JP6647405B2

JP6647405B2 - Ｄ−タガトース転換活性が高められたヘキスロン酸ｃ４−エピメラーゼ変異体及びこれを用いたｄ−タガトースの製造方法

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Publication number: JP6647405B2
Application number: JP2018529992A
Authority: JP
Inventors: ヤン，ソンジェ; イ，ヨンミ; パク，イルヒャン; イ，チャンヒョン; チョ，ヒョングク; キム，ソンボ; キム，ヤンヒ; パク，スンウォン
Original assignee: シージェイチェルジェダンコーポレイション
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2037-07-31
Also published as: JP2018536422A; WO2018021893A1; KR20180013815A; US20210147824A1; KR20180013812A; CN108368498B; EP3492589A1; JP2019507601A; JP2018526011A; WO2018021895A1; CN108884454B; KR101905469B1; EP3492588A1; EP3492587A1; KR101946157B1; EP3492589A4; EP3333261A4; EP3333261C0; KR101955103B1; HK1257779A1

Description

本発明は、Ｄ−タガトース転換活性が高められたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、及びこれを用いたＤ−タガトースの製造方法に関する。

タガトースは、牛乳、チーズ、カカオなどの食品、リンゴやミカンなどの甘味の天然果実に少量だけ存在する天然甘味料であり、カロリーは砂糖の１／３程度の１．５ｋｃａｌ／ｇであり、ＧＩ（Ｇｌｙｃｅｍｉｃｉｎｄｅｘ、血糖指数）は３であって砂糖の５％水準であるにもかかわらず、砂糖と同様の甘さを有し、様々な健康機能性がある。そのため、様々な製品に活用した場合、健康と味を同時に満足させる代替甘味料として利用できる。

従来知られているタガトースの製造方法は、ガラクトースを主原料とする化学的方法（触媒反応）と生物学的方法（異性化酵素反応）がある（韓国公開特許第２００９−００８２７７４号を参照）。しかし、前記製造方法においてガラクトースの基礎原料となる乳糖は、国際市場で原乳と乳糖の生産量、需要と供給量などによって価格が不安定であり、タガトース生産における原料の安定的な需給には限界がある。したがって、通常の一般的な糖（砂糖、ブドウ糖、フルクトースなど）を原料としてタガトースが製造できる新たな方法が必要である。そこで、本発明者らは、新たなヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼを利用し、フルクトースからタガトースを製造する方法を報告したが（大韓民国公開特許第１０−２０１４−０１４３１０９号）、産業的生産のためにはタガトース転換活性がもっと高い酵素の開発が必要である。

このような背景下で、本発明者らはヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼの特定箇所のアミノ酸を変異させ、フルクトースからタガトースへの転換活性が野生型に比べて著しく増加したことを確認し、本発明を完成した。

本明細書において、多数の特許及び他の文献が参照され、その引用が括弧で表示される。本発明及び本発明が属する技術分野の水準をより明確に説明するため、これらの特許および他の文献に開示の内容は、その全体が本明細書に参照として含まれる。

本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基が変異した、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。

本発明の他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基が変異した、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。

本発明の更に他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基が変異した、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。

本発明の更に他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から７７番のロイシン（Ｌ）のアミノ酸残基が変異した、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。

本発明の更に他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基が変異した、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。

本発明の更に他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から３５１番プロリン（Ｐ）のアミノ酸残基が変異した、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。

本発明の更に他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、および１７５番グルタミン酸（Ｅ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。

本発明の更に他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）、１４９番グルタミン（Ｑ）と２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供することである。

本発明の更に他の目的は、本発明に開示されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体をコードする核酸、前記核酸を含む形質転換体、本発明の変異体を発現する微生物またはその培養物、または本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含むＤ−タガトース生産用の組成物を提供することである。

本発明の更に他の目的は、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、本発明の形質転換体、本発明の変異体を発現する微生物またはその培養物、または本明細書のタガトース生産用の組成物と、Ｄ−フロックトス（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を接触させることを含む、Ｄ−タガトースの製造方法を提供することである。

以下、本発明に関してより詳細に説明する。本発明の他の目的および利点は、添付した特許請求の範囲及び詳細な説明によってもっと明確になる。本明細書に記載のない内容は、本発明の技術分野または類似分野における熟練者なら十分に認識と類推できるため、その説明を省略する。

本発明の目的を達成するために本発明の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から９番ヒスチジン（Ｈ）、２１番チロシン（Ｙ）、６０番グルタミン酸（Ｅ）、６２番バリン（Ｖ）、６８番グルタミン酸（Ｅ）、７７番ロイシン（Ｌ）、９１番ロイシン（Ｌ）、９７番スレオニン（Ｔ）、１２５番セリン（Ｓ）、１２６番バリン（Ｖ）、１４０番ロイシン（Ｌ）、１４１番アスパラギン酸（Ｄ）、１４５番トリプトファン（Ｗ）、１４９番グルタミン（Ｑ）、１５７番グリシン（Ｇ）、１５８番アラニン（Ａ）、１６０番アラニン（Ａ）、１６３番バリン（Ｖ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６６番プロリン（Ｐ）、１６７番グルタミン酸（Ｅ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、１７５番グルタミン酸（Ｅ）、１７６番グリシン（Ｇ）、１７７番フェニルアラニン（Ｆ）、１８５番セリン（Ｓ）、２０２番メチオニン（Ｍ）、２１８番グリシン（Ｇ）、２２１番チロシン（Ｙ）、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）、２４１番バリン（Ｖ）、２４２番チロシン（Ｙ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、２７６番スレオニン（Ｔ）、２８４番バリン（Ｖ）、２９５番フェニルアラニン（Ｆ）、２９７番フェニルアラニン（Ｆ）、３０２番フェニルアラニン（Ｆ）、３０６番トリプトファン（Ｗ）、３１６番ロイシン（Ｌ）、３３７番リシン（Ｋ）、３５１番プロリン（Ｐ）、３６１番フェニルアラニン（Ｆ）、３６６番アラニン（Ａ）、３８６番アルギニン（Ｒ）、３８８番イソロイシン（Ｉ）、４０２番セリン（Ｓ）、４０３番チロシン（Ｙ）、４１５番バリン（Ｖ）、４２９番アスパラギン酸（Ｄ）、４４０番チロシン（Ｙ）及び４４１番グリシン（Ｇ）からなる群より選択される一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する［下記表２〜表１０を参照］。

