JP6707087B2 - コレステロール吸収能を有するプロバイオティック株、その方法および使用 - Google Patents

Description

本発明はプロバイオティック株の分野に関し、さらに詳細には、コレステロール吸収能を有するプロバイオティック株、およびその治療上の用途の分野に関する。本発明はまた、プロバイオティック株を用いた脂質代謝異常の治療に関する。

高コレステロール血症は循環器病における最も重要な危険因子であり、多くの国で死亡や障害の主要な原因の一つとみなされている。血清コレステロール濃度が１％減少することで、冠動脈心疾患のリスクは２〜３％減少し得ることが示されている。高コレステロール血症の薬物療法は、それらの治療上懸念を生じさせる望ましくない副作用を有する。したがって、ヒトの血清コレステロール濃度を低下させるための、さらに自然な方法が必要とされている。

乳酸桿菌およびその他の乳酸菌は、消化機能のバランスをとり、コレステロールの除去を促進する上で重要な役割を果たしているが、用量と効果の関連についての研究はまだ確立していない。これらによる胆汁酸塩の脱抱合能のため、近年では、生物学的コレステロール低下剤としての乳酸菌使用の可能性に関心がもたれている。幾つかの研究により、ヒト、ラットおよびニワトリにおける乳酸菌の消費と、血中コレステロール濃度の減少との関連性が提唱された。胆汁酸塩の豊富な環境における胆汁酸塩加水分解酵素（ＢＳＨ）の存在は、この細菌にとっての選択的利点である。ＢＳＨ活性は、抱合胆汁酸塩に対する細菌の抵抗性を高め、消化管内での生存、すなわちコロニー形成能を増大させることによって、細菌の利益となる。乳酸桿菌による胆汁酸塩の脱抱合とコレステロール減少能についての研究は、ほとんどの場合、ヒト、ブタおよび発酵乳調製物から分離された株について行われてきた。

ラクトバチルス・アシドフィルスおよびビフィズス菌の株が、実験培地からコレステロールを資化することが報告された。このように、両タイプの細菌は、ヒトの血清コレステロールを減少させる可能性を有する。乳酸菌株のコレステロール低下作用に関する機構を解明するために、多くの試みがなされてきた。提唱されている機構の一つは、増殖する間の、細胞壁によるコレステロールの減少である。可能性のあるもう一つの機構は、ＢＳＨを産生する細菌による胆汁酸塩の脱抱合である。しかしながらこれらの機構は、血清コレステロールをうまく減少させるために、細菌が生きていることを必要とする。

このように、当該技術分野には、依然、脂質代謝異常、特に高コレステロール血症の治療に有効な、プロバイオティックベースの治療法への希求が存在している。

第１の態様によれば、本発明は、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記プロバイオティック株のバリアントから選択されるプロバイオティック株に関する。

別の態様によれば、本発明は、本発明のプロバイオティック株を含んでなる、生物学的に純粋な培養物に関する。

別の態様によれば、本発明は、本発明のプロバイオティック株を含んでなる組成物に関する。

別の態様によれば、本発明は、本発明のプロバイオティック株を含んでなる医薬品に関する。

別の態様によれば、本発明は、本発明のプロバイオティック株を含んでなる栄養製品に関する。

別の態様によれば、本発明は、本発明のプロバイオティック株を含んでなる飼料に関する。

別の態様によれば、本発明は、本発明のプロバイオティック株の細胞膜または細胞壁濃縮画分に関する。

別の態様によれば、本発明は、増加されたコレステロール吸収能を有する本発明のプロバイオティック株を得るための方法であって、その細胞を不活性化させる工程を含んでなる方法に関する。

別の態様によれば、本発明は、増加されたコレステロール吸収能を有する本発明のプロバイオティック株を得るための方法であって、それらの対数期の間に６乃至９のｐＨにて細胞を培養する工程を含んでなる方法に関する。

別の態様によれば、本発明は、増加されたコレステロール吸収能を有する微生物を得るための方法であって、コレステロールを吸収する微生物を、ペプチドグリカン加水分解酵素活性を含んでなる組成物とを接触させることを含んでなる方法に関する。

別の態様によれば、本発明は、増加されたコレステロール吸収能を有する本発明の微生物を得るためのいずれかの方法によって得られる細胞に関する。

別の態様によれば、本発明は、薬剤としての用途のための、本発明のプロバイオティック株に関する。

別の態様によれば、本発明は、薬剤としての用途のための、増加されたコレステロール吸収能を有する本発明の微生物を得るためのいずれかの方法によって得られる細胞に関する。

別の態様によれば、本発明は、脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびメタボリック症候群からなる群から選択される疾病または状態の治療および／または予防における用途のための、本発明のプロバイオティック株に関する。

別の態様によれば、本発明は、脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびメタボリック症候群からなる群から選択される疾病または状態の治療および／または予防における用途のための、増加されたコレステロール吸収能を有する本発明の微生物を得るためのいずれかの方法によって得られる細胞に関する。

