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JP6670412B2 - ゲノムの標的改変のための方法及び組成物 - Google Patents
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JP6670412B2 - ゲノムの標的改変のための方法及び組成物 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／９１４，７６８号、２０１４年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０１７，４１６号、２０１４年７月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／０２９，２６１号、２０１４年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／０５２，９０６号、２０１４年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０５９，５２７号、２０１４年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０６４，３８４号の利益を主張するものであり、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢ経由でテキストファイルとして提出された配列表に関する参照
配列表の公式コピーは、２０１４年１０月１５日に作成され、２７．５キロバイトのサイズをもつ、４５３４６０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴという名称のファイルで、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出され、これは、本明細書とともに出願される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ラットは、心臓血管（例えば、高血圧症）、代謝（例えば、肥満、糖尿病）、神経学的（例えば、疼痛病理）、及び様々な癌が挙げられるが、これらに限定されない、様々なヒト疾患の病理を再現することができる重要な動物モデル系として見なされているが、一つには、例えば、１つ以上の連続的電気穿孔法等のインビトロでの一連の遺伝子改変後にそれらの多能性を維持することができる、生殖細胞系列を伝達することが可能な多能性ラット細胞が入手不可能であることにより、さらにもう一つには、多能性ラット細胞における、大きなゲノムＤＮＡ配列の導入もしくは欠失、または大きな内因性ゲノムＤＮＡ配列の外因性核酸配列との置換を可能にする効率的な標的化技術の欠如により、ヒト疾患をモデル化する際のラットの使用は、マウスと比較して限定されている。
当該技術分野において、現行の標的発見の分野を開拓または拡大してより迅速かつ容易に治療剤を検証することが可能となる、生物のゲノムにおける正確な標的変化を可能にする組成物及び方法が必要である。
標的遺伝子改変を介して真核細胞において対象とするゲノム遺伝子座を改変するための方法が提供される。そのような方法は、（ａ）真核細胞に、（ｉ）少なくとも１０ｋｂであり、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む、第１の発現構築物、（ｉｉｉ）標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物、を導入することであって、第１及び第２のプロモータが真核細胞において活性である、導入することと、（ｂ）該対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む、改変された真核細胞を特定することと、を含む。
一実施形態において、標的遺伝子改変は、２対立遺伝子の遺伝子改変である。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである。別の実施形態において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである。
一実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態において、哺乳動物細胞は、線維芽細胞である。
一実施形態において、真核細胞は、多能性細胞である。一実施形態において、多能性細胞は、ヒト多能性細胞である。一実施形態において、ヒト多能性細胞は、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞またはヒト成人幹細胞である。別の実施形態において、ヒト多能性細胞は、発達的に制限されたヒト前駆細胞である。別の実施形態において、ヒト多能性細胞は、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
一実施形態において、標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が隣接する。一実施形態において、標的配列には、３’末端上にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する。
いくつかの実施形態において、５’及び３’相同性アームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。
本方法は、標的遺伝子改変が、（ａ）内因性核酸配列の相同もしくはオーソロガス核酸配列による置換、（ｂ）内因性核酸配列の欠失、（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、（ｄ）外因性核酸配列の挿入、（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、（ｆ）相同もしくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、（ｉ）多能性細胞において活性な第３のプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子の挿入、または（ｊ）それらの組み合わせ、を含むことをさらに規定する。
一実施形態において、対象とするゲノム遺伝子座は、（ｉ）５’相同性アームに相同である５’標的配列、及び（ｉｉ）３’相同性アームに相同である３’標的配列を含む。
いくつかの実施形態において、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている。いくつかの実施形態において、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている。
一実施形態において、対象とするゲノム遺伝子座は、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、またはＲａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方を含む。
一実施形態において、第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。
少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、ゲノムをＣａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡに曝露することを含み、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びＬＴＶＥＣへの曝露後、このゲノムが少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含むように改変される、ゲノムを改変するための方法がさらに提供される。
いくつかのそのような方法において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂの核酸配列を含む。いくつかのそのような方法において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂの核酸配列を含む。
大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、ＬＴＶＥＣが少なくとも１０ｋｂであり、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、ＬＴＶＥＣの存在下で、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、このゲノムが、第１の核酸を含むように対象とするゲノム遺伝子座で改変される、ゲノムを改変するための方法がさらに提供される。標的配列は、対象とするゲノム遺伝子座に、またはその近傍にあり得る。
いくつかのそのような方法において、ゲノムは、真核細胞中にあり、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＬＴＶＥＣは、真核細胞に導入される。いくつかのそのような方法は、対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変を含む、改変された真核細胞を特定することをさらに含む。
いくつかのそのような方法において、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の形態で一緒に導入される。他の方法において、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に導入される。
いくつかのそのような方法において、（ａ）Ｃａｓタンパク質は、タンパク質、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で真核細胞に導入され、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で真核細胞に導入され、かつ（ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で真核細胞に導入される。
いくつかの方法において、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ（ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、第１、第２、及び第３のプロモータは、真核細胞において活性である。任意に、第１、第２、及び／または第３の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。
いくつかの方法において、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、第１及び第２のプロモータは、真核細胞において活性である。任意に、第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。
いくつかの方法において、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、タンパク質−ＲＮＡ複合体として真核細胞に導入される。
いくつかの方法において、標的遺伝子改変は、対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び対象とするゲノム遺伝子座での第１の核酸の挿入を同時に含む。いくつかの方法において、欠失した内因性核酸配列は、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂであり、挿入された第１の核酸は、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである。いくつかの方法において、欠失した内因性核酸配列は、約３８ｋｂ〜約１１０ｋｂであり、挿入された第１の核酸は、約４３ｋｂ〜約１３４ｋｂである。
いくつかの方法において、標的遺伝子改変は、２対立遺伝子の遺伝子改変である。任意に、２対立遺伝子の遺伝子改変は、２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。
いくつかの方法において、改変された真核細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である。いくつかの方法において、改変された真核細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である。任意に、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。任意に、標的遺伝子改変は、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への第１の核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。第１の染色体は、２つの相同染色体のうちの一方であり得、第２の染色体は、もう一方の相同染色体であり得る。
いくつかの方法において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである。任意に、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである。
いくつかの方法において、第１の核酸は、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである。いくつかの方法において、第１の核酸は、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである。いくつかの方法において、第１の核酸は、約４３ｋｂ〜約１３４ｋｂである。
いくつかの方法において、真核細胞は、哺乳動物細胞、線維芽細胞、多能性細胞、非ヒト多能性細胞、齧歯類多能性細胞、マウスもしくはラット胚幹（ＥＳ）細胞、ヒト多能性細胞、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、またはヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
いくつかの方法において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの方法において、標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する。
いくつかの方法において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。任意に、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。
いくつかの方法において、標的遺伝子改変は、（ａ）内因性核酸配列の相同もしくはオーソロガス核酸配列による置換、（ｂ）内因性核酸配列の欠失、（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、もしくは約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、もしくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、（ｄ）外因性核酸配列の挿入、（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、もしくは約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、（ｆ）相同もしくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、（ｉ）多能性細胞において活性な第３のプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子の挿入、または（ｊ）それらの組み合わせ、を含む。
いくつかの方法において、対象とするゲノム遺伝子座は、（ｉ）５’相同性アームに相同である５’標的配列、及び（ｉｉ）３’相同性アームに相同である３’標的配列を含む。任意に、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている。任意に、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている。任意に、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂだけ離れている。いくつかの方法において、５’及び３’標的配列は、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂだけ離れている。いくつかの方法において、５’及び３’標的配列は、約３８ｋｂ〜約１１０ｋｂだけ離れている。
いくつかの方法において、対象とするゲノム遺伝子座は、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、またはＲａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方を含む。他の方法において、対象とするゲノム遺伝子座は、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、またはＥｒｂｂ４遺伝子座を含む。さらに他の方法において、対象とするゲノム遺伝子座は、Ｌｒｐ５遺伝子座を含む。さらに他の方法において、対象とするゲノム遺伝子座は、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、またはＤｐｐ４遺伝子座を含む。
対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む、Ｆ０世代非ヒト動物を生み出すための方法がさらに提供され、本方法は、（ａ）改変された非ヒトＥＳ細胞を形成するために、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、非ヒトＥＳ細胞におけるゲノムを、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることであって、ＬＴＶＥＣが少なくとも１０ｋｂであり、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含む、接触させることと、（ｂ）対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む、改変された非ヒトＥＳ細胞を特定することと、（ｃ）改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト宿主胚に導入することと、（ｄ）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることと、を含み、代理母が、対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代非ヒト動物を生み出す。
いくつかのそのような方法において、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の形態で一緒に導入される。他のそのような方法において、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に導入される。
いくつかのそのような方法において、（ａ）Ｃａｓタンパク質は、タンパク質、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で非ヒトＥＳ細胞に導入され、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒトＥＳ細胞に導入され、かつ（ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒトＥＳ細胞に導入される。
いくつかのそのような方法において、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ（ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、第１、第２、及び第３のプロモータは、非ヒトＥＳ細胞において活性である。任意に、第１、第２、及び第３の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。
いくつかのそのような方法において、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、第１及び第２のプロモータは、非ヒトＥＳ細胞において活性である。任意に、第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。
いくつかのそのような方法において、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、タンパク質−ＲＮＡ複合体として非ヒトＥＳ細胞に導入される。
いくつかのそのような方法において、標的遺伝子改変は、対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び対象とするゲノム遺伝子座での第１の核酸の挿入を同時に含む。
いくつかのそのような方法において、標的遺伝子改変は、２対立遺伝子の遺伝子改変である。任意に、２対立遺伝子の遺伝子改変は、２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。
いくつかのそのような方法において、改変非ヒトＥＳ細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である。いくつかのそのような方法において、改変非ヒトＥＳ細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である。任意に、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。任意に、標的遺伝子改変は、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への第１の核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。第１の染色体は、２つの相同染色体のうちの一方であり得、第２の染色体は、もう一方の相同染色体であり得る。
いくつかのそのような方法において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
真核細胞、マウス細胞、またはヒト細胞における対象とするゲノム遺伝子座でのゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、対象とするゲノム遺伝子座での標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂであり、対象とするゲノム遺伝子座で５’標的配列に相同である５’相同性アーム及び対象とするゲノム遺伝子座で３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、第１の核酸は、少なくとも３０ｋｂであり、かつ／または５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも３０ｋｂだけ離れており、ＬＴＶＥＣの存在下で、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触した後、このゲノムは、対象とするゲノム遺伝子座で第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変される、方法がさらに提供される。
上記の方法のいずれも、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＬＴＶＥＣを、真核細胞、マウス細胞、またはヒト細胞に導入することをさらに含み得る。上記の方法のいずれも、対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む改変真核細胞、改変マウス細胞、または改変ヒト細胞を特定することをさらに含み得る。
上記の方法のいくつかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の転写産物の形態で一緒に導入される。上記の方法のいくつかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に導入される。
上記の方法のいくつかにおいて、（ａ）Ｃａｓタンパク質は、タンパク質、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で真核細胞、マウス細胞、またはヒト細胞に導入され、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で真核細胞、マウス細胞、またはヒト細胞に導入され、かつ（ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で真核細胞、マウス細胞、またはヒト細胞に導入される。上記の方法のいくつかにおいて、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、真核細胞、マウス細胞、またはヒト細胞に導入される。
上記の方法のいくつかにおいて、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ（ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、第１、第２、及び第３のプロモータは、真核細胞、マウス細胞、またはヒト細胞において活性である。上記の方法のいくつかにおいて、第１、第２、及び／または第３の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。
上記の方法のいくつかにおいて、（ａ）Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一の転写産物においてＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物の形態であり、第１及び第２のプロモータは、真核細胞、マウス細胞、またはヒト細胞において活性である。上記の方法のいくつかにおいて、第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。
上記の方法のいくつかにおいて、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである。上記の方法のいくつかにおいて、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである。
上記の方法のいくつかにおいて、第１の核酸は、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである。上記の方法のいくつかにおいて、第１の核酸は、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである。
上記の方法のいくつかにおいて、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。上記の方法のいくつかにおいて、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。
上記の方法のいくつかにおいて、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている。上記の方法のいくつかにおいて、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている。上記の方法のいくつかにおいて、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂだけ離れている。上記の方法のいくつかにおいて、５’標的配列及び３’標的配列は、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂだけ離れている。
上記の方法のいくつかにおいて、真核細胞は、ラット細胞ではない。上記の方法のいくつかにおいて、真核細胞は、多能性細胞、非多能性細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、齧歯類多能性細胞、または線維芽細胞である。上記の方法のいくつかにおいて、真核細胞は、初代細胞または不死化細胞である。上記の方法のいくつかにおいて、齧歯類多能性細胞は、マウスまたはラット胚幹（ＥＳ）細胞である。
上記の方法のいくつかにおいて、マウス細胞またはヒト細胞は、初代細胞または不死化細胞である。上記の方法のいくつかにおいて、マウス細胞またはヒト細胞は、多能性細胞である。上記の方法のいくつかにおいて、マウス多能性細胞は、マウス胚幹（ＥＳ）細胞である。上記の方法のいくつかにおいて、ヒト多能性細胞は、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、またはヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。上記の方法のいくつかにおいて、ヒトｉＰＳ細胞は、基本培地及び補充物を含む培地において維持され、この培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ３）阻害剤、及び（ｃ）ＭＥＫ阻害剤を含み、この培地は、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
上記の方法のいくつかにおいて、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。上記の方法のいくつかにおいて、標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する。
上記の方法のいくつかにおいて、標的遺伝子改変は、単一ステップにおける対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び対象とするゲノム遺伝子座で第１の核酸の挿入を同時に含む。上記の方法のいくつかにおいて、欠失した内因性核酸配列は、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂであり、挿入された第１の核酸は、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである。
上記の方法のいくつかにおいて、標的遺伝子改変は、２対立遺伝子の遺伝子改変である。上記の方法のいくつかにおいて、２対立遺伝子の遺伝子改変は、２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。上記の方法のいくつかにおいて、改変真核細胞、改変マウス細胞、または改変ヒト細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である。上記の方法のいくつかにおいて、改変真核細胞、改変マウス細胞、または改変ヒト細胞は、対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である。上記の方法のいくつかにおいて、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び第１の核酸の挿入を含む。上記の方法のいくつかにおいて、標的遺伝子改変は、（１）第１及び第２の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座への第１の核酸の挿入及び第２の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。
上記の方法のいくつかにおいて、標的遺伝子改変は、（ａ）相同もしくはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、（ｂ）内因性核酸配列の欠失、（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、（ｄ）外因性核酸配列の挿入、（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、（ｆ）相同もしくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、（ｉ）多能性細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子の挿入、または（ｊ）それらの組み合わせ、を含む。
上記の方法のいくつかにおいて、対象とするゲノム遺伝子座は、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｅｒｂｂ４遺伝子座、Ｌｒｐ５遺伝子座、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、またはＤｐｐ４遺伝子座を含む。上記の方法のいくつかにおいて、対象とするゲノム遺伝子座は、染色体外ＤＮＡを含む。
対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代非ヒト動物またはマウスを生み出すための方法であって、（ａ）上記の方法のいずれかを用いて、非ヒトまたはマウスＥＳ細胞を改変することと、（ｂ）対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む改変非ヒトまたはマウスＥＳ細胞を特定することと、（ｃ）改変非ヒトまたはマウスＥＳ細胞を非ヒトまたはマウス宿主胚に導入することと、（ｄ）代理母において非ヒトまたはマウス宿主胚を懐胎することと、を含み、代理母が、対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代非ヒト動物またはマウスを生み出す、方法も提供される。
例えば、本発明は、以下を提供する。
（項目１）
マウス細胞またはヒト細胞における対象とするゲノム遺伝子座でのゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失及び前記対象とするゲノム遺伝子座の前記第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変され、
（ｉ）欠失した前記対象とするゲノム遺伝子座の領域が、少なくとも３０ｋｂであり、
かつ／または
（ｉｉ）前記挿入された第１の核酸が少なくとも３０ｋｂである、前記方法。
（項目２）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び前記ＬＴＶＥＣが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目１に記載の前記方法。
（項目３）
前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変を含む、前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞を特定することをさらに含む、項目１または２に記載の前記方法。
（項目４）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一転写産物の形態で一緒に導入される、項目２または３に記載の前記方法。
（項目５）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、項目２または３に記載の前記方法。
（項目６）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目２〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目６に記載の前記方法。
（項目８）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞において活性である、項目６に記載の前記方法。
（項目９）
前記第１、第２、及び／または第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目８に記載の前記方法。
（項目１０）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、単一転写産物において、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、
前記第１及び第２のプロモータが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞において活性である、項目６に記載の前記方法。
（項目１１）
前記第１及び前記第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目１０に記載の前記方法。
（項目１２）
前記標的遺伝子改変が、単一ステップにおける前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を同時に含む、項目１〜１１のいずれかに記載の前記方法。
（項目１３）
前記欠失した内因性核酸配列が約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂであり、前記挿入された第１の核酸が約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、項目１２に記載の前記方法。
（項目１４）
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、項目１〜１３のいずれかに記載の前記方法。
（項目１５）
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目１４に記載の前記方法。
（項目１６）
前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である、項目１４に記載の前記方法。
（項目１７）
前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、項目１４に記載の前記方法。
（項目１８）
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目１６に記載の前記方法。
（項目１９）
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記第１の核酸の挿入、及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、項目１６に記載の前記方法。
（項目２０）
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである、項目１〜１９のいずれかに記載の前記方法。
（項目２１）
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである、項目１〜２０のいずれかに記載の前記方法。
（項目２２）
前記第１の核酸が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである、項目１〜２１のいずれかに記載の前記方法。
（項目２３）
前記第１の核酸が、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、項目１〜２２のいずれかに記載の前記方法。
（項目２４）
前記マウス細胞または前記ヒト細胞が、初代細胞または不死化細胞である、項目１〜２３のいずれかに記載の前記方法。
（項目２５）
前記マウス細胞または前記ヒト細胞が多能性細胞である、項目１〜２３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２６）
前記マウス多能性細胞がマウス胚幹（ＥＳ）細胞である、項目２５に記載の前記方法。
（項目２７）
前記ヒト多能性細胞が、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限された（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ヒト前駆細胞、またはヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目２５に記載の前記方法。
（項目２８）
前記ヒトｉＰＳ細胞が、基本培地及び補充物を含む培地において維持され、前記培地が、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、
（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ３）阻害剤、及び
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤を含み、
前記培地が、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目１〜２８のいずれかに記載の前記方法。（項目３０）
前記標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、項目１〜２９のいずれかに記載の前記方法。
（項目３１）
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１〜３０のいずれかに記載の前記方法。
（項目３２）
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、項目１〜３１のいずれかに記載の前記方法。
（項目３３）
前記標的遺伝子改変が、
（ａ）相同またはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、
（ｂ）内因性核酸配列の欠失、
（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、
約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、
（ｄ）外因性核酸配列の挿入、
（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、
（ｆ）相同またはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、
（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、
（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的
配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、
（ｉ）前記多能性細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子の挿入、あるいは、
（ｊ）それらの組み合わせ、を含む、項目１〜３２のいずれかに記載の前記方法。
（項目３４）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている、項目１〜３３のいずれかに記載の前記方法。
（項目３５）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている、項目１〜３４のいずれかに記載の前記方法。
（項目３６）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂだけ離れている、項目１〜３５のいずれかに記載の前記方法。
（項目３７）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂだけ離れている、項目１〜３６のいずれかに記載の前記方法。
（項目３８）
前記対象とするゲノム遺伝子座が、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｅｒｂｂ４遺伝子座、Ｌｒｐ５遺伝子座、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、またはＤｐｐ４遺伝子座を含む、項目１〜３７のいずれかに記載の前記方法。
（項目３９）
前記対象とするゲノム遺伝子座が、染色体外ＤＮＡを含む、項目１〜３８のいずれかに記載の前記方法。
（項目４０）
対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代マウスを生み出すための方法であって、
（ａ）改変マウスＥＳ細胞を形成するために、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、マウスＥＳ細胞における前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることであって、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とする遺伝子改変を含むように改変され、前記対象とする遺伝子改変が、前記対象とする遺伝子座の領域の欠失及び前記対象とするゲノム遺伝子座で前記第１の核酸の挿入を含み、
（ｉ）欠失した前記対象とするゲノム遺伝子座の領域が、少なくとも３０ｋｂであり、かつ／または
（ｉｉ）前記挿入された第１の核酸が少なくとも３０ｋである、接触させることと、
（ｂ）前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む前記改変ＥＳ細胞を特定することと、
（ｃ）前記改変マウスＥＳ細胞をマウス宿主胚に導入することと、
（ｄ）代理母において前記マウス宿主胚を懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む前記Ｆ０世代マウスを生み出す、前記方法。
（項目４１）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一転写産物の形態で一緒に導入される、項目４０に記載の前記方法。
（項目４２）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、項目４０に記載の前記方法。
（項目４３）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入される、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目４４）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、前記マウスＥＳ細胞に導入される、項目４３に記載の前記方法。
（項目４５）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性である、項目４３に記載の前記方法。
（項目４６）
前記第１、第２、及び第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目４５に記載の前記方法。
（項目４７）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、単一転写産物において、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、
前記第１及び第２のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性である、項目４３に記載の前記方法。
（項目４８）
前記第１及び前記第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目４７に記載の前記方法。
（項目４９）
前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を同時に含む、項目４０〜４８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５０）
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、項目４０〜４９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５１）
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目５０に記載の前記方法。
（項目５２）
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である、項目５０に記載の前記方法。
（項目５３）
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、項目５０に記載の前記方法。
（項目５４）
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目５２に記載の前記方法。
（項目５５）
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記第１の核酸の挿入及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、項目５２に記載の前記方法。
（項目５６）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目４０〜５５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５７）
真核細胞における対象とするゲノム遺伝子座でゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、
前記真核細胞がラット細胞ではなく、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失及び前記対象とするゲノム遺伝子座の前記第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変され、
（ｉ）欠失した前記対象とするゲノム遺伝子座の領域が、少なくとも３０ｋｂであり、
かつ／または
（ｉｉ）前記挿入された第１の核酸が少なくとも３０ｋｂである、前記方法。
（項目５８）
前記非ラット真核細胞が、多能性細胞、非多能性細胞、哺動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、または線維芽細胞である、項目５７に記載の前記方法。
（項目５９）
前記非ラット真核細胞が、初代細胞または不死化細胞である、項目５７に記載の前記方法。
皿中で通常分離し、浮遊する小型球形コロニーとして成長するラットＥＳＣを示す。 ラットＥＳＣにより発現される様々な多能性マーカーを示す。ＡはＯｃｔ−４（緑色）を示し、ＢはＳｏｘ−２（赤色）を示し、ＣはＤＡＰＩ（青色）を示し、ＤはｒＥＳＣにより発現される多能性マーカーのオーバーレイを示す。 ラットＥＳＣがアルカリホスファターゼ（多能性マーカー）の光レベルを発現することを示す。 ４２Ｘ，Ｙである細胞系列ＤＡ．２Ｂの核型を示す。ラットＥＳＣが多くの場合、４倍体となるため、核型分析が行われ、そのため、細胞系列は、分裂中期の染色体の広がりを計数することにより事前に選別され、大部分が正常な計数を有する細胞系列が、正式に核型分析された。 ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 ＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株の染色体数の分析を示す写真を提供する。 図１のラットＥＳＣの拡大図を示す。 生殖細胞系列を通したラットＥＳＣゲノムの胚盤胞注射及び伝達によるキメラの生成を示す。キメラは、親ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳＣを用いた胚盤胞注射により生成された。高い割合のキメラが、通常、アルビノ鼻を有する。 図９にアスタリスク（＊）で標識されたＡＣＩ／ＳＤキメラが雄親となるアルビノ同腹子を有するＦ１アグーチ子を示す。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座の概略図を提供し、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ１及びＺＦＮ２）の切断部位を灰色バーで示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ）に対応するゲノム領域を濃灰色ボックスで示す。ＡｐｏＥ遺伝子のエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示される。エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。 同じ間隔を有し、マウスにおけるように、Ｓｅｔｄ５遺伝子とＴｈｕｍｐｄ３遺伝子との間にあるラットのＲｏｓａ２６遺伝子座の標的化を示す。パネルＡは、マウスのＲｏｓａ２６遺伝子座の構造を示す。マウスのＲｏｓａ２６転写物は、２つまたは３つのエクソンから成る。パネルＢは、ラットのＲｏｓａ２６遺伝子座の構造を示し、ラットの遺伝子座は、マウスエクソン１（Ｅｘ１ａ）に対して相同的なエクソンに加えて、第２のエクソン１（Ｅｘ１ｂ）を含むが、第３のエクソンは、ラットにおいては確認されていない。パネルＣは、標的とするラットのＲｏｓａ２６対立遺伝子を示し、５ｋｂの相同性アームはそれぞれ、ＤＡ ｒＥＳＣからのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによってクローン化され、標的とする対立遺伝子は、ラットのＲｏｓａ２６イントロンにおいて１１７ｂｐの欠失を置換するスプライシング受容体（ＳＡ）−ｌａｃＺ−ｈＵＢ−ｎｅｏカセットを含む。 Ｘ−ｇａｌで染色された１４週齢の野生型ラットの対照脳を示す。対照脳は、ＬａｃＺに対して低レベルの背景染色を示した（背面図）。 ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合ラット（１４週齢）の脳におけるＬａｃＺ発現を示す。ｌａｃＺレポーターは、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体の脳全体にわたって遍在的に発現した。 Ｘ−ｇａｌで処理された１４週齢の野生型ラットの対照心臓及び胸腺（挿入図）を示す。対照心臓及び胸腺は、ＬａｃＺに対して低レベルの背景染色を示した。 １４週齢のｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合ラットの対照心臓及び胸腺（挿入図）におけるＬａｃＺ発現を示す。ｌａｃＺレポーターは、ｒＲＯＳＡ２６ヘテロ接合体の心臓及び胸腺全体にわたって遍在的に発現した。 Ｘ−ｇａｌで処理された１４週齢の野生型ラットの対照肺を示す。対照肺は、ＬａｃＺに対して低レベルの背景染色を示した。 １４週齢のｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体ラットの肺におけるＬａｃＺ発現を示す。ｌａｃＺレポーターは、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体の肺全体にわたって遍在的に発現した。 Ｅ１２．５ラット胚におけるＬａｃＺ発現を示す。低レベルの背景ＬａｃＺ染色を示す野生型対照胚（Ｈ）と比較して、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体胚は、胚全体にわたってＬａｃＺレポーターの遍在的発現を示した。 Ｅ１４．５ラット胚におけるＬａｃＺ発現を示す。低レベルの背景ＬａｃＺ染色を示す野生型対照胚（Ｊ）と比較して、ｒＲｏｓａ２６ヘテロ接合体ラット胚は、胚全体にわたってＬａｃＺレポーターの遍在的発現を示した。 選択カセット（ｌａｃＺ−ｎｅｏカセット）を含む標的化ベクターの電気穿孔後のラットＥＳ細胞内に生じる相同または非相同的組み換え事象を示す。 ゲノム編集エンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ）が標的ゲノム配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、ＥＳ細胞において非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を活性化する機構を示す。 標的化ベクターの相同的組み換えの効率を改善するためにＺＦＮ／ＴＡＬＥＮを利用する遺伝子標的技術を示す。ＤＳＢは、二本鎖切断を表す。 改変ラットのＡｐｏＥ遺伝子座のキメラ生成及び生殖細胞系列の伝達によって生み出されたＡｐｏＥ−ＺＦＮ−ＡＢ５キメラを示す。標的改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって支援された。 ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ Ｄを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせたＩＬ２ｒ−γ標的化事象の概略図を提供する。ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ Ｄによって標的とされるラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の領域を示す（配列番号９３）。ＺＦＮ切断部位を図に示す。 ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ Ｄを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせたまたはｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ４）と組み合わせたＩＬ２ｒ−γ標的化事象の概略図を提供する。ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ ＤまたはｇＲＮＡ１〜４によって標的とされたラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の領域を示し、ＺＦＮ切断部位を示す。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座及び標的化プラスミドの概略図を提供する。上の概略図は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応するゲノム領域のゲノム構造を示す。ＡｐｏＥ遺伝子のエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示される。エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。下パネルは、標的化プラスミドを示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。標的化ベクターは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、及びｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。自己欠失カセットは、Ｃｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む。 ジンクフィンガーヌクレアーゼと、レポーター遺伝子（ＬａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、自己欠失カセットを含む標的化ベクターとを用いた、ラットＥＳ細胞におけるＡｐｏＥ遺伝子座を標的化するための概略図を提供する。図２１Ｂは、ホモ接合性標的ＡｐｏＥ遺伝子座を示す。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座及び大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。上パネルは、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応するゲノム領域のゲノム構成を示す。ＡｐｏＥのエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示され、エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。下パネルは、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を改変するためのＬＴＶＥＣを示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座の概略図を提供し、標的化ベクターと標的同種染色体領域との間の相同的組み換えを増強するために大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と一緒に使用される、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ１及びＺＦＮ２）における切断部位を灰色バーで示す。 ３．２ｋｂの欠失と、レポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）ならびに薬物選択カセット（ｈＵｂ−ｎｅｏ）及びマウスＰｒｍ１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子を含む自己欠失カセットの挿入とによって破壊されたラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座を示す。 ３．２ｋｂの欠失と、レポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）ならびにマウスＰｒｍ１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子及び薬物選択カセット（ｈＵｂ−Ｎｅｏ）を含む自己欠失カセットの挿入とによって破壊されたラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の別の図を提供する。 ラットＲａｇ２遺伝子座を改変するためのラットＲａｇ２遺伝子座及び大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。上パネルは、ラットＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２は、点状の灰色影付きで示される単一のエクソンを含む。下パネルは、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ラットのＲａｇ１／Ｒａｇ２遺伝子座、及びＲａｇ２の標的化（Ｒａｇ２の欠失）またはＲａｇ２／Ｒａｇ１の二重標的化（Ｒａｇ２／Ｒａｇ１の欠失）のいずれかによって欠失したゲノム領域のゲノム構造を提供する。 遺伝子座を改変するために使用される、ラットのＲａｇ２及びＲａｇ１遺伝子座ならびに大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。上パネルは、Ｒａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２及びＲａｇ１はそれぞれ、点状の灰色影付きで示される単一のエクソンを含む。下パネルは、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ＩＩ２ｒｇ−／ｙキメララット（パネルＡ〜Ｃ）及び野生型ＤＡラット（パネルＤ〜Ｆ）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＧＦＰ発現ならびにＴ−細胞マーカーＣＤ３（パネルＡ及びＤ）、Ｂ−細胞マーカーＢ２２０（パネルＢ及びＥ）、及びＮＫ細胞マーカーＣＤ１６１ａ（パネルＣ及びＦ）のフローサイトメトリー分析を示す。二重陽性細胞を象限Ｒ８に示す。図２９は、ＩＩ２ｒｇ−／ｙ ＰＢＭＣが成熟リンパ球マーカーを発現しないことを示す。 ＩＩ２ｒｇ−／ｙキメララット（パネルＡ〜Ｃ）及び野生型ＤＡラット（パネルＤ〜Ｆ）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＧＦＰ発現ならびにＴ−細胞マーカーＣＤ３（パネルＡ及びＤ）、Ｂ−細胞マーカーＢ２２０（パネルＢ及びＥ）、及びＮＫ細胞マーカーＣＤ１６１ａ（パネルＣ及びＦ）のフローサイトメトリー分析を示す。二重陽性細胞を象限Ｒ８に示す。図２９は、ＩＩ２ｒｇ−／ｙ ＰＢＭＣが成熟リンパ球マーカーを発現しないことを示す。 ＧＦＰ陽性リンパ球が、３つのＩＩ２ｒｇ−／ｙキメラのうち２つのキメラにおける末梢血中に検出されたことを示す。 ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座の完全ヒト化におけるラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座及び標的化プラスミドの概略図を提供する。上パネルは、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ、灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。下パネルは、標的化プラスミドである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ）は、灰色ボックスで示される。標的化プラスミドは、ヒトＩＬ−２ｒｇゲノム領域、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する欠失カセットを含む。 ラットのＩｌ２ｒｇ遺伝子座の細胞外ドメインヒト化におけるラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座及び標的化プラスミドの概略図を提供する。上パネルは、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ、灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。下パネルは、標的化プラスミドである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ）は、灰色ボックスで示される。標的化プラスミドは、ＩＬ−２Ｒｇゲノム領域のヒト細胞外ドメイン、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ヒトＩＬ−２ｒｇタンパク質（配列番号２０、ＮＰ＿０００１９７．１）、ラットＩＬ−２ｒｇタンパク質（配列番号２１、ＮＰ＿５４３１６５．１）、及びラットＩＬ−２ｒｇタンパク質の残りに融合されたＩＬ−２ｒｇのヒト細胞外ドメインを含むキメラＩＬ−２ｒｇタンパク質（配列番号２２）の配列アライメントを提供する。ヒトＩＬ−２ｒｇとラットＩＬ−２ｒｇとの間の結合を垂直線で示す。 マウスＬｒｐ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＬｒｐ５遺伝子座を下パネルに示す。ヒト化領域は、細胞外ドメインである。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）及びＺＦＮ（ａ〜ｄ）における標的部位を示す。 欠失の大きさが増加するＬＴＶＥＣ標的化遺伝子（図３５Ａ）及びヒト遺伝子の挿入の大きさが増加するＬＴＶＥＣ（図３５Ｂ）の標的化効率の割合（％）を示す。ＬＴＶＥＣを、単独で（灰色四角形または三角形）またはＺＦＮと組み合わせて（黒色四角形または三角形）使用した。 欠失の大きさが増加するＬＴＶＥＣ標的化遺伝子（図３５Ａ）及びヒト遺伝子の挿入の大きさが増加するＬＴＶＥＣ（図３５Ｂ）の標的化効率の割合（％）を示す。ＬＴＶＥＣを、単独で（灰色四角形または三角形）またはＺＦＮと組み合わせて（黒色四角形または三角形）使用した。 マウスＴｒｐａ１遺伝子の全コード領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＴｒｐａ１遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＦｏｌｈ１遺伝子の細胞外ドメイン（エクソン２から終止コドン）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＦｏｌｈ１遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＥ２、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子のエクソン２から終止コドンまでの領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子の全コード領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＥｒｂｂ４遺伝子のエクソン４〜１５のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援のヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスＥｒｂｂ４遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＲｏｒ１遺伝子のエクソン２〜７のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスのＲｏｒ１遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 マウスＤｐｐ４遺伝子のエクソン２から終止コドンの領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援によるヒト化の概略図を提供し、ＬＴＶＥＣを上パネルに示し、マウスのＤｐｐ４遺伝子座を下パネルに示す。矢印は、各ｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）における標的部位を示す。 Ｘ−ｇａｌで染色された１２週齢雌ラットの脳を示す。図４３Ａ〜Ｃは、野生型ラットからの脳を示し、図４３Ｄ〜Ｆは、ＡｐｏＥ＋／−ラットからの脳を示す。図４３Ａ及びＤは背面図を示し、図４３Ｂ及びＥは腹側図を示し、図４３Ｃ及びＦは拡大図を示す。 Ｘ−ｇａｌで染色された１２週齢雌ラットの脳を示す。図４３Ａ〜Ｃは、野生型ラットからの脳を示し、図４３Ｄ〜Ｆは、ＡｐｏＥ＋／−ラットからの脳を示す。図４３Ａ及びＤは背面図を示し、図４３Ｂ及びＥは腹側図を示し、図４３Ｃ及びＦは拡大図を示す。 Ｘ−ｇａｌで染色された１２週齢雌ラットの心臓（Ａ及びＣ）ならびに血管の対応する拡大図（Ｂ及びＤ）を示す。図４４Ａ及びＢは、それぞれ、野生型ラットからの心臓及び血管を示し、図４４Ｃ及びＤは、それぞれ、ＡｐｏＥ＋／−ラットからの心臓及び血管を示す。染色は、心臓の心房及びいくつかの血管（例えば、大静脈）に存在した。 Ｘ−ｇａｌで染色された１２週齢雌ラットの肝臓を示す。図４５Ａ及びＢは、野生型ラットからの肝臓を示し、図４５Ｃ及びＤは、ＡｐｏＥ＋／−ラットからの肝臓を示す。図４５Ｂ及びＤは、肝臓の拡大図である。 ６週間、９週間、１２週間、及び１５週間でのホモ接合性ＡｐｏＥを標的とするラット、ヘテロ接合ＡｐｏＥを標的とするラット、及び野生型ラットにおけるコレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、及びトリグリセリドレベルの検出（それぞれ、図４６Ａ〜Ｄ）を示す。 ラットのＡｐｏＥ遺伝子座（上パネル）、及びラットのＡｐｏＥ遺伝子座（下パネル）を標的とする大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を示す。上パネルは、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応するゲノム領域のゲノム構成を示す。ＡｐｏＥのエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示され、エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。ＡｐｏＥ ｇＲＮＡ２（配列番号８７）及びｇＲＮＡ３（配列番号８８）における標的部位を示す。下パネルは、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を改変するためのＬＴＶＥＣを示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ラットＲａｇ２遺伝子座（上パネル）、及びラットＲａｇ２遺伝子座（下パネル）を標的とする大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を示す。上パネルは、ラットＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２は、点状の灰色影付きで示される単一のエクソンを含む。Ｒａｇ２ ｇＲＮＡ１（配列番号８９）及びｇＲＮＡ４（配列番号９０）における標的部位を示す。下パネルは、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ及びハイグロマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座（上パネル）、及びラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座（下パネル）の細胞外ドメインのヒト化のための標的化プラスミドの概略図を示す。上パネルは、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ、灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｉｌ２ｒｇ ｇＲＮＡ２（配列番号９１）及びｇＲＮＡ４（配列番号９２）における標的部位を示す。下パネルは、標的化プラスミドである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４．３ｋｂ及び４．０ｋｂ）は、灰色ボックスで示される。標的化プラスミドは、ＩＬ−２Ｒｇゲノム領域のヒト細胞外ドメイン、ならびにＣｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。 Ｉｌ２ｒｇが標的となるラットＥＳ細胞（クローンＩｌ２ｒｇ−ＣＧ１２）における遺伝座を改変するために使用される、ラットＲａｇ２及びＲａｇ１遺伝子座ならびに大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を示す。上パネルは、Ｒａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ、灰色ボックス）に対応する同種ゲノム領域のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２及びＲａｇ１はそれぞれ、陰影のない矢印で示される単一のエクソンを含む。下パネルは、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ）は、灰色ボックスによって示される。ＬＴＶＥＣは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離され、アクチンプロモータに作動連結された、レポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）及びピューロマイシン耐性遺伝子を含む。ＬＴＶＥＣは、Ｃｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットをさらに含む。 ヒトｉＰＳ細胞におけるＬＴＶＥＣ及びガイドＲＮＡを用いたマウスＡｄａｍ６ａ遺伝子座及びマウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子座を含む核酸によるヒトＡＤＡＭ６遺伝子座の一部分の置換の概略図を示す。ガイドＲＮＡの標的部位を、矢印によって示す。 ２ｉ培地において８日間培養されたヒトｉＰＳ細胞により示された形態を示す。図５２Ｂは、２ｉ培地において１２日間培養されたヒトｉＰＳ細胞により示された形態を示す。 ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地または低オスモル濃度ＶＧ２ｉ培地において６日間培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す。図５３Ａ及び５３Ｂは、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地（図３Ａ）またはＶＧ２ｉ培地（図５３Ｂ）において６日間培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す。図５３Ｃ及び５３Ｄは、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地（図５３Ｃ）またはＶＧ２ｉ培地（図５３Ｄ）において新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）のフィーダー細胞に６日間培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す。 アルカリホスファターゼに対して染色されたＶＧ２ｉ培地において培養された再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞を示す。図５４Ｂ及び５４Ｃは、ＮＡＮＯＧの発現に対して免疫染色されたＶＧ２ｉ培地において培養された再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞を示す。 ＶＧ２ｉ培地において培養された再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞の酵素解離及び継代培養を示す。図５５Ａは、ＲＯＣＫ阻害剤の不在下でトリプシンによる酵素解離前にＶＧ２ｉ培地において培養された再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞を示す。図５５Ｂは、継代培養後１日間ＶＧ２ｉ培地において培養されたヒトｉＰＳ細胞を示す。図５５Ｃは、継代培養後４日間ＶＧ２ｉ培地において培養されたヒトｉＰＳ細胞を示す。