本発明の他の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する。

前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはトリプトファン（Ｗ）で、より具体的にはフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、またはチロシン（Ｙ）で置換される。前記一実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）またはバリン（Ｖ）で置換され、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、及び１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）、３０６番トリプトファン（Ｗ）、および３８６番アルギニン（Ｒ）からなる群より選択される一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１８５番セリン（Ｓ）は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）で置換され；前記２６７番バリン（Ｖ）はメチオニン（Ｍ）で置換され；前記２６８番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され；前記２７２番スレオニン（Ｔ）は、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）で置換され；前記３０６番トリプトファン（Ｗ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換され；前記３８６番アルギニン（Ｒ）は、プロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換される。

前記一実施例の一例において本発明は、前記４０３番チロシン（Ｙ）及び１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の変異の他に、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）、及び前記３８６番アルギニン（Ｒ）のいずれか一か所が変異した変異体を提供する。例えば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）の残基がリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはグルタミン（Ｑ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２７２番スレオニン（Ｔ）はアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記３８６番アルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。

前記一実施例の他の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）及び１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、さらに前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）、及び前記３８６番アルギニン（Ｒ）の中から選択されたいずれか２カ所が置換された変異体である。前記変異の位置は、前記１８５番と前記２６７番、前記１８５番と前記２６８番、前記１８５番と前記２７２番、前記１８５番と前記３０６番、前記１８５番と前記３８６番、前記２６７番と前記２６８番、前記２６７番と前記２７２番、前記２６７番と前記３０６番、前記２６７番と前記３８６番、前記２６８番と前記２７２番、前記２６８番と前記３０６番、前記２６８番と前記３８６番、前記２７２番と前記３０６番、前記２７２番と前記３８６番、または前記３０６番と前記３８６番である。例えば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはグルタミン（Ｑ）で置換され、２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはグルタミン（Ｑ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）残基がリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはグルタミン（Ｑ）で置換され、前記２７２番スレオニン（Ｔ）はアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、前記３８６番アルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。

前記一実施例の他の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）及び１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、さらに前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）、及び前記３８６番アルギニン（Ｒ）の中から選択されたいずれか３カ所が置換された変異体である。前記変異の位置は、例えば、前記１８５番、前記２６７番及び前記２６８番；前記１８５番、前記２６７番及び前記２７２番；前記１８５番、前記２６７番及び前記３０６番；前記１８５番、前記２６７番及び前記３８６番；前記１８５番、前記２６８番及び前記２７２番；前記１８５番、前記２６８番及び前記３０６番；前記１８５番、前記２６８番及び前記３８６番；前記１８５番、前記２７２番及び前記３０６番；前記１８５番、前記２７２番及び前記３８６番；前記２６７番、前記２６８番及び前記２７２番；前記２６７番、前記２６８番及び前記３０６番；前記２６７番、前記２６８番及び前記３８６番；前記２６７番、前記２７２番及び前記３０６番；前記２６７番、前記２７２番及び前記３８６番；前記２６７番、前記３８６番及び前記３０６番；前記２６８番、前記２７２番及び前記３０６番；前記２６８番、前記２７２番及び前記３８６番；前記２６８番、前記３０６番及び前記３８６番；または前記２７２番、前記３０６番及び前記３８６番である。例えば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはグルタミン（Ｑ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換された変異体である。例えば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）残基がリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはグルタミン（Ｑ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２７２番スレオニン（Ｔ）はアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体である。例えば、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）残基がリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはグルタミン（Ｑ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換され、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）はフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。