フルオレステロール（対照−）およびエゼチミブ（対照＋）、Ｌ．ロイテリＶ３４０１またはＢ．ブレーベＢＴ８２０の菌液と共にインキュベートした、Ｈ−Ｔ２９腸細胞の相対的細胞蛍光平均（％）を示した図である。 フルオレステロール（対照−）およびエゼチミブ（対照＋）または不活化細菌の菌液と共にインキュベートした、Ｈ−Ｔ２９腸細胞の相対的細胞蛍光平均（％）を示した図である。Ａ．Ｌ．ロイテリＶ３４０１、Ｂ．Ｂ．ブレーベＢＴ８２０。 （ｇｔｇ）５（左パネル）およびＯＰＬ１（右パネル）プライマーによって生成した、Ｌ．ロイテリ株のＲＡＰＤパターンを示した図である。左パネル：左レーンから右レーンへ：レーン１、１００ｂｐ分子量マーカー；レーン２、Ｌ．ロイテリＶ３４０１；レーン３、ＬＲ３５；レーン４、ＬＲ２０；レーン５、ＬＲ０１；レーン６、ＣＥＣＴ９２５；レーン７、ＤＳＭ１９７３８；レーン８、鋳型なしの対照（ＮＴＣ）；レーン９、１００ｂｐ分子量マーカーおよびレーン１０、１ｋｂ分子量マーカー。右パネル：レーン１、Ｖ３４０１；レーン２、ＬＲ３５；レーン３、ＬＲ２０；レーン４、１００ｂｐ分子量マーカー。 Ｂ．ブレーベＢＴ８２０およびその他のＢ．ブレーベ株ならびにビフィドバクテリウム・ロングム株の、（ｇｔｇ）５ ＲＡＰＤフィンガープリントを示した図である。レーン１、１ｋｂ分子サイズマーカー。レーン２、１００ｂｐ分子サイズマーカー。レーン３、Ｂ．ブレーベＢＴ８２０。レーン４、ＢＢ２６。レーン５、ＤＳＭ２００９１。レーン６、ＣＥＣＴ４８３９。レーン７、ＢＢ６９。レーン８、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＡＴＣＣ１５７０７。 フルオレステロールのミセル（対照）、エゼチミブ（３００μＭ）、Ｌ．ロイテリＶ３４０１、Ｂ．ブレーベＢＴ８２０の熱不活化細胞懸濁液（５・１０^８細菌／ｍＬ）と共にインキュベートしたＨＴ−２９腸細胞、ならびにエゼチミブおよび各微生物と共にインキュベートした腸細胞の相対的蛍光（幾何平均）を示した図である。 フルオレステロールと共にインキュベートし、蛍光測定法によって測定した、Ｌ．ロイテリＶ３４０１、Ｂ．ブレーベＢＴ８２０および陰性対照（無作為に選択）のサンプルの、正味の蛍光（任意の単位）を示した図である。 フローサイトメトリーによって決定した、Ｌ．ロイテリＶ３４０１、Ｂ．ブレーベＢＴ８２０および無作為に選択した陰性対照の懸濁液中の、細菌あたりの蛍光（幾何平均）を示した図である。 Ａ．増殖培地であるｐＨ６の培地ＡおよびｐＨ５の培地Ｂ中で得たＬ．ロイテリＶ３４０１培養の、生菌濃度を示した図である。Ｂ．フルオレステロール（対照−）、エゼチミブ（対照＋）または記載する条件下で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１の熱不活化懸濁液と共にインキュベートしたＨ−Ｔ２９腸細胞の相対的細胞蛍光平均（％）を示した図である。 フルオレステロール（対照−）、エゼチミブ（対照＋）または異なった培地および増殖ｐＨ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１の熱不活化懸濁液と共にインキュベートした、Ｈ−Ｔ２９腸細胞の相対的細胞蛍光平均（％）を示した図である。Ａ．グルコースを加えた培地Ｂ、ｐＨ５。Ｂ．リン酸カリウムを加えた培地Ｂ、ｐＨ５。Ｃ．低濃度の酵母抽出物を加えた培地Ｂ、ｐＨ５。Ｄ．リン酸カリウムおよび低濃度の酵母抽出物を加えた培地Ｂ、ｐＨ５。Ｅ．標準培地Ｂ、ｐＨ５。Ｆ．培地Ｂ、ｐＨ６。Ｇ．培地Ａ、ｐＨ６。Ｈ．培地Ａ、ｐＨ５。 フルオレステロール（対照−）、エゼチミブ（対照＋）または異なった増殖ｐＨ値の培地Ｂ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１の熱不活化懸濁液と共にインキュベートした、Ｈ−Ｔ２９腸細胞の相対的細胞蛍光平均（％）を示した図である。 フルオレステロール、およびｐＨ５の培地Ｂにおいて１４時間増殖させ、ｐＨ６にて２４時間インキュベートし、異なった時間間隔で収集したＬ．ロイテリＶ３４０１の熱不活化菌液と共にインキュベートした、Ｈ−Ｔ２９腸細胞の相対的細胞蛍光平均（％）を示した図である。 ｑＰＣＲによって測定した、培地Ｂおよび培地Ａ中の溶解酵素の相対的遺伝子発現値を示した図である。 ｐＨ４（レーン１〜２）、ｐＨ５（３〜４）、ｐＨ６（５〜６）、ｐＨ７（７〜８）の培地Ｂ、およびｐＨ６の培地Ａ（９〜１０）中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１から得たタンパク質抽出物の、ザイモグラム（Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）を示した図である。 ｐＨ６の培地Ａ（Ａ、Ｂ）およびｐＨ５の培地Ｂ（Ｃ、Ｄ）中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１の、透過型電子顕微鏡像を示した図である。 フルオレステロールおよびｐＨ６の培地ＡおよびｐＨ５の培地Ｂ中で増殖させた熱不活化菌液と共にインキュベートした、Ｈ−Ｔ２９腸細胞の相対的細胞蛍光平均（％）を示した図である。Ａ．Ｌ．ロイテリＬＲ０１。Ｂ．Ｂ．ブレーベＢＢ１６。Ｃ．Ｌ．ファーメンタムＣＥＣＴ５７１６。Ｄ．Ｌ．ロイテリＬＲ３５。Ｅ．Ｌ．ロイテリＬＲ２０。Ｆ．ラクトコッカス・ラクティスＬＬ１８。Ｆ．ロイコノストック・メセンテロイデスＬＭ３７。Ｈ．ペディオコッカス・ペントサセウスＰＰ０２。 ｑＰＣＲによって測定した、ｐＨ６の培地ＡおよびｐＨ５の培地Ｂ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１ならびにＬＲ２０株の、溶解酵素遺伝子の相対的発現を示した図である。 細菌サンプルを含まないフルオレステロールミセル（対照−）、エゼチミブ（対照＋）、ならびにＬ．ロイテリＬＲ３５、Ｌ．プランタルムＬＰ１８およびＢ．ブレーベＢＴ８２０の、熱不活化懸濁液（Ｃ）およびＬ．ロイテリＶ３４０１からのタンパク質抽出物と共にインキュベートした懸濁液（Ｔ）と共にインキュベートした、Ｈ−Ｔ２９腸細胞あたりの相対的蛍光（％）を示した図である。 フローサイトメトリーによって測定した、細胞あたりの蛍光強度（幾何平均）を示した図である。Ｃ：フルオレステロールを含まない、熱不活化細菌サンプル（自己蛍光対照）。Ｆ：フルオレステロールと共にインキュベートした熱不活化細菌。ＴＦ：Ｌ．ロイテリＶ３４０１タンパク質抽出物によって処理し、熱不活化し、フルオレステロールミセルと共にインキュベートした細菌サンプル。 ５７日後に６動物群において測定した血清コレステロールを示した図である。エラーバーは平均の標準誤差を示す。Ａ．健常対照群；Ｂ．高コレステロール血症対照群；Ｃ．生菌Ｌ．ロイテリＶ３４０１群；Ｄ．熱不活化Ｌ．ロイテリＶ３４０１群；Ｅ．生菌Ｂ．ブレーベＢＴ８２０群；Ｆ．熱不活化Ｂ．ブレーベＢＴ８２０群。 ５７日後に６動物群において測定した、ＨＤＬコレステロール（Ａ）、ＬＤＬコレステロール（Ｂ）およびＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ比（Ｃ）を示した図である。エラーバーは平均の標準誤差を示す。対照群Ａ（＃）および高コレステロール血症群Ｂ（＊）に対する有意差（スチューデントｔ、α＝０．０５およびｐ＜０．５）を示す。 ５７日後の６動物群における、血漿トリグリセリド（Ａ）およびリン脂質（Ｂ）濃度を示した図である。エラーバーは平均の標準誤差を示す。 ５７日後の６動物群における、血漿グルコース値を示した図である。エラーバーは平均の標準誤差を示す。対照群Ａ（＃）および高コレステロール血症群Ｂ（＊）に対する有意差（スチューデントｔ、α＝０．０５およびｐ＜０．５）を示す。

