JP6705754B2 - Ｄｈａの製造のための塩化物及びナトリウムを含有しない培地中におけるオーランチオキトリウム属の微細藻類を培養する方法 - Google Patents

Description

本発明は、オーランチオキトリウム マングローベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）属のスラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）の細胞を培養する方法に関する。該方法は、高収量のバイオマス及び脂質中、とりわけドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）中でこのように培養された原生生物の濃縮を得ることを可能にする。本発明は、低含有量のナトリウムイオン（Ｎａ^＋）及び塩化物イオン（Ｃｌ⁻）を有する化学的に定義された培地で、高細胞密度のＤＨＡリッチのスラウストキトリドの生産を可能にする培養方法の開発に関する。

本発明は、オーランチオキトリウム属に属するスラウストキトリドのみに関する。この属は、遺伝的、代謝的及び生理学的特性評価によって区切られる。

ナトリウムイオン（Ｎａ^＋）又は塩化物イオン（Ｃｌ⁻）を有意に添加することなく、細胞を培養する培養方法は、オーランチオキトリウム マングローベイの高密度細胞生産−乾燥物約１２５〜１４０ｇ／Ｌ−を可能にする。当該バイオマスは、ＤＨＡリッチであって、１５〜２０ｇ／Ｌの培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）、好ましくは２０〜２５ｇ／Ｌの培養物、あるいは２５〜３０ｇ／Ｌの培養物レベルを有する。

非常に少量の塩化ナトリウムが、当該方法に必要な培地に存在し、特に、塩化物イオン（Ｃｌ⁻）及びナトリウムイオン（Ｎａ^＋）である。従って、培地中には、１ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．２ｇ／Ｌ未満の塩化物イオン、及び１００ｍｇ／Ｌ未満、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ未満のナトリウムイオン（Ｎａ^＋）が存在する。これにより、培地と接触して機器に必要な余分な投資支出を回避し、かつ、実質的に廃液を処理するコストを削減すること、バイオマス中の塩化物塩又はナトリウム塩の存在に関連する欠点を回避すること、及び、インプット（収量を向上するために培養物に添加される製品）を削減することで該培地のコストを削減することを可能とする。

前文

特定の種は、大量の脂質、特に多価不飽和脂肪酸を蓄積又は分泌することができるため、原生生物は現在、数多くの工業的事業の対象である。

多価不飽和脂肪酸のうち、オメガ−３シリーズ（ＰＵＦＡ−ω３）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ又はＣ２０：５ ω３）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ又はＣ２２：６ ω３）、並びにオメガ−６シリーズ（ＰＵＦＡ−ω６）、特にアラキドン酸（ＡＲＡ又はＡＡ又はエイコサテトラエン酸Ｃ２０：４ ω６）の特定の高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡｓ）は、栄養上重要であり、治療適用の面で強力な可能性を秘めていることが認識されており、。

必須栄養素とみなされるＤＨＡは、細胞の正常な機能発達に必要であり、様々な生化学的プロセス及び機能に重要な役割を果たしている。細胞膜への組み込まれることにより、中枢神経系の発生や網膜機能に必須であり、視力や記憶に関与するメカニズムの獲得及び十分な維持に重要な役割を果たしている。

スラウストキトリド類（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）、特にオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）は、従属栄養的に培養した場合にＤＨＡを産生することが知られている［Ｗ．Ｋ．Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｉｃｒｏａｌｇａ，Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ＫＲＳ１０１．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．：１６４（８）：１４６８-８０］。オーランチオキトリウムはまた、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、β-カロテンやフェニコキサンチン（ｐｈｏｅｎｉｃｏｘａｎｔｈｉｎ）などのカロテノイドを生産することが知られている［Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｒ，Ｈｏｎｄａ，Ｄ．（２００７）Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ａｎｄ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ， Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）：ｅｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｎｄ ｅｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｎｄ Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｇｅｎ．ｎｏｖ．；Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．４８，ｐｐ．１９９-２１１］。

工業的規模で原生生物による脂肪酸の生産を実現するには、採算性のある製造を実施するためのいくつかの要因を考慮しなければならない。これらの要因のうち、以下のことが挙げられる：

−原材料費用及び機器費用（購入又はリース、及びそのメンテナンス）、並びに人件費；
−生産の技術要件：例えば、前培養及び培養工程の数及び技術的な困難性、培養のオンライン監視、及び製品を付加価値化するための培養物由来のバイオマスを処理する工程；
−培養により得られる廃液（ｅｆｆｌｕｅｎｔ）の処理。

現在、従属栄養的に又は混合栄養的に、スラウストキトリド科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ ｆａｍｉｌｙ）の原生生物の培養に現在使用されている培地は、多くの量の塩、特に塩化ナトリウムを含んでいる。一例として、培地ＡＴＣＣ培地番号７９０（１１ｇ／ＬのＮａ^＋及び１９ｇ／ＬのＣｌ⁻）を挙げることができる。

対象の油及び／又は他の分子を製造する方法において、スラウストキトリド科の海洋原生生物を培養するための塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の使用は、投資及び廃液処理の点でかなり余分な支出を含み、副産物の価格設定（ｖａｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ）を制限する。

実際には、塩化物イオンは、発酵槽の製造に使用される材料であるステンレス鋼、培地の調整及び滅菌に使用する動物、及び微細藻類を培養して得られたバイオマスを処理するための他の機器の劣化を引き起こする。この現象の１つの結果は、バイオマス生産及び処理（下流の処理、又はＤＳＰ）に使用される道具の早期劣化である。

当該劣化問題を回避するために、塩化物イオンに対してより耐性がある、特に合金製の装置を使用することができる。より高い塩耐性を有するこれらの材料は、高価である。この場合、生産投資コストが実質的に高くなる。

また、塩化ナトリウム（又は他のナトリウム塩、例えば、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウムタイプ）の使用は、廃液処理、特に塩水脱塩の点で、かなり余分な支出を招く。