前記一実施例の他の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、及び１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、さらに前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）、及び前記３８６番アルギニン（Ｒ）の中から選択されたいずれか４カ所、５カ所、６カ所で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）及び前記２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列に構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１６４番リシン（Ｋ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、１７５番グルタミン酸（Ｅ）、２９７番アスパラギン（Ｎ）、および３８８番イソロイシン（Ｉ）がさらに変異したものである。前記１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で、前記１６８番アスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）で、前記１７５番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で、前記２９７番アスパラギン（Ｎ）はリシン（Ｋ）で、前記３８８番イソロイシン（Ｉ）はバリン（Ｖ）で置換される。前記一実施例の一例におけるヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、前記１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で、前記１６８番アスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）で、前記１７５番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で、前記２９７番アスパラギン（Ｎ）はリシン（Ｋ）で、前記３８８番イソロイシン（Ｉ）はバリン（Ｖ）で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）及び前記３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基ほか配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から３５１番プロリン（Ｐ）がさらに変異したものである。具体的に、前記３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）及び前記３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から６８番グルタミン酸（Ｅ）がさらに変異したものである。前記６８番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、及び３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から６０番グルタミン酸（Ｅ）、２０２番メチオニン（Ｍ）、２２１番チロシン（Ｙ）及び２４２番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記６０番グルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）で、前記２０２番メチオニン（Ｍ）はスレオニン（Ｔ）で、前記２２１番チロシン（Ｙ）はフェニルアラニン（Ｆ）で、前記２４２番チロシン（Ｙ）はフェニルアラニン（Ｆ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）、及び前記３８６番アルギニン（Ｒ）からなる群より選択される一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、前記ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から９１番のロイシン（Ｌ）、１４１番アスパラギン酸（Ｄ）、および１７６番グリシン（Ｇ）からなる群から選択された複数のアミノ酸残基がさらに変異したものである。具体的に本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）及び前記２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基の他に前記９１番ロイシン（Ｌ）、前記１４１番アスパラギン酸（Ｄ）または前記１７６番グリシン（Ｇ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記９１番ロイシン（Ｌ）はトリプトファン（Ｗ）、イソロイシン（Ｉ）またはアスパラギン（Ｎ）で、１４１番アスパラギン酸（Ｄ）はフェニルアラニン（Ｆ）で、１７６番グリシン（Ｇ）はヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはチロシン（Ｙ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記３０６番トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、このヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は配列番号１のアミノ酸配列に構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から２８４番バリン（Ｖ）及び４１５番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。具体的に、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基の他に、前記２８４番バリン（Ｖ）及び前記４１５番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記２８４番バリン（Ｖ）はアラニン（Ａ）で、前記４１５番バリン（Ｖ）はグルタミン酸（Ｅ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸の他に、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記３０６番トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、このヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１６６番プロリン（Ｐ）または２３１番アスパラギン酸（Ｄ）がさらに変異したものである。具体的に、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記３０６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基の他に、前記１６６番プロリン（Ｐ）または前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）がさらに変異したものである。前記１６６番プロリン（Ｐ）はアルギニン（Ｒ）で、前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記３８６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基がさらに変異されることができ、このヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２６番バリン（Ｖ）がさらに変異したものである。具体的に、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記３８６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基の他に、前記１２６番バリン（Ｖ）がさらに変異したものである。前記１２６番バリン（Ｖ）は、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）またはスレオニン（Ｔ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から４０３番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基、２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基、３０６番トリプトファン（Ｗ）及び３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基が変異した、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１の４０３番チロシン（Ｙ）、１２５番セリン（Ｓ）、１８５番セリン（Ｓ）、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、２７２番スレオニン（Ｔ）及び３８６番トリプトファン（Ｗ）のアミノ酸残基の他に、９７番スレオニン（Ｔ）、１２６番バリン（Ｖ）、１４５番トリプトファン（Ｗ）、１６３番バリン（Ｖ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６６番プロリン（Ｐ）、２３１番アスパラギン酸（Ｄ）、２４１番バリン（Ｖ）、２７６番スレオニン（Ｔ）、３３７番リシン（Ｋ）、３６６番アラニン（Ａ）、４０２番セリン（Ｓ）、４２９番アスパラギン酸（Ｄ）または４４０番チロシン（Ｙ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記９７番スレオニン（Ｔ）はアラニン（Ａ）またはロイシン（Ｌ）で置換され；前記１２６番バリン（Ｖ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはアルギニン（Ｒ）で置換され；前記１４５番トリプトファン（Ｗ）はアラニン（Ａ）で置換され；前記１６３番バリン（Ｖ）は、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）またはグルタミン（Ｑ）で置換され；前記１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で置換され；前記１６６番プロリン（Ｐ）はアルギニン（Ｒ）で置換され；前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換され；前記２４１番バリン（Ｖ）は、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）で置換され；前記２７６番スレオニン（Ｔ）は、グルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）で置換され；前記３３７番リシン（Ｋ）は、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）で置換され；前記３６６番アラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、またはシステイン（Ｃ）で置換され；前記４０２番セリン（Ｓ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）またはチロシン（Ｙ）で置換され；前記４２９番アスパラギン酸（Ｄ）はプロリン（Ｐ）で置換され、前記４４０番チロシン（Ｙ）はアラニン（Ａ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記３８６番トリプトファン（Ｗ）、及び９７番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１６４番リシン（Ｋ）、１６６番アスパラギン酸（Ｄ）または２３１番アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で置換され；前記１６６番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換され；前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記３８６番トリプトファン（Ｗ）、及び１６３番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から２３１番アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）はアルギニン（Ｒ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１８５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記３８６番トリプトファン（Ｗ）、及び３３７番リシン（Ｋ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１５７番グリシン（Ｇ）、１６０番アラニン（Ａ）、１６７番グルタミン酸（Ｅ）、１７７番フェニルアラニン（Ｆ）、２１８番グリシン（Ｇ）、２９５番フェニルアラニン（Ｆ）、３０２番フェニルアラニン（Ｆ）、３６１番フェニルアラニン（Ｆ）、３６６番アラニン（Ａ）または４４１番グリシン（Ｇ）アミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１５７番グリシン（Ｇ）はアルギニン（Ｒ）で置換され；前記１６０番アラニン（Ａ）は、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）で置換され；前記１６７番グルタミン酸（Ｅ）は、アラニン（Ａ）、トリプトファン（Ｗ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）またはセリン（Ｓ）で置換され；前記１７７番フェニルアラニン（Ｆ）は、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）またはロイシン（Ｌ）で置換され；前記２１８番グリシン（Ｇ）は、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはシステイン（Ｃ）で置換され；前記２９５番フェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）で置換され；前記３０２番フェニルアラニン（Ｆ）はシステイン（Ｃ）で置換され；前記３６１番フェニルアラニン（Ｆ）は、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）またはシステイン（Ｃ）で置換され；前記３６６番アラニン（Ａ）はセリン（Ｓ）で置換され；４４１番グリシン（Ｇ）は、グルタミン酸（Ｅ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から７７番ロイシン（Ｌ）、１５８番アラニン（Ａ）、またはそれらの組み合わせのアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記７７番ロイシン（Ｌ）は、プロリン（Ｐ）またはアルギニン（Ｒ）で、また、前記１５８番アラニン（Ａ）はスレオニン（Ｔ）で置換される。前記４０３番チロシン（Ｙ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記７７番ロイシン（Ｌ）のアミノ酸残基、及び１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から３８６番アルギニン（Ｒ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記３８６番アルギニン（Ｒ）はプロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換される。