本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、蛍光のコレステロール類似体であるフルオレステロールとコレステロールの腸上皮細胞による吸収をうまく減少させる、２つのプロバイオティック株、ラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１（受託番号ＣＥＣＴ８６０５）およびビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０（受託番号ＣＥＣＴ８６０６）を同定した。これらが効果を発揮するための機構は、コレステロールを吸収することにより、腸管からコレステロールを捕捉して、腸上皮から吸収される量を減少させる能力に基づく。さらに本発明者らは、これらの株のコレステロール吸収能が、Ｌ．ロイテリＶ３４０１（ＣＥＣＴ ８６０５）株に特異的であるとみられる溶解活性の増大を通して、驚くほど誘導されることを見出した。この予想外の発見によって、前記既存の機能を有する微生物におけるコレステロール吸収機能の活性化が可能になる。

株および培養
第１の態様によれば、本発明は、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択される株に関し、以下、これを「本発明のプロバイオティック株」と称する。

本明細書で用いられる用語「株」は、微生物種、好ましくは細菌種の遺伝的バリアントまたはサブタイプを指す。本明細書で用いられる用語「プロバイオティック株」は、微生物、好ましくは細菌の生きた株であって、適切な量を投与した際に、宿主に健康上の利益を与える株を指す。本発明に関連する適切な宿主としては、いずれかの哺乳類、好ましくはヒトおよびチンパンジーのような霊長類、ブタ、ウマ、雌ウシ、ヤギ、雌ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスが挙げられ、好ましくはヒトである。その他の適切な宿主としては、鳥類、好ましくはニワトリ、カモ、ガチョウ、ハクチョウ、キジ、ドバト、ハトおよびダチョウが挙げられる。

本発明は、以下より選択されるプロバイオティック株を企図する
−受託番号ＣＥＣＴ８６０５にてスペイン培養細胞系統保存機関（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ：ＣＥＣＴ）に寄託されているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１株、またはコレステロール吸収能を有するそのバリアント、および
−受託番号ＣＥＣＴ８６０６にてＣＥＣＴに寄託されているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有するそのバリアント。

したがって本発明は、コレステロール吸収能を有する、Ｌ．ロイテリＶ３４０１株およびＢ．ブレーベＢＴ８２０株のバリアントにも関する。本明細書で用いられる用語、株の「バリアント」または「変異体」は、主に変異によって参照株Ｘから得られた、天然または特別に開発されたいずれかの株であって、参照株、すなわちＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株またはＣＥＣＴ８６０６ Ｂ．ブレーベＢＴ８２０株のコレステロール吸収能を維持している株を指す。

バリアントは、それらが、参照株のコレステロール吸収能に関して同様の有利な性質を共有しているという条件で、本明細書に例示する特定の株に同定される同じ生物学的特性を有するか、または有さない可能性がある。例えば本明細書の意図によれば、「バリアント」株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、本明細書に開示される株と約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有し得る。

別の実施形態によれば、本発明の株のバリアントは、そのゲノムが、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株またはＣＥＣＴ８６０６ Ｂ．ブレーベＢＴ８２０株のいずれかのゲノムとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、いずれかの株を指す。一般に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、摂氏約４０度の１０×ＳＳＣ中か、または同等のイオン強度／温度の溶液中で行われる。中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、典型的には摂氏約５０度の６×ＳＳＣ中で行われ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、一般に摂氏約６０度の１×ＳＳＣ中で行われる。

別の実施形態によれば、バリアントと親株との間の関連性の程度は、コアゲノムのＤＮＡ保存を検出する、平均的ヌクレオチド同一性（ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ：ＡＮＩ）（Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ Ｋ ａｎｄ Ｔｉｅｄｊｅ ＪＭ，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：２５６７−２５９２）として決定される。幾つかの実施形態によれば、バリアントと親株との間のＡＮＩは、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％、約９９．９９９９９％、約９９．９９９９９９％以上であるが、１００％未満である。

別の実施形態によれば、バリアントと親株との間の関連性の程度は、オリゴヌクレオチドの頻度に基づいた、テトラヌクレオチドシグネチャー頻度相関係数（Ｔｅｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（Ｂｏｈｌｉｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００８，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：１０４）として決定される。幾つかの実施形態によれば、バリアントと親株との間のテトラヌクレオチドシグネチャー頻度相関係数は、約０．９９、０．９９９、０．９９９９、０．９９９９９、０．９９９９９９、０．９９９９９９以上であるが、１未満である。

別の実施形態によれば、バリアントと親株との間の関連性の程度は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いたパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によって、親株およびバリアント株のゲノムを分析することで得られた類似性の程度として決定される。ＰＦＧＥによって得られた類似性の程度は、ダイス類似係数によって測定できる。幾つかの実施形態によれば、バリアントと親株との間のダイス類似係数は、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％、約９９．９９９９９％、約９９．９９９９９９％以上であるが、１００％未満である。