原核細胞における細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）を介してラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの対象とするゲノム遺伝子座を改変するための組成物及び方法が提供される。対象とするゲノム遺伝子座、例えば、エンドヌクレアーゼと組み合わせ、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を用いた、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウスの対象とするゲノム遺伝子座を遺伝子的に改変するための組成物及び方法も提供される。１つ以上の標的遺伝子改変を含む、遺伝子的に改変された非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、齧歯類、または非ラット齧歯類を生み出すための組成物及び方法も提供される。また、単離されたヒト及び非ヒト全能または多能性幹細胞、特に、インビトロでの連続的遺伝子改変後、多能性を維持することが可能であり、かつ生殖細胞系列を通してそれに続く世代に標的遺伝子改変を伝達することができるラット胚幹細胞も提供される。
用語集
本明細書に使用される「胚幹細胞」または「ＥＳ細胞」という用語は、胚への導入の際に発生中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能または多能性細胞を含む。本明細書に使用される「多能性細胞」という用語は、１つを超える分化した細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。「非多能性細胞」という用語は、多能性細胞ではない細胞を含む。
本明細書に使用される「相同核酸」という用語は、既知の参照配列と同一であるか、または実質的に類似している核酸配列を含む。一実施形態において、「相同核酸」という用語は、既知の参照配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらに１００％同一であるアミノ酸配列を有する配列を特徴付けるために使用される。
本明細書に使用される「オーソロガス核酸」という用語は、別の種において、既知の参照配列と機能的に同等である１つの種からの核酸配列を含む。
本明細書に使用される「大きな標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」という用語は、真核細胞において、相同遺伝子の標的化を行うことを目的とする他のアプローチにより一般に使用されるものよりも大きいクローン化ゲノムＤＮＡの断片に由来する真核細胞における大きな標的化ベクターを含む。ＬＴＶＥＣの例としては、細菌性相同染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に使用される「対立遺伝子の改変」（ＭＯＡ）という用語は、ゲノムにおける遺伝子（複数を含む）または染色体座（複数を含む）の１つの対立遺伝子の正確なＤＮＡ配列の改変を含む。本明細書に記載される「対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）」の例は、単一ヌクレオチドという小さい欠失、置換、もしくは挿入、または対象とする遺伝子（複数を含む）もしくは染色体座（複数を含む）に広がる多くのキロベースの欠失、ならびにこれらの２つの極限間でのあらゆる及びすべての可能な改変が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に使用される「組み換え部位」という用語は、部位特異的リコンビナーゼにより認識され、組み換え事象のための基質として機能し得るヌクレオチド配列を含む。
「連続の」遺伝子改変には、細胞（例えば、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されるヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）に独立して行われた２つ以上の改変が含まれる。第１の改変は、電気穿孔法、または当該技術分野で周知の任意の他の方法により達成され得る。次いで、第２の改変は、好適な第２の核酸構築物を用いる同じ細胞ゲノムに行われる。第２の改変は、第２の電気穿孔法、または当該技術分野で周知の任意の他の方法により達成され得る。様々な実施形態において、同じ細胞の第１及び第２の遺伝子改変後、第３、第４、第５、第６等の連続遺伝子改変（１つのものに続いて別のもの）は、例えば、連続電気穿孔法または当該技術分野で周知の（連続的な）任意の他の好適な方法を用いて達成され得る。
本明細書に使用される「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、２つの組み換え部位が単一の核酸分子内にまたは別々の核酸分子上に物理的に分離される「組み換え部位」間の組み換えを促進し得る一群の酵素を含む。「部位特異的リコンビナーゼ」の例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、及びＤｒｅリコンビナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸配列に関して「生殖細胞系列」という用語は、子孫に継代され得る核酸配列を含む。
「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という表現は、任意の生物からの免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖配列を含む。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインは、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片は、ＣＤＲ、ＣＤＲ、及びＦＲ、ならびにそれらの組み合わせを含む。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモルの範囲のＫＤでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現及び分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、生殖細胞系列中に存在するＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントのレパートリーから誘導されるＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントを一般に含む可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる。様々な生物についてのＶ、Ｄ、及びＪ重鎖セグメントの配置、位置、及び術語体系は、ＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」においてワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上のインターネットを介してアクセス可能なＩＭＧＴデータベース中に見出すことができる。
「軽鎖」という表現には、任意の生物からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限り、ヒトカッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖及びＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインには、一般に、３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインと、軽鎖定常領域アミノ酸配列とが含まれる。軽鎖可変ドメインは、生殖細胞系列中に存在する軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントのレパートリーから誘導される軽鎖ＶＬ及び軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントを一般に含む軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる。様々な生物についての軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの配置、位置、及び術語体系は、ＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」においてワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上のインターネットを介してアクセス可能なＩＭＧＴデータベース中に見出すことができる。軽鎖には、例えば、それらが現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第１のエピトープ及び第２のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖はまた、それらが現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つ以上のエプトープを結合及び認識するもの、または重鎖が結合及び認識するのを補助するものも含まれる。
「作動可能に連結された」という表現には、作動可能に連結された成分が、それらの意図される様式において機能する関係性が含まれる。一例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写調節を保持するように、調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー配列等）に作動可能に連結され得る。一例では、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列は、免疫グロブリン重または軽鎖配列への配列間の適切な組み換えを可能にするように、免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結され得る。
１．核酸を含む標的遺伝子座
標的遺伝子座で少なくとも１つの挿入核酸の組み込みを可能にする様々な方法及び組成物が提供される。本明細書に使用される「対象とするゲノム遺伝子座」は、挿入核酸を組み込みすることを望むゲノム内のＤＮＡの任意のセグメントまたは領域を含む。「対象とするゲノム遺伝子座」及び「対象とする標的ゲノム遺伝子座」という用語は、交換可能に使用することができる。対象とするゲノム遺伝子座は、細胞に対して天然であり得るか、またはあるいは、細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡの異種または外因性セグメントを含み得る。ＤＮＡのそのような異種または外因性セグメントには、トランス遺伝子、発現カセット、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、またはゲノムＤＮＡの異種もしくは外因性領域が含まれ得る。「遺伝子座」という用語は、ゲノムＤＮＡ内のＤＮＡのセグメントとして本明細書に定義される。本明細書に記載される遺伝子改変には、対象とする遺伝子座からの１つ以上の欠失、対象とする遺伝子座の付加、対象とする遺伝子座置換、及び／またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。対象とする遺伝子座には、コード領域または非コード調節領域が含まれ得る。
対象とするゲノム遺伝子座には、例えば、認識部位、選択マーカー、予め組み込まれた挿入核酸、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド、プロモータ等を含む、標的化された組み込み系の任意の成分がさらに含まれ得る。あるいは、対象とするゲノム遺伝子座は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、または適切な宿主細胞中に含まれる任意の他の遺伝子操作されたゲノム領域等の細胞内の染色体外ＤＮＡ内に位置付けられ得る。様々な実施形態において、標的遺伝子座は、原核生物、真核生物、非ラット真核生物、酵母、細菌、非ヒト哺乳動物、非ヒト細胞、齧歯類、非ラット齧歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、赤毛猿）、家畜哺乳動物、もしくは農業用哺乳動物、または対象とする任意の他の生物、またはそれらの組み合わせからの天然、異種、または外因性核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、対象とするゲノム遺伝子座は、ヒト、マウス、またはそれらの組み合わせからの核酸配列を含む。
特定の実施形態において、標的遺伝子座は、例えば、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞からのものである。
特定の実施形態において、対象とするゲノム遺伝子座は、「ラット核酸」の標的遺伝子座を含む。そのような領域は、細胞のゲノム内に組み込まれるラットからの核酸を含む。標的遺伝子座の非限定的な例としては、Ｂ細胞において発現されたタンパク質をコードするゲノム遺伝子座、未成熟Ｂ細胞においてポリペプチドを発現するゲノム遺伝子座、成熟Ｂ細胞においてポリペプチドを発現するゲノム遺伝子座、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座、または例えばＴ細胞受容体アルファ遺伝子座を含むＴ細胞受容体遺伝子座が挙げられる。標的ゲノム遺伝子座のさらなる例としては、Ｆｃｅｒ１ａ遺伝子座、Ｔｌｒ４遺伝子座、Ｐｒｌｒ遺伝子座、Ｎｏｔｃｈ４遺伝子座、Ａｃｃｎ２遺伝子座、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｌｒｐ５遺伝子座、例えばＩＬ２受容体ガンマ（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子座を含むＩＬ２受容体遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１／Ｒａｇ２遺伝子座、及びＥｒｂｂ４遺伝子座が挙げられる。任意のそのような標的遺伝子座は、ラットからのものであり得るか、または真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、もしくは非ヒト哺乳動物細胞からのものであり得る。
一実施形態において、標的遺伝子座は、哺乳動物免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態において、標的遺伝子座は、ラット免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態において、標的遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された再配列されないラット、マウス、またはヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含むゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるラット、マウス、またはヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列である。一実施形態において、重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。一実施形態において、標的遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された再配列されたラット、マウス、またはヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態において、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組み合わせから選択されるラット、マウス、またはヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列である。一実施形態において、重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。
一実施形態において、標的遺伝子座は、哺乳動物免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノムＤＮＡ配列は、再配列されない哺乳動物λ及び／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。
一実施形態において、ゲノムＤＮＡ配列は、再配列される哺乳動物λ及び／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態において、再配列されないλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列は、λ軽鎖定常領域の核酸配列及びκ軽鎖定常領域の核酸配列から選択される哺乳動物免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される。一実施形態において、哺乳動物免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列は、ラット免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列である。一実施形態において、哺乳動物免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列は、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列である。一実施形態において、哺乳動物免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列である。
本明細書に使用されるＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座は、これらの遺伝子または遺伝子組み換えのそれぞれが位置付けられるゲノム（すなわち、哺乳動物ゲノム、ヒトゲノム、もしくは非ヒト哺乳動物ゲノム）のそれぞれの領域を含む。ＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座（すなわち、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／または組み合わせたＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座）のうちのいずれか１つの改変は、所与の遺伝子座への任意の所望の変化を含み得る。所与の遺伝子座（すなわち、哺乳動物、ヒト、または非ヒト哺乳動物の遺伝子座）への改変の非限定的な例は、本明細書にさらに詳細に論じられる。
例えば、特定の実施形態において、ＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座（すなわち、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＡｐｏＥ遺伝子座、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＲａｇ２遺伝子座、ならびに／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座）のうちの１つ以上は、コードされたＡｐｏＥタンパク質またはインターロイキン−２受容体ガンマタンパク質またはＲａｇ１タンパク質またはＲａｇ２タンパク質またはＲａｇ１及びＲａｇ２タンパク質の組み合わせの活性及び／またはレベルが低下するように改変される。他の実施形態において、ＡｐｏＥタンパク質、インターロイキン−２受容体ガンマタンパク質、Ｒａｇ１タンパク質、またはＲａｇ２タンパク質、またはＲａｇ１及びＲａｇ２タンパク質の組み合わせの活性はない。
「低下する」とは、対象とする遺伝子座でコードされる遺伝子及び／またはタンパク質のレベルまたは活性の任意の低下が意図される。例えば、活性の低下は、（１）所与のタンパク質（すなわち、ＡｐｏＥ、インターロイキン−２受容体ガンマ、Ｒａｇ２、Ｒａｇ２、またはＲａｇ１及びＲａｇ２の組み合わせ）の全体レベルまたは活性の統計的に有意な低下のいずれかを含むことができ、これには、例えば、適切な対照と比較したときに、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、またはそれを超える低下したレベルまたは活性を含む。ＡｐｏＥ、インターロイキン−２受容体ガンマ、Ｒａｇ１、及びＲａｇ２のうちのいずれかの濃度及び／または活性の低下についてアッセイする方法は、当該技術分野で周知である。
他の実施形態において、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＡｐｏＥ遺伝子座、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＲａｇ２遺伝子座、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＲａｇ１遺伝子座、及び／または哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座のうちの１つ以上は、コードされたＡｐｏＥポリペプチド、インターロイキン−２受容体ガンマポリペプチド、Ｒａｇ２ポリペプチド、Ｒａｇ１ポリペプチド、またはＲａｇ１及びＲａｇ２ポリペプチドの両方の活性及び／またはレベルが増加するような改変を含む。「増加する」とは、対象とする遺伝子座でコードされる遺伝子／ポリペプチドのレベルまたは活性の任意の増加が意図される。例えば、活性の増加は、（１）所与のタンパク質（すなわち、ＡｐｏＥ、インターロイキン−２受容体ガンマ、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２、またはＲａｇ１及びＲａｇ２）の全体レベルまたは活性の統計的に有意な増加のいずれかを含むことができ、これには、例えば、適切な対照と比較したときに、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、またはそれを超える増加したレベルまたは活性を含む。ＡｐｏＥ、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２、及びインターロイキン−２受容体ガンマタンパク質のうちのいずれかの濃度及び／または活性の増加についてアッセイする方法は、当該技術分野で周知である。
哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＡｐｏＥ遺伝子座、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＲａｇ２遺伝子座、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＲａｇ１遺伝子座、及び／または哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座への遺伝子改変は、ゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ゲノム遺伝子座での外因性核酸の挿入、またはそれらの組み合わせを含み得る。欠失及び／または挿入は、本明細書の他の箇所で論じられる所与の遺伝子座内のどこにでも生じ得る。
本明細書に提供されるさらなる実施形態は、ＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分の、別の生物からのＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の対応する相同またはオーソロガス部分による置換を通した、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の改変を含む。
さらに他の実施形態において、哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座のうちの１つ以上の改変は、ＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分の、その全長にわたって、それが置換するＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％共有する挿入ポリヌクレオチドによる置換を通して行われる。
所与の挿入ポリヌクレオチド及び／または欠失遺伝子座の対応する領域は、コード領域、イントロン、エクソン、非翻訳領域、調節領域、プロモータ、もしくはエンハンサー、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらの任意の一部分であり得る。さらに、所与の挿入ポリヌクレオチド及び／または例えば欠失遺伝子座の領域は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド長、１００〜５００ヌクレオチド長、５００〜１ｋｂヌクレオチド長、１ｋｂ〜１．５ｋｂヌクレオチド長、１．５ｋｂ〜２ｋｂヌクレオチド長、２ｋｂ〜２．５ｋｂヌクレオチド長、２．５ｋｂ〜３ｋｂヌクレオチド長、３ｋｂ〜５ｋｂヌクレオチド長、５ｋｂ〜８ｋｂヌクレオチド長、８ｋｂ〜１０ｋｂヌクレオチド長、はまたそれよりも長いヌクレオチド長を含む任意の所望の長さのものであり得る。他の例では、挿入または置換の大きさは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜１Ｍｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂである。他の実施形態において、所与の挿入ポリヌクレオチド及び／または欠失遺伝子座の領域は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、またはそれを超える。他の実施形態において、所与の挿入ポリヌクレオチド及び／または欠失遺伝子座の領域は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂ、またはそれを超える。
所与の挿入ポリヌクレオチドは、例えば、齧歯類、非ラット齧歯類、ラット、マウス、ハムスター、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、真核生物、非ラット真核生物、ヒト、農業用動物、または家畜を含む、任意の生物からのものであり得る。
本明細書にさらに詳細に論じられるように、様々な方法は、例えば、ＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ（Ｉｌ２ｒｇ）遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座における標的改変を含む、対象とする任意の遺伝子座の標的改変を生じるように提供される。インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座で欠失、挿入、置換、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含む、遺伝子的に改変された非ヒト動物、遺伝子的に改変された非ヒト哺乳動物、遺伝子的に改変された非ラット真核生物、遺伝子的に改変された非多能性細胞、または遺伝子的に改変された多能性細胞（例えば、多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、またはヒトｉＰＳ細胞）がさらに提供される。そのような遺伝子改変（標的遺伝子座の活性の不在、低下、増加、または調節をもたらすものを含む）はまた、生殖細胞系列を通して伝達することができる。特定の実施形態において、遺伝子改変は、所望の標的遺伝子座のノックアウトをもたらす。そのような非ヒト動物は、例えば、本明細書の他の箇所で論じられるように、様々な実験系での使用を見出す。
例えば、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）ノックアウトは、プラーク形成、転写変化（全トランスクリプトームショットガン配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）、及びエクスビボ機能が挙げられるが、これらに限定されない、内皮機能を研究するための動物モデルを提供する。ＡｐｏＥは、重要な輸送分子であり、血流を通してコレステロール等の脂質を輸送することができる。ＡｐｏＥはまた、例えば、脳からβ−アミロイドを除去するように神経系で機能することもできる。ＡｐｏＥにおける改変は、例えば、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、及びアルツハイマー病を含む、様々な状態に関連づけられている。ＡｐｏＥノックアウト動物は、血液からのリポタンパク質の除去機能低下を示し、アテローム性動脈硬化症を発症する。したがって、ＡｐｏＥノックアウト動物は、例えば、内皮機能、プラーク形成、転写変化（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、及びアルツハイマー病等の状態及び／またはプロセスを研究するためのモデルを提供する。ＡｐｏＥ活性を測定するためのアッセイは、当該技術分野で周知である。例えば、ＡｐｏＥ活性の低下は、ＥＬＩＳＡまたは免疫ブロット法等の免疫学的検定により、対象から得られた血液試料中のＡｐｏＥレベルの低下についてアッセイすることにより測定され得る。さらに、ラットの大きなサイズは、これらのアッセイすべてを容易にし、データの質を改善する。
ＲＡＧ１（組み換え活性化遺伝子１）及びＲＡＧ２（組み換え活性化遺伝子２）は、ＶＤＪ組み換え活性を有するマルチサブユニット複合体の一部であり、リンパ球において、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体遺伝子の再配列及び組み換えに重要な役割を果たす酵素である。ＲＡＧ１及びＲＡＧ２は、Ｔ細胞受容体及びＢ細胞受容体（すなわち、免疫グロブリン）遺伝子のセグメントの組み換え及び接合を促進するように二本鎖ＤＮＡ開裂を誘導する。ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２のノックアウトは、Ｂ細胞及びＴ細胞の損失を生じ、重度の免疫欠損を引き起こす。ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２ノックアウト動物は、例えば、異種移植片（すなわち、ラットにおけるヒト細胞異種移植片）、癌、ワクチン開発、自己免疫疾患、感染病、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の研究での使用を見出す。ＲＡＧ１及び／またはＲＡＧ２活性を測定するための様々なアッセイが当該技術分野で周知であり、例えば、対象における組み換え効率を測定すること、またはＢ細胞及び／またはＴ細胞の有無についてアッセイすることを含む。
ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）は、ある特定の免疫細胞の表面上に発現し、サイトカインインターロイキン−２（ＩＬ−２）と結合する。ＩＬ−２Ｒは、アルファ鎖（ＩＬ−２Ｒａ、ＣＤ２５）、ベータ鎖（ＩＬ−２Ｒｂ、ＣＤ１２２）、及びガンマ鎖（ＩＬ２−Ｒｇ、ＣＤ１３２）を含む少なくとも３つの別々のサブユニット鎖を含む内在性膜タンパクである。ＩＬ−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γまたはＩＬ２Ｒｇとも称する）鎖は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の受容体を含む様々なサイトカイン受容体により共有される共通のガンマ鎖である。ＩＬ−２Ｒｇは、リガンドの結合に寄与する細胞の細胞外表面上に細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル変換経路を誘導するように様々な分子と相互作用し得る細胞内ドメインと、を含む。Ｉｌ２ｒｇ遺伝子は、哺乳動物においてＸ−染色体上に見出され、ヒトにおいてガンマ鎖のある特定の突然変異が重度のＴ細胞欠乏を特徴とするヒトＸ−連鎖重症複合免疫不全（ＸＳＣＩＤ）を引き起こし得る。さらに、ガンマ鎖の細胞外ドメインは、膜貫通受容体から流出し、可溶性ガンマ鎖受容体として放出され得る。可溶性ガンマ鎖受容体は、対象の血液中で検出され得、サイトカインシグナル伝達を調節するように機能し得る。
いくつかの実施形態において、非ヒトＩＬ−２Ｒｇ鎖は、遺伝子的に改変された動物が完全なヒトＩＬ−２Ｒｇ鎖を発現するように、ヒトＩＬ２−Ｒｇ鎖で置き換えられる。他の例では、非ヒトＩＬ−２Ｒｇ鎖の細胞外ドメインのみをヒトＩＬ−２Ｒｇ鎖の細胞外ドメインと置換することは、有用であり得る。そのような場合、非ヒトにおいて発現される結果として得られたヒト化ＩＬ−２Ｒｇ鎖は、ヒト細胞外ドメインを含み、分子の残りは、天然の生物からものである。
ＩＬ−２Ｒｇの完全長ヒト化は、この改変遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物がヒトＩＬ−２Ｒｇを生成するため、有用である。これにより、ヒトＩＬ−２Ｒｇに特異的な抗体を有する非ヒト哺乳動物におけるヒトＩＬ−２Ｒｇの検出を可能にする。細胞外のヒト化（すなわち、非ヒト哺乳動物ＩＬ−２Ｒｇの細胞外ドメインをヒトＩＬ−２Ｒｇの細胞外ドメインと置換すること）により、ＩＬ２−Ｒｇのヒトリガンドと結合するＩＬ−２Ｒｇポリペプチドをもたらすが、細胞質ドメインが依然として非ヒト哺乳動物由来であるため、ＩＬ−２Ｒｇの細胞外のヒト化形態もまた、非ヒト哺乳動物のシグナル伝達機構と相互作用するであろう。
２．標的遺伝子座の改変
Ａ．標的化ベクター及び挿入核酸
ｉ．挿入核酸
本明細書に使用される「挿入核酸」は、標的遺伝子座で組み込みすることを望むＤＮＡのセグメントを含む。一実施形態において、挿入核酸は、対象とする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、挿入核酸は、１つ以上の発現カセットを含み得る。所与の発現カセットは、対象とするポリヌクレオチド、発現に影響を及ぼす様々な調節成分とともに選択マーカー及び／またはレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。挿入核酸内に含まれ得る、対象とするポリヌクレオチド、選択マーカー、及びレポーター遺伝子の非限定的な例は、本明細書の他の箇所で詳細に論じられる。
特定の実施形態において、挿入核酸は、ゲノムＤＮＡのセグメント、ｃＤＮＡ、調節領域、またはそれらの任意の部分もしくは組み合わせを含み得る、ラットからの核酸を含み得る。他の実施形態において、挿入核酸は、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、ヒト、非ヒト哺乳動物、齧歯類、非ラット齧歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、赤毛猿）、家畜哺乳動物、または農業用哺乳動物、または対象とする任意の他の生物からの核酸を含み得る。本明細書にさらに詳細に概説されるように、様々な方法及び組成物に用いられる挿入核酸は、対象とする標的遺伝子座の「ヒト化」をもたらし得る。
一実施形態において、挿入核酸は、内在性遺伝子の少なくとも１つのエクソンのノックイン対立遺伝子を含む。一実施形態において、挿入核酸は、内在性遺伝子全体のノックイン対立遺伝子を含む（すなわち、「遺伝子交換ノックイン」）。
一実施形態において、挿入核酸は、例えば、プロモータ、エンハンサー、または転写リプレッサー結合因子を含む調節因子を含む。
さらなる実施形態において、挿入核酸は、条件付き対立遺伝子を含む。一実施形態において、条件付き対立遺伝子は、米国特許第ＵＳ２０１１／０１０４７９９号（これは参照によりその全体が組み込まれる）に記載される、多機能性対立遺伝子である。特定の実施形態において、この条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の発動配列、及びセンスまたはアンチセンス配向の薬物選択カセット、（ｂ）アンチセンス配向の、対象とするヌクレオチド配列（ＮＳＩ）及び反転モジュールにより条件的（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロン及び反転可能なジーントラップ様モジュールを利用する、例えば、米国特許第ＵＳ２０１１／０１０４７９９号を参照されたく、これは参照によりその全体が組み込まれる）、ならびに（ｃ）第１のリコンビナーゼへの曝露の際に組み換わって、（ｉ）発動配列及びＤＳＣを欠き、かつ（ｉｉ）センス配向でＮＳＩ及びアンチセンス配向でＣＯＩＮを含有する、条件付き対立遺伝子を形成する、組み換え可能な単位、を含む。
挿入核酸は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ。
一実施形態において、挿入核酸は、例えば、約１ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２ｋｂ〜約２０ｋｂ、または約０．５ｋｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、または非ヒト哺乳動物細胞ゲノムＤＮＡ配列の欠失を含む。一実施形態において、ゲノムＤＮＡ配列の欠失の程度は、５’相同性アーム及び３’相同性アームの全長よりも大きい。一実施形態において、ゲノムＤＮＡ配列の欠失の程度は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ。
一実施形態において、挿入核酸は、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物、ヒト、または非ヒト哺乳動物核酸配列の挿入またはこれらの相同またはオーソロガスヒト核酸配列による置換を含む。一実施形態において、挿入核酸は、対応するＤＮＡ配列を含む内因性遺伝子座でＤＮＡ配列の挿入またはＤＮＡ配列の相同またはオーソロガスヒト核酸配列による置換を含む。
一実施形態において、遺伝子改変は、核酸配列の付加である。一実施形態において、付加されたヌクレオチド配列は、５ｋｂ〜２００ｋｂの範囲に及ぶ。
一実施形態において、挿入核酸は、コード配列において遺伝子改変を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、コード配列の欠失突然変異体を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、２つの内因性コード配列の融合を含む。
一実施形態において、挿入核酸は、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物、ヒト、または非ヒト哺乳動物、核酸配列の挿入またはこれらの相同またはオーソロガスヒト核酸配列による置換を含む。一実施形態において、挿入核酸は、対応するラットＤＮＡ配列を含む内因性ラット遺伝子座でラットＤＮＡ配列の挿入またはラットＤＮＡ配列の相同またはオーソロガスヒト核酸配列による置換を含む。
一実施形態において、遺伝子改変は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。一実施形態において、非タンパク質コード配列の欠失は、調節要素の欠失を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、プロモータの欠失を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、プロモータまたは調節要素の付加を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、プロモータまたは調節要素の置換を含む。
一実施形態において、標的化ベクターの核酸配列は、ゲノムに組み込まれるとき、哺乳動物、ヒト、または非ヒト哺乳動物のＡｐｏＥ遺伝子座の領域の遺伝子改変を生じるポリヌクレオチドを含み、ＡｐｏＥ遺伝子座での遺伝子改変は、ＡｐｏＥ活性の低下、ＡｐｏＥ活性の増加、またはＡｐｏＥ活性の調節をもたらす。一実施形態において、ＡｐｏＥノックアウト（「ヌル対立遺伝子）が作製される。
一実施形態において、標的化ベクターの核酸配列は、ゲノムへの組み込みが哺乳動物、ヒト細胞、または非ヒト哺乳動物のインターロイキン−２受容体遺伝子座の領域の遺伝子改変を生じるとき、インターロイキン−２受容体座で遺伝子改変は、インターロイキン−２受容体活性を低下させるポリヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、インターロイキン−２受容体ノックアウト（「ヌル対立遺伝子」）が作製される。
さらなる実施形態において、挿入核酸は、哺乳動物、ヒト細胞、または非ヒト哺乳動物のＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座及び／またはＲａｇ２遺伝子座、及び／またはＲａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分の、別の生物からのＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の対応する相同またはオーソロガス部分による置換をもたらす。
さらに他の実施形態において、挿入核酸は、その全長にわたって、それが置換するＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％共有するポリヌクレオチドを含む。
所与の挿入ポリヌクレオチド及び哺乳動物、ヒト細胞、または非ヒト哺乳動物の置換される遺伝子座の対応する領域は、コード領域、イントロン、エクソン、非翻訳領域、調節領域、プロモータ、もしくはエンハンサー、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。さらに、所与の挿入ポリヌクレオチド及び／または哺乳動物、ヒト細胞、もしくは非ヒト哺乳動物の欠失遺伝子座の領域は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド長、１００〜５００ヌクレオチド長、５００〜１ｋｂヌクレオチド長、１ｋｂ〜１．５ｋｂヌクレオチド長、１．５ｋｂ〜２ｋｂヌクレオチド長、２ｋｂ〜２．５ｋｂヌクレオチド長、２．５ｋｂ〜３ｋｂヌクレオチド長、３ｋｂ〜５ｋｂヌクレオチド長、５ｋｂ〜８ｋｂヌクレオチド長、８ｋｂ〜１０ｋｂヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長を含む任意の所望の長さのものであり得る。他の例では、挿入または置換の大きさは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂである。他の実施形態において、所与の挿入ポリヌクレオチド及び／または哺乳動物、ヒト細胞、もしくは非ヒト哺乳動物の欠失遺伝子座の領域は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、もしくは９００ヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、もしくはそれを超える。
一実施形態において、プロモータは、構成的に活性なプロモータである。
一実施形態において、このプロモータは、誘導プロモータである。一実施形態において、誘導プロモータは、化学的に調節されたプロモータである。一実施形態において、化学的に調節されたプロモータは、アルコール調節プロモータである。一実施形態において、アルコール調節プロモータは、アルコール脱水素酵素（ａｌｃＡ）遺伝子プロモータである。一実施形態において、化学的に調節されたプロモータは、テトラサイクリン調節プロモータである。一実施形態において、テトラサイクリン調節プロモータは、テトラサイクリン応答性プロモータである。一実施形態において、テトラサイクリン調節プロモータは、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）である。一実施形態において、テトラサイクリン調節プロモータは、ｔｅｔ−Ｏｎプロモータである。一実施形態において、テトラサイクリン調節プロモータは、ｔｅｔ−Ｏｆｆプロモータである。一実施形態において、化学的に調節されたプロモータは、ステロイド調節プロモータである。一実施形態において、ステロイド調節プロモータは、ラットのグルココルチコイド受容体のプロモータである。一実施形態において、ステロイド調節プロモータは、エストロゲン受容体のプロモータである。一実施形態において、ステロイド調節プロモータは、エクジソン受容体のプロモータである。一実施形態において、化学的に調節されたプロモータは、金属調節プロモータである。一実施形態において、金属調節プロモータは、金属タンパク質プロモータである。一実施形態において、誘導プロモータは、物理的に調節されたプロモータである。一実施形態において、物理的に調節されたプロモータは、温度調節されたプロモータである。一実施形態において、温度調節されたプロモータは、熱ショックプロモータである。一実施形態において、物理的に調節されたプロモータは、光調節プロモータである。一実施形態において、光調節プロモータは、光誘導プロモータである。一実施形態において、光調節プロモータは、光抑制性プロモータである。
一実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータである。一実施形態において、プロモータは、ニューロン特異的プロモータである。一実施形態において、プロモータは、グリア特異的プロモータである。一実施形態において、プロモータは、筋細胞特異的プロモータである。一実施形態において、プロモータは、心臓細胞特異的プロモータである。一実施形態において、プロモータは、腎細胞特異的プロモータである。一実施形態において、プロモータは、骨細胞特異的プロモータである。一実施形態において、プロモータは、内皮細胞特異的プロモータである。一実施形態において、プロモータは、免疫細胞特異的プロモータである。一実施形態において、免疫細胞プロモータは、Ｂ細胞プロモータである。一実施形態において、免疫細胞プロモータは、Ｔ細胞プロモータである。
一実施形態において、プロモータは、発達的に調節されたプロモータである。一実施形態において、発達的に調節されたプロモータは、発達の胚形成期間中のみ活性である。一実施形態において、発達的に調節されたプロモータは、成熟細胞中のみ活性である。
特定の実施形態において、プロモータは、細胞型に基づいて選択されてもよい。したがって、様々なプロモータは、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞での使用を見出す。
いくつかの実施形態において、挿入核酸は、部位特異的組み換え標的配列が隣接する核酸を含む。挿入核酸全体は、そのような部位特異的組み換え標的配列が側面に位置し得るが、挿入核酸内の対象とする任意の領域または個々のポリヌクレオチドもまた、そのような部位が位置し得ることが認識される。部位特異的リコンビナーゼは、リコンビナーゼポリペプチドを細胞に導入すること、または部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すること等を含む、任意の手段により細胞に導入され得る。部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、挿入核酸内または別々のポリヌクレオチド内に位置し得る。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、誘導プロモータ、細胞に内在するプロモータ、細胞に対して異種であるプロモータ、細胞特異的プロモータ、組織特異的プロモータ、または発達段階特異的プロモータを含む、細胞において活性なプロモータに作動可能に連結され得る。挿入核酸において、挿入核酸または対象とする任意のポリヌクレオチドが側面に位置し得る部位特異的組み換え標的配列には、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、及びそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、部位特異的組み換え部位は、挿入核酸内に含まれる選択マーカー及び／またはレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドが隣接する。そのような例において、標的遺伝子座で挿入核酸を組み込みした後、部位特異的組み換え部位間の配列が除去され得る。
一実施形態において、挿入核酸は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。選択マーカーは、選択カセットに含まれ得る。そのような選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、もしくは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞、ラット細胞、多能性ラット細胞、ＥＳラット細胞、真核細胞、非ラット真核細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞において活性なプロモータに作動可能に連結される。対象とするポリヌクレオチドを標的遺伝子座に連続的にタイリングするとき、選択マーカーは、上記に概説されるように、ヌクレアーゼ剤に対して組み換え部位を含み得る。一実施形態において、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、部位特異的組み換え標的配列が隣接する。
挿入核酸は、プロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子をさらに含み得、このレポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、エメラルド、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、紺碧色、Ｔ−サファイア、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及び／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、またはそれらを含むレポータータンパク質をコードする。そのようなレポーター遺伝子は、細胞において活性なプロモータに作動可能に連結され得る。そのようなプロモータは、誘導プロモータ、レポーター遺伝子もしくは細胞に内在するプロモータ、レポーター遺伝子もしくは細胞に対して異種であるプロモータ、細胞特異的プロモータ、組織特異的プロモータ、または発達段階特異的プロモータであり得る。
一実施形態において、核酸の挿入は、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋肉系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、またはそれらの組み合わせで発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む哺乳動物の核酸を含むことができる。一実施形態において、哺乳動物の核酸は、骨髄または骨髄由来細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、核酸は、脾臓細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。
一実施形態において、哺乳動物の核酸は、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋肉系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、またはそれらの組み合わせで発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、哺乳動物の核酸は、骨髄または骨髄由来細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、核酸は、脾臓細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、マウスゲノムＤＮＡ配列、ラットゲノムＤＮＡ配列、真核性ゲノムＤＮＡ配列、非ラット真核性ゲノムＤＮＡ配列、哺乳動物ゲノムＤＮＡ配列、ヒトゲノムＤＮＡ配列、もしくは非ヒトＤＮＡ配列哺乳動物、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、ラット及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、マウス及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、マウス及びラットゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、ラット、マウス、及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、マウスゲノムＤＮＡ配列、ラットゲノムＤＮＡ配列、ハムスターゲノムＤＮＡ配列、ヒトゲノムＤＮＡ配列、真核性ゲノムＤＮＡ配列、非ラット真核性ゲノムＤＮＡ配列、哺乳動物ゲノムＤＮＡ配列、もしくは非ヒトＤＮＡ配列哺乳動物、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、ラット及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、マウス及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、マウス及びラットゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、ラット、マウス、及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。
一実施形態において、遺伝子改変は、ヒト遺伝子の少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態において、ヒト疾患は、神経疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、心臓血管疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、腎疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、筋肉疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、血液疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、癌である。一実施形態において、ヒト疾患は、免疫系疾患である。
一実施形態において、ヒト疾患対立遺伝子は、優性対立遺伝子である。一実施形態において、ヒト疾患対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。一実施形態において、ヒト疾患対立遺伝子は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含む。
一実施形態において、遺伝子改変は、結合特性の変化、局在変化、発現変化、及び／または発現パターンの変化を有するタンパク質の突然変異形態を生み出す。
一実施形態において、挿入核酸は、選択カセットを含む。一実施形態において、選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、ラットＥＳ細胞において活性なプロモータに作動可能に連結される。一実施形態において、選択マーカーは、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子から選択されるか、またはそれらを含む。
一実施形態において、核酸は、Ｂ細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、核酸は、未成熟Ｂ細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、核酸は、成熟Ｂ細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。
一実施形態において、挿入核酸は、調節要素を含む。一実施形態において、調節要素は、プロモータである。一実施形態において、調節要素は、エンハンサーである。一実施形態において、調節要素は、転写レプレッサー結合要素である。
一実施形態において、遺伝子改変は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。一実施形態において、非タンパク質コード配列の欠失は、調節要素の欠失を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、調節要素の欠失を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、プロモータまたは調節要素の付加を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、プロモータまたは調節要素の置換を含む。
ｉｉ．発現カセット
本明細書に提供される対象とするゲノム組み込みシステム（すなわち、ヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入核酸、対象とするポリヌクレオチド、標的化ベクター、選択マーカー、及び他の成分のうちのいずれか１つまたはそれらの任意の組み合わせ）で用いられる様々な成分を含む、ポリヌクレオチドまたは核酸分子が本明細書に提供される。
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、及び「核酸断片」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、任意に、合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物のうちの１つ以上のセグメントからなってもよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含むことができ、リボヌクレオチドは、天然分子及び合成類似体の両方、ならびにこれらの任意の組み合わせを含む。本明細書に提供されるポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムアンドループ構造等を含むが、これらに限定されない、配列のすべての形態も包含する。
対象とするゲノム組み込みシステムの様々な成分を含む組み換えポリヌクレオチドがさらに提供される。「組み換えポリヌクレオチド」及び「組み換えＤＮＡ構築物」という用語は、本明細書で同義的に使用される。組み換え構築物は、自然界に一緒には見られない、調節配列及びコード配列等の核酸配列の人為的または異種の組み合わせを含む。他の実施形態において、組み換え構築物は、異なる起源に由来する調節配列及びコード配列、または同じ起源に由来するが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される調節配列及びコード配列を含んでもよい。そのような構築物は、それ自体を使用してもよく、またはベクターと組み合わせて使用してもよい。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法によって異なる。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。本明細書に提供される単離された核酸断片のうちのいずれかを含む宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択し、増殖するために必要とされる遺伝子要素もまた、提供される。スクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載される対象とするゲノム組み込みシステムの成分のうちの１つ以上は、原核細胞、真核細胞、非ラット真核細胞、細菌、酵母細胞、もしくは哺乳動物細胞、または対象とする他の生物もしくは細胞型における発現のための発現カセットで提供される。このカセットは、本明細書に提供されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含むことができる。「作動可能に連結された」は、作動可能に連結された成分が、それらの意図される様式において機能する関係性が含まれる。例えば、対象とするポリヌクレオチドと調節配列との間の作動可能な連結（すなわち、プロモータ）は、対象とするポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な連結である。作動可能に連結された要素は、継続であっても、不継続であってもよい。２つのタンパク質コード領域の結合を指すために使用されるとき、作動可能に連結されたとは、コード領域が同じリーディングフレーム中にあることを意味する。別例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写調節を保持するように、調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー配列等）に作動可能に連結され得る。一例では、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列は、免疫グロブリン重または軽鎖配列への配列間の適切な組み換えを可能にするように、免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結され得る。
カセットは、生物に共導入される対象とする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドをさらに含み得る。あるいは、対象とするさらなるポリヌクレオチドは、複数の発現カセット上に提供され得る。調節領域の転写調節下での組み換えポリヌクレオチドの挿入に対して複数の制限部位及び／または組み換え部位を有するような発現カセットが、提供される。発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含有し得る。
発現カセットは、５’から３’方向への転写、転写及び翻訳開始領域（すなわち、プロモータ）、本明細書に提供される組み換えポリヌクレオチド、ならびに哺乳動物細胞または対象とする宿主細胞に機能的な転写及び翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含むことができる。調節領域（すなわち、プロモータ、転写調節領域、及び翻訳終結領域）ならびに／または本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞にまたは互いに天然／類似であり得る。あるいは、調節領域及び／または本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞にまたは互いに異種であり得る。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータは、ポリヌクレオチドが由来した種とは異なる種からのものであるか、または同じ／類似の種由来である場合、一方または両方は、それらの原型及び／もしくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されるか、またはプロモータは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドに対して天然のプロモータではない。あるいは、調節領域及び／または本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、完全に合成され得る。
この終結領域は、転写開始領域を含んで天然であり得、作動可能に連結された組み換えポリヌクレオチドを含んで天然であり得、宿主細胞を含んで天然であり得るか、またはプロモータ、組み換えポリヌクレオチド、宿主細胞、もしくはそれらの任意の組み合わせとは別の起源（すなわち、外来または異種）から由来し得る。
発現カセットを調製する際に、適切な配向でＤＮＡ配列を提供するように、様々なＤＮＡ断片を操作してもよい。このような目的で、アダプターまたはリンカーを、ＤＮＡ断片を連結させるために用いてもよく、または好都合な制限部位の供給、過剰なＤＮＡの除去、制限部位の除去等を行うために他の操作を含んでもよい。この目的のために、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転位及びトランスバージョンが行われてもよい。
多くのプロモータが、本明細書に提供される発現カセットに使用することができる。このプロモータは、所望の結果に基づいて選択することができる。対象とするポリヌクレオチドの発現のタイミング、位置、及び／またはレベルを調節するために、発現カセットにおける異なるプロモータの使用によって異なる用途が強化され得ることが認識される。そのような発現構築物はまた、必要に応じて、プロモータ調節領域（例えば、誘発可能な、構成的、環境的に、または発達的に調節されるか、または細胞もしくは組織特異的／選択的発現を付与する）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位、及び／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。
本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含む発現カセットはまた、形質転換細胞の選択のために選択マーカー遺伝子を含むこともできる。選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織の選択に利用される。
必要に応じて、方法及び組成物に用いられる配列（すなわち、対象とするポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ剤等）は、細胞における発現増加のために最適化され得る。つまり、遺伝子は、例えば、改善された発現のために、哺乳動物優先コドン、ヒト優先コドン、齧歯類優先コドン、非ラット齧歯類優先コドン、マウス優先コドン、ラット優先コドン、ハムスター優先コドン等を含む、対象とする所与の細胞において優先されるコドンを用いて合成することができる。
本明細書に提供される様々な方法及び組成物は、選択マーカーを用いることができる。様々な選択マーカーは、本明細書に開示される方法及び組成物において使用することができる。そのような選択マーカーは、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ネオマイシン、またはピューロマイシン等の抗生物質への耐性を与えることができる。そのような選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、及びブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）が挙げられる。さらに他の実施形態において、選択マーカーは、誘導プロモータに作動可能に連結され、選択マーカーの発現が細胞に対して毒性がある。そのような選択マーカーの非限定的な例としては、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）が挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞において活性なプロモータに作動可能に連結される。
ｉｉｉ．標的化ベクター
標的化ベクターは、挿入核酸を、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの核酸の標的遺伝子に導入するために用いられる。標的化ベクターは、挿入核酸を含み、挿入核酸が隣接する５’及び３’相同性アームをさらに含む。挿入核酸が隣接する相同性アームは、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの核酸の標的遺伝子座内の領域に対応する。参照の便宜上、標的ゲノム遺伝子座内の対応する同族ゲノム領域は、本明細書では「標的部位」と称される。例えば、標的化ベクターは、第１及び第２の標的部位に相補的な第１及び第２の相同性アームが隣接する第１の挿入核酸を含み得る。したがって、標的化ベクターは、それにより、相同性アームと細胞のゲノム内で相補的な標的部位との間に生じる相補的組み換え事象を通して、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの核酸の標的遺伝子座への挿入核酸の組み込みに役立つ。
一実施形態において、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの核酸の標的遺伝子座は、５’相同性アームに相補的な第１の核酸配列及び３’相同性アームに相補的な第２の核酸配列を含む。一実施形態において、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも５ｋｂだけ離れている。別の実施形態において、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも５ｋｂであるが２００ｋｂ未満だけ離れている。一実施形態において、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも１０ｋｂだけ離れている。一実施形態において、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂだけ離れている。なおさらなる実施形態において、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが３Ｍｂ未満、または少なくとも約２Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている。
標的化ベクターの相同性アームは、例えば、少なくとも５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、１０〜２０ｋｂ、２０〜３０ｋｂ、３０〜４０ｋｂ、４０〜５０ｋｂ、５０〜６０ｋｂ、６０〜７０ｋｂ、７０〜８０ｋｂ、８０〜９０ｋｂ、９０〜１００ｋｂ、１００〜１１０ｋｂ、１１０〜１２０ｋｂ、１２０〜１３０ｋｂ、１３０〜１４０ｋｂ、１４０〜１５０ｋｂ、１５０〜１６０ｋｂ、１６０〜１７０ｋｂ、１７０〜１８０ｋｂ、１８０〜１９０ｋｂ、１９０〜２００ｋｂ長またはそれ以上を含む対応する標的部位を有する相同組み換え事象を促進するのに十分な任意の長さからのものであり得る。以下にさらに詳細に概説されるように、大きな標的化ベクターは、より巨大な長さの標的化アームを用いることができる。特定の実施形態において、５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は、少なくとも１０ｋｂであるか、または５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は、少なくとも約１６ｋｂ〜約１００ｋｂまたは約３０ｋｂ〜約１００ｋｂである。他の実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計の合計の大きさは、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約３０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約４０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、または約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。一実施形態において、欠失の大きさは、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計の大きさと同じであるか、またはそれと類似している。
一実施形態において、対象とするゲノム遺伝子座は、（ｉ）５’相同性アームに相同である５’標的配列、及び（ｉｉ）３’相同性アームに相同である３’標的配列を含む。一実施形態において、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている。なおさらなる実施形態において、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満、または少なくとも約２Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている。
