅ
ｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グ
リセロゼラチンなどが使われる。

本発明の一実施例によれば、前記薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動
脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路
を通じて通常の方式で対象体に投与することができる。

前記ペプチドの望ましい投与量は、対象体の状態及び体重、疾患の種類及び程度、薬物
形態、投与経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択されうる。本発明の
一実施例によれば、これに制限されるものではないが、１日投与量が０．０１〜２００ｍ
ｇ／ｋｇ、具体的には、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１〜１００ｍ
ｇ／ｋｇであり得る。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与するこ
ともでき、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない。

本発明において、前記‘対象体ん’は、ヒトを含む哺乳動物であり得るが、これら例に
限定されるものではない。

また、本発明において、前記健康食品は、本発明のペプチドの以外に、他の食品または
食品添加物と共に使われ、通常の方法によって適切に使われる。有効成分の混合量は、そ
の使用目的、例えば、予防、健康または治療的処置によって適するように決定されうる。

前記健康食品に含有された化合物の有効容量は、前記治療剤の有効容量に準して使用す
ることができるが、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の
摂取の場合には、前記範囲以下であり、有効成分は、安全性面で何の問題がないために、
前記範囲以上の量でも使われうるということは確実である。

前記健康食品の種類には、特別な制限がなく、例としては、肉類、ソーセージ、パン、
チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガ
ム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲み物、お茶、ドリンク剤、ア
ルコール飲料及びビタミン複合剤などが挙げられる。

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実
施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定され
るものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供さ
れるものである。

＜実験例１＞眼球表面疾患の動物モデルの製作
目と視力研究のための動物実験は、大韓民国の仁済医科大学及びＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅ
ｍｅｎｔから承認された動物実験指針書によって行われた（Ｎｏ．；２０１４−０２８）
。

２．０〜２．５ｋｇのニュージーランドの白ウサギ２６匹をＳａｍｔａｋｏ（Ｏｓａｎ
，Ｋｏｒｅａ）から購入し、ケタミン塩酸塩（３０ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ
、Ｈｕｏｎｓ，Ｊｅｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）及びキシラジン塩酸塩（２．５ｍｇ／ｋｇ
、Ｂａｙｅｒ Ｋｏｒｅａ Ｌｔｄ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）混合物を筋肉に注射し
て、全身麻酔し、アルカリプロパラカイン（Ａｌｃａｉｎｅ ｐｒｏｐｒａｃａｉｎｅ）
点眼液（Ａｌｃｏｎ Ｉｎｃ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を用いて局所麻酔した。

次いで、１Ｎ ＮａＯＨを濡らした８ｍｍフィルター紙をウサギの右側の角膜中心に１
分間露出させて、アルカリ火傷モデルを製作し、火傷７日後、アルカリ火傷による角膜血
管新生及び角膜混濁の増加を確認した。

前記ウサギをランダムにアルカリ火傷群（ｎ＝５）及びペプチド処理群（ｎ＝５）に分
けた。アルカリ火傷群は、生理食塩水を毎日４回投与し、ペプチド処理群には、Ｈｙｐ−
ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド１０ｍｇ／ｍＬを毎日４回投与し、左目を対照群として使用
した。

前記方法で、それぞれの処理物質を１０日間投与した後、Ｈ＆Ｅ染色、Ｍａｓｓｏｎ´
ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色及び免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）を行って、纎維化、血管新生、炎症及び角膜構造の変化などを確認した。

＜実験例2＞角膜血管新生及び混濁化の確認

角膜血管新生及び混濁化に対する臨床評価を行った。

角膜血管新生の程度を０点から３点まで評価した。血管新生が表われていない場合、０
点、角膜周辺部の血管新生が確認される場合、１点、瞳の縁部まで血管新生が拡張された
場合、２点、及び瞳の縁部を越えて角膜中心まで血管新生が拡張された場合、３点と評価
し、角膜血管新生の評価時に、相当な混濁及び幅広い瞼球癒着が形成されて、角膜血管新
生の程度を評価しにくい場合、３点と評価した。