最後に、油抽出後に残存するバイオマスで構成される油かす型副産物中のナトリウム塩の存在が、特に動物飼料用、魚の養殖用、又は化粧品用成分若しくは製薬業界における成分としての物価設定をより困難にしている。

米国特許第５５１８９１８号は、塩化ナトリウムと他のタイプのナトリウム塩（硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、等）との置換について述べている。それは例えステンレス鋼の機器の早期摩耗を回避することが可能であっても、培地へナトリウム塩を添加することは、廃液処理に関連する追加コストも、上述の副産物の物価設定の問題も回避することができない。

また、ＮａＣｌと他のナトリウム塩の置換は、代替塩の購入に関連する追加費用を招く。

Ｙｏｋｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．の表題「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ ＳＲ２１」の論文（（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．４９，ｐｐ．７２−７６）において、スキゾキトリウム リマシヌム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＳＲ２１株の塩条件に対する耐性について研究された。当該株は、高塩濃度に対して広く耐性を有しており、その濃度は海水の５０％〜２００％であった。塩を含まない培地における該株の増殖は、５０％の海水を含む培養の半分であった。本発明者らは、この研究で使用した基礎培地もまた、３％グルコース及び１％酵母抽出物を含むことに注目する。「塩を含有しない」又は「低濃度」の塩を含む、特許請求の範囲の培地は、米国特許第８，９００，８３１に記載されている。しかしながら、Ｙｏｋｏｓｈｉらにおいては、酵母抽出物の添加は、微細藻類の増殖に必要とされる。しかしながら、酵母抽出物を補充したこのような培地は、３０ｍｇ超の塩化物塩及びナトリウム塩を含有する。

しかも、酵母抽出物の添加は、培地の追加コストを意味し、食品又は医薬品として使用する最終的なバイオマスの品質の点でも不利である。酵母抽出物は、標準化された製品ではなく、従って、酵母抽出物のバッチは均質ではない。これは、酵母抽出物を含む培地のバイオマス由来の最終製品の均一性に影響を与える。

Ｓｈａｂａｌａ ｅｔ ａｌ．（「Ｏｓｍｏｔｉｃ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｏｄｉｕｍ ｉｎ ｍａｒｉｎｅ ｐｒｏｔｉｓｔ ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ」（２００９）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１１（７），ｐｐ．１８３５−１８４３）は、スラウストキトリウムが、このナトリウムを含まない培地の浸透圧調整を可能にするマンニトール又はスクロースのような化合物が補充された培地が提供された、低ナトリウム含量（１ｍＭ）培地中において増殖できることを示した。しかし、後者の化合物の存在が、これらの材料コストに関連する余分な支出をもたらす。また、培地の浸透圧を調節する化合物を添加したにもかかわらず、塩を含まず、かつ、マンニトールを含むものから得られたバイオマス収率（ミリリットルあたり２００，０００細胞）は、ＤＨＡの工業的生産には不十分なままである。

Ｓｈａｂａｌａ ｅｔ ａｌ．による最近の論文「Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ ｃａｎ ｂｅ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｌｏｗ−ｓａｌｔ ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＰＵＦＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）１５：４３７-４４４）では、ＯＵＣ８８と名付けられた、スキゾキトリウム リマシヌムＳＲ２１のＵＶ誘発ランダム突然変異誘発により変異体が得られ、脂肪酸組成の変化を誘導する環境因子を決定する試験が行われた。当該論文の図２は、塩濃度が０．９％を下回った場合、バイオマス及び脂質の量が大幅に減少することを示している（バイオマス中２０ｇ／Ｌ未満、及び、脂質中の１０ｇ／Ｌ未満）。

鋼の機器の摩耗に関する問題を回避する一方で、発酵の生産コスト並びに得られたバイオマス処理を減らし、製造される脂肪酸の収率を増加させるための最適な条件でスラウストキトリド類を培養できることが望ましい。特に、他の培地成分を添加することなしに、廃液の処理に関する余分な支出並びに追加のＤＳＰ工程及び最終製品の物価設定の問題に関する余分な支出をもたらしうる培地中のナトリウムイオン及び塩化物イオンを減少させ、実質的に除去することを可能にする、オーランチオキトリウムを培養する方法を提供することが望ましい。

本発明の文脈において、ＤＨＡの工業生産に十分なバイオマス及び脂質の収率を得ることが望ましい。従って、例えば、１００ｇ／Ｌ超の乾燥物、好ましくは、１３０ｇ／Ｌ超の乾燥物、より好ましくはさらに１５０ｇ／Ｌ超の乾燥物であることが望ましい。従って、例えば、乾燥物の総重量との関係で４０％超の脂肪酸、５０％もの脂肪酸が得られることが好ましい。また、例えば、乾燥物の総重量との関係で３０％超、４０％ものＤＨＡが得られることが好ましい。

従って、多数の株のスクリーニング実験の結果、出願人は、Ｓｈａｂａｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の論文で定義されたような、ナトリウムも、塩化物も、酵母抽出物などの有機物供給源（ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｕｒｃｅ）も、マンニトール若しくはスクロースなどの浸透剤（又はソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の他の浸透剤）も添加すること無しに、化学的に定義された培地中で成長可能なオーランチオキトリウム属の原生生物の株を同定することに成功した。

本発明の条件下で培養されたこれらの株は、高収率のバイオマス（１１０ｇ／Ｌ超、好ましくは１２０ｇ／Ｌ）及び多価不飽和脂肪酸（１５ｇ／Ｌ超、好ましくは２０ｇ／Ｌ）、好ましくはＤＨＡの産生を得ることを可能とする。

