JP6674686B2 - Coated cell, method for producing the same, and method for producing three-dimensional tissue using coated cell - Google Patents
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Description
本開示は、被覆細胞、その製造方法及び被覆細胞を用いた三次元組織体の製造方法に関する。 The present disclosure relates to a coated cell, a method for producing the same, and a method for producing a three-dimensional tissue using the coated cell.
生体外で細胞の三次元組織を構築する技術が開発されている（例えば、特許文献１及び２）。特許文献１には、細胞層を形成する工程と、細胞層を第１物質含有液と第２物質含有液とに交互に積層させる工程とを繰返し行い、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を介して細胞層を積層する技術が記載されている。特許文献２には、細胞表面全体が細胞外マトリックス膜で被覆された被覆細胞を基材上で培養することによって細胞の三次元組織を製造する方法が開示されている。 Techniques for constructing a three-dimensional tissue of cells in vitro have been developed (for example, Patent Documents 1 and 2). Patent Document 1 discloses that a step of forming a cell layer and a step of alternately laminating a cell layer with a first substance-containing liquid and a second substance-containing liquid are repeatedly performed, and the cell is formed via an extracellular matrix (ECM). Techniques for stacking layers are described. Patent Literature 2 discloses a method for producing a three-dimensional tissue of cells by culturing coated cells having the entire cell surface coated with an extracellular matrix membrane on a substrate.
三次元組織を実験動物の代替品や移植材料としての利用の普及を促進するためには、より高品質の三次元組織を効率よく製造することが求められている。 In order to promote the use of three-dimensional tissues as substitutes for experimental animals and as transplant materials, it is required to efficiently produce higher-quality three-dimensional tissues.
本発明者らは、鋭意研究を重ね、被膜成分を含有する液に浸漬させた細胞の回収を、液透過性膜を用いて行うことにより、被膜形成における細胞へのダメージを低減しつつ被覆細胞の収率（回収率）を向上できることを見出した。 The present inventors have conducted intensive studies, and by using a liquid-permeable membrane to collect cells immersed in a liquid containing a coating component, the coated cells were reduced while reducing damage to the cells during film formation. Was found to be able to improve the yield (recovery rate).
本開示によれば、細胞へのダメージを低減しつつ効率よく被覆細胞を製造する方法が提供される。本開示は、高品質な被覆細胞を提供しうる。このような被覆細胞を利用することで、細胞へのダメージを低減しつつ三次元組織が効率よく製造されうる。 According to the present disclosure, a method for efficiently producing coated cells while reducing damage to the cells is provided. The present disclosure can provide high quality coated cells. By using such coated cells, a three-dimensional tissue can be efficiently produced while reducing damage to the cells.
本開示は、被膜成分を含有する液に浸漬させた細胞の回収を、液透過性膜を用いて行うことにより、被膜形成における細胞へのダメージを低減しつつ被覆細胞の収率（回収率）を向上できるとの知見に基づく。 The present disclosure is directed to recovering cells immersed in a liquid containing a coating component by using a liquid-permeable membrane, thereby reducing damage to the cells in forming the coating and obtaining the yield of coated cells (recovery rate). It is based on the knowledge that can be improved.
一つの実施態様において、本開示は、細胞の表面に被膜を形成することを含む被覆細胞の製造方法であって、前記被覆細胞は、細胞と前記細胞表面を覆う被膜とを含み、前記被膜の形成は、前記被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる工程、及び前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する工程を含む、被覆細胞の製造方法に関する。 In one embodiment, the present disclosure is a method for producing a coated cell comprising forming a coating on the surface of a cell, wherein the coated cell comprises a cell and a coating covering the cell surface, wherein the coating comprises The formation relates to a method for producing coated cells, comprising the steps of immersing cells in a liquid containing the coating component, and separating the immersed cells and the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane. .
他の実施態様において、本開示は、本開示の被覆細胞の製造方法により製造された被覆細胞に関する。 In another embodiment, the present disclosure relates to a coated cell produced by the method for producing a coated cell of the present disclosure.
別の実施態様において、本開示は、細胞と前記細胞表面を覆う被膜とを含む被覆細胞であって、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性が、１０００ａｃｔｉｖｉｔｙ／μＵ以下である被覆細胞に関する。 In another embodiment, the present disclosure relates to a coated cell comprising a cell and a coating covering the cell surface, wherein the coated cell has lactate dehydrogenase (LDH) activity of 1000 activity / μU or less.
別の実施態様において、本開示は、三次元組織体の製造方法であって、細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び前記被覆細胞を三次元に配置することを含み、前記被覆細胞の形成は、前記被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む、三次元組織体の製造方法に関する。 In another embodiment, the present disclosure is a method for producing a three-dimensional tissue body, comprising forming a coated cell having a coating formed on the surface of a cell, and arranging the coated cell three-dimensionally. Forming the coated cells comprises immersing the cells in a liquid containing the coating component, and separating the immersed cells and the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane, tertiary. The present invention relates to a method for manufacturing an original organization.
別の実施態様において、本開示は、本開示の被覆細胞の製造方法を実施するための装置であって、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる手段、及び浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する手段を含む、装置に関する。 In another embodiment, the present disclosure provides an apparatus for performing the method for producing a coated cell according to the present disclosure, comprising: means for immersing cells in a solution containing a coating component; and a device including the immersed cells and the coating component. The present invention relates to an apparatus including a means for separating a liquid containing a by a liquid-permeable membrane.
別の実施態様において、本開示は、本開示の三次元組織体の製造方法を実施するための装置であって、被覆細胞を三次元に配置する手段を含み、前記被覆細胞は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる工程、及び前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する工程によって形成されたものである、装置に関する。 In another embodiment, the present disclosure is an apparatus for performing the method for producing a three-dimensional tissue body of the present disclosure, the method including a means for arranging coated cells in three dimensions, wherein the coated cells are capable of forming a coating component. The present invention relates to an apparatus formed by a step of immersing cells in a contained liquid and a step of separating the immersed cells and the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane.
本開示により、被膜形成における細胞へのダメージを低減しつつ被覆細胞の収率（回収率）を向上できるというメカニズムの詳細については不明であるが、以下のように推定される。従来の被覆細胞の製造では、多くの場合に合計で１５回を越える遠心分離処理が行われる。この遠心分離処理が細胞にストレスを与えて細胞膜を脆弱化させたり、さらには細胞を死滅させる場合がある。また、遠心分離処理後にピペット等による液の除去が行われるが、その際に、液と共に誤って細胞が取り除かれる場合がある。これに対し、被膜成分を含有する液の分離を液透過性膜によって行うことにより、従来の遠心分離処理と比較して被膜形成時における細胞へのストレスが軽減され細胞膜の脆弱化を防ぐことができ、被覆細胞の収率を向上できると推定される。ただし、これらの推測は本発明を限定するものではない。 According to the present disclosure, the details of the mechanism capable of improving the yield (recovery rate) of the coated cells while reducing the damage to the cells during the film formation are unknown, but are presumed as follows. Conventional production of coated cells often involves a total of more than 15 centrifugation steps. This centrifugation may give stress to the cells, weaken the cell membrane, or even kill the cells. After the centrifugation, the liquid is removed by a pipette or the like. At this time, the cells may be erroneously removed together with the liquid. In contrast, by separating the liquid containing the coating component using a liquid-permeable membrane, stress on the cells during coating formation is reduced as compared with the conventional centrifugation treatment, thereby preventing the cell membrane from becoming brittle. It is estimated that the yield of coated cells can be improved. However, these presumptions do not limit the present invention.
本開示によれば、一つの実施形態において、被膜形成時における細胞へのストレスを低減できるため、細胞膜の脆弱化が低減され、製造される被覆細胞の生存率が向上する。このため、本開示によれば、高品質の被覆細胞が製造されうる。また、本開示によれば、液透過性膜を用いて液との分離を行うことから、自動化及び／又は量産化が可能になりうる。本開示における「高品質の被覆細胞」について、「高品質」とは、細胞膜が脆弱化していないこと、細胞から放出されるＬＤＨ活性が無処理の細胞（被覆されていない細胞）のＬＤＨ活性と同じ又は同じ程度又は実質的に同じ程度又はほぼ同じ程度であること等が挙げられる。一つの実施形態において、細胞膜の脆弱化は、被膜の形成前後におけるＬＤＨ活性の増加率や細胞から放出されるＬＤＨ量等で評価することができる。例えば、被膜の形成前後におけるＬＤＨ活性の増加率が２０％以下、１５％以下、１０％以下、１０％未満、９％以下又は８％以下である場合、高品質の被覆細胞であると評価することができる。被膜の形成前後におけるＬＤＨ活性の増加率は、被覆細胞のＬＤＨ活性（ＬＤＨcoat）と被覆前（無処理）の細胞のＬＤＨ活性（ＬＤＨnon-coat）とを用いて下記式から求めることができる。
［増加率］＝｛（ＬＤＨcoat−ＬＤＨnon-coat）／ＬＤＨnon-coat｝×１００According to the present disclosure, in one embodiment, stress on cells at the time of forming a coating film can be reduced, so that cell membrane fragility is reduced and the survival rate of manufactured coated cells is improved. Therefore, according to the present disclosure, high-quality coated cells can be produced. Further, according to the present disclosure, since separation from a liquid is performed using a liquid-permeable membrane, automation and / or mass production may be possible. As for “high quality coated cells” in the present disclosure, “high quality” means that the cell membrane is not weakened and the LDH activity released from the cells is the LDH activity of untreated cells (uncoated cells). The same or the same or substantially the same or almost the same. In one embodiment, the weakening of the cell membrane can be evaluated by the rate of increase in LDH activity before and after the formation of the coating, the amount of LDH released from the cells, and the like. For example, if the increase rate of the LDH activity before and after the formation of the coating is 20% or less, 15% or less, 10% or less, less than 10%, 9% or less, or 8% or less, the cells are evaluated as high quality coated cells. be able to. The increase rate of the LDH activity before and after the formation of the coating can be obtained from the following equation using the LDH activity of the coated cells (LDH coat ) and the LDH activity of the cells before coating (untreated) (LDH non-coat ). .