また、角膜混濁の程度を０点から３点まで評価した。虹彩部分が鮮かに見える透明な角
膜の場合、０点、虹彩部分に部分的な混濁が確認される場合、１点、瞳の縁部と虹彩部分
とが弱く見える時、２点、虹彩及び瞳の部分が完全に混濁化された場合、３点と評価した
。

＜実験例3＞Ｍａｓｓｏｎ´ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色

眼球を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させた後、洗浄し、パラフィンが打ち込ま
れた組織切片（６μｍ）で製作する時まで７０％アルコールに貯蔵した。コラーゲン纎維
化及び纎維化の等級程度を視覚化するために、切片にＭａｓｓｏｎｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍ
ｅ染色を行い、仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍ
ｅｒ ２．０ ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で切片のイメージを撮影した。

＜実験例4＞組織学的分析のための化学染色

組織学的分析のために、眼球を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させた後、ｏｐｔ
ｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＣＴ；Ｔｉ
ｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，
Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に打ち込み、液体窒素に冷凍させた。

試料を４％ホルムアルデヒドに２４時間固定させ、乾燥させた後、パラフィンワックス
に打ち込んだ。次いで、８μｍ厚さの組織切片で準備した後、ヘマトキシリン／エオシン
（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、切片のイメージを仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌ ｍｉｃｒｏｓｃ
ｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮
影した。

＜実験例5＞免疫組織化学的分析

組織切片を６μｍ厚さに切断して免疫組織化学分析に使用した。

まず、組織切片を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させ、０．１％トリトンＸ−１
００、不活性化された２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｓｉｇｍａ、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を透過させ、抗ＣＤ３１（１：１，０００；Ａｂｃａｍ Ｉｎ
ｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、抗ｂＦＧＦ（１：１，０００；Ｂｉｏｓｓ Ｉｎｃ
．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、抗ＩＬ−１β、抗ＩＬ−６（１：１，０００；Ｃｌｏｕｄ−
Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、抗ＭＭＰ−９、抗ＩＣＭＡ−１、抗
ＴＮＦα、抗大食細胞／単核（１：１，０００；Ａｂｎｏｖａ Ｃｒｏｐ．，Ｔａｉｐｅ
ｉ，Ｔａｉｗａｎ）及び抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
）１次抗体で４℃で一晩インキュベーションした。

次いで、切片に２次抗体を４５分間インキュベーションし、ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉ
ｄｉｎｅ（ＤＡＢ）ｃｈｒｏｍｏｇｅｎで免疫学的反応を視覚化し、切片を室温で３０秒
間Ｍａｙｅｒ´ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。

前記方法で染色された切片を仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；Ｎ
ａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。

＜実験例6＞Ｔｕｂｉｎｇ ａｓｓａｙ

ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの抗血管形成の効果をヒト血管内皮細胞（Ｈ
ＵＶＥＣ）を利用したＴｕｂｉｎｇ ａｓｓａｙを行って、確認した。

ＨＵＶＥＣ細胞をｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した後、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ
）がコーティングされた４８ウェルプレートに分周し、５０ｎｇ／ｍｌ濃度の組換えヒト
ＶＥＧＦと共にコラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIを濃度別に処理し、３７℃インキュベータ
ーで４時間放置した後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で管（Ｔｕｂｅ）形成を観察し、管長
さは、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）で分析した。

＜実験例7＞実験動物及び脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）モデルの製作

Ｃ５７ＢＬ／６マウスをオリエントバイオから購入し、本動物実験は、目と視力研究の
ための動物使用に対して大韓民国の仁済医科大学（Ｎｏ，２０１３−０５３）とＡＲＶＯ
に承認された指針によって行われた。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにダイオードグリー
ンレーザ（ｄｉｏｄｅ ｇｒｅｅｎ ｌａｓｅｒ；５３２ｎｍ、１５０ｍＷ、０．１ｓｅ
ｃ、５０μｍ、ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒ）を用いて網膜視神経部位に損傷を与え
た。レーザ（Ｌａｓｅｒ）照射直後、ＣＰI、ＣＰII及び陽性対照群アバスチンをＰＢＳ
に溶解して、一日に５ｍｇずつ５日間眼球内に投与した。各実験群は、それぞれ５匹ずつ
マウスの両目を用いて、前記実験を進行した。