単離され且つ選択されたオーランチオキトリウム株の代表種である、本発明に関連する１つの株（ＦＣＣ１３２４）は、ブダペスト条約の規定に従って、２０１３年６月２１日にアクセッション番号ＣＣＡＰ４０６２／１でＣＣＡＰ（海洋科学スコットランド協会 藻類及び原生動物微生物保存機関（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｚｏａ，Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ダンスタッフナージ（Ｄｕｎｓｔａｆｆｎａｇｅ）海洋研究所、オーバン、アーガイル ＰＡ３７１ＱＡ、スコットランド、英国）に寄託した。

図１：小サブユニットリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列間の関係を示す系統解析。配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷのＭｅｇａ５．１で整列させた。分析は、最大尤度法（ｍａｘｉｍｕｍ-ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて実施した。本研究で用いたスラウストキトリド株は以下の属に属する：オーランチオキトリウム マングローベイ、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）及びシゾキトリウム アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、ウルケニア ビスルジェンシス（Ｕｌｋｅｎｉａ ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ウルケニア属（Ｕｌｋｅｎｉａ ｓｐ．）、ウルケニア プロフンダ（Ｕｌｋｅｎｉａ ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ボトリオキトリウム属（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）、ボトリオキトリウム ラジアツム（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍ）、パリエチキトリウム属（Ｐａｒｉｅｔｉｃｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）、パリエチキトリウム サルカリアヌム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｙｔｒｉｕｍ ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍ）、アプラノキトリウム ケルグエレンス（Ａｐｌａｎｏｃｈｔｙｔｒｉｕｍ ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｅ）、アプラノキトリウム ストッチノイ（Ａｐｌａｎｏｃｈｔｙｔｒｉｕｍ ｓｔｏｃｃｈｉｎｏｉ）、オブロギキトリウム ムルチルジメンタ（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、オブロギキトリウム属（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）及びフィトフトラ インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）。ブートストラップ値が７５％より高い場合、ブートストラップ値は有意とみなされる。 図２：三角フラスコにおける低Ｎａ^＋及びＣｌ⁻含有量のＦＣＣ−Ｍ培地を用いた増殖試験。本発明の実施形態に係る培地における、本発明の株（黒）及び本発明に関連しない株（灰色及び線）の増殖の比較。各株の列の長さは、吸光度を表す（実施例１）。 図３：三角フラスコ中で培養した様々なスラウストキト株の脂肪酸プロファイル（実施例２）。（Ａ）及び（Ｂ）：オーランチオキトリウム リマシヌム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）のメンバーであるオーランチオキトリウム マングローベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）（パネルの最初の３行）、及び、ＡＴＣＣ２０８８８株を含むシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）並びにオーランチオキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）株ＳＥＫ２１７及びＳＥＫ２０９（パネルの最後の３行）によって例証された、本発明の属間の脂肪酸プロフィールの比較。培養条件は、実施例２に記載されている。 図４：バイオリアクターで培養した様々なスラウストキトリド株の脂肪酸プロファイル（実施例３及び４）。（Ａ）及び（Ｂ）：本発明の株の脂質プロフィール。（Ａ）多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の合計との関係でパーセンテージとして表したＰＵＦＡ。（Ｂ）総飽和脂肪酸との関係でパーセンテージとして表した飽和酸。ＫＯＨ又はＮＨ_４ＯＨによりｐＨを調整した培養物は、それぞれ、略語（ＫＯＨ）又は（ＮＨ_４ＯＨ）で同定した。培養条件は、実施例３及び４に記載されている。

詳細な説明

「株」とは、本発明で定義されたオーランチオキトリウム属の天然株のみならず、前記天然株の変異体も意味する。

「化学的に定義された」とは、化学組成が公知であり、且つ、製品又は混合物を構成する各要素も公知である、任意の製品又は製品の混合物を意味する。

「化学的に定義された培地」とは、各要素の含有量が公知である培地、すなわち、天然状態及び各構成成分の固定濃度がない両方状態で組成物が変わる、酵母抽出物又は他のタンパク質の複合供給源又はペプトンなどの有機物又は他の複合成長剤を有しない、培地を意味する。

「浸透圧調節剤」とは、培地中で浸透圧を維持することを可能にする、培地中に存在する薬剤を意味する。

「遺伝的同一性」とは、ＢＬＡＳＴ型ソフトウェアによって評価されるような、２つのＤＮＡ配列間の同一性を意味する。

従って、本発明は、（Ｎａ^＋）と塩化物（Ｃｌ⁻）を実質的に含まない有機培地における従属又は混合栄養モードのオーランチオキトリウム マングローベイ及びオーランチオキトリウム リマシヌム型の特定の原生生物を培養する方法を目的とする。この培養方法は、高収率のバイオマス、脂質、特にＤＨＡを得ることを可能とする。

本発明に関係する株は、化学的に定義された培地中で、有意な量の塩化物イオン又はナトリウムイオンを添加することなく、また、例えばマンニトール、ソルビトール又はポリエチレングリコールのような浸透圧調節剤の添加なしに、高密度で増殖する能力を有する。それらは、近年の系統発生的分類によれば、ＤＨＡを産生することが知られるオーランチオキトリウム マングローベイ及びオーランチオキトリウム リマシヌム型のスラウストキトリド株である（Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｕｌｋｅｎｉａ ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ａｎｄ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ，Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）：ｅｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｌｋｅｎｉａ ａｎｄ ｅｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ，Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ．Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ．４８（６）ｐ．３２９-３４１；Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｒ．，Ｈｏｎｄａ，Ｄ．（２００７） Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ （Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ，Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ，ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）：ｅｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｎｄ ｅｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｎｄ Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｇｅｎ．ｎｏｖ．Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ４８，１９９-２１１； Ｔｓｕｉ ＣＫ，ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｇａｉｎ ｏｆ ｅｃｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｇｌｉｄｉｎｇ．Ｍｏｌ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌ．５０（１）：ｐ．１２９-４０）。