別の実施形態によれば、ある株を所定の親株のバリアントであるとみなす場合に、当該技術分野において公知であるいずれかの方法、例えばＢｏｕｃｈｅｔらによって記載される方法（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２００８，２１：２６２−２７３）を用いて得られたリボタイプは、両株の間で同じである。

別の実施形態によれば、バリアントと親株との間の関連性の程度は、反復性遺伝子外パリンドロームエレメントベースのＰＣＲ（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂａｓｅｄ ＰＣＲ：ＲＥＰ−ＰＣＲ）（例えばＣｈｏｕ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６，１１０：１３５−４８を参照）によって得られた両株の遺伝子プロファイルを比較することによって得た、ピアソン相関係数である。幾つかの実施形態によれば、バリアントと親株のＲＥＰ−ＰＣＲプロファイルを比較することによって得たピアソン相関係数は、約０．９９、０．９９９、０．９９９９、０．９９９９９、０．９９９９９９、０．９９９９９９以上であるが、１未満である。

別の実施形態によれば、バリアントと親株との間の関連性の程度は、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）（Ｍａｉｄｅｎ，Ｍ．Ｃ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３１４０−３１４５を参照）によって得られた両株の遺伝子プロファイルを比較することによって得た、連鎖距離である。幾つかの実施形態によれば、バリアントと親株のＭＬＳＴによって得た連鎖距離は、約０．９９、０．９９９、０．９９９９、０．９９９９９、０．９９９９９９、０．９９９９９９以上であるが、１未満である。

好ましい実施形態によれば、バリアントと親株とは同じ属である。さらになお好ましい実施形態によれば、バリアントと親株とは同じ属または亜種である。

本明細書で用いられる用語「コレステロール吸収能」は、それによって株がコレステロールを捕捉し、株の細菌細胞構造内に取り込むことができる性質を指す。当業者は、細胞のコレステロール吸収能を決定するために適した技術が、当該技術分野に多数あることを認識するであろう。これに限定されるものではないが、これには本特許出願の実施例の項に記載される方法が含まれ、この方法は、ミセルから細菌内への、フルオレステロール、または式（Ｉ）のコレステロール類似体であるＮＢＤ−コレステロールの取り込みの、蛍光光度法または蛍光サイトメトリーによる検出に基づく。

本発明における用途に適したバリアントとしては、それらが由来する株のコレステロール吸収能に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％以上のコレステロール吸収能を有するバリアントが挙げられる。

特定の実施形態によれば、本発明のプロバイオティック株は生細胞の形態である。別の特定の実施形態によれば、本発明のプロバイオティック株は非生細胞の形態である。本明細書で用いられる用語「生存率」は、細胞自体を維持するか、またはその能力を回復して、細胞が分裂するまでに生存するための、細胞の能力を指す。したがって、生細胞は、細胞が生存して分裂できることを示し、反対に非生細胞は、細胞が生存して分裂できないことを示す。非生細胞には死細胞も含まれることが理解されるであろう。

生存率は、当該技術分野における、多数の従来アッセイによって決定できる。これらには、乳酸脱水素酵素アッセイ、ヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルーアッセイおよび７−アミノアクチノマイシンＤアッセイのような細胞溶解アッセイまたは膜漏出アッセイや、ＤＮＡマイクロアレイおよびタンパク質チップを用いてストレス経路の活性化を試験する、ゲノミクスおよびプロテオミクスアッセイが含まれる。

本発明のプロバイオティック株の生存率は０％、または少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％である。細胞生存率のパーセンテージは、細胞自体を維持するか、またはそれらの能力を回復して、それらが分裂するまでに生存できる細胞のパーセンテージを反映する。反対に、本発明のプロバイオティック株の非生存率は１００％、または少なくとも９５％、または少なくとも９０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８０％、または少なくとも７５％、または少なくとも７０％、または少なくとも６５％、または少なくとも６０％、または少なくとも５５％、または少なくとも５０％、または少なくとも４５％、または少なくとも４０％、または少なくとも３５％、または少なくとも３０％、または少なくとも２５％、または少なくとも２０％、または少なくとも１５％、または少なくとも１０％、または少なくとも５％、または０％である。細胞非生存率のパーセンテージは、細胞自体を維持するか、またはそれらの能力を回復できず、それらが分裂するまでに生存できない細胞のパーセンテージを反映する。

別の態様によれば、本発明は、本発明のプロバイオティック株の、生物学的に純粋な培養物に関する。

本明細書で用いられる用語「生物学的に純粋な培養物」は、本発明の細菌が、培養中に存在する他の生物と比較して、９０％以上、例えば９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の割合で見出される培養を指す。本明細書で用いられる用語「培養」は、本発明の細菌の集団を指す。培養は、培養液、または培養の増殖または維持に有益な、培養液に添加してよい他のいずれかの物質のような、本発明の細菌以外のその他の成分を含んでよい。用語「培養液」または「培地」は当該技術分野において認識されており、一般には、生細胞の培養に用いられるいずれかの物質または調製物を指す。細胞培養に関して用いられる用語「培地」には、細胞周囲の環境の成分が含まれる。培地は、固体、液体、気体または相および材料の混合物であってよい。培地には、液体増殖培地、および細胞増殖を持続させない液体培地が含まれる。培地にはまた、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質のようなゲル状培地も含まれる。代表的な気体培地には、ペトリ皿またはその他の固体もしくは半固体の支持体上で増殖する細胞が曝露される気相が含まれる。用語「培地」はまた、それが細胞に接触していなくても、細胞培養における用途が意図された材料も指す。言い換えれば、細菌培養用に調製された栄養素の豊富な液体は培地である。同様に、水または他の液体と混合することによって、細胞培養に適したものとなる粉末混合物は、「粉末培地」と称され得る。「限定培地」は、化学的に限定された（通常は精製された）成分から作られた培地を指す。「限定培地」は、酵母抽出物およびビーフブロスのような、十分に特徴付けられていない生物学的抽出物を含有しない。「富栄養培地」には、特定の種の生きた形態の、ほとんどまたはすべての増殖を支持するように意図された培地が含まれる。富栄養培地には、しばしば複雑な生物学的抽出物が含まれる。本発明においては、乳酸菌またはビフィズス菌の培養に適した、当該技術分野において公知の、従来のいずれかの培養液、例えばＭＲＳ培地、ハンクス培地、ＡＰＴ培地、ＲＣＭ培地、ＬＭ１７培地、ＢＳＭ培地およびＥｌｌｉｋｅｒ培地が使用できる。