＜実験例8＞組織学的分析

レーザによる組織変化を観察するために、マウス眼球を摘出して、１０％ホルマリンで
固定させ、ＯＣＴ混合物に深く打ち込んだ。

前記方法で処理された８μｍ組織試料をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し
、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ
）を用いて撮影及び分析した。

＜実験例9＞網膜−脈絡膜フラットマウント（Ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔ）

レーザ照射１４日後、網膜−脈絡膜フラットマウンドを行って、ＣＰIIのＣＮＶ病変サ
イズの抑制効果を確認した。マウスを麻酔させ、２５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラ
ン（ｄｅｘｔｒａｎ）をｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌで１００ｍｌ注射した。３０分後、
マウスを安楽死し、眼球を摘出して、１０％ホルマリンで固定した後、角膜と水晶体とを
除去し、カバーガラスにフラットマウントした。ＦＩＴＣ−デキストランによって染色さ
れた新生血管は、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を通じて観察し、その病変サイズをＩｍａｇ
ｅ Ｊ ｐｒｏｇｒａｍを通じて測定した。

＜実験例１0＞定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析

ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの新生血管関連遺伝子発現の抑制効果を確認
するために、摘出されたマウス眼球の網膜と脈絡膜混合物とからＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ
ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写
酵素とを用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ産物は、表１の特異的プライマーセット（
コスモジンテック，Ｋｏｒｅａ）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ２Ｘ ＰｒｅＭｉ
ｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて増幅させ、行われたＰＣＲ条件としては、試料を９
５℃で１０分間培養した後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒及び７２℃で１５秒間進行
して、４０ＰＣＲサイクルを行った。相対定量化を２−（ＤＤＣＴ）方法（Ｌｉｖａｋ
ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１；ＤＤＣＴ＝（ＣＴ，ｔａｒｇｅｔ−ＣＴ，ａ
ｃｔｉｎ）処理区（ＣＴ，ｔａｒｇｅｔ−ＣＴ，ａｃｔｉｎ）対照区）で計算した。

＜実験例１1＞ウェスタンブロット

マウスの網膜と脈絡膜混合物とをプロテアーゼ抑制カクテル及びホスファターゼ抑制カ
クテルが含まれたＰｒｏ−ＰＲＥＰ ｂｕｆｆｅｒ（ｉＮｔＲＯＮ）で溶解した後、タン
パク質を抽出した。

抽出されたタンパク質は、ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量
した後、ＳＤＳ ｇｅｌ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと混合して、１００℃で５分間
沸かして変性させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動されたタンパク質は、ニトロセル
ロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移され、次いで、非特異的タンパク質結合を遮断する
ために、膜を５％脱脂乳で１時間放置した後、１次抗体でＶＥＧＦ、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ
−１、Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ−２及びβ−ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を処理して、一般的な免疫ブロットを行った。次いで、ＥＣＬｋ
ｉｔ（Ａｄｖａｎｓｔａ）及びｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｌ ＤＯＣ ｓｙｓｔｅｍで免疫
反応性タンパク質を検出した。

＜実験例１2＞実験動物及び乾性眼モデルの製作

ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２^ｂマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈ
ａｒｂｏｒ、ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。動物実験は、目と視力研究のための動物使用
に対して大韓民国の仁済医科大学（Ｎｏ．；２０１４−０２９）とＡＲＶＯに承認された
指針によって行われた。１２〜１６週齢のＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２^ｂマウスに乾燥ストレス
で一日１８時間４０〜５０％の周囲湿度とファンとを利用した通風に露出させ、皮下に０
．５ｍｇ／０．２ｍＬムスカリン受容体遮断剤を注射した。また、１０日間、午前９時、
午後１２時、午後３時及び午後６時の一日４回スコポラミン臭化水素酸（ｓｃｏｐｏｌａ
ｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，ＭＯ）をマウスの尻側に交互に注射した。前記方法で処理されたマウスを１０日後、安
楽死させ、実験期間の間の動物の行動と食べ物及び水の摂取とを制限しなかった。