通常、これらの微細藻類属の従属栄養培養は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、培地ＡＴＣＣ ７９０ Ｂｙ＋（１．０ｇの酵母抽出物、１．０ｇのペプトン、５．０ｇのＤ（＋）グルコース及び１Ｌの海水）で使用されるような、海水ベースの培地で実施されたことを想起すべきである。

株は、遺伝子的に、並びにそれらの脂質プロファイルによって特徴付けられる。

本発明に関する株は、該発明の株、ＦＣＣ１３２４株の代表株の遺伝子に対して、４つの遺伝子、１８ｓ、アクチン、チューブリン及びＥＦ１−αの遺伝的同一性を特徴としている。ＦＣＣ１３２４株は、単離され、選択された新規オーランチオキトリウム株の代表種であり、ブダペスト条約の規定従って、２０１３年６月２１日にアクセッション番号ＣＣＡＰ４０６２／１でＣＣＡＰ（海洋科学スコットランド協会 藻類及び原生動物微生物保存機関、ダンスタッフナージ海洋研究所、オーバン、アーガイル ＰＡ３７１ＱＡ、スコットランド、英国）に寄託した。

表１（ａ）は、オーランチオキトリウム マングローベイ属及び遺伝的に最も近いシゾキトリウム属、並びに、他の遺伝的に近い株の間の４つの遺伝子の配列の比較である。比較した遺伝子によれば、ＣＣＡＰ４０６２−１株の遺伝子と９１％〜１００％の間の同一性を有する配列をもつ全ての株は、オーランチオキトリウム属とみなすことができる。関係するＣＣＡＰ４０６２−１ １８ｓ遺伝子と少なくも９２％の遺伝的同一性は、本発明の株を特徴づけている。

１８ｓ遺伝子（配列番号１）と少なくとも９２％のの遺伝的同一性を有する株が本発明に関係し、低ナトリウム、低塩化物培地中で増殖する可能性がある。出願人はまた、このようにして１８ｓ遺伝子の遺伝的同一性によって定義したこれらの株は、アクチン遺伝子（配列番号２）に対して少なくとも９６％、チューブリン遺伝子に対して少なくとも９１％（配列番号３）及びＥＦ１−α遺伝子（配列番号４）に対して少なくとも９５％の遺伝的同一性を有している。これらのパーセンテージ同一性を表１（ｂ）に表す。

図１は、本発明の株のこの定義を導く系統解析を示している。

本研究で用いたスラウストキト株はオーランチオキトリウム マングローベイ属、シゾキトリウム属及びシゾキトリウム アグレガツムのメンバーである。

配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ ＷのＭｅｇａ５．１で整列させた。図中の分岐にある数字は、ブートストラップ値である。

７０％のブートストラップ値は、有意な２つの群間の分岐の下限とみなされる。Ｈｉｌｌｉｓ Ｄ．Ｍ．及びＢｕｌｌ Ｊ．Ｊ．の論文「Ａｎ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｂｏｏｔｓｔｒａｐｐｉｎｇ ａｓ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」（（１９９３）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１８２-１９２）によれば、７０％超のブートストラップ割合は、通常、対応するクレード（グループ）が本物である少なくとも９５％の確率と一致する。

図１では、２つのグループに分離するノードが１００％の値を有しているので、Ａ．マングローベイ及びシゾキトリウム属との間の差は有意であり、従って２つの異なる属が存在することを意味している。これらの２つの群は、Ｙｏｋｏｙａｍａ及びＨｏｎｄａ（（２００７），Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ａｎｄ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ （Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ， Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）：ｅｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｎｄ ｅｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｎｄ Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ ｇｅｎ．ｎｏｖ．；Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．４８，ｐｐ．９９-２１１）で既に示されたように、シゾキトリウム アグレガツムとは非常に離れている。

図１では、本発明に関する株は、図の上部の最初のグループの株であり、オーランチオキトリウム マングローベイという名称を有している。

本発明に関する株の例としては、発明者らによって同定されたように分類された系統学的クラスにおいて、オーランチオキトリウム属ＳＤ１１６（ＪＸ８６３６７２）、オーランチオキトリウム リマシヌム（ＡＢ０２２１０７）、オーランチオキトリウム マングローベイ（ＤＱ３６７０４９）、オーランチオキトリウム リマシヌム ＳＬ１１０１（ＪＮ９８６８４２）、オーランチオキトリウム リマシヌム（ＪＮ９８６８４２）、オーランチオキトリウム属ＬＹ２０１２（ＪＸ８４７３７０）、オーランチオキトリウム リマシヌム（ＨＭ０４２９０９）及びオーランチオキトリウム属ＢＬ１０（ＦＪ８２１４７７）株を挙げることができる。括弧内の数字はアクセッション番号である。

実際に、それぞれのこれらの株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４に対してＣＣＡＰ４０６２／１株の配列とそれぞれ少なくとも９２％、９６％、９１％及び９４％のパーセンテージ同一性を有している。

例えば、配列番号１と９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の遺伝的同一性を有するオーランチオキトリウム属の株は、本発明に関するものである。これらの株もまた、配列番号２と９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の遺伝的同一性、配列番号３と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の遺伝的同一性、及び、配列番号４と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の遺伝的同一性を有している。

表１（ａ）は、ＣＣＡＰ４０６２／１と、本発明に関する又は関係しない株との遺伝的同一性の比較を詳細に示す。

シゾキトリウム属ＡＴＣＣ２０８８８株（ＤＱ３６７０５０）も、ＦＣＣ１４１２株シゾキトリウム属ＳＥＫ２０９（ＡＢ２９０５７４）も、本発明に関する株のメンバーではないことに留意する。これらの株の配列番号１へ同一性値は９１％である。

これらの株は、非常に少量の塩化ナトリウムを有する化学的に定義された培地中（すなわち、酵母抽出物又は他のタンパク質抽出物の非存在下）で、高密度で増殖する能力を有する。この培地は、３．５ｇ／Ｌ未満、好ましくは１ｇ／Ｌ未満、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌ未満のナトリウムイオンと、１ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．２ｇ／Ｌ未満の塩化物イオンを含むことを特徴としている。