ヌクレアーゼ剤が用いられるとき、標的化ベクターの５’及び３’相同性アームに対応する同族ゲノム領域は、認識部位でニックまたは二本鎖切断の際に、同族ゲノム領域と相同性アームとの間の相同的組み換え事象の発生を促進するためにヌクレアーゼ標的部位に「十分に近接して配置される」。例えば、ヌクレアーゼ標的部位は、５’及び３’相同性アームに対応する同族ゲノム領域間のどこでも配置され得る。特定の実施形態において、認識部位は、同族ゲノム領域のうちの少なくとも一方または両方に直ぐ隣接される。
本明細書に使用される、相同性アーム及び標的部位（すなわち、同族ゲノム領域）は、互いに「相補する」か、または２つの領域が相同的な組み換え反応に対する基質として機能するように互いに十分なレベルの配列同一性を共有するとき、互いに「相補的である」。「相補性」とは、対応するまたは「相補的」配列と同一であるか、またはそれに対して配列同一性を共有するＤＮＡ配列を意味する。所与の標的部位と標的化ベクター上に見出される対応する相同性アームとの間の配列同一性は、相同的組み換えが生じるのを可能にする配列同一性の任意の程度であり得る。例えば、標的化ベクター（またはその断片）の相同性アーム及び標的部位（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、この配列が相同的組み換えを行うために、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性であり得る。さらに、相同性アームと相補的標的部位との間の相補性の相補的領域は、切断された認識部位で相同的組み換えを促進させるのに十分な任意の長さのものであり得る。例えば、所与の相同性アーム及び／または相補的標的部位は、相同性アームが、細胞のゲノム内で対応する標的部位で相同的組み換えを行うのに十分な相補性を有するように、（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるＬＴＶＥＣベクターにおいて記載されるように）少なくとも５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、１０〜２０ｋｂ、２０〜３０ｋｂ、３０〜４０ｋｂ、４０〜５０ｋｂ、５０〜６０ｋｂ、６０〜７０ｋｂ、７０〜８０ｋｂ、８０−９０ｋｂ、９０〜１００ｋｂ、１００〜１１０ｋｂ、１１０〜１２０ｋｂ、１２０〜１３０ｋｂ、１３０〜１４０ｋｂ、１４０〜１５０ｋｂ、１５０〜１６０ｋｂ、１６０〜１７０ｋｂ、１７０〜１８０ｋｂ、１８０〜１９０ｋｂ、１９０〜２００ｋｂ、２００ｋｂ〜３００ｋｂ長、またはそれを超える相同性の相補領域を含むことができる。参照の便宜上、相同性アームは、本明細書では、５’及び３’相同性アームと称される。この術語は、標的化ベクター内の挿入核酸に対する相同性アームの相対位置に関する。
したがって、標的化ベクターの相同性アームは、標的遺伝子座を有する標的部位に対して相補的であるように設計される。それ故に、相同性アームは、細胞に天然に存在する遺伝子座に対して相補的であり得るか、またはそれらは、トランス遺伝子、発現カセット、またはゲノムＤＮＡの異種もしくは外因性領域が挙げられるが、これらに限定されない、細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡの異種または外因性セグメントの領域に対して相補的であり得る。あるいは、標的化ベクターの相同性アームは、ヒト人工染色体の領域、または適切な宿主細胞中に含まれる任意の他の遺伝子操作されたゲノム領域に対して相補的であり得る。なおさらに、標的化ベクターの相同性アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、またはＰ１ファージライブラリーの領域に対して相補的であり得るか、またはそれに由来し得る。それ故に、特定の実施形態において、標的化ベクターの相同性アームは、所与の細胞に天然に存在する、異種であるか、または外因性である、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターのゲノム遺伝子座に対して相補的である。さらなる実施形態において、相同性アームは、ヌクレアーゼ剤によって誘発されるニックまたは二本鎖切断の不在下で、従来の方法を用いて標的不可能である、または不正確にのみもしくは著しく低効率でのみ標的化され得る、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターのゲノム遺伝子座に対して相補的である。一実施形態において、相同性アームは、合成ＤＮＡに由来する。
さらに他の実施形態において、５’及び３’相同性アームは、標的とするゲノムと同じゲノムに対して相補的である。一実施形態において、相同性アームは、関連ゲノムからのものであり、例えば、標的とするゲノムは、第１の株のラットゲノムであり、標的化アームは、第２の株のラットゲノムからのものであり、第１の株及び第２の株は異なる。他の実施形態において、相同性アームは、同じ動物のゲノムからのものであるか、または同じ株のゲノムからのものであり、例えば、標的とするゲノムは、第１の株のラットゲノムであり、標的化アームは、同じラットからもしくは同じ株からのラットゲノムからのものである。
標的化ベクター（大きな標的化ベクター等）はまた、本明細書の他の箇所に論じられるように、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含むこともできる。選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含むことができ、核酸配列は、プロモータに作動可能に連結される。プロモータは、対象とする原核細胞及び／または対象とする真核細胞において活性であり得る。そのようなプロモータは、誘導プロモータ、レポーター遺伝子もしくは細胞に内在するプロモータ、レポーター遺伝子もしくは細胞に対して異種であるプロモータ、細胞特異的プロモータ、組織特異的プロモータ、または発達段階特異的プロモータであり得る。一実施形態において、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、ならびに／またはそれらの組み合わせから選択されるか、それらを含む。標的化ベクターの選択マーカーは、５’及び３’相同性アームが隣接され得るか、または５’もしくは３’のいずれかの相同性アームが見出され得る。
一実施形態において、標的化ベクター（大きな標的化ベクター等）は、プロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、このレポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、エメラルド、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、紺碧色、Ｔ−サファイア、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及び／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、またはそれらを含む。そのようなレポーター遺伝子は、細胞において活性なプロモータに作動可能に連結され得る。そのようなプロモータは、誘導プロモータ、レポート遺伝子もしくは細胞に内在するプロモータ、レポーター遺伝子もしくは細胞に対して異種であるプロモータ、細胞特異的プロモータ、組織特異的プロモータ、または発達段階特異的プロモータであり得る。
一実施形態において、標的化ベクター（例えば、大きな標的化ベクターを含む）とヌクレアーゼ剤との組み合わせた使用は、標的化ベクターのみの使用と比較して、標的化効率の増加をもたらす。一実施形態において、標的化ベクターがヌクレアーゼ剤と組み合わせて使用されるとき、標的化ベクターの標的化効率は、標的化ベクターが単独で使用される場合と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍増加する。
標的化ベクターを用いるとき、ベクターの設計は、本明細書に記載されるように、約５ｋｂ〜約２００ｋｂである所与の配列の挿入を可能にするようになされ得る。一実施形態において、挿入は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、または約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂである。
標的化ベクターを用いるとき、ベクターの設計は、本明細書に記載されるように、約５ｋｂ〜約２００ｋｂまたは約５ｋｂ〜約３．０Ｍｂである所与の配列の置換を可能にするようになされ得る。一実施形態において、置換は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂである。
一実施形態において、標的化ベクターは、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。一実施形態において、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする。一実施形態において、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンは、原核細胞においてその発現を妨げるようにイントロンによって分離される。
一実施形態において、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅ（または任意のリコンビナーゼまたはヌクレアーゼ剤）の核（例えば、この遺伝子はＮＬ−Ｃｒｅ遺伝子である）への局在を促進するための核局在シグナルをさらに含む。特定の実施形態において、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、核局在シグナル及びイントロン（例えば、ＮＬ−Ｃｒｅｉ）をさらに含む。
様々な実施形態において、ヌクレアーゼ剤（上で論じられたＣｒｅまたはＣｒｅｉリコンビナーゼを含む）の発現に好適なプロモータは、Ｐｒｍ１、Ｂｌｉｍｐ１、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４、Ｉｇｆ２、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ５、及び／またはＰａｘ３から選択されるか、またはそれらを含む。特定の実施形態において、プロモータは、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４プロモータである。様々なプロモータは、例えば、マウスもしくはラット等の齧歯類、非ラット齧歯類、真核生物、非ラット真核生物、非ヒト哺乳動物、哺乳動物、ヒト、またはハムスターを含む任意の生物からのものであり得る。別の特定の実施形態において、プロモータは、Ｐｒｍ１プロモータである。別の特定の実施形態において、プロモータは、ラットＰｒｍ１プロモータである。別の特定の実施形態において、プロモータは、マウスＰｒｍ１プロモータである。別の特定の実施形態において、プロモータは、Ｂｌｉｍｐ１プロモータまたはその断片、例えば、Ｂｌｉｍｐ１プロモータの１ｋｂもしくは２ｋｂの断片である。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号及び米国出願公開第２０１３−０３１２１２９号を参照されたく、これらの両方は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ｉｖ．大きな標的化ベクター
本明細書に使用される「大きな標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」という用語は、細胞において相同的組み換え標的化を行うことを目的とする他のアプローチによって一般的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、かつそれに由来する、ならびに／または細胞において相同的組み換え標的化を行うことを目的とする他のアプローチによって一般的に使用されるものよりも大きい核酸配列を含む挿入核酸を含む相同性アームを含む、大きな標的化ベクターを含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、それらの大きさの限界により、従来のプラスミドに基づいた標的化ベクターによって収容することができない大きな遺伝子座の改変を可能にする。特定の実施形態において、ＬＴＶＥＣの相同性アーム及び／または挿入核酸は、真核細胞または非ラット真核細胞のゲノム配列を含む。ＬＴＶＥＣの大きさが大きすぎて、例えば、サザンブロット法及びロングレンジ（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲ等の従来のアッセイによって標的化事象のスクリーニングができない。ＬＴＶＥＣの例としては、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬＴＶＥＣの非限定的な例及びそれらを作製するための方法は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号、及び国際公開第ＷＯ２００２／０３６７８９号（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）、米国特許公開第２０１３／０１３７１０１号において記載されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
ＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約５５０ｋｂが挙げられるが、これらに限定されない、任意の長さからのものであり得る。一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、約１００ｋｂである。
いくつかの実施形態において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである。
いくつかの実施形態において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂの核酸配列を含む。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約３０ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約４０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、または約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、挿入核酸を含む。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂの核酸配列を含む。
ＬＴＶＥＣを用いるとき、ベクターの設計は、本明細書に記載されるように、約５ｋｂ〜約２００ｋｂまたは約５ｋｂ〜約３Ｍｂである所与の配列の置換を可能にするようになされ得る。一実施形態において、置換は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂである。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣの相同性アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、またはＰ１ファージライブラリーに由来する。他の実施形態において、相同性アームは、細胞の標的とするゲノム遺伝子座に由来し、場合によっては、ＬＴＶＥＣが標的とするように設計される標的ゲノム遺伝子座は、従来の方法を用いて標的不可能である。さらに他の実施形態において、相同性アームは、合成ＤＮＡに由来する。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣにおける５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は、少なくとも１０ｋｂである。他の実施形態において、ＬＴＶＥＣにおける５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約２００ｋｂである。一実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計は、約３０ｋｂ〜約１００ｋｂである。他の実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計の合計の大きさは、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約３０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約４０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、または約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。一実施形態において、欠失の大きさは、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計の大きさと同じであるか、またはそれと類似している。
他の実施形態において、５’相同性アームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、３’相同性アームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲に及ぶ。他の実施形態において、５’及び３’相同性アームの合計は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、または約３０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、ＬＴＶＥＣ相同性アームが隣接するラット核酸配列に対して相同またはオーソロガスである挿入核酸を含む。一実施形態において、挿入核酸配列は、ラット以外の種からのものである。一実施形態において、挿入核酸配列は、真核生物からのものである。一実施形態において、ラット核酸配列に対して相同またはオーソロガスである挿入核酸は、哺乳動物核酸である。一実施形態において、ラット核酸配列に対して相同またはオーソロガスである挿入核酸は、非ヒト哺乳動物核酸である。一実施形態において、哺乳動物核酸は、マウス核酸である。一実施形態において、哺乳動物核酸は、ヒト核酸である。一実施形態において、哺乳動物核酸は、ハムスター核酸である。一実施形態において、挿入核酸は、ゲノムＤＮＡである。一実施形態において、挿入は、上記のように、５ｋｂ〜２００ｋｂである。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含む。用いることができる様々な形態の選択カセット及びレポーター遺伝子は、本明細書の他の箇所で詳細に論じられる。本明細書の他の箇所で説明されているように、ＬＴＶＥＣはまた、多能性もしくは非多能性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの細胞において、標的化ベクターと、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの核酸の標的遺伝子座との間の相同的組み換えを促進するヌクレアーゼ剤と組み合わせて、本明細書に提供される方法で使用することもできる。
一実施形態において、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。一実施形態において、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする。一実施形態において、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンは、原核細胞においてその発現を妨げるようにイントロンによって分離される。一実施形態において、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅ（または任意のリコンビナーゼまたはヌクレアーゼ剤）の核（例えば、この遺伝子はＮＬ−Ｃｒｅ遺伝子である）への局在を促進するための核局在シグナルをさらに含む。特定の実施形態において、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、核局在シグナル及びイントロン（例えば、ＮＬ−Ｃｒｅｉ）をさらに含む。
様々な実施形態において、ヌクレアーゼ剤（上記に論じられたＣｒｅまたはＣｒｅｉリコンビナーゼを含む）の発現に好適なプロモータは、Ｐｒｍ１、Ｂｌｉｍｐ１、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４、Ｉｇｆ２、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ５、及び／またはＰａｘ３から選択されるか、またはそれらを含む。特定の実施形態において、プロモータは、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４プロモータである。様々なプロモータは、例えば、マウスもしくはラット等の齧歯類、非ラット齧歯類、真核生物、非ラット真核生物、非ヒト哺乳動物、哺乳動物、ヒト、またはハムスターを含む任意の生物からのものであり得る。別の特定の実施形態において、プロモータは、Ｐｒｍ１プロモータである。別の特定の実施形態において、プロモータは、ラットＰｒｍ１プロモータである。別の特定の実施形態において、プロモータは、マウスＰｒｍ１プロモータである。別の特定の実施形態において、プロモータは、Ｂｌｉｍｐ１プロモータまたはその断片、例えば、Ｂｌｉｍｐ１プロモータの１ｋｂもしくは２ｋｂの断片である。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号及び米国出願公開第２０１３−０３１２１２９号を参照されたく、これらの両方は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、本明細書の他の箇所で詳細に論じられたように、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターのＡｐｏＥ遺伝子座、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の領域の欠失、付加、置換、またはそれらの組み合わせをもたらし得る挿入核酸を含む。特定の実施形態において、ＡｐｏＥ遺伝子座の遺伝子改変は、ＡｐｏＥ活性、ＩＬ−２Ｒｇ活性、Ｒａｇ２活性、Ｒａｇ１活性、ならびに／またはＲａｇ２及びＲａｇ１活性の低下、増加、または調節をもたらす。一実施形態において、ＡｐｏＥノックアウト、Ｉｌ２ｒｇノックアウト、Ｒａｇ２ノックアウト、Ｒａｇ１ノックアウト、Ｒａｇ２／Ｒａｇ１ノックアウトが作製される。以下に論じられるように、ヌクレアーゼ剤は、対象とする任意のゲノム遺伝子座を標的にするＬＴＶＥＣ標的化システムのうちのいずれかとともに用いることができる。
別の実施形態において、ゲノムを、少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡに曝露する。そのような場合、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びＬＴＶＥＣに曝露した後、ゲノムは、少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含むように改変される。特定の実施形態において、ＬＴＶＥＣは、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂの核酸配列を含む。
ｖ．ヌクレアーゼ剤及びヌクレアーゼ剤の認識部位
上で詳細に概説されたように、ヌクレアーゼ剤は、原核細胞において、または多能性もしくは非多能性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの細胞内の両方において、標的遺伝子座の改変に役立つように本明細書で開示される方法及び組成物中で利用され得る。そのようなヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターと標的遺伝子座との間の相同的組み換えを促進し得る。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、エンドヌクレアーゼ剤を含む。
本明細書に使用される「ヌクレアーゼ剤の認識部位」という用語は、ニックまたは二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって誘発されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤の認識部位は、細胞に内因性（または天然に存在する）であり得るか、またはその認識部位は、細胞に外因性であり得る。特定の実施形態において、認識部位は、細胞に外因性であり、そのため、細胞のゲノムに天然に生じない。なおさらなる実施形態において、認識部位は、細胞、及び標的ゲノム遺伝子座で位置付けられることが望ましい対象とするポリヌクレオチドに外因性である。さらなる実施形態において、外因性または内因性認識部位は、宿主細胞のゲノムに一度だけ存在する。特定の実施形態において、ゲノム内で一度だけ生じる内因性または天然部位が特定される。次いで、そのような部位を使用して、内因性認識部位でニックまたは二本鎖切断をもたらすヌクレアーゼ剤を設計することができる。
認識部位の長さは、変動し得、例えば、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、またはそれを超えるヌクレオチド長である認識部位を含むことができる。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤のそれぞれのモノマーは、少なくとも９ヌクレオチドの認識部位を認識する。他の実施形態において、認識部位は、約９〜約１２ヌクレオチド長、約１２〜約１５ヌクレオチド長、約１５〜約１８ヌクレオチド長、または約１８〜約２１ヌクレオチド長、及びそのような部分的な範囲（例えば、９〜１８ヌクレオチド）の任意の組み合わせである。認識部位は、パリンドロームであり得る、つまり、一方の鎖上の配列が相補鎖上の反対方向に同じ配列を読み取る。所与のヌクレアーゼ剤が認識部位に結合し、その結合部位を切断し得るか、あるいは、このヌクレアーゼ剤が認識部位とは異なる配列と結合し得ることを認識される。さらに、認識部位という用語は、ニック／切断部位がヌクレアーゼ剤結合部位内またはその外側にあるかどうかに関係なく、ヌクレアーゼ剤結合部位及びニック／切断部位の両方を含む。別の変形例では、ヌクレアーゼ剤による切断は、互いに直ぐ反対側のヌクレオチド配列部位で生じて、平滑末端切断を生じ得るか、または他の場合では、切断は、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれかであり得る、「付着末端」とも呼ばれる一本鎖オーバーハングを生じるように交互に配列され得る。
所望の認識部位へのニックまたは二本鎖切断を誘発する任意のヌクレアーゼ剤は、本明細書で開示される方法及び組成物で使用することができる。天然に存在するまたは天然型ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤が所望の認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘発する限り、用いることができる。あるいは、改変または遺伝子操作されたヌクレアーゼ剤を用いることができる。「遺伝子操作されたヌクレアーゼ剤」は、所望の認識部位でニックまたは二本鎖切断を特異的に認識し、それらを誘発するために、その天然型から遺伝子操作された（改変されたまたは由来する）ヌクレアーゼを含む。したがって、遺伝子操作されたヌクレアーゼ剤は、天然型、天然に存在するヌクレアーゼ剤に由来し得るか、または人工的に生成もしくは合成され得る。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質切断剤中の１つのアミノ酸または核酸切断剤中の１つのヌクレオチドのみであり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼは、認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘発し、この認識部位は、天然型（遺伝子操作されないまたは改変されない）ヌクレアーゼ剤によって認識されない配列ではなかった。認識部位または他のＤＮＡでニックまたは二本鎖切断を生じることは、本明細書では、認識部位または他のＤＮＡを「切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と称され得る。
例示された認識部位の活性変異体及び断片もまた提供される。そのような活性変異体は、所与の認識部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を含み得、この活性変異体は、生物学的活性を保持し、それ故に、配列特異的な様式でヌクレアーゼ剤によって認識され、切断することができる。ヌクレアーゼ剤による認識部位の二本鎖切断を測定するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、一般に、認識部位を切断するヌクレアーゼの能力を測定する。
ヌクレアーゼ剤の認識部位は、標的遺伝子座またはその近傍のどこにでも位置付けられ得る。認識部位は、遺伝子のコード領域内または調節領域内に位置し得、これは、遺伝子の発現に影響を及ぼす。したがって、ヌクレアーゼ剤の認識部位は、イントロン、エクソン、プロモータ、エンハンサー、調節領域、または任意の非タンパク質コード領域において位置し得る。
一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノムにおいて特定の標的配列で二本鎖切断を作製するために使用することができる一連の配列特異的なヌクレアーゼである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、例えば、ＦｏｋＩ等のエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに、天然または遺伝子操作された転写活性化様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を融合することによって作製される。独自のモジュラーＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインは、潜在的に任意の所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、遺伝子操作されて、特定のＤＮＡ標的部位を認識し、それ故に、所望の標的配列で二本鎖切断を作製するために使用することができる。国際公開第ＷＯ２０１０／０７９４３０号、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ ＆ Ｂｏｃｈ（２０１０） Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８−４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７−７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３−１４８を参照されたく、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる。
好適なＴＡＬヌクレアーゼ、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法の例は、例えば、米国特許公開第２０１１／０２３９３１５ Ａ１号、同第２０１１／０２６９２３４ Ａ１号、同第２０１１／０１４５９４０ Ａ１号、同第２００３／０２３２４１０ Ａ１号、同第２００５／０２０８４８９ Ａ１号、同第２００５／００２６１５７
Ａ１号、同第２００５／００６４４７４ Ａ１号、同第２００６／０１８８９８７ Ａ１号、及び同第２００６／００６３２３１ Ａ１号（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）において開示されている。様々な実施形態において、例えば、対象とするゲノム遺伝子座の標的核酸配列においてまたはその近傍で切断されるＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが、遺伝子操作され、標的核酸配列は、標的化ベクターによって改変される配列またはその近傍にある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物で用いるのに好適なＴＡＬヌクレアーゼは、具体的には、本明細書に記載されるように、標的化ベクターによって改変される標的核酸配列でまたはその近傍で結合するように設計されるものを含む。
一実施形態において、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、１２〜２５のＴＡＬリピートを含み、各ＴＡＬリピートは、１ｂｐの下部部位に結合する。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態において、独立したヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、約６ｂｐ〜約４０ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量化し、標的配列で二本鎖切断を作製する。
一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、約５ｂｐ〜約６ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量化し、二本鎖切断を作製する。
本明細書で開示される様々な方法及び組成物において用いられるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をさらに含むことができる。一実施形態において、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐの下部部位に結合する。他の実施形態において、ＺＦＮは、独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態において、独立したヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含み、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１及び第２のＺＦＮは、約６ｂｐ〜約４０ｂｐの切断部位または約５ｂｐ〜約６ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量化し、二本鎖切断を作製する。例えば、米国特許第ＵＳ２００６０２４６５６７号、同第ＵＳ２００８０１８２３３２号、同第ＵＳ２００２００８１６１４号、同第ＵＳ２００３００２１７７６号、国際公開第ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２号、米国特許第ＵＳ２０１３０１２３４８４号、同第ＵＳ２０１００２９１０４８号、及び国際公開第ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に提供される方法の一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、（ａ）ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合されるジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質、または（ｂ）ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合される転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含むキメラタンパク質を含む。
さらに別の実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、これらのファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１６）、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、リン酸ジエステル結合の金属イオン及び加水分解の調整に関与する。ＨＥａｓｅは、それらの長い認識部位、及びそれらのＤＮＡ基質においていくつかの配列多型性を容認するため注目に値する。メガヌクレアーゼのドメイン、構造、及び機能が公知であり、例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ
Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９−２４８、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０−９、Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４−２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９−９５、及びＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照のこと。いくつかの例では、天然に存在する変異体、及び／または遺伝子操作された誘導体のメガヌクレアーゼが使用される。反応速度、補因子相互作用、発現、最適条件、及び／もしくは認識部位特異性を改変する、ならびに活性をスクリーニングするための方法が公知であり、例えば、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ ３１：２９５２−６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３−１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０−９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１−４１、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１−８００、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、国際公開第ＷＯ２００５１０５９８９号、同第ＷＯ２００３０７８６１９号、同第ＷＯ２００６０９７８５４号、同第ＷＯ２００６０９７８５３号、同第ＷＯ２００６０９７７８４号、及び同第ＷＯ２００４０３１３４６号を参照のこと。
Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、またはそれらの任意の活性変異体もしくは断片が含まれるが、これらに限定されない、任意のメガヌクレアーゼが、本明細書では使用され得る。
一実施形態において、メガヌクレアーゼは、１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。一実施形態において、メガヌクレアーゼは、ゲノム中の１つの完全に一致した標的配列を認識する。一実施形態において、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一実施形態において、このホーミングヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１６）ファミリーのホーミングヌクレアーゼである。一実施形態において、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１６）ファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、及びＩ−Ｄｍｏｌから選択される。
ヌクレアーゼ剤は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼをさらに含み得る。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特定の認識部位を認識するが、一般に、切断部位（認識部位）から離れた数百の塩基対であり得るヌクレアーゼ結合部位から可変の位置で切断する。ＩＩ型のシステムでは、制限活性は、任意のメチラーゼ活性から独立しており、切断は、一般に、結合部位内またはその近傍の特定の部位で生じる。ほとんどのＩＩ型酵素は、パリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は、非パリンドローム認識部位を認識し、その認識部位の外側で切断し、ＩＩｂ型酵素は、認識部位の外側の両方の部位で配列を２回切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称認識部位を認識し、片側で、認識部位から約１〜２０ヌクレオチドの限定された距離で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は、さらに説明され、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベースにおいて分類される（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：４１８−２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：１８０５−１２、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１−７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。
様々な方法及び組成物において用いられるヌクレアーゼ剤はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムも含むことができる。そのようなシステムは、例えば、場合によっては、発現されるべき所望の細胞型のためにコドン最適化されるＣａｓ９ヌクレアーゼを用いることができる。そのようなシステムはまた、２つの別々の分子を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いることもできる。例示的な２つの分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ｔａｒｇｅｔｅｒ−ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「骨格」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の二本鎖の片方を形成する一続きのヌクレオチドの両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡの二本鎖のもう一方を形成する一続きのヌクレオチドを含む。したがって、ｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドに相補的であり、それとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡの二本鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。ｃｒＲＮＡは、さらに、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。したがって、ｇＲＮＡは、標的配列にハイブリダイズする配列及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。それ故に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（対応する対として）がハイブリダイズして、ｇＲＮＡを形成する。細胞内の改変に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列及び／または長さは、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的であるように設計され得る。
３つの要素（Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡ）をコードする天然に存在する遺伝子は、一般に、オペロン（複数を含む）に組織化される。天然に存在するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、Ｃａｓ９システム及び生物によって異なるが、２１〜４６ヌクレオチド長の２つの重複配列（ＤＲ）が隣接する２１〜７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含む場合がある（例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／１３１８３３号を参照のこと）。Ｓ．ピオゲネスの場合、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、それとハイブリダイズし、これは、同様にＣａｓ９タンパク質と結合する。
あるいは、このシステムは、コドン最適化したＣａｓ９により機能する融合したｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物（すなわち、単一の転写物）をさらに用いる。この単一のＲＮＡは、しばしば、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと称される。ｇＲＮＡ内で、ｃｒＲＮＡ部分は、所与の認識部位における「標的配列」として特定され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、しばしば、「骨格」と称される。簡潔に言えば、標的配列を含む短ＤＮＡ断片が、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入される。ｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（いくつかの実施形態において、約２０ヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（骨格）の形態、ならびに細胞において活性であり、真核細胞において適切な処理において必要な要素である好適なプロモータを含む。システムの多くは、アニールして、二本鎖ＤＮＡを形成し、次いで、ｇＲＮＡ発現プラスミドにクローン化される、特注の相補オリゴに依存する。次いで、ｇＲＮＡ発現カセット及びＣａｓ９発現カセットを細胞に導入する。例えば、Ｍａｌｉ
Ｐ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３−６、Ｊｉｎｅｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６−２１、Ｈｗａｎｇ ＷＹ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２２７−９、Ｊｉａｎｇ Ｗ
ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９、及びＣｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９−２３を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、国際公開第ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１号、同第ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１号、同第ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１号、同第ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２号、同第ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２号、及び同第ＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１号も参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で提供され得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡとの複合体の形態で提供され得る。他の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡであり得る。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で提供され得る。他の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、それぞれ、別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子の形態で提供され得る。
一実施形態において、細胞において対象とするゲノム遺伝子座を改変するための方法は、細胞に、（ａ）クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物、（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に連結したゲノム標的配列に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物を導入することを含み、ゲノム標的配列に、プロトスペーサー隣接モチーフが隣接する。任意に、ゲノム標的配列に、３’末端上で、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が隣接する。一実施形態において、この細胞は、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞を含む。
一実施形態において、ゲノム標的配列は、ＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧ（ＧＮ１−２０ＧＧ；配列番号１）のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ゲノム標的配列は、配列番号２３を含み、Ｎは、１〜２０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ゲノム標的配列は、配列番号１の１４〜２０ヌクレオチド長を含む。
一実施形態において、ｇＲＮＡは、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸配列を含む。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、（ａ）核酸配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号２）のキメラＲＮＡ、または（ｂ）核酸配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’（配列番号３）のキメラＲＮＡを含む。
別の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３’（配列番号４）、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧ（配列番号５）、または５’−ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＵＵＵＵＡ−３’（配列番号６）を含む。
さらに他の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’（配列番号７）または５’−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号８）を含む。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型Ｃａｓタンパク質である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。一実施形態において、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態において、第１の核酸配列は、ヒトコドン最適化型Ｃａｓタンパク質をコードする。
ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方の鎖を切断することなく、標的部位で一本鎖切断（すなわち、「ニック」）を作製し得る「ニッカーゼ」である。例えば、Ｃａｓ９は、反対側のＤＮＡ鎖の切断に関与する２つのヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン）を含む。これらのドメインのいずれかの突然変異がニッカーゼを作製し得る。ニッカーゼを作製する突然変異の例は、例えば、国際公開第ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１号及び同第ＷＯ／２０１３／１４２５７８Ａ１号に見出され得、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、ｄｓＤＮＡの各鎖上の標的部位に特異的な２つの別々のＣａｓタンパク質（例えば、ニッカーゼ）は、別の核酸、または同じ核酸において別々の領域においてオーバーハング配列に相補的なオーバーハング配列を形成し得る。核酸を、ｄｓＤＮＡの両方の鎖上の標的部位に特異的な２つのニッカーゼと接触させることによって形成されるオーバーハング末端は、５’または３’のオーバーハング末端であり得る。例えば、第１のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第１の鎖上に一本鎖切断を形成し得るが、一方、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列を形成するようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を形成し得る。一本鎖切断を形成する各ニッカーゼの標的部位は、形成されたオーバーハング末端配列が異なる核酸分子上にオーバーハング末端配列に相補的であるように選択され得る。２つの異なる核酸分子の相補的なオーバーハング末端は、本明細書で開示される方法によってアニールされ得る。いくつかの実施形態において、第１の鎖上のニッカーゼの標的部位は、第２の鎖上のニッカーゼの標的部位とは異なる。
一実施形態において、第１の核酸は、Ｃａｓタンパク質においてヌクレアーゼ活性部位の少なくとも１つのアミノ酸残基を破壊する突然変異体を含み、突然変異体Ｃａｓタンパク質は標的ＤＮＡ領域の一方の鎖のみに切断を生じ、突然変異体は、標的ＤＮＡ領域において非相同的組み換えを減少させる。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。一実施形態において、核局在化シグナルは、ＳＶ４０核局在化シグナルである。
一実施形態において、ゲノム標的配列及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現を駆動する第２のプロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータは、ヒトＵ６プロモータである。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータは、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータは、マウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモータである。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸配列は、合成ループを介して連結され、発現時、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡの二本鎖を形成する。
上述されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞の細胞型のうちのいずれかとともに、大きな標的化ベクターと組み合わせて使用することができる。
一実施形態において、第１の発現構築物及び第２の発現構築物は、同じプラスミドから発現される。
一実施形態において、第１及び第２の発現構築物は、ＬＴＶＥＣと一緒に導入される。一実施形態において、第１及び第２の発現構築物は、ある期間にわたってＬＴＶＥＣとは別々に導入される。
一実施形態において、本方法は、本明細書に記載される異なる標的遺伝子座の多重編集のために複数の第２の構築物及び複数のＬＴＶＥＣを導入することを含む。
ヌクレアーゼ剤の活性変異体及び断片（すなわち、遺伝子操作されたヌクレアーゼ剤）も提供される。そのような活性変異体は、天然ヌクレアーゼ剤に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を含み得、活性変異体は、所望の認識部位で切断する能力を保持し、それ故に、ニックまたは二本鎖切断を誘導する活性を保持する。例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤のうちのいずれかも、天然エンドヌクレアーゼ配列から改変され、天然ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった認識部位でニックまたは二本鎖切断を認識し、誘導するように設計され得る。それ故に、いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼは、対応する天然ヌクレアーゼ剤の認識部位とは異なる認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断を誘導する活性のためのアッセイが知られており、一般に、認識部位を含むＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性及び特異性を測定する。
ヌクレアーゼ剤は、当該技術分野で周知の任意の手段によって細胞に導入されてもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞に直接導入されてもよい。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドを、細胞に導入することができる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドを細胞に導入するとき、ヌクレアーゼ剤は、細胞内に一時的に、条件付きで、または構造的に発現され得る。それ故に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、発現カセット中に含有され、かつ条件付きプロモータ、誘導プロモータ、構造的プロモータ、または組織特異的プロモータに作動可能に連結され得る。対象とするそのようなプロモータは、本明細書の他の箇所でさらに詳細に論じられる。あるいは、このヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするまたはそれを含むｍＲＮＡとして細胞に導入される。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々のＲＮＡ転写物として発現される。
特定の実施形態において、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定的に組み込まれ、細胞において活性であるプロモータに作動可能に連結される。他の実施形態において、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、挿入核酸を含む同じ標的化ベクター中に存在するが、一方、他の例では、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、挿入核酸を含む標的化ベクターから離れているベクターまたはプラスミド中に存在する。
ヌクレアーゼ剤がヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を通して細胞に提供されるとき、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、対象とする細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置き換えるために改変され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌性細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または対象とする任意の他の宿主細胞を含む、対象とする所与の原核または真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置き換えるために改変され得る。
一実施形態において、エンドヌクレアーゼ剤は、ＬＴＶＥＣと一緒に導入される。一実施形態において、エンドヌクレアーゼ剤は、ある期間にわたってＬＴＶＥＣとは別々に導入される。一実施形態において、エンドヌクレアーゼ剤は、ＬＴＶＥＣの導入前に導入される。一実施形態において、エンドヌクレアーゼ剤は、ＬＴＶＥＣの導入後に、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターＥＳ細胞に導入される。
一実施形態において、エンドヌクレアーゼ剤は、エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現構築物であり、この核酸配列は、プロモータに作動可能に連結される。一実施形態において、このプロモータは、構成的に活性なプロモータである。一実施形態において、このプロモータは、誘導プロモータである。一実施形態において、このプロモータは、多能性もしくは非多能性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスター細胞において活性である。一実施形態において、エンドヌクレアーゼ剤は、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。
Ｂ．標的遺伝子座に対象とするポリヌクレオチドを組み込むための方法
対象とする標的遺伝子座を改変するための方法が提供される。一実施形態において、多能性もしくは非多能性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスター細胞において標的遺伝子座は、遺伝子改変の標的となる。そのような方法は、（ａ）多能性もしくは非多能性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスター細胞に、５’ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの相同性アーム及び３’ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターの相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することと、（ｂ）標的遺伝子座で標的遺伝子改変を含む遺伝子的に改変された多能性もしくは非多能性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスター細胞を特定することと、を含み、標的遺伝子改変は生殖細胞系列を通して伝達することができる。特定の実施形態において、５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は、少なくとも１０ｋｂであり、及び／または大きな標的化ベクターが用いられる。
他の実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計の合計の大きさは、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約３０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約４０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、または約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。一実施形態において、欠失の大きさは、ＬＴＶＥＣの５’及び３’相同性アームの合計の大きさと同じであるか、またはそれと類似している。
多能性細胞、例えば、ラット細胞は、胚幹細胞、例えば、ラット胚幹細胞であり得る。特定の実施形態において、（ａ）ラットＥＳ細胞は、ＤＡ株もしくはＡＣＩ株に由来するか、または（ｂ）ラットＥＳ細胞は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせを含む多能性マーカーの発現を特徴とする。他の例において、用いられるラット胚幹細胞は、２０１４年２月２０に出願された米国特許出願第１４／１８５，１０３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において記載される、ラットＥＳ細胞を含む。
任意の多能性または非多能性細胞を、本明細書に提供される方法で使用することができる。例えば、多能性または非多能性細胞は、真核生物、非ラット真核生物、非ヒト哺乳動物、哺乳動物、齧歯類、非ラット齧歯類、ラット、マウス、ヒト、またはハムスターからの細胞であり得る。
本明細書の他の箇所に記載されるように、挿入核酸は、任意の核酸配列であり得る。非限定的な実施形態において、（ａ）挿入核酸は、相同もしくはオーソロガス哺乳動物の核酸配列による内因性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターの核酸配列の置換を含み、（ｂ）挿入核酸は、内因性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターの核酸配列の欠失を含み、（ｃ）挿入核酸は、内因性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターの核酸配列の欠失を含み、この欠失は、５ｋｂ〜２００ｋｂまたは５ｋｂ〜３Ｍｂの範囲に及び（本明細書の他の箇所で詳細に論じられたように）、（ｄ）挿入核酸は、外因性核酸配列（例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、もしくは約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列を含む）の付加を含み、（ｅ）挿入核酸は、相同またはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列を含み、（ｆ）（ａ）の相同またはオーソロガス核酸配列であって、核酸配列がヒト核酸配列であり、（ｇ）挿入核酸は、（ａ）の相同またはオーソロガス核酸配列を含み、核酸配列がヒト及びラット核酸配列を含むキメラ核酸配列であり、（ｈ）挿入核酸は、（ｅ）の外因性核酸配列を含み、挿入核酸は、約５ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲に及び、（ｉ）挿入核酸は、部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子を含み、（ｊ）挿入核酸は、プロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、（ｋ）挿入核酸は、齧歯類の重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ遺伝子セグメント、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントを含み、（ｌ）挿入核酸は、齧歯類の重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された再配列された核酸配列を含み、（ｍ）挿入核酸は、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリンＶκもしくはＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリンＪκもしくはＪλ遺伝子セグメントを含み、これらは、哺乳動物免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結され、（ｎ）挿入核酸は、哺乳動物免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖可変領域核酸配列を含み、（ｏ）（ｋ）及び／もしくは（ｌ）の哺乳動物の重鎖定常領域の核酸配列は、ラット定常領域の核酸配列、ヒト定常領域の核酸配列、もしくはそれらの組み合わせを含むか、あるいは（ｐ）（ｍ）及び／もしくは（ｎ）の哺乳動物の免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖定常領域の核酸は、ラット定常領域の核酸配列、ヒト定常領域の核酸配列、もしくはそれらの組み合わせを含む。
一実施形態において、挿入核酸は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態において、挿入核酸は、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なヒトＤ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態において、挿入核酸は、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なＪＨ遺伝子セグメントを含む。一実施形態において、挿入核酸は、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、Ｖκ２−４０、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態において、挿入核酸は、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態において、挿入核酸は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。
特定の実施形態において、多能性もしくは非多能性ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスター細胞における標的遺伝子座の改変の際に、遺伝子改変は、生殖細胞系列を通して伝達することができる。
一実施形態において、挿入核酸配列は、ゲノムに組み込まれるとき、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターのＡｐｏＥ遺伝子座の領域の遺伝子改変を生じるポリヌクレオチドを含み、ＡｐｏＥ遺伝子座での遺伝子改変は、ＡｐｏＥ活性の低下、ＡｐｏＥ活性の増加、またはＡｐｏＥ活性の調節をもたらす。一実施形態において、ＡｐｏＥノックアウトが作製される。
一実施形態において、挿入核酸配列は、ゲノムに組み込まれるとき、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、またはハムスターのインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座の領域の遺伝子改変を生じるポリヌクレオチドを含み、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座での遺伝子改変は、インターロイキン−２受容体活性の低下、インターロイキン−２受容体ガンマ活性の増加、またはインターロイキン−２受容体活性の調節をもたらす。一実施形態において、インターロイキン−２受容体ノックアウトが作製される。
さらに別の実施形態において、挿入核酸配列は、ゲノムに組み込まれるとき、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターのＲａｇ１遺伝子座、ラット、真核生物、非ラット真核生物、非ヒト哺乳動物、哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターのＲａｇ２遺伝子座、及び／またはラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターのＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の領域の遺伝子改変を生じるポリヌクレオチドを含み、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターのＲａｇ１、Ｒａｇ２、及び／もしくはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座での遺伝子改変は、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２、もしくはＲａｇ１及びＲａｇ２タンパク質活性の低下、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２、もしくはＲａｇ１及びＲａｇ２タンパク質活性の増加、またはＲａｇ１、Ｒａｇ２、もしくはＲａｇ１及びＲａｇ２タンパク質活性の調節をもたらす。一実施形態において、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２、またはＲａｇ２／Ｒａｇ１ノックアウトが作製される。
さらなる実施形態において、挿入核酸は、ラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターのＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座及び／またはＲａｇ２遺伝子座、ならびに／またはＲａｇ１遺伝子座及び／もしくはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分の、別の生物からのＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の対応するオーソロガス部分による置換をもたらす。
さらに他の実施形態において、挿入核酸は、その全長にわたって、それが置換するＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％共有するポリヌクレオチドを含む。