[Increase rate] = {(LDH coat − LDH non-coat ) / LDH non-coat } × 100
本開示において「被覆細胞」とは、表面が被膜で覆われた細胞をいう。 In the present disclosure, “coated cells” refers to cells whose surfaces are covered with a coating.
一つの実施形態において、細胞には、例えば、線維芽細胞、肝ガン細胞等のがん細胞、上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞及び免疫細胞等の接着性細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、血管平滑筋細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、細胞は、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の動物由来の細胞であってもよい。別の実施形態において、細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞等の由来の細胞であってもよい。別の実施形態において、細胞は培養細胞であってもよい。別の実施形態において、培養細胞には、例えば、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。 In one embodiment, the cells include, for example, fibroblasts, cancer cells such as liver cancer cells, epithelial cells, nerve cells, cardiomyocytes, hepatocytes, islet cells, tissue stem cells, and adherent cells such as immune cells. Vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, and vascular smooth muscle cells, but are not limited thereto. In other embodiments, the cells may be cells of human origin or cells of non-human animals. In another embodiment, the cells may be cells derived from embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells and the like. In another embodiment, the cells may be cultured cells. In another embodiment, the cultured cells include, but are not limited to, for example, primary cultured cells, subcultured cells, and cell line cells. The cells may be of one type or of two or more types.
本開示は、上述のとおり、被膜形成時における細胞へのダメージを低減しうる。このため、一つの実形形態において、本開示は、ダメージに弱い細胞（ナイーブな細胞）への被膜形成に特に適している。ダメージに弱い細胞には、例えば、ヒトｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、心筋細胞、肝細胞、血管平滑筋細胞、膵島細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来の肝細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来の血管平滑筋細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来の膵島細胞が挙げられるが、これらに限定されない。 As described above, the present disclosure can reduce damage to cells during film formation. Thus, in one embodiment, the present disclosure is particularly suitable for forming a coating on cells that are vulnerable to damage (naive cells). Cells that are vulnerable to damage include, for example, human iPS cells, ES cells, cardiomyocytes, hepatocytes, vascular smooth muscle cells, islet cells, human iPS cell-derived cardiomyocytes, human iPS cell-derived hepatocytes, and human iPS cell-derived cells Vascular smooth muscle cells, pancreatic islet cells derived from human iPS cells, but are not limited thereto.
一つの実施形態において、被膜は、細胞外マトリックスを含む。細胞外マトリックスには、例えば、生体内で細胞の外の空間を充填して骨格的役割、足場を提供する役割、及び生体因子を保持する役割等の少なくとも一つの役割を果たす物質が挙げられる。一つの実施形態において、細胞外マトリックスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において上記の役割を果たしうる物質や、人工的に合成された物質やその一部を含んでもよい。細胞外マトリックスの具体例には、例えば、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、コラーゲンペプチド、ラミニン及びポリリジン等が挙げられる。細胞外マトリックスは、これらの例に限定されるものではなく、特開２００７−２２８９２１号公報（特許第４９１９４６４号）及び特開２０１２−１１５２５４号公報に開示のものが挙げられる。一つの実施形態において、被膜は、１又は２種類以上の細胞外マトリックスを含んでいてもよい。他の実施形態において、被膜は、２以上の異なる細胞外マトリックスを含む膜を２層以上積層されている。 In one embodiment, the coating comprises an extracellular matrix. The extracellular matrix includes, for example, a substance that plays at least one of a role of filling a space outside a cell in a living body to provide a skeletal role, a role of providing a scaffold, and a role of retaining a biological factor. In one embodiment, the extracellular matrix may include substances that can play a role in in vitro cell culture, or artificially synthesized substances or parts thereof. Specific examples of the extracellular matrix include, for example, fibronectin, gelatin, collagen, collagen peptide, laminin, and polylysine. The extracellular matrix is not limited to these examples, and examples thereof include those disclosed in JP-A-2007-228921 (Japanese Patent No. 4991964) and JP-A-2012-115254. In one embodiment, the coating may include one or more extracellular matrices. In other embodiments, the coating comprises two or more layers comprising two or more different extracellular matrices.
別の実施形態において、被膜は、第１物質を含む膜及び第１物質と相互作用する第２物質を含む膜を含み、好ましくは第１物質を含む膜と第１物質と相互作用する第２物質を含む膜とが交互に積層されている。第１物質と第２物質との組み合わせには、例えば、ＲＧＤ配列を有する高分子とＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有する高分子と負の電荷を有する高分子との組み合わせが挙げられる。第１物質と第２物質との組み合わせの具体例には、フィブロネクチンとゼラチン（またはコラーゲンペプチド）、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、及びラミニンとゼラチン等が挙げられる。 In another embodiment, the coating comprises a film comprising a first material and a film comprising a second material interacting with the first material, preferably a film comprising the first material and a second film comprising a second material interacting with the first material. Films containing substances are alternately stacked. The combination of the first substance and the second substance includes, for example, a combination of a polymer having an RGD sequence and a polymer interacting with a polymer having an RGD sequence, or a polymer having a positive charge and a negative A combination with a charged polymer is given. Specific examples of the combination of the first substance and the second substance include fibronectin and gelatin (or collagen peptide), fibronectin and ε-polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and heparin, and laminin and gelatin. Is mentioned.
本開示において「液透過性膜」とは、被膜成分を含有する液と細胞とを分離可能な膜をいう。一つの実施形態において、液透過性膜としては、例えば、不織布、多孔質膜、フィルター、及びメッシュ等が使用できるが、これらに限定されない。他の実施形態において、液透過性膜には、例えば、細胞の分離膜として公知の分離膜、及び今後開発されうる分離膜が使用できる。例えば、液透過性膜は、液透過性膜上に細胞を保持できるものが好ましい。液透過性膜の孔径は、例えば、細胞直径の１０〜９０％の大きさである。当業者であれば、液透過性膜の孔径を、細胞の大きさ等に応じて適宜設定できる。一つの実施形態において、液透過性膜の孔径は、０．４〜８μｍ、又は３〜８μｍである。 In the present disclosure, the “liquid permeable membrane” refers to a membrane capable of separating cells containing a coating component from cells. In one embodiment, as the liquid-permeable membrane, for example, a nonwoven fabric, a porous membrane, a filter, a mesh, or the like can be used, but is not limited thereto. In another embodiment, for example, a separation membrane known as a cell separation membrane and a separation membrane that can be developed in the future can be used as the liquid-permeable membrane. For example, the liquid permeable membrane is preferably one that can hold cells on the liquid permeable membrane. The pore size of the liquid-permeable membrane is, for example, 10 to 90% of the cell diameter. Those skilled in the art can appropriately set the pore size of the liquid-permeable membrane according to the size of cells and the like. In one embodiment, the pore size of the liquid permeable membrane is 0.4-8 μm, or 3-8 μm.
［被覆細胞の製造方法］
一つの実施態様において、本開示は、被覆細胞の製造方法（以下、「本開示の被覆細胞の製造方法」ともいう）に関する。本開示の被覆細胞の製造方法は、細胞の表面に被膜を形成することを含み、被膜の形成は、前記被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる工程、及び前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する工程を含む。[Method for producing coated cells]
In one embodiment, the present disclosure relates to a method for producing coated cells (hereinafter, also referred to as “a method for producing coated cells of the present disclosure”). The method for producing a coated cell according to the present disclosure includes forming a coating on the surface of the cell, wherein the coating is formed by immersing the cell in a liquid containing the coating component, and the immersed cell and the coating. A step of separating the liquid containing the components from the liquid by a liquid-permeable membrane.
一つの実施形態において、細胞の浸漬工程は、細胞を、被膜成分を含有する液に浸漬させることにより行う。 In one embodiment, the step of immersing the cells is performed by immersing the cells in a solution containing a coating component.
本開示において「被膜成分」とは、被膜を構成する成分、及び／又は被膜に含まれる成分をいう。被膜成分には、上述の細胞外マトリックスが挙げられる。 In the present disclosure, the “coating component” refers to a component constituting the coating and / or a component contained in the coating. Coating components include the extracellular matrix described above.
一つの実施形態において、被膜成分を含有する液は、被膜成分及び溶媒を含む。被膜成分の含有量は、例えば、０．０００１〜１質量％、０．０１〜０．５質量％、又は０．０２〜０．５質量％である。溶媒には、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液には、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、及びＧＴＡ緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒のｐＨは、例えば、３〜１１、６〜８、又は７．２〜７．４であるが、これらに限定されない。 In one embodiment, the liquid containing the coating component includes the coating component and a solvent. The content of the coating component is, for example, 0.0001 to 1% by mass, 0.01 to 0.5% by mass, or 0.02 to 0.5% by mass. Solvents include, but are not limited to, aqueous solvents such as, for example, water, phosphate buffered saline (PBS) and buffers. Examples of the buffer include a Tris buffer such as a Tris-HCl buffer, a phosphate buffer, a HEPES buffer, a citrate-phosphate buffer, a glycylglycine-sodium hydroxide buffer, and a Britton-Robinson buffer. , And GTA buffers. The pH of the solvent is, for example, 3 to 11, 6 to 8, or 7.2 to 7.4, but is not limited thereto.