実施例１において、出願人は、そのような培地中（主培地の表２（ａ）を参照）で、本発明の株並びに本発明に関係しない比較株を用いて、三角フラスコにて増殖試験を行った。培養物は、無機窒素（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、炭素源としてのグルコースの存在下で、有機窒素源の供給無しで調製した。従って、図２はこれらの実験の結果を示す。結果は、全てのオーランチオキトリウム マングローベイ株が、試験した他のスラウストキトリド属、シゾキトリウム属及びシゾキトリウム アグレガツムとは異なり、この培地上で増殖する能力を有していることを示している。

本発明の株は、１８Ｓ、アクチン、チューブリン及びＥＦ１−α遺伝子に対して、ＦＣＣ１３２４株の少なくともそれぞれ９２％、９６％、９１％及び９５％の遺伝的同一性を有していることに留意されたい。

本発明に関係する株は、それらの脂質プロフィールによっても特徴付けられる。ＣＣＡＰ ４０６２／１株は、本発明の株の例及び代表として挙げられる。

図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は、二つの異なる属の株の間の脂肪酸プロファイルの比較を示す。本発明の属は、オーランチオキトリウム リマシヌムがその一部であるオーランチオキトリウム マングローベイ（各パネルの最初の３行）、ＡＴＣＣ２０８８８株を含むシゾキトリウム属並びにオーランチオキトリウム属ＳＥＫ２１７及びＳＥＫ２０９（各パネルの最後の３行）で図示された。オーランチオキトリウム マングローベイ属の脂質プロファイルは、実施例２に記載された本発明の実施形態の培養条件において、大部分がＤＨＡを有する（全ＰＵＦＡの８０％以上）。

図３（Ａ）において、ＡＴＣＣ２０８８８株、オーランチオキトリウム属ＳＥＫ２１７及びＳＥＫ２０９は、本発明の株との関係で、より多くのＥＰＡを有する異なるプロファイルを有することがわかる。

ＤＰＡ（ｎ−６）は、少量のＡＡ及びＥＰＡを有する総ＰＵＦＡの約２０％を示す（図３（Ａ）参照）。ＣＣＰＡ４０６２／１株と遺伝的類似性を有する他の株もまたこのプロファイルを示す。

図３（Ｂ）は、ＡＴＣＣ２０８８８株、オーランチオキトリウム属ＳＥＫ２１７とＳＥＫ２０９が、少ないパルミチン酸と、より多い量の奇数脂肪酸Ｃ１５：０及びＣ１７：０とを有する異なる飽和脂肪酸プロファイルを有することを示す。

図４（Ａ）は、総多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）に関連するパーセンテージで表したＰＵＦＡを示す。図４（Ｂ）は、総飽和脂肪酸に関連してパーセンテージで表された飽和脂肪酸を示す。そのｐＨがＫＯＨ又はＮＨ_４ＯＨで調整された培養物は、それぞれ略語（ＫＯＨ）又は（ＮＨ_４ＯＨ）により同定された。プロファイルは、培養条件に応じて、事実上変化がないままである。ＤＨＡは、大部分の多価不飽和脂肪酸であり、総不飽和酸の約８０％である。Ｃ１６：０は、実施例３及び４に記載された発明の実施形態の培養条件において、大部分の飽和脂肪酸を残存し、総飽和酸の９０％超である。

従って、本発明者らは、本発明に関連する株を定義した。これらの株は、有意な量のナトリウム又は塩化物を添加することなく、化学的に定義された培地中で高密度に増殖する能力を有している。

これらの株の培養は、一般的に従属栄養モードにて実施される。

本発明の化学的に定義された培地は、微生物の成長に必要な炭素源、窒素源及び塩を含んでいる。当業者は、発酵プロセスにおいて微生物の成長に必要な要素を熟知している。

本発明の好ましい実施形態によれば、炭素源は、グルコース及びグリセロールから選択される化学的に定義された供給源（ｓｏｕｒｃｅ）、好ましくはグルコースである。

培地中の炭素源の含有量は、有利には１０〜９０ｇ／Ｌ、又は１０〜７５ｇ／Ｌである。

窒素源は、有利には、酵母抽出物又はタンパク質抽出物の混合物などの窒素を含有する任意の複雑な有機物質を除く、化学的に定義された無機又は有機源である。

好ましくは、窒素源はアンモニウム塩、特に硫酸アンモニウム、及び/又は硝酸塩、特に硝酸カリウムである。

培地中の窒素源の含有量は、有利には、１〜１０ｇ／Ｌの間である。

主培地は、本発明の微細藻類を培養するために当業者に知られている他のすべての成分を含んでいてもよい。培地は、一般に、化学的に定義された無機塩、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属塩、並びに他の金属の塩を含有する。例えば、Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｏ又はＺｎ塩に言及することができる。例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、又は硫酸銅、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛などの硫酸塩に言及することができる。また、カリウム酸リン酸塩などのリン酸塩、又は炭酸カルシウムなどの炭酸塩に言及することができる。また、塩化コバルト、塩化マンガン、塩化カルシウム等の塩化物に言及することができる。また、アルカリ金属酸化物に言及することができる。また、モリブデン酸ナトリウム及び亜セレン酸ナトリウムなどの亜セレン酸塩及びモリブデン酸塩に言及することができる。他の使用可能な無機塩は、例えば、臭化カリウム又はヨウ化カリウムなどのハロゲン化物である。

培地中の種々の塩の含有量は、成長の点で微生物のニーズに依存する。特定の塩は、亜鉛、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン、ニッケル又は銅塩などの微量元素の供給源として少量でのみ使用される。