本発明は更に他の一態様において、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する。前記１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記１８５番の他に、前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基は、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換される。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換され、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基が、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体である。具体的な例では、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換され、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記１８５番セリン（Ｓ）及び前記１２５番セリン（Ｓ）の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。２６８番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換される。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する。前記２７２番スレオニン（Ｔ）は、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）のアミノ酸残基の他に、前記１２５番セリン（Ｓ）残基がさらに変異したものである。前記１２５番セリンはシステイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換される。また、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体である。一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がセリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、リシン（Ｋ）、またはチロシン（Ｙ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記１２５番セリン（Ｓ）残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１８５番セリン（Ｓ）残基がさらに変異したものである。前記１８５番セリン（Ｓ）は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）またはアルギニン（Ｒ）で置換される。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、及び前記１８５番セリン（Ｓ）残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）、および３０６番トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記２６７番バリン（Ｖ）はメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）がフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換された変異体である。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換された変異体である。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換され、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）がフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換され、２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換された変異体である。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換され、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）がフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）がフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１８５番セリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、前記３０６番トリプトファン（Ｗ）がフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記１２５番セリン（Ｓ）残基の他に、２６７番バリン（Ｖ）、２６８番セリン（Ｓ）または前記２６７番バリン（Ｖ）と２６８番セリン（Ｓ）残基の組み合わせがさらに変異した変異体である。前記２６７番バリン（Ｖ）残基はメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換される。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）残基はメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記１２５番セリン（Ｓ）；また、前記２６７番バリン（Ｖ）および／または前記２６８番セリン（Ｓ）の他に、配列番号１のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から２３１番アスパラギン酸（Ｄ）、３８６番アルギニン（Ｒ）残基またはその組み合わせがさらに変異した変異体である。前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、前記３８６番アルギニン（Ｒ）は、プロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換される。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）残基はメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換されることができ、前記２３１番アスパラギン酸（Ｄ）がアルギニン（Ｒ）で置換されるか、前記３８６番アルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換されるか、前記２３１番及び前記３８６番の両方がそれぞれアルギニン（Ｒ）、またはプロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換された変異体である。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記２６７番バリン（Ｖ）、前記２６８番セリン（Ｓ）、及び３８６番アルギニン（Ｒ）残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から９７番スレオニン（Ｔ）、１４９番グルタミン（Ｑ）、１６６番プロリン（Ｐ）または３５１番プロリン（Ｐ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異した変異体である。前記９７番スレオニン（Ｔ）は、アラニン（Ａ）またはロイシン（Ｌ）で置換され、前記１４９番グルタミン（Ｑ）はアルギニン（Ｒ）で置換され、前記１６６番プロリン（Ｐ）はアルギニン（Ｒ）で置換され、前記３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換される。前記実施例の一例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、またはセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）残基はメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で置換され、前記３８６番アルギニン（Ｒ）はバリン（Ｖ）で置換され、前記９７番スレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）またはロイシン（Ｌ）で置換されるか、前記１４９番グルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）で置換されるか、前記１６６番プロリン（Ｐ）がアルギニン（Ｒ）で置換されるか、前記３５１番プロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記２７２番スレオニン（Ｔ）及び前記１２５番セリン（Ｓ）、および前記２６７番バリン（Ｖ）および／または前記２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１６４番リシン（Ｋ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、および１７５番グルタミン酸（Ｅ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で置換され、前記１６８番アスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）で置換され、前記１７５番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で置換される。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から７７番のロイシン（Ｌ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する。前記７７番ロイシン（Ｌ）は、プロリン（Ｐ）またはアルギニン（Ｒ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記７７番ロイシン（Ｌ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１２５番セリンはシステイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記７７番ロイシン（Ｌ）および１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１５８番アラニン（Ａ）、３５１番プロリン（Ｐ）またはその組み合わせのアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１５８番アラニン（Ａ）はスレオニン（Ｔ）で置換され、前記３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換される。

本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記７７番ロイシン（Ｌ）、前記１２５番セリン（Ｓ）及び前記１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から９番ヒスチジン（Ｈ）、６０番グルタミン酸（Ｅ）、および４１５番バリン（Ｖ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異したものである。具体的に、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記７７番ロイシン（Ｌ）、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１５８番アラニン（Ａ）、前記９番ヒスチジン（Ｈ）、前記６０番グルタミン酸（Ｅ）、及び４１５番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基が変異したものである。前記９番ヒスチジン（Ｈ）は、チロシン（Ｙ）で置換され、前記６０番グルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記４１５番バリン（Ｖ）はグルタミン酸（Ｅ）で置換される。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する。前記１５８番アラニン（Ａ）はスレオニン（Ｔ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１２５番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換される。一例において、配列番号１のアミノ酸配列のうち１５８番アラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換され、１２５番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換される。一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記１５８番アラニン（Ａ）及び前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１４９番グルタミン（Ｑ）、２６７番バリン（Ｖ）及び３５１番プロリン（Ｐ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１４９番グルタミン（Ｑ）は、アルギニン（Ｒ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）はメチオニン（Ｍ）で置換され、前記３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換される。更に、前記１５８番アラニン（Ａ）のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）で置換され、１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、さらに１４９番グルタミン（Ｑ）はアルギニン（Ｒ）で置換されるか、２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換されるか、３５１番プロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）で置換された変異体が提供される。

本発明のさらに他の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から３５１番プロリン（Ｐ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する。前記３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記３５１番プロリン（Ｐ）のアミノ酸残基の他に、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１２５番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換される。さらに、前記３５１番プロリン（Ｐ）はセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がシステイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換された変異体が提供される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記３５１番プロリン（Ｐ）及び前記１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基の他に２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記２６７番バリン（Ｖ）はメチオニン（Ｍ）で置換される。このヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、２１番チロシン（Ｙ）、６２番バリン（Ｖ）、１４９番グルタミン（Ｑ）及び３１６番ロイシン（Ｌ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記２１番チロシン（Ｙ）はフェニルアラニン（Ｆ）で置換され、６２番バリン（Ｖ）はイソロイシン（Ｉ）で置換され、１４９番グルタミン（Ｑ）はアルギニン（Ｒ）で置換され、３１６番ロイシン（Ｌ）はフェニルアラニン（Ｆ）で置換される。前記一実施例の一例は、前記３５１番プロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）で置換され、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換され、前記２１番チロシン（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換され、前記６２番バリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）で置換され、前記１４９番グルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）で置換され、前記３１６番ロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換された変異体である。