眼球乾燥ストレス１０日後、スコポラミン注射を中断し、一般湿度と温度環境に転換し
、乾燥ストレス除去した後、１０ｍｇ／ｍｌ Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫとコラーゲン
は、生理食塩水（ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）に溶解して、５μＬずつ一日に５回１０
日間眼球に投与し、生理食塩水及び０．１％ＨＡは、一日に５回１０日間眼球に投与した
。６つの実験群は、それぞれ３匹ずつマウスの両目を用いて、前記実験を進行し、あらゆ
る実験は、繰り返して進められた。

＜実験例１3＞涙量の確認

涙の生成をフェノールレッド−浸潤綿スレッド（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ−ｉｍｐｒｅｇ
ｎａｔｅｄ ｃｏｔｔｏｎ ｔｈｒｅａｄｓ；Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ；Ｏａｓｉｓ、Ｇｌ
ｅｎｄｏｒａ、ＣＡ）を用いて報告された方法（Ｖｉｌｌａｒｅａｌ ＡＬ，Ｆａｒｌｅ
ｙ Ｗ，Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒ ＳＣ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｏｐｉｃａｌ ｏｐｈ
ｔｈａｌｍｉｃ ｅｐｉｎａｓｔｉｎｅ ａｎｄ ｏｌｏｐａｔａｄｉｎｅ ｏｎ ｔｅ
ａｒ ｖｏｌｕｍｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｅｙｅ Ｃｏｎｔａｃｔ Ｌｅｎｓ．２００６；
３２（６）：２７２−２７６．）で測定した。涙量は、医療用ピンセットを用いてスレッ
ドを２０秒間側面眼角に位置させ、涙に濡れて赤色に変わったスレッドを顕微鏡（ＳＺＸ
７；Ｏｌｙｍｐｕｓ ｃｏｒｐ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察して、ｍｍで表示した
。前記測定されたｍｍ内の涙液を２０秒間マウスの涙量と予想される容量の塩基性溶液（
０．９％塩分１５００ｍＬと５ｍＬの５Ｎ ＮａＯＨ）を濡らした綿スレッドで表わした
標準曲線と比較した。

＜実験例１4＞角膜表面の屈曲性の評価

角膜表面の屈曲性は、動物を麻酔後、実体顕微鏡（ＳＺＸ７；Ｏｌｙｍｐｕｓ）の光繊
維リング照明から白リングの反射イメージを得た。角膜の滑らかさをデジタルイメージの
白リングに反射された角膜上皮細胞の不規則性を等級化して評価した。角膜不規則性の深
刻度点数は、反射リングを４等分に分けて不規則性程度によって５等級で計算した。不規
則性ないは０等級、１／４等分の不規則性を１等級；２／４等分の不規則性は２等級；３
／４等分の不規則性を３等級；いずれも不規則な程度を４等級；深刻な程度を５等級にし
てあらゆるリングを確認した。

＜実施例１＞タンパク質分析及びペプチド合成

Ｂａｅｋ´ｓ ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａ
ｓｓ Ｓｅｐｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｄｉａｔｅｃｈ Ｋｏｒｅａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓ
ｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で動物軟骨細胞由来の細胞外基質のタンパク質分析を行った。

前記タンパク質分析を通じてコラーゲンタイプII α１タンパク質のアミノ酸配列の一
部に該当するヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ；
配列番号１）を得て、前記ペプチドを、図１のように（株）バイオセルトラン（ＢＩＯＣ
ＥＬＴＲＡＮ；Ｃｈｕｎｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で合成した。