所与の挿入ポリヌクレオチド、及びラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターの置換される遺伝子座の対応する領域は、コード領域、イントロン、エクソン、非翻訳領域、調節領域、プロモータ、もしくはエンハンサー、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。さらに、所与の挿入ポリヌクレオチド、及び／またはラット、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、ヒト、非ヒト哺乳動物、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターの置換される遺伝子座の領域は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド長、１００〜５００ヌクレオチド長、５００〜１ｋｂヌクレオチド長、１ｋｂ〜１．５ｋｂヌクレオチド長、１．５ｋｂ〜２ｋｂヌクレオチド長、２ｋｂ〜２．５ｋｂヌクレオチド長、２．５ｋｂ〜３ｋｂヌクレオチド長、３ｋｂ〜５ｋｂヌクレオチド長、５ｋｂ〜８ｋｂヌクレオチド長、８ｋｂ〜１０ｋｂヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長を含む任意の所望の長さのものであり得る。他の例では、挿入または置換の大きさは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂである。他の実施形態において、所与の挿入ポリヌクレオチド、及び／またはラット、真核生物、非ラット真核生物、非ヒト哺乳動物、哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、もしくはハムスターの置換される遺伝子座の領域は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、もしくは９００ヌクレオチドまたは少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、またはそれを超える。
ｉ．細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）を介して核酸の標的遺伝子座を改変するための方法
原核細胞における細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）を介して、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、ヒト、または非ヒト哺乳動物の核酸の標的遺伝子座を改変するための方法及び組成物が提供される。そのような方法は、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、ヒト、または非ヒト哺乳動物の核酸の標的遺伝子座を遺伝子的に改変するために、原核細胞において細菌性相同的組み換えを利用して、標的化ベクターを作製する際の使用を見出す。遺伝子的に改変された標的遺伝子座を含むような標的化ベクターは、真核細胞、例えば、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞に導入され得る。「相同的組み換え」は、相同性領域内の交差部位での２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換を含む。したがって、「細菌性相同的組み換え」または「ＢＨＲ」は、細菌において生じる相同的組み換えを含む。
細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）を介して、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞，非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞からの核酸の標的遺伝子座を改変するための方法が提供される。これらの方法は、原核細胞に、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することを含み、原核細胞は、核酸の標的遺伝子座を含み、標的遺伝子座でＢＨＲを媒介するリコンビナーゼを発現することができる。そのような標的化ベクターは、本明細書に記載される大きな標的化ベクターのうちのいずれかを含み得る。
一実施形態において、本方法は、原核細胞に、（ｉ）対象とするＤＮＡ配列を有する核酸を含む第１の構築物、（ｉｉ）５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む第２の標的化構築物、ならびに（ｉｉｉ）細菌性相同的組み換えを媒介するリコンビナーゼをコードする第３の構築物に導入することを含む。一実施形態において、第１、第２、及び第３の構築物は、ある期間にわたって、別々に原核細胞に導入される。一実施形態において、原核細胞は、リコンビナーゼをコードする核酸を含み、本方法は、第３の構築物の導入を必要としない。一実施形態において、リコンビナーゼは、誘導プロモータの制御下で発現される。
一実施形態において、核酸を含む第１の構築物は、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来する。標的ゲノム遺伝子座で挿入核酸を含む原核細胞が選択され得る。本方法は、原核細胞における標的遺伝子座での複数の挿入核酸の導入を可能にするために、本明細書で開示されるように、連続的に繰り返され得る。一旦標的核酸遺伝子座が原核細胞内で「構築される」と、改変された標的遺伝子座を含む標的化ベクターは、原核細胞から単離され、真核細胞、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞，、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞内で標的ゲノム遺伝子座に導入され得る。
標的化ベクターを受容するための好ましいラット細胞は、２０１４年２月２０日に出願された米国出願第１４／１８５，７０３号において記載されており、この内容は、本明細書で概説されている。これらのラット細胞は、インビトロで１つ以上の標的遺伝子改変後、それらの多能性を維持することが可能な多能性ラット細胞であり、生殖細胞系列を通じて標的遺伝子改変を伝達することができる。
例えば、電気穿孔された多能性細胞は、標的化ベクターを含む薬物耐性細胞の選択のために高密度でプレーティングされる。薬物選択プロセスは、大部分のプレーティングした細胞（約９９％）を取り除き、個々のコロニーを残し、これらの各々は、単一細胞に由来するクローンである。残りの細胞のうち、ほとんどの細胞（約８０〜１００％）は、ゲノムにおけるランダム配置で組み込まれた標的化ベクター（薬物選択カセットを含む）を含む。したがって、コロニーは、個々に選ばれ、正しいゲノム配置で標的化ベクターを持つＥＳ細胞を特定するように遺伝子決定される（例えば、以下に記載される対立遺伝子アッセイの改変を用いて）。
ハイスループット定量的アッセイ、すなわち、対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変は、遺伝子決定のために使用することができる。そのようなアッセイは、遺伝子改変後、親染色体における改変された対立遺伝子（複数を含む）の大規模なスクリーニングを可能にする。ＭＯＡアッセイは、定量的ＰＣＲ、例えば、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が挙げられるが、これに限定されない、様々な分析技術を介して行われ得る。例えば、リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び標的とされない参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを含む。加えて、プライマーセットは、増幅配列を認識する蛍光プローブを含む。一実施形態において、定量的アッセイは、Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）を介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、ＭＭＰアッセイ（登録商標）を介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎを介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術を介して行われる（例えば、米国特許出願第ＵＳ２００５／０１４４６５５号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
次いで、標的遺伝子改変を含む選択された多能性細胞（すなわち、非ヒト多能性細胞、非ヒトＥＳ細胞）を、宿主胚、例えば、プレ桑実胚期または胞胚期の胚に導入し、代理母の子宮内に移植して、創始非ヒト動物（Ｆ０動物）を作製することができる。その後に、創始動物を、例えば、野生型動物と繁殖させて、遺伝子改変に対してヘテロ接合性であるＦ１子孫を作製することができる。ヘテロ接合性のＦ１動物の交配により、遺伝子改変に対してホモ接合性の子孫を生み出すことができる。ヘテロ接合性のＦ１動物の交配により、遺伝子改変に対してホモ接合性の子孫を生み出すことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される標的遺伝子座の様々な遺伝子改変は、本明細書の他の箇所で詳細に記載される、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を用いて行われ得る。例えば、ＬＴＶＥＣは、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子組み換え技術を用いて細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡから得られ得る（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（６）：６５２−６５９を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製するための細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）の使用は、大きなゲノムＤＮＡ断片を適応させ、多能性または非多能性細胞における標的改変を内因性遺伝子座に導入するのに結果として起こる低効率にプラスミドの限界を回避する。１つ以上の標的遺伝子改変は、ＬＴＶＥＣを作製する際に行われ得る。原核細胞において生み出された例示的なＬＴＶＥＣは、相同アームが隣接し、特定のゲノム領域に相補的である１つ以上の遺伝子改変または外因性核酸（例えば、ラット核酸のホモログまたはオルソログ）を有するゲノム配列をもつ挿入核酸を含み得る。
また、本明細書に記載される様々な標的化ベクターを含む宿主原核細胞も提供される。そのような原核細胞としては、大腸菌等の細菌が挙げられるが、これに限定されない。一実施形態において、宿主原核細胞は、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを含み、この挿入核酸は、約５ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲に及ぶ。
宿主原核細胞は、リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸をさらに含み得るか、またはリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、誘導プロモータに作動可能に連結される。
標的遺伝子改変を生成するために、原核細胞と組み合わせて本明細書に記載されるＬＴＶＥＣを用いる様々な方法及び組成物がさらに提供される。そのような組成物及び方法は、本明細書の他の箇所で論じられる。
原核細胞に、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することを含む、細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）を介して核酸の標的遺伝子座を改変するための方法が提供され、この原核細胞は、５’及び３’相同性アームに対応する核酸を含み、原核細胞は、標的遺伝子座でＢＨＲを媒介するリコンビナーゼを発現することができる。そのような標的化ベクターは、本明細書に記載される大きな標的化ベクターのうちのいずれかを含み得る。そのような方法は、本明細書で詳細に論じられるＬＴＶＥＣを用いることができ、本明細書の他の箇所で論じられるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをさらに用いる。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、大腸菌等の原核細胞において活性であるプロモータによって制御され得る。
ｉｉ．多能性細胞または非多能性細胞において、対象とする標的遺伝子座を改変するための方法
標的遺伝子改変を介して多能性細胞または非多能性細胞における対象とする標的遺伝子座を改変するための方法であって、（ａ）多能性細胞または非多能性細胞に、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することであって、５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は、少なくとも１０ｋｂである、導入することと、（ｂ）対象とする標的遺伝子座で標的遺伝子改変を含む遺伝子的に改変された多能性または非多能性細胞を特定することと、を含む、方法がさらに提供される。一実施形態において、５’相同性アーム及び３’相同性アームの合計は、少なくとも約１６ｋｂ〜約３０ｋｂである。特定の実施形態において、標的遺伝子改変は、生殖細胞系列を通して伝達することができる。そのような標的化ベクターは、本明細書に記載される大きな標的化ベクターのうちのいずれかを含み得る。
様々な細胞をまた、本明細書に提供される対象とする標的遺伝子座を改変するための方法において使用することもできる。特定の実施形態において、この細胞は、真核細胞、非ラット真核細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト誘導性多能性細胞（ｉＰＳ）細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、またはＣＨＯ細胞である。
一態様において、標的遺伝子改変を介して多能性細胞において対象とするゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、（ａ）そのゲノムの少なくとも１つの標的遺伝子改変後、その多能性を維持することが可能であり、かつＦ１世代の生殖細胞系列に標的改変を伝達することができる多能性細胞を提供することと、（ｂ）大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を多能性細胞に導入することであって、ＬＴＶＥＣは、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含み、５’相同性アーム及び３’相同性アームは、ゲノムＤＮＡ断片を含む、導入することと、（ｃ）標的遺伝子改変を含む遺伝子的に改変された多能性細胞を特定することと、を含む、方法が提供される。
様々な方法は、対象とする標的遺伝子座で組み込まれた挿入核酸を有する細胞を特定するために使用することができる。対象とする標的遺伝子座での挿入核酸の挿入は、「対立遺伝子の改変」をもたらす。「対立遺伝子の改変」という用語及び改変された対立遺伝子の検出のための方法は、本明細書の他の箇所でさらに詳細に論じられている。
一態様において、エンドヌクレアーゼ媒介の遺伝子標的法を介して、非多能性細胞または多能性細胞において、対象とするゲノム遺伝子座を改変するための方法が提供され、本方法は、（ａ）遺伝子的に改変されたゲノムをＦ１世代の生殖細胞系列に伝達することができる単離された非多能性細胞または単離された多能性細胞を提供することと、（ｂ）非多能性細胞または多能性細胞にエンドヌクレアーゼ剤を導入することであって、エンドヌクレアーゼ剤は、対象とするゲノム遺伝子座に位置する標的ＤＮＡ配列でニックまたは二本鎖切断を作製し、非多能性細胞または多能性細胞において、標的ＤＮＡ配列でニックまたは二本鎖切断は、（ｉ）ニックまたは二本鎖切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介のＤＮＡ修復であって、ＮＨＥＪ媒介のＤＮＡ修復は、標的ＤＮＡ配列で核酸配列の挿入または欠失を含む突然変異対立遺伝子を作製する、ＤＮＡ修復、または（ｉｉ）野生型核酸配列の回復をもたらす相同的組み換え媒介のＤＮＡ修復を誘導する、導入することと、（ｃ）対象とする改変されたゲノム遺伝子座を特定することと、を含む。
一態様において、ヌクレアーゼ剤を介して、単離された胚幹細胞（ＥＳ）における対象とするゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、（ａ）標的遺伝子改変をＦ１世代の生殖細胞系列に伝達することができる単離されたＥＳ細胞を提供することと、（ｂ）ＥＳ細胞に、（ｉ）５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であって、この挿入が少なくとも５ｋｂである核酸配列である、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）、及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼ剤であって、エンドヌクレアーゼ剤が対象とするゲノム遺伝子座に位置する標的ＤＮＡ配列でニックまたは二本鎖切断を作製し、標的配列が挿入核酸中に存在しない、エンドヌクレアーゼ剤を導入することと、（ｃ）胚幹（ＥＳ）細胞において標的遺伝子改変を特定することと、を含む、方法が提供される。
一態様において、ＲＮＡにガイドされたゲノムの遺伝子操作を介して、非多能性細胞または多能性細胞において、対象とするゲノム遺伝子座を改変するための方法が提供され、本方法は、（ａ）Ｆ１世代の生殖細胞系列に遺伝子的に改変されたゲノムを伝達することができる非多能性細胞または多能性細胞を提供することと、（ｂ）非多能性細胞または多能性細胞に、（ｉ）クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に連結されたゲノム標的配列に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物を導入することを含み、ゲノム標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が隣接する。任意に、ゲノム標的配列には、３’末端上で、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が隣接する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質ならびにＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡは、一緒には天然に存在しない（例えば、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、一緒には天然に存在しない）。一実施形態において、ゲノム標的配列は、ＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧ（ＧＮ１−２０ＧＧ；配列番号１）のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ゲノム標的配列は、配列番号１を含み、Ｎは、１４〜２０ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｇＲＮＡは、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸配列及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第４の核酸配列を含む。一実施形態において、発現時、Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、対象とするゲノム遺伝子座に位置する標的ＤＮＡ配列でニックまたは二本鎖切断を作製し、非多能性細胞または多能性細胞における標的ＤＮＡ配列でのニックまたは二本鎖切断は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体によって形成されるニックまたは二本鎖切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介のＤＮＡ修復であって、ＮＨＥＪは、標的ＤＮＡ配列で核酸配列の挿入または欠失を含む突然変異対立遺伝子を作製する、ＤＮＡ修復、または（ｉｉ）野生型核酸配列の回復をもたらす相同的組み換え媒介のＤＮＡ修復を誘導し、（ｃ）対象とする改変されたゲノム遺伝子座を特定することを含む。
一態様において、ＲＮＡにガイドされたゲノムの遺伝子操作を介して、非多能性細胞または多能性細胞における対象とするゲノム遺伝子座を改変するための方法が提供され、本方法は、生殖細胞系列を通して改変されたゲノムを伝達することができる非多能性細胞または多能性細胞に、（ｉ）クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、及び（ｉｉ）ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することを含み、ｇＲＮＡがゲノム標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、ゲノム標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が隣接する。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、単離されたタンパク質として、非多能性細胞または多能性細胞に導入され得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の細胞取り込みを促進する細胞透過性ドメインをさらに含み得る。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子として細胞に導入され得る。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡ分子として細胞に導入され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、構築物中に提供され、かつ非多能性細胞または多能性細胞中で発現することができるプロモータに作動可能に連結され得る。ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、非多能性細胞または多能性細胞中での発現のためにコドン最適化される。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子として非多能性細胞または多能性細胞に導入され得る。例えば、ｇＲＮＡ分子は、インビトロで転写され得る。他の実施形態において、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ分子として非多能性細胞または多能性細胞に導入され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、構築物中に存在し、かつ非多能性細胞または多能性細胞中でｇＲＮＡを発現することができるプロモータに作動可能に連結され得る。他の実施形態において、ｇＲＮＡは、化学的に合成され得る。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、融合されたｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ分子（すなわち、単一転写物）として非多能性細胞または多能性細胞に導入され得る。他の実施形態において、ｇＲＮＡは、別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子（すなわち、別々の転写物）として非多能性細胞または多能性細胞に導入され得る。他の実施形態において、ｇＲＮＡは、それぞれ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子として非多能性細胞または多能性細胞に導入され得る。例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子は、別々の構築物中に存在し、かつ非多能性細胞または多能性細胞中で発現することができるプロモータに作動可能に連結され得る。上記の実施形態のうちのいずれかにおいて、構築物の任意の組み合わせは、別々の核酸分子中に存在するか、または単一核酸分子中に一緒に存在し得る。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、非多能性細胞または多能性細胞に、同時にまたは順次導入され得る。同様に、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、非多能性細胞または多能性細胞に、同時にまたは連続して導入され得る。Ｃａｓタンパク質（もしくはコード核酸）対ｇＲＮＡ（もしくはコードＤＮＡ）の比及び／またはｃｒＲＮＡ対ｔｒａｃｒＲＮＡの比は、それらがＲＮＡ−タンパク質複合体を形成することができるように、ほぼ化学量論量であり得る。
ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡを含む複合体の形態で非多能性細胞または多能性細胞に導入され得る。
一実施形態において、多能性細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）である。一実施形態において、多能性細胞は、発達的に制限された前駆細胞である。
様々な実施形態において、選択マーカー内の認識部位におけるニックまたは二本鎖切断の存在は、標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ等）と対象とする標的遺伝子座との間の組み換えの効率及び／または頻度を増加させる。一実施形態において、この組み換えは、相同的組み換えである。別の実施形態において、この組み換えは、非相同末端結合による挿入である。様々な実施形態において、ニックまたは二本鎖切断の存在下で、標的ゲノム遺伝子座の標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ等）の標的化効率は、ニックまたは二本鎖切断がない場合（例えば、同じ標的化ベクター及び同じ相同性アームを用い、対象とするゲノム遺伝子座で対応する標的部位であるが、ニックまたは二本鎖切断を作製するさらなるヌクレアーゼ剤がない場合）よりも少なくとも約２倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約４倍高い。
一実施形態において、標的遺伝子座の標的遺伝子改変は、２対立遺伝子である。「２対立遺伝子」とは、遺伝子の両方の対立遺伝子が標的遺伝子改変を含むことを意味する。標的遺伝子改変は、各対立遺伝子において同じであり得るか、または異なり得る。例えば、２対立遺伝子改変は、対応する相同染色体上の対応する対立遺伝子に行われる同じ改変をもたらし得るか、または対応する相同染色体上の対応する対立遺伝子に行われる異なる改変をもたらし得る。それ故に、２対立遺伝子改変は、例えば、対象とするゲノム遺伝子座で特異的改変に対してホモ接合性（すなわち、両方の対立遺伝子において特異的改変）、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性（例えば、一方の対立遺伝子において特異的改変であり、もう一方の対立遺伝子の不活性化または破壊）、または対象とするゲノム遺伝子座で半接合性（例えば、一方の対立遺伝子において特異的改変であり、もう一方の対立遺伝子の欠失）をもたらし得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ剤とともに標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣを含む）の組み合わせた使用により、標的化ベクターのみの使用と比較して、細胞において対象とするゲノム遺伝子座の２対立遺伝子の標的遺伝子改変をもたらす。標的化ベクターがヌクレアーゼ剤と組み合わせて使用されるとき、２対立遺伝子の標的化効率は、標的化ベクターのみが使用されるときと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍またはそれ以上増加する。さらなる実施形態において、２対立遺伝子の標的化効率は、少なくとも０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、もしくは５％、またはそれを超える。
標的遺伝子座で２対立遺伝子の標的遺伝子改変は、ホモ接合性の遺伝子的に改変された細胞をもたらし得る。「ホモ接合性」とは、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対立遺伝子）が同じ方法で改変されていることを意味する。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ剤を用いた標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣを含む）の組み合わせた使用により、細胞において対象とするゲノム遺伝子座の２対立遺伝子のホモ接合性の標的遺伝子改変をもたらす。一実施形態において、２対立遺伝子の遺伝子改変は、２つの相同染色体（すなわち、一対の第１及び第２の相同染色体）において対象とするゲノム遺伝子座で内因性核酸配列の欠失、ならびに２つの相同染色体（すなわち、一対の第１及び第２の相同染色体）において対象とするゲノム遺伝子座で挿入核酸の挿入を含む。いくつかの実施形態において、挿入核酸は、両方の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列を置換する。一実施形態において、挿入核酸は、欠失した内因性核酸配列に対して相同またはオーソロガスである。
一実施形態において、標的遺伝子座での標的遺伝子改変は、半接合性の遺伝子的に改変された細胞をもたらす。「半接合性」とは、標的遺伝子座の１つのみの対立遺伝子（すなわち、２つの相同染色体のうちの１つの染色体上の対立遺伝子）が存在するか、または１つの対立遺伝子のみが発現可能であり、機能的であることを意味する。他の実施形態において、標的遺伝子改変は、より一般に、複合ヘテロ接合性をもたらす。複合ヘテロ接合性は、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対立遺伝子）が改変されるが、それらは異なる方法（例えば、一方の対立遺伝子において挿入及びもう一方の対立遺伝子の不活性化または破壊）で改変される状況を含む。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ剤を用いた標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣを含む）の組み合わせた使用により、細胞において対象とするゲノム遺伝子座の半接合性の標的遺伝子改変をもたらす。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ剤を用いた標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣを含む）の組み合わせた使用により、細胞において対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性を形成する標的遺伝子改変をもたらす。一実施形態において、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び挿入核酸の挿入を含む。他の実施形態において、標的遺伝子改変は、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への挿入核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。第１の染色体は、２つの相同染色体のうちの第１の相同染色体であり得、第２の染色体は、２つの相同染色体のうちの第２の相同染色体であり得る。他の実施形態において、標的改変は、（１）第１の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び対象とするゲノム遺伝子座への挿入核酸の挿入、ならびに（２）第２の相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む。内因性核酸配列の破壊は、例えば、ヌクレアーゼ剤により形成される対象とするゲノム遺伝子座で二本鎖切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介のＤＮＡ修復によって修復されるとき、これは対象とするゲノム遺伝子座で核酸配列の挿入または欠失を含む突然変異対立遺伝子を作製し、それにより、対象とするゲノム遺伝子座の破壊を生じることをもたらし得る。破壊の例には、対象とするゲノム遺伝子座で調節要素（例えば、プロモータまたはエンハンサー）の変更、ミスセンス突然変異、切断突然変異、ヌル突然変異、または（例えば、フレームシフト突然変異を生じる）少数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失が含まれる。破壊の別例は、ナンセンス突然変異である。破壊は、対立遺伝子の不活性化（すなわち、機能の喪失）または喪失をもたらし得る。
ホモ接合性及び半接合性の標的遺伝子改変は、これらの突然変異を含む遺伝子的に改変された細胞が以下に論じられる遺伝子的に改変された動物を生み出すために使用されるとき、意図された標的遺伝子改変に対して非ヘテロ接合性（すなわち、ホモ接合性または半接合性）である遺伝子的に改変された動物を生み出すためのプロセスがより効率であり、繁殖ステップをあまり必要としないのであまり時間がかからないため、有利である。複合ヘテロ接合性または半接合性をもたらす標的遺伝子改変（例えば、一方の対立遺伝子において挿入及びもう一方の対立遺伝子の不活性化、破壊、または喪失）は、同じ理由により有利であり得る。
様々な細胞型がまた、ヌクレアーゼ剤を介してゲノム遺伝子座を改変するために、本明細書で上記に記載される様々な方法のうちのいずれにおいても使用され得る。特定の実施形態において、この細胞は、真核細胞、非ラット真核細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト誘導性多能性細胞（ｉＰＳ）細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、またはＣＨＯ細胞である。
インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座またはＡｐｏＥ遺伝子座において標的遺伝子改変を有する、遺伝子的に改変された非ヒト動物を含む組成物が提供される。本明細書に提供される様々な方法及び組成物は、これらの改変された遺伝子座が生殖細胞系列を通して伝達することを可能にする。
特定の実施形態において、遺伝子的に改変された非ヒト動物または遺伝子的に改変された多能性もしくは非多能性細胞は、インターロイキン−２ガンマ受容体遺伝子座において標的遺伝子改変を有するか、またはＡｐｏＥ遺伝子座において標的遺伝子改変を有するゲノム遺伝子座を含み、インターロイキン−２ガンマ受容体ゲノム遺伝子座またはＡｐｏＥ遺伝子座は、（ｉ）インターロイキン−２ガンマ受容体遺伝子座の少なくとも一部分もしくはＡｐｏＥ遺伝子座の少なくとも一部分の欠失、（ｉｉ）ＡｐｏＥ遺伝子座もしくはインターロイキン−２ガンマ受容体遺伝子座への異種核酸配列の挿入、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含み、遺伝子的に改変されたゲノム遺伝子座は、生殖細胞系列を通して伝達することができる。
そのような遺伝子的に改変された非ヒト動物及びそのような遺伝子的に改変された多能性細胞が作製することを可能にする方法が、さらに提供される。そのような方法は、標的遺伝子改変を介して、多能性細胞において、ＡｐｏＥゲノム遺伝子座またはインターロイキン−２ガンマ受容体遺伝子座を改変するための方法を含む。本方法は、（ａ）多能性細胞に、ＡｐｏＥ遺伝子座に５’相同性アーム及びＡｐｏＥ遺伝子座に３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することと、（ｂ）対象とするＡｐｏＥゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む遺伝子的に改変された多能性細胞を特定することと、を含み、標的遺伝子改変は生殖細胞系列を通して伝達することができる。
さらなる方法は、（ａ）多能性細胞に、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座に５’相同性アーム及びインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座に３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することと、（ｂ）インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座で標的遺伝子改変を含む遺伝子的に改変された多能性細胞を特定することと、を含み、標的遺伝子改変は生殖細胞系列を通して伝達することができる。
ｉｉｉ．標的遺伝子座で対象とする複数のポリヌクレオチドの組み込み方法
本明細書に提供される様々な方法及び組成物は、所与の標的遺伝子座による対象とする複数のポリヌクレオチドの標的組み込みを可能にする。上記に記載される様々な方法は、連続して反復されて、所与の標的遺伝子座への任意の数の挿入核酸の標的とする組み込みを可能にする。それ故に、様々な方法は、標的遺伝子座への少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれよりも多くの挿入核酸の挿入を提供する。特定の実施形態において、そのような連続タイリング法は、真核細胞、例えば、非ラット真核細胞、哺乳動物細胞（すなわち、ヒト、非ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、サル、ラット、ハムスター、家畜哺乳動物、または農業用動物）から標的遺伝子座への大規模なゲノム領域の再構築を可能にする。そのような例において、コード領域及び非コード領域の両方を含むゲノム領域の移動及び再構築は、少なくとも一部分において、コード領域、非コード領域、及び天然のゲノム領域内に見出されるコピー数の変形例に保持することによって、所与の領域の複雑性が保存されるのを可能にする。それ故に、様々な方法は、例えば、任意の真核細胞、任意の非ラット真核細胞、任意の哺乳動物細胞、または対象とする動物内、特に、原核生物の宿主細胞内または非多能性細胞、多能性細胞、もしくはＥＳ細胞内に「異種」または「外因性」ゲノム領域を生成する方法を提供する。ある非限定的例において、非ヒト動物内（すなわち、ラット内）に「ヒト化」ゲノム領域を生成する。任意の細胞内にゲノム領域を生成する方法が本明細書に提供される。特定の実施形態において、この細胞は、真核細胞、非ラット真核細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト誘導性多能性細胞（ｉＰＳ）細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、またはＣＨＯ細胞である。
３．ヒト化ゲノム遺伝子座
ヒト化ゲノム遺伝子座を含む様々な方法及び組成物が本明細書に提供される。本明細書に使用される「ヒト化」ゲノム遺伝子座とは、少なくとも１つのヒト核酸配列を含む非ヒトゲノムの領域を意味する。ヒト化ゲノム遺伝子座は、その中に挿入されたヒトＤＮＡ配列を有する任意の生物からのＤＮＡの領域を含むことができる。特定の実施形態において、生物は、真核生物、非ラット真核生物、非ヒト哺乳動物、哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、ラット、マウス、またはハムスターである。例えば、「ヒト化ラット遺伝子座」は、その中に挿入されたヒトＤＮＡ配列を有するラットＤＮＡの領域を含む。
ヒトＤＮＡ配列は、天然に存在するヒトＤＮＡ配列であり得るか、またはその天然型から改変され得る。特定の実施形態において、ヒトＤＮＡは、天然型ヒト配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を共有する。ヒト配列が天然型ヒト配列ではない場合、それは、オーソロガスな非ヒト配列が有するよりも天然型ヒト配列に対してより大きな配列同一性を少なくとも有する。さらになお、ヒトＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡの領域、非コード調節領域、またはヒトＤＮＡのコード、ゲノム、もしくは調節領域の任意の部分を含み得る。非ヒト遺伝子座に挿入されたヒトＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所に記載されるように、挿入ポリヌクレオチドのうちのいずれかを含み得る。特定の実施形態において、ヒトＤＮＡ配列は、非ヒト標的遺伝子座に対してオーソロガスであるが、他の例では、ヒトＤＮＡ配列は、非ヒト標的遺伝子座に対して相同である。
一実施形態において、標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の挿入、または相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性核酸配列の置換である。一実施形態において、標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の挿入、または対応する非ヒト核酸配列を含む内因性遺伝子座で相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性核酸配列の置換を含む。
ヒト化遺伝子座を作製するための方法は、核酸を含む標的遺伝子座に、ヒト核酸配列を導入することを含む。一実施形態において、ヒト化非ヒト動物を作製する方法が提供される。そのような方法は、（ａ）非ヒト多能性細胞または非多能性細胞のゲノムを、ヒト核酸配列を含む挿入核酸を含む標的化ベクターを用いて改変して、ドナー細胞を形成することと、（ｂ）ドナー細胞を宿主胚に導入することと、（ｃ）代理母において宿主胚を懐胎させることと、を含み、この代理母がヒト核酸配列を含む子孫を生む。特定の実施形態において、ヒト化遺伝子座は、生殖細胞系列を通して伝達することができる。さらなる実施形態において、標的化ベクターは、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）及びヒト核酸配列が少なくとも５ｋｂである挿入核酸を含む。
他の方法において、ヒト化ゲノム遺伝子座は、細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）を介して核酸の標的遺伝子座を改変することによって作製される。本方法は、原核細胞に、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することを含み、挿入核酸はヒト核酸配列を含み、原核細胞は核酸を含み、標的遺伝子座でＢＨＲを媒介するリコンビナーゼを発現することができる。
ヒト化ゲノム遺伝子座は、（ａ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列の挿入、（ｂ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性核酸配列の置換、または（ｃ）それらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態において、ヒト化ゲノム遺伝子座は、生殖細胞系列を通して伝達することができる。さらに他の実施形態において、オーソロガスなヒト配列は、非ヒト遺伝子座において見出される対応する配列を置換する。
任意のヒト核酸配列は、本明細書に提供される方法及び組成物において使用され得る。方法及び組成物において使用され得るヒト核酸配列の非限定的な例は、本明細書の他の箇所で詳細に論じられる。
対象とする遺伝子座への挿入のためのヒト核酸配列は、任意の大きさであり得る。一実施形態において、ヒト核酸配列は、約５００ヌクレオチド〜約２００ｋｂ、約５００ヌクレオチド〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、または約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであり得る。特定の実施形態において、ヒト核酸配列は、少なくとも５ｋｂである。
一実施形態において、相同またはオーソロガスなヒト核酸配列が、（ａ）哺乳動物の重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ遺伝子セグメント、及び１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメント、（ｂ）哺乳動物の重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列、（ｃ）哺乳動物の免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリンＶκもしくはＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリンＪκもしくはＪλ遺伝子セグメント、または（ｄ）哺乳動物の免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される再配列されたヒト免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖可変領域の核酸配列を含む、ゲノム遺伝子座が提供される。
別の実施形態において、（ａ）哺乳動物の免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列は、定常領域の核酸配列、ヒト定常領域の核酸配列、またはそれらの組み合わせであるか、または（ｂ）哺乳動物の免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列は、ラット定常領域の核酸配列、ヒト定常領域の核酸配列、またはそれらの組み合わせである、ゲノム遺伝子座が提供される。
特定の実施形態において、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／またはそれらの組み合わせから選択されるか、またはそれらを含む、ゲノム遺伝子座が提供される。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なヒトＤ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、及び／またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なＪＨ遺伝子セグメントを含む。一実施形態において、挿入核酸は、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、Ｖκ２−４０、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。
さらに別の実施形態において、ヒトインターロイキン−２受容体（ＩＬ２Ｒ）核酸配列またはその変異体もしくは断片を含むヒト化ゲノム遺伝子座を含むゲノム遺伝子座が提供される。特定の実施形態において、ＩＬ２Ｒ核酸配列は、インターロイキン−２受容体アルファ、インターロイキン−２受容体ベータ、またはインターロイキン−２受容体ガンマ核酸配列またはその変異体もしくは断片を含む。
さらなる実施形態において、ゲノム遺伝子座は、非ヒトＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／もしくはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の対応する相同またはオーソロガス部分を置換する、ヒトＡｐｏＥ遺伝子座、ヒトインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ヒトＲａｇ２遺伝子座、ヒトＲａｇ１遺伝子座、及び／またはヒトＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分を含むヒト化ゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、ＩＬ−２Ｒｇの非ヒト細胞外ドメインを、ヒトＩＬ−２Ｒｇの細胞外ドメインと置換し、この分子の残りは非ヒト由来である。
別の実施形態において、ヒト化ゲノム遺伝子座を含む遺伝子的に改変された非ヒト動物が提供される。そのような遺伝子的に改変された非ヒト動物は、（ａ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列の挿入、（ｂ）内因性ゲノム遺伝子座での相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による核酸配列の置換、または（ｃ）それらの組み合わせを含み、ヒト化ゲノム遺伝子座は、生殖細胞系列を通して伝達することができる。
本明細書に提供され、上述される様々なヒト化ゲノム遺伝子座のうちのいずれかを含む非ヒト動物を含む）遺伝子的に改変された動物も提供される。
４．対象とするポリヌクレオチド
対象とする任意のポリヌクレオチドは、様々な挿入核酸に含まれ、それにより、標的遺伝子座で組み込まれ得る。本明細書で開示される方法は、標的とするゲノム遺伝子座に組み込まれる少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれよりも多くの対象とするポリヌクレオチドを提供する。
標的ゲノム遺伝子座で組み込まれるとき、挿入核酸内の対象とするポリヌクレオチドは、細胞に１つ以上の遺伝子改変を導入することができる。遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び／または標的ゲノム遺伝子座への外因性もしくは異種もしくはオーソロガスポリヌクレオチドの付加を含むことができる。一実施形態において、遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座で対象とする外因性ポリヌクレオチドによる内因性核酸配列の置換を含む。したがって、本明細書に提供される方法は、ノックアウト、欠失、挿入、置換（「ノックイン」）、点突然変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、またはそれらの組み合わせを含む遺伝子改変の生成を可能にする。そのような改変は、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、または任意のその後の挿入核酸の組み込みの際に生じ得る。
挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれる対象とするポリヌクレオチドは、それを導入する細胞に天然で存在する配列を含むことができ、対象とするポリヌクレオチドは、それを導入する細胞に異種であり得、対象とするポリヌクレオチドは、それを導入する細胞に外因性であり得、対象とするポリヌクレオチドは、それを導入する細胞にオーソロガスであり得るか、または対象とするポリヌクレオチドは、それを導入する細胞とは異なる種からのものであり得る。本明細書に使用される、標的遺伝子座で挿入される配列に関して「天然に存在する」とは、標的遺伝子座を有する細胞に天然に存在する、または標的遺伝子座が（すなわち、ラットに）由来した細胞に天然に存在する配列である。本明細書に使用される、配列に関して「異種」は、外来種に由来する、または同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入により組成物及び／またはゲノム遺伝子座においてその天然形態とは実質的に異なるまたは改変される配列を含む。本明細書に使用される、配列に関して「外因性」は、外来種に由来する配列である。対象とするポリヌクレオチドは、非ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、ハムスター、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳動物、または非農業用哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない、対象とする任意の生物からのものであり得る。対象とするポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、調節領域、またはゲノムＤＮＡをさらに含み得る。それ故に、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７の、及び／またはその後の挿入核酸のうちのいずれも、そのような配列を含むことができる。
一実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれる対象とするポリヌクレオチドは、マウス核酸配列、ヒト核酸、非ヒト核酸、真核生物核酸、非ラット真核生物核酸、非ヒト哺乳動物核酸、哺乳動物核酸、齧歯類核酸、非ラット齧歯類核酸、ラット核酸、ハムスター核酸、サル核酸、農業用哺乳動物核酸、または非農業用哺乳動物核酸に天然に存在する。さらに他の実施形態において、標的遺伝子座で組み込まれる対象とするポリヌクレオチドは、ゲノム核酸の断片である。一実施形態において、ゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸、非ヒト核酸、真核生物核酸、非ラット真核生物核酸、非ヒト哺乳動物核酸、哺乳動物核酸、齧歯類核酸、非ラット齧歯類核酸、ラット核酸、ハムスター核酸、サル核酸、農業用哺乳動物核酸、もしくは非農業用哺乳動物核酸、またはそれらの組み合わせである。
一実施形態において、対象とするポリヌクレオチドは、上述のように、約５００ヌクレオチド〜約２００ｋｂの範囲に及び得る。対象とするポリヌクレオチドは、約５００ヌクレオチド〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、または約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂからのものであり得る。
挿入核酸内の及び／または標的ゲノム遺伝子座で挿入される対象とするポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、ｍｉＲＮＡをコードすることができるか、または例えば、調節配列、プロモータ配列、エンハンサー配列、転写リプレッサー結合配列を含む対象とする任意の調節領域もしくは非コード領域、または非タンパク質コード配列の欠失を含むことができるが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。さらに、挿入核酸内の及び／または標的ゲノム遺伝子座で挿入される対象とするポリヌクレオチドは、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋肉系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、またはそれらの組み合わせで発現されるタンパク質をコードすることができる。一実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的ゲノム遺伝子座で挿入される対象とするポリヌクレオチドは、骨髄または骨髄由来細胞で発現されるタンパク質をコードする。一実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で挿入される対象とするポリヌクレオチドは、膵臓細胞で発現されるタンパク質をコードする。さらに他の実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で挿入される対象とするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞で発現されるタンパク質をコードし、未成熟Ｂ細胞で発現されるタンパク質をコードするか、または成熟Ｂ細胞で発現されるタンパク質をコードする。
挿入ポリヌクレオチド内の対象とするポリヌクレオチドは、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分を含むことができる。これらの所与の遺伝子座のそのような部分は、本明細書の他の箇所で論じられており、用いられ得る対象とする任意の生物からの様々な相同及びオーソロガス領域も同様である。
一実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で挿入される対象とするポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という表現は、本明細書の他の箇所に記載されている。
一実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で挿入される対象とするポリヌクレオチドは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。
一実施形態において、ゲノム核酸配列は、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ遺伝子セグメント、及び１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントを含み、これらは、哺乳動物の重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される。一実施形態において、ゲノム核酸配列は、哺乳動物の重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む。一実施形態において、ゲノム核酸配列は、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリンＶκもしくはＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリンＪκもしくはＪλ遺伝子セグメントを含み、これらは、哺乳動物免疫グロブリンλもしくはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される。一実施形態において、ゲノム核酸配列は、哺乳動物免疫グロブリンλまたはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリンλまたはκ軽鎖可変領域の核酸配列を含む。一実施形態において、重鎖定常領域の核酸配列は、ラット定常領域の核酸配列、ヒト定常領域の核酸配列、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態において、免疫グロブリンλまたはκ軽鎖定常領域の核酸は、ラット定常領域の核酸配列、ヒト定常領域の核酸配列、またはそれらの組み合わせを含む。
一実施形態において、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／またはそれらの組み合わせから選択されるか、またはそれらを含む。一実施形態において、重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。
一実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれる対象とするポリヌクレオチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。「軽鎖」という表現は、任意の生物からの免疫グロブリン軽鎖配列を含み、本明細書の他の箇所に記載されている。
一実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれる対象とするポリヌクレオチドは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。
一実施形態において、ゲノム核酸配列は、１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリンＶκまたはＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリンＪκまたはＪλ遺伝子セグメントを含み、これらは、齧歯類免疫グロブリンλまたはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される。一実施形態において、ゲノム核酸配列は、齧歯類免疫グロブリンλまたはκ軽鎖軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリンλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態において、軽鎖定常領域の核酸配列は、ラット定常領域の核酸配列、ヒト定常領域の核酸配列、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態において、免疫グロブリンλまたはκ軽鎖定常領域の核酸は、ラット定常領域の核酸配列、ヒト定常領域の核酸配列、またはそれらの組み合わせを含む。
挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、細胞外タンパク質または受容体に対するリガンドをコードすることができる。特定の実施形態において、コードされたリガンドは、サイトカインである。対象とするサイトカインは、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ、ＣＸ３ＣＬ、及び／またはＸＣＬから選択される、またはそれらを含むケモカインを含む。このサイトカインはまた、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含むこともできる。さらに他の実施形態において、このサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）である。一実施形態において、このインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、及び／またはＩＬ−３６から選択される、またはそれらを含む。一実施形態において、このインターロイキンは、ＩＬ−２である。特定の実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的ゲノム遺伝子座で組み込まれた対象とするそのようなポリヌクレオチドは、ヒトからのものであり、より具体的な実施形態において、ヒトゲノム配列を含むことができる。
挿入核酸内の及び／または標的ゲノム遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）をコードすることができる。
挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、細胞質タンパク質または膜タンパク質をコードすることができる。一実施形態において、この膜タンパク質は、受容体、例えば、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、インターロイキン２受容体−アルファ、インターロイキン−２受容体ベータ、インターロイキン−２受容体ガンマ、または受容体チロシンキナーゼである。他の例では、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、標的遺伝子座のオーソロガスまたは相同領域を含むことができる。
挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体アルファを含むＴ細胞受容体の少なくとも１つの領域をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。特定の方法では、挿入核酸の各々は、連続的な組み込みの終了の際に、ゲノムＴ細胞受容体遺伝子座の一部分または全体が標的遺伝子座で組み込まれるように、Ｔ細胞受容体遺伝子座（すなわち、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座）のゲノム領域を含む。そのような挿入核酸は、Ｔ細胞受容体遺伝子座（すなわち、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座）の可変セグメントまたは結合セグメントのうちの少なくとも１つ以上を含むことができる。さらに他の実施形態において、Ｔ細胞受容体の領域をコードする対象とするポリヌクレオチドは、例えば、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、ラット、ヒト、サル、ハムスター、農業用哺乳動物、または家畜用哺乳動物からの、突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。
他の実施形態において、標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、核タンパク質をコードする。一実施形態において、核タンパク質は、核受容体である。特定の実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするそのようなポリヌクレオチドは、ヒトからのものであり、より具体的な実施形態において、ヒトゲノム配列を含むことができる。
挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、コード配列において遺伝子改変を含むことができる。そのような遺伝子改変としては、コード配列の欠失突然変異または２つのコード配列の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、例えば、ヒト突然変異タンパク質を含む突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。一実施形態において、この突然変異タンパク質は、変化した結合特性、変化した局在、変化した発現、及び／または変化した発現パターンを特徴とする。一実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、例えば、神経性疾患の対立遺伝子、心臓血管疾患の対立遺伝子、腎疾患の対立遺伝子、筋肉疾患の対立遺伝子、血液疾患の対立遺伝子、発癌性遺伝子の対立遺伝子、または免疫系疾患の対立遺伝子を含む、少なくとも１つの疾患対立遺伝子を含む。そのような例では、この疾患対立遺伝子は、優性対立遺伝子であり得るか、またはこの疾患の対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。さらに、この疾患対立遺伝子は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含むことができる。突然変異タンパク質をコードする対象とするポリヌクレオチドは、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、ラット、ヒト、サル、ハムスター、農業用哺乳動物、または家畜用哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない、任意の生物からの、突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。
一実施形態において、遺伝子改変は、変化した結合特性、変化した局在、変化した発現、及び／または変化した発現パターンを有するタンパク質の突然変異形態を生み出す。
一実施形態において、遺伝子改変は、ＡｐｏＥ遺伝子座、例えば、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座の領域の欠失、付加、置換、またはそれらの組み合わせをもたらし、ＡｐｏＥ遺伝子座での遺伝子改変は、ＡｐｏＥ活性を低下させる。一実施形態において、ＡｐｏＥノックアウトが作製される。
一実施形態において、遺伝子改変は、Ｒａｇ１遺伝子座、例えば、ラットＲａｇ１遺伝子座の領域の欠失、付加、置換、またはそれらの組み合わせをもたらし、Ｒａｇ１遺伝子座での遺伝子改変は、Ｒａｇ１活性を低下させる。一実施形態において、Ｒａｇ１ノックアウトが作製される。一実施形態において、遺伝子改変は、Ｒａｇ２遺伝子座、例えば、ラットＲａｇ２遺伝子座の領域の欠失、付加、置換、またはそれらの組み合わせをもたらし、Ｒａｇ２遺伝子座での遺伝子改変は、Ｒａｇ２活性を低下させる。一実施形態において、Ｒａｇ２ノックアウトが作製される。一実施形態において、遺伝子改変は、Ｒａｇ１／Ｒａｇ２遺伝子座、例えば、ラットＲａｇ１／Ｒａｇ２遺伝子座の領域の欠失、付加、置換、またはそれらの組み合わせをもたらし、Ｒａｇ１／Ｒａｇ２遺伝子座での遺伝子改変は、Ｒａｇ１活性を低下させ、Ｒａｇ２活性を低下させる。一実施形態において、Ｒａｇ１／Ｒａｇ２ノックアウトが作製される。
一実施形態において、遺伝子改変は、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、例えば、ラットインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座の領域の欠失、付加、置換、またはそれらの組み合わせをもたらし、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座での遺伝子改変は、インターロイキン−２受容体ガンマを低下させる。一実施形態において、インターロイキン−２受容体ガンマノックアウトが作製される。
本明細書の他の箇所で論じられるように、本明細書に提供されるさらなる実施形態は、ＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座のうちの１つ以上を含み、例えば、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座、ラットインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の一部分の、別の生物からのＡｐｏＥ遺伝子座、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、及び／またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の対応するオーソロガスな部分による置換を通して改変される。
一実施形態において、複数の遺伝子改変を生じさせる。一実施形態において、遺伝子改変は、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、例えば、ラットインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座の領域の欠失、付加、置換、またはそれらの組み合わせをもたらし、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座での遺伝子改変は、インターロイキン−２受容体ガンマを低下させ、第２の遺伝子改変は、ラットＲａｇ２遺伝子座の領域の欠失、付加、置換、またはそれらの組み合わせをもたらし、Ｒａｇ２遺伝子座での遺伝子改変は、Ｒａｇ２活性を低下させる。一実施形態において、インターロイキン−２受容体ガンマ／Ｒａｇ２ノックアウトが作製される。そのようなラットは、ＳＣＩＤ表現型を有する。
一実施形態において、哺乳動物の核酸は、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋肉系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、またはそれらの組み合わせで発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、哺乳動物の核酸は、骨髄または骨髄由来細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、核酸は、脾臓細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、マウスゲノムＤＮＡ配列、ラットゲノムＤＮＡ配列、ヒトゲノムＤＮＡ配列、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、ラット及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、マウス及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、マウス及びラットゲノムＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ゲノム遺伝子座は、順序を問わず、ラット、マウス、及びヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。
一実施形態において、挿入核酸は、遺伝子のコード配列において遺伝子改変を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、コード配列の欠失突然変異体を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、２つの内因性コード配列の融合を含む。
一実施形態において、遺伝子改変は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。一実施形態において、非タンパク質コード配列の欠失は、調節要素の欠失を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、プロモータの付加を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、プロモータまたは調節要素の置換を含む。一実施形態において、調節要素は、エンハンサーである。一実施形態において、調節要素は、転写レプレッサー結合要素である。
一実施形態において、遺伝子改変は、突然変異ヒトタンパク質をコードするヒト核酸配列の置換を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、ヒト遺伝子の少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態において、ヒト疾患は、神経疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、心臓血管疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、腎疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、筋肉疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、血液疾患である。一実施形態において、ヒト疾患は、癌である。一実施形態において、ヒト疾患は、免疫系疾患である。一実施形態において、ヒト疾患対立遺伝子は、優性対立遺伝子である。一実施形態において、ヒト疾患対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。一実施形態において、ヒト疾患対立遺伝子は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含む。
挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドはまた、例えば、プロモータ配列、エンハンサー配列、または転写リプレッサー結合配列を含む調節配列も含み得る。特定の実施形態において、挿入核酸内の及び／または標的遺伝子座で組み込まれた対象とするポリヌクレオチドは、非タンパク質コード配列の欠失を有するポリヌクレオチドを含むが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。一実施形態において、非タンパク質コード配列の欠失は、調節配列の欠失を含む。別の実施形態において、調節要素の欠失は、プロモータ配列の欠失を含む。一実施形態において、調節要素の欠失は、エンハンサー配列の欠失を含む。そのような対象とするポリヌクレオチドは、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、齧歯類、非ラット齧歯類、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳動物、または家畜用哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない、任意の生物からの突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。
５．配列の導入及びトランスジェニック動物の生成の方法
上で概説されたように、標的遺伝子座への対象とする１つ以上のポリヌクレオチドの標的とする組み込みを可能にする方法及び組成物が、本明細書に提供される。そのようなシステムは、様々な成分を用い、参照の便宜上、本明細書で、「標的組み込みシステム」という用語は、一般的に、組み込み事象（すなわち、非限定的な例において、様々なヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ＤＮＡポリヌクレオチド、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び／または対象とするポリヌクレオチド）に必要なすべての成分を含む。
本明細書に提供される方法は、細胞に、対象とするゲノム組み込みシステムの様々な要素を含む１つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド構築物を導入することを含む。「導入すること」は、配列が細胞の内部にアクセスするような様式で細胞に配列（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を提示することを意味する。本明細書に提供される方法は、細胞への対象とするゲノム組み込みシステムの任意の成分を導入するための特定の方法に依存せず、ただ、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの細胞の内部にアクセスするものである。様々な細胞型にポリヌクレオチドを導入するための方法が当該技術分野で周知であり、これには、安定したトランスフェクション法、一過的なトランスフェクション法、及びウイルス媒介性の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
任意の生物からの任意の細胞を、本明細書に提供される方法で使用することができる。特定の実施形態において、細胞は、真核生物、非ラット真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、非ラット齧歯類、ラット、マウス、またはハムスターからのものである。特定の実施形態において、細胞は、真核細胞、非ラット真核細胞、多能性細胞、非多能性細胞、非ヒト多能性細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、ヒト誘導多能性細胞（ｉＰＳ）細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、またはＣＨＯ細胞である。
いくつかの実施形態において、本方法及び組成物で用いられる細胞は、それらのゲノムに安定に組み込まれたＤＮＡ構築物を有する。「安定に組み込まれた」または「安定に導入された」とは、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれ、その子孫に継承されることが可能な細胞へのポリヌクレオチドの導入を意味する。任意のプロトコルは、ＤＮＡ構築物または対象とするゲノム組み込みシステムの様々な成分の安定した組み込みに使用され得る。
トランスフェクションプロトコル、及びポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を細胞に導入するためのプロトコルは変化し得る。化学系トランスフェクション法を含む非限定的なトランスフェクション法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６−６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４（４）：１５９０−４、及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６−９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ−デキストランもしくはポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーの使用が含まれる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、及び光学的トランスフェクションが含まれる。粒子系トランスフェクションには、遺伝子銃、磁気を利用したトランスフェクション（ｍａｇｎｅｔ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の使用が含まれる（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７−２８）。また、様々な方法をトランスフェクションのために使用することもできる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドのうちの１つ以上の細胞への導入は、電気穿孔、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクションにより媒介されるか、またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）により媒介される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドのうちの１つ以上の細胞への導入は、プロモータに作動可能に連結された対象とする核酸配列を含む発現構築物を導入することをさらに含む。一実施形態において、このプロモータは、構成的に活性なプロモータである。一実施形態において、このプロモータは、誘導プロモータである。一実施形態において、このプロモータは、幹細胞、例えば、胚幹細胞に活性である。
一実施形態において、発現構築物は、ＬＴＶＥＣと一緒に導入される。一実施形態において、発現構築物は、ある期間にわたってＬＴＶＥＣとは別々に導入される。
一実施形態において、細胞への１つ以上のポリヌクレオチドの導入は、ある期間にわたって複数回行われ得る。一実施形態において、細胞への１つ以上のポリヌクレオチドの導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回行われる。
一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターまたは大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）で同時に細胞に導入される。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ある期間にわたって標的化ベクターまたはＬＴＶＥＣとは別々に導入される。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターまたはＬＴＶＥＣの導入前に導入されるが、他の実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターまたはＬＴＶＥＣの導入後に導入される。
一実施形態において、スクリーニングステップは、親染色体の対立遺伝子（ＭＯＡ）の改変を評価するために定量的アッセイを含む。一実施形態において、定量的アッセイは、定量ＰＣＲを介して行われる。一実施形態において、定量的ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。一実施形態において、リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び標的とされない参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを含む。一実施形態において、プライマーセットは、増幅配列を認識する蛍光プローブを含む。一実施形態において、定量的アッセイは、蛍光媒介インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、比較ゲノムハイブリダイゼーションを介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、等温ＤＮＡ増幅を介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、等温ＤＮＡ増幅を介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、固定化されたプローブ（複数を含む）への定量的ハイブリダイゼーションを介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）を介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、ＭＭＰアッセイ（登録商標）を介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎを介して行われる。一実施形態において、定量的アッセイは、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術を介して行われる（例えば、米国特許出願第ＵＳ２００５／０１４４６５５号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ヒト化非ヒト動物を作製するための方法であって、（ａ）多能性細胞のゲノムを、ヒト核酸配列を含む挿入核酸を含む標的化ベクターを用いて改変して、ドナー細胞を形成することと、（ｂ）ドナー細胞を宿主胚に導入することと、（ｃ）代理母において宿主胚を懐胎させることと、を含み、この代理母が、ヒト核酸配列を含む子孫を生み出す、方法がさらに提供される。一実施形態において、ドナー細胞は、胞胚期またはプレ桑実胚期（すなわち、４細胞期または８細胞期）である宿主胚に導入される。さらに、ステップ（ａ）はまた、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）及び／または少なくとも５ｋｂ長のヒト核酸配列で行われ得る。さらに他の実施形態において、遺伝子改変は、生殖細胞系列を通して伝達することができる。
遺伝子的に改変された非ヒト動物が、本明細書で開示される様々な方法を用いて生成され得る。そのような方法は、（１）本明細書で開示される方法を用いて、多能性細胞の標的遺伝子座で１つ以上の対象とするポリヌクレオチドを組み込んで、標的とするゲノム遺伝子座で挿入核酸を含む遺伝子的に改変された多能性細胞を生成することと、（２）標的ゲノム遺伝子座で１つ以上の対象とするポリヌクレオチドを有する遺伝子的に改変された多能性細胞を選択することと、（３）遺伝子的に改変された多能性細胞を宿主胚に導入することと、（４）遺伝子的に改変された多能性細胞を含む宿主胚を代理母に移植することと、を含む。遺伝子的に改変された多能性細胞からの子孫が生成される。一実施形態において、ドナー細胞は、胞胚期またはプレ桑実胚期（すなわち、４細胞期または８細胞期）である宿主胚に導入される。生殖細胞系列を通して伝達することができる子孫が生成される。この多能性細胞は、本明細書の他の箇所で論じられるように、ＥＳ細胞であり得る。
核移植技術をまた、遺伝子的に改変された非ヒト動物を生成するためにも使用することができる。簡潔に言えば、核移動のための方法は、（１）卵母細胞を除核するステップと、（２）除核卵母細胞と組み合わせられるドナー細胞または核を単離するステップと、（３）この細胞または核を除核卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成するステップと、（４）この再構成された細胞を動物の子宮に移植して、胚を形成するステップと、（５）胚を発生させるステップと、を含む。そのような方法において、卵母細胞は、一般に、死亡した動物から回収されるが、それらはまた、生きた動物の卵管及び／または卵巣から単離してもよい。卵母細胞は、除核前に当業者に周知の様々な培地内で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、当業者に周知の多くの様式で行うことができる。再構成された細胞を形成するための、除核卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、通常、融合前の透明帯下へのドナー細胞のマイクロインジェクションによるものである。融合は、接触／融合面に対するＤＣ電気パルスの適用（電気融合）、ポリエチレングリコール等の融合促進化学物質への細胞の曝露、またはセンダイウイルス等の不活性化ウイルスによって誘導され得る。再構成された細胞は、典型的には、核ドナー及びレシピエント卵母細胞の融合の前、その間、及び／またはその後に、電気的手段及び／または非電気的手段によって活性化される。活性化方法には、電気パルス、化学的誘導ショック、精子の侵入、卵母細胞内の二価陽イオンレベルの増加、及び卵母細胞内の（キナーゼ阻害剤等による）細胞タンパク質のリン酸化の減少が含まれる。活性化された再構成された細胞または胚は、典型的には、当業者に周知の培地中で培養され、次いで、動物の子宮へと移植される。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００８００９２２４９号、国際公開第ＷＯ／１９９９／００５２６６Ａ２号、米国特許公開第ＵＳ２００４０１７７３９０号、国際公開第ＷＯ／２００８／０１７２３４Ａ１号、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
一態様において、遺伝子的に改変された非ヒト動物を作製するための方法であって、エンドヌクレアーゼ媒介遺伝子標的化を用いて、多能性細胞における対象とするゲノム遺伝子座を改変し、対象とするゲノム遺伝子座で改変を導入して、改変された多能性細胞を形成することと、多能性を維持するのに十分な条件下で、改変された多能性細胞を維持することと、宿主胚におけるドナー細胞として改変された多能性細胞を用いることと、代理母において改変された多能性細胞を含む宿主胚を懐胎させることと、を含み、代理母がこの宿主胚を懐胎し、遺伝子的に改変された子孫が生まれる、方法が提供される。
一実施形態において、この標的配列は、イントロン中に位置する。一実施形態において、この標的配列は、エクソン中に位置する。一実施形態において、この標的配列は、プロモータ中に位置する。一実施形態において、この標的配列は、プロモータ調節領域中に位置する。一実施形態において、この標的配列は、エンハンサー領域中に位置する。
一実施形態において、導入ステップは、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって複数回行われる。一実施形態において、ステップは、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも２回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも３回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも４回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも５回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも６回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも７回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも８回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも９回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１０回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１１回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１２回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１３回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１４回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１５回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１６回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１７回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１８回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも１９回、異なる標的配列を認識する複数のエンドヌクレアーゼを用いて、ある期間にわたって少なくとも２０回行われる。
一実施形態において、導入ステップは、電気穿孔、細胞質内注射、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクションにより媒介されるか、またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）により媒介される。
一実施形態において、本方法は、外因性核酸を遺伝子的に改変された多能性細胞に導入することをさらに含む。一実施形態において、外因性核酸は、トランス遺伝子である。一実施形態において、外因性核酸は、内因性遺伝子座に導入される。一実施形態において、外因性核酸は、異所的に（例えば、その内因性遺伝子座とは異なる遺伝子座で）導入される。
一態様において、遺伝子的に改変された非ヒト動物を作製するための方法であって、ＲＮＡにガイドされたゲノムの遺伝子操作を用いて、多能性細胞における対象とするゲノム遺伝子座を改変し、対象とするゲノム遺伝子座で改変を導入して、改変された多能性細胞を形成することと、多能性を維持するのに十分な条件下で、改変された多能性細胞を維持することと、宿主胚におけるドナー細胞として改変された多能性細胞を用いることと、代理母において改変された多能性細胞を含む宿主胚を懐胎させることと、を含み、代理母がこの宿主胚を懐胎し、遺伝子的に改変された子孫が生まれる、方法が提供される。
一実施形態において、本方法は、約２％〜約８０％の範囲に及ぶ標的化率を有する。
一実施形態において、本方法は、異なるゲノム遺伝子座の多重編集のために異なるゲノム標的配列を含む複数の第２の発現構築物を同時導入することを含む。一実施形態において、本方法は、ある期間にわたって異なるゲノム遺伝子座の多重編集のために異なるゲノム標的配列を含む複数の第２の発現構築物を導入することを含む。
一実施形態において、導入ステップは、ある期間にわたって複数回行われる。一実施形態において、導入ステップ（ｂ）は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回行われる。
一実施形態において、第１の発現構築物及び第２の発現構築物は、同じプラスミドから発現される。
一実施形態において、導入ステップは、電気穿孔、細胞質内注射、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクションにより媒介されるか、またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）により媒介される。
一実施形態において、本方法は、外因性核酸を、突然変異対立遺伝子を含む多能性細胞に導入することをさらに含む。
一実施形態において、外因性核酸は、トランス遺伝子である。一実施形態において、外因性核酸は、内因性遺伝子座に導入される。一実施形態において、外因性核酸は、異所的に（例えば、その内因性遺伝子座とは異なる遺伝子座で）設置される。
一実施形態において、本方法は、外因性核酸を遺伝子的に改変された多能性細胞に導入することをさらに含む。一実施形態において、外因性核酸は、トランス遺伝子である。一実施形態において、外因性核酸は、内因性遺伝子座に導入される。一実施形態において、外因性核酸は、異所的に（例えば、その内因性遺伝子座とは異なる遺伝子座で）導入される。
一態様において、ヒト化非ヒト動物を作製するための方法であって、少なくとも５ｋｂのヒト配列を含む挿入を含むＬＴＶＥＣを用いて多能性細胞のゲノムを改変することと、ドナー細胞として多能性細胞を用いることと、ドナー細胞を宿主胚に導入することと、代理母において宿主胚を懐胎させることと、を含み、この代理母がヒト化を含む子孫を出産する、方法が提供される。
本明細書に記載される、その生殖細胞系列における１つ以上の遺伝子改変を含む遺伝子的に改変された非ヒト動物を作製するための他の方法であって、（ａ）本明細書に記載される様々な方法を用いて、原核細胞に含まれる標的遺伝子座を改変することと、（ｂ）標的遺伝子座で遺伝子改変を含む改変された原核細胞を選択することと、（ｃ）改変された原核細胞のゲノムから遺伝子的に改変された標的化ベクターを単離することと、（ｄ）遺伝子的に改変された標的化ベクターを多能性細胞に導入して、標的とするゲノム遺伝子座で挿入核酸を含む遺伝子的に改変された多能性細胞を生成することと、（ｅ）遺伝子的に改変された多能性細胞を選択することと、（ｆ）プレ桑実胚期で遺伝子的に改変された多能性細胞を宿主胚に導入することと、（ｇ）遺伝子的に改変された多能性細胞を含む宿主胚を代理母に移植して、遺伝子的に改変された多能性細胞に由来するＦ０世代を生成することと、を含む、方法が提供される。そのような方法において、標的化ベクターは、大きな標的化ベクターを含むことができる。多能性細胞は、ＥＳ細胞であり得る。さらなる方法において、単離ステップ（ｃ）は、（ｃ１）遺伝子的に改変された標的化ベクター（すなわち、遺伝子的に改変されたＬＴＶＥＣ）を線形化することをさらに含む。さらに他の実施形態において、導入ステップ（ｄ）は、（ｄ１）本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤を多能性細胞に導入することをさらに含む。一実施形態において、選択ステップ（ｂ）及び／または（ｅ）は、本明細書に記載される選択可能な薬剤を原核細胞または多能性細胞に適用することによって行われる。一実施形態において、選択ステップ（ｂ）及び／または（ｅ）は、本明細書に記載される対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を介して行われる。
原核細胞における細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）を介して哺乳動物細胞の標的遺伝子座を改変するためのさらなる方法が提供され、これらの方法には、（ａ）核酸を含む標的遺伝子座を含む原核細胞を提供することと、（ｂ）原核細胞に、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することであって、挿入核酸が哺乳動物領域を含む（例えば、ヒトからのＤＮＡ挿入を含む）、導入することと、（ｃ）標的遺伝子座で挿入核酸を含む標的とする原核細胞を選択することと、を含み、原核細胞は、ＢＨＲを媒介するリコンビナーゼを発現することができる。ステップ（ａ１）は、第１のヌクレアーゼ剤に対して第１の認識部位を含む第１のポリヌクレオチドを含む核酸を含む標的遺伝子座を含む原核細胞を提供することを含み得、ステップ（ｂ１）は、原核細胞において、第１の認識部位でまたはその近傍でニックまた二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤を発現することをさらに含み得る。ステップ（ａ）〜（ｃ）は、原核細胞における標的遺伝子座での複数の挿入核酸の導入を可能にするために、本明細書で開示されるように、連続的に繰り返され得る。一旦標的とするゲノム遺伝子座が原核細胞を用いて「構築される」と、改変された標的遺伝子座を含む標的化ベクターは、原核細胞から単離され、多能性細胞内で標的ゲノム遺伝子座に導入され得る。次いで、改変されたゲノム遺伝子座を含む多能性細胞（すなわち、ＥＳ細胞）を、遺伝子的に改変された非ヒト動物に作製することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される標的ゲノム遺伝子座の様々な遺伝子改変は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子組み換え技術を用いて細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡに由来するＬＴＶＥＣを用いて細菌性細胞における一連の相同的組み換え反応（ＢＨＲ）によって行われ得る（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（６）：６５２−６５９を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される様々な遺伝子改変を含む標的とするＥＳ細胞が、挿入ＥＳ細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩマウス（登録商標）方法を介して、対応する生物から、例えば、８細胞期のマウス胚のようなプレ桑実胚期の胚に導入される（例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、同第７，２９４，７５４号、及び米国特許出願第２００８−００７８０００ Ａ１号を参照されたく、これらのすべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。遺伝子的に改変されたＥＳ細胞を含む胚が、胞胚期までインキュベートされ、次いで、代理母に移植され、Ｆ０を生み出す。遺伝子的に改変されたゲノム遺伝子座を担持する動物は、本明細書に記載される対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を介して特定され得る。得られたＦ０世代の遺伝子的に改変されたＥＳ細胞に由来する非ヒト動物を、野生型非ヒト動物と交配させて、Ｆ１世代の子孫を得る。特定のプライマー及び／またはプローブにより遺伝子決定した後、遺伝子的に改変されたゲノム遺伝子座に対してヘテロ接合性であるＦ１非ヒト動物を、互いに交配させて、遺伝子的に改変されたゲノム遺伝子座に対してホモ接合性である動物を生み出す。あるいは、それぞれ遺伝子改変を有するＦ０雌非ヒト動物及びＦ０雄非ヒト動物を、交配させて、遺伝子改変に対してホモ接合性であるＦ１非ヒト動物を得ることができる。
一態様において、例えば、別の生物からの相同またはオーソロガスな核酸配列を有する内因性核酸配列の標的改変を含む、遺伝子的に改変されたラットゲノムが提供される。
一実施形態において、相同またはオーソロガスな核酸配列は、約５ｋｂ〜約２００ｋｂの長さのものである。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂの範囲に及ぶ。一実施形態において、相同またはオーソロガスな非ラット核酸配列は、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲に及ぶ。挿入核酸に用いられ得る対象とする様々なポリヌクレオチドが、本明細書の他の箇所に記載される。
非ヒト動物の標的ゲノム改変のためのさらなる方法が提供される。そのような方法は、（ａ）対象とするゲノム遺伝子座を改変するための本明細書に提供される様々な方法のうちのいずれかに従って、非ヒト多能性細胞における対象とするゲノム遺伝子座を改変し、それにより、標的ゲノム改変を含む遺伝子的に改変された非ヒト多能性細胞を生み出すことと、（ｂ）ステップ（ａ）の改変された非ヒト多能性細胞を非ヒト宿主胚に導入することと、（ｃ）代理母において改変された多能性細胞を含む非ヒト宿主胚を懐胎させることと、を含むことができ、この代理母が標的ゲノム改変を含むＦ０子孫を生み出し、標的ゲノム改変は、生殖細胞系列を通して伝達することができる。
いくつかの実施形態において、標的ゲノム改変は、対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び対象とするゲノム遺伝子座での外因性核酸の挿入（すなわち、単一ステップにおける欠失及び挿入）を同時に含む。いくつかの実施形態において、標的ゲノム改変は、２対立遺伝子の遺伝子改変を含む。２対立遺伝子の遺伝子改変は、２つの相同染色体（すなわち、一対の第１及び第２の染色体）における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び外因性核酸の挿入を含むことができる。
他の実施形態において、標的ゲノム改変は、対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である改変された多能性細胞を形成する。他の実施形態において、標的ゲノム改変は、対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である改変された多能性細胞を形成する。いくつかの実施形態において、１つの染色体における対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失及び外因性核酸の挿入を含む。例えば、標的遺伝子改変は、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への外因性核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含むことができる。第１の染色体は、２つの相同染色体のうちの第１の相同染色体であり得、第２の染色体は、２つの相同染色体のうちの第２の相同染色体であり得る。
６．細胞
本明細書に記載される様々な方法及び組成物は、細胞におけるゲノム遺伝子座の標的化システムを用いる。一実施形態において、細胞は、多能性細胞である。一実施形態において、細胞は、非多能性細胞である。一実施形態において、多能性細胞は、非ヒト多能性細胞である。一実施形態において、非ヒト多能性細胞は、哺乳動物の多能性細胞である。一実施形態において、多能性細胞は、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
他の実施形態において、この細胞は、真核細胞、非ラット真核細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限されたヒト前駆細胞、非ヒト哺乳動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、齧歯類細胞、非ラット齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、またはＣＨＯ細胞である。
一実施形態において、真核細胞は、初代細胞である。初代細胞は、生物、臓器、または組織から直接単離されている、細胞または細胞の培養物を含む。初代細胞は、形質変換も不死化もされない細胞を含む。それらは、組織培養においてこれまで継代されなかったか、または組織培養においてこれまで継代されたが、組織培養において無限に継代することができない、生物、臓器、または組織から得られた任意の細胞を含む。そのような細胞は、従来の技法によって単離することができ、例えば、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチン生成細胞、メラニン細胞、単球、単核細胞、含脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、及び平滑筋細胞を含む。いくつかの実施形態において、初代細胞は、結合組織、筋肉組織、神経系組織、または上皮組織に由来する。
別の実施形態において、真核細胞は、不死化細胞である。不死化細胞は、通常、無限に増殖しないが、突然変異または変化により、正常な細胞の老化を回避し、その代わりに分裂し続け得る、多細胞生物からの細胞を含む。そのような突然変異または変化は、天然に存在し得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、及びマウス胎児線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が含まれる。多くの種類の不死化細胞が、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態において、不死化細胞は、癌細胞に由来する。別の実施形態において、初代または不死化細胞は、組み換え遺伝子またはタンパク質を培養または発現するために、一般的に使用されるものである。
他の実施形態において、多能性細胞は、そのゲノムの少なくとも１つの標的遺伝子改変後、その多能性を維持することが可能であり、Ｆ１世代の生殖細胞系列に標的改変を伝達することができる。
一実施形態において、多能性細胞は、単細胞期の非ヒト受精卵である。一実施形態において、非ヒト受精卵は、哺乳動物の受精卵である。一実施形態において、哺乳動物の受精卵は、単細胞期の齧歯類の受精卵である。一実施形態において、哺乳動物の受精卵は、単細胞期のラットまたはマウスの受精卵である。
本明細書で開示される方法及び組成物に用いられる様々な細胞はまた、大腸菌を含む細菌性細胞等の原核細胞を含むこともできる。特定の実施形態において、原核細胞は、組換えコンピテント株の大腸菌である。一実施形態において、原核細胞は、リコンビナーゼをコードする核酸を含むが、他の例では、原核細胞は、リコンビナーゼをコードする核酸を含まず、リコンビナーゼをコードする核酸は、原核細胞に導入される。一実施形態において、リコンビナーゼをコードする核酸は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼをコードする核酸は、ｐＡＢＧである。一実施形態において、リコンビナーゼは、誘導プロモータの制御下で発現される。一実施形態において、リコンビナーゼの発現は、アラビノースによって制御される。
Ａ．ヒト誘導多能性幹細胞を作製及び維持するための低オスモル濃度の培地
細胞培養培地が、本発明の方法及び組成物で用いるために提供される。一実施形態において、この培地は、ヒトｉＰＳ細胞の集団を作製するために好適である。別の実施形態において、この培地は、培養物中でヒトｉＰＳ細胞を維持するために好適である。いくつかの実施形態において、ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブまたはナイーブ様である。
本明細書に提供される培地は、少なくとも１つの基本培地、補充物、白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤を含む。
本発明の培地は、低オスモル濃度の培地である。一例において、オスモル濃度は、約１７５〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇである。さらなる例において、培地のオスモル濃度は、約１８０〜２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２２０〜２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２２５〜２３５ｍＯｓｍである。特定の実施形態において、培地のオスモル濃度は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇである。
本発明に提供される基本培地は、補充物が添加される低オスモル濃度の基本培地である。本発明の基本培地は、様々な形態でのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＤＭＥＭ、カタログ番号１１９７１−０２５）、及びＫＯ−ＤＭＥＭ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０８２９−０１８）として市販されている低塩ＤＭＥＭを含む、培養物中でヒトｉＰＳ細胞を維持するために典型的に使用される基本培地とは異なる。
本明細書に提供される基本培地は、低オスモル濃度の培地であるが、低オスモル濃度に限定されない特徴を示す。例えば、表Ａに示されるＤＭＥＭ製剤は、本明細書に提供される塩化ナトリウム及び／または重炭酸ナトリウムの濃度を変化させることによって、本発明の目的に好適であるように作製され得、表Ａに示される標準的なＤＭＥＭ基本培地または低塩ＤＭＥＭ基本培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ）と比較して異なるオスモル濃度をもたらす。
本発明の基本培地は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）等のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩を含み得る。基本培地中のＮａＣｌの例示的な濃度は、５０±５ｍＭまたは約３ｍｇ／ｍＬを含む。
別の実施形態において、基本培地は、炭酸塩の濃度を示す。炭酸塩は、ナトリウム塩であり得る。そのような例において、このナトリウム塩は、重炭酸ナトリウムであり得る。特定の実施形態において、重炭酸ナトリウムは、約２６±５ｍＭまたは約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で基本培地中に存在する。
さらに別の実施形態において、基本培地は、低オスモル濃度の基本培地である。基本培地のオスモル濃度は、約１７５〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１８０〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１９０〜２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約１９５〜２０５ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内であり得る。基本培地の例示的なオスモル濃度は、２００、２１４、２１６、または２１８ｍＯｓｍ／ｋｇであり得る。特定の例において、基本培地のオスモル濃度は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇである。オスモル濃度は、細胞が異なる濃度のＣＯ２において培養されるときに決定され得る。いくつかの例において、細胞は、３％ ＣＯ２または５％ ＣＯ２で培養される。
好ましい実施形態において、基本培地は、３．０ｍｇ／ｍＬの濃度のＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度の重炭酸ナトリウムを含み、２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
本発明の基本培地で配合される補充物は、本明細書で開示されるヒトｉＰＳ細胞の集団を作製、維持、または富化するのに好適である。そのような補充物は、本開示では、「補充物」または「＋補充物」と示される。「補充物」という用語または「＋補充物」という表現は、表Ａに記載される基本培地の成分に添加される１つ以上のさらなる要素を含む。例えば、補充物としては、Ｆ−１２（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２（登録商標）補充物（Ｇｉｂｃｏ；１００倍溶液）、ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ−２７（登録商標）補充物（Ｇｉｂｃｏ；５０倍溶液）、Ｌ−グルタミン、グルコース、２−メルカプトエタノール、白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ＬＩＦポリペプチドは、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドである。いくつかの例において、ｈＬＩＦポリペプチドは、約１〜１０００単位／ｍＬ、約２０〜８００単位／ｍＬ、約５０〜５００単位／ｍＬ、約７５〜２５０単位／ｍＬ、または約１００単位／ｍＬの濃度で使用される。
別の特定の実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。いくつかの例において、ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．１〜１０μＭ、約１〜５μＭ、約２〜４μＭ、または約３μＭの濃度で使用される。
別の特定の実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１を含む。いくつかの例において、ＰＤ０３２５９０１は、約０．１〜５μＭ、約０．２〜１μＭ、約０．３〜０．７μＭ、または約０．５μＭの濃度で使用される。
例示的な培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の本明細書に記載される低オスモル濃度の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２補充物、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７補充物、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む。
別の特定の実施形態において、培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、またＦＧＦ２もしくはＦＧＦ−βとして知られている）を含んでも、含まなくてもよい。好ましくは、本発明の培地は、ｂＦＧＦを含まない。
Ｂ．ヒト誘導多能性幹細胞
ヒトｉＰＳ細胞の集団を作製するための方法及び組成物が、本明細書に提供される。培養物中でヒトｉＰＳ細胞を維持するための方法及び組成物が、さらに提供される。培養物中で生成または維持されるヒトｉＰＳ細胞もまた、提供される。
「多能性細胞」または「多能性幹細胞」という用語は、１つを超える分化した細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性細胞は、例えば、哺乳動物の胚幹（ＥＳ細胞）細胞または哺乳動物の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であり得る。多能性細胞の例は、ヒトｉＰＳ細胞を含む。
「胚幹細胞」または「ＥＳ細胞」という用語は、好適な条件下で、インビトロ培養物中で維持され得る胚盤胞の内細胞塊に由来する胚由来の全能または多能性細胞を意味する。ＥＳ細胞は、例えば、内胚葉、外胚葉、または中胚葉の３つの脊椎動物の胚葉のうちのいずれかの細胞に分化することができる。ＥＳ細胞はまた、好適なインビトロ培養条件下で無限に繁殖するそれらの能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）Ｖｏｌ．２８２（５３９１），ｐｐ．１１４５−１１４７）を参照のこと。
「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」という用語は、分化した成熟細胞に直接由来し得る多能性幹細胞を含む。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリー転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリー転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、Ｋｒuｐｐｅｌ様ファミ
リー（ＫＬＦ）転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、ならびに／またはＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及び／もしくはＧｌｉｓ１等の関連転写因子を含み得る非多能性細胞に、再プログラミング因子の特定のセットを導入することによって作製され得る。ヒトｉＰＳ細胞はまた、例えば、ｍｉＲＮＡ、転写因子の作用を模倣する小分子、または系列指示子の使用によっても作製され得る。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、内胚葉、外胚葉、または中胚葉の３つの脊椎動物の胚葉のうちのいずれかの細胞に分化することができるそれらの能力によって特徴付けられる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、好適なインビトロ培養条件下で無限に繁殖するそれらの能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ（２００６）Ｖｏｌ．１２６（４），ｐｐ．６６３−６７６）を参照のこと。
「ナイーブ」及び「プライム」という用語は、ヒトｉＰＳ細胞の異なる多能性の状態を特定する。「ナイーブ様」という用語は、ナイーブ多能性細胞の１つ以上の特徴を示す多能性の状態を示す細胞を特定する。ナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞はまた、「ナイーブ様」ヒトｉＰＳ細胞とも称され得る。いくつかの実施形態において、ナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、小型ドーム状のコロニーによって特徴付けられる形態等のナイーブヒトｉＰＳ細胞の１つ以上の形態学的特徴を示す。いくつかの実施形態において、ナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、本明細書に記載される多能性マーカーのうちの１つ以上を示す。いくつかの実施形態において、ナイーブまたはナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブヒトｉＰＳ細胞である。他の実施形態において、ナイーブまたはナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ様ｉＰＳ細胞である。
ナイーブ及びプライムｉＰＳ細胞は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２００９）Ｖｏｌ．４（６），ｐｐ．４８７−４９２）を参照のこと。ナイーブヒトｉＰＳ細胞は、着床前の胚の内細胞塊のＥＳ細胞の多能性の状態と類似している多能性の状態を示す。そのようなナイーブ細胞は、系統特異性及び関与に対してプライムではない。雌ナイーブｉＰＳ細胞は、２つの活性なＸ染色体によって特徴付けられる。培養物中において、ナイーブヒトｉＰＳ細胞の自己再生は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）及び他の阻害剤によって異なる。培養されたナイーブヒトｉＰＳ細胞は、丸いドーム状のコロニー及び頂低極性の欠如によって特徴付けられるクローン性形態を示す。培養されたナイーブ細胞は、本明細書の他の箇所に記載されるように１つ以上の多能性マーカーをさらに示し得る。適切な条件下で、培養物中におけるナイーブヒトｉＰＳ細胞の倍加時間は、１６〜２４時間であり得る。
プライムヒトｉＰＳ細胞は、着床後の胚盤葉上層細胞の多能性の状態と類似している多能性の状態を示す。そのような細胞は、系統特異性及び関与に対してプライムである。雌プライムｉＰＳ細胞は、１つの活性なＸ染色体及び１つの不活性なＸ染色体によって特徴付けられる。培養物中において、プライムヒトｉＰＳ細胞の自己再生は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及びアクチビンによって異なる。培養されたプライムヒトｉＰＳ細胞は、上皮単分子層によって特徴付けられるクローン性形態を示し、頂低極性を示す。適切な条件下で、培養物中におけるプライムヒトｉＰＳ細胞の倍加時間は、２４時間またはそれ以上であり得る。
一実施形態において、ヒトｉＰＳ細胞は、多能性の状態を示すように形質転換された非多能性細胞に由来し得る。そのような形質転換細胞には、例えば、多能性を誘導する再プログラミング遺伝子を発現するように形質転換されている細胞が含まれる。多能性の状態には、例えば、本明細書に記載される多能性マーカーのうちの１つ以上の発現が含まれ得る。そのような細胞（ヒト包皮線維芽細胞等）は、当該技術分野で公知の任意の手段によって、再プログラミング遺伝子または対象とする任意のさらなる遺伝子を発現するように形質転換され得る。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ（２００６）Ｖｏｌ．１２６（４），ｐｐ．６６３−６７６）を参照のこと。例えば、それらは、１つ以上のプラスミド、レンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、またはレトロウイルスベクターを用いて細胞に導入され得る。場合によっては、これらのベクターは、ゲノムに組み込まれ、再プログラミングが完了した後、除去され得る。特定の実施形態において、非多能性細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、またはそれらの任意の組み合わせを含む再プログラミング遺伝子で形質転換される。
いくつかの例において、形質転換された細胞は、プライムヒトｉＰＳ細胞を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される低オスモル濃度の培地中で培養したヒトｉＰＳ細胞は、１つ以上の表現型、遺伝子発現プロファイル、またはナイーブ状態のマーカー特徴を示す。一例において、ヒトｉＰＳ細胞は、発現がナイーブ状態を示す１つ以上の多能性マーカーを示す。そのような多能性マーカーは、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、５Ｔ４、ＡＢＣＧ２、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＢ、Ｅ−カドヘリン、Ｃｂｘ２、ＣＤ９、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ、ＣＤＸ２、ＣＨＤ１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、ＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＥＲＲベータ／ＮＲ３Ｂ２、ＥＳＧＰ、Ｆ−ボックスタンパク質１５／ＦＢＸＯ１５、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦｏｘＤ３、ＧＢＸ２、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、ＧＤＦ−３、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、インテグリンアルファ６／ＣＤ４９ｆ、インテグリンアルファ６ベータ１、インテグリンアルファ６ベータ４、インテグリンベータ１／ＣＤ２９、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、Ｌ１ＴＤ１、Ｌｅｆｔｙ、Ｌｅｆｔｙ−１、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、ＬＩＮ−２８Ａ、ＬＩＮ−２８Ｂ、ＬＩＮ−４１、ｃＭａｆ、ｃＭｙｃ、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−４Ａ、ポドカリキシン、Ｒｅｘ−１／ＺＦＰ４２、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＳＴＡＴ３、Ｓｔｅｌｌａ／Ｄｐｐａ３、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＥＲＴ、ＴＥＸ１９、ＴＥＸ１９．１、ＴＨＡＰ１１、ＴＲＡ−１−６０（Ｒ）、ＴＲＯＰ−２、ＵＴＦ１、及び／またはＺＩＣ３を含むことができる。特定の例において、発現された多能性マーカーは、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、またはその両方である。
別の実施形態において、本明細書に記載される低オスモル濃度の培地中で培養したヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ状態を示す形態学的特徴を示す。例示的な形態は、培養物中で小型のドーム状のコロニーを有する細胞によって特徴付けられる。
別の実施形態において、本明細書に記載される低オスモル濃度の培地中で培養したヒトｉＰＳ細胞は、単細胞の懸濁液に機械的もしくは酵素的に解離され、継代され、かつ／または継代培養され得る。一例において、酵素解離は、トリプシンを用いて行われ得る。本発明の低オスモル濃度の培地において培養されるとき、ヒトｉＰＳ細胞は、単細胞の懸濁液への増強された解離により、より大きな形質転換効率を提供することができる。培養物中でヒトｉＰＳ細胞を維持するために一般に使用される他のタイプの培地（例えば、ｍＴｅＳＲ（商標）培地または２ｉ培地）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞の解離は、機械的に、またはトリプシンほど強力ではないコラゲナーゼ等の酵素を用いて行われなければならない。その結果として、細胞は、あまり効率的にまたは完全に解離されない。対照的に、本発明の低オスモル濃度の培地を用いて、トリプシンを細胞を解離するために使用することができ、増強された解離により、形質転換効率の増加をもたらす。さらに、培養物中でヒトｉＰＳ細胞を維持するために一般に使用される他のタイプの培地（例えば、ｍＴｅＳＲ（商標）培地または２ｉ培地）とは異なって、本発明の低オスモル濃度の培地（好ましくは、ｂＦＧＦを含まない低オスモル濃度の培地）を用いて培養されたヒトｉＰＳ細胞の酵素解離は、そのような細胞の継代に通常必要とされる１つ以上の阻害剤の不在下で行われ得る。除外され得る例示的な阻害剤は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である。ＲＯＣＫ阻害剤は、ヒトｉＰＳ細胞を継代して、プロアポトーシスの経路の活性化を阻害するときに、通常必要とされる。
さらなる実施形態において、本明細書に記載される低オスモル濃度の培地中で培養した継代培養されたヒトｉＰＳ細胞は、酵素解離及び継代培養後にナイーブまたはナイーブ様の状態を維持し得る。いくつかの例において、継代培養されたヒトｉＰＳ細胞は、小型ドーム状のコロニーによって特徴付けられる形態を示し続け得る。継代培養されたヒトｉＰＳ細胞はまた、本明細書に記載されるものまたは多能性マーカーを発現し続け得る。
Ｃ．ヒト誘導多能性幹細胞の集団を作製及び維持するための方法
インビトロ培養物中においてヒトｉＰＳ細胞を作製するための方法及び組成物が提供される。インビトロ培養物中においてヒトｉＰＳ細胞を維持するための方法及び組成物がさらに提供される。
「作製すること」という用語は、細胞が、ナイーブまたはナイーブ様の状態を示す、すなわち、ナイーブヒトｉＰＳ細胞の１つ以上の特徴を示すように、細胞表現型、遺伝子発現、またはその両方の変化を誘起するのに好適な条件下で、本明細書に記載される１つ以上の再プログラミング因子を発現するように形質転換された非多能性細胞を培養することを含む。ナイーブまたはナイーブ様の状態は、特定の培養条件、例えば、本明細書に記載される低オスモル濃度の培地における培養に応答して発現され得る。いくつかの例において、ナイーブまたはナイーブ様の状態を表す細胞の割合は、培養物中で細胞の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、及び最大１００％である。
一実施形態において、本方法は、ナイーブまたはナイーブ様のヒトｉＰＳ細胞の集団におけるインビトロ培養物を増大させる。そのような実施形態において、ナイーブまたはナイーブ様のヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブまたはナイーブ様の状態を表さない細胞にわたって優先的に培養物中で繁殖され得る。別の実施形態において、ナイーブまたはナイーブ様のヒトｉＰＳ細胞は、培養物から選択され、酵素的に解離され、かつ継代培養されて、ナイーブまたはナイーブ様のヒトｉＰＳ細胞の富化した集団を生成し得る。
一実施形態において、多能性の状態を表すように形質転換された非多能性細胞は、少なくとも１日、２日、５日、７日、１０日、１４日、２１日、もしくは２８日の期間中、または培養物中でナイーブまたはナイーブ様の発現を誘起するのに十分な任意の期間中、ナイーブまたはナイーブ様の状態の発現を誘起するのに好適な本明細書に提供される培養物中でインビトロ培養される。形質転換された細胞は、少なくとも１週間、２週間、３週間、または４週間、本発明の培地中で培養され得る。時には、形質転換された細胞は、１〜４週間培養される。ナイーブまたはナイーブ様の状態の発現は、本明細書の他の箇所に記載される、形態学的特徴または多能性マーカーの発現、ナイーブもしくはナイーブ様の状態の特徴を観察することによって決定され得る。
一実施形態において、多能性の状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、ナイーブまたはナイーブ様の状態の特徴を発現するまで本発明の低オスモル濃度の培地中で培養される。次いで、細胞は、本発明の培地中で培養され、ナイーブまたはナイーブ様の状態を維持し得る。別の実施形態において、多能性の状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、まず、本発明の低オスモル濃度の培地中で培養する前に、高オスモル濃度の培地中で培養される。そのような高オスモル濃度の培地は、本発明の低オスモル濃度の培地よりも高いオスモル濃度を示し、ｂＦＧＦを含み得る。いくつかの高オスモル濃度の培地は、ウシ血清アルブミン、ｂＦＧＦ、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、塩化リチウム、ピペコリン酸、及びガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のうちの１つ以上を含む。高オスモル濃度の培地の例は、ｍＴｅＳＲ（商標）培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む。
いくつかの実施形態において、多能性の状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、まず、ナイーブまたはナイーブ様の状態の特徴を表し始め、細胞が本発明の低オスモル濃度の培地中で培養されるまで、ｂＦＧＦを含む高オスモル濃度の培地中で培地され得る。一例において、細胞は、少なくとも１日、２日、５日、１０日、３０日、６０日、もしくは９０日の期間中、１週間、２週間、４週間、８週間、もしくは１２週間、または１日間〜３カ月間の期間中、ｂＦＧＦを含む高オスモル濃度の培地中で培養され得る。ｂＦＧＦを含む高オスモル濃度の培地中での培養の例示的な期間は、２カ月である。
他の実施形態において、多能性の状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、まず、三次元の細胞集塊によって特徴付けられる形態を示し始め、細胞が本発明の低オスモル濃度の培地中で培養されるまで、ｂＦＧＦを含む高オスモル濃度の培地中で培養され得る。そのような実施形態において、三次元の塊を示す細胞が、選択され、解離され（例えば、トリプシンを用いて）、かつ本明細書に記載される低オスモル濃度の培地中で新しい培養物に移動され得る。
「維持する」、「維持すること」、及び「維持」という用語は、本明細書に記載されるヒトｉＰＳ細胞の特徴または表現型のうちの少なくとも１つ以上の維持を含む。そのような特徴は、ナイーブ細胞の多能性、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、及び／または他の機能的特徴を維持することを含み得る。「維持する」、「維持すること」、及び「維持」という用語はまた、細胞の増殖、及び／または培養されたナイーブ細胞の数の増加も包含し得る。これらの用語は、細胞がプライムまたは非多能性の状態に変換するのを防ぐ培養条件を含む。これらの用語は、細胞が多能性及び／またはナイーブを保持するのを可能にするが、細胞は、分裂し、数が増加し続けても、続けなくてもよい、培養条件をさらに含む。
一実施形態において、ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブまたはナイーブ様状態でそのような細胞を維持するのに好適である本明細書に提供される培地においてインビトロで培養される。特定の例において、ヒトｉＰＳ細胞は、１、２、５、７、１０、１４、２１、または２８日間、または約２週間、約３週間、約４週間、もしくはそれ以上の期間、培養された細胞がナイーブまたはナイーブ様状態で維持されている限り、好適な培地において培養することができる。細胞は、少なくとも１、２、３、または４週間培養することができる。時には、細胞は、１〜４週間培養される。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、培地における細胞の増殖、細胞の遺伝子改変、及び／または細胞の継代培養に十分な任意の期間中維持することができる。
別の実施形態において、多能性状態を発現するように形質転換されるヒトｉＰＳ細胞または非多能性細胞は、インビトロ培養に好適な基質またはフィーダー細胞層上で培養させることができる。特定の例において、細胞は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で培養される。別の例において、細胞は、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）のフィーダー細胞上で培養される。別の例において、細胞は、ＧＥＬＴＲＥＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で培養される。
さらなる実施形態において、本発明の低オスモル濃度の培地において培養されるヒトｉＰＳ細胞の倍加時間は、多能性状態を発現するように形質転換されるプライムヒトｉＰＳ細胞または非多能性細胞と比較して低減される。特定の例において、本発明のヒトｉＰＳ細胞の倍加時間は、１６〜２４時間である。
７．配列同一性
本明細書に提供される方法及び組成物は、対象とするゲノム組み込みシステムの様々な異なる要素（すなわち、ヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入核酸、対象とするポリヌクレオチド、標的化ベクター、選択マーカー、及び他の要素）を用いる。対象とするゲノム組み込みシステムのうちのいくつかの要素は、活性な変異体及び断片を有し得ることが本記載全体にわたって認識される。そのような要素は、例えば、ヌクレアーゼ剤（すなわち、遺伝子操作されたヌクレアーゼ剤）、ヌクレアーゼ剤の認識部位、対象とするポリヌクレオチド、標的部位、及び標的化ベクターの対応する相同性アームを含む。これらの要素のそれぞれにおける生物学的活性は、本明細書の他の箇所に記載される。
本明細書に使用される、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウで最大一致のために整列させたときに同じになる、２つの配列中の残基を指す。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用されるとき、同一ではない残基位置はしばしば、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、荷電または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させない、保存アミノ酸置換によって異なることが認められる。配列が保存置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存性性質を補正するように上方に調節されてもよい。そのような保存置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調節を行うための手段は、当業者には周知である。典型的には、これは、完全な不整合というよりむしろ部分的不整合として保存置換をスコア化し、それにより、パーセンテージ配列同一性を増加させることに関する。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを付与され、非保存置換がゼロのスコアを付与される場合、保存置換はゼロから１の間のスコアを付与される。保存置換のスコア化は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に実装される通りに算出される。
本明細書に使用される、「配列同一性のパーセンテージ」とは、比較ウィンドウで２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値を意味し、その比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントに関して参照配列（付加及び欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を決定し、マッチ位置の数を求め、マッチ位置数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
特に明記されない限り、本明細書に提供される配列同一性／類似性の値は、以下のパラメータを用い、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を用いて得られた値、またはその任意の同等プログラムで得られた値を指す：５０のＧＡＰ重量及び３の長さ重量、ならびにｔｈｅ
ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いたヌクレオチド配列の同一性割合（％）及び類似性割合（％）、８のＧＡＰ重量及び２の長さ重量、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いたアミノ酸配列の同一性割合（％）及び類似性割合（％）。「同等プログラム」は、問題になっている任意の２つの配列のために、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０によって生成された対応するアラインメントと比較して、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチ及び同一の配列同一性割合を有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを意味する。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物は、それとの関連で刊行物が引用される方法及び／または材料を開示及び記載するように、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の言及を包含する。本明細書に使用されるすべての技術及び科学用語は、同じ意味を有する。
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のその開示のためにのみ提供される。本発明が先行発明の理由でそのような刊行物に先行する権利を与えられない承認として本明細書では解釈されないものとする。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実施することができ、したがって、本発明の範囲を示すように、参照は、前述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲になされるべきである。
非限定的な実施形態は、以下のものを含む。
１．多能性ラット細胞における対象とするゲノム遺伝子座の標的改変のための方法であって、（ａ）多能性ラット細胞に、５’ラット相同性アーム及び３’ラット相同性アームが隣接する挿入核酸を含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を導入することであって、該５’及び該３’相同性アームの合計が、少なくとも１０ｋｂであるが１５０ｋｂ未満である、導入することと、（ｂ）該対象とするゲノム遺伝子座で該標的遺伝子改変を含む遺伝子的に改変された多能性ラット細胞を特定することと、を含み、該標的遺伝子改変が該生殖細胞系列を通して伝達することができる、該方法。
２．該標的遺伝子改変が、２対立遺伝子である、実施形態１に記載の該方法。
３．該多能性ラット細胞が、ラット胚幹（ＥＳ）細胞である、実施形態１または２に記載の該方法。
４．該多能性ラット細胞が、ＤＡ株またはＡＣＩ株由来である、実施形態１、２、または３に記載の該方法。
５．該多能性ラット細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ベータ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせを含む、少なくとも１つの多能性マーカーの発現によって特徴付けられる、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の該方法。
６．該多能性ラット細胞が、
（ａ）ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、及び／もしくはＲｅｘｏ１を含む１つ以上の多能性マーカーの発現の欠如、（ｂ）Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／もしくはＢｍｐｒ２を含む中胚葉マーカーの発現の欠如、（ｃ）Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、及び／もしくはＳｏｘ７を含む１つ以上の内胚葉マーカーの発現の欠如、または（ｄ）Ｎｅｓｔｉｎ及び／もしくはＰａｘ６を含む１つ以上の神経マーカーの発現の欠如、の特徴のうちの１つによって特徴付けられる、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の該方法。
７．該ＬＴＶＥＣの該５’及び該３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の該方法。
８．該ＬＴＶＥＣの該５’及び該３’相同性アームの合計が、約１６ｋｂ〜約１５０ｋｂである、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の該方法。
９．該標的遺伝子改変が、（ａ）相同またはオーソロガス核酸配列による内因性ラット核酸配列の置換、（ｂ）内因性ラット核酸配列の欠失、（ｃ）内因性ラット核酸配列の欠失であって、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性ラット核酸配列の欠失、（ｄ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列、（ｅ）相同またはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列、（ｆ）ヒト及びラット核酸配列を含むキメラ核酸配列、（ｇ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子、または（ｈ）ラット細胞において活性なプロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の該方法。
１０．対象とするゲノム遺伝子座が、（ｉ）該５’ラット相同性アームに相同である第１の核酸配列、及び（ｉｉ）該３’ラット相同性アームに相同である第２の核酸配列を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の該方法。
１１．該第１及び該第２の核酸配列が、少なくとも５ｋｂであるが、３Ｍｂ未満だけ離れている、実施形態１０に記載の該方法。
１２．該第１及び該第２の核酸配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている、実施形態１０に記載の該方法。
１３．導入ステップ（ａ）が、該多能性ラット細胞における該標的化構築物と該対象とするゲノム遺伝子座との間の相同的組み換えを促進するヌクレアーゼ剤をコードする第２の核酸を導入することをさらに含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の該方法。
１４．該ヌクレアーゼ剤が、（ａ）ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合されるジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質、または（ｂ）ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合される転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含むキメラタンパク質を含む、実施形態１３に記載の該方法。
１５．導入ステップ（ａ）が、該多能性ラット細胞に、（ｉ）クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に連結されたゲノム標的配列に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物を導入することをさらに含み、該ゲノム標的配列には、該３’末端上にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の該方法。
１６．該対象とするゲノム遺伝子座が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、実施形態１５に記載の該方法。
１７．該ｇＲＮＡが、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸配列を含む、実施形態１５または１６に記載の該方法。
１８．該Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、実施形態１５、１６、または１７に記載の該方法。
１９．該ｇＲＮＡが、（ａ）配列番号２の該核酸配列の該キメラＲＮＡ、または（ｂ）配列番号３の該核酸配列の該キメラＲＮＡを含む、実施形態１５、１６、１７、または１８に記載の該方法。
２０．該ｃｒＲＮＡが、配列番号４、配列番号５、または配列番号６を含む、実施形態１７に記載の該方法。
２１．該ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号７または配列番号８を含む、実施形態１７に記載の該方法。