本発明のさらに他の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）、１６４番リシン（Ｋ）、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）及び１７５番グルタミン酸（Ｅ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する。前記１２５番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１６４番リシン（Ｋ）は、メチオニン（Ｍ）で、前記１６８番アスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）で、前記１７５番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で置換される。

本発明の一実施例において、前記１２５番セリン（Ｓ）、前記１６４番リシン（Ｋ）、前記１６８番アスパラギン酸（Ｄ）、及び１７５番グルタミン酸（Ｅ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１４０番ロイシン（Ｌ）、３８６番アルギニン（Ｒ）、２６８番セリン（Ｓ）、および２９７番アスパラギン（Ｎ）からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異したものである。前記１４０番ロイシン（Ｌ）はプロリン（Ｐ）で、前記３８６番アルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）またはバリン（Ｖ）で置換され、前記２６８番セリン（Ｓ）はシステイン（Ｃ）またはスレオニン（Ｔ）で、前記２９７番アスパラギン（Ｎ）はリシン（Ｋ）で置換される。前記一実施例の一例は、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で、前記１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で、前記１６８番アスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）で、前記１７５番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で、前記１４０番ロイシン（Ｌ）はプロリン（Ｐ）で、３８６番アルギニン（Ｒ）はプロリン（Ｐ）で置換された変異体である。前記一実施例の一例による本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、前記１２５番セリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）で、前記１６４番リシン（Ｋ）はメチオニン（Ｍ）で、１６８番アスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）に、前記１７５番グルタミン酸（Ｅ）はグリシン（Ｇ）で、前記２６８番セリン（Ｓ）はスレオニン（Ｔ）で、前記２９７番アスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）で置換された変異体である。

本発明のさらに他の一態様において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１２５番セリン（Ｓ）、１４９番グルタミン（Ｑ）及び２６７番バリン（Ｖ）のアミノ酸残基が変異したヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を提供する。前記１２５番セリン（Ｓ）は、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、前記１４９番グルタミン（Ｑ）はアルギニン（Ｒ）で置換され、前記２６７番バリン（Ｖ）はメチオニン（Ｍ）で置換される。

一実施例において本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、野生型ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）から表２〜９に示す変異アミノ酸残基位置及び置換されたアミノ酸残基より導出できるアミノ酸配列（例えば、表２〜表１０中Ｍ１２５変異体）で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、またはこれらのアミノ酸配列を有する変異体に比べて、５０％以上の遺伝的相同性を有し、一実施例では６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％から９９％の相同性を有するポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含むことができる。

本発明における「相同性」という用語は、二つのポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）間の同一性の百分率を意味する。一方の部分から他方の部分までの配列間に相応性は周知の当該技術によって決定できる。例えば、配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接整列して、相同性を決定することができる。また、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件でポリヌクレオチドを混成化した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解し、分解された断片の長さを測定することで相同性を決定することができる。

本発明における「相同」という用語は、すべての文法的形態やスペリング変異形態は（ｇｒａｍｍａｔｉｃａｌｆｏｒｍｓａｎｄｓｐｅｌｌｉｎｇｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）、スーパーファミリー由来のタンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）と他種由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）を含み、「共通進化起源」を有するタンパク質との間の関係を意味する。これらのタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、高レベルの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。しかし、一般の使用と本発明における「相同」は「非常に高い」などの形容詞によって修飾される場合、配列の類似性を意味し、共通進化起源を意味することではない。

本発明における「配列類似性」という用語は、共通進化起源の共有には関係がなく、タンパク質の塩基配列やアミノ酸配列の間の同一性や相応性の程度を意味する。一実施例では、二つのアミノ酸配列がアミノ酸配列の所定の長さにおいて、ポリペプチドのマッチが少なくとも２１％（一実施例において少なくとも約５０％、他の実施例において少なくとも７５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９９％）であった場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同の配列は、データバンクで使用される標準ソフトウェアを使用して、例えば、特定システムのために定義された厳格な条件下で用いた混成化実験によって配列を比較することで確認することができる。定義された適切な混成化条件は、当該技術の範囲内に属する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、１９８９、ｉｎｆｒａを参照）。

本発明に記述されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、Ｄ−フルクトースの４番炭素の位置をエピマー化してＤ−タガトースに転換してＣ４−エピマー化の活性単位が高められ、Ｄ−フルクトースからＤ−タガトースを効率的に生産することができる。

本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、高温性ロドサーマス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、テルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属、またはディクチオグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ）属に属する高温性微生物のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼから由来したものであり得る。具体的にテルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属微生物のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼから由来したもの、より具体的にテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）またはテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ）のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼから由来したものである。

本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼは中温性の微生物（ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）が生産する酵素と同じ機能を持ちながら極限反応（高温など）の条件で安定して反応を行うことができ、中温性の微生物の汚染防止、気質の溶解度が低い物質の溶解度の増加、反応速度の増加など、多くの利点があるため中温性酵素を利用した産業的な欠点を克服することができる。

本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を発現するＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉなどの菌株を形質転換させ、これを培養して培養物を得て前記培養物を破砕し、カラムなどを介して精製したものであり得る。前記形質転換用菌株として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、またはバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）などがある。

本発明の他の一態様において、本発明は本明細書に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体をコードする核酸、前記核酸を含む形質転換体、または本明細書に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を発現する微生物または前記微生物の培養物または本明細書に記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含むＤ−タガトースの生産用の組成物を提供する。

他の実施例において、本明細書に記載のＣ４−エピメラーゼ変異体をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。本発明における「ベクター」の用語は、有機体、例えば宿主細胞に塩基のクローニングおよび／または転移するため任意の媒体をいう。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片を複製できる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であり得る。ここで、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自律的ユニットとして機能する、すなわち、自己制御によって複製が可能である任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）をいう。「ベクター」という用語は、試験管内、生体外または生体内で有機体、例えば、宿主細胞に塩基を導入するためのウイルスおよび非ウイルス媒介物を含む。「ベクター」の用語にはミニサークルＤＮＡが含まれ得る。