本発明の方法のための特に好ましい培地は、必要であれば、他のような要素、例えば、栄養成分などの硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、ホウ酸カリウム及びリン酸からなる群から選択される少なくとも一つの塩とは別に含む。塩（単数又は複数）は、超過された本発明の全塩の含有量が用いられることなく追加される。硫酸マグネシウム、塩化カルシウム及びリン酸カリウムが培地に添加された場合は特に好ましい。

有利なことに、イオンの含有量は、表２（ａ）に詳述した範囲に含まれる。

すべての場合において、培地中のこれらの塩の状態及び割合は、ナトリウムイオンの含有量が３．５ｇ／Ｌ未満、好ましくは１ｇ／Ｌ未満、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌ未満であり、かつ、塩化物イオンの含有量が１ｇ／Ｌ未満、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２００ｍｇ／Ｌであるよう選択される。

本発明の好適な実施形態によれば、培地はまた、アミノ酸、プリン、ピリミジン、化学的に定義されたビタミンなどの付加的なマクロ又はマイクロ栄養素、すなわち、酵母などのような複合源による培地において供給されるマクロ又はミクロ栄養素以外を含んでいる。一般に、培地（ｍｅｄｉｕｍ）は、当業者に公知の他の培地成分を含んでいる。必要であれば消泡剤を添加してもよい。しかし、培地は、化学的に定義できない複雑な構成成分は含んでいない。

ビタミンは、有利には、チアミン、ビタミンＢ１２、パントテン酸及びそれらの混合物から選択される。

培地中のビタミン含有量は、有利には、表２（ａ）に記載の値の間である。

本発明の好適な実施形態によれば、化学的に定義された培地は、化学的に定義された炭素源、化学的に定義された窒素源、塩、及び化学的に定義されたビタミンの混合物からなる。

この培地は、発酵槽において、有利には少なくとも１０００リットル発酵槽において、特にいわゆる「バッチ」不連続モード、いわゆる「フェドバッチ（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）」半連続モード、又は連続モードの培養に特に適していることに留意されたい。

本発明の実施形態に係る培地の例は、以下の表２（ｂ）のように定義される。

本発明の実施形態に係る培地の例は、以下の表２の（ｃ）のように定義されている。ＦＣＣ−Ｍという名前のこの培地は、０．０００３８ｇ／Ｌのナトリウム（Ｎａ^＋）及び０．４３７ｇ／Ｌの塩化物（Ｃｌ⁻）を含む。培地は、添加されたＮａＣｌは含まない。

従来、バイオリアクター又は発酵槽において、従属又は混合栄養条件下で、本発明に係る株の培養中、基礎培地は、微細藻類の増殖を維持するために添加溶液が添加される。炭素含有基質、例えばグルコースが添加されてもよい（添加溶液２）。当業者は、添加溶液の各成分の濃度を決定する方法を知っている。例えば、各成分の含有量は、一例として、下記の表３（ａ）に示され。

このような添加溶液の例が表３（ｂ）に示されている。

本発明の実施形態によれば、培養が発酵槽又はバイオリアクターで実施される場合、典型的には、細胞増殖を維持するために追加の溶液を添加した後、最終的なＮａ^＋濃度は、約１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは６ｍｇ／Ｌ未満、及び、最終的なＣｌ⁻濃度は、約２５０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ未満である。

本発明の別の実施形態によれば、培養が三角フラスコ中で実施される場合、Ｎａ^＋終濃度は、５ｍｇ／Ｌ未満、好ましくは２ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ未満、及び、Ｃｌ⁻終濃度は、約１ｇ／Ｌ、好ましくは０．７５０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは０．５ｇ／Ｌ未満である。

一般に、培養の過程において、有機炭素含有基質の添加は、細胞に高濃度の脂質を蓄積させるために実施される（例えば、表３（ａ又はｂ）の添加溶液２を参照）。追加の基質（添加溶液２）は、培養プロセスの間に十分な濃度を維持するために培地に添加される。この有機炭素含有基質は、純粋な形態にて又は混合にて：グルコース、セルロース誘導体、スクロース及び／又はグリセロールを優先的に含む。有機基質濃度は、一般的に２００ｍＭ〜５００ｍＭである。

培地中に含まれる有機炭素含有基質は、複合分子又は基質の混合物から構成されてもよい。小分子からなる、例えばトウモロコシ、小麦又はジャガイモのデンプンの生体内変換由来の生成物、特に澱粉加水分解物は、例えば、本発明の原生生物の従属又は混合栄養培養に適した有機炭素含有基質を構築する。

培養中、ｐＨは４〜８の間、温度は２０〜３０℃の間、及び、溶存酸素濃度が典型的には５％〜３０％の間で調整される。

この方法は、該培養から得られるバイオマス収量を増加させるという利点を有する。それはまた、従って多価不飽和脂肪酸、より具体的にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）中で培養された原生生物を濃縮するという利点を有する。

本発明の実施形態によれば、前培養は、少量のＮａＣｌを有する培地、例えば、窒素源として酵母抽出物、及び例えば炭素源としてのグルコースを含む、培地ＦＣＣ−Ｍで調製される（表２（ｃ））。インキュベーション期間後、例えば４８時間後、細胞を遠心分離し、細胞ペレットを、少量のＮａＣｌを含有する培地、例えば、酵母抽出物も他の無機又は有機窒素源も含まない、ＦＣＣ−Ｍでリンスする。この操作の目的は、前培養中の酵母抽出物の存在を介した、主培養物中の任意のＮａ^＋の供給を回避することであり、一般に、主要溶液の培養体積の１／１００（ｖ／ｖ）と一致する。