ＨＰＬＣを行って、前記合成されたヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの純度を
確認した結果、図２のように、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが純度
９９．３％に合成されたことを確認することができた。

また、Ｉｏｎ−Ｍａｓｓを通じてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの
分子量を確認した結果であって、図３のように、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰ
Ｋペプチドの分子量が６５４．９９であると確認された。

＜実施例２＞ペプチドによる角膜血管新生及び混濁化の変化確認

角膜アルカリ火傷７日後、角膜血管新生及び混濁化に対する臨床評価を行った。

その結果、図４の（Ａ）のように、アルカリ火傷後、即時角膜混濁が表われ、アルカリ
火傷７日後、角膜血管新生及び混濁が増加したことを確認することができた。

角膜血管新生及び混濁が確認された後、生理食塩水またはＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ
ペプチドをそれぞれ１０日間処理した結果（アルカリ火傷１７日後）、図４の（Ｂ）及び
図４の（Ｃ）のように、対照群の角膜混濁点数が３．０であって、相当増加し、血管新生
点数は２．８であって、新生血管が瞳の縁部を越えて角膜中心まで拡張されたことを確認
することができた。

一方、図４の（Ｂ）のように、ペプチドが処理された実験群で混濁化の減少効果が表わ
れることを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、角膜混濁化の阻害に効果的で
あることが確認された。

＜実施例３＞ペプチドによる角膜の厚さの変化確認

仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０
ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影したＨ＆Ｅ染色切片の角膜の厚さをＮ
ＤＰ ｖｉｅｗプログラム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，ＵＳＡ）を用いて分析した。

その結果、図５の（Ｂ）のように、アルカリ火傷後、角膜の厚さが正常範囲である５２
６．６μｍから９６０．６μｍに増加したことを確認することができた。

しかし、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド処理１０日後、ペプチドが処理された実
験群では、角膜の厚さが５５０．０μｍ（ｐ＜０．０５）であって、アルカリ火傷群より
も減少したことを確認することができた。

＜実施例４＞ペプチドの角膜纎維化の抑制効果確認

アルカリ火傷によって誘導された角膜の纎維化に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペ
プチドの影響を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ´ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行った。

その結果、図６のように、アルカリ火傷対照群の場合、アルカリ火傷によってストロマ
部分に褐色線維芽細胞の形成が増加したことが確認されたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰ
Ｋペプチドが処理された実験群では、線維芽細胞の増加が抑制されたことを確認すること
ができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが線維芽細胞の増加を阻害するこ
とにより、角膜纎維化の抑制に効果的であることが確認された。

＜実施例５＞ペプチドの角膜血管新生の抑制効果確認

Ｈ＆Ｅ染色を行って、アルカリ火傷による角膜の組織学的変化を確認した。

その結果、図７の上部を参考すれば、アルカリ火傷によって角膜に上皮増殖、炎症性細
胞侵入、癲癇浮腫及び新生血管の形成が誘導されたことが確認された。

しかし、前記組織学的変化に対して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、処理実
験群では向上した改善効果が表われ、図５の（Ａ）のように、Ｈ＆Ｅ染色結果でも、ペプ
チドが処理された組織で新生血管の形成が有意に改善されたことを確認することができた
。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、新生血管の形成に影響を及ぼ
すと確認されることによって、アルカリ火傷を負わせた角膜でＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰ
Ｋペプチド処理し、角膜血管新生の特異的マーカーであるＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦ
を用いて、角膜切片に免疫染色を行った。

その結果、図７のように、ＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦ血管新生マーカーが、アルカ
リ火傷による纎維化基質細胞で強く発現されることを確認することができた。

しかし、ペプチドが処理された実験群では、上皮、上皮下及び基質でＣＤ３１、ＦＧＦ
及びＶＥＧＦの有意な減少を確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、角膜血管新生の阻害に効果的
であることが確認された。