一つの実施形態において、浸漬条件は、被膜を構成する成分の種類及び濃度、細胞の種類及び濃度等に応じて適宜決定できる。浸漬時間は、例えば、３０秒〜２４時間、１分〜６０分、１分〜１５分、１分〜１０分、又は１分〜５分であるが、これらに限定されない。浸漬時の周囲温度は、例えば、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃であるが、これらに限定されない。 In one embodiment, the immersion conditions can be appropriately determined according to the type and concentration of the components constituting the coating, the type and concentration of the cells, and the like. The immersion time is, for example, 30 seconds to 24 hours, 1 minute to 60 minutes, 1 minute to 15 minutes, 1 minute to 10 minutes, or 1 minute to 5 minutes, but is not limited thereto. The ambient temperature during immersion is, for example, 4 to 60 ° C, 20 to 40 ° C, or 30 to 37 ° C, but is not limited thereto.
一つの実施形態において、細胞の浸漬は、細胞へのストレスを低減しつつ、効率よく被膜を形成する点から、液及び／又は細胞を振とうしながら行うことが好ましい。振とう速度は、例えば、３０００ｒｐｍ以下、１００〜２０００ｒｐｍ、又は５００〜１０００ｒｐｍであるが、これらに限定されない。 In one embodiment, it is preferable to immerse the cells while shaking the liquid and / or the cells from the viewpoint of forming a coating efficiently while reducing the stress on the cells. The shaking speed is, for example, 3000 rpm or less, 100 to 2000 rpm, or 500 to 1000 rpm, but is not limited thereto.
他の実施形態において、細胞の浸漬は、液透過性膜上で行ってもよく、液透過性膜が底面に配置された容器（例えば、セルカルチャーインサート等）を用いて行ってもよい。細胞へのストレスを低減しかつ工数を削減する点から、別の実施形態において、細胞の浸漬は、細胞を液透過性膜上に配置し、それを被膜成分を含有する液に浸漬させることによって行ってもよいし、また、液透過性膜上に細胞を配置し、そこに被膜成分を含有する液を添加することによって行ってもよい。別の実施形態において、細胞の浸漬は、細胞へのストレスを低減する点から、液透過性膜を振とうしながら細胞の浸漬を行うことが好ましい。振とう速度は、上述のとおりである。 In another embodiment, the cell immersion may be performed on a liquid-permeable membrane, or may be performed using a container (for example, a cell culture insert or the like) having the liquid-permeable membrane disposed on the bottom surface. In terms of reducing stress on cells and reducing man-hours, in another embodiment, immersing the cells is by placing the cells on a liquid-permeable membrane and immersing it in a liquid containing the coating components. Alternatively, it may be performed by arranging cells on a liquid-permeable membrane and adding a liquid containing a coating component thereto. In another embodiment, it is preferable to immerse the cells while shaking the liquid-permeable membrane in order to reduce stress on the cells. The shaking speed is as described above.
被膜成分を含有する液と細胞との分離工程は、液透過性膜によって浸漬した細胞と被膜成分を含有する液とを分離することにより行ってもよい。分離は、例えば、重力、毛管現象又は表面張力等を用いて行うことができる。一つの実施形態において、細胞と液との分離は、細胞へのストレスを低減する点から、液透過性膜を振とうしながら行うことが好ましい。また、他の実施形態において、同様の点から、細胞と液との分離は、液及び／又は細胞を振とうしながら行ってもよい。振とう速度は、例えば、３０００ｒｐｍ以下、１００〜２０００ｒｐｍ、又は５００〜１０００ｒｐｍであるが、これらに限定されない。 The step of separating the liquid containing the coating component from the cells may be performed by separating the cell immersed by the liquid-permeable membrane and the liquid containing the coating component. Separation can be performed using, for example, gravity, capillary action, surface tension, or the like. In one embodiment, the separation of the cell and the liquid is preferably performed while shaking the liquid-permeable membrane from the viewpoint of reducing stress on the cell. Further, in another embodiment, from the same point, the separation of the cell and the liquid may be performed while shaking the liquid and / or the cell. The shaking speed is, for example, 3000 rpm or less, 100 to 2000 rpm, or 500 to 1000 rpm, but is not limited thereto.
一つの実施形態において、被膜の形成は、リンス工程を含んでいてもよい。リンス工程は、分離工程により得られた細胞を、リンス液に浸漬させること、及びリンス液に浸漬させた細胞とリンス液とを液透過性膜によって分離することを含みうる。一つの実施形態では、予めリンス液を添加した容器（例えば、カルチャープレート等）に、細胞を配置した液透過性膜を配置することで、細胞をリンス液に浸漬させる。他の実施形態では、細胞を配置した液透過性膜を備える容器（例えば、セルカルチャーインサート等）に、リンス液を添加することで、細胞をリンス液に浸漬させる。リンス液の除去は、被膜成分を含有する液の除去と同様に行うことができる。一つの実施形態において、リンス工程は、上述の被膜成分を含有する液との分離工程毎に行うことが好ましい。リンス液としては、例えば、被膜成分を含有する液の調製に用いられうる溶媒が挙げられるが、他の溶媒であってもよい。一つの実施形態において、リンス液は、被膜成分を含有する液の調製に用いた溶媒が好ましい。 In one embodiment, forming the coating may include a rinsing step. The rinsing step may include immersing the cells obtained in the separation step in a rinsing liquid, and separating the cells immersed in the rinsing liquid and the rinsing liquid by a liquid-permeable membrane. In one embodiment, the cells are immersed in the rinse liquid by disposing a liquid-permeable membrane in which the cells are disposed in a container (for example, a culture plate or the like) to which a rinse liquid has been added in advance. In another embodiment, the cells are immersed in a rinse solution by adding a rinse solution to a container (eg, a cell culture insert or the like) having a liquid-permeable membrane in which the cells are arranged. The rinsing liquid can be removed in the same manner as the removal of the liquid containing the film component. In one embodiment, the rinsing step is preferably performed for each separation step from the liquid containing the above-described coating component. The rinsing liquid includes, for example, a solvent that can be used for preparing a liquid containing a coating component, but may be another solvent. In one embodiment, the rinsing liquid is preferably a solvent used for preparing a liquid containing a coating component.
他の実施形態において、被膜の形成は、異なる２種類以上の成分を含む被膜を形成することを含む。異なる２種類以上の成分を含む被膜の形成は、例えば、２種類以上の異なる被膜成分を含む液を使用したり、異なる被膜成分をそれぞれ含む２種類以上の液を交互に使用すること等により行うことができる。 In other embodiments, forming the coating comprises forming a coating that includes two or more different components. The formation of a film containing two or more different components is performed, for example, by using a liquid containing two or more different film components or alternately using two or more types of liquids each containing a different film component. be able to.
別の実施形態において、被膜の形成は、被膜を構成する成分である第１物質を含む被膜と、被膜を構成する成分であって前記第１物質とは異なる第２物質を含む被膜とを形成することを含む。さらに別の実施形態において、被膜の形成は、第１物質を含む被膜の形成と第２物質を含む被膜の形成とを交互に２回以上行うことを含む。第１物質及び第２物質には、上述のものが挙げられる。 In another embodiment, the formation of the film includes forming a film including a first material that is a component of the film, and forming a film including a second material that is a component of the film and different from the first material. Including doing. In yet another embodiment, forming the coating comprises alternately forming the coating containing the first substance and forming the coating containing the second substance two or more times. The first substance and the second substance include those described above.
一つの実施形態において、第１物質を含む被膜と第２物質を含む被膜との形成は、第１物質を含む第１液と、第２物質を含む第２液との２種類の液を使用することにより行うことができる。一つの実施形態において、第１物質を含む被膜の形成は、第１物質を含む第１液に細胞を浸漬させる工程、及び前記浸漬させた細胞と第１液とを液透過性膜によって分離する工程を含む。一つの実施形態において、第２物質を含む被膜の形成は、第１物質とは異なる第２物質を含む第２液に第１液から分離した細胞を浸漬させる工程、及び記浸漬させた細胞と第２液とを液透過性膜によって分離する工程を含む。 In one embodiment, the formation of the coating containing the first substance and the coating containing the second substance uses two kinds of liquids, a first liquid containing the first substance and a second liquid containing the second substance. Can be performed. In one embodiment, the step of immersing the cells in a first liquid containing the first substance and the step of immersing the cells in a first liquid containing the first substance, and separating the immersed cells from the first liquid by a liquid-permeable membrane. Process. In one embodiment, the step of immersing the cells separated from the first liquid in a second liquid containing a second substance different from the first substance is performed by forming the coating containing the second substance. A step of separating the second liquid from the second liquid by a liquid-permeable membrane.
被膜の形成を行う回数は、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又は１１回以上であるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、被膜の形成は、特に制限されるものではなく、形成される被膜の厚みが１ｎｍ以上、又は１ｎｍ〜１×１０3ｎｍとなるように行う。The number of times the coating is formed is, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11 or more, but is not limited thereto. Not done. In one embodiment, the formation of the coating is not particularly limited, and is performed such that the thickness of the formed coating is 1 nm or more, or 1 nm to 1 × 10 3 nm.