本発明における「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を包括的に含む意味であり、核酸の基本的な構成単位であるヌクレオチドには、天然ヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部分が変形された類似体も含まれる（参照文献：Ｓｃｈｅｉｔ、ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｎａｌｏｇｓ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８０）；ＵｈｌｍａｎとＰｅｙｍａｎ、ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４（１９９０））。

本発明における「形質転換」という用語は、核酸断片が宿主生物のゲノムの中に移動して安定的に遺伝されることを言い、「形質転換体」は核酸がこのゲノムの中に移動して安定的に遺伝される有機体を言う。形質転換体は、例えば、原核細胞または真核細胞であり、具体的には、エンテロバクテリア科の微生物またはコリネ型微生物など、より具体的に、エスケリキア属の微生物、セラチア属の微生物などを挙げることができ、最も具体的には大腸菌である。

有機体内に形質転換する方法は、前記核酸を有機体に導入するいかなる方法も含まれ、当該分野で公知された適切な標準技術を適切に選択して行うことができる。一例として、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、カルシウムホスフェート共沈殿（ｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ）、陽イオンリポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃｌｉｐｏｓｏｍｅ）法などがあるが、これらに限定されない。

ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含むＤ−タガトース生産用の組成物は、Ｄ−タガトース生産用の組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができる。これらの賦形剤として、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、または等張化剤などがあるが、これらに限定されない。前記組成物内のキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体は、組成物の固形重量を基準に０．１重量％〜７０重量％の範囲で含まれることができる。

本発明のさらに他の実施例は、本発明は本明細書に記載されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、本明細書に記載された形質転換体、または本明細書に記載されたタガトース生産用の組成物と、Ｄ−フルクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を反応させて前記Ｄ−フルクトースをエピマー化する工程を備えたＤ−タガトースの製造方法を提供する。

以下、本発明の様態によるＤ−タガトースの製造方法について説明する。

前記方法は、本発明のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、前記変異体を発現する微生物または前記微生物の培養物またはこれを含むＤ−タガトース生産用の組成物をＤ−フルクトースと接触させることを含む。これにより、Ｄ−フルクトースの４番目炭素をエピマー化する。

単糖類は、一般的にアルドヘキソース（ａｌｄｏｈｅｘｏｓｅ）とケトヘキソース（ｋｅｔｏｈｅｘｏｓｅ）に大別される。本発明の原料であるＤ−フルクトースはケトヘキソースの一つであり、これを使用してＤ−タガトースを製造することができる。

前記Ｄ−フルクトースは、砂糖の加水分解により製造することと、ブドウ糖を異性化して製造することができる。これにより、フルクトース、砂糖とブドウ糖などの普遍化されて安価な原料を使用して高収率でタガトースを製造することができるため、タガトースの大量生産が可能になる。

本発明のＤ−フルクトースをエピマー化させる工程は、ｐＨ５〜９、ｐＨ６〜９、ｐＨ７〜９、またはｐＨ７．５〜８．５で実施する。本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程は、５０℃〜８５℃、５０℃〜７５℃または５０℃〜７０℃で実施する。前記ｐＨまたは温度条件で本発明の変異体酵素を処理した時、比較的に高温で反応させることができ、製造工程中の微生物汚染を最小限に抑えることと、基質として使用されるフルクトースの溶解度を高めることができ、酵素の反応速度及び転換率を最大化することができる。

また、本発明のＤ−フルクトース濃度は１０〜５０％（ｗ／ｖ）である。一実施例における前記濃度は、２０〜５０％（ｗ／ｖ）、２０〜４０％（ｗ／ｖ）、２０〜３０％（ｗ／ｖ）である。本発明の変異体酵素は、高濃度のＤ−フルクトースからＤ−タガトースを生産することができるため、経済的かつ効率的にＤ−タガトースの生産ができる長所がある。

前記本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程は、金属塩が存在する条件で実施することができる。一実施例において、本発明の金属はＮｉ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｎ、及びＺｎからなる群より選択される一つ以上の金属である。具体的に、本発明の金属塩は、ＮｉＳＯ_４、ＮｉＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、およびＺｎＳＯ_４からなる群からなる群より選択される一つ以上である。本発明のＤ−フルクトースをエピマー化する工程が金属塩の存在する条件下で行われるので、変換活性が高まる効果がある。

本発明の一実施例に係る製造方法は、本発明の接触させるステップの前にショ糖を加水分解してＤ−フルクトースを得るステップをさらに備えることができる。前記加水分解に用いる酵素は、β−フルクトフラノシダーゼ、インベルターゼ、サッカラーゼなどを含むβ−Ｄ−フルクトシダーゼ；スクラーゼ、α−グルコシダーゼとα−Ｄ−グルコヒドロラーゼからなる群より選択される一つ以上であるが、これらに限定されない。

本発明の一実施例に係る製造方法は、本発明の接触させるステップの前に、グルコースを異性化してＤ−フルクトースを得るステップをさらに備えることができる。前記異性化の酵素には、グルコースイソメラーゼまたはホスホグルコイソメラーゼなどがあるが、これらに限定されない。

本発明の一実施例に係る製造方法は、本発明の接触させるステップの後に、Ｄ−タガトースを含むエピマー化反応物を得るステップをさらに備えることができる。

本発明の一実施例に係る製造方法は、本発明のエピマー化反応物を得るステップの後に、得られたＤ−タガトースを含むエピマー化反応物を精製するステップをさらに備えることができる。

本発明の一実施例に係る製造方法は、本発明のエピマー化反応物を精製するステップの後に、前記精製したＤ−タガトースを含むエピマー化反応物を結晶化するステップをさらに備えることができる。