＜実施例６＞ペプチドの抗炎症の効果確認

前記Ｈ＆Ｅ染色遂行結果、アルカリ火傷によって炎症細胞が角膜に侵透したことを確認
することができた。したがって、炎症マーカー発現に対する各ペプチドの効果を確認する
ために、角膜切片に大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＭ
Ｐ−９のような炎症特異的マーカーで免疫染色を行った。

その結果、図８のように、アルカリ火傷は、上皮と上皮下及び増殖性基質で大食細胞の
発現を増加させた一方、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、
大食細胞の発現が効果的に抑制されたことを確認することができた。また、アルカリ火傷
群では、ＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインとＩＣＡＭ−１付
着分子の発現増加が確認されたが、ペプチドが処理された実験群では、前記炎症性因子の
発現が減少したことを確認することができた。追加的に、アルカリ火傷群の角膜では、Ｍ
ＭＰ−９の発現が強く表われた一方、ペプチドが処理された実験群で、ＭＭＰ−９の発現
が抑制されたことを確認することができた。

＜実施例７＞ペプチドの血管形成の抑制効果確認

ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を利用したＴｕｂｉｎｇ ａｓｓａｙを行って、ヒド
ロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの抗血管形成の効果を確認した。

その結果、図９のように、ＶＥＧＦ処理群では、ＶＥＧＦ非処理群よりも管形成（Ｔｕ
ｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が約１．５倍以上増加した一方、コラーゲン、ＣＰＩ及びＣ
ＰIIが処理された実験群では、いずれも有意的に血管形成が抑制された。特に、ＣＰIIは
、濃度依存的に管形成を抑制し、ＶＥＧＦ非処理群の血管形成の程度とほぼ同様に減少し
たと表われた。また、年齢関連黄斑変性治療剤であるアバスチン処理群とも、類似したレ
ベルに確認された。

＜実施例８＞ペプチドの脈絡膜新生血管の抑制効果確認

実験例7のような方法でマウス眼球にレーザを照射し、レーザ照射１４日後、眼球を摘
出して、Ｈ＆Ｅ染色を行った。

その結果、図１０のように、レーザ照射部位の組織が崩壊されながら、新生血管が形成
されたことを確認することができた。一方、図３のように、コラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰ
IIをそれぞれ眼球内注射で５日間処理した実験群では、いずれも２μｇに処理された時、
ＣＮＶ病変が減少したことを確認することができた。

また、前記実験で確認したように、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
実験で最も優れた抗血管形成能を示したヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰ
II）の脈絡膜新生血管の抑制効果を陽性対照群であるアバスチンと比較するために、レー
ザ照射直後からＣＰII及びアバスチンをそれぞれ５μｇずつ５日間連続して眼球内注射し
、レーザ照射１４日後、眼球を摘出した後、血管をＦＩＴＣ−デキストランで染色した後
、フラットマウンド実験を行って、ＣＮＶ病変サイズを測定した。

その結果、図１１のように、ＣＰII処理群の病変サイズが対照群の病変サイズよりも有
意に減少し、同じ濃度のアバスチンが処理された陽性対照群の病変サイズと類似したレベ
ルであると確認された。

＜実施例９＞ペプチドの新生血管関連遺伝子及びタンパク質の抑制効果確認

マウスにレーザ照射１４日後、網膜と脈絡膜とからＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲ
Ｔ−ＰＣＲで遺伝子発現を分析した。

その結果、図１２のように、代表的な新生血管関連遺伝子であるＶＥＧＦが、レーザ処
理群では５５倍程度発現が増加したが、アバスチン処理群及びＣＰII処理群では、レーザ
非処理群と類似しているレベルに減少したことを確認することができた。

一方、ＩＣＡＭ及びＭＣＰ−１遺伝子は、レーザ処理群でそれぞれ約３００倍及び１０
倍の発現増加が確認されたが、これも、ＣＰII処理群では、有意的に減少したことを確認
することができた。