２２．改変されたラットゲノム遺伝子座であって、（ｉ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列の挿入、（ｉｉ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性ラット核酸配列の置換、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含み、該生殖細胞系列を通して伝達することができる、改変されたラットゲノム遺伝子座。
２３．該挿入または置換の大きさが、約５ｋｂ〜約４００ｋｂである、実施形態２２に記載の該改変されたラットゲノム遺伝子座。
２４．該挿入または置換の大きさが、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂである、実施形態２２に記載の該ラットゲノム遺伝子座。
２５．ヒト化ラットを作製するための方法であって、（ａ）ヒト核酸を含む標的化構築物を用いて多能性ラット細胞における対象とするゲノム遺伝子座を標的として、遺伝子的に改変された多能性ラット細胞を形成することと、（ｂ）該遺伝子的に改変された多能性ラット細胞を宿主ラット胚に導入することと、（ｃ）代理母において該宿主ラット胚を懐胎させることと、を含み、該代理母が、（ｉ）ヒト核酸配列の挿入、（ｉｉ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による対象とするゲノム遺伝子座でのラット核酸配列の置換、（ｉｉｉ）ヒト及びラット核酸配列を含むキメラ核酸配列、または（ｉｖ）それらの組み合わせを含む、改変されたゲノム遺伝子座を含むラット子孫を生み出し、該改変されたゲノム遺伝子座が、該生殖細胞系列を通して伝達することができる、方法。
２６．該標的化構築物が、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、該ＬＴＶＥＣの該５’及び該３’相同性アームの合計が、少なくとも１０ｋｂであるが１５０ｋｂ未満である、実施形態２５に記載の該方法。
２７．該標的化構築物の該５’及び該３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、または約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、実施形態２６に記載の該方法。
２８．該ヒト核酸配列が、少なくとも５ｋｂであるが４００ｋｂ未満である、実施形態２５、２６、または２７に記載の該方法。
２９．該ヒト核酸配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも２００ｋｂであるが２５０ｋｂ未満、少なくとも２５０ｋｂであるが３００ｋｂ未満、少なくとも３００ｋｂであるが３５０ｋｂ未満、または少なくとも３５０ｋｂであるが４００ｋｂ未満である、実施形態２５、２６、または２７に記載の該方法。
３０．該多能性ラット細胞が、ラット胚幹（ＥＳ）細胞である、実施形態２５〜２９のいずれか１つに記載の該方法。
３１．該多能性ラット細胞が、ＤＡ株またはＡＣＩ株由来である、実施形態２５〜３０のいずれか１つに記載の該方法。
３２．該多能性ラット細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ベータ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせを含む、少なくとも１つの多能性マーカーの発現によって特徴付けられる、実施形態２５〜３１のいずれか１つに記載の該方法。
３３．該多能性ラット細胞が、（ａ）ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、及び／もしくはＲｅｘｏ１を含む１つ以上の多能性マーカーの発現の欠如、（ｂ）Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／もしくはＢｍｐｒ２を含む１つ以上の中胚葉マーカーの発現の欠如、（ｃ）Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、及び／もしくはＳｏｘ７を含む１つ以上の内胚葉マーカーの発現の欠如、または（ｄ）Ｎｅｓｔｉｎ及び／もしくはＰａｘ６を含む１つ以上の神経マーカーの発現の欠如、の特徴のうちの１つ以上によって特徴付けられる、実施形態２５〜３１のいずれか１つに記載の該方法。
３４．ヒト化ゲノム遺伝子座を含む改変されたラットであって、該ヒト化ゲノム遺伝子座が、（ｉ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列の挿入、（ｉｉ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性ゲノム遺伝子座でのラット核酸配列の置換、（ｉｉｉ）ヒト及びラット核酸配列を含むキメラ核酸配列、または（ｉｖ）それらの組み合わせを含み、該ヒト化ゲノム遺伝子座が、該生殖細胞系列を通して伝達することができる、改変されたラット。
３５．ラットまたはラット細胞のゲノム遺伝子座における標的遺伝子改変を含むラットまたはラット細胞であって、該ゲノム遺伝子座が、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座であり、該標的遺伝子改変が、（ａ）ゲノム遺伝子座での内因性ラット核酸配列の欠失、（ｂ）ヒト及びラット核酸配列を含む、相同核酸、オーソロガスな核酸、もしくはキメラ核酸の挿入、または（ｃ）それらの組み合わせを含み、該標的遺伝子改変が、該ラットもしくは該ラット細胞から繁殖したラットの該生殖細胞系列を通して伝達することができる、該ラットまたはラット細胞。
３６．（ａ）該ゲノム遺伝子座での該内因性ラット核酸の該欠失が、少なくとも約１０ｋｂであるか、または（ｂ）該ゲノム遺伝子座での該内因性ラット核酸の該欠失が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂであり、（ｃ）該ゲノム遺伝子座での該外因性核酸配列の該挿入が、少なくとも約５ｋｂであるか、または（ｄ）該ゲノム遺伝子座での該外因性核酸配列の該挿入が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂである、実施形態３５に記載の該ラットまたはラット細胞。
３７．（ａ）該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座での該標的遺伝子改変が、インターロイキン−２受容体ガンマタンパク質活性の減少または不在をもたらすか、（ｂ）該ＡｐｏＥ遺伝子座での該標的遺伝子改変が、ＡｐｏＥタンパク質活性の減少または不在をもたらすか、（ｃ）該Ｒａｇ１遺伝子座での該標的遺伝子改変が、Ｒａｇ１タンパク質活性の減少または不在をもたらすか、（ｄ）該Ｒａｇ２遺伝子座での該標的遺伝子改変が、Ｒａｇ２タンパク質活性の減少または不在をもたらすか、あるいは（ｅ）該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座での該標的遺伝子改変が、Ｒａｇ２タンパク質活性及びＲａｇ１活性の減少または不在をもたらす、実施形態３５または３６に記載の該ラットまたはラット細胞。
３８．該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座の該標的遺伝子改変が、（ａ）全ラットインターロイキン−２受容体ガンマコード領域もしくはその一部の欠失、（ｂ）ヒトインターロイキン−２受容体ガンマコード領域もしくはその一部による該全ラットインターロイキン−２受容体ガンマコード領域もしくはその一部の置換、（ｃ）ヒトインターロイキン−２受容体ガンマの細胞外ドメインによる該ラットインターロイキン−２受容体ガンマコード領域の置換、または（ｄ）該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座の少なくとも３ｋｂの欠失、を含む、実施形態３５、３６、または３７に記載の該ラットまたはラット細胞。
３９．該ＡｐｏＥ遺伝子座の該標的遺伝子改変が、（ａ）全ＡｐｏＥコード領域もしくはその一部の欠失、または（ｂ）該ＡｐｏＥコード領域を含む該ＡｐｏＥ遺伝子座の少なくとも１．８ｋｂの欠失、を含む、実施形態３５〜３７のいずれか１つに記載の該ラットまたはラット細胞。
４０．該Ｒａｇ２遺伝子座の該標的遺伝子改変が、（ａ）全Ｒａｇ２コード領域もしくはその一部の欠失、（ｂ）該Ｒａｇ２コード領域を含む該Ｒａｇ２遺伝子座の少なくとも５．７ｋｂの欠失を含む、実施形態３５〜３７のいずれか１つに記載の該ラットまたはラット細胞。
４１．該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の該標的遺伝子改変が、（ａ）該全Ｒａｇ２コード領域もしくはその一部の欠失及び全Ｒａｇ１コード領域もしくはその一部の欠失、または（ｂ）該Ｒａｇ２コード領域を含む該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の少なくとも１６ｋｂの欠失を含む、実施形態３５〜３７のいずれか１つに記載の該ラットまたはラット細胞。
４２．該標的遺伝子改変が、該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、該ＡｐｏＥ遺伝子座、該Ｒａｇ１遺伝子座、該Ｒａｇ２遺伝子座、または該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座での選択マーカーを含む発現カセットの挿入を含む、実施形態３５〜４１のいずれか１つに記載の該ラットまたはラット細胞。
４３．該発現カセットが、該ゲノム遺伝子座での該内因性プロモータに作動可能に連結されたｌａｃＺ遺伝子、及び選択マーカーに作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む、実施形態４２のいずれか１つに記載の該ラットまたはラット細胞。
４４．該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、該ＡｐｏＥ遺伝子座、該Ｒａｇ１遺伝子座、該Ｒａｇ２遺伝子座、または該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座における該標的遺伝子改変が、自己欠失選択カセットの挿入を含む、実施形態３５〜４３のいずれか１つに記載の該ラットまたはラット細胞。
４５．該自己欠失選択カセットが、該ラット細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子、及び雄生殖細胞特異的なプロモータに作動可能に連結されたリコンビナーゼ遺伝子を含み、該自己欠失する選択カセットに、該リコンビナーゼによって認識される組み換え認識部位が隣接する、実施形態４４に記載の該ラットまたはラット細胞。
４６．（ａ）該雄生殖細胞特異的なプロモータがプロタミン−１プロモータであるか、または（ｂ）該リコンビナーゼ遺伝子がＣｒｅをコードし、該組み換え認識部位がｌｏｘＰ部位である、実施形態４５に記載の該ラットまたはラット細胞。
４７．該ゲノム遺伝子座での該外因性核酸配列の該挿入が、内因性インターロイキン−２受容体ガンマプロモータ、内因性ＡｐｏＥプロモータ、内因性Ｒａｇ１プロモータ、または内因性Ｒａｇ２プロモータに作動可能に連結されたレポーター核酸を含む、実施形態３５〜４６のいずれか１つに記載の該ラットまたはラット細胞。
４８．該レポーター核酸が、β−ガラクトシダーゼ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、エメラルド、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、紺碧色、Ｔ−サファイア、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及び／またはそれらの組み合わせを含む、レポーターをコードする、実施形態４７に記載の該ラットまたはラット細胞。
４９．該ラット細胞が、多能性ラット細胞またはラット胚幹（ＥＳ）細胞である、実施形態３５〜４８のいずれか１つに記載の該ラット細胞。
５０．該多能性ラット細胞または該ラット胚幹（ＥＳ）細胞が、（ａ）ＤＡ株もしくはＡＣＩ株由来であるか、（ｂ）Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ベータ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、もしくはそれらの組み合わせを含む少なくとも１つの多能性マーカーの発現によって特徴付けられるか、または（ｃ）（ｉ）ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、及び／もしくはＲｅｘｏ１を含む１つ以上の多能性マーカーの発現の欠如、（ｉｉ）Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／もしくはＢｍｐｒ２を含む中胚葉マーカーの発現の欠如、（ｉｉｉ）Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、及び／もしくはＳｏｘ７を含む１つ以上の内胚葉マーカーの発現の欠如、または（ｉｖ）Ｎｅｓｔｉｎ及び／もしくはＰａｘ６を含む１つ以上の神経マーカーの発現の欠如、の特徴のうちの１つ以上によって特徴付けられる、実施形態４９に記載の該ラット細胞。
５１．多能性ラット細胞中のインターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、またはＲａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座における標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、（ａ）該多能性ラット細胞に、該標的ゲノム遺伝子座に対して相同である５’及び３’ラット相同性アームが隣接する挿入核酸を含む標的化ベクターを導入することと、（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む遺伝子的に改変された多能性ラット細胞を特定することと、を含み、該標的遺伝子改変が、該多能性ラット細胞から繁殖したラットの生殖細胞系列を通して伝達することができる、該方法。
５２．該標的化ベクターが大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、該５’及び該３’ラット相同性アームの合計が、少なくとも約１０ｋｂであるが約１５０ｋｂ未満である、実施形態５１に記載の該方法。
５３．該多能性ラット細胞への該標的化ベクターの導入は、（ｉ）該標的ゲノム遺伝子座での内因性ラット核酸配列の欠失、（ｉｉ）該標的ゲノム遺伝子座での外因性核酸配列の挿入、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせをもたらす、実施形態５１または５２に記載の該方法。
５４．（ａ）該ゲノム遺伝子座での該内因性ラット核酸の該欠失が、少なくとも約１０ｋｂであるか、または（ｂ）該ゲノム遺伝子座での該内因性ラット核酸の該欠失が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂであり、（ｃ）該ゲノム遺伝子座での該外因性核酸配列の該挿入が、少なくとも約５ｋｂであるか、または（ｄ）該ゲノム遺伝子座での該外因性核酸配列の該挿入が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂである、実施形態５３に記載の該方法。
５５．（ａ）該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座での該標的遺伝子改変が、インターロイキン−２受容体ガンマタンパク質活性の減少または不在をもたらすか、（ｂ）該ＡｐｏＥ遺伝子座での該標的遺伝子改変が、ＡｐｏＥタンパク質活性の減少または不在をもたらすか、（ｃ）該Ｒａｇ１遺伝子座での該標的遺伝子改変が、Ｒａｇ１タンパク質活性の減少または不在をもたらすか、（ｄ）該Ｒａｇ２遺伝子座での該標的遺伝子改変が、Ｒａｇ２タンパク質活性の減少または不在をもたらすか、あるいは（ｅ）該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座での該標的遺伝子改変が、Ｒａｇ２タンパク質活性及びｉ Ｒａｇ１タンパク質活性の減少または不在をもたらす、実施形態５１〜５４のいずれか１つに記載の該方法。
５６．該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座の該標的遺伝子改変が、（ａ）該全ラットインターロイキン−２受容体ガンマコード領域もしくはその一部の欠失、（ｂ）ヒトインターロイキン−２受容体ガンマコード領域もしくはその一部による該全ラットインターロイキン−２受容体ガンマコード領域もしくはその一部の置換、（ｃ）ヒトインターロイキン−２受容体ガンマの該細胞外ドメインによる該ラットインターロイキン−２受容体ガンマコード領域の置換、または（ｄ）該インターロイキン−２受容体ガンマコード領域を含む該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座の少なくとも３ｋｂの欠失、を含む、実施形態５１〜５４のいずれか１つに記載の該方法。
５７．該ＡｐｏＥ遺伝子座の該標的遺伝子改変が、（ａ）該全ＡｐｏＥコード領域もしくはその一部の欠失、（ｂ）該ＡｐｏＥコード領域を含む該ＡｐｏＥ遺伝子座の少なくとも１．８ｋｂの欠失を含む、実施形態５１〜５５のいずれか１つに記載の該方法。
５８．該Ｒａｇ２遺伝子座の該標的遺伝子改変が、（ａ）該全Ｒａｇ２コード領域もしくはその一部の欠失、または（ｂ）該Ｒａｇ２コード領域を含む該Ｒａｇ２遺伝子座の少なくとも５．７ｋｂの欠失を含む、実施形態５１〜５５のいずれか１つに記載の該方法。
５９．該Ｒａｇ１／Ｒａｇ２遺伝子座の該標的遺伝子改変が、（ａ）該全Ｒａｇ２コード領域もしくはその一部の欠失及び該全Ｒａｇ１コード領域もしくはその一部の欠失、または（ｂ）該Ｒａｇ２及びＲａｇ１コード領域を含む該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座の少なくとも１６ｋｂの欠失を含む、実施形態５１〜５５のいずれか１つに記載の該方法。
６０．該挿入核酸が、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、実施形態５１〜５９のいずれか１つに記載の該方法。
６１．該発現カセットが、該ゲノム遺伝子座での内因性プロモータに作動可能に連結されたｌａｃＺ遺伝子、及び選択マーカー遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む、実施形態６０に記載の該方法。
６２．該挿入核酸が、自己欠失選択カセットを含む、実施形態５１〜６０のいずれか１つに記載の該方法。
６３．該自己欠失選択カセットが、該ラット多能性細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子、及び雄生殖細胞特異的なプロモータに作動可能に連結されたリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、該自己欠失選択カセットには、該リコンビナーゼによって認識される組み換え認識部位が隣接する、実施形態６２に記載の該方法。
６４．（ａ）該雄生殖細胞特異的なプロモータがプロタミン−１プロモータであるか、または（ｂ）該リコンビナーゼ遺伝子がＣｒｅをコードし、該組み換え認識部位がｌｏｘＰ部位である、実施形態６３に記載の該方法。
６５．該ゲノム遺伝子座での該外因性核酸配列の該挿入が、内因性インターロイキン−２受容体ガンマプロモータ、内因性ＡｐｏＥプロモータ、内因性Ｒａｇ１プロモータ、または内因性Ｒａｇ２プロモータに作動可能に連結されたレポーター核酸を含む、実施形態５３に記載の該方法。
６６．該レポーター核酸配列が、β−ガラクトシダーゼ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、エメラルド、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、紺碧色、Ｔ−サファイア、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせを含む、レポーターをコードする、実施形態６５に記載の該方法。
６７．該多能性ラット細胞が、ラット胚幹（ＥＳ）細胞である、実施形態５１〜６６のいずれか１つに記載の該方法。
６８．該多能性ラット細胞が、（ａ）ＤＡ株もしくはＡＣＩ株由来であるか、または（ｂ）Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、アルカリホスファターゼ、もしくはそれらの組み合わせを含む多能性マーカーの発現によって特徴付けられるか、または（ｃ）（ｉ）ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、及び／もしくはＲｅｘｏ１を含む１つ以上の多能性マーカーの発現の欠如、（ｉｉ）Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／もしくはＢｍｐｒ２を含む中胚葉マーカーの発現の欠如、（ｉｉｉ）Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、及び／もしくはＳｏｘ７を含む１つ以上の内胚葉マーカーの発現の欠如、または（ｉｖ）Ｎｅｓｔｉｎ及び／もしくはＰａｘ６を含む１つ以上の神経マーカーの発現の欠如、の特徴のうちの１つによって特徴付けられる、実施形態５１〜６７のいずれか１つに記載の該方法。
６９．該標的ゲノム遺伝子座での該標的遺伝子改変を特定することをさらに含み、該特定ステップが、該標的ゲノム遺伝子座での対立遺伝子（ＭＯＡ）の改変を評価するために定量的アッセイを用いる、実施形態５１〜６８のいずれか１つに記載の該方法。
７０．導入ステップ（ａ）が、該多能性ラット細胞における該標的化ベクターと該標的ゲノム遺伝子座との間の相同的組み換えを促進するヌクレアーゼ剤をコードする第２の核酸を導入することをさらに含む、実施形態５１〜６９のいずれか１つに記載の該方法。
７１．該ヌクレアーゼ剤が、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合されるジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質を含む、実施形態７０に記載の該方法。
７２．該方法が、該標的ゲノム遺伝子座の２対立遺伝子の遺伝子改変をもたらす、実施形態７１に記載の該方法。
７３．導入ステップ（ａ）が、該多能性ラット細胞に、（ｉ）クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に連結されたゲノム標的配列に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物を導入することを含み、該ゲノム標的配列には、３’末端上にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、実施形態５１〜７０のいずれか１つに記載の該方法。
７４．該対象とするゲノム遺伝子座が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、実施形態７３に記載の該方法。
７５．該ｇＲＮＡが、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸配列を含む、実施形態７３または７４に記載の該方法。
７６．該Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、実施形態７３に記載の該方法。
７７．該ｇＲＮＡが、（ａ）配列番号２の該核酸配列の該キメラＲＮＡ、または（ｂ）配列番号３の該核酸配列の該キメラＲＮＡを含む、実施形態７３、７４、または７５に記載の該方法。
７８．該ｃｒＲＮＡが、配列番号４、配列番号５、または配列番号６を含む、実施形態７５に記載の該方法。
７９．該ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号７または配列番号８を含む、実施形態７５に記載の該方法。
８０．該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、該ＡｐｏＥ遺伝子座、該Ｒａｇ１遺伝子座、該Ｒａｇ２遺伝子座、及び／または該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座で標的遺伝子改変を含む、実施形態３５〜５０のいずれか１つに記載の該ラットまたはラット細胞。
８１．該インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座及び／または該Ｒａｇ２／Ｒａｇ１遺伝子座で標的遺伝子改変を含む、実施形態８０に記載の該ラットまたはラット細胞。
さらなる非限定的な実施形態は、以下のものを含む。
１．真核細胞における対象とするゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、（ａ）該真核細胞に、（ｉ）少なくとも１０ｋｂであり、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む、第１の発現構築物、（ｉｉｉ）標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物、を導入することであって、第１及び第２のプロモータが真核細胞において活性である、導入することと、（ｂ）該対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む、改変された真核細胞を特定することと、を含む、該方法。
２．該標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、実施形態１に記載の該方法。
３．該ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである、実施形態１に記載の該方法。
４．該ＬＴＶＥＣが、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである、実施形態１に記載の該方法。
５．該真核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１に記載の該方法。
６．該哺乳動物細胞が、線維芽細胞である、実施形態５に記載の該方法。
７．該真核細胞が、多能性細胞である、実施形態１に記載の該方法。
８．該多能性細胞が、ヒト多能性細胞である、実施形態７に記載の該方法。
９．該ヒト多能性細胞が、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞またはヒト成人幹細胞である、実施形態８に記載の該方法。
１０．該ヒト多能性細胞が、発達的に制限されたヒト前駆細胞である、実施形態８に記載の該方法。
１１．該ヒト多能性細胞が、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、実施形態８に記載の該方法。
１２．該Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、実施形態１に記載の該方法。
１３．該標的配列には、３’末端上にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、実施形態１に記載の該方法。
１４．該５’及び該３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、実施形態１に記載の該方法。
１５．該ＬＴＶＥＣの該５’及び該３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、実施形態１に記載の該方法。
１６．該標的遺伝子改変が、（ａ）相同もしくはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、（ｂ）内因性核酸配列の欠失、（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、（ｄ）外因性核酸配列の挿入、（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、（ｆ）相同もしくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、（ｉ）多能性細胞において活性な第３のプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子の挿入、または（ｊ）それらの組み合わせ、を含む、実施形態１に記載の該方法。
１７．該対象とするゲノム遺伝子座が、（ｉ）該５’相同性アームに相同である５’標的配列、及び（ｉｉ）該３’相同性アームに相同である３’標的配列を含む、実施形態１に記載の該方法。
１８．該５’標的配列及び該３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている、実施形態１７に記載の該方法。
１９．該５’標的配列及び該３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている、実施形態１７に記載の該方法。
２０．該対象とするゲノム遺伝子座が、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、または、該Ｒａｇ１遺伝子座及び該Ｒａｇ２遺伝子座の両方を含む、実施形態１に記載の該方法。
２１．該第１及び該第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、実施形態１に記載の該方法。
２２．ゲノムを改変するための方法であって、少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、該ゲノムをＣａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡに曝露することを含み、該Ｃａｓタンパク質、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び該ＬＴＶＥＣへの曝露後、該ゲノムが少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含むように改変される、該方法。
２３．該ＬＴＶＥＣが、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂの核酸配列を含む、実施形態２２に記載の該方法。
２４．該ＬＴＶＥＣが、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂの核酸配列を含む、実施形態２２に記載の該方法。
２５．ゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、該ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、該ＬＴＶＥＣが少なくとも１０ｋｂであり、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、該ＬＴＶＥＣの存在下で、該Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、該ゲノムが、該第１の核酸を含むように対象とするゲノム遺伝子座で改変される、該方法。
２６．該ゲノムが、真核細胞中にあり、該Ｃａｓタンパク質、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、該ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び該ＬＴＶＥＣが、該真核細胞に導入される、実施形態２５に記載の該方法。
２７．該対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変を含む改変された真核細胞を特定することをさらに含む、実施形態２６に記載の該方法。
２８．該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の形態で一緒に導入される、実施形態２６または２７に記載の該方法。
２９．該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、実施形態２６または２７に記載の該方法。
３０．（ａ）該Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、該Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または該Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で該真核細胞に導入され、（ｂ）該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で該真核細胞に導入され、かつ（ｃ）該ｔｒａｃｒＲＮＡが、該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で該真核細胞に導入される、実施形態２６〜２９のいずれか１つに記載の該方法。
３１．該Ｃａｓタンパク質、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び該ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、該真核細胞に導入される、実施形態３０に記載の該方法。
３２．（ａ）該Ｃａｓタンパク質をコードする該ＤＮＡが、該Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、（ｂ）該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする該ＤＮＡが、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ（ｃ）該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする該ＤＮＡが、該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、該第１、第２、及び第３のプロモータが、該真核細胞において活性である、実施形態３０に記載の該方法。
３３．該第１、第２、及び／または第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、実施形態３２に記載の該方法。
３４．（ａ）該Ｃａｓタンパク質をコードする該ＤＮＡが、該Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ（ｂ）該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする該ＤＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする該ＤＮＡが、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物の形態であり、該第１及び第２のプロモータが、該真核細胞において活性である、実施形態３０に記載の該方法。
３５．該第１及び該第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、実施形態３４に記載の該方法。
３６．該標的遺伝子改変が、該対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び該対象とするゲノム遺伝子座での該第１の核酸の挿入を同時に含む、実施形態２７〜３５のいずれか１つに記載の該方法。
３７．該標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、実施形態２７〜３６のいずれか１つに記載の該方法。
３８．該２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における該対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び該第１の核酸の挿入を含む、実施形態３７に記載の該方法。
３９．該改変真核細胞が、該対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、実施形態２７〜３６のいずれか１つに記載の該方法。
４０．１つの染色体における該対象とするゲノム遺伝子座での該標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び該第１の核酸の挿入を含む、実施形態３９に記載の該方法。
４１．該標的遺伝子改変が、（１）２つの相同染色体における該対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における該対象とするゲノム遺伝子座への該第１の核酸の挿入及び第２の染色体における該対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、実施形態３９に記載の該方法。
４２．該ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである、実施形態２５〜４１のいずれか１つに記載の該方法。
４３．該ＬＴＶＥＣが、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである、実施形態２５〜４２のいずれか１つに記載の該方法。
４４．該第１の核酸が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである、実施形態２５〜４３のいずれか１つに記載の該方法。
４５．該真核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２６〜４４のいずれか１つに記載の該方法。
４６．該哺乳動物細胞が、線維芽細胞である、実施形態４５に記載の該方法。
４７．該真核細胞が、多能性細胞である、実施形態２６〜４３のいずれか１つに記載の該方法。
４８．該多能性細胞が、非ヒト多能性細胞である、実施形態４７に記載の該方法。
４９．該非ヒト多能性細胞が、齧歯類多能性細胞である、実施形態４８に記載の該方法。
５０．該齧歯類多能性細胞が、マウスまたはラット胚幹（ＥＳ）細胞である、実施形態４９に記載の該方法。
５１．該多能性細胞が、ヒト多能性細胞である、実施形態４７に記載の該方法。
５２．該ヒト多能性細胞が、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞またはヒト成人幹細胞である、実施形態５１に記載の該方法。
５３．該ヒト多能性細胞が、発達的に制限されたヒト前駆細胞である、実施形態５１に記載の該方法。
５４．該ヒト多能性細胞が、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、実施形態５１に記載の該方法。
５５．該Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、実施形態２５〜５４のいずれか１つに記載の該方法。
５６．該標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、実施形態２５〜５５のいずれか１つに記載の該方法。
５７．該ＬＴＶＥＣの該５’及び該３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、実施形態２５〜５６のいずれか１つに記載の該方法。
５８．該ＬＴＶＥＣの該５’及び該３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、実施形態２５〜５７のいずれか１つに記載の該方法。
５９．該標的遺伝子改変が、（ａ）内因性核酸配列の相同もしくはオーソロガス核酸配列による置換、（ｂ）内因性核酸配列の欠失、（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、もしくは約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、（ｄ）外因性核酸配列の挿入、（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、（ｆ）相同もしくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、（ｉ）多能性細胞において活性な第３のプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子の挿入、または（ｊ）それらの組み合わせ、を含む、実施形態２７〜５８のいずれか１つに記載の該方法。
６０．該対象とするゲノム遺伝子座が、（ｉ）該５’相同性アームに相同である５’標的配列、及び（ｉｉ）該３’相同性アームに相同である３’標的配列を含む、実施形態２５〜５９のいずれか１つに記載の該方法。
６１．該５’標的配列及び該３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている、実施形態６０に記載の該方法。
６２．該５’標的配列及び該３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている、実施形態６０に記載の該方法。
６３．該５’標的配列及び該３’標的配列が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂだけ離れている、実施形態６０に記載の該方法。
６４．該対象とするゲノム遺伝子座が、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、または、該Ｒａｇ１遺伝子座及び該Ｒａｇ２遺伝子座の両方を含む、実施形態２５〜６３のいずれか１つに記載の該方法。
６５．該対象とするゲノム遺伝子座が、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、またはＥｒｂｂ４遺伝子座を含む、実施形態２５〜６３のいずれか１つに記載の該方法。
６６．該対象とするゲノム遺伝子座が、Ｌｒｐ５遺伝子座を含む、実施形態２５〜６３のいずれか１つに記載の該方法。
６７．該対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含む、Ｆ０世代非ヒト動物を生み出すための方法であって、（ａ）改変された非ヒトＥＳ細胞を形成するために、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、非ヒトＥＳ細胞における該ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることであって、該ＬＴＶＥＣが少なくとも１０ｋｂであり、５’相同性アーム及び３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含む、接触させることと、（ｂ）該対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変を含む、該改変された非ヒトＥＳ細胞を特定することと、（ｃ）該改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト宿主胚に導入することと、（ｄ）代理母において該非ヒト宿主胚を懐胎させることと、を含み、該代理母が、該対象とするゲノム遺伝子座での標的遺伝子改変を含むＦ０世代非ヒト動物を生み出す、該方法。
６８．該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の形態で一緒に導入される、実施形態６７に記載の該方法。
６９．該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、実施形態６７に記載の該方法。
７０．（ａ）該Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、該Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または該Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で非ヒトＥＳ細胞に導入され、（ｂ）該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で該非ヒトＥＳ細胞に導入され、かつ（ｃ）該ｔｒａｃｒＲＮＡが、該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で該非ヒトＥＳ細胞に導入される、実施形態６７〜６９のいずれか１つに記載の該方法。
７１．該Ｃａｓタンパク質、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び該ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、該非ヒトＥＳ細胞に導入される、実施形態７０に記載の該方法。
７２．（ａ）該Ｃａｓタンパク質をコードする該ＤＮＡが、該Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、（ｂ）該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする該ＤＮＡが、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ（ｃ）該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする該ＤＮＡが、該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、該第１、第２、及び第３のプロモータが、該非ヒトＥＳ細胞において活性である、実施形態７０に記載の該方法。
７３．該第１、第２、及び第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、実施形態７２に記載の該方法。
７４．（ａ）該Ｃａｓタンパク質をコードする該ＤＮＡが、該Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ（ｂ）該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする該ＤＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする該ＤＮＡが、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物の形態であり、該第１及び第２のプロモータが、該非ヒトＥＳ細胞において活性である、実施形態７０に記載の該方法。
７５．該第１及び該第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、実施形態７４に記載の該方法。
７６．該標的遺伝子改変が、該対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び該対象とするゲノム遺伝子座での該第１の核酸の挿入を同時に含む、実施形態６７〜７５のいずれか１つに記載の該方法。
７７．該標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、実施形態６７〜７６のいずれか１つに記載の該方法。
７８．該２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における該対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び該第１の核酸の挿入を含む、実施形態７７に記載の該方法。
７９．該改変非ヒトＥＳ細胞が、該対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、実施形態６７〜７６のいずれか１つに記載の該方法。
８０．１つの染色体における該対象とするゲノム遺伝子座での該標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び該第１の核酸の挿入を含む、実施形態７９に記載の該方法。
８１．該標的遺伝子改変が、（１）２つの相同染色体における対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）第１の染色体における対象とするゲノム遺伝子座への第１の核酸の挿入及び第２の染色体における対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、実施形態７９に記載の該方法。
８２．該Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、実施形態６７〜８１のいずれか１つに記載の該方法。
以下の実施例は、本発明をいかに実施し使用するかに関する完全な開示及び記載を当業者に提供するために記載されており、本発明者が彼らの発明として見なす範囲を限定する意図はなく、以下の実験が行われた実験のすべてまたは唯一行われた実験であることを述べようとするものでもない。使用される数（例えば、量、温度等）に関して正確性を保証する努力をしているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
実施例１．ラットＥＳ細胞由来及び特徴付け
１．１．ラットＥＳ細胞の特徴付け
図１に示されるように、ラットＥＳＣは、小型球形コロニーとして成長し、皿中で通常分離し、浮遊する（拡大図、図８）。ラットＥＳＣは、Ｏｃｔ−４（図２Ａ）及びＳｏｘ２（図２Ｂ）を含む多能性マーカーを発現し、高レベルのアルカリホスファターゼを発現する（図３）。細胞系列ＤＡ．２Ｂの核型４２Ｘ，Ｙである（図４）。ラットＥＳＣは多くの場合、４倍体となり、それ故に、細胞系列は、分裂中期の染色体の広がりを計数することにより事前に選別され、大部分が正常な計数を有する細胞系列が、正式に核型分析された。
ＡＣＩ胚盤胞を、商業的に得られた過剰排卵処置した雌から回収した。ＤＡ胚盤胞を、商業的に得られた冷凍の８細胞胚から培養した。透明帯を酸性タイロードにより除去し、胚盤胞を分裂期に選別したＭＥＦ上にプレーティングした。副産物を採取し、標準的な方法を用いて拡大させた。２ｉ培地を用いて、すべての胚盤胞をプレーティングし、培養し、拡大させた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ，Ｃｅｌｌ １３５：１２９９−１３１０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
１．２．：ラット生成
ラットＥＳＣゲノムの胚盤胞注射及び伝達によってキメララットを生成した。親ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳＣを用いた胚盤胞注射により生成されたキメラを図９に示す。図９にアスタリスク（＊）で標識されたＡＣＩ／ＳＤキメラが雄親となるアルビノ同腹子を有するＦ１アグーチ子を図１０に示す。
親ラットＥＳＣの生殖細胞系列の伝達。
３つの正倍数性のラットＥＳＣ細胞系列を、アルビノＳＤ胚盤胞へのマイクロインジェクションによって多分化能について評価した。ラットＥＳＣ貢献を示す、アグーチの毛色によってキメラを特定した（図１０を参照のこと）。各細胞系列について、キメラの大部分は、Ｆ１子孫にｒＥＳＣゲノムを伝達した（表２）。
１．３．：ラット胚幹細胞の誘導
過剰排卵のプロトコル、ラット
０日目：妊娠中の雌の血清を注射：腹腔内、２０Ｕ（０．４ｍｌ）。
１日目：活動なし
２日目：（４６時間後）：ｈＣＧ、ＩＰ、５０Ｕ（１ｍｌ）で注射。
− 単一の雌の交配の設定。
３日目：膣栓を確認。雌の膣口を塞いだ。これは、０．５日目である。
６日目（ｅ３．５）：雌を殺処分し、胚を洗浄した。
ＥＳ細胞由来プロトコル（過剰排卵）
０日目：
１）ＣＯ２により雌を殺処分した。
２）前面腹部を７０％ エタノールで消毒し、鋏を用い、腹部体壁を開口し、内臓を露出させた。
３）卵管及び子宮角を別々にし、それらを温かいＮ２Ｂ２７培地を含む組織培養皿に入れた。可能な限り多くの血液を洗い流し、Ｎ２Ｂ２７を含む新しい皿に移した。
４）１ｍｌの注射器及び２７ｇの鈍針を用いて、子宮角及び卵管を通して培地を流して、胚盤胞を培地に押し出した。
５）マウスピペットを用いて胚盤胞を採取し、ＫＳＯＭ＋２ｉ（１μＭ ＰＤ０３２５９０１、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１）を含む胚培養皿に移す。ＫＳＯＭは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅにより製造された培養培地である。カタログ番号は、ＭＲ−１０６−Ｄである。
６）３７°で、７．５％ ＣＯ２に一晩培養した。
ＥＳ細胞誘導プロトコル（冷凍胚）
０日目：
１）冷凍８細胞胚（市販の）をＭ２培地に解凍した。室温で１０分間培養した。
２）ＫＳＯＭ＋２ｉに移し、一晩培養した。
ＥＳ細胞誘導プロトコル（両方に対して同じ）
１日目：
１）２ｉ培地に空洞化した胚を移し、一晩培養した。
２）ＫＳＯＭ＋２ｉにおいて空洞化していない胚を継続して培養した
２日目：
１）２ｉ培地にすべての残りの胚を移した（空洞化されているかどうかにかかわらず）。
２）一晩培養し、２ｉ培地において早期胚を継続して培養した。
３日目：
１）酸性タイロードにより３０〜６０秒間胚を移し、透明帯を除去した。
２）胚を２ｉ培地において３回洗浄して、酸性タイロードを除去した。
３）９６ウェルフィーダープレート（ウェルは分裂期に不活性化したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦの単層を含む）の別々のウェルに各胚を付着させた。
４）２ｉ培地において一晩培養した。
４〜５日目：
１）副産物（非晶質の未分化細胞塊）の存在でプレーティングした胚を観察した。副産物は、プレーティングした胚の大きさがほぼ２倍になるときに移動の準備が整う。
２）各日：マイクロピペットで使用済み培地を除去し、新たな２ｉ培地と取り換える。
３）新しいフィーダーウェルに副産物を移動させた：
ａ．使用済み培地を除去し、ＰＢＳでウェルを穏やかに洗浄した。
ｂ．ＰＢＳを除去し、３０μｌの０．０５％ トリプシンを添加し、１０分間インキュベートした。
ｃ．３０μｌの２ｉ＋１０％ ＦＢＳを添加することによりトリプシンの反応を停止させた。
ｄ．マイクロピペッタで細胞を穏やかに解離させ、２４ウェルフィーダープレート中の新しいウェルにウェルの全内容物を移した。これが継代１（Ｐ１）であった。
ｅ．２ｉ培地において一晩培養した。
５〜８日目：（タイミングはいかに迅速に各細胞系統が拡大するかにより異なる）
１）毎日培地（２ｉ培地）を交換し、ＥＳＣ形態を持つコロニーの存在で観察した。
２）コロニーが出現するとき、コロニーが約５０％コンフルエントに拡大するまで継続して培養した。
３）これまでのように、コロニーをトリプシン化し、継代し、６ウェル皿中に１細胞系統当たり１ウェルをフィーダー上にプレーティングした。これが継代２（Ｐ２）であった。
続き：
１）約５０％コンフルエントまで供給を継続し、各細胞系統を観察した。
２）従来通り、細胞をトリプシン化した。
３）２ｉ＋１０％ ＦＢＳによりトリプシン処理を停止させ、遠心分離（５’、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ卓上型遠心機において１２００ｒｐｍ）により細胞をペレット化した。
４）上清を吸引し、４００μｌの凍結培地（７０％ ２ｉ、２０％ ＦＢＳ、１０％ ＤＭＳＯ）において細胞を穏やかに再懸濁した。
５）２つのバイアルに細胞を分注し、−８０°で凍結させた。これが継代３（Ｐ３）であった。
６）長期間保存のため、バイアルを液体窒素保存容器に移した。
２ｉ培地を表３中の通りに調製した。
材料：妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）
ヒト妊娠尿繊毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）
雌ラット（５〜１２週齢）
雄ラット（１２週齢から８月齢）、１ケージ当たり１匹
注射器／針
６：００〜１８：００に明かりのある動物部屋
手順：
１日目：８：００〜１０：００ＡＭ
２０ＩＵ ＰＭＳＧ（０．４ｍｌ）を雌の腹腔内に注射
未使用のＰＭＳＧを廃棄する。
３日目：８：００〜１０：００ＡＭ（ＰＭＳＧ注射から４８時間後）
５０ＩＵ ＨＣＧ（１ｍｌ）を雌の腹腔内に注射
交配用ケージ内に雄１匹当たり雌１匹を入れる。
未使用のＨＣＧを廃棄する。
４日目：８：００〜１０：００ＡＭ（ＨＣＧ注射から２４時間後）
雌の膣栓を確認する。
ホルモン供給元
ＰＭＳＧ：Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ−４８７７（１０００ＩＵ）。５０ＩＵ／ｍｌの最終［ ］にＰＢＳ中で再懸濁した。１ｍｌのアリコート中に−２０°で保存する。
ＨＣＧ：Ｓｉｇｍａ ＃ＣＧ−５（５０００ ＩＵ）。５０ＩＵ／ｍｌの最終［ ］にＰＢＳ中で再懸濁した。１ｍｌのアリコート中に−２０°で保存する。
１．４．：ラット胚幹細胞株の核型決定
本明細書で作製されたラットＥＳ細胞株が核型決定され、これらの結果を表４〜７に要約する。
１．５．：ラット胚幹細胞へのベクターの電気穿孔
１．電気穿孔前に、２４〜４８時間、ラットＥＳ細胞を継代した。
２．電気穿孔の２４時間前に、培地をＲＶＧ２ｉ＋ＲＯＣＫｉ（１０μＭ Ｙ−２７６３２）に交換した
３．トリプシン処理の３０分前に培地を交換した。
４．電気穿孔したＤＮＡをアリコートした。
５．ＤＮＡを１０分より長く室温で加温した。
６．５分間６２℃でＤＮＡを加熱した。氷上にＤＮＡを置く。
７．トリプシン処理した細胞：
ａ．浮遊コロニーを回収した。できるだけ多くの浮遊物を回収するためにプレートを洗浄した。
ｂ．ペレット化したコロニー：７５０ｒｐｍで３分
ｃ．５〜１０ｍｌのＰＢＳでペレットを１回洗浄し、再回転／ペレット
ｄ．上清を吸引し、５００λのトリプシン、０．０５％＋１％ ニワトリ血清を添加した。
ｉ．１管当たり１つより多い１０ｃｍのプレートのコロニーをプールしなかった。トリプシン化の際に、管の底に詰めたコロニーが多すぎる場合、それらは凝集して、細胞のほとんどがなくなるであろう。
ｅ．３７°で４分。凝集を最小限に抑えるために数回コロニーをピペットで取り除いた。
ｆ．ステップを１〜２回繰り返した：３７°で４分
ｇ．５００λ ＲＶＧ２ｉ＋１０％ ＦＢＳによりトリプシン反応を停止させた。
８．細胞をペレット化した：１２００ｒｐｍで５分
９．１０ｍｌのＰＢＳ中で細胞を再懸濁した。２つの２０λアリコートを計数して、全細胞数を決定した。
１０．ペレット化した細胞（５分／１２００ｒｐｍ）、全細胞数及び全再懸濁容量を計算し、正確な細胞濃度を達成した（標的数／７５μｌのＥＰ緩衝液）。
１１．最小体積のＥＰ緩衝液中で再懸濁し、全体積を測定し、ＥＰ緩衝液により標的容量を調節する。電気穿孔用緩衝液は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅにより販売されている。カタログ番号は、ＥＳ−００３−Ｄである。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：６５２−６５９を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。
１２．７５λ 細胞を５０λ ＤＮＡに添加し、ＢＴＸ４８−ウェルキュベットの１つのウェルに１２５λ 細胞／ＤＮＡ溶液を移す。
ａ．１２５λ ＥＰ緩衝液で同じカラム中の空のウェルを充填した。
１３．ＢＴＸエレクトロポレーター中でキュベットを１回パルスした：
ａ．設定：４００Ｖ；Ω；１００μＦ（設定は変動し得る）
１４．回復させるために１５分間氷上にキュベットを置いた。
１５．５ｍｌのＲＶＧ２ｉ＋１０μＭ ＲＯＣＫｉに細胞を除去した。
１６．２０ｍｌのＲＶＧ２ｉ＋１０μＭのＲＯＣＫｉを含む１５ｃｍのプレートに加えた。プレートは、２倍のｎｅｏＲ ＭＥＦ（またはプロジェクトに応じてその他のＭＥＦ）を有する。ｎｅｏＲ選択可能なマーカーは、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｇｅｎｅ，１９：３２７−３６または米国特許第７，２０５，１４８号もしくは同第６，５９６，５４１号（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である。
１７．３７°でインキュベートした。４８時間後、選択を開始する。
使用されたＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２であった。
１．６：ラット胚幹細胞における標的遺伝子改変の選択
１．電気穿孔前に２４〜４８時間、細胞を継代した。
２．電気穿孔の２４時間前に、培地をＲＶＧ２ｉ＋ＲＯＣＫｉ（１０μＭ Ｙ−２７６３２）に交換した。
３．トリプシン処理の３０分前に培地を交換した。
４．電気穿孔したＤＮＡをアリコートした。
５．ＤＮＡを１０分より長く室温で加温した。
６．５分間６２℃でＤＮＡを加熱した。氷上にＤＮＡを置く。
７．細胞をトリプシン処理した：
ａ．浮遊コロニーを回収した。できるだけ多くの浮遊物を回収するためにプレートを洗浄した。
ｂ．コロニーをペレット化した：７５０ｒｐｍで３分
ｃ．５〜１０ｍｌのＰＢＳでペレットを１回洗浄し、再回転／ペレット
ｄ．上清を吸引し、５００λのトリプシン、０．０５％＋１％ ニワトリ血清を添加した。
ｉ．１管当たり１つより多い１０ｃｍのプレートのコロニーをプールしなかった。トリプシン化の際に、管の底に詰めたコロニーが多すぎる場合、それらは凝集して、細胞のほとんどがなくなるであろう。
ｅ．３７°で４分。凝集を最小限に抑えるために数回コロニーをピペットで取り除いた。
ｆ．１〜２回繰り返した：３７°で４分
ｇ．５００λ ＲＶＧ２ｉ＋１０％ ＦＢＳによりトリプシン反応を停止させた。
８．細胞をピレット化した：１２００ｒｐｍで５分
９．１０ｍｌのＰＢＳ中で細胞を再懸濁した。２つの２０λアリコートを計数して、全細胞数を決定した。
１０．ペレット化した細胞（５分／１２００ｒｐｍ）、全細胞数及び全再懸濁容量を計算し、正確な細胞濃度を達成した（標的数／７５μｌのＥＰ緩衝液）。
１１．最小容量のＥＰ緩衝液中で再懸濁し、全容量を測定し、ＥＰ緩衝液により標的容量を調節した。
１２．７５λ 細胞を５０λ ＤＮＡに添加し、ＢＴＸ ４８ウェルキュベットの１つのウェルに１２５λ 細胞／ＤＮＡ溶液を移す。
ａ．１２５λ ＥＰ緩衝液で同じカラム中の空のウェルを充填した。
１３．ＢＴＸエレクトロポレーター中でキュベットを１回パルスした：
ａ．設定：４００Ｖ；１００μＦ（設定は変動し得る）
１４．回復させるために１５分間氷上にキュベットを置いた。
１５．５ｍｌのＲＶＧ２ｉ＋１０μＭのＲＯＣＫｉに細胞を除去した。
１６．２０ｍｌのＲＶＧ２ｉ＋１０μＭのＲＯＣＫｉを含む１５ｃｍのプレートに加えた。プレートは、２倍のｎｅｏＲ ＭＥＦ（またはプロジェクトに応じてその他のＭＥＦ）を有した。
１７．３７°でインキュベートした。４８時間後、選択を開始した。
１８．Ｇ４１８の選択プロトコルは以下の通りであった：
ａ．２日目（ＥＰから２日後）：７５μｇ／ｍｌの２ｉ培地＋Ｇ４１８中で細胞をインキュベートした。
ｂ．３日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地中で細胞をインキュベートした。
ｃ．４日目：７５μｇ／ｍｌの２ｉ培地＋Ｇ４１８中で細胞をインキュベートした。
ｄ．５日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地中で細胞をインキュベートした。
ｅ．６日目：７５μｇ／ｍｌの２ｉ培地＋Ｇ４１８中で細胞をインキュベートした。
ｆ．７日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地中で細胞をインキュベートした。
ｇ．８日目：７５μｇ／ｍｌの２ｉ培地＋Ｇ４１８中で細胞をインキュベートした。
ｈ．９日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地中で細胞をインキュベートした。
ｉ．１０日目：７５μｇ／ｍｌの２ｉ培地＋Ｇ４１８中で細胞をインキュベートした。
ｊ．１１日目：Ｇ４１８を含まない２ｉ培地中で細胞をインキュベートした。
ｋ．１２日目：コロニーを選出して、スクリーニングのために拡大させた。各コロニーを、０．０５％ トリプシン＋１％ ニワトリ血清中で１０分間解離し、次いで、９６ウェルフィーダープレートの１つのウェルにプレーティングした。
１９．２ｉ培地中でコロニーを３日間拡大させた。
２０．新しい９６ウェルフィーダーウェルにクローンを１：１に継代した。
２１．２ｉ培地中でクローンを３日間拡大させた。
２２．各クローンについて、コロニーをトリプシン中に解離した。各クローンの２／３を冷凍し、−８０°で保存し、ラミニンプレート（１０μｇ／ｍｌのラミニンでコーティングした９６ウェルプレート）上に残りの１／３をプレーティングした。
２３．ラミニンプレートがコンフルエントであった場合には、クローンの遺伝子型のためのスクリーニング研究室に移した。
１．７．ラット胚幹細胞の分子署名
表８に列挙された遺伝子は、マウスＥＳ細胞において対応する遺伝子よりもラットＥＳ細胞において２０倍低いレベルで発現した。表９に列挙された遺伝子は、マウスＥＳ細胞において対応する遺伝子よりもラットＥＳ細胞において２０倍高いレベルで発現した。
表８及び９中のマイクロアレイデータを以下の通りに作製した。ラットＥＳ細胞（ＡＣＩ．Ｇ２及びＤＡ．２Ｂ）ならびにマウスＥＳ細胞（Ｆ１Ｈ４）を、コンフルエントまで３代継代のために２ｉ培地中で培養した。Ｆ１Ｈ４細胞を、フィーダーの不在下、ゼラチンでコーティングしたプレート上で培養した。Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞は、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃヘテロ接合性胚（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，Ｈｉｃｋｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｅｓｃａｒａｖａｇｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｓａｕ，Ｌ．，Ｄｏｒｅ，Ａ．Ｔ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．，Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．（２００７）を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）由来であった。
以下のプロトコルをサンプル調製のために使用した：１．５ｍＬのエッペンドルフ管を試料ＩＤで標識した。プレート上で成長した細胞を３７℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中ですすいだ。ＰＢＳを除去し、３００ｕｌのＴｒｉｚｏｌ（登録商標）を添加した。スクレーパーを使用して、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中の細胞を剥がし取った。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）中の溶解細胞を、１．５ｍＬのエッペンドルフ管中に採取した。懸濁液上で成長した細胞については、細胞を３７℃のＰＢＳ中ですすぎ、１．５ｍＬの管中に採取した。細胞を遠心分離し、ＰＢＳを除去し、３００ｕｌのＴｒｉｚｏｌ（登録商標）を細胞に添加した。ピペット操作により細胞膜を破った。１０〜１０５細胞を有する試料をＦＡＣＳのために分類し、容積を１００ｕＬ未満に濃縮した。４容積のＲＮＡ溶解緩衝液を添加し、ピペット操作により混合した。試料については、３２０ｕＬのＲＮＡ溶解緩衝液を８０ｕＬの試料に添加した。試料を−２０℃で保存した。
ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して、マウス及びラット遺伝子の発現レベルを測定した。Ｔｏｐｈａｔによるシークエンシングの読み取りをマウス及びラット参照ゲノムにマッピングし、ＲＰＫＭ（百万のマッピングされた断片当たりのエクソン１キロベース当たりの断片）をマウス及びラット遺伝子について算出した。遺伝子記号に基づいた相同遺伝子を選択し、次いで、ｔ検定を使用して、マウスとラットとの間のそれぞれの遺伝子の発現レベルを比較した。ｍｉＲ−３２は、上位１０位において、ラットＥＳＣにおいて発現したが、マウスＥＳ細胞においては発現しなかった。ｍｉＲ−６３２からの比較データは存在しないが、ラットＥＳＣにおいて発現した他の遺伝子と比較したその発現のレベル及び胚発生におけるそれらの知られている機能に基づいて、ｍｉＲ−６３２を、ラットＥＳ細胞におけるマーカーとして選択した。
表８．列挙された遺伝子は、マウスＥＳ細胞において対応する遺伝子よりもラットＥＳ細胞において２０倍低いレベルで発現した。
表９．列挙された遺伝子は、マウスＥＳ細胞において対応する遺伝子よりもラットＥＳ細胞において２０倍高いレベルで発現した。
表１０．マウスＥＳ細胞において対応する遺伝子よりもラットＥＳ細胞において２０倍高いレベルで発現する表９からの遺伝子のサブセット
ラットＥＳ細胞における多能性マーカー／遺伝子を用いるさらなる分子署名もまた、開発された。表１１は、ＲＮＡプロファイリングデータからの遺伝子の一覧及びそれらの発現ランクを提供する。ｍＲＮＡは、ラットＥＳ細胞から単離され、様々なマーカーの発現レベルを互いに対して比較した。「ランク」という用語は、個々の遺伝子の相対的な発現レベルを意味し、ランクが高いほど（１が最も高い）、発現が高い。例えば、アッセイされた遺伝子のすべてのうちの１３のＯｃｔ４のランクは、１２の遺伝子を除いたすべてよりも高く発現したことを意味する。この実験の背景は、３０を下回る任意の発現値であり、６１０７の遺伝子は、３０以上の発現値を有した。
表１１．様々な多能性、中胚葉、内胚葉、神経、及び栄養外胚葉マーカー／遺伝子を用いるラットＥＳ細胞分子署名
実施例２：ラットにおけるゲノム遺伝子座の不活性化
２．１：エンドヌクレアーゼ剤を用いた内因性ゲノム遺伝子座の不活性化
内因性ラットゲノム遺伝子座で突然変異対立遺伝子を導入するために、本明細書に記載されるラットＥＳ細胞は、ＺＦＮ１及び２（またはＴＡＬＥＮ１及び２）を発現する発現ベクター（またはｍＲＮＡ）で電気穿孔される。これらのタンパク質は、約６ｂｐ〜約４０ｂｐだけ離れている、反対のストランド上でそれらの標的配列と結合する。二本鎖切断が、標的遺伝子座内に形成され、細胞が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復を試みている。多くの場合、ＮＨＥＪは、欠失の形成をもたらし、しばしば、（ほとんどの場合、フレームシフト突然変異を生じることによって）遺伝子の機能を破壊する。突然変異対立遺伝子を含む陽性クローンを特定するために、薬物選択が行われないので、電気穿孔した細胞を低密度でプレーティングする。コロニーを選出し、突然変異が生じなかったかどうかを確認するために、標的部位でアッセイした（例えば、上述の対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を用いて）。次いで、突然変異対立遺伝子を含む選択されたＥＳ細胞を宿主ラット胚、例えば、プレ桑実胚期または胞胚期のラット胚に導入し、代理母の子宮内に移植して、創始ラット（Ｆ０ラット）を作製する。続いて、創始ラットを野生型ラットと繁殖させて、突然変異対立遺伝子に対してヘテロ接合性であるＦ１子孫を作製する。ヘテロ接合性のＦ１ラットの交配により、突然変異対立遺伝子に対してホモ接合性の子孫を生み出すことができる。
２．２．：ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたラットアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子の不活性化におけるラットＥＳＣの標的化
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ゲノムにおける独自の標的配列にエンドヌクレアーゼ活性を導くように配列特異的なモジュラーＤＮＡ結合ドメインを使用する。ＺＦＮは、一対のモノマーとして遺伝子操作される。各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合されたＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの非特異的な切断ドメインを含有する。各ジンクフィンガーは、３ｂｐのサブサイトと結合し、特異性は、両方のモノマーの組み合わせた標的微により達成される。ＺＦＮは、ＤＮＡにおいて二重鎖切断（ＤＳＢ）を生じ、突然変異（挿入または欠失）は、しばしば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）中に起こる。図１５は、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ等のゲノム編集エンドヌクレアーゼが標的ゲノム配列において二重鎖切断を導入し、細胞におけるＮＨＥＪを活性化する。ＤＳＢはまた、ドナー配列にＺＦＮが与えられる場合、相同的組み換えにより相同性配向型修復（ＨＤＲ）も刺激する。
そのようなＺＦＮは、標的化効率を改善するために、本明細書に記載される様々な方法及び組成物と組み合わせて用いられた。ラットアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子座は、ＺＦＮ１及び２を発現する発現ベクターをもラットＥＳ細胞に導入することを除いては、実施例３．２（ａ）（ｉ）に記載されるように標的とした。ｒＴＺＦＮ１Ｐ及びｒＴＺＦＮ２Ｐと組み合わせてＡｐｏＥ標的化事象の概略図を提供する、図１１を参照のこと。実施例５において以下に論じられるように、標的化効率を決定し、これらの結果を表１２に示す。ヘテロ接合性標的化、ホモ接合性標的化、及び「混合」ダブルス（例えば、複合ヘテロ接合性標的化）についてスクリーニングするために、特定のプライマー及びプローブを使用して、遺伝子型を決定した。驚くことには、標的化効率は、８〜１０倍に増加した。
プラスミド標的化ベクターは、自己欠失薬物選択カセット、及びレポーター遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子を用いて構築した（選択カセットを含む標的化ベクターの電気穿孔時に生じ得る相同及び非相同的組み換え事象の説明については、図１４を参照のこと）。良好な標的化効率を達成し、高い割合（％）のキメラを生み出した。また、標的化効率を改善する際のその効果を試験するために、標的化ベクターと組み合わせてジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）も試験した（標的化ベクターの相同的組み換えの効率を改善するためのＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを用いた遺伝子標的技術の説明については図１６を参照のこと）。標的化ベクターは、ＡｐｏＥ遺伝子座を切断する２つのＺＦＮ対のために発現ベクターと共発現した。ラットＥＳＣクローンを、標的化ベクターの両方で電気穿孔し、一組のＺＦＮが、標的化ベクター単独で電気穿孔されたラットＥＳＣクローンのものよりも８〜１０倍高い標的化効率を示した。さらに、クローンの約２％の２対立遺伝子のホモ接合性の標的化を検出した。これらの標的とするクローンのうちの２つから高い割合（％）のキメラを得た。