本発明の単離されたオーランチオキトリウム株は、かなりの量のバイオマスの量のみならず、脂質、ＤＨＡが豊富である脂質を生産することを可能にする。実際、従属又は混合栄養条件における本発明の方法は、１００ｇ／Ｌ超、好ましくは１２０ｇ／Ｌ超のバイオマス収量を得ることを可能にするものであり、該バイオマスは、乾燥物の重量に対して５０％〜６０％の脂質を有する。ＤＨＡは、原生生物に含まれる全脂肪酸の１５％超、又は２０％超、又は３０％超を表すことができる。本発明の実施形態の原生生物は、従って、ＤＨＡ生産性（時間あたりの培養１リットル当たり産生される目的生成物の量）が、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／時、好ましくは少なくとも０．２ｇ／Ｌ／時、及びより好ましくは少なくとも０．３ｇ／Ｌ／時であってもよい。

本発明の方法はさらに以下の工程を含む：
ａ）従属栄養条件において、特に、配列番号１と少なくとも９２％の遺伝的同一性有するオーランチオキトリウム属の、１以上のラビリンチュロマイセテス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）株を、１ｇ／Ｌ未満、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ未満のナトリウム（Ｎａ^＋）、及び１ｇ／Ｌ未満、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ未満の塩化物（Ｃｌ⁻）を含有する化学的に定義された培地中で培養し、
ｂ）数世代にわたって前記培養物を維持する工程、
ｃ）このように培養されたバイオマスを回収する工程。

「回収する工程」とは、より具体的には、前記世代の間で細胞の株が最も増加した株（単数又は複数）を単離することを意味する。

該方法はまた、追加の工程を含んでもよい：
ｄ）該株の該脂質を回収する工程、及び任意に、
ｅ）該回収された脂質からＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）を抽出すること。

工程（ａ）の株は、配列番号２の配列と少なくとも９６％の遺伝的同一性、及び／又は配列番号３の配列と少なくとも９１％の遺伝的同一性、及び／又は配列番号４の配列と少なくとも９５％の遺伝的同一性を有していてもよい。

本発明の培養方法は、バイオマス、脂質、特にＤＨＡの生産性及び高い収率を損なうことなく、低レベルのナトリウム及び塩化物を有する培地中で、これらのオーランチオキトリウム株の培養物を調製することを可能とする。従って、細胞の培養や、得られたバイオマスを処理するために使用される発酵槽や他のステンレス鋼製装置の劣化、並びに、バイオマス生産と処理（下流の処理、又はＤＳＰ）に使用されるツールの腐食による早期劣化が回避される。

本発明はまた、本発明に係るＤＨＡリッチな株の高細胞密度の生産を可能にする培地の開発に関する。培地は、低含有量のナトリウムイオン（Ｎａ^＋）及び塩化物イオン（Ｃｌ⁻）を有すると化学的に定義される。Ｎａ^＋濃度は、一般的に１００ｍｇ／Ｌ未満、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ未満であり、Ｃｌ⁻の濃度は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは２００ｍｇ／Ｌ未満である。本発明の実施形態によれば、本発明に関係する株の培養は、０．５ｇ／Ｌ未満のＮａＣｌ、６ｍｇ／Ｌ未満のナトリウムイオン及び２００ｍｇ／Ｌ未満の塩化物イオンを含有する培地中で実施される。

実施形態によれば、培地は、ＦＣＣ−Ｍ（表２（ｃ））である。培養が発酵槽又はバイオリアクター中で実施される場合、上述のように、添加溶液が望ましいであろう（例えば、表３（ａ又はｂ）を参照）。

本発明の培地は化学的に定義されているので、それらは、例えば、それ自体が、塩化ナトリウムの量を含む酵母抽出物又はペプトンなどの増殖剤も、マンニトール又はソルビトールのような浸透圧調整剤も含んでいない。従って、これらの薬剤の非存在下において、培養物由来のバイオマス及び脂質は、最終製品の含有量を特徴づけるために、又は最終製品中にこれらの不必要な添加剤を除去するために必要となる多数のＤＳＰ工程を行うこと無く、食品（又は医薬品）に使用可能である。従って、これらの追加工程に関連する余分なコストが回避される。同様に、オイル抽出後に得られる副産物は、例えば、オイルケーキの形で動物飼料に使用することができる。

本発明の方法及び本発明の培地の別の利点は、培養物から得られる廃液が、追加コストをもたらし且つ生産に利益をもたらさない追加の処理工程を必要とする薬剤を含まないことである。

本発明の方法と培地は、塩化物イオンとナトリウムイオンの使用及び余分なコストに関連する問題を回避しながら、培養物から得られたバイオマスの生産を最適化することを可能にするだけでなく、多価不飽和脂肪酸で培養したこのように培養された生物を濃縮することを可能にする。

好ましくは、株は、上述の方法に従って培養され、その後、その脂質含量、特に、ＤＨＡを含む脂質を抽出するために回収される。ＤＨＡを含む、脂質の選択的抽出方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．及びＤｙｅｒ， Ｗ．Ｊ．（１９５９）［Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１-９１７］に記載されている。

本発明の実施形態の株は、従って、、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／時、好ましくは少なくとも０．２ｇ／Ｌ／時、より好ましくは少なくとも０．３ｇ／Ｌ／時のＤＨＡの生産性を有していてもよい。

本発明はまた、本発明の方法から得られたバイオマス及び／又は副生成物の全て又は一部の、ヒトの消費のため製品中の成分としての製品、又は動物飼料、特に水産養殖の原料としての、使用に関する。

本発明はまた、本文書中に記載された実施形態の培地、特に、脂質及び顔料の製造のための原生生物を培養するための、ＦＣＣ−Ｍと名付けられた培地の使用にも関する。

実施例１
三角フラスコでの増殖試験：

図２に記載された株は、２日間、再構成海塩（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ（登録商標）、１５ｇ／Ｌ）を含む培地中で最初に培養し、次に遠心分離し、ＦＣＣ−Ｍ培地５０ｍｌを含む三角フラスコに播種（１／１０００ ｖ／ｖ）する前に、ＦＣＣ−Ｍ溶液（表２（ｃ））で一回洗浄した。細胞培養物の吸光度は、撹拌しながら（２２０ｒｐｍ）２６℃で３日間インキュベーション後に測定した。