また、新生血管関連タンパク質マーカーの発現において、ＣＰIIの効果を評価するため
に、レーザ照射１４日後、網膜と脈絡膜とからタンパク質を抽出して、ＶＥＧＦ、ＶＥＧ
ＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＲ−２（Ｆｌｋ−１）及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ
２の免疫ブロッティングを行った。

その結果、図１３のように、レーザ照射によって新生血管形成促進因子であるＡｎｇｉ
ｏｐｏｉｅｔｉｎ２とＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２との発現が著しく増加したことを
確認することができ、特に、新生血管の形成に最も重要な役割を果たすと知られたＶＥＧ
Ｆの発現が著しく増加した。しかし、ＣＰIIが処理された実験群では、前記タンパク質の
発現が著しく減少し、年齢関連黄斑変性治療剤アバスチンとほぼ類似したレベルを示した
。

＜実施例１０＞涙の生成の効果確認

涙の生成程度をフェノールレッド−浸潤綿スレッドで測定した。

その結果、図１５のように、乾燥ストレスは、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２^ｂマウスの涙量を
正常群（０．２２±０．０１μＬ）と比較して、約８５．５％有意なレベルに減少したこ
とを確認することができた（ＤＳ １０Ｄ ｇｒｏｕｐ、０．０３±０．０１μＬ、ｐ＜
０．０５）。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（０．２３
±０．０２μＬ）は、処理１０日目で涙量が７．９倍（ｐ＜０．０５）増加し、陰性対照
群であるｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ処理群（０．０８±０．０１μＬ）と比較して、約
２．８倍（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコラーゲン処理群（０．１３±０．０２μ
Ｌ）と比較して、涙量が約１．７倍（ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができ
た。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ；０．１３±０．０
２μＬ）、ＤＱＳ（Ｄｉｑｕａｓ；０．１６±０．０２μＬ）及びＨＡ（Ｈｙａｌｕｎｉ
；０．１４±０．０１μＬ）と比較して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群の涙量は、
それぞれ１．７倍（ｐ＜０．０５）、１．４倍（ｐ＜０．０５）及び１．６倍（Ｐ＜０．
０５）増加したと表われた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫは、現在販売される乾性眼治療剤よりも高
いレベルに減少した涙量を回復させると確認された。

＜実施例１１＞角膜表面の屈曲性確認

各実験群の角膜表面の屈曲程度を数値化して、角膜表面の屈曲性を確認した。

その結果、図１６のように、正常角膜（０．３３±０．５８点）と比較して、１０日間
乾燥ストレスに露出されたマウスの角膜表面の屈曲程度は、約１３倍（４．３３±０．５
８点；ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができた。一方、乾燥ストレス除去後
、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（２．０±０点）１０日目で角膜表面の屈曲性が５
３．８％（ｐ＜０．０５）有意的に減少し、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎ
ｅ処理群（３．３３±１．５３点）よりは４０％（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコ
ラーゲン処理群（３．６７±１．１６点）よりは４５．５％（ｐ＜０．０５）が減少した
ことを確認することができた。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（３．３３±０．５８点；３
．０±１．０点；３．０±０ 点）と比較して、それぞれ４０％（ｐ＜０．０５）、３３
．３％（ｐ＜０．０５）及び３３．３％（ｐ＜０．０５）に角膜表面の屈曲程度が減少し
たことを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫは、乾性眼治療剤よりも角膜表面の屈曲性
の改善に効果的であると確認された。