前記エピマー化反応物の精製方法は、特に制限されなく、本発明の技術分野における通常の方法を使用することができる。非限定的例として、クロマトグラフィー、分別結晶およびイオン精製などがある。前記精製方法は単独で、又は二つ以上の方法を並行することもできる。例えば、クロマトグラフィーでエピマー化反応物を精製することと、前記クロマトグラフィーによる糖の分離は分離しようとする糖とイオン樹脂に付着した金属イオンとの間の弱い結合力の差を利用して行うことができる。

また、本発明は、本発明の精製するステップの前または後に、脱色、脱塩、またはその両方を実施することをさらに備えることができる。前記脱色および／または脱塩を行うことで、もっと精製されて不純物のないエピマー化反応物を得ることができる。

前記精製されたエピマー化反応物は、濃縮後にＳＭＢクロマトグラフィー工程によって純粋なタガトース液を得た後に結晶化する工程に進むことができる。

本発明の一実施例に係る製造方法は、本発明の結晶化するステップの前に分離して得られた前記タガトース液を濃縮するステップをさらに備えることができる。前記濃縮は、精製されたＤ−タガトースを含むエピマー化反応物の濃度を約２．５〜３倍に濃縮することであり、前記濃縮するステップでもっと効率的に結晶化することができる。

本発明の結晶化するステップで用いられる方法は、特に制限されなく、通常の結晶化方法を用いることができる。例えば、冷却結晶化方法を用いた結晶化方法がある。前記結晶化ステップにより、最終的に精製されたＤ−タガトースを高収率で得ることができる。

本発明の一実施例に係る製造方法は、本発明の精製ステップの後に未反応のＤ−フルクトースを本発明の接触するステップに再利用すること、本発明の結晶化ステップの後に結晶が分離された母液を前記精製ステップで再利用すること、またはこの両方を実施するステップをさらに備えることができる。前記再利用ステップによりＤ−タガトースをさらに高収率で得ることができ、廃棄されるＤ−フルクトース量が少なくなるので経済的に利点がある。

本明細書で前記用語「ｎ番目の炭素」とは、ＩＵＰＡＣで規定による炭素番号をつける規則に基づいて決定された炭素を意味し、Ｃｎで表現する。ｎは１以上の整数である。例えば、「４番目炭素でエピマー化」することを「Ｃ４−エピマー化」で表現できる。

本明細書で配列番号１のアミノ酸配列を有するヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端からｎ番目のアミノ酸残基（Ｘ）は、ｎＸで簡単に表現できる。

また、本発明において変異したアミノ酸残基で置換されるアミノ酸に関する言及がない場合は、本明細書の他の部分で言及された該当位置のアミノ酸残基における置換可能なアミノ酸を考慮することができる。

本明細書におけるアミノ酸は、以下の略語で表記できる。

また、大韓民国公開特許第１０−２０１４−０１４３１０９号の開示事項は、本明細書に参照として含まれる。

本発明は、Ｄ−フルクトースの４番炭素の位置をエピマー化してＤ−タガトースへの転換活性が改善されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）変異体を提供し、普遍化した原料であるＤ−フルクトースを用いてＤ−タガトースを効率的に大量生産することにより、製造原価が低減されて経済的に有利である。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明の例示であり、本発明の内容をこれらによって限定解釈してはいけない。

実施例１．改良ターゲット部位の設計と解析
テルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）由来のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（以下、野生型という）のアミノ酸と相同性を有する相同遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇ、他の微生物種で同一機能を有すると予測される相同遺伝子）の活性部位の３次構造モデル分析に基づいて、機能的に重要であると予測されるアミノ酸を１次選定し、これらのアラニンスキャニング突然変異（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）分析後、再設計された（ｒｅｆｉｎｉｎｇ）活性部位の構造とＤ−フルクトースの間のドッキングモデル分析の結果に基づいて、Ｄ−フルクトースＣ４−エピマー化転換反応の活性単位を高めるために改良ターゲット部位を設計した。以下、これを詳細に説明する。

１−１．相同遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）分析
野生型のアミノ酸配列（配列番号１）と相同性を有する相同遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を、ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子データベースを利用して選別し［配列包括度（ｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｖｅｒａｇｅ）８０％と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）５０％以上の相同遺伝子を約６０本］、選別した相同遺伝子のアミノ酸配列間の多重配列アラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ）分析により、野生型のアミノ酸配列において機能的に重要であると予測されるアミノ酸残基を同定した。

１−２．酵素３次構造モデルの分析
タンパク質データバンク（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ）のデータベース内に、野生型および相同遺伝子と３０％以上のアミノ酸配列の相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示すタンパク質の構造がなく、ホモロジーモデリング方法による野生型の３次構造モデル予測の精度が低いと予想されるため、様々なモデリングサーバー（ＲａｐｔｏｒＸ、Ｒｏｂｅｔｔａ、ＭｏｄＷｅｂ、Ｍ４Ｔ、ＨＨｐｒｅｄ、ＰＨＹＲＥ２、ＩＴＡＳＳＥＲとＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ）を介して得られた３次構造モデルの間の活性部位を比較・分析し、同一であると予測される構造部位に関する情報を得た。

１−３．アラニンスキャニング変異とドッキング分析
上述した相同遺伝子間のアミノ酸配列の分析と活性部位の３次構造モデルの分析に基づいて選定されたアミノ酸をアラニンに置換変異して、これらの組換え変異酵素を大腸菌で生産した後、各変異部位の特性を分析した。前記アラニンスキャニング変異分析の後、再設計された活性部位の構造とＤ−フルクトース間のドッキングシミュレーションを介して、機能的に重要であると予測されるアミノ酸を選別してＤ−フルクトースＣ４−エピマー化転換反応の活性単位を高めるために、改良ターゲット部位を設計した。アラニンスキャン変異を介して活性が完全に消失するアミノ酸部位［触媒金属イオン結合残基と脱プロトン化／プロトン化（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ／ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）に関与する触媒残基であると推定］は、活性を改良するためのターゲット部位から排除した。