実施例２
三角フラスコ中で増殖させた細胞の脂肪酸プロフィール

図２に記載された株は、２日間、再構成海塩（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ（登録商標）、１５ｇ／Ｌ）を含む培地中で最初に培養し、次に遠心分離し、硫酸アンモニウムを酵母抽出物（４ｇ／Ｌ）で置換したＦＣＣ−Ｍ培地５０ｍｌを含む三角フラスコに播種（１／１０００ ｖ／ｖ）する前に、ＦＣＣ−Ｍ溶液（表２（ｃ））で一回洗浄した。
脂肪酸（ＦＡＭＥ）プロファイルは、撹拌しながら（２２０ｒｐｍ）２６℃で３日間インキュベートした細胞培養物から決定した。

実施例３
バイオリアクターにおける増殖及びＤＨＡ産生テスト：

オーランチオキトリウム培養は、コンピュータ管理された専用の自動装置を用いて、１Ｌ〜２Ｌ使用可能な発酵槽（バイオリアクター）で調製した。システムのｐＨは、塩基（ＮａＯＨ又はＫＯＨ）、及び／又は酸（硫酸溶液）を添加することによって調整した。培養温度は２６℃に設定した。撹拌は、ラシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）形状（ダウンポンプを有する３つのブレードインペラ）に応じてシャフト上に配置された３つの撹拌ロータにより実施した。溶存酸素圧を、撹拌速度（２５０〜１２００ｒｐｍ）、空気流量（０．２５〜１ｖｖｍ）及び酸素流量（０．１〜０．５ｖｖｍ）を用いた培養を通して、培地中で調製した。自動化された監視システムに統合された調製パラメータは、５％〜３０％の間に一定のｐＯ２を維持することを可能とする。培養時間は、５０〜２００時間の間、好ましくは６５〜９６時間の間、例えば７２時間であった。

前培養は、窒素源として４ｇの酵母抽出物及び炭素源として３０ｇのグルコースを含有するＦＣＣ−Ｍ培地中にて、温度が制御された密閉容器（２６°Ｃ）内の振動台（１４０ｒｐｍ）で調製した。インキュベーションの４８時間後、細胞を３０００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを、酵母抽出物や他の無機若しくは有機窒素源を含まないＦＣＣ−Ｍ培地で洗浄した。培養中、３回の添加溶液１の追加、並びに、２００ｍＭ〜５００ｍＭの間にグルコース濃度を維持するために、添加溶液２の添加を行った。

培養モニタリング：
総バイオマス濃度は、乾燥物（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｆフィルターで濾過した後、秤量前に少なくとも２４時間、１０５℃のオーブンで乾燥）を測定することによってモニターした。

総脂質及びＦＡＭＥの量は、古典的に文献に記載された方法（Ｆｏｌｃｈ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９５７ Ｍａｙ；２２６（１）：４９７-５０９）に従って分析した。

実施例４
発酵槽での培養：

オーランチオキトリウム培養物は、実施例３に記載されたものと同様の方法にて、発酵槽で調製した。手順は、動物飼料用副産物の価値を低くする可能性があるＮａＯＨ又はＫＯＨを使用したｐＨ調整に関連する過剰なＮａ^＋又はＫ^＋供給を回避するために、アンモニア（ＮＨ_４ＯＨ）を添加することによるｐＨ調整方法を変更した。それは、実施例３に記載したのと同様の方法で、発酵槽内で調製した。細胞培養に必要とされる窒素の一部は、アンモニア（ＮＨ_４ＯＨ）を用いたｐＨ調整を介して供給されるため、もはや添加溶液１の組成物中の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含む必要はなかった。

表３は、この実施例の結果を示す。

Claims (14)

1. ＤＨＡを製造するための方法であって、以下の工程を含む：
   ａ）従属又は混合栄養条件下で、６ｍｇ／Ｌ未満のナトリウムイオン及び２００ｍｇ／Ｌ未満の塩化物を含有し、かつ、２００ｍＭ〜５００ｍＭの有機炭素含有基質を含有する化学的に定義された培地中において、配列番号１の配列と少なくとも９２％の遺伝的同一性を有するオーランチオキトリウム属の１以上の株を培養する、方法。
2. オーランチオキトリウム属の株（単数又は複数）が、配列番号２の配列と少なくとも９６％、及び／又は配列番号３の配列と少なくとも９１％、及び／又は配列番号４の配列と少なくとも９５％の遺伝的同一性を有することを特徴とする、請求項１に記載の培養方法。
3. 前記培地が、浸透圧調節剤、例えばマンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール及びスクロースを含有しないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. さらに、以下の工程：
   ｂ）複数世代にわたって前記培養を維持し、
   ｃ）そのように培養されたバイオマスを回収し、
   ｄ）前記株の脂質を回収し、及び任意に、
   ｅ）ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）を抽出すること、
   を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記培地が、
   からなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 工程ｂ）由来の前記バイオマスが、少なくとも１００ｇ／Ｌの乾燥物を示すことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 工程ｂ）の終了時のＤＨＡ濃度が、少なくとも１５ｇ／Ｌを示すことを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
8. 工程ｂ）の終了時の前記バイオマス中に含まれる前記ＤＨＡが、総脂質の３０％超を示すことを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記方法が、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／時のＤＨＡ生産性を有することを特徴とする、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. オーランチオキトリウム属の前記生物が、アクセッション番号ＣＣＡＰ４０６２／１にてＣＣＡＰ（藻類及び原性生物保存機関）に寄託されたＦＣＣ１３２４株に相当することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. からなることを特徴とする、培地。
12. からなることを特徴とする、請求項１１に記載の培地。
13. 脂質及び顔料の製造のために原性生物を培養するための請求項１１又は１２に記載の培地の使用。
14. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を実施するための請求項１１又は１２に記載の培地の使用。