標準的な技法を用いて、ＡｐｏＥを標的とする（ＺＦＮ支援による）ラットＥＳＣクローンを、ＳＤ胚盤胞に顕微注入し、次いで、これを偽妊娠したＳＤ受容雌に移した。毛色によってキメラを特定し（ＡｐｏＥ−ＺＦＮ−ＡＢ５キメラ（すなわち、ＡｐｏＥ−／−キメラ）を示す、図１７を参照のこと）、雄Ｆ０キメラをＳＤ雌と繁殖させた。標的とするＡｐｏＥ対立遺伝子の存在で、生殖細胞系列のＦ１子を遺伝子型化した（表１３）。これらの標的とするクローンのうちの２つから高い割合（％）のキメラを得た。
ＡｐｏＥノックアウトラットは、様々なタイプの障害及び疾患を試験ための手段を提供する。ヒトにおいては、アポリポタンパク質は、カイロミクロン、ＨＤＬ、ＬＤＬ、及びＶＬＤＬにおいて見出される。ＡＰＯＥは、トリグリセリドリッチリポタンパク質構成要素の正常な異化に必須である。ＡＰＯＥの欠損により、例えば、家族性高コレステロール血症、脂質異常症、ベータリポタンパク質血症、家族性異常ベータリポタンパク質血症、ＩＩＩ型高リポタンパク質血症（ＨＬＰ ＩＩＩ）、冠動脈疾患のリスクを含む多くの病状をもたらす。１つのイソ型（ＡｐｏＥ４）は、遅発性及び突発性アルツハイマー病、場合によっては、ＭＳとも関連している。
マウスにおいては、ＡｐｏＥは、ＨＤＬにおいて見出され、ヒトにおいて見られるような、コレステロールを輸送する。ＡｐｏＥ欠損マウス（２つの独立したＫＯ）は、正常な血漿コレステロールの５倍を有し、３月齢（ヒト症候群に匹敵する）で近位大動脈において泡沫細胞リッチな沈殿物を発生した。
ラットにおけるＡｐｏＥノックアウトは、プラーク形成、転写変化（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）、及びエクスビボ機能が挙げられるが、これらに限定されない、内皮機能を研究するための動物モデルを提供する。さらに、大きいサイズのラットは、これらのアッセイすべてを容易にし、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータの質を潜在的に改善し得る。
２．３．ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γ）遺伝子座の不活性化
ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γまたはＩｌ２ｒｇ）遺伝子座を、ＺＦＮ Ｕ（ＺＦＮ上流）及びＺＦＮ Ｄ（ＺＦＮ下流）を発現する発現ベクターをもラットＥＳ細胞に導入することを除いては、実施例３．３（ａ）に記載されるように標的とした。図１８は、ＺＦＮ Ｕ及びＺＦＮ Ｄと組み合わせたＩＬ２ｒ−γ標的化事象の概略図を提供する。配列番号９３内でのこれらのジンクフィンガーが結合するＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の配列を、図１８において示す。以下の実施例３．３（ａ）において論じられるように、標的化効率を決定し、これらの結果を表１４に示す。簡潔に言えば、ホモ接合性標的クローンをＰＣＲにより確認した。ＺＦＮ１対については、１９２のうち１７３の突然変異クローンがスクリーニングされ（９０％）、ＺＦＮ２対については、１９２のうち１６２のクローンがスクリーニングされた（８４％）。
標準的な技法を用いて、ＩＬ２ｒ−γを標的とする（ＺＦＮ支援による）ラットＥＳＣクローンを、ＳＤ胚盤胞に顕微注入し、次いで、これを偽妊娠したＳＤ受容雌に移した。毛色によってキメラを特定し、雄Ｆ０キメラをＳＤ雌と繁殖させた。標的とするＩＬ２ｒ−γ対立遺伝子の存在で、生殖細胞系列のＦ１子を遺伝子型化した。
２．４．：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた、ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γ）の不活性化
ラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座を、標的化効率に役立たせるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをもラットＥＳ細胞に導入したことを除いては、実施例３．３（ａ）に記載されるように標的とした。ＳＢＩ：Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｓ９「ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅ」の一体型ベクターを用いて、ＣＡＧ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、またはＣＭＶプロモータによりＣａｓ９発現を駆動した。カスタムｇＲＮＡをベクターに連結し、Ｈ１プロモータにより発現した。Ｉｌ２ｒｇに対する４つのｇＲＮＡを設計した。ｇＲＮＡｓ１−４により標的とされるラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座を図１９に示す。標的化（例えば、ヘテロ接合性標的化、ホモ接合性標的化、及び複合ヘテロ接合性標的化）についてスクリーニングするために、特定のプライマー及びプローブを使用して、遺伝子型を決定した。様々なガイドＲＮＡを用いる場合の標的化の結果を表１５に示す。「強」及び「弱」は、コロニーが標的改変を有するというスクリーニングに基づいた証拠の強度を指す。
２．５．：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた、マウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ）遺伝子の不活性化
マウスＨｐｒｔ遺伝子座は、ＬＴＶＥＣ単独またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせて使用して、マウスＥＳ細胞において標的とされた。３２．９ｋｂの完全Ｈｐｒｔコード配列は、ｅＧＦＰも発現した、ｐＣＡＧＧ−Ｐｕｒｏピューロマイシン耐性選択カセットの欠失及びそれによる置換に対して標的とされた。欠失端点は、開始及び終止コドンであった。使用されたガイドＲＮＡ配列は、５’−ＧＡＣＣＣＧＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＵＣＧ−３’（配列番号８４）であり、これは、マウスＨｐｒｔ遺伝子のエクソン１を標的とした。予測された標的部位切断位置は、欠失の５’末端からの２２塩基対であった。ＥＳ細胞において観察されたＣａｓ９／ｇＲＮＡの実際の切断効率は、９３％以上であった。要約を表１６に示す。完全３２．９ｋｂのＨｐｒｔ遺伝子座の標的化を支援するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用は、ＬＴＶＥＣ単独での使用を５倍上回る標的の増強をもたらした。
実施例３：ラットゲノム遺伝子座の標的改変
３．１：ラットＥＳＣの標的化：ラットのＲｏｓａ２６遺伝子座
ラットのＲｏｓａ２６遺伝子座は、同じ間隔を有し、マウスにおけるように、Ｓｅｔｄ５遺伝子とＴｈｕｍｐｄ３遺伝子との間にある。ラットのＲｏｓａ２６遺伝子座（図１２、パネルＢ）は、マウスのＲｏｓａ２６遺伝子座（図１２、パネルＡ）とは異なる。マウスＲｏｓａ２６転写物は、２つまたは３つのエクソンからなる。ラット遺伝子座は、マウスエクソン１（Ｅｘ１ａ）に対して相同的なエクソンに加えて、第２のエクソン１（Ｅｘ１ｂ）を含む。第３のエクソンは、ラットにおいて特定されていない。ラットＲｏｓａ２６対立遺伝子の標的化を図１２Ｃに示し、ここでは５ｋｂの相同性アームはそれぞれ、ＤＡラットＥＳＣからのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによってクローン化された。標的とする対立遺伝子は、ラットＲｏｓａ２６イントロンにおいて１１７ｂｐの欠失を置換するＳＡ（スプライシング受容体）−ｌａｃＺ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットを含む。
ラットのＲｏｓａ２６遺伝子座での標的化効率を決定した（表１７）。標準的な技法を用いて、線形化ベクターをＤＡまたはＡＣＩラットＥＳＣに電気穿孔し、形質変換したコロニーを２ｉ培地＋Ｇ４１８において培養した。個々のコロニーを選出し、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイを用いてスクリーニングした（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．ｅｔ
ａｌ．（２００３） Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２−６６０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
Ｒｏｓａ２６を標的とするラットＥＳＣクローンを用いた、キメラ生成及び生殖細胞系列の伝達。 標準的な技法を用いて、再確認されたＲｏｓａ２６を標的とするラットＥＳＣクローンを、ＳＤ胚盤胞に顕微注入し、次いで、これを偽妊娠したＳＤ受容雌に移した。毛色によってキメラを特定し、雄Ｆ０キメラをＳＤ雌と繁殖させた。標的とするＲｏｓａ２６対立遺伝子の存在で、生殖細胞系列（アグーチ）のＦ１子を遺伝子型化し、２２匹のアグーチ子のうちの９匹は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座でのヘテロ接合体として遺伝子型化した（表１８）。
Ｒｏｓａ２６遺伝子座での遺伝子的に改変された対立遺伝子が生殖細胞系列を通して伝達されたことを確認するために、ｌａｃＺ発現を、ヘテロ接合性のＲｏｓａ２６を標的とするラットにおけるＸ−ｇａｌ染色によって確認した。１４週齢のヘテロ接合性のＲｏｓａ２６を標的とするラットからの脳、心臓及び胸腺、ならびに肺のＸ−ｇａｌ染色は、ｌａｃＺの発現を示し（それぞれ、図１３Ｂ、Ｄ、及びＦ）、一方、年齢を一致させた野生型対照は、低レベルの背景Ｘ−ｇａｌ染色を示した（それぞれ、図１３Ａ、Ｃ、及びＥ）。Ｅ１２．５及びＥ１４．５のヘテロ接合性のＲｏｓａ２６を標的とするラット胚におけるＸ−ｇａｌ染色は、ｌａｃＺの遍在的発現を示し（それぞれ、図１３Ｇ及びＩ）、一方、対照ラット胚は、低レベルの背景Ｘ−ｇａｌ染色を示した（それぞれ、図１３Ｈ及びＪ）。
３．２．（ａ）（ｉ）：ラットアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子座の標的化
ラットアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子座を標的として、ＡｐｏＥ機能を破壊した。ＡｐｏＥ遺伝子座の標的化は、ＡｐｏＥ遺伝子座に相同である５’及び３’相同性アームが隣接するｌａｃＺ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットを含む標的化ベクターを用いて行われた。図２０は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座が、１．８ｋｂの欠失と、プロタミンプロモータにより駆動されるＣｒｅｉ遺伝子を含む自己欠失カセットをさらに含む、ｌａｃＺ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットの挿入とによって破壊された遺伝子的に改変されたラットのＡｐｏＥ遺伝子座を示す。電気穿孔法の条件は以下の通りであった：６ｕｇ ＤＮＡ、２．０５×１０６細胞、４００Ｖ、２００ｕＦ：３４２Ｖ、５９３ｕｓｅｃ；２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なｎｅｏＲ ＭＥＦ上にプレーティング。
ＡｐｏＥ遺伝子座での標的化効率を決定し、表１９に示す。標準的な技法を用いて、線形化ベクターをＤＡ株由来のＤＡ．２ＢラットＥＳＣに電気穿孔し、形質変換したコロニーを培養した。個々のコロニーを選出し、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイを用いてスクリーニングした。
ＡｐｏＥを標的とするラットＥＳＣクローンを用いた、キメラ生成及び生殖細胞系列の伝達が行われた。標準的な技法を用いて、ＡｐｏＥを標的とするラットＥＳＣクローンを、ＳＤ胚盤胞に顕微注入し、次いで、これを偽妊娠したＳＤ受容雌に移した。毛色によってキメラを特定し、雄Ｆ０キメラをＳＤ雌と繁殖させた。生殖細胞系列の伝達が達成された。標的とするＡｐｏＥ対立遺伝子の存在で、Ｆ１子を遺伝子型化した（表２０）。
内因性ＡｐｏＥプロモータにより駆動されたＬａｃＺ発現は、１２週齢のＡｐｏＥ＋／−雌ラットにおける脳、血管、及び肝臓においてＸ−ｇａｌ染色により確認された（それぞれ、図４３〜４５）。図４３〜４５は、内因性ＡｐｏＥの発現パターンを反映するｌａｃＺの発現パターンを示す。年齢を一致させた野生型対照は、低レベルの背景Ｘ−ｇａｌ染色を示した。
ＡｐｏＥ欠失ラットの表現型をさらに試験した。縦断的血液生化学検査研究を行い、３週間間隔で、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、及びトリグリセリドレベルを測定した。図４６Ａ〜Ｄは、６週齢、９週齢、１２週齢、及び１５週齢のホモ接合性標的、ヘテロ接合性標的、及び野生型ラットにおける血清コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、及びトリグリセリドレベルを示す。２匹の野生型ラット、７匹のヘテロ接合性ラット、及び８匹のホモ接合性ラットからなる年齢を一致させたコホートにおいて目から出血させた。雄と雌の間で有意差は見られなかった。ホモ接合性のＡｐｏＥ欠失ラットは、コレステロール及びＬＤＬレベルの上昇ならびにＨＤＬレベルの減少を示した。ＡｐｏＥ−／−マウスとは異なり、ＡｐｏＥ欠失ラットにおけるトリグリセリドの著しい増加は観察されなかった。
行われたさらなる表現型分析は、大動脈のプラーク形成の組織学／エクスビボ画像、大動脈のプラーク形成のインビボ画像、及び大動脈内皮の転写変化（全トランスクリプトームショットガン配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ））を含む。これらのアッセイのタイミングは、プラーク形成の時間記録により異なる。プラークは、２４週間のＡｐｏＥ−／−マウスにおいて検出可能である。
ＡｐｏＥにおけるさらなる標的化データもまた、表２２に提供される。
３．２．（ａ）（ｉｉ）．ラットにおける標的化ベクターを用いたＡｐｏＥの標的化
図２０は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座及び標的化プラスミドの概略図を提供する。図２０の上の概略図は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応するゲノム領域のゲノム構造を示す。ＡｐｏＥのエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥの３つのイントロンは、線で示され、エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。
図２０の下の概略図は、標的化ベクターである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。標的化ベクターは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、及びｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。自己欠失カセットは、マウスＰｒｍ１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子、及びヒトユビキチンプロモータに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含む薬物選択カセットを含む。
Ｃｒｅｉ遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含み、これらは、原核細胞におけるその発現を妨ぐようにイントロン（Ｃｒｅｉ）によって分離される。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号及び米国出願公開第２０１３−０３１２１２９号を参照されたく、これらは詳細に自己欠失カセットを説明し、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｒｍ１プロモータを用いることにより、自己欠失カセットは、Ｆ０ラットの雄胚細胞において特異的に欠失され得る。標的化ベクターを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なネオマイシン耐性ＭＥＦ上にプレーティングした。実施例１に記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、選択し、維持した。
表４４に示されるように、３８４のコロニーをスクリーニングし、２３の標的とするクローンを得た。標的化効率は、５．９９％であった。３つのクローンを、実施例１において本明細書に記載される胚盤胞に注入した。キメラを生成する３つのクローンを得、クローンのうちの１つに生殖細胞系列を通して標的改変を伝達した。
３．２．（ａ）（ｉｉｉ）．ジンクフィンガーヌクレアーゼを組み合わせた標的化ベクターによるラットにおけるＡｐｏＥの標的化
実施例３．２（ａ）（ｉｉ）において用いられる標的化ベクターをジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせて使用して、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を標的とした。表２１は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座のゲノム構成の要約を提供する。表２１中に示される配置をラットゲノムの参照配列の構築５．０（ＥＮＳＭＢＬ）から得られた。ＡｐｏＥは、（−）ストランドの染色体１上にある。
表２１．ラットのＡｐｏＥ遺伝子座及びジンクフィンガーヌクレアーゼ結合部位及び切断部位の配置の要約
図１１は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座の概略図を提供し、ＺＦＮ１及びＺＦＮ２における切断部位を灰色バーで示す。ＺＦＮ１の切断部位は、エクソン３中にあり、ＺＮＦ２の切断部位は、イントロン３中にある。両方のＺＦＮ部位の正確な位置を表２１に示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、５ｋｂ及び５．４ｋｂ）に対応するゲノム領域を濃灰色ボックスで示す。ＡｐｏＥのエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示され、エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。
用いられる標的化ベクターは、実施例３．２（ａ）（ｉｉ）におけるものと同じであり、図２０に示され、図２１Ａは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び図２０に示される標的化ベクターを用いて、ラットＥＳ細胞におけるＡｐｏＥ遺伝子座を標的化するための概略図を提供する。ＺＦＮには、２つの発現プラスミドとして、ＺＦＮ対のそれぞれの半分に対して１つを導入した。ＺＦＮ１には、２０ｕｇのプラスミド、及びＺＦＮ２には、２０ｕｇのプラスミドを使用した。ＺＦＮは、Ｓｉｇｍａから購入した。それぞれのＺＦＮの発現は、ＣＭＶプロモータにより駆動された。
標的化ベクターを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なｎｅｏＲ ＭＥＦ上にプレーティングした。実施例１において記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、選択し、維持した。
表２２及び表４４に示されるように、３８４のコロニーをスクリーニングし、２９０の標的とするクローンを得た。標的化効率は、７５．５２％であった。２つのクローンを、実施例１において本明細書に記載される胚盤胞に注入した。キメラを生成する２つのクローンを得、クローンのうちの１つに生殖細胞系列を通じて標的改変を伝達した。
さらに、ＺＦＮ１及びＺＦＮ２を用いて、２．０８％の効率を有する８つの２対立遺伝子を標的とするクローンを生み出した。
３．２．（ｂ）（ｉ）：大きな標的化ベクター（ＬＴＣ）を用いたラットアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子座の標的改変
約４５ｋｂのＡｐｏＥ遺伝子座に対して５’相同性アーム及び約２３ｋｂのＡｐｏＥ遺伝子座に対して３’相同性アームが隣接するｌａｃＺ−マウスＰｒｍ１−Ｃｒｅｉカセットを含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を用いて、ＡｐｏＥ遺伝子座の標識化が行われる。図２２は、ＡｐｏＥ遺伝子座が、１．８３ｋｂの欠失と、ｌａｃＺ遺伝子ならびにｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉカセット及びｈＵｂ−ｎｅｏ選択カセットを含む自己欠失カセットの挿入とによって破壊されたラットのＡｐｏＥ遺伝子座を示す。実施例３．２（ａ）（ｉ）において用いられる方法を用いて、このベクターをラットＥＳ細胞に導入することができる。
実施例３．２．（ｂ）（ｉｉ）．大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を用いたラットのＡｐｏＥ遺伝子座の標的化
図２２は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座及び大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。図２２の上の概略図は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ、濃い灰色ボックス）に対応するゲノム領域のゲノム構成を示す。ＡｐｏＥのエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥの３つのイントロンは、線で示され、エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。
図２２の下の概略図は、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。標的化ベクターは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、ならびにマウスＰｒｍ１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子及びヒトユビキチンプロモータに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含む薬物選択カセットを含む、ｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。Ｃｒｅｉは、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含み、これらは、原核細胞におけるその発現を妨げるようにイントロン（Ｃｒｅｉ）によって分離される。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号及び米国出願公開第２０１３−０３１２１２９号を参照されたく、これらは詳細に自己欠失カセットを説明し、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。マウスＰｒｍ１プロモータを用いることにより、自己欠失カセットは、Ｆ０ラットの雄胚細胞において特異的に欠失され得る。
ＬＴＶＥＣを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なｎｅｏＲ ＭＥＦ上にプレーティングした。実施例１に記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、選択し、維持した。
表４４に示されるように、２８８のコロニーをスクリーニングし、８つの標的とするクローンを得た。標的化効率は、２．７８％であった。３つのクローンを、実施例２において本明細書に記載されるように、胞胚期で宿主胚に注入して、キメララット（Ｆ０）を生み出した。さらに、０．３５％の２対立遺伝子効率であるという条件で、１つの２対立遺伝子を標的とするクローンを生み出した。
３．２．（ｂ）（ｉｉｉ）．ジンクフィンガーヌクレアーゼを組み合わせた大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）によるラットにおけるＡｐｏＥの標的化
実施例３．２．（ｂ）（ｉｉ）において用いられるＬＴＶＥＣをジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせて使用して、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を標的とした。表２１は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座のゲノム構成の要約を提供し、示された位置は、ラットゲノムの参照配列の構築５．０（ＥＮＳＭＢＬ）から得られた。
図２３は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座の概略図を提供し、ＺＦＮ１及びＺＦＮ２における切断部位を灰色バーで示す。ＺＦＮ１の切断部位は、ｔエクソン３中にあり、ＺＮＦ２の切断部位は、イントロン３中にある。両方のＺＦＮ部位の正確な位置を表２１に示す。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４５ｋｂ及び２３ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＡｐｏＥ遺伝子のエクソン１は、非コードであり、５’相同性アームに最も近い白抜きのボックスとして示される。ＡｐｏＥ遺伝子の３つのイントロンは、線で示される。エクソン２及び３は、コード領域を含み、点状の灰色ボックスとして示される。エクソン４は、点状の灰色影付き及び白抜きのボックスで示されるコード配列及び非コード配列の両方を含む。
用いられたＬＴＶＥＣは、実施例３．２（ｂ）（ｉｉ）におけるもので図２２に示されたものと同じである。ＺＦＮには、２つの発現プラスミドとして、ＺＦＮ対のそれぞれの半分に対して１つを導入した。ＺＦＮ １には、２０ｕｇのプラスミド、及びＺＦＮ２には、２０ｕｇのプラスミドを使用した。ＺＦＮは、Ｓｉｇｍａから購入した。それぞれのＺＦＮの発現は、ＣＭＶプロモータにより駆動された。
標的化ベクターを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なｎｅｏＲ ＭＥＦ上にプレーティングした。実施例１に記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、選択し、維持した。
表４４に示されるように、２８８のコロニーをスクリーニングし、１６の標的とするクローンを得た。標的化効率は、５．５６％であった。１つのクローンを、実施例２において本明細書に記載される胚盤胞に注入した。
さらに、ＺＦＮ１及びＺＦＮ２を用いることにより、０．３５％の効率を有する、１つの２対立遺伝子を標的とするクローンを生み出した。
３．２．（ｂ）（ｉｖ）．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を組み合わせた大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）によるラットにおけるＡｐｏＥの標的化
実施例３．２．（ｂ）（ｉｉ）において用いられるＬＴＶＥＣをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせて使用して、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を標的とした。表２３は、ＡｐｏＥのＬＴＶＥＣを単独で使用して、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を標的とするか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼと組み合わせて使用して、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座を標的とした、実験の結果の比較を示す。それぞれの実験において、電気穿孔された多能性細胞は、高密度でプレーティングされ、薬物耐性であるコロニーを見出すために薬物選択に供した。薬物耐性コロニーを選出し、本明細書に記載される対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を用いて標的改変についてスクリーニングした。具体的には、４×１０６細胞を、４００Ｖの電圧、１００ｕＦのキャパシタンス、及び０の抵抗で２ｕｇのＡｐｏＥ
ＬＴＶＥＣで電気穿孔した。後者の実験において、６ｕｇのＣａｓ９発現プラスミド及び３ｕｇのＡｐｏＥ ｇＲＮＡ２または３ｕｇのＡｐｏＥ ｇＲＮＡ３もまた、電気穿孔した。７５ｕｇ／ｍＬのＧ４１８を用いて選択を行った。ＡｐｏＥ ｇＲＮＡ２は、ＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＴＧＧ（配列番号８７）の配列を有し、領域６７ｂｐの３’のラットＡｐｏＥエクソン３の開始部分を標的とする。ＡｐｏＥ ｇＲＮＡ３は、ＣＣＴＧＣＧＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＡＣＧＣＴＴＴ（配列番号８８）の配列を有し、９７ｂｐの３’のラットＡｐｏＥエクソン３の開始部分を標的とする（図４７を参照のこと）。表２３に示されるように、Ｃａｓ９、及びｇＲＮＡのいずれかをＡｐｏＥ ＬＴＶＥＣと一緒に細胞に導入したとき、標的化効率が増加した（４３％から５３％または４７％）。対立遺伝子の標的化は、ＡｐｏＥ ｇＲＮＡ２または３と組み合わせてＡｐｏＥ ＬＴＶＥＣを標的とした５つのコロニーにおいて観察されたが、２対立遺伝子の標的化は、ＡｐｏＥ ＬＴＶＥＣ単独では観察されなかった。
３．３（ａ）：ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γ）遺伝子座の標的化
ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γまたはＩｌ２ｒｇ）遺伝子座を標的として、ＩＬ２ｒ−γ機能を破壊した。ＩＬ２ｒ−γは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１によるシグナル伝達において重要な役割を果たし、ＩＬ２ｒ−γにおける突然変異は、Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞の成長において著しい欠陥と関連する。
ＩＬ２ｒ−γ遺伝子座の標的化は、図２４に示されるＩＬ２ｒ−γ遺伝子座に相同である５’及び３’相同性アームが隣接するｅＧＦＰ−ｈＵｂ−ｎｅｏカセットを含む標的化ベクターを用いて行われた。図２５は、ラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座が３．２ｋｂの欠失により破壊されたラットのＩＬ２ｒ−γ遺伝子座のゲノム構造を示す。標的とするＩＬ２ｒ−γ遺伝子座はまた、ｅＧＦＰ遺伝子、ならびにマウスプロタミン１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたｈＵｂプロモータを含む薬物選択カセットを含む自己欠失カセット、からなった。
ＩＬ２ｒ−γ遺伝子座での標的化効率を決定し、表２４に示す。標準的な技法を用いて、線形化ベクターをＤＡ．２ＢラットＥＳＣに電気穿孔し、形質変換したコロニーを培養した。個々のコロニーを選出し、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイを用いてスクリーニングした。
ＩＬ２ｒ−γ−を標的とするラットＥＳＣクローンを用いたキメラ生成及び生殖細胞系列の伝達が行われた。標準的な技法を用いて、ＩＬ２ｒ−γ−を標的とするラットＥＳＣクローンを、ＳＤ胚盤胞に顕微注入し、次いで、これを偽妊娠したＳＤ受容雌に移した。毛色によってキメラを特定し、雄Ｆ０キメラをＳＤ雌と繁殖させた。標的とするＩＬ２ｒ−γ対立遺伝子の存在で、生殖細胞系列のＦ１子を遺伝子型化した（表２５）。クローンＩｌ２ｒｇ−ＣＧ１２を用いた別の顕微注入実験において、生殖細胞系列の伝達はまた、毛色及び遺伝子型によっても確認された。
Ｉｌ２ｒｇ−／Ｙのキメラ３番の表現型をさらに試験した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、いくつかのリンパ系の抗原を認識する抗体で染色した。ＧＦＰ陽性ＰＢＭＣが、図３０に示されるように、キメラの２から検出された。さらに、ＧＦＰ＋細胞は、Ｔ細胞マーカーＣＤ３に対して陰性であり（図２９Ａ）、大部分は、Ｂ細胞マーカーＢ２２０及びＮＫ細胞マーカーＣＤ１６１ａに対して陰性であった（それぞれ、図２９Ｂ及びＣ）。野生型ラットからのＰＢＭＣは、ＧＦＰ発現の陰性対照として使用された。図２９Ｄ〜Ｆを参照のこと。二重陽性の小集団は、マウスにおける公開されたＩｌ２ｒｇノックアウト表現型と一致する。これらのデータは、ＩＬ２受容体ガンマ陽性細胞を含むキメララットから得られ、これは、表現型の分析を複雑にする場合がある。リンパ球の数の対応する減少を示すために、フローサイトメトリー分析もまた、骨髄及び脾臓からの細胞集団において行うことができる。Ｍａｓｈｉｍｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１）：ｅ８８７０を参照のこと。
３．３（ｂ）：ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γ）遺伝子座の標的改変
ラットインターロイキン−２受容体ガンマ（ＩＬ２ｒ−γ）遺伝子座を標的として、ラットにおけるＩＬ２ｒ−γ機能を破壊した。図２５は、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座のゲノム構造（図２５の上パネル）及び遺伝子座に導入された標的化ベクター（図２５の下パネル）を示す。ｅＧＦＰは、遺伝子的に改変されたラットの免疫表現型がＦＡＣＳを用いて試験され得るように、レポーターとして選択された。自己欠失カセット（ｈＵｂ−Ｎｅｏ、Ｐｒｍ１−Ｃｒｅ）を用いて、薬物選択カセット及びＦ０ラットの雄胚細胞において特異的なＣｒｅ遺伝子を欠失した。さらに、標的化ベクターは、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子の全コード領域（約３．２ｋｂ）を欠失するように設計された。
ラットＥＳＣにおける欠失の大きさを、ラットＩｌ２ｒｇ遺伝子座に特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって確認した。胞胚期での宿主胚への標的とするクローンの顕微注入時、高パーセンテージのキメラが得られた。これらのキメラは、交配のために設定された。標的化が予想通りに作用するかどうかを判定するために、キメラからの末梢血が交配前に回収され、末梢血中の免疫細胞の表現型がＦＡＣＳを介して分析された。図３０に示されるように、ＧＦＰ陽性細胞は、試験された３つのうちの２つのキメラにおける末梢血中に検出され、キメララットは、１％未満のＴ細胞、１％未満のＢ細胞、及び１％未満のＮＫ細胞を含み、これらは、ＧＦＰ（すなわち、Ｉｌ２ｒｇ ＫＯ細胞）に対して陽性である（図２９Ａ〜Ｃ）。
３．４（ａ）（ｉ）．大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）によるラットにおけるＲａｇ２遺伝子座の標的化
表２６は、ラットＲａｇ２遺伝子座のゲノム構成の要約を提供し、示された位置は、ラットゲノムの参照配列の構築５．０（ＥＮＳＭＢＬ）から得られた。Ｒａｇ２は、（＋）ストランドの染色体３上にある。
図２６は、ラットＲａｇ２遺伝子座及び大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。ＬＴＶＥＣは、１４０ｋｂであり、欠失については約５．７ｋｂの部分のラットＲａｇ２遺伝子座を標的とする。図２６の上の概略図は、ラットのＡｐｏＥ遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アームに対応するゲノム領域（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ、濃い灰色ボックス）のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２は、点状の灰色影付きで示される単一のエクソンを含む。
図２６の下の概略図は、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び８４ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、及びｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。自己欠失カセットは、Ｃｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたマウスＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む。ネオマイシン耐性遺伝子を、Ｉｌ２ｒｇを標的とするラットＥＳ細胞の再標的化を可能にするハイグロマイシン耐性遺伝子と置換した、ＬＴＶＥＣの別の変形例が作製された。Ｃｒｅｉは、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含み、これらは原核細胞におけるその発現を妨げるようにイントロン（Ｃｒｅｉ）によって分離される。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号及び米国出願公開第２０１３−０３１２１２９号を参照されたく、これらは詳細に自己欠失カセットを説明し、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。マウスＰｒｍ１プロモータを用いることにより、自己欠失カセットは、Ｆ０ラットの雄胚細胞において特異的に欠失され得る。
ＬＴＶＥＣを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なｎｅｏＲ ＭＥＦ上にプレーティングした。実施例１において記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、維持した。
本明細書の他の箇所に記載されるように、コロニーをスクリーニングし、標的とするクローンを得た。次いで、標的とするクローンを、本明細書の他の箇所に記載されるように宿主胚に注入して、Ｆ０ラットを生み出す。
３．４（ａ）（ｉｉ）．大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるラットにおけるＲａｇ２遺伝子座の標的化
表２７は、ハイグロマイシン耐性遺伝子（図４８を参照のこと）を有するＲａｇ２ ＬＴＶＥＣの変形例を単独で使用して、ラットＲａｇ２遺伝子座を標的とするか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼと組み合わせて使用して、ラットＲａｇ２遺伝子座を標的とした、実験の結果の比較を示す。それぞれの実験において、電気穿孔された多能性細胞は、高密度でプレーティングされ、薬物耐性であるコロニーを見出すために薬物選択に供した。薬物耐性コロニーを選出し、本明細書に記載される対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を用いて標的改変についてスクリーニングした。具体的には、４×１０６細胞を、４００Ｖの電圧、１００ｕＦのキャパシタンス、及び０の抵抗で２ｕｇのＲａｇ２ ＬＴＶＥＣで電気穿孔した。後者の実験において、６ｕｇのＣａｓ９発現プラスミド及び３ｕｇのＲａｇ２ ｇＲＮＡ１または３ｕｇのＲａｇ２ ｇＲＮＡ４もまた、電気穿孔した。７５ｕｇ／ｍＬのＧ４１８を用いて選択を行った。Ｒａｇ２ ｇＲＮＡ１は、ＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＧＣＴＣＧＴＡＣＡＡ（配列番号８９）の配列を有し、領域２１９ｂｐの３’のラットＲａｇ２開始コドン（ＡＴＧ）を標的とする。Ｒａｇ２ ｇＲＮＡ４は、ＣＣＣＣＴＣＡＧＡＴＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴ（配列番号９０）の配列を有し、ラットＲａｇ２終止コドン（ＴＡＧ）の領域１２ｂｐの３’を標的とする（図４８を参照のこと）。表２７に示されるように、Ｃａｓ９、及びｇＲＮＡのいずれかをＲａｇ２ ＬＴＶＥＣと一緒に細胞に導入したとき、標的化効率を増加した（０％から１０％または３８％）。２対立遺伝子の標的化は、１つのコロニーにおいて観察された。
３．４．（ｂ）（ｉ）：ラットにおけるＲａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座の標的化
図２７は、ラットＲａｇ１／Ｒａｇ２遺伝子座のゲノム構造を提供する。ＣＤＳはコード配列を示し、灰色ボックスはエクソンを表す。Ｒａｇ２は、右への転写を有する「プラス」ストランド上にある。Ｒａｇ１は、左への転写を有する「マイナス」ストランド上にある。Ｍｂｐ＝百万塩基対
表２８は、ラットＲａｇ２及びＲａｇ１遺伝子座のゲノム構成の要約を提供し、示された位置は、ラットゲノムの参照配列の構築５．０（ＥＮＳＭＢＬ）から得られた。Ｒａｇ１は、（−）ストランドの染色体３上にある。
図２８は、ラットＲａｇ２及びＲａｇ１遺伝子座ならびに大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の概略図を提供する。ＬＴＶＥＣは、約７０ｋｂであり、欠失についてはＲａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座を含む約１６．６ｋｂのラットゲノム遺伝子座を標的とする。図２８の上の概略図は、Ｒａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座ならびに５’及び３’相同性アームに対応するゲノム領域（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ、濃い灰色ボックス）のゲノム構成を示す。Ｒａｇ２及びＲａｇ１はそれぞれ、点状の灰色影付きで示される単一のエクソンを含む。図２８の下の概略図は、ＬＴＶＥＣである。５’及び３’相同性アーム（それぞれ、４８ｋｂ及び１５ｋｂ）は、濃い灰色ボックスで示される。ＬＴＶＥＣは、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）、及びｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。自己欠失カセットは、Ｃｒｅｉ遺伝子に作動可能に連結されたラットＰｒｍ１プロモータ、及びネオマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されたヒトユビキチンプロモータを含む薬物選択カセットを含む。ネオマイシン耐性遺伝子を、Ｉｌ２ｒｇを標的とするラットＥＳ細胞の再標的化を可能にするハイグロマイシン耐性遺伝子と置換した、ＬＴＶＥＣの別の変形例が作製された。Ｃｒｅｉは、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含み、これらは、原核細胞におけるその発現を妨げるようにイントロン（Ｃｒｅｉ）によって分離される。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号及び米国出願公開第２０１３−０３１２１２９号を参照されたく、これらは詳細に自己欠失カセットを説明し、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。雄胚細胞においてＣｒｅｉの発現を特異的に駆動するラットＰｒｍ１プロモータを用いることにより、自己欠失カセットは、Ｆ０ラットの雄胚細胞において欠失され得る。
ＬＴＶＥＣを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なｎｅｏＲ ＭＥＦ上にプレーティングした。実施例１において記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、維持した。
本明細書の他の箇所に記載されるように、コロニーをスクリーニングし、標的とするクローンを得た。次いで、標的とするクローンを、本明細書の他の箇所に記載されるように宿主胚に注入して、Ｆ０ラットを生み出す。
３．４．（ｂ）（ｉｉ）：Ｉｌ２ｒｇ遺伝子座がすでに標的とされたラットＥＳ細胞におけるＲａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座の再標的化
図５０において見られるようなＬＴＶＥＣは、欠失のためにＲａｇ１及びＲａｇ２遺伝子座を標的とするために調製された。ＬＴＶＥＣの全長は、７２ｋｂであった。ＬＴＶＥＣを、実施例３．３において見られるようなＩｌ２ｒｇ遺伝子座の欠失のためにすでに標的とされたラットＥＳ細胞に電気穿孔した。具体的には、ラットＥＳ細胞は、クローンＩｌ２ｒｇ−ＣＧ１２からのものであり、生殖細胞系列の伝達は、実施例３．３（ａ）において確認された。実施例１において記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、維持した。本明細書の他の箇所に記載されるように、二重標的とするクローンをスクリーニングし、標的とするクローンを得た。Ｉｌ２ｒｇ−ＣＧ１２細胞は、８５％の効率で再標的とし、Ｉｌ２ｒｇ突然変異は、依然として、標的とするクローン中に存在した。本明細書の他の箇所に記載されるように、電気穿孔を行い、１．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて、抗生物質選択を行った。次いで、標的とするクローンを、本明細書の他の箇所に記載されるように宿主胚に注入して、Ｆ０ラットを生み出すであろう。Ｉｌ２ｒｇを標的とするラットによるＲａｇ１／Ｒａｇ２を標的とするラットを異種交配させるよりも迅速であるため、再標的化は有利である。
実施例４．ヒト化
４．１．ラットゲノム遺伝子座のヒト化
本明細書に記載されるラットＥＳ細胞を用いて、インビトロで１回以上電気穿孔した後に、それらの多能性を維持することが可能であり、継の世代に標的遺伝子改変を伝達することができる、ラットゲノム遺伝子座のヒト化が行われる。さらに、大きなゲノムＤＮＡ断片を適応させる際に、プラスミドの限界を回避し、かつラットＥＳ細胞における内因性遺伝子座への標的遺伝子改変の導入の低い効率を克服するために、１つ以上の標的遺伝子改変が、細菌性相同的組み換え（ＢＨＲ）を利用し、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を用いることによって、細菌、例えば、大腸菌において行われる。本明細書に記載されるＬＴＶＥＣは、例えば、１つ以上の改変による内因性ラットゲノム配列の大きな断片を含むか、または特定のゲノム領域に相補的であるラット相同性アームが隣接する外因性核酸（例えば、相同またはオーソロガスなヒト核酸）を含む。
４．２．ラット免疫グロブリン遺伝子座のヒト化
内因性ラット免疫グロブリン重鎖遺伝子座のヒト化は、１つ以上の内因性ラット免疫グロブリン重鎖核酸配列（例えば、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメント）を除去し、かつ、改変免疫グロブリン遺伝子座に、標的化ベクター、例えば、（ｉ）１つ以上の再配列されないヒト可変領域核酸配列（例えば、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメント）、または１つ以上の再配列されたヒト可変領域核酸配列（例えば、１つ以上のヒトの再配置されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子セグメント）、（ｉｉ）選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ部位が隣接するネオマイシン耐性遺伝子）、ならびに（ｉｉｉ）５’及び３’ラット相同性アーム、を含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を導入することによって行われる。
簡潔に言えば、ラットＢＡＣクローンにおける１つ以上の内因性ラット免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメント（すなわち、１つ以上のＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメント）を除去するか、またはラット相同性アームが隣接する選択カセットを有する内因性ラット免疫グロブリン重鎖遺伝子座を標的化することによって不活性化する。より具体的には、標的化ベクターは、標的ラットゲノム配列（例えば、１つ以上のラットＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む上流及び下流ラットゲノムＤＮＡ配列）に相補的である５’及び３’ラット相同性アームが隣接する選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ部位が隣接するネオマイシン耐性遺伝子）を含むように構成される。
次に、ラット免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む大きなラットゲノムＤＮＡ断片を含む細菌性細胞が、選択され、一過性に誘導されたプロモータに作動可能に連結されたリコンビナーゼをコードするプラスミド（例えば、ｐＡＢＧ）と共に導入される。次いで、上で構成された標的化ベクターを、組換えコンピテントな細菌性細胞に導入する。電気穿孔を行った後、細菌性細胞は、ＢＡＣクローンにおいて、標的化ベクターと標的ラットゲノム配列との間の相同的組み換えを開始するために、誘導因子（例えば、アラビノシド）により処理する。形質転換した細胞は、高密度でプレーティングされ、薬物耐性であるコロニーを見出すために薬物選択に供される。薬物耐性コロニーを選出し、標的改変についてスクリーニングする。
標的遺伝子改変の特定を促進するために、ハイスループット定量的アッセイ、すなわち、遺伝子改変後、親染色体において改変対立遺伝子（複数を含む）の大規模なスクリーニングを可能にする、対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変が用いられる。ＭＯＡアッセイは、定量的ＰＣＲ、例えば、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が挙げられるが、これに限定されない、様々な分析技術を介して行われ得る。例えば、リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び標的とされない参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを含む。加えて、プライマーセットは、増幅配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。あるいは、定量的アッセイは、蛍光媒介インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（複数を含む）への定量的ハイブリダイゼーション、Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＭＭＰアッセイ（登録商標）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、及びＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられるが、これらに限定されない、様々な分析技術を介して行われ得る。（例えば、米国特許出願第ＵＳ２００５／０１４４６５５号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
次いで、改変ラットＢＡＣクローン、すなわち、１つ以上の内因性重鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＨ、Ｄ、及び／またはＪＨ遺伝子セグメント）が欠失した、または不活性化したラットゲノムＤＮＡ配列を含むＢＡＣクローンを含む細菌性細胞は、（ｉ）１つ以上の再配列されないヒト可変領域核酸配列（例えば、１つ以上の再配列されないヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメント）、または１つ以上の再配列されたヒト可変領域核酸配列（例えば、１つ以上の再配列されたヒトＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子セグメント）を含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）で電気穿孔される。
細菌性細胞における相同的組み換えの開始及び陽性クローンの選択は、上述のように行われる。再配列されないまたは再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に標的とされた場合、内因性ラット免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される。あるいは、内因性ラット重鎖定常領域遺伝子座は、例えば、内因性重鎖定常領域遺伝子座から１つ以上のラット重鎖定常領域遺伝子セグメント（ＣＨ）を欠失することによって不活性化され得、ヒト重鎖定常領域の核酸配列と置換され得る。
同様に、内因性ラット免疫グロブリンκまたはλ軽鎖遺伝子のヒト化は、１つ以上の内因性ラット免疫グロブリンκ及び／またはλ軽鎖可変領域核酸配列（例えば、１つ以上の内因性ラットＶκ遺伝子セグメント及び１つ以上の内因性ラットＪκ遺伝子セグメント）を除去し、標的化ベクター、例えば、（ｉ）１つ以上の再配列されないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列（例えば、１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメント）、または１つ以上の再配列されたヒト可変領域核酸配列（例えば、１つ以上のヒトの再配置されたＶκ−Ｊκ遺伝子セグメント）、（ｉｉ）選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ部位が隣接するネオマイシン耐性遺伝子）、ならびに（ｉｉｉ）５’及び３’ラット相同性アーム、を含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を用いて、改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を標的化することによって行われる。
再配列されないまたは再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に標的とされた場合、内因性ラット免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結される。
細菌性細胞においてそのように生成されたＬＴＶＥＣは、例えば、ヒト化ラット免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子座を含む挿入核酸を含み、１つ以上の内因性ラット重鎖または軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、１つ以上のヒト重または軽鎖可変領域遺伝子セグメント、及び特定のゲノム標的配列に相補的なラット相同アーム（例えば、５ｋｂ〜１５０ｋｂの範囲に及ぶ）と置換される。次いで、上述の遺伝子改変を含むＬＴＶＥＣは、線形化され、ラットＥＳ細胞に電気穿孔される。電気穿孔したラットＥＳ細胞は、標的化ベクターを含む薬物耐性ＥＳ細胞を選択するために高密度でプレーティングされる。薬物選択プロセスは、大部分のプレーティングした細胞（約９９％）を取り除き、個々のコロニーを残し、これらの各々は、単一細胞に由来するクローンである。残りの細胞のうち、ほとんどの細胞（約８０〜１００％）は、ゲノムにおけるランダム配置で組み込まれた標的化ベクターを含む。したがって、コロニーは、選出され、正しいゲノム配置で標的化ベクターを含むラットＥＳ細胞を特定するように遺伝子決定される（例えば、上述の対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を用いて）。
標的遺伝子改変の効率を増加させるために、ラットＥＳ細胞は、ＬＴＶＥＣと一緒にＺＦＮ１及び２（またはＴＡＬＥＮ１及び２）を発現する発現ベクター（またはｍＲＮＡ）で電気穿孔される。標的化ベクターの相同性アームは、ＺＦＮ標的部位の外側にあり、したがって、標的化ベクターは、ＺＦＮによって切断されない。ＺＦＮによって生成された二重鎖切断は相同性配向型修復（ＨＤＲ）を刺激するか、そうでなければ、哺乳動物細胞において通常生じる非常に低い比率の修復を占める（非相同末端結合、ＮＨＥＪと比較して）。
あるいは、本明細書に記載される、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、ガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒ−ＲＮＡ）及びｔｒａｎｓ活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む）を含む発現ベクターを、ＬＴＶＥＣと一緒に細菌性細胞に導入して、標的ゲノム遺伝子座での相同的組み換え効率を増加させることができる。電気穿孔した細胞は、高密度でプレーティングされ、薬物耐性であるコロニーを見出すために薬物選択に供される。薬物耐性コロニーを選出し、本明細書に記載される対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を用いて標的改変についてスクリーニングする。これらの手順後、標的化効率の改善が達成され得る。例えば、改善の量は、少量（例えば、１０％〜１５％の改善）または多量（例えば、１０％〜８０％の改善）であり得る。
次いで、標的遺伝子改変を含む選択されたラットＥＳ細胞を、宿主ラット胚、例えば、プレ桑実胚期または胞胚期のラット胚に導入し、代理母の子宮内に移植して、創始ラット（Ｆ０ラット）を作製する。続いて、創始ラットを野生型ラットと繁殖させて、遺伝子改変に対してヘテロ接合性であるＦ１子孫を作製する。ヘテロ接合性のＦ１ラットの交配により、遺伝子改変に対してホモ接合性の子孫を生み出すことができる。
４．３（ａ）．ヒトＩＬ２受容体ガンマによるラットのＩＬ２ｒｇの置換
表２９は、ラットインターロイキン２受容体ガンマ遺伝子座のゲノム構成の要約を提供し、示された位置は、ラットゲノムの参照配列の構築５．０（ＥＮＳＭＢＬ）から得られた。Ｉｌ２ｒｇは、（−）ストランドの染色体Ｘ上にある。
図２５の下の概略図は、Ｉｌ２ｒｇの３．２ｋｂの欠失のある標的化ベクターである。標的化ベクターは、内因性プロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）、及びｌｏｘＰ部位（白抜き矢印）が隣接する自己欠失カセットを含む。自己欠失カセットは、マウスＰｒｍ１プロモータに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子、及びヒトユビキチンプロモータに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含む薬物選択カセットを含む。
Ｃｒｅｉ遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含み、これらは、原核細胞におけるその発現を妨げるようにイントロン（Ｃｒｅｉ）によって分離される。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号及び米国出願公開第２０１３−０３１２１２９号を参照されたく、これらは詳細に自己欠失カセットを説明し、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。マウスＰｒｍ１プロモータを用いることにより、Ｃｒｅ発現カセット及び薬物選択カセットは、Ｆ０ラットの雄胚細胞において特異的に欠失され得る。標的化ベクターを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なネオマイシン耐性ＭＥＦ上にプレーティングした。実施例１に記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、選択し、維持した。
プラスミド標的化ベクターは、図３１に示されるように、完全長ラットインターロイキン２受容体ガンマコード領域を完全長ヒトインターロイキン２受容体ガンマコード領域と置換するように構成された。標的化ベクターを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なネオマイシン耐性ＭＥＦ上にプレーティングした。具体的には、４×１０６細胞を、４００Ｖの電圧、１００ｕＦのキャパシタンス、及び０の抵抗で２ｕｇのＩｌ２ｒｇ 完全長ヒト化ベクターで電気穿孔した。７５ｕｇ／ｍＬのＧ４１８を用いて選択を行った。実施例１に記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、選択し、維持した。
表４４に示されるように、１６８のコロニーをスクリーニングし、６つの標的とするクローンを得た。標的化効率は、３．５７％であった。１つのクローンを、実施例１において本明細書に記載される胚盤胞に注入し、キメラを生み出す１つのクローンを得た。
クローンを、実施例１において本明細書に記載される胚盤胞に注入した。Ｆ０キメララットを生み出すクローンを得た。標準的な技法を用いて、胚盤胞を、偽妊娠した受容雌に移し、キメラＦ０ラットを得た。生殖細胞系列を通して標的改変を伝達するＦ０ラットを得る。
４．３（ｂ）（ｉ）．ヒトＩＬ２ｒｇ細胞外ドメインによるラットのＩＬ２ｒｇ細胞外ドメインの置換
ＩＬ２受容体ガンマの完全長ヒト化は、この改変遺伝子座を有するラットがヒトＩＬ−２ｒｇを生成するので、有用であり、これにより、ヒトＩｌ２ｒｇに特異的な抗体を有するラットにおけるヒトＩｌ２ｒｇの検出を可能にする。
細胞外のヒト化（すなわち、ラットＩＬ−２ｒｇの細胞外ドメインをヒトＩＬ−２ｒｇの細胞外ドメインと置換すること）により、ＩＬ２−Ｒｇのヒトリガンドと結合するＩＬ−２ｒｇポリペプチドをもたらすが、細胞質ドメインが依然としてラットであるため、ＩＬ−２ｒｇの細胞外のヒト化形態もまた、ラットのシグナル伝達機構と相互作用するであろう。図３３は、ヒトＩＬ−２ｒｇタンパク質（配列番号２０、ＮＰ＿０００１９７．１）、ラットＩＬ−２ｒｇ領域（配列番号２１、ＮＰ＿５４３１６５．１）、及びラットＩＬ−２ｒｇタンパク質の残りに融合されたヒト細胞外ドメインを含むキメラＩＬ−２ｒｇタンパク質（配列番号２２）の配列アライメントを提供する。ヒトＩＬ−２ｒｇとラットＩＬ−２ｒｇとの間の結合部を垂直線で示す。
表３０は、ラットインターロイキン２受容体ガンマ遺伝子座のゲノム構成の要約を提供し、示された位置は、ラットゲノムの参照配列（ＥＮＳＭＢＬ）の構築５．０から得られた。Ｉｌ２ｒｇは、（−）ストランドの染色体Ｘ上にある。Ｉｌ２ｒｇの細胞外ドメインの位置がさらに述べられる。
プラスミド標的化ベクターは、図３２に示されるように、インターロイキン２受容体ガンマコード領域のラット細胞外ドメインをヒト細胞外ドメインと置換するように構成された。標的化ベクターを、実施例１において得られたラットＥＳ細胞に電気穿孔し、２ｉ＋１０ｕＭ ＲＯＣＫｉ中の１５ｃｍの２倍濃厚なネオマイシン耐性ＭＥＦ上にプレーティングした。実施例１に記載されるように、形質転換したラットＥＳ細胞を培養し、選択し、維持した。
表４４に示されるように、１９２のコロニーをスクリーニングし、１３の標的とするクローンを得た。標的化効率は、６．７７％であった。
２つのクローンを、実施例１において本明細書に記載される胚盤胞に注入し、キメラを生み出す２つのクローンを得た。Ｆ０ラットを生み出すクローンを得た。生殖細胞系列を通して標的改変を伝達するＦ０ラットを得る。
４．３（ｂ）（ｉｉ）．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせたプラスミドを用いたヒトＩＬ２ｒｇの細胞外ドメインによるラットのＩＬ２ｒｇの細胞外ドメインの置換
表３１は、図３２に示されるＩｌ２ｒｇの細胞外ドメインのヒト化ベクターの変形例を単独で使用して、ラットＲａｇ２遺伝子座を標的とするか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼと組み合わせて使用して、ラットＲａｇ２遺伝子座を標的とした、実験の結果の比較を示す。それぞれの実験において、電気穿孔された多能性細胞は、高密度でプレーティングされ、薬物耐性であるコロニーを見出すために薬物選択に供した。薬物耐性コロニーを選出し、本明細書に記載される対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を用いて標的改変についてスクリーニングした。具体的には、４×１０６細胞を、４００Ｖの電圧、１００ｕＦのキャパシタンス、及び０の抵抗で２ｕｇのＩｌ２ｒｇの細胞外ドメインのヒト化ベクターで電気穿孔した。後者の実験において、６ｕｇのＣａｓ９発現プラスミド及び３ｕｇのＩｌ２ｒｇ ｇＲＮＡ２または３ｕｇのＩｌ２ｒｇ ｇＲＮＡ４もまた、電気穿孔した。７５ｕｇ／ｍＬのＧ４１８を用いて選択を行った。Ｉｌ２ｒｇ ｇＲＮＡ２は、ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＡＴＡＣＡＡＴＣＴＧＧ（配列番号９１）の配列を有し、領域１９０ｂｐの３’のラットＩｌ２ｒｇエクソン１を標的とする。Ｉｌ２ｒｇ ｇＲＮＡ４は、ＣＣＣＣＣＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＣＣＴＡＧＧ（配列番号９２）の配列を有し、領域８０ｂｐの５’のラットＩｌ２ｒｇ終止コドン（ＴＧＡ）を標的とする（図４９を参照のこと）。
４．４（ａ）．同時に起こるヒト遺伝子の置換を有する大きな非ヒト動物遺伝子欠失のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより増強された標的化
完全ヒト抗体等のヒト病状のために新しく開発された薬物は、しばしば、ヒト細胞及び組織においてそれらの標的に対して高度に特異的であり、齧歯類における相同標的を認識しない。この高いレベルの選択性は、ヒトにおける薬物の先制使用前に、齧歯類における薬物の作用の有効性及び機構を試験するのを不可能にする。
この問題に対する非常に有効な解決策は、薬物標的をコードするヒト遺伝子では齧歯類同族体を置換する遺伝子的に改変されたマウスまたはラットを作製することである。齧歯類におけるそのようなヒト化対立遺伝子を作製するための１つの方法は、まず、胚幹（ＥＳ）細胞において齧歯類遺伝子を欠失し、次いで、第２の遺伝子改変事象において、欠失遺伝子座で正確にヒト遺伝子を挿入することである。次いで、ＥＳ細胞を齧歯類の胚に注入し、齧歯類の代理母の子宮内に移植して、その後、それがヒト化対立遺伝子を持つ遺伝子的に改変された子を産む。
ヒト化遺伝子改変を行うより有効な方法は、齧歯類遺伝子の欠失及びそのヒト対照物による置換を同時に誘導する大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を使用することである。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の遺伝子組み換え法を用いることにより、そのような単一ステップのヒト化は、齧歯類の遺伝子欠失及びヒトの遺伝子挿入が約２０キロベース対（ｋｂ）よりも小さいときに、比較的高い効率で達成され得る。１００ｋｂよりも大きな欠失及び置換を引き起こすより大きな単一ステップのヒト化は、ＬＴＶＥＣ及びＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の遺伝子組み換え法等の遺伝子組み換え法により可能であるが、時折、非常に大きな改変に直面する標的化効率の低減より、成功には、所望の遺伝子改変を持つものを見出すように、スクリーニングまたは何百何千のＥＳ細胞クローンを必要とする場合がある。
大きなヒト化の効率を改善するために、ＬＴＶＥＣ遺伝子の標的化をクラスター化規則性散在短パリンドローム反復ＲＮＡにガイドされたＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）と組み合わせる方法を開発した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの１つのストランドとの間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対によって、Ｃａｓ９を特定のＤＮＡ配列で切断するように誘導するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡに結合する細菌性Ｃａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼからなるリボヌクレオタンパク質酵素である。標的化機構の簡潔さにより、大体の任意のゲノム遺伝子座で二重鎖切断を誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを設計することは容易である。二重鎖切断は、変異性であり、しばしば、二重鎖切断の部位での欠失または挿入をもたらす、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により細胞のゲノム修復を誘導する。二重鎖切断を修復する代替の機構は、切断部位を有する配列同一性または類似性を共有するＤＮＡの内因性または外因性の断片が、細胞の相同的組み換え機構の作用により切断端を継ぎ目なく修復する、相同性配向型修復（ＨＤＲ）である。ＨＤＲは、切断部位で元の配列を復元する完全な修復をもたらし得るか、または二重鎖切断の部位で配列の欠失、挿入、または置換等の設計された改変を誘導するように使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、意図された遺伝子改変の部位で正確な二重鎖切断を誘導することにより遺伝子操作されたＨＤＲ事象の割合を大いに増大させ得る。
齧歯類遺伝子のすべてまたは一部の正確な単一ステップの欠失及びそのヒトホモログのすべてまたは一部との同時置換をもたらすために、齧歯類ＥＳ細胞に、３つの核酸分子：（１）ＬＴＶＥＣ、（２）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡ、及び（３）ＣＲＩＳＰＲ 単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｓｇＲＮＡ自体をコードするプラスミド、を電気穿孔することにより導入した。ＬＴＶＥＣは、齧歯類遺伝子を欠失し、ヒト遺伝子を挿入するＨＲ事象を誘導するように設計された齧歯類ＤＮＡの相同性アームが隣接する遺伝子産物（タンパク質またはＲＮＡ）をコードするヒト遺伝子のすべてまたは一部を含んだ。ヒト化ＬＴＶＥＣはまた、抗生物質（例えば、Ｇ４１８）に対して耐性を生じる酵素（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）の発現を誘導する薬物選択カセットも有した。ＬＴＶＥＣを利用し、それをそれらのゲノムに組み込んだＥＳ細胞は、抗生物質を含有する成長培地中のペトリ皿上にコロニーを成長させ、形成することができた。ＬＴＶＥＣ分子よりも５００〜１，０００倍以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードする核分子を導入したので、ＬＴＶＥＣ含有薬物耐性コロニーの大部分もまた、少なくとも一時的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を含有した。薬物耐性コロニーを選出し、それらを対立遺伝子損失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ａｌｌｅｌｅ）方法によりスクリーニングし（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２−６６０、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｔｈｅ ｌｏｓｓ−ｏｆ−ａｌｌｅｌｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＥＳ ｃｅｌｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５−３０７、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、正確に標的とするヒト化対立遺伝子を有するクローンを特定した。
ある特定の実験において、ＬＴＶＥＣは、マウスＬｒｐ５（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５）遺伝子の６８ｋｂの欠失及び相同ヒトＬＲＰ５遺伝子の９１ｋｂの断片による同時置換を生じるように設計された（図３４）。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたマウスＬｒｐ５遺伝子の６８ｋｂの配列に隣接するマウスＬｒｐ５遺伝子座の一部に由来する７ｋｂ及び３３ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する相同性アームが隣接するヒトＬＲＰ５遺伝子の９１ｋｂの断片を含んだ。別の実験において、Ｌｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードするプラスミドと、欠失を標的としたマウスＬｒｐ５遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計されたｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ２、ｇＥ、ｇＦ）のうちの１つをコードする第２のプラスミドとを組み合わせた。ｓｇＲＮＡは、ヒトＬＲＰ５遺伝子の挿入部分においていかなる配列の認識も避けるように設計された。