一つの実施形態において、本開示の被覆細胞の製造方法により製造される被覆細胞は、細胞へのストレスが軽減され細胞膜の脆弱化が抑制されていることから、高品質であり、ＬＤＨ活性が無処理の細胞（被覆されていない細胞）のＬＤＨ活性と同程度である。被覆細胞が心筋細胞又はヒトｉＰＳ由来の心筋細胞の被覆細胞である場合、一つの実施形態において、被覆細胞のＬＤＨ活性は、１０００ａｃｔｉｖｉｔｙ／μＵ以下、又は８００ａｃｔｉｖｉｔｙ／μＵ以下である。ＬＤＨ活性は、実施例に記載の方法により求めることができる。 In one embodiment, the coated cells produced by the method for producing coated cells of the present disclosure are of high quality and have no LDH activity because stress on the cells is reduced and cell membrane fragility is suppressed. It is comparable to the LDH activity of the treated cells (uncoated cells). When the coated cell is a cardiomyocyte or a coated cell of a human iPS-derived cardiomyocyte, in one embodiment, the LDH activity of the coated cell is 1000 activity / μU or less, or 800 activity / μU or less. LDH activity can be determined by the method described in the Examples.
本開示の被覆細胞の製造方法によれば、細胞の浸漬と液透過性膜を用いた分離（液の除去）とによって被膜を形成できるため、一つの実施形態において、自動化への応用が容易であり、好ましくは量産化が可能になりうる。 According to the method for producing coated cells of the present disclosure, a coating can be formed by immersion of cells and separation (removal of liquid) using a liquid-permeable membrane. Therefore, in one embodiment, application to automation is easy. Yes, and preferably allows mass production.
［被覆細胞］
他の実施態様において、本開示は、本開示の被覆細胞の製造方法により製造された被覆細胞に関する。また、一つの実施形態において、本開示は、細胞と前記細胞表面を覆う被膜とを含む被覆細胞であって、ＬＤＨ活性が、１０００ａｃｔｉｖｉｔｙ／μＵ以下である被覆細胞に関する。他の実施形態において、本開示の被服細胞は、被膜の厚みが１ｎｍ以上、又は１ｎｍ〜１×１０3ｎｍである。本開示の被覆細胞において、被膜及び細胞は上述のとおりである。[Coated cells]
In another embodiment, the present disclosure relates to a coated cell produced by the method for producing a coated cell of the present disclosure. In one embodiment, the present disclosure relates to a coated cell comprising a cell and a coating covering the cell surface, wherein the coated cell has an LDH activity of 1000 activity / μU or less. In other embodiments, the coated cells of the present disclosure have a coating thickness of 1 nm or more, or 1 nm to 1 × 10 3 nm. In the coated cells of the present disclosure, the coating and the cells are as described above.
［三次元組織体の製造方法］
別の実施態様において、本開示は、三次元組織体の製造方法（以下、「本開示の三次元組織体の製造方法」ともいう）に関する。本開示の三次元組織体の製造方法は、本開示の被覆細胞を三次元に配置することを含む。一つの実施形態において、本開示の三次元組織体の製造方法は、本開示の被覆細胞を積層して培養することにより三次元組織体を形成することを含む。他の実施形態において、三次元組織体の形成は、特開２０１２−１１５２５４号公報に開示された方法及び実施例の記載を参酌して行うことができる。[Method of manufacturing three-dimensional structure]
In another embodiment, the present disclosure relates to a method for producing a three-dimensional tissue (hereinafter, also referred to as “a method for producing a three-dimensional tissue of the present disclosure”). The method for producing a three-dimensional tissue of the present disclosure includes arranging the coated cells of the present disclosure in three dimensions. In one embodiment, the method for producing a three-dimensional tissue of the present disclosure includes forming a three-dimensional tissue by stacking and culturing the coated cells of the present disclosure. In another embodiment, formation of a three-dimensional tissue body can be performed in consideration of the description of the method and examples disclosed in JP-A-2012-115254.
一つの実施形態において、本開示の三次元組織体の製造方法は、被覆細胞を形成することを含んでいてもよい。一つの実施形態において、被覆細胞の形成は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む。他の実施形態において、被覆細胞の形成は、本開示の被覆細胞の製造方法により行うことができる。 In one embodiment, the method for producing a three-dimensional tissue of the present disclosure may include forming coated cells. In one embodiment, forming the coated cells includes immersing the cells in a liquid containing the coating component, and separating the immersed cells from the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane. Including. In another embodiment, formation of coated cells can be performed by the method for producing coated cells of the present disclosure.
［被覆細胞の製造方法を実施するための装置］
別の実施態様において、本開示は、本開示の被覆細胞の製造方法を実施するための装置（以下、「本開示の被覆細胞の製造装置」ともいう）に関する。本開示の被覆細胞の製造装置は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる手段、及び浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する手段を含む。被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる手段には、例えばカルチャープレート、ディッシュ、フラスコ等が挙げられるが、これらに限定されない。浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する手段には、例えばセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、本開示の被覆細胞の製造装置は、プレート等をシェイクするための手段をさらに含んでもよい。プレート等をシェイクするための手段には、例えば混合・振とう機（例えば、ロータリーシェイカー）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本開示の被覆細胞の製造装置は、三次元組織体を製造する装置をさらに含んでもよい。三次元組織体を製造する装置については、以下に説明する。[Apparatus for carrying out method for producing coated cells]
In another embodiment, the present disclosure relates to an apparatus for performing the method for producing coated cells of the present disclosure (hereinafter, also referred to as “an apparatus for producing coated cells of the present disclosure”). The apparatus for producing coated cells of the present disclosure includes means for immersing cells in a liquid containing a coating component, and means for separating the immersed cells from the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane. Means for immersing cells in a solution containing a coating component include, but are not limited to, for example, a culture plate, a dish, and a flask. Means for separating the immersed cells from the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane include, but are not limited to, for example, cell culture inserts. In one embodiment, the apparatus for producing coated cells of the present disclosure may further include means for shaking a plate or the like. Means for shaking the plate or the like include, but are not limited to, for example, a mixing and shaking machine (for example, a rotary shaker). Furthermore, the device for producing coated cells of the present disclosure may further include a device for producing a three-dimensional tissue body. An apparatus for producing a three-dimensional structure will be described below.
［三次元組織体の製造方法を実施するための装置］
別の実施態様において、本開示は、本開示の三次元組織体の製造方法を実施するための装置（以下、「本開示の三次元組織体の製造装置」ともいう）に関する。本開示の三次元組織体の製造装置は、被覆細胞を三次元に配置する手段を含み、ここで、被覆細胞は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる工程と、前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する工程によって形成されたものである。一つの実施形態において、被覆細胞を三次元に配置する手段は、被覆細胞を容器（例えば、セルカルチャーインサート、カルチャープレート、ディッシュ、フラスコ等）に播種する手段である。例えば、以下の実施例に示すように、本開示の被覆細胞をセルカルチャーインサートに播種し、培養することで、被覆細胞を三次元に配置しうる。本開示の三次元組織体の製造装置は、細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成する装置をさらに含んでもよい。被覆細胞を形成する装置は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる手段、及び前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する手段を含む。一つの実施形態では、被覆細胞を形成する装置は、上述した本開示の被覆細胞の製造装置である。[Apparatus for implementing a method for manufacturing a three-dimensional structure]
In another embodiment, the present disclosure relates to an apparatus (hereinafter, also referred to as “a three-dimensional tissue manufacturing apparatus of the present disclosure”) for performing the method of manufacturing a three-dimensional tissue of the present disclosure. An apparatus for producing a three-dimensional tissue body of the present disclosure includes means for arranging coated cells three-dimensionally, wherein the coated cells are a step of immersing the cells in a liquid containing a coating component, and the step of immersing the cells. And a liquid containing the above-mentioned coating component formed by a step of separating by a liquid-permeable membrane. In one embodiment, the means for arranging the coated cells in three dimensions is a means for seeding the coated cells into a container (eg, cell culture insert, culture plate, dish, flask, etc.). For example, as shown in the following examples, the coated cells of the present disclosure can be three-dimensionally arranged by seeding and culturing the coated cells in a cell culture insert. The apparatus for producing a three-dimensional tissue of the present disclosure may further include an apparatus for forming a coated cell having a coating formed on the surface of a cell. The apparatus for forming coated cells includes means for immersing cells in a liquid containing a coating component, and means for separating the cells soaked from the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane. In one embodiment, the apparatus for forming coated cells is the above-described apparatus for producing coated cells of the present disclosure.
以下に、本開示を具体的な実施形態を示しながら詳細に説明する。しかしながら、本開示は、以下の実施形態に限定されるものではないことはいうまでもない。 Hereinafter, the present disclosure will be described in detail with reference to specific embodiments. However, it is needless to say that the present disclosure is not limited to the following embodiments.
（実施形態１）
本実施形態１では、第１物質（例えば、フィブロネクチン）を含む被膜と第２物質（例えば、ゼラチン）を含む被膜との２種類の被膜を交互に形成する形態を例にとり説明する。(Embodiment 1)
In the first embodiment, an example will be described in which two types of films, that is, a film containing a first substance (for example, fibronectin) and a film containing a second substance (for example, gelatin) are alternately formed.
まず、培養した細胞をリンス工程に供する。
リンスは、セルカルチャーインサートに配置した細胞をリンス液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）に浸漬し、その後、リンス液を除去することにより行うことができる。細胞の浸漬は、例えば、細胞が配置されたセルカルチャーインサートをリンス液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を含有する容器（ウェル又はディッシュ等）に配置し、所定の時間浸漬することにより行うことができる。次いで、インサートを容器から取り出すことにより、インサートのフィルターからリンス液を除去し、これにより細胞を回収することができる。細胞へのダメージを低減しつつ、リンス液と細胞とを分離する点から、ゆっくり振とうさせながらインサートを容器から取り出すことが好ましい。インサートの振とう速度は上述のとおりである。First, the cultured cells are subjected to a rinsing step.