実施例２．変異酵素の生産と活性が改良された変異酵素の選別
実施例１で設計したターゲット部位（野生型ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から９、２１、６０、６２、６８、７７、９１、９７、１２５、１２６、１４０、１４１、１４５、１４９、１５７、１５８、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１６８、１７５、１７６、１７７、１８５、２０２、２１８、２２１、２３１、２４１、２４２、２６７、２６８、２７２、２７６、２８４、２９５、２９７、３０２、３０６、３１６、３３７、３５１、３６１、３６６、３８６、３８８、４０２、４０３、４１５、４２９、４４０および４４１番のアミノ酸残基）の５４カ所の一部位飽和突然変異ライブラリー（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｔｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｌｉｂｒａｒｙ）を作製し、活性単位が改良される変異部位とアミノ酸をスクリーニング選別した。選抜された改良部位の情報を統合して複数の変異酵素を作製した後、Ｄ−フルクトースＣ４−エピマー化転換反応の活性単位が高められた変異酵素を開発した。

２−１．飽和突然変異（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
野生型酵素遺伝子の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）発現のために製作された組換えベクター（ｐＥＴ２１ａのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位に野生型を導入し、野生型のＣ−末端に６ｘＨｉｓ−ｔａｇが結合した組換え酵素を発現）を変異株ライブラリー作成用の飽和突然変異誘発法のテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いた。変異分布の多様性および変異体の収率などを考慮して、逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲベースの飽和突然変異誘発法を使用し（２０１４．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４９：９０−９８）、製作された変異株ライブラリーのスクリーニング規模を最小限に抑えるため（飽和突然変異時に導入されるコドンの数を最小限に抑えること）、終止コドンを排除し、大腸菌のレアコドン（ｒａｒｅｃｏｄｏｎｓ）が最小化されたＮＤＴ、ＶＭＡ、ＡＴＧとＴＧＧの混合プライマーを（２０１２Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ５２：１４９−１５８）を設計して使用した。詳細には、各々の変異部位の上流塩基１５ｂｐと変異部位を置換する塩基３ｂｐ（各々ＮＤＴ、ＶＭＡ、ＡＴＧとＴＧＧ）、下流塩基１５ｂｐで全長は３３ｂｐにして、混合プライマーを製作して使用した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間変性後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１０分間の伸長を３０回繰り返した後、７２℃で６０分間伸長反応を行った。変異部位別の飽和突然変異ライブラリーを作製した後、ライブラリー別の変異株をランダム選抜＜変異１１個＞して塩基配列を分析して、アミノ酸変異の分布を評価した。この分析結果に基づいて、ライブラリー別配列包括度（ｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｖｅｒａｇｅ）９０％以上のスクリーニング規模を設定した（２００３．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５；３１：ｅ３０）。

２−２．活性改良変異酵素のスクリーニングと、複数の変異酵素の製作
製作された飽和突然変異ライブラリーから活性改良の変異酵素を大量で高速スクリーニングするために、Ｄ−フルクトースを特異的に定量化できる発色測定法を用いた。詳細には、７０％のフォリン-チオカルトー溶液（ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕｒｅａｇｅｎｔ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）と基質反応完了液を１５：１の割合で混合した後、８０℃で５分間反応し９００ｎｍで測定してＯＤ値で比較分析した。

野生型酵素（配列番号１）と相対活性を比較して活性（Ｄ−フルクトース転換・Ｄ−タガトース生成）が増加した変異部位５４か所の変異体を１次選抜し、該当遺伝子は塩基配列分析してアミノ酸変異情報を分析した（表２〜表１０）。

前記１次選抜された変異酵素は、精製（Ｈｉｓ−ｔａｇ親和クロマトグラフィ）酵素液を用いてＤ−フルクトースと反応させた後、反応産物をＨＰＬＣ分析法（カラムＳｈｏｄｅｘＳＵＧＡＲＳＰ−Ｇ、カラム分析温度８０℃、移動相Ｈ_２Ｏ、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、ＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘ検出器）を用いて、野生型酵素に比べＤ−フルクトース転換・Ｄ−タガトース生成活性が増加した変異株２３６種を最終選抜した。

実施例３．活性が改善した変異酵素に対する特性の比較と評価
単位活性が改善した単一部位の変異酵素と、これらの組み合わせた多重部位の変異酵素に対して、Ｄ−フルクトースＣ４−エピマー化の相対活性を評価するために、各酵素を通常の方法（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、１９８９）により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させて後精製（Ｈｉｓ−ｔａｇ親和クロマトグラフィー）し、ＮｉＳＯ_４が存在する条件で各酵素を１０ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で２５％（ｗ／ｖ）Ｄ−フルクトース基質に添加した後、ｐＨ８．０［５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液］と６５℃で２時間反応させテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）由来の野生型組換え酵素（野生型、配列番号１）と比較して、Ｄ−フルクトースＣ４−エピマー化の相対活性を測定した。

前記結果から、本発明のＣ４−エピメラーゼ変異体のＤ−フルクトースＣ４−エピマー化活性が野生型酵素より増加したことを確認し、特にＭ１９９の酵素変異体は、約２０倍の単位活性が増加したと分析されて、野生型酵素に比べてタガトースの製造活性が著しく増加することを確認することができる。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ（ＨｅｘｕｒｏｎａｔｅＣ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）のＮ−末端から１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたことを特徴とする、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）で置換され、かつ、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されたことを特徴とする、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
配列番号１のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼのＮ−末端から１８５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がグルタミン（Ｑ）で置換され、１２５番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、かつ、２６８番セリン（Ｓ）のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換されたことを特徴とする、ヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体。
請求項１ないし３のいずれか一つに記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体をコードする核酸。
請求項４に記載の核酸を含む形質転換体。
請求項１ないし３のいずれか一つに記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体を含む、タガトース生産用の組成物。
請求項１ないし３のいずれか一つに記載のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ変異体、前記変異体を発現する微生物又は前記微生物の培養物とＤ−フルクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を接触させるステップを備える、Ｄ−タガトースの製造方法。