別の態様によれば、本発明は、本発明のプロバイオティック株の細胞膜または細胞壁の濃縮画分に関する。

本明細書で用いられる用語「細胞膜濃縮画分」は、細胞膜の含有量が、未分画の細胞よりも高くなる細胞分画手順によって得られた調製物を指す。同様に、本明細書で用いられる用語「細胞壁濃縮画分」は、細胞壁の含有量が、未分画の細胞よりも高くなる細胞分画手順によって得られた調製物を指す。細胞膜濃縮画分および細胞壁濃縮画分を得るための技術は、当該技術分野において公知の従来技術であり、浸透圧による均質化、または乳鉢、乳棒、ブレンダーもしくは超音波を用いた物理的均質化のような均質化と、遠心分離のような分画技術との組み合わせを含む。

微生物のコレステロール吸収能を増大させるための方法
本発明者らはまた、予想外に、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株およびＣＥＣＴ８６０６ Ｂ．ブレーベＢＴ８２０株のコレステロール吸収能が、細胞を細胞の不活化に供することによって誘導または増大できるということも決定した（実施例３）。また、同じ効果は、細胞を６以上のｐＨにて増殖させた場合にも観察された（実施例４）。

したがって別の態様によれば、本発明は、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択される、増加されたコレステロール吸収能を有するプロバイオティック株を得るための方法に関する。以下、この方法は、細胞を不活化させる工程または細胞を６以上のｐＨにて培養する工程を含んでなる「本発明の第１の方法」である。

用語「コレステロール吸収能」、「プロバイオティック株」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０」および「バリアント」は、本発明のプロバイオティック株に関連して詳述されており、それらの定義および実施形態は参照によって本明細書に含まれる。

本発明の第１の方法は、細胞を不活化させる工程を含んでなる。この工程は、本発明のプロバイオティック株の培養または分離した細胞において行われてよいことが、当業者には明らかであろう。本明細書で用いられる用語「細胞の不活化」は、細胞を生細胞から非生細胞へ転換させる方法を指す。本発明の株に関連して記載された、細胞が生細胞であるか、または非生細胞であるかを決定するための様々な方法がある。得られた細胞は、０％の生細胞と１００％の非生細胞、または少なくとも１％の生細胞と９９％の非生細胞、または少なくとも５％の生細胞と９５％の非生細胞、または少なくとも１０％の生細胞と９０％の非生細胞、または少なくとも１５％の生細胞と８５％の非生細胞、または少なくとも２０％の生細胞と８０％の非生細胞、または少なくとも２５％の生細胞と７５％の非生細胞、または少なくとも３０％の生細胞と７０％の非生細胞、または少なくとも３５％の生細胞と６５％の非生細胞、または少なくとも４０％の生細胞と６０％の非生細胞、または少なくとも４５％の生細胞と５５％の非生細胞、または少なくとも５０％の生細胞と５０％の非生細胞、または少なくとも５５％の生細胞と４５％の非生細胞、または少なくとも６０％の生細胞と４０％の非生細胞、または少なくとも６５％の生細胞と３５％の非生細胞、または少なくとも７０％の生細胞と３０％の非生細胞、または少なくとも７５％の生細胞と２５％の非生細胞、または少なくとも８０％の生細胞と２０％の非生細胞、または少なくとも８５％の生細胞と１５％の非生細胞、または少なくとも９０％の生細胞と１０％の非生細胞、または少なくとも９５％の生細胞と５％の非生細胞、または少なくとも９９％の生細胞と１％の非生細胞を含む。

細胞を不活化させるための様々な方法が当該技術分野において利用可能であり、熱不活化、マイクロ波による不活化、圧力による不活化、酸による不活化、塩基による不活化、アルコールによる不活化および過酸化物による不活化が挙げられる。

本発明の第１の方法の特定の実施形態によれば、不活化は、熱不活化、マイクロ波による不活化、圧力による不活化、酸による不活化、塩基による不活化、アルコールによる不活化および過酸化物による不活化からなる群から選択される。

本明細書で用いられる用語「熱不活化」は、高温を用いた細胞の不活化を指す。これは通常、細胞またはそれらを含む培地の温度を、５０℃を超えて上昇させることによって達成される。熱不活化に適した方法は当該技術分野において公知であり、実施例の項に記載される方法を含むが、これに限定されない。該方法は、本発明のプロバイオティックを含む培養を１２０℃にて２０分間インキュベートすること、および培養を室温まで冷却することからなる。

本明細書で用いられる用語「マイクロ波による不活化」は、マイクロ波を用いた細胞の不活化を指す。マイクロ波による不活化に適した方法は当該技術分野において公知であり、これに限定されるものではないが、実験用マイクロ波装置を用いて、本発明のプロバイオティック株を含む細胞またはそれらを含む培地をマイクロ波へ供することを含む。例えば不活化は、３分間に装置の出力を３００Ｗまで徐々に上げ、この状態をさらに５分間維持することによって達成されてよい。

本明細書で用いられる用語「圧力による不活化」は、圧力を用いた細胞の不活化を指す。圧力による不活化に適した方法は当該技術分野において公知であり、これに限定されるものではないが、例えばホモジナイザーまたはフレンチプレスを用いた均質化が挙げられる。例えば細胞の不活化は、高圧ホモジナイザーを、１，５００〜２，０００ｂａｒの圧力および１５〜２０パルス／分で１０分間用いることによって達成されてよい。