＜実施例１２＞角膜上皮細胞の剥離抑制効果確認

角膜上皮細胞の剥離に及ぼすペプチドの影響を確認するために、各実験群マウスの角膜
をＨ＆Ｅ染色した。

その結果、図１７のように、乾燥ストレスによって角膜の上皮細胞の剥離が２４倍増加
した（２．２９±０．５７／０．１ｍｍ^２、ｐ＜０．０５）。一方、乾燥ストレス除去後
、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（０．３８±０．１７／０．１ｍｍ^２）で角膜の上
皮細胞の剥離が８３．３％（ｐ＜０．０５）減少した。また、陰性対照群であるｎｏｒｍ
ａｌ ｓａｌｉｎｅ処理群（１．３３±０．１７／０．１ｍｍ^２）と比較して、７１．４
％（ｐ＜０．０５）角膜上皮細胞の剥離が減少し、陽性対照群であるコラーゲン処理群（
０．８６±０．２９／０．１ｍｍ^２）よりは、５５．６％（ｐ＜０．０５）角膜上皮細胞
の剥離が減少した。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（１．５２±０．３３／０．
１ｍｍ^２；０．０９５±０．１７／０．１ｍｍ^２；１．７１±０／０．１ｍｍ^２）と比較
して、それぞれ７５％（ｐ＜０．０５）、６０％（ｐ＜０．０５）及び７７．８％（ｐ＜
０．０５）有意的に減少したことを確認することができた。

前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが、乾性眼治療剤よりも角膜上皮細胞の剥
離の減少に効果的であると確認された。

＜実施例１３＞結膜杯状細胞の分布に及ぼす影響確認

乾性眼マウスモデルを対象にして点眼による結膜杯状細胞の分布を観察した。

その結果、図１８のように、乾燥ストレスは、正常結膜（１４．３８±０．４４／０．
１ｍｍ^２）と比較して、５８．２％（６．０２±０．２９／０．１ｍｍ^２、ｐ＜０．０５
）杯状細胞を減少させた。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理
群（１３．９±０．８３／０．１ｍｍ^２）では、減少した杯状細胞が２．３倍（ｐ＜０．
０５）回復され、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ処理群（５．４３±０．
２９／０．１ｍｍ^２）と比較して、２．６倍（ｐ＜０．０５）増加し、陽性対照群である
ｃｏｌｌａｇｅｎ処理群（１１．０５±０．３３／０．１ｍｍ^２）と比較して、１．３倍
（ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができた。

また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（１１．１４±０．７６／０
．１ｍｍ^２；８．８６±０．２９／０．１ｍｍ^２；８．６７±０．１７／０．１ｍｍ^２）
と比較して、それぞれ１．２倍（ｐ＜０．０５）、１．５倍（ｐ＜０．０５）及び１．６
倍（ｐ＜０．０５）有意に杯状細胞が回復されたことを確認することができた。

前記結果から、結膜の杯状細胞の分布は、ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ処理を除いた残
りの処理群でも結膜の杯状細胞の分布が改善されると表われたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡ
ＧＰＫが処理された動物の角膜で著しく増加したことを確認することができた。

＜実施例１４＞乾性眼マウスモデルで抗炎症の効果確認

乾性眼マウスモデルを対象にして炎症反応因子の発現において、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡ
ＧＰＫの効果を評価するために、涙腺でＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭ
Ｐ−２及びＭＭＰ−９の免疫染色を行った。

その結果、図１９のように、乾燥ストレスによって涙腺で炎症性サイトカインであるＴ
ＮＦ−αと付着分子であるＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１の発現が著しく増加したことを確
認することができ、乾燥ストレスによって涙腺のＭＭＰ−２とＭＭＰ−９も、顕著に増加
した。しかし、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが処理されたマウスモデルの涙腺では、炎症
関連因子の発現が著しく減少したことを確認することができ、乾性眼治療剤であるＣｓＡ
、ＤＱＳ及びＨＡが処理されたマウスモデルよりも、顕著に抑制されたことを確認するこ
とができた。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このよう
な具体的な記述は、単に望ましい実施態様であり、これにより、本発明の範囲が制限され
るものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、下記の特
許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。

Claims (6)

1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
2. 前記ペプチドは、コラーゲンタイプＩＩ α１由来であることを特徴とする請求項１に記載の黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
3. 前記ペプチドは、眼球の新生血管の形成を抑制することを特徴とする請求項１に記載の黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
4. 前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項１に記載の黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
5. 前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であることを特徴とする請求項１に記載の黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
6. 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または改善用健康食品。