Rinsing can be performed by immersing the cells arranged in the cell culture insert in a rinsing solution (for example, Tris-HCl), and then removing the rinsing solution. The cells can be immersed, for example, by arranging the cell culture insert on which the cells are arranged in a container (well or dish, etc.) containing a rinsing liquid (eg, Tris-HCl) and immersing the cells for a predetermined time. . Next, the rinse can be removed from the filter of the insert by removing the insert from the container, thereby recovering the cells. From the viewpoint of separating the rinse solution and the cells while reducing the damage to the cells, it is preferable to remove the insert from the container while slowly shaking. The shaking speed of the insert is as described above.
セルカルチャーインサートのメンブレンの孔径は、メンブレン上に細胞を保持でき、かつ液を透過できるものであればよく、通常の細胞培養に用いられるメンブレンの孔径が挙げられる。孔径は、一つの実施形態において、０．１μｍ〜２０μｍ、又は０．４μｍ〜１０μｍである。メンブレンの材質には、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、又はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等が挙げられるが、これらに限定されない。 The pore size of the membrane of the cell culture insert is not particularly limited as long as cells can be retained on the membrane and liquid can pass therethrough, and examples thereof include the pore size of a membrane used for ordinary cell culture. The pore size is, in one embodiment, from 0.1 μm to 20 μm, or from 0.4 μm to 10 μm. Examples of the material of the membrane include, but are not limited to, polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, and polytetrafluoroethylene (PTFE).
次に、第１物質を含む被膜を形成する。
被膜の形成は、リンスした細胞をインサートと共に、第１物質を含む液（例えば、フィブロネクチン／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ液）に浸漬し、液を除去することにより行うことができる。細胞の浸漬は、リンスした細胞が配置されたインサートを、第１物質を含む液（例えば、フィブロネクチン／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ液）が配置された容器に、所定の時間浸漬することにより行うことができる。浸漬は、細胞へのダメージを低減しつつ効率よく被膜を形成する点から、インサートをゆっくり振とうさせながら行うことが好ましい。次いで、インサートを容器から取り出すことにより、インサートのフィルターから第１物質を含む液を除去し、これにより細胞を回収することができる。細胞へのダメージを低減しつつ、第１物質を含む液と細胞とを分離する点から、ゆっくり振とうさせながらインサートを容器から取り出すことが好ましい。また、細胞の浸漬は、リンスした細胞が配置されたインサートを容器に配置し、そこに第１物質を含む液を添加することにより行ってもよい。Next, a film containing the first substance is formed.
The formation of the coating can be performed by immersing the rinsed cells together with the insert in a liquid containing the first substance (for example, a fibronectin / Tris-HCl solution) and removing the liquid. The cells can be immersed by immersing the insert on which the rinsed cells are arranged in a container in which a liquid containing the first substance (for example, a fibronectin / Tris-HCl solution) is arranged for a predetermined time. The immersion is preferably performed while the insert is slowly shaken from the viewpoint of forming a coating efficiently while reducing damage to cells. Next, the liquid containing the first substance is removed from the filter of the insert by removing the insert from the container, whereby the cells can be collected. It is preferable to remove the insert from the container while gently shaking from the viewpoint of separating the cell containing the first substance and the cell while reducing damage to the cell. Alternatively, the cells may be immersed by arranging the insert in which the rinsed cells are arranged in a container, and adding a liquid containing the first substance thereto.
次に、上記と同様にしてリンス工程を行った後、第２物質を含む被膜を形成する。
被膜の形成は、第１物質を含む液に替えて第２物質を含む液（例えば、ゼラチン／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ液）を用いる以外は、第１物質を含む被膜の形成と同様の方法で行うことができる。浸漬は、細胞へのダメージを低減しつつ効率よく被膜を形成する点から、インサートをゆっくり振とうさせながら行うことが好ましい。次いで、インサートを容器から取り出すことにより、インサートのフィルターから第２物質を含む液を除去して細胞を回収する。細胞へのダメージを低減しつつ、第２物質を含む液と細胞とを分離する点から、ゆっくり振とうさせながらインサートを容器から取り出すことが好ましい。Next, after performing a rinsing step in the same manner as described above, a film containing the second substance is formed.
The formation of the coating is performed in the same manner as the formation of the coating containing the first substance, except that a liquid containing the second substance (for example, a gelatin / Tris-HCl solution) is used instead of the liquid containing the first substance. Can be. The immersion is preferably performed while the insert is slowly shaken from the viewpoint of forming a coating efficiently while reducing damage to cells. Next, by removing the insert from the container, the liquid containing the second substance is removed from the filter of the insert to collect the cells. It is preferable to remove the insert from the container while gently shaking, in order to separate the liquid containing the second substance from the cells while reducing damage to the cells.
次に、上記と同様にしてリンス工程を行い、所定の厚みの被膜が形成されるまで、第１物質を含む被膜の形成、リンス工程、及び第２物質を含む被膜の形成をこの順番で繰返し行い、最後に第１物質を含む被膜の形成及びリンス工程を行う。これにより、第１物質を含む被膜と第２物質を含む被膜との２種類の被膜が細胞表面に交互に積層された被覆細胞が形成される。 Next, a rinsing step is performed in the same manner as described above, and the formation of the coating containing the first substance, the rinsing step, and the formation of the coating containing the second substance are repeated in this order until a coating having a predetermined thickness is formed. Then, finally, a film formation and a rinsing step including the first substance are performed. As a result, a coated cell in which two types of coatings, that is, a coating containing the first substance and a coating containing the second substance, are alternately laminated on the cell surface is formed.
（実施形態２）
本実施形態２では、被覆細胞を用いた三次元組織体の製造方法について、血管内皮細胞の層（１層）を線維芽細胞の細胞層（２層以上）でサンドイッチして製造する形態を例にとり説明する。(Embodiment 2)
In the second embodiment, an example of a method for manufacturing a three-dimensional tissue using coated cells is an example in which a layer (one layer) of vascular endothelial cells is sandwiched with a cell layer (two or more layers) of fibroblasts. Will be explained.
まず、線維芽細胞の被覆細胞（以下、「被覆線維芽細胞」ともいう）を準備する。被覆細胞は実施形態１に基づき作製できる。 First, fibroblast-coated cells (hereinafter, also referred to as “coated fibroblasts”) are prepared. The coated cells can be prepared according to the first embodiment.
被覆線維芽細胞を基材上に播種して培養する。被覆線維芽細胞の播種は、被覆線維芽細胞が２層以上、好ましくは３層、４層、５層、８層又は１０層以上積層されるように行う。播種時の線維芽細胞の密度は、一つの実施形態において、１×１０2〜１×１０9細胞／ｃｍ3、１×１０4〜１×１０8細胞／ｃｍ3又は１×１０5〜１×１０7細胞／ｃｍ3である。The coated fibroblasts are seeded on a substrate and cultured. Seeding of the coated fibroblasts is performed so that the coated fibroblasts are stacked in two or more layers, preferably three, four, five, eight or ten or more layers. In one embodiment, the density of the fibroblasts at the time of seeding is 1 × 10 2 to 1 × 10 9 cells / cm 3 , 1 × 10 4 to 1 × 10 8 cells / cm 3 or 1 × 10 5 to 1 × 10 7 cells / cm 3 .
一つの実施形態において、培養は、ディッシュ内に培地を添加して行う。培地には、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、培養する細胞の種類に応じて、適宜培地を選択できる。一つの実施形態において、培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培養温度は、例えば、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃である。培養時間は、例えば、１〜２４時間、又は６〜２４時間である。 In one embodiment, the culturing is performed by adding a medium to the dish. Examples of the medium include, but are not limited to, Eagle's MEM medium, Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RDMI, and GlutaMax medium. Those skilled in the art can appropriately select a medium according to the type of cells to be cultured. In one embodiment, the medium may be a medium supplemented with serum or a serum-free medium. The culture temperature is, for example, 4 to 60 ° C, 20 to 40 ° C, or 30 to 37 ° C. The culture time is, for example, 1 to 24 hours, or 6 to 24 hours.
次に、形成された積層体の上に血管内皮細胞を播種して培養する。血管内皮細胞は、血管内皮細胞の層が１層形成されるように配置する。血管内皮細胞は、被膜を形成したものを使用してもよいし、被膜が形成されていないものを使用してもよい。培養条件は上述のとおりである。 Next, vascular endothelial cells are seeded on the formed laminate and cultured. The vascular endothelial cells are arranged such that one layer of the vascular endothelial cells is formed. As the vascular endothelial cells, those having a coating formed thereon or those having no coating formed thereon may be used. Culture conditions are as described above.
ついで、血管内皮細胞の上に被覆線維芽細胞を播種して培養する。被覆線維芽細胞の播種及び培養は上記と同様に行う。これにより、内部に毛細血管様構造が形成された三次元組織体が形成できる。 Next, the coated fibroblasts are seeded on the vascular endothelial cells and cultured. Seeding and culturing of coated fibroblasts are performed as described above. Thereby, a three-dimensional tissue body having a capillary-like structure formed therein can be formed.
本実施形態２では血管内皮細胞の層（１層）を線維芽細胞の細胞層（２層以上）でサンドイッチして製造する形態を例にとり説明したが、本開示はこれに限定されるものではない。他の実施形態において、血管内皮細胞と線維芽細胞とを混合して播種し培養することによって三次元組織体を形成してもよい。 In the second embodiment, an example was described in which the layer (one layer) of vascular endothelial cells was sandwiched between fibroblast cell layers (two or more layers) to produce the layer, but the present disclosure is not limited to this. Absent. In another embodiment, a three-dimensional tissue body may be formed by mixing and inoculating and culturing vascular endothelial cells and fibroblasts.