本明細書で用いられる用語「酸による不活化」は、ｐＨを下げることによる細胞の不活化を指す。これは通常、細胞またはそれらを含む培地に酸を加え、続いて細胞または培地を中和することによって達成される。細胞の不活化の目的には強酸が好ましく、これに限定されるものではないが、塩酸（ＨＣｌ）、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、過塩素酸（ＨＣｌＯ_４）、硝酸（ＨＮＯ_３）および硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）が挙げられる。酸の強度は、プロトンを失うその能力または傾向を指す。例えば不活化は、Ｈ_２ＳＯ_４を細胞に、濃度が８０ｍＭに達するまで加え、細胞を５５℃にて４時間インキュベートした後、１０Ｍ ＮａＯＨをｐＨが７になるまで加えて中和することによって達成されてよい。

同様に、本明細書で用いられる用語「塩基による不活化」は、ｐＨを上げることによる細胞の不活化を指す。これは通常、細胞またはそれらを含む培地に塩基を加え、続いて細胞または培地を中和することによって達成される。細胞の不活化の目的には強塩基が好ましく、これに限定されるものではないが、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化バリウム［Ｂａ（ＯＨ）_２］、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化ストロンチウム［Ｓｒ（ＯＨ）_２］、水酸化カルシウム［Ｃａ（ＯＨ）_２］、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）および水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）が挙げられる。塩基の強度は、酸を脱プロトン化するその能力を指す。例えば不活化は、ＮａＯＨを細胞に、濃度が８０ｍＭに達するまで加え、細胞を５５℃にて４時間インキュベートした後、９６％ Ｈ_２ＳＯ_４をｐＨが７になるまで加えて中和することによって達成されてよい。

本明細書で用いられる用語「過酸化物による不活化」は、過酸化物を用いた細胞の不活化を指す。過酸化物は、酸素−酸素の単結合、または過酸化物の陰イオンであるＯ_２ ^２−を含む化合物であり、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、スーパーオキシド、ジオキシゲニル、オゾンおよびオゾニドが挙げられる。例えば細胞の不活化は、細胞を１．５％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏ_２中で３７℃にて１時間インキュベートすることによって達成されてよい。続いて、細胞をカタラーゼ処理することによってＨ_２Ｏ_２を除去する。

本明細書で用いられる用語「アルコールによる不活化」は、アルコールを用いた細胞の不活化を指す。アルコールは飽和炭素原子に結合した−ＯＨ官能基を有する有機ヒドロキシル化合物であり、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノールが挙げられる。例えば細胞の不活化は、９６％エタノールによって細胞培養を１：１希釈した後、３７℃にて１時間インキュベートすることによって達成されてよい。続いて、回転式エバポレーター、すなわちｒｏｔａｖａｐ内での蒸発によってエタノールを除去する。

好ましい実施形態によれば、不活化は熱不活化である。

不活化工程の結果、本発明のプロバイオティック株の細胞は、非生細胞か、または死細胞ともなる。

あるいは、本発明の第１の方法は、細胞を、６乃至９のｐＨにて、それらの活発な増殖期の間に培養することを含んでなる。

この本発明の第１の方法の代替法に従って細胞を増殖させるためには、培養液のｐＨが、６乃至９、好ましくは６乃至８．５、さらに好ましくは６乃至８、さらになお好ましくは６乃至７．５、さらになお好ましくは６乃至７、または、さらになお好ましくは６乃至６．５であることが必要になる。特定の実施形態によれば、ｐＨは６である。

通常の知識を有する当業者は、ｐＨ６乃至９が、そのｐＨを有する培地の使用によって得られるであろうことを、直ちに理解するであろう。この範囲のｐＨを有する培地は当該技術分野において公知であるが、ｐＨ６乃至９は、適切な酸、例えばＨＣｌ、または塩基、例えばＮａＯＨを用いてｐＨを調節することによって、いずれの培地においても得られるであろう。

別の特定の実施形態によれば、本発明の第１の方法は、６乃至９のｐＨにおいて細胞を培養する工程を含んでなり、前記細胞を不活化させる工程をさらに含んでなる。

本明細書で用いられる用語「活発な増殖期」は、総生物量または細胞数の増加によって特徴付けられる、細菌増殖の段階を指す。細菌増殖は、通常、時間に対して細胞数の対数をプロットする、増殖曲線の形で表現され得る。バッチ培養における細菌の増殖は、４つの異なる相によって表すことができる。
−この間に細菌が増殖条件に順応し、細胞数の増加率が最小である、誘導期。
−増殖率が、特定の増殖条件に対して一定かつ最大になるまで徐々に増加する（早期の対数期）ことによって特徴付けられる対数期（Ｌｏｇ ｐｈａｓｅまたはｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）。
−増殖率が低下し（早期の静止期）、最終的にはゼロになることによって特徴付けられる、静止期。
−この間に培養中の生細胞数が低下する、死滅期。

したがって当業者は、活発な増殖期が、早期の対数期から早期の静止期まで拡大することを、直ちに理解するであろう。

細菌増殖は、細胞数をモニターすることによって、所定の時間間隔に形成された生物量の乾燥重量の増大を測定することによって、特定の物質の取り込みおよび代謝（または放出）をモニターすることによって、および所定の時間内に生物量に取り込まれた放射性の代謝産物の量を測定することによって、測定されてよい。典型的には、細胞数は、分光光度計を用いて吸光度を測定することにより、懸濁液中の細菌濃度を決定することによって測定され、この目的のためには一般にＯＤ６００が用いられる。

本発明の第１の方法によって得られた細胞は、不活化を行っていない細胞に比較して、増加されたコレステロール吸収能を示す。

本明細書で用いられる用語「増加されたコレステロール吸収能」は、不活化に供されていない細胞のコレステロール吸収能に対して、少なくとも１０１％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％以上のコレステロール吸収能を指す。細胞のコレステロール吸収能を決定するために適した方法として、これに限定されるものではないが、本特許出願の実施例の項に記載される方法が挙げられ、この方法は、ミセルから細菌内へのフルオレステロールの取り込みの、蛍光光度法または蛍光サイトメトリーによる検出に基づく。

本発明はまた、本発明の第１の方法によって得られた細胞も企図する。したがって別の態様によれば、本発明は、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株のコレステロール吸収能を増大させるための方法であって、細胞を不活化させる工程を含んでなる方法、によって得られた細胞に関する。

別の態様によれば、本発明は、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株のコレステロール吸収能を増大させるための方法であって、細胞を６以上のｐＨにて培養する工程を含んでなる方法、によって得られる細胞に関する。