Ｌｒｐ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を表３２に示す。ＬＴＶＥＣをＥＳ細胞に単独で導入した場合に、スクリーニングした薬物耐性クローンのうちの１．０％が正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性のヒト化対立遺伝子を有することを見出した。対照的に、ＬＴＶＥＣを、８つの試験済みｓｇＲＮＡのうちの７つ（ｓｇＲＮＡ−５’Ａ、ｓｇＲＮＡ−５’Ｂ、ｓｇＲＮＡ−５’Ｂ２、ｓｇＲＮＡ−Ｃ、ｓｇＲＮＡ−Ｄ、ｓｇＲＮＡ−３’Ｅ２、及びｓｇＲＮＡ−３’Ｆ；表３３に提供される配列）により誘導されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、２．１〜７．３％の範囲に及ぶ効率で正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異を生じ、これは、支援されないＬＴＶＥＣと比較して、単一ステップのヒト化遺伝子標的化の２〜９倍の増強を示した。単一対立遺伝子の標的化に加えて、ｓｇＲＮＡ−５’Ｂ２によるＣａｓ９誘導型切断については、１％の頻度で２対立遺伝子のホモ接合性のヒト化を検出した。ホモ接合性のＬｒｐ５ヒト化ＥＳ細胞は、ＶＥＬＯＣＩマウス（登録商標）遺伝子操作法（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：９１−９９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により、表現型及び薬効の研究の準備が整った完全なＥＳ細胞由来マウスに直接変換され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる大きなＬｒｐ５ヒト化の増強した標的化は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて行った同等の実験と比較して、著しい。欠失を標的としたマウスＬｒｐ５遺伝子の領域内の部位で二重鎖切断を形成するように設計された４つのＺＦＮを得た（図３４）。１つのＺＦＮは、５’末端付近の配列の欠失を標的とし（ａ）、１つは、中央の配列の欠失を標的とし（ｂ）、２つは、３’末端付近の配列の欠失を標的とした（ｃ，ｄ）。別個の実験において、Ｌｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失を標的としたマウスＬｒｐ５遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計された４つのＺＦＮ（ａ〜ｄ）のうちの１つをコードするプラスミドと組み合わせた。ＺＦＮのすべてが活性であり、Ｌｒｐ５遺伝子においてＮＨＥＪ突然変異を誘導することができた（データは示さず）が、ＬＴＶＥＣと組み合わせた場合に、ＬＴＶＥＣ単独と比較して、ＨＤＲ媒介性遺伝子標的化をいずれも増強しなかったと判断した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる大きなＬｒｐ５ヒト化の増強した標的化効率もまた、一連のＺＦＮの支援によるヒト化実験と比較して、著しい。これらの実験において、一連のＺＦＮの支援によるヒト化を行い、マウス標的遺伝子の欠失及びヒト遺伝子の挿入が、一般に大きさがますます増加した（表３４、図３５）。図３５Ａは、欠失の大きさが増加するＬＴＶＥＣ標的化遺伝子の標的化効率の割合を示す。ＬＴＶＥＣは、単独で（灰色四角形）またはＺＦＮと組み合わせて（黒色四角形）使用した。図３５Ｂは、大きさが増加するヒト遺伝子挿入によるＬＴＶＥＣの標的化効率の割合を示す。さらに、ＬＴＶＥＣは、単独で（灰色三角形）またはＺＦＮと組み合わせて（黒色三角形）使用した。表３４及び図３５に示されるように、ＬＴＶＥＣの標的化効率を増強するＺＦＮ媒介性ＤＮＡ切断の能力は、マウス標的遺伝子の欠失の大きさが２４．７ｋｂよりも大きくなった場合、及びヒト遺伝子の挿入の大きさが２２．２ｋｂよりも大きくなった場合に消失した（表３４、図３５Ａ）。対照的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、Ｌｒｐ５遺伝子のＬＴＶＥＣの標的化効率を増強することができ、これには、６８．３ｋｂのマウス遺伝子の欠失及び９１．０ｋｂのヒト遺伝子の挿入を含んだ（表３２、図３４）。このことは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、他のヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）が増強することができない状況においてＬＴＶＥＣの標的化効率を増強することができることを示す。
ｎ．ｄ．＝決定されず
ｎ．ａ．＝該当なし
（ ）＝ＺＦＮを用いない場合よりもＺＦＮを用いた場合に標的化効率が低い
比較実験を、他のマウス遺伝子のヒト化に対して行った。１つの実験において、ＬＴＶＥＣは、マウスＴｒｐａ１（一過性受容体潜在的カチオンチャネルサブファミリーＡメンバー１）遺伝子の４５ｋｂの欠失及び相同ヒトＴＴｒｐａ１遺伝子の５５ｋｂの断片による同時置換を生じるように設計された（図３６）。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたマウスＴｒｐａ１遺伝子の４５ｋｂの配列に隣接するマウスＴｒｐａ１遺伝子座の一部に由来する４１ｋｂ及び５８ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する相同性アームが隣接するヒトＴＲＰＡ１遺伝子の５５ｋｂの断片を含んだ。別個の実験において、Ｔｒｐａ１ヒト化ＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードするプラスミドと、欠失を標的としたマウスＴｒｐａ１遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計された８つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＥ２、及びｇＦ）のうちの１つをコードする第２のプラスミドとを組み合わせた。ｓｇＲＮＡは、ヒトＴＲＰＡ１遺伝子の挿入部分においていかなる配列の認識も避けるように設計された。
Ｔｒｐａ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を表３５に示す。ＬＴＶＥＣをＥＳ細胞に単独で導入した場合に、スクリーニングした薬物耐性クローンのうちの１．０％が正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を有することを見出した。対照的に、ＬＴＶＥＣを、８つの試験済みｓｇＲＮＡのうちの６つ（Ａ、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＦ；表４３に提供された配列）により誘導されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、１．０〜３．１％の範囲に及ぶ効率で正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異または２対立遺伝子の複合ヘテロ接合もしくはホモ接合性突然変異を生じた。ｇＲＮＡ Ａ及びｇＲＮＡ ＦによるＣａｓ９誘導型切断については、１．０％の頻度で複合ヘテロ接合性突然変異を検出した。
別の実験において、ＬＴＶＥＣは、マウスＦｏｌｈ１（グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２）遺伝子の５５ｋｂの欠失及び相同ヒトＦＯＬＨ１遺伝子の６１ｋｂの断片による同時置換を生じるように設計された（図３７）。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたマウスＦｏｌｈ１遺伝子の５５ｋｂの配列に隣接するマウスＦｏｌｈ１遺伝子座の一部に由来する２２ｋｂ及び４６ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する相同性アームが隣接するヒトＦＯＬＨ１遺伝子の６１ｋｂの断片を含んだ。別の実験において、Ｆｏｌｈ１ヒト化ＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードするプラスミドと、欠失を標的としたマウスＦｏｌｈ１遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計された６つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、及びｇＥ２）のうちの１つをコードする第２のプラスミドとを組み合わせた。ｓｇＲＮＡは、ヒトＦＯＬＨ１遺伝子の挿入部分においていかなる配列の認識も避けるように設計された。
Ｆｏｌｈ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を表３６に示す。ＬＴＶＥＣをＥＳ細胞に単独で導入した場合に、９６のスクリーニングした薬物耐性クローンのいずれも正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を有さないことを見出した。対照的に、ＬＴＶＥＣを、６つの試験済みｓｇＲＮＡのうちの３つ（Ａ、Ｄ、及びＥ２；表４３に提供された配列）により誘導されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、１．０〜３．１％の範囲に及ぶ効率で正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異を生じた。
別の実験において、ＬＴＶＥＣは、補体成分５（Ｃ５またはＨｃ）におけるマウス遺伝子の７６ｋｂの欠失及び相同ヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂの断片による同時置換を生じるように設計された（図３８）。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の７６ｋｂの配列に隣接するマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座の一部に由来する３４．１ｋｂ及び３１．２ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する相同性アームが隣接するヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂの断片を含んだ。別の実験において、Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化ＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードするプラスミドと、欠失を標的としたマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計された６つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、及びｇＥ２）のうちの１つをコードする第２のプラスミドとを組み合わせた。ｓｇＲＮＡは、ヒトＣ５遺伝子の挿入部分においていかなる配列の認識も避けるように設計された。
Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を表３７に示す。ＬＴＶＥＣをＥＳ細胞に単独で導入した場合に、スクリーニングした薬物耐性クローンのうちの１．０％が正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を有することを見出した。対照的に、ＬＴＶＥＣを、６つの試験済みｓｇＲＮＡのすべて（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＥ２；表４３に提供された配列）により誘導されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、４．２〜１６．７％の範囲に及ぶ効率で正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異または２対立遺伝子の複合ヘテロ接合性もしくはホモ接合性突然変異を生じた。ｇＲＮＡ Ａ及びＥによるＣａｓ９誘導型切断については、それぞれ、５．２％及び４．２％の頻度で複合ヘテロ接合性突然変異を検出した。
別の実験において、ＬＴＶＥＣは、マウスＡｄａｍｔｓ５（トロンボスポンジンモチーフ５を有するジスインテグリン及びメタロプロテアーゼ）遺伝子の３８ｋｂの欠失及び相同ヒトＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の４３ｋｂの断片による同時置換を生じるように設計された（図３９）。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたマウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子の３８ｋｂの配列に隣接するマウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子座の一部に由来する２２ｋｂ及び４６ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する相同性アームが隣接するヒトＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の４３ｋｂの断片を含んだ。別個の実験において、Ａｄａｍｔｓ５ヒト化ＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードするプラスミドと、欠失を標的としたマウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計された８つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＥ２、及びｇＦ）のうちの１つをコードする第２のプラスミドとを組み合わせた。ｓｇＲＮＡは、ヒトＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の挿入部分においていかなる配列の認識も避けるように設計された。
Ａｄａｍｔｓ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を表３８に示す。ＬＴＶＥＣをＥＳ細胞に単独で導入した場合に、９６のスクリーニングした薬物耐性クローンのいずれも正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を有さないことを見出した。対照的に、ＬＴＶＥＣを、８つの試験済みｓｇＲＮＡのうちの２つ（Ｂ及びＦ；表４３に提供された配列）により誘導されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、１．０％の効率で正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異または２対立遺伝子の複合ヘテロ接合性突然変異を生じた。ｇＲＮＡ
Ｅ２によるＣａｓ９誘導型切断については、１．０％の頻度で複合ヘテロ接合性突然変異を検出した。
表３８．Ａｄａｍｔｓ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化に対するスクリーニング結果
別の実験において、ＬＴＶＥＣは、マウスＥｒｂｂ４（受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−４）遺伝子の１０２ｋｂの欠失及び相同ヒトＥｒｂｂ４遺伝子の１２７ｋｂの断片による同時置換を生じるように設計された（図４０）。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたマウスＥｒｂｂ４遺伝子の１０２ｋｂの配列に隣接するマウスＥｒｂｂ４遺伝子座の一部に由来する４８ｋｂ及び２６ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する相同性アームが隣接するヒトＥＲＢＢ４遺伝子の１２７ｋｂの断片を含んだ。別個の実験において、Ｅｒｂｂ４ヒト化ＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードするプラスミドと、欠失を標的としたマウスＥｒｂｂ４遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計された８つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＥ２、及びｇＦ）のうちの１つをコードする第２のプラスミドとを組み合わせた。ｓｇＲＮＡは、ヒトＥＲＢＢ４遺伝子の挿入部分においていかなる配列の認識も避けるように設計された。
Ｅｒｂｂ４遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を表３９に示す。ＬＴＶＥＣをＥＳ細胞に単独で導入した場合に、９６のスクリーニングした薬物耐性クローンのいずれも正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を有さないことを見出した。対照的に、ＬＴＶＥＣを、８つの試験済みｓｇＲＮＡのうちの１つ（Ｄ；表４３に提供された配列）により誘導されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、１．０％の効率で正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異または２対立遺伝子の複合ヘテロ接合性突然変異を生じた。ｇＲＮＡ ＤによるＣａｓ９誘導型切断については、１％の頻度で複合ヘテロ接合性突然変異を検出した。
別の実験において、ＬＴＶＥＣは、マウスＲｏｒ１（チロシン−タンパク質キナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１）遺伝子の１１０ｋｂの欠失及び相同ヒトＲＯＲ１遺伝子の１３４ｋｂの断片による同時置換を生じるように設計された（図４１）。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたマウスＲｏｒ１遺伝子の１１０ｋｂの配列に隣接するマウスＲｏｒ１遺伝子座の一部に由来する４１．８ｋｂ及び９６．４ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する相同性アームが隣接するヒトＲＯＲ１遺伝子の１３４ｋｂの断片を含んだ。別個の実験において、Ｒｏｒ１ヒト化ＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードするプラスミドと、欠失を標的としたマウスＲｏｒ１遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計された６つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、及びｇＦ）のうちの１つをコードする第２のプラスミドとを組み合わせた。ｓｇＲＮＡは、ヒトＲＯＲ１遺伝子の挿入部分においていかなる配列の認識も避けるように設計された。
Ｒｏｒ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を表４０に示す。ＬＴＶＥＣをＥＳ細胞に単独で導入した場合に、９６のスクリーニングした薬物耐性クローンのいずれも正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を有さないことを見出した。対照的に、ＬＴＶＥＣを、６つの試験済みｓｇＲＮＡのうちの２つ（Ｄ及びＦ；表４３に提供された配列）により誘導されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、１．０％の効率で正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異または２対立遺伝子の複合ヘテロ接合性突然変異を生じた。ｇＲＮＡ ＦによるＣａｓ９誘導型切断については、１％の頻度で複合ヘテロ接合性突然変異も検出した。
別の実験において、ＬＴＶＥＣは、マウスＤｐｐ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）遺伝子の７９ｋｂの欠失及び相同ヒトＤＰＰ４遺伝子の８２ｋｂの断片による同時置換を生じるように設計された（図４２）。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたマウスＤｐｐ４遺伝子の７９ｋｂの配列に隣接するマウスＤｐｐ４遺伝子座の一部に由来する４６ｋｂのゲノムＤＮＡをそれぞれ含有する５’及び３’相同性アームが隣接するヒトＤＰＰ４遺伝子の８２ｋｂの断片を含んだ。別個の実験において、Ｄｐｐ４ヒト化ＬＴＶＥＣを、Ｃａｓ９をコードするプラスミドと、欠失を標的としたマウスＤｐｐ４遺伝子の領域内で二重鎖切断を形成するように設計された８つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＥ２、及びｇＦ）のうちの１つをコードする第２のプラスミドとを組み合わせた。ｓｇＲＮＡは、ヒトＤＰＰ４遺伝子の挿入部分においていかなる配列の認識も避けるように設計された。
Ｄｐｐ４遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を表４１に示す。ＬＴＶＥＣをＥＳ細胞に単独で導入した場合に、スクリーニングした薬物耐性クローンのうちの２．１％が正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を有することを見出した。対照的に、ＬＴＶＥＣを、８つの試験済みｓｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｂ２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｅ２、及びＦ；表４３に提供された配列）のうちのいずれか１つにより誘導されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、２．１〜７．３％の範囲に及ぶ効率で正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異を生じた。
様々なマウス遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるヒト化の結果を要約する表を表４２に提供する。第１の行は、標的とする遺伝子座を示す。第２の行は、内因性マウス遺伝子座の欠失の大きさ（Ｄｅｌ）及び対応するヒト遺伝子座の挿入の大きさ（Ｉｎｓ）を示す。残りの行は、正確に標的とする単一対立遺伝子のヘテロ接合性突然変異、２対立遺伝子の複合ヘテロ接合性突然変異もしくは２対立遺伝子のホモ接合性突然変異を有したそれぞれの状態に対して多くのコロニー（９６の中から）を示す。「ｇＲＮＡなし」は、ＬＴＶＥＣ単独を表し、一方、その他の行は、ＬＴＶＥＣ＋対応するｇＲＮＡ（欠失遺伝子座内の相対位置により示される）を表す。
実施例５．ラットゲノム遺伝子座の標的改変の要約
表４４．実施例３及び４に論じられる様々なベクタータイプ及びヌクレアーゼ剤で標的化したラットの要約
表４５は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせたプラスミドまたはＬＴＶＥＣのいずれかによるラットＥＳ細胞の標的化の要約を示す。２つのｇＲＮＡは、それぞれの標的遺伝子座：Ｒａｇ２、ＡｐｏＥ、及びＩｌ２ｒｇについて別々に試験した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の切断効率は、すべての３つの遺伝子座で２０％を超えた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を標的化プラスミド及びＬＴＶＥＣと組み合わせて使用した場合に、増加した標的化効率及び増加した２対立遺伝子の標的化が観察された。
表４６は、ラットゲノム遺伝子座の標的改変に対する生殖細胞系列の伝達データの要約を示す。生殖細胞系列の伝達は、ＡｐｏＥを標的とするラット及びＩｌ２ｒｇを標的とするラットにおいて確認された。ラットＥＳ細胞は、ＸＹ（雄）であり、ヘテロ接合性を標的とした。したがって、標的とするＥＳ細胞が生殖細胞系列に寄与する場合、ＥＳ細胞由来の精液のうちの約５０％が突然変異対立遺伝子を持ち、ヘテロ接合性のＦ１子を生み出すであろう。
実施例６．ヒト誘導多能性幹細胞の作製、維持、及び標的化
６．１．ヒトｉＰＳ細胞の作製
この実施例は、非多能性ヒト細胞からのヒトｉＰＳ細胞の作製を説明する。ＣＭ７プロモータに作動可能に連結された４つの再プログラミング因子（ｈＯｃｔ４、ｈＳｏｘ２、ｈＫＬＦ−４、ｈＭＹＣ）をコードする遺伝子を含む、ＰｉｇｇｙＢａＣ（Ｓｙｓｔｅｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ベクター（ＰＢ−６００Ａ＿ＣＡＧＧＳ Ｂｓｔ ＸＩ（０．６４μｇ／μＬ）及びＰＢ−２００（０．９９μｇ／μＬ）を、ＲＥＤ ａｎｄ ＢＬＵＥ ＧｅｎｅＩｎ（商標）トランスフェクション試薬（ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）を用いて、新生児ヒト包皮線維芽細胞に導入した。トランスフェクト細胞を、Ｅ７培地においてＮｕＦＦ１のフィーダー細胞上でインキュベートして、再プログラミング因子のベクター及び発現の取り込みを可能にした。Ｅ７培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＮａＨＣＯ３、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及びＦＧＦ−２を含んだ。
ピューロマイシン選択は、Ｅ７培地において２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いてトランスフェクションから１０日後に開始した。２１日目に、コロニーを選択し、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＮａＨＣＯ３、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、グルタチオン、Ｌ−グルタミン、規定脂質、チアミン、微量元素Ｂ及びＣ、β−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピペコリン酸、塩化リチウム、及びＧＡＢＡを含むｍＴｅＳＲ（商標）培地において培養した。２９〜５７日目に、６ウェルプレート中で約５０％コンフルエントに達するまで、細胞を、ｍＴｅＳＲ（商標）培地中で繁殖させ、継代した。６５〜７３日目に、ｍＴｅＳＲ（商標）培地及びＧｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、繁殖及び継代を継続した。７６日目に、ナイーブまたはナイーブ様ｈｉＰＳＣを含む細胞のさらなる繁殖、継代、及び維持のために、培地を低オスモル濃度のＶＧ２ｉ培地に交換した。
６．２．ヒトｉＰＳ細胞におけるＬＴＶＥＣの標的化
この実施例は、ヒトｉＰＳ細胞におけるＬＴＶＥＣの標的化の使用を説明する。図５１に示されるように、ＶＧ２ｉ培地において繁殖されたヒトｉＰＳ細胞に、核酸分子：（１）ＬＴＶＥＣ（０．６７μｇ）、（２）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするプラスミド（５μｇ）、及び（３）ＣＲＩＳＰＲ単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするプラスミド（１０μｇ）、を電気穿孔することにより導入した。試料のうちの１つの組には、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを除外した。具体的には、３×１０６細胞を、７００Ｖの電圧、２５ｕＦのキャパシタンス、及び４００オームの抵抗で電気穿孔した。ＬＴＶＥＣは、欠失を対象としたヒトＡＤＡＭ６遺伝子座の４．１ｋｂの配列に隣接するゲノム領域に由来する３４ｋｂ及び１０５ｋｂのゲノムＤＮＡを含有する相同性アームが隣接するマウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子を含む１６．７ｋｂの核酸を含んだ。ＬＴＶＥＣはまた、抗生物質（ハイグロマイシン）に対して耐性を生じる酵素の発現を誘導する薬物選択カセットも有した。使用されたヒトＡＤＡＭ６ ｇＲＮＡは、配列：ＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＴ（配列番号９４）を有した。
ＬＴＶＥＣを取り込み、それをそれらのゲノムに組み込んだ細胞は、抗生物質を含有する成長培地中のＧＥＬＴＲＥＸ（商標）でコーティングした組織培養皿上にコロニーを成長させ、形成することができた。ＬＴＶＥＣ分子よりも５００〜１，０００倍多いＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードする核分子を導入したので、ＬＴＶＥＣ含有薬物耐性コロニーの大部分もまた、少なくとも一時的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を含有した。薬物耐性コロニーを選出し、それらを対立遺伝子損失方法によりスクリーニングし（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２−６６０、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５−３０７、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、正確に標的とする対立遺伝子を有するクローンを特定した。
ＡＤＡＭ６遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の支援によるＬＴＶＥＣの標的化の結果を表４７に示す。
ＬＴＶＥＣをヒトｉＰＳ細胞に単独で導入した場合に、３．１％の標的化効率が観察された。対照的に、ＬＴＶＥＣを、ＡＤＡＭ６ ｇＲＮＡにより誘導されたＣａｓ９と組み合わせることにより、７．３％の標的化効率をもたらした。
６．３．ヒトｉＰＳ細胞形態における低オスモル濃度の培地の効果
この実施例は、培養下でのヒトｉＰＳ細胞の多能性の状態における塩濃度、イオン強度、及び／またはオスモル濃度の効果を説明する。表４８に記載される培地またはｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地において、ヒトｉＰＳ細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）またはＧＥＬＴＲＥＸ（商標）基質上に培養した。
使用した基本培地がＤＭＥＭであった場合、この培地は２ｉ培地と称された。使用した基本培地がＶＧ−ＤＭＥＭであった場合、この低オスモル濃度培地はＶＧ２ｉ培地と称された。ＶＧ２ｉ培地のオスモル濃度（２３３ｍＯｓｍ／ｋｇ）は、従来の２ｉ培地のオスモル濃度（２６１ｍＯｓｍ／ｋｇ）よりも低い。
図５２に示されるように、８日間（図５２Ａ）または１２日間（図５２Ｂ）、２ｉ培地においてＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上に培養されたヒトｉＰＳ細胞は、プライム状態でｉＰＳ細胞の形態特徴、特に、上皮単分子層における成長及び頂低極性の出現を示した。
ｍＴｅＳＲ−ｈＬＩＦ培地及びＶＧ２ｉ培地を、ヒトｉＰＳ細胞の形態及び多能性の状態におけるそれらの効果についてさらに評価した。この試験では、ヒトｉＰＳ細胞を、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地（図５３Ａ及び５３Ｃ）またはＶＧ２ｉ培地（図５３Ｂ及び５３Ｄ）においてＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）またはＮｕＦＦのフィーダー細胞に６日間培養した。ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地においてＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）またはＮｕＦＦのフィーダー細胞に培養した場合、ヒトｉＰＳ細胞は、プライム多能性の状態の形態特徴、特に、上皮単分子層における成長及び頂低極性の出現を示した。ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地において培養されたいくつかの細胞は、三次元のクランピングにより特徴付けられた形態を示し始めた。それとは対照的に、ＶＧ２ｉ培地においてＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）またはＮｕＦＦのフィーダー細胞に培養した場合、ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ多能性の状態の形態特徴、特に、丸いドーム状のコロニーにおける成長及び頂低極性の欠如を示した。
６．４．ヒトｉＰＳ細胞における多能性マーカーの発現に対する低オスモル濃度の培地の効果
この実施例は、プライム状態からナイーブ状態に再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞の多能性マーカーの発現における塩濃度、イオン強度、及び／またはオスモル濃度の効果を説明する。ＶＧ２ｉ培地においてＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）基質上での培養から２４日後、再プログラミングされたナイーブヒトｉＰＳ細胞は、アルカリホスファターゼまたはＮＡＮＯＧの発現に対して染色された。再プログラミングされた細胞は、アルカリホスファターゼ（図５４Ａ）及びＮＡＮＯＧ（図５４Ｂ及び５４Ｃ）の両方に強度に発現したことが観察され、このことはナイーブ多能性の状態であることを示す。
６．５．ヒトｉＰＳ細胞の酵素解離及び継代培養における低オスモル濃度の培地の効果
この実施例では、低オスモル濃度のＶＧ２ｉ培地を用いてナイーブ状態に再プログラミングされたヒトｉＰＳ細胞を、トリプシンを用いて酵素的に解離して、単細胞懸濁液を作製した（図５５Ａ）。この細胞懸濁液を、ＶＧ２ｉ培地における継代培養のために新しいＧＥＬＴＲＥＸ（商標）でコーティングしたプレート上に継代した。継代培養した細胞がナイーブ多能性の状態で細胞の形態特徴を示し続けたことが、１日後（図５５Ｂ）及び４日後（図５５Ｃ）に観察された。特に、細胞は、丸いドーム状のコロニーとして成長し、頂低極性を示さなかった。酵素解離が、一般にプロアポトーシス経路の活性化を妨げるのに必要である、ＲＯＣＫ阻害剤の不在下で行われ得ることは注目に値した。これは、プロアポトーシス経路が、本明細書で特定された条件下で培養されたナイーブヒトｉＰＳ細胞における酵素解離及び継代培養期間ほど、強く活性されないことを示唆している。
本出願で言及されるすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に指示されている場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の任意の実施形態、態様、ステップ、または特性の文脈に特に明らかにされていない限り、任意のその他と組み合わせて使用され得る。範囲への言及は、範囲内の任意の整数、範囲内の任意の部分的な範囲を含む。複数の範囲への言及は、そのような範囲の合成数を含む。
例えば、本発明は、好ましい実施形態において、以下の項目を提供する。
（項目１）
マウス細胞またはヒト細胞において対象とするゲノム遺伝子座でゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、前記第１の核酸が、少なくとも３０ｋｂであり、かつ／または前記５’標的配列及び前記３’標的配列が少なくとも３０ｋｂ離れており、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変される、前記方法。
（項目２）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び前記ＬＴＶＥＣが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目１に記載の前記方法。
（項目３）
前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む、前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞を特定することをさらに含む、項目１または２に記載の前記方法。
（項目４）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一転写産物の形態で一緒に導入される、項目２または３に記載の前記方法。
（項目５）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、項目２または３に記載の前記方法。
（項目６）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目２〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、前記マウス細胞または前記ヒト細胞に導入される、項目６に記載の前記方法。
（項目８）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞において活性である、項目６に記載の前記方法。
（項目９）
前記第１、第２、及び／または第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目８に記載の前記方法。
（項目１０）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む、第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、単一の転写産物において前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物の形態であり、
前記第１及び第２のプロモータが、前記マウス細胞または前記ヒト細胞において活性である、項目６に記載の前記方法。
（項目１１）
前記第１及び前記第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目１０に記載の前記方法。
（項目１２）
前記標的遺伝子改変が、単一ステップにおける前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を同時に含む、項目１〜１１のいずれかに記載の前記方法。
（項目１３）
前記欠失した内因性核酸配列が約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂであり、前記挿入された第１の核酸が約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、項目１２に記載の前記方法。
（項目１４）
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、項目１〜１３のいずれかに記載の前記方法。
（項目１５）
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目１４に記載の前記方法。
（項目１６）
前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である、項目１４に記載の前記方法。
（項目１７）
前記改変マウス細胞または前記改変ヒト細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、項目１４に記載の前記方法。
（項目１８）
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目１６に記載の前記方法。
（項目１９）
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記第１の核酸の挿入、及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、項目１６に記載の前記方法。
（項目２０）
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、または少なくとも９０ｋｂである、項目１〜１９のいずれかに記載の前記方法。
（項目２１）
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである、項目１〜２０のいずれかに記載の前記方法。
（項目２２）
前記第１の核酸が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである、項目１〜２１のいずれかに記載の前記方法。
（項目２３）
前記第１の核酸が、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、項目１〜２２のいずれかに記載の前記方法。
（項目２４）
前記マウス細胞または前記ヒト細胞が、初代細胞または不死化細胞である、項目１〜２３のいずれかに記載の前記方法。
（項目２５）
前記マウス細胞または前記ヒト細胞が多能性細胞である、項目１〜２３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２６）
前記マウス多能性細胞がマウス胚幹（ＥＳ）細胞である、項目２５に記載の前記方法。
（項目２７）
前記ヒト多能性細胞が、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞、ヒト成人幹細胞、発達的に制限された（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ヒト前駆細胞、またはヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目２５に記載の前記方法。
（項目２８）
前記ヒトｉＰＳ細胞が、基本培地及び補充物を含む培地において維持され、前記培地が、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、
（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ３）阻害剤、及び
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤を含み、
前記培地が、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目１〜２８のいずれかに記載の前記方法。（項目３０）
前記標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、項目１〜２９のいずれかに記載の前記方法。
（項目３１）
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１〜３０のいずれかに記載の前記方法。
（項目３２）
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、項目１〜３１のいずれかに記載の前記方法。
（項目３３）
前記標的遺伝子改変が、
（ａ）相同もしくはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、
（ｂ）内因性核酸配列の欠失、
（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、
約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、
（ｄ）外因性核酸配列の挿入、
（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、
（ｆ）相同もしくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、
（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、
（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、
（ｉ）前記多能性細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子の挿入、または、
（ｊ）それらの組み合わせ、を含む、項目１〜３２のいずれかに記載の前記方法。
（項目３４）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ離れている、項目１〜３３のいずれかに記載の前記方法。
（項目３５）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、または少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、または少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ離れている、項目１〜３４のいずれかに記載の前記方法。
（項目３６）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂだけ離れている、項目１〜３５のいずれかに記載の前記方法。
（項目３７）
前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂだけ離れている、項目１〜３６のいずれかに記載の前記方法。
（項目３８）
前記対象とするゲノム遺伝子座が、インターロイキン−２受容体ガンマ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｅｒｂｂ４遺伝子座、Ｌｒｐ５遺伝子座、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、またはＤｐｐ４遺伝子座を含む、項目１〜３７のいずれかに記載の前記方法。
（項目３９）
前記対象とするゲノム遺伝子座が、染色体外ＤＮＡを含む、項目１〜３８のいずれかに記載の前記方法。
（項目４０）
対象とするゲノム遺伝子座で標的遺伝子改変を含むＦ０世代マウスを生み出すための方法であって、
（ａ）改変マウスＥＳ細胞を形成するために、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、マウスＥＳ細胞における前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることであって、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、前記第１の核酸が、少なくとも３０ｋｂであり、かつ／または前記５’標的配列及び前記３’標的配列が少なくとも３０ｋｂ離れている、接触させることと、
（ｂ）前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む前記改変マウスＥＳ細胞を特定することと、
（ｃ）前記改変マウスＥＳ細胞をマウス宿主胚に導入することと、
（ｄ）代理母において前記マウス宿主胚を懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む前記Ｆ０世代マウスを生み出す、前記方法。
（項目４１）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一転写産物の形態で一緒に導入される、項目４０に記載の前記方法。
（項目４２）
前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、項目４０に記載の前記方法。
（項目４３）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で、前記マウスＥＳ細胞に導入される、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目４４）
前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、前記マウスＥＳ細胞に導入される、項目４３に記載の前記方法。
（項目４５）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第４の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性である、項目４３に記載の前記方法。
（項目４６）
前記第１、第２、及び第３の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目４５に記載の前記方法。
（項目４７）
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む、第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、単一の転写産物において前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む、第２の発現構築物の形態であり、
前記第１及び第２のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性である、項目４３に記載の前記方法。
（項目４８）
前記第１及び前記第２の発現構築物が、単一の核酸分子上にある、項目４７に記載の前記方法。
（項目４９）
前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を同時に含む、項目４０〜４８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５０）
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、項目４０〜４９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５１）
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目５０に記載の前記方法。
（項目５２）
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性である、項目５０に記載の前記方法。
（項目５３）
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で半接合性である、項目５０に記載の前記方法。
（項目５４）
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記第１の核酸の挿入を含む、項目５２に記載の前記方法。
（項目５５）
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記第１の核酸の挿入及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、項目５２に記載の前記方法。
（項目５６）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目４０〜５５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５７）
真核細胞において対象とするゲノム遺伝子座でゲノムを改変するための方法であって、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、前記ゲノムを、Ｃａｓタンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡと接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂであり、前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム、及び前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する第１の核酸を含み、前記第１の核酸が、少なくとも３０ｋｂであり、かつ／または前記５’標的配列及び前記３’標的配列が少なくとも３０ｋｂ離れており、
前記真核細胞がラット細胞ではなく、
前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓタンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記ゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座での前記第１の核酸の挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変される、前記方法。
（項目５８）
前記非ラット真核細胞が、多能性細胞、非多能性細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、または線維芽細胞である、項目５７に記載の前記方法。
（項目５９）
前記非ラット真核細胞が、初代細胞または不死化細胞である、項目５７に記載の前記方法。

Claims (59)

  1. 多能性細胞において対象とするゲノム遺伝子座でゲノムを改変するためのインビトロの方法であって、
    前記多能性細胞に、Ｃａｓ９タンパク質と、前記対象とするゲノム遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡと、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）とを導入することを含み、前記ＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂのサイズであり、かつ
    （ｉ）前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム；及び
    （ｉｉ）前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含み、
    前記多能性細胞は、齧歯類胚幹（ＥＳ）細胞であり、
    前記ガイドＲＮＡは、前記挿入核酸におけるいかなる配列の認識も避けるように設計されており、
    前記多能性細胞に、前記Ｃａｓ９タンパク質と、前記ガイドＲＮＡと、前記ＬＴＶＥＣとを導入した後、前記多能性細胞のゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の少なくとも３０ｋｂの欠失及び／または前記対象とするゲノム遺伝子座の前記挿入核酸の少なくとも３０ｋｂの挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変され、ここで、前記標的遺伝子改変が前記対象とするゲノム遺伝子座の前記挿入核酸の少なくとも３０ｋｂの挿入を含む場合、前記ＬＴＶＥＣは少なくとも３０ｋｂのサイズである、方法。
  2. 前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、前記ガイドＲＮＡが、欠失のために標的とされる前記対象とするゲノム遺伝子座の前記領域内に、二本鎖切断を生じさせるように設計されている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列が、欠失のために標的とされる前記対象とするゲノム遺伝子座の前記領域の５’末端内にある、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列が、欠失の終点から、５０〜１０００塩基対にある、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列が、欠失のために標的とされる前記対象とするゲノム遺伝子座の前記領域の３’末端内にある、請求項１または２に記載の方法。
  6. 前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列が、欠失の終点から、５０〜１０００塩基対にある、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列が、イントロン、エクソン、プロモータ、エンハンサー、調節領域、または任意の非タンパク質コード領域内に位置している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列が、遺伝子のコード領域内に、または遺伝子の発現に影響する調節領域内に位置している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号２、３、４、５、６、７または８を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号３、４、５または７を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含む単一の核酸分子として導入される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記単一の核酸分子が、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態で一緒に融合した前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  14. （ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡの形態で導入され、
    （ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で導入され、かつ
    （ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で導入される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記Ｃａｓ９タンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として導入される、請求項１４に記載の方法。
  16. （Ｉ）（ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
    （ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
    （ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
    ここで、前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記多能性細胞において活性であり、
    前記第１、第２及び第３の発現構築物は、単一の核酸分子上にあるか、または複数の核酸分子上にあるか、あるいは、
    （ＩＩ）（ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ
    （ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、
    ここで、前記第１及び第２のプロモータが、前記多能性細胞において活性であり、
    前記第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にあるか、または別々の核酸分子上にある、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記挿入核酸の挿入を同時に含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記欠失した内因性核酸配列が３０ｋｂ〜１１０ｋｂであり、前記挿入核酸が４０ｋｂ〜１４０ｋｂである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. （ａ）前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記挿入核酸の挿入を含むか、または
    （ｂ）前記改変多能性細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性であるか、または半接合性である、請求項１９に記載の方法。
  21. １つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記挿入核酸の挿入を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記挿入核酸の挿入、及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の破壊を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも４０ｋｂであるか；あるいは
    前記標的遺伝子改変が、目的のゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、ここで、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂである、
    請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記標的遺伝子改変が、前記挿入核酸の挿入を含み、前記挿入核酸が、少なくとも４０ｋｂであるか；あるいは
    前記標的遺伝子改変が、対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失および前記挿入核酸の挿入を含み、ここで、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記挿入核酸が、少なくとも１０ｋｂである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記挿入核酸が、４０ｋｂ〜１４０ｋｂである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、１０ｋｂ〜１５０ｋｂもしくは３０ｋｂ〜１５０ｋｂの長さである、及び／または
    前記ＬＴＶＥＣが、１００ｋｂ〜３００ｋｂの長さである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記標的遺伝子改変が、
    （ａ）相同またはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、
    （ｂ）内因性核酸配列の欠失、
    （ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、
    少なくとも３０ｋｂ〜３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、
    （ｄ）外因性核酸配列の挿入、
    （ｅ）少なくとも３０ｋｂ〜４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、
    （ｆ）相同またはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、
    （ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、
    （ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、
    （ｉ）前記多能性細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子の挿入、あるいは、
    （ｊ）それらの組み合わせ、を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、
    前記欠失が、少なくとも４０ｋｂであるか；あるいは
    前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座における前記挿入核酸の挿入および前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、前記挿入は少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記欠失は、少なくとも１０ｋｂである、
    請求項１〜２８のいずれか1項に記載の方法。
  30. 欠失する前記ゲノム遺伝子座の領域が、３０ｋｂ〜１１０ｋｂである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失と、前記挿入核酸の前記対象とするゲノム遺伝子座での挿入とを含み、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記挿入が少なくとも３０ｋｂである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、前記多能性細胞に対して内因性である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、前記多能性細胞の前記ゲノムに組み込まれたＤＮＡの異種または外因性セグメントを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、免疫グロブリン遺伝子座である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記免疫グロブリン遺伝子座が、
    （ａ）哺乳動物免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列；または
    （ｂ）哺乳動物免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列
    をコードする、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記免疫グロブリン遺伝子座が、
    （ａ）再配列されない哺乳動物λ及び／またはκ軽鎖可変領域核酸配列；または
    （ｂ）再配列される哺乳動物λ及び／またはκ軽鎖可変領域核酸配列
    を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、Ｔ細胞受容体遺伝子座である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記Ｔ細胞受容体遺伝子座が、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記対象とするゲノム遺伝子座が、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子座、ＡｐｏＥ遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座、Ｒａｇ２遺伝子座、Ｒａｇ１遺伝子座及びＲａｇ２遺伝子座の両方、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｔｒｐａ１遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｅｒｂｂ４遺伝子座、Ｌｒｐ５遺伝子座、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座、Ｒｏｒ１遺伝子座、またはＤｐｐ４遺伝子座を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記挿入核酸が、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記挿入核酸が、
    （ａ）Ｖ Ｈ １−２、Ｖ Ｈ １−３、Ｖ Ｈ １−８、Ｖ Ｈ １−１８、Ｖ Ｈ １−２４、Ｖ Ｈ １−４５、Ｖ Ｈ １−４６、Ｖ Ｈ １−５８、Ｖ Ｈ １−６９、Ｖ Ｈ ２−５、Ｖ Ｈ ２−２６、Ｖ Ｈ ２−７０、Ｖ Ｈ ３−７、Ｖ Ｈ ３−９、Ｖ Ｈ ３−１１、Ｖ Ｈ ３−１３、Ｖ Ｈ ３−１５、Ｖ Ｈ ３−１６、Ｖ Ｈ ３−２０、Ｖ Ｈ ３−２１、Ｖ Ｈ ３−２３、Ｖ Ｈ ３−３０、Ｖ Ｈ ３−３０−３、Ｖ Ｈ ３−３０−５、Ｖ Ｈ ３−３３、Ｖ Ｈ ３−３５、Ｖ Ｈ ３−３８、Ｖ Ｈ ３−４３、Ｖ Ｈ ３−４８、Ｖ Ｈ ３−４９、Ｖ Ｈ ３−５３、Ｖ Ｈ ３−６４、Ｖ Ｈ ３−６６、Ｖ Ｈ ３−７２、Ｖ Ｈ ３−７３、Ｖ Ｈ ３−７４、Ｖ Ｈ ４−４、Ｖ Ｈ ４−２８、Ｖ Ｈ ４−３０−１、Ｖ Ｈ ４−３０−２、Ｖ Ｈ ４−３０−４、Ｖ Ｈ ４−３１、Ｖ Ｈ ４−３４、Ｖ Ｈ ４−３９、Ｖ Ｈ ４−５９、Ｖ Ｈ ４−６１、Ｖ Ｈ ５−５１、Ｖ Ｈ ６−１、Ｖ Ｈ ７−４−１、Ｖ Ｈ ７−８１、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なヒトＶ Ｈ 遺伝子セグメント；
    （ｂ）Ｄ１−１、Ｄ１−７、Ｄ１−１４、Ｄ１−２０、Ｄ１−２６、Ｄ２−２、Ｄ２−８、Ｄ２−１５、Ｄ２−２１、Ｄ３−３、Ｄ３−９、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ４−４、Ｄ４−１１、Ｄ４−１７、Ｄ４−２３、Ｄ５−１２、Ｄ５−５、Ｄ５−１８、Ｄ５−２４、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ６−１９、Ｄ６−２５、Ｄ７−２７、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なヒトＤ遺伝子セグメント；あるいは
    （ｃ）Ｊ Ｈ １、Ｊ Ｈ ２、Ｊ Ｈ ３、Ｊ Ｈ ４、Ｊ Ｈ ５、Ｊ Ｈ ６、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の機能的なＪ Ｈ 遺伝子セグメント
    を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記挿入核酸が、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記挿入核酸が、
    （ａ）Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、Ｖκ２−４０、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメント；
    （ｂ）Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント；あるいは
    （ｃ）Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、またはそれらの組み合わせを含む１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメント
    を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記挿入核酸が、ヒトＴ細胞受容体の少なくとも１つの領域をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記Ｔ細胞受容体が、Ｔ細胞受容体アルファである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記挿入核酸が、少なくとも１つの疾患対立遺伝子を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記挿入核酸が、ヒト遺伝子の少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記標的遺伝子改変により、（ａ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列の挿入、（ｂ）相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性核酸配列の置換、または（ｃ）それらの組み合わせを含むヒト化ゲノム遺伝子座がもたらされる、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記標的遺伝子改変が、相同もしくはオーソロガスなヒト核酸配列による内因性核酸配列の置換を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失と、前記挿入核酸の前記対象とするゲノム遺伝子座での挿入とを含み、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記挿入が少なくとも３０ｋｂである、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記欠失領域が３０ｋｂ〜１１０ｋｂであり、前記挿入核酸が４０ｋｂ〜１４０ｋｂである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＬＴＶＥＣが１００ｋｂ〜３００ｋｂであり、前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、３０ｋｂ〜１５０ｋｂであり、前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失と、前記挿入核酸の前記対象とするゲノム遺伝子座での挿入とを含み、前記欠失が３０ｋｂ〜１１０ｋｂであり、前記挿入が４０ｋｂ〜１４０ｋｂである、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記ＬＴＶＥＣが２０ｋｂ〜２５０ｋｂの長さであり、
    前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、２０ｋｂ〜２００ｋｂの長さであり、
    前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失と、前記挿入核酸の前記対象とするゲノム遺伝子座での挿入とを含み、前記欠失が３０ｋｂ〜１１０ｋｂであり、前記挿入が４０ｋｂ〜１４０ｋｂであり、
    前記ガイドＲＮＡが、欠失のために標的とされる前記対象とするゲノム遺伝子座の前記領域内に、二本鎖切断を生じさせるように設計されている、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記多能性細胞が、ラット胚幹（ＥＳ）細胞またはマウスＥＳ細胞である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記多能性細胞が、ラットＥＳ細胞である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ラットＥＳ細胞は、分裂期に不活性化したマウス胎児線維芽細胞のフィーダー細胞層上で、表３に示される２ｉ培地によって培養され、前記標的遺伝子改変は、生殖細胞系列を通して伝達されることが可能である、請求項５５に記載の方法。
  57. （ａ）前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む、改変されたラットＥＳ細胞を特定することと、
    （ｂ）前記改変されたラットＥＳ細胞をラット宿主胚に導入することと、
    （ｃ）代理母において前記ラット宿主胚を懐胎させることと
    をさらに含み、前記代理母が、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含むＦ０世代ラットを生み出す、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 前記多能性細胞が、マウスＥＳ細胞である、請求項５４に記載の方法。
  59. （ａ）前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む、改変されたマウスＥＳ細胞を特定することと、
    （ｂ）前記改変されたマウスＥＳ細胞をマウス宿主胚に導入することと、
    （ｃ）代理母において前記マウス宿主胚を懐胎させることと
    をさらに含み、前記代理母が、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含むＦ０世代マウスを生み出す、請求項５８に記載の方法。
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