本実施形態２では線維芽細胞と血管内皮細胞とを用いて三次元組織体を製造する方法を例にとり説明したが、本開示はこれに限定されるものではない。他の実施形態において、線維芽細胞に替えて又は併せて心筋細胞を用いて三次元組織体を製造してもよい。別の実施形態において、血管内皮細胞に替えて又は併せてリンパ管内皮細胞を用いて三次元組織体を製造してもよい。 In the second embodiment, a method for producing a three-dimensional tissue using fibroblasts and vascular endothelial cells has been described as an example, but the present disclosure is not limited to this. In another embodiment, a three-dimensional tissue body may be produced using cardiomyocytes instead of or in combination with fibroblasts. In another embodiment, a three-dimensional tissue body may be produced using lymphatic endothelial cells instead of or in combination with vascular endothelial cells.
本開示は、以下の実施形態に関しうる。
［１］ 細胞の表面に被膜を形成することを含む、被覆細胞の製造方法であって、
前記被覆細胞は、細胞と前記細胞表面を覆う被膜とを含み、
前記被膜の形成は、
細胞を、被膜成分を含有する液に浸漬させる工程、及び
前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する工程を含む、被覆細胞の製造方法。
［２］ 前記浸漬は、前記液及び／又は前記細胞を振とうしながら行うことを含む、［１］記載の被覆細胞の製造方法。
［３］ 前記分離は、前記液透過性膜を振とうしながら行うことを含む、［１］又は［２］に記載の被覆細胞の製造方法。
［４］ 前記被膜の形成は、異なる２種類以上の成分を含む被膜を形成することを含む、［１］から［３］のいずれかに記載の被覆細胞の製造方法。
［５］ 前記被膜の形成は、被膜成分である第１物質を含む被膜と、被膜成分であって前記第１物質とは異なる第２物質を含む被膜とを形成することを含み、
前記第１物質を含む被膜の形成は、
細胞を、前記第１物質を含む第１液に浸漬させる工程、及び
前記浸漬させた細胞と前記第１液とを液透過性膜によって分離する工程を含み、
前記第２物質を含む被膜の形成は、
前記分離した細胞を、前記第１物質とは異なる第２物質を含む第２液に浸漬させる工程、及び
前記浸漬させた細胞と前記第２液とを液透過性膜によって分離する工程を含む、［１］から［４］のいずれかに記載の被覆細胞の製造方法。
［６］ 前記第１物質を含む被膜の形成と前記第２物質を含む被膜の形成とを交互に行うことを含む、［５］記載の被覆細胞の製造方法。
［７］ 前記第１物質と前記第２物質との組み合わせが以下からなる群から選択される、［５］または［６］に記載の被覆細胞の製造方法：
（ａ）フィブロネクチン及びゼラチン；
（ｂ）フィブロネクチン及びε−ポリリジン；
（ｃ）フィブロネクチン及びヒアルロン酸；
（ｄ）フィブロネクチン及びデキストラン硫酸；
（ｅ）フィブロネクチン及びヘパリン；ならびに
（ｆ）ラミニン及びゼラチン。
［８］ 前記第１物質と前記第２物質との組み合わせがフィブロネクチン及びゼラチンである、［７］記載の被覆細胞の製造方法。
［９］ 前記被膜の形成は、さらにリンス工程を含み、
前記リンス工程は、
前記分離工程により得られた細胞をリンス液に浸漬させること、及び
前記リンス液に浸漬させた細胞と前記リンス液とを液透過性膜によって分離することを含む、［１］から［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］ 前記被膜の厚みが１ｎｍ〜１×１０3ｎｍとなるように前記被膜の形成を行う、［１］から［９］のいずれかに記載の被覆細胞の製造方法。
［１１］ ［１］から［１０］のいずれかに記載の被覆細胞の製造方法により製造された被覆細胞。
［１２］ 細胞と前記細胞表面を覆う被膜とを含む被覆細胞であって、
ＬＤＨ活性が、１０００ａｃｔｉｖｉｔｙ／μＵ以下である、被覆細胞。
［１３］ 前記皮膜が、被膜成分である第１物質と、被膜成分であって前記第１物質とは異なる第２物質を含む、［１２］記載の被覆細胞。
［１４］ 前記第１物質と前記第２物質との組み合わせが以下からなる群から選択される、［１３］記載の被覆細胞：
（ａ）フィブロネクチン及びゼラチン；
（ｂ）フィブロネクチン及びε−ポリリジン；
（ｃ）フィブロネクチン及びヒアルロン酸；
（ｄ）フィブロネクチン及びデキストラン硫酸；
（ｅ）フィブロネクチン及びヘパリン；ならびに
（ｆ）ラミニン及びゼラチン。
［１５］ 前記第１物質と前記第２物質との組み合わせがフィブロネクチン及びゼラチンである、［１４］記載の被覆細胞。
［１６］ 前記被膜の厚みが１ｎｍ〜１×１０3ｎｍである、［１１］から［１５］のいずれかに記載の被覆細胞。
［１７］ 三次元組織体の製造方法であって、
［１１］から［１６］のいずれかに記載の被覆細胞を三次元に配置することを含む、三次元組織体の製造方法。
［１８］ 前記被覆細胞を形成することを含む、［１７］記載の三次元組織体の製造方法。
［１９］ 三次元組織体の製造方法であって、
細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び
前記被覆細胞を三次元に配置することを含み、
前記被覆細胞の形成は、
被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び
前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む、三次元組織体の製造方法。
［２０］ 前記被覆細胞の形成は、［１］から［１０］のいずれかに記載の被覆細胞の製造方法により行う、［１８］又は［１９］に記載の三次元組織体の製造方法。
［２１］ ［１］から［１０］のいずれかに記載の被覆細胞の製造方法を実施するための装置であって、
被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる手段、及び
浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する手段
を含む、装置。
［２２］ ［１７］〜［２０］のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法を実施するための装置であって、
被覆細胞を三次元に配置する手段
を含み、
前記被覆細胞は、
被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる工程、及び
前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する工程によって形成されたものである、装置。The present disclosure may relate to the following embodiments.
[1] A method for producing a coated cell, comprising forming a coating on the surface of a cell,
The coated cells include cells and a coating covering the cell surface,
The formation of the coating,
A method for producing coated cells, comprising the steps of immersing cells in a liquid containing a coating component, and separating the immersed cells from the liquid containing the coating component with a liquid-permeable membrane.
[2] The method for producing coated cells according to [1], wherein the immersion includes shaking the liquid and / or the cells.
[3] The method for producing a coated cell according to [1] or [2], wherein the separation includes performing the separation while shaking the liquid-permeable membrane.
[4] The method for producing a coated cell according to any one of [1] to [3], wherein forming the coating includes forming a coating containing two or more different components.
[5] The formation of the coating includes forming a coating containing a first substance that is a coating component and a coating containing a second substance that is a coating component and different from the first substance,
The formation of the film containing the first substance includes:
Immersing the cells in a first liquid containing the first substance, and separating the immersed cells and the first liquid by a liquid-permeable membrane,
The formation of the coating containing the second substance includes:
A step of immersing the separated cells in a second liquid containing a second substance different from the first substance, and a step of separating the immersed cells and the second liquid by a liquid-permeable membrane; The method for producing a coated cell according to any one of [1] to [4].
[6] The method for producing a coated cell according to [5], comprising alternately forming a film containing the first substance and forming a film containing the second substance.
[7] The method for producing a coated cell according to [5] or [6], wherein the combination of the first substance and the second substance is selected from the group consisting of:
(A) fibronectin and gelatin;
(B) fibronectin and ε-polylysine;
(C) fibronectin and hyaluronic acid;
(D) fibronectin and dextran sulfate;
(E) fibronectin and heparin; and (f) laminin and gelatin.
[8] The method for producing coated cells according to [7], wherein the combination of the first substance and the second substance is fibronectin and gelatin.
[9] The formation of the coating further includes a rinsing step,
The rinsing step includes:
[1] to [8], including immersing the cells obtained in the separation step in a rinsing solution, and separating the cells immersed in the rinsing solution and the rinsing solution by a liquid-permeable membrane. The production method according to any one of the above.
[10] The method for producing a coated cell according to any one of [1] to [9], wherein the coating is formed such that the thickness of the coating is 1 nm to 1 × 10 3 nm.
[11] A coated cell produced by the method for producing a coated cell according to any one of [1] to [10].
[12] A coated cell comprising a cell and a coating covering the cell surface,
A coated cell having an LDH activity of 1000 activity / μU or less.
[13] The coated cell according to [12], wherein the coating contains a first substance that is a coating component and a second substance that is a coating component and is different from the first substance.
[14] The coated cell according to [13], wherein the combination of the first substance and the second substance is selected from the group consisting of:
(A) fibronectin and gelatin;
(B) fibronectin and ε-polylysine;
(C) fibronectin and hyaluronic acid;
(D) fibronectin and dextran sulfate;
(E) fibronectin and heparin; and (f) laminin and gelatin.
[15] The coated cell according to [14], wherein the combination of the first substance and the second substance is fibronectin and gelatin.
[16] The coated cell according to any one of [11] to [15], wherein the thickness of the coating is 1 nm to 1 × 10 3 nm.
[17] A method for producing a three-dimensional structure, comprising:
A method for producing a three-dimensional tissue, comprising arranging the coated cells according to any one of [11] to [16] three-dimensionally.
[18] The method for producing a three-dimensional tissue according to [17], comprising forming the coated cell.