驚くべきことに本発明者らは、コレステロール吸収能を有する細胞を、そのコレステロール吸収能を増大させるために改変可能であることも観察した。実施例７に示すように、前記改変は、細胞を、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株から得た細胞抽出物と共にインキュベートすることによって行われる。コレステロール吸収活性の吸収の増大を引き起こす物質は、ムレイン加水分解酵素活性を有する酵素であると同定された。いずれかの理論に制約されるものではないが、ペプチドグリカン加水分解酵素は、コレステロール吸収能を有する微生物の細胞壁の透過、またはコレステロールを含有するミセルに対するその細胞壁の親和性増大に役割を果たしていると思われる。これにより、微生物によって吸収されるコレステロールの量は増大し得る。さらに、この効果は、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株が発現するペプチドグリカン加水分解酵素に特異的であるとみられる。

したがって別の態様によれば、本発明は、コレステロール吸収能を有する微生物を、ペプチドグリカン加水分解酵素活性を有する酵素を含んでなる組成物とを接触させることを含んでなる、増加されたコレステロール吸収能を有する微生物を得るための方法に関し、この方法は以下「本発明の第２の方法」と称される。

用語「コレステロール吸収能」および「増加されたコレステロール吸収能」については、本発明のプロバイオティック株および本発明の第１の方法に関連して詳述されており、それらの定義および実施形態は参照によって本明細書に含まれる。

本発明の第２の方法は、コレステロール吸収能を有する微生物を、ペプチドグリカン加水分解酵素を含んでなる組成物と接触させる工程を含んでなる。

本明細書で用いられる用語「微生物」は、、単細胞または多細胞生物であってよく、かつ原核生物または真核生物であってもよい、コレステロール吸収能を有する微視的生物を指す。微生物がコレステロール吸収能を有するか否かを決定するための方法は、本発明のプロバイオティック株に関連して詳述されており、それらは参照によって本明細書に含まれる。

特定の実施形態によれば、コレステロール吸収能を有する微生物は原核生物である。別の特定の実施形態によれば、コレステロール吸収能を有する微生物は真核生物である。

好ましい実施形態によれば、コレステロール吸収能を有する微生物は、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株の細菌である。別の好ましい実施形態によれば、コレステロール吸収能を有する微生物は、ＣＥＣＴ８６０６ Ｂ．ブレーベＢＴ８２０株の細菌である。

本発明の目的のため、コレステロール吸収能を有する微生物と接触させる組成物は、ペプチドグリカン加水分解酵素を含んでなる。本明細書で用いられる用語「ペプチドグリカン加水分解酵素」または「ムレイン加水分解酵素」は、ペプチドグリカンの加水分解を触媒する酵素、すなわちペプチドグリカン小嚢（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｓａｃｃｕｌｉ）またはその断片内の共有結合を切断できる酵素を指す。これらの酵素の生理的機能としては、細胞壁の発達の制御、細胞分裂および自己融解の間の娘細胞の分離、および増殖する間のペプチドグリカンの代謝回転が挙げられ、ここで代謝回転による産物は、別の生物が細菌を認識するための、またある種の細菌ではβ−ラクタマーゼ誘導のための、シグナル伝達分子として役立つ。特殊な加水分解酵素は、大きなトランスエンベロープ複合体（線毛、鞭毛、分泌系）を構築するペプチドグリカンの細孔を拡大するか、または胞子形成もしくは発芽の間にペプチドグリカンを特異的に切断する。さらに、ペプチドグリカン加水分解酵素は、細菌集団に起こる同胞の死滅または発生上の溶解のような、溶解現象にも関連する。

ペプチドグリカン加水分解酵素活性は、ペプチドグリカン内のアミド、ペプチドおよびグリコシド結合の加水分解を指す。様々なペプチドグリカン加水分解酵素およびそれらの各切断部位については、Ｖｏｌｌｍｅｒら、２００８（Ｖｏｌｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３２：２５９−８６）に記載されている。簡単に述べると、ペプチドグリカン加水分解酵素には以下のものが含まれる。
−ペプチドステムの、ＭｕｒＮＡｃとＮ−末端Ｌ−アラニン残基との間のアミド結合を加水分解するＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ類。これらには、１，６−無水ＭｕｒＮＡｃ残基の部位を特異的に切断する幾つかのアミダーゼ類（ａｎｈＡｍｉ）が含まれる。
−ペプチド結合を加水分解して、Ｃ−末端のＤ−またはＬ−アミノ酸を除去するカルボキシペプチダーゼ類。これらには、ＤＤ−カルボキシペプチダーゼ、ＬＤ−カルボキシペプチダーゼおよびＤＬ−カルボキシペプチダーゼが含まれる。
−ペプチド内のアミド結合を切断するエンドペプチダーゼ類。これらには、ＤＤ−エンドペプチダーゼ、ＬＤ−エンドペプチダーゼおよびＤＬ−エンドペプチダーゼが含まれる。
−グリカン鎖を切断するグリコシダーゼ類。これらには、以下の３つのタイプのグリコシダーゼがある。
ａ）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基と、隣接する単糖との間のグリコシド結合を加水分解するＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、
ｂ）リゾチーム、および
ｃ）溶解性トランスグリコシラーゼ。

リゾチームおよび溶解性トランスグリコシラーゼもまた、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ムラミダーゼ（ムラミダーゼ）として集合的に知られており、これらは同じグリコシド結合、すなわちペプチドグリカン内のＭｕｒＮＡｃとＧｌｃＮＡｃ残基との間のβ１，４−グリコシド結合を切断する（図１Ｂ）。

ペプチドグリカン加水分解酵素の活性はしばしば、二次修飾の存在または非存在により、または高分子量ペプチドグリカンまたは小断片のいずれであるかにより、あるタイプのペプチドグリカンに特異的である。したがって、ペプチドグリカン加水分解酵素は、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、またはグリコシダーゼからなる群から選択される。

特定の実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素はＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼである。別の特定の実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素はカルボキシペプチダーゼである。別の特定の実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素はエンドペプチダーゼである。別の特定の実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、リゾチームおよび溶解性トランスグリコシラーゼからなる群から選択されるグリコシダーゼである。