[19] A method for producing a three-dimensional structure, comprising:
Forming a coated cell having a coating formed on the surface of the cell, and arranging the coated cell three-dimensionally,
The formation of the coated cells,
A method for producing a three-dimensional tissue, comprising: immersing cells in a liquid containing a coating component; and separating the immersed cells and the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane.
[20] The method for producing a three-dimensional tissue according to [18] or [19], wherein the formation of the coated cells is performed by the method for producing coated cells according to any one of [1] to [10].
[21] An apparatus for performing the method for producing a coated cell according to any one of [1] to [10],
An apparatus comprising: means for immersing cells in a liquid containing a coating component; and means for separating the immersed cells from the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane.
[22] An apparatus for performing the method for producing a three-dimensional structure according to any one of [17] to [20],
Including means for arranging the coated cells in three dimensions,
The coated cell,
An apparatus formed by a step of immersing cells in a liquid containing a coating component, and a step of separating the immersed cells and the liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane.
以下、実施例を用いて本開示をさらに説明する。ただし、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。 Hereinafter, the present disclosure will be further described using examples. However, the present disclosure is not construed as being limited to the following examples.
なお、本明細書において、以下の略語を使用する。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）：ＨＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製）でｐＨ７．４に調整した５０ｍＭ Ｔｒｉｓを、０．２μｍ γ−ｒａｙ ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｅｒ（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの
ＢＦＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｐｌａｓｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
ＦＮ液：０．２ｍｇ ＢＦＮ／１ｍｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
Ｇ液：０．２ｍｇ Ｇｅｌａｔｉｎ／１ｍｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）In this specification, the following abbreviations are used.
50 mM Tris-HCl (pH 7.4): 50 mM Tris adjusted to pH 7.4 with HCl (manufactured by Nacalai Tesque), which is sterilized and filtered through a 0.2 μm γ-ray style filter (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.) BFN: Fibronectin from bovine plasma (Sigma-Aldrich)
FN solution: 0.2 mg BFN / 1
Solution G: 0.2 mg Gelatin / 1
（実施例１）
［被覆細胞の作製］
６ｗｅｌｌカルチャープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のウェル及び６ｗｅｌｌセルカルチャーインサート（ｃｏｒｎｉｎｇ社製、孔：３μｍ）を準備した。インサートに心筋細胞懸濁液（１〜１０×１０6細胞／ｗｅｌｌ）を入れた。５００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌが配置されたウェルの中にインサートを配置した。細胞をＴｒｉｓ−ＨＣｌに浸漬させた状態で、プレート及びインサートを１分間５００ｒｐｍ、ロータリーシェイカーでシェイクした。その後、インサートを引き上げ、空のウェルに配置し、１０００ｒｐｍで１０〜２０秒間シェイクしながら、インサートのメンブレンを通じてＴｒｉｓ−ＨＣｌを除去した（リンス処理）。ついで、５００μｌのＦＮ液が配置されたウェルにＴｒｉｓ−ＨＣｌを除去したインサートを配置し、細胞をＦＮ液に浸漬させた状態でプレート及びインサートを１分間５００ｒｐｍでシェイクした後。その後、インサートを引き上げ、空のウェルに配置し、１０００ｒｐｍで１０〜２０秒間シェイクしながら、インサートのメンブレンを通じてＦＮ液を除去した。これにより細胞表面にＦＮ膜を形成した（ＦＮ膜形成）。ついで、上記と同じ手順でリンス処理を行った。その後、５００μｌのＧ液が配置されたウェルにＴｒｉｓ−ＨＣｌを除去したインサートを配置し、細胞をＧ液に浸漬させた状態でプレート及びインサートを１分間５００ｒｐｍでシェイクした後、インサートを引き上げ、空のウェルに配置し、１０００ｒｐｍで１０〜２０秒間シェイクしながら、インサートのメンブレンを通じてＧ液を除去した。これにより細胞表面にＧ膜を形成した（Ｇ膜形成）。ついで、上記と同じ手順でリンス処理を行った。ＦＮ膜形成及びリンス処理と、Ｇ膜形成及びリンス処理とを交互に合計で９ステップ行い、細胞表面に（ＦＮ／Ｇ）4ＦＮ膜が形成された被覆心筋細胞を得た（被膜の厚み：およそ１０ｎｍ）。(Example 1)
[Preparation of coated cells]
A well of a 6-well culture plate (manufactured by Corning) and a 6-well cell culture insert (manufactured by Corning, hole: 3 μm) were prepared. The cardiomyocyte suspension (1-10 × 10 6 cells / well) was placed in the insert. The insert was placed in a well in which 500 μl of 50 mM Tris-HCl was placed. While the cells were immersed in Tris-HCl, the plate and insert were shaken with a rotary shaker at 500 rpm for 1 minute. Thereafter, the insert was pulled up, placed in an empty well, and shaken at 1000 rpm for 10 to 20 seconds to remove Tris-HCl through the membrane of the insert (rinse treatment). Then, the insert from which Tris-HCl was removed was placed in a well in which 500 μl of the FN solution was placed, and the plate and the insert were shaken at 500 rpm for 1 minute while the cells were immersed in the FN solution. Thereafter, the insert was pulled up, placed in an empty well, and shaken at 1000 rpm for 10 to 20 seconds to remove the FN solution through the membrane of the insert. Thus, an FN film was formed on the cell surface (FN film formation). Subsequently, a rinsing treatment was performed in the same procedure as above. Thereafter, an insert from which Tris-HCl was removed was placed in a well in which 500 μl of the G solution was placed, and the plate and the insert were shaken at 500 rpm for 1 minute while the cells were immersed in the G solution. Solution G was removed through the membrane of the insert while shaking at 1000 rpm for 10 to 20 seconds. As a result, a G film was formed on the cell surface (G film formation). Subsequently, a rinsing treatment was performed in the same procedure as above. The FN film formation and rinsing treatment and the G film formation and rinsing treatment were alternately performed for a total of 9 steps to obtain a coated cardiomyocyte having a (FN / G) 4 FN film formed on the cell surface (coat thickness: Approximately 10 nm).
［収率］
生細胞数をトリパンブルー染色及び血球計を用いた測定により求めて、収率を算出した。その結果を図１に示す。
［ＬＤＨ活性測定］
ＦＮ膜又はＧ膜を形成するごとに細胞を回収し、被膜が形成された細胞のＬＤＨ活性を測定した。ＬＤＨ活性の測定はＬＤＨ細胞毒性アッセイキットにより行った。その結果を図２に示す。[yield]
The number of viable cells was determined by trypan blue staining and measurement using a hemocytometer, and the yield was calculated. The result is shown in FIG.
[LDH activity measurement]
The cells were collected each time the FN film or the G film was formed, and the LDH activity of the cells on which the film was formed was measured. LDH activity was measured using an LDH cytotoxicity assay kit. The result is shown in FIG.
（比較例１）
１〜１０×１０6細胞の心筋細胞を遠心チューブに加え、０．０４ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１ｍＬ加えて３７℃で１分間インキュベーションした。その後、８００×ｇで１分間遠心分離を行い、上澄みを除去した（ＦＮ膜形成操作）。つぎに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１ｍＬ加えて３７℃で１分間インキュベーションした。その後、８００×ｇで１分間遠心分離を行い、上澄みを除去した（洗浄操作）。続いて、０．０４ｍｇ／ｍＬのゼラチンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１ｍＬ加えて３７℃で１分間インキュベーションした。その後、８００×ｇで１分間遠心分離を行い、上澄みを除去した（Ｇ膜形成操作）。つぎに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１ｍＬ加えて３７℃で１分間インキュベーションした。その後、８００×ｇで１分間遠心分離を行い、上澄みを除去した（洗浄操作）。ＦＮ膜形成操作及び洗浄操作と、Ｇ膜操作及び洗浄操作とを交互に合計で９ステップ行い、細胞表面に（ＦＮ／Ｇ）4ＦＮ膜が形成された被覆心筋細胞を得た（被膜の厚み：およそ１０ｎｍ）。(Comparative Example 1)
1 to 10 × 10 6 cardiomyocytes were added to a centrifuge tube, 1 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.04 mg / mL fibronectin was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 minute. Thereafter, centrifugation was performed at 800 × g for 1 minute, and the supernatant was removed (FN membrane forming operation). Next, 1 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 minute. Thereafter, the mixture was centrifuged at 800 × g for 1 minute, and the supernatant was removed (washing operation). Subsequently, 1 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 0.04 mg / mL gelatin was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 minute. Thereafter, centrifugation was performed at 800 × g for 1 minute, and the supernatant was removed (G film forming operation). Next, 1 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 minute. Thereafter, the mixture was centrifuged at 800 × g for 1 minute, and the supernatant was removed (washing operation). The FN film formation operation and the washing operation and the G film operation and the washing operation were alternately performed for a total of 9 steps to obtain a coated cardiomyocyte having a (FN / G) 4 FN film formed on the cell surface (coat thickness). : About 10 nm).
実施例１と同様にして収率及びＬＤＨ活性を測定した。これらの結果を図１及び２にそれぞれ示す。 The yield and LDH activity were measured in the same manner as in Example 1. These results are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
図１は心筋細胞懸濁液に含まれる細胞数（被膜形成に用いた細胞数）と収率との関係を示すグラフの一例であり、図２はＬＤＨ活性と被膜形成の回数との関係を示すグラフの一例である。図１に示すように、実施例１は、いずれの場合においても、比較例１と比較して収率が高かった。また、比較例１は被膜の形成工程（ステップ数）の増加と共にＬＤＨ活性が増加し、被膜形成終了（９ステップ）では被膜形成開始時（１ステップ目）よりもＬＤＨ活性が約４倍も上昇した。これに対し、実施例１ではＬＤＨ活性の増加は殆ど見られず、その増加率も１０％未満であった。つまり、実施例１の方法によれば、細胞にダメージを殆ど与えることなく被膜を形成できることが確認できた。 FIG. 1 is an example of a graph showing the relationship between the number of cells contained in the cardiomyocyte suspension (the number of cells used for film formation) and the yield, and FIG. 2 shows the relationship between LDH activity and the number of film formations. It is an example of the graph shown. As shown in FIG. 1, the yield of Example 1 was higher than that of Comparative Example 1 in each case. In Comparative Example 1, the LDH activity increased with an increase in the number of steps of forming the film (the number of steps). At the end of the film formation (9 steps), the LDH activity increased about 4 times as compared with the start of the film formation (first step). did. In contrast, in Example 1, almost no increase in LDH activity was observed, and the rate of increase was less than 10%. That is, it was confirmed that according to the method of Example 1, a film could be formed with little damage to the cells.
（実施例２）
実施例１で作製した被覆心筋細胞を用いて三次元組織体の作製を行った。２４ウェルサイズのセルカルチャーインサートに１×１０6細胞の心筋細胞を播種し、４日間培養した。得られた三次元組織体の位相差写真及びＨＥ組織切片像の一例を図３に示す。(Example 2)
Using the coated cardiomyocytes prepared in Example 1, a three-dimensional tissue body was prepared. 1 × 10 6 cardiomyocytes were seeded on a 24-well cell culture insert and cultured for 4 days. FIG. 3 shows an example of a phase contrast photograph and an HE tissue section image of the obtained three-dimensional tissue body.
（比較例２）
比較例１で作製した被覆心筋細胞を用いた以外は実施例２と同様に三次元組織体の作製を行った。得られた三次元組織体の位相差写真及びＨＥ組織切片像の一例を図３に示す。(Comparative Example 2)
A three-dimensional tissue body was prepared in the same manner as in Example 2, except that the coated cardiomyocytes prepared in Comparative Example 1 were used. FIG. 3 shows an example of a phase contrast photograph and an HE tissue section image of the obtained three-dimensional tissue body.
図３Ａは三次元組織体の位相差写真の一例であり、図３ＢはＨＥ組織切片像の一例である。図３Ａ及びＢにおいて上図が実施例２の三次元組織体であり、下図が比較例２の三次元組織体である。図３Ａ及びＢに示すように、実施例２の三次元組織体は、比較例２の三次元組織体と比較して、均一な組織を形成していることが確認できた。 FIG. 3A is an example of a phase contrast photograph of a three-dimensional tissue, and FIG. 3B is an example of an HE tissue section image. 3A and 3B, the upper figure is the three-dimensional structure of Example 2, and the lower figure is the three-dimensional structure of Comparative Example 2. As shown in FIGS. 3A and 3B, it was confirmed that the three-dimensional tissue of Example 2 formed a more uniform tissue than the three-dimensional tissue of Comparative Example 2.
（実施例３）
被覆血管平滑筋細胞および血管内皮細胞を用いて三次元組織体の作製を行った。実施例１と同様の方法で、細胞表面に（ＦＮ／Ｇ）4ＦＮ膜が形成された被覆血管平滑筋細胞を得た。２４ウェルサイズのセルカルチャーインサートに、作製した被覆血管平滑筋細胞（１×１０6細胞）を播種し、４日間培養した。得られた三次元組織体（以下、「第一の三次元組織体」ともいう）は、１０層の血管平滑筋層を有していた。さらに、この第一の三次元組織体の上に、１×１０５細胞の血管内皮細胞を播種し、４日間培養した。得られた三次元組織体（以下、「第二の三次元組織体」ともいう）を、抗ＣＤ３１抗体を用いて免疫染色した。免疫染色は従来公知の方法で行った。免疫染色の結果、第二の三次元組織体において、血管平滑筋層（１０層）の上に血管内皮細胞層（１層）が形成されていることが確認された。また、血管平滑筋層中に血管内皮細胞が混在していないことが確認された。(Example 3)
A three-dimensional tissue body was prepared using the coated vascular smooth muscle cells and vascular endothelial cells. In the same manner as in Example 1, coated vascular smooth muscle cells having a (FN / G) 4 FN film formed on the cell surface were obtained. The prepared coated vascular smooth muscle cells (1 × 10 6 cells) were seeded on a 24-well cell culture insert, and cultured for 4 days. The obtained three-dimensional tissue (hereinafter, also referred to as “first three-dimensional tissue”) had 10 vascular smooth muscle layers. Further, 1 × 10 5 vascular endothelial cells were seeded on the first three-dimensional tissue and cultured for 4 days. The obtained three-dimensional tissue (hereinafter, also referred to as “second three-dimensional tissue”) was immunostained using an anti-CD31 antibody. Immunostaining was performed by a conventionally known method. As a result of immunostaining, it was confirmed that a vascular endothelial cell layer (one layer) was formed on the vascular smooth muscle layer (10 layers) in the second three-dimensional tissue. It was also confirmed that vascular endothelial cells were not mixed in the vascular smooth muscle layer.
（比較例３）
比較例１と同様の方法で、（ＦＮ／Ｇ）4ＦＮ膜が形成された被覆血管平滑筋細胞を作製した。作製した被覆血管平滑筋細胞（１×１０6細胞）および血管内皮細胞（１×１０５細胞）を用いて、実施例３と同様の方法で、三次元組織体を得た。抗ＣＤ３１抗体を用いた免疫染色の結果、一部の血管内皮細胞が血管平滑筋層中に混在していた。(Comparative Example 3)
In the same manner as in Comparative Example 1, coated vascular smooth muscle cells having a (FN / G) 4 FN film formed thereon were produced. Using the prepared coated vascular smooth muscle cells (1 × 10 6 cells) and vascular endothelial cells (1 × 10 5 cells), a three-dimensional tissue body was obtained in the same manner as in Example 3. As a result of immunostaining using an anti-CD31 antibody, some vascular endothelial cells were mixed in the vascular smooth muscle layer.
Claims (14)
前記被覆細胞は、細胞と前記細胞表面を覆う被膜とを含み、
前記被膜の形成は、
被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる工程、及び
前記浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する工程を含み、
前記浸漬は、前記液及び／又は前記細胞を振とうしながら行うことを含み、
前記分離は、前記液透過性膜を振とうしながら行うことを含む、被覆細胞の製造方法。 A method for producing a coated cell while reducing damage to the cell, comprising forming a coating on the surface of the cell ,
The coated cells include cells and a coating covering the cell surface,
The formation of the coating,
Step of immersing cells in a liquid containing a coating component, and the step of separating the liquid containing the coating component and the submerged allowed cell by a liquid-permeable membrane seen including,
The immersion includes shaking the liquid and / or the cells,
The method for producing coated cells, comprising performing the separation while shaking the liquid-permeable membrane .
前記第１物質を含む被膜の形成は、
前記第１物質を含む第１液に細胞を浸漬させる工程、及び
前記浸漬させた細胞と前記第１液とを液透過性膜によって分離する工程を含み、
前記第２物質を含む被膜の形成は、
前記分離した細胞を前記第１物質とは異なる第２物質を含む第２液に浸漬させる工程、及び
前記浸漬させた細胞と前記第２液とを液透過性膜によって分離する工程を含む、請求項１又は２に記載の被覆細胞の製造方法。 The formation of the film includes forming a film including a first material that is a film component, and forming a film including a second material that is a film component and different from the first material,
The formation of the film containing the first substance includes:
A step of immersing cells in a first liquid containing the first substance, and a step of separating the immersed cells and the first liquid by a liquid-permeable membrane,
The formation of the coating containing the second substance includes:
A step of immersing the separated cells in a second liquid containing a second substance different from the first substance, and a step of separating the immersed cells and the second liquid by a liquid-permeable membrane. Item 3. The method for producing a coated cell according to Item 1 or 2 .
前記リンス工程は、
リンス液に前記分離工程により得られた細胞を浸漬させること、及び
前記リンス液に浸漬させた細胞と前記リンス液とを液透過性膜によって分離することを含む、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。 The formation of the coating further includes a rinsing step,
The rinsing step includes:
It immersing the cells obtained by the separation step to the rinse liquid, and separating by the cells that are immersed the rinsing liquid and the liquid-permeable layer on the rinsing liquid, either of claims 1 to 4 The production method described in 1.
細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び
前記被覆細胞を三次元に配置することを含み、
前記被覆細胞の形成は、請求項１から８のいずれかに記載の被覆細胞の製造方法により行う、三次元組織体の製造方法。 A method for producing a three-dimensional structure, comprising:
Forming a coated cell having a coating formed on the surface of the cell, and arranging the coated cell three-dimensionally,
A method for producing a three-dimensional tissue , wherein the formation of the coated cells is performed by the method for producing coated cells according to any one of claims 1 to 8 .
被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させる手段、及び
浸漬させた細胞と前記被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離する手段を含む、装置。 An apparatus for performing the method for producing a coated cell according to any one of claims 1 to 8 ,
Means for immersing the cells in a liquid containing a coating component, and
An apparatus, comprising: means for separating a cell containing the immersed cells and a liquid containing the coating component by a liquid-permeable membrane.
被覆細胞を三次元に配置する手段
を含み、
前記被覆細胞は、請求項１から８のいずれかに記載の被覆細胞の製造方法によって形成されたものである、装置。 An apparatus for performing the method for manufacturing a three-dimensional tissue according to claim 12 ,
Including means for arranging the coated cells in three dimensions,
An apparatus, wherein the coated cells are formed by the method for producing coated cells according to any one of claims 1 to 8 .
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