好ましい実施形態によれば、グリコシダーゼはＮ−アセチルグルコサミニダーゼである。別の好ましい実施形態によれば、グリコシダーゼはリゾチームである。別の好ましい実施形態によれば、グリコシダーゼは溶解性トランスグリコシラーゼである。

別の特定の実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素は、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株に特異的なペプチドグリカン加水分解酵素である。

ペプチドグリカン加水分解酵素が、コレステロール吸収能を有する微生物におけるコレステロール吸収能の増大に対して、その能力を発揮するためには、ペプチドグリカン加水分解酵素を前記生物と接触させる必要がある。当業者は、接触工程が多様な方法によって実行されてよいことを容易に理解するであろう。このような方法の１つは、前記生物においてペプチドグリカン加水分解酵素を組換え技術によって発現させることによるものである。

したがって特定の実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素を含んでなる組成物は、前記ペプチドグリカン加水分解酵素を発現する生物の抽出物である。

ペプチドグリカン加水分解酵素の組換えによる発現は、当該技術分野における従来法を用いて行われてよい。好ましくは、ペプチドグリカン加水分解酵素をコードするヌクレオチド配列は、酵素が含み得るいずれかの天然のシグナルペプチドもコードする。例えばヌクレオチド配列は、発現制御配列へ作動的に結合してよく、これによって遺伝子コンストラクトまたは発現カセットが形成される。本明細書で用いられる用語「機能的に連結する」は、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドグリカン加水分解酵素が、調節配列または発現制御配列の調節下で、正確な読み枠において発現されることを意味する。本発明の発現カセットは、当該技術分野において公知の分子生物学的技術によって得ることができる。調節配列は、前記ペプチドグリカン加水分解酵素の転写、ならびにそれが当てはまる場合には翻訳を調節および制御する配列であり、プロモーター配列、転写制御因子をコードする配列、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）および／または転写ターミネーター配列を含む。本発明に関連した適切なプロモーターとしては、誘導性および恒常性のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。発現カセットは、プロモーター配列に隣接しているかまたは離れており、転写を増大させることによって機能するエンハンサーをさらに含んでよい。特定の実施形態によれば、前記発現調節配列は、原核細胞内で機能的である。別の特定の実施形態によれば、前記発現調節配列は、真核細胞内で機能的である。

有利には、発現カセットは、前記発現カセットによって形質転換された宿主細胞の選択を可能にするモチーフまたは表現型をコードするマーカーもしくは遺伝子をさらに含んでなる。本発明の発現カセット内に含まれてよい前記マーカーの例としては、抗生物質耐性遺伝子、毒性化合物に対して抵抗性の遺伝子が挙げられ、一般にこれらはすべて、遺伝的に形質転換された細胞の選択を可能にする。

発現カセットは、適切なベクター内に挿入されてよい。ベクターの選択は、それが続いて導入される宿主細胞、すなわちコレステロール吸収能を有する微生物に依存するであろう。例示目的で、前記核酸配列が導入されるベクターは、宿主細胞内に導入された際、前記細胞のゲノムに統合されるかまたはされない、プラスミドまたはベクターであってよい。前記発現ベクターの取得は、当業者に公知の従来の方法によって行われてよい。特定の実施形態によれば、前記組換えベクターは、原核細胞の形質転換に有用なベクターである。特定の実施形態によれば、前記組換えベクターは、真核細胞の形質転換に有用なベクターである。

コレステロール吸収能を有する微生物の細胞を形質転換、トランスフェクションまたは感染させるために、ペプチドグリカン加水分解酵素をコードする配列を含んでなるベクターを用いることができる。形質転換、トランスフェクションまたは感染させた細胞は、当業者に公知の従来法によって得ることができる。このような細胞は、原核生物または真核生物の細胞であってよい。したがって、得られた形質転換、トランスフェクションまたは感染させた細胞は、ペプチドグリカン加水分解酵素をコードする配列を含んでなる。

ペプチドグリカン加水分解酵素をコードする配列を含む遺伝子コンストラクト、発現カセットおよびベクターもまた本発明の態様である。

コレステロール吸収能を有する微生物が、ペプチドグリカン加水分解酵素を含んでなる発現ベクターをいったん取り入れると、前記ペプチドグリカン加水分解酵素は、当業者に公知の従来法によって組換え的に発現し得る。例えば、ペプチドグリカン加水分解酵素の組換え発現は誘導的または恒常的であってよい。好ましくは、組換え的に発現したペプチドグリカン加水分解酵素は分泌される。

したがって、得られた、組換え的に発現したペプチドグリカン加水分解酵素は、組成物、好ましくは細胞外の組成物の一部を形成する。この組成物はコレステロール吸収能を有する微生物と接触し、それによって前記コレステロール吸収能を増大させる機能を発揮する。

コレステロール吸収能を有する微生物のコレステロール吸収能の増大に関与するペプチドグリカン加水分解酵素は、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株に特異的に発現していると思われることから、本発明の第２の方法もまた、前記株から得たタンパク質抽出物を用いて実行され得る。

したがって別の特定の実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素を含んでなる組成物は、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株のタンパク質抽出物である。好ましくは、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株の細胞は、６以上のｐＨにて培養される。

本明細書で用いられる用語「タンパク質抽出物」は、細胞のタンパク質内容を指す。幾つかの実施形態によれば、タンパク質抽出物は、「総タンパク質抽出物」または「未精製タンパク質抽出物」を指し、これは本発明の株に由来し、細胞壁や大きな細胞小器官の断片または破片をほとんど含まないタンパク質の収集物を指す。代表的な実施形態によれば、全組織タンパク質抽出物は、細菌を溶解緩衝液へ加えることによって得てよいが、本発明はこれに限定されない。しかしながら、全タンパク質抽出物は、当該技術分野において公知のいずれかの抽出法を用いて抽出してよい。

タンパク質抽出物を得るための方法は従来法であり、当業者に公知である。通常、タンパク質は、これを含む細胞を破砕することによって溶液とする。これを達成するためには幾つかの方法があり、例えば凍結と融解の反復、超音波処理、高圧による均質化、濾過、または有機溶媒による透過処理が挙げられる。

幾つかの実施形態によれば、タンパク質抽出物は、ペプチドグリカン加水分解酵素活性を豊富にするために少なくとも部分的に分画され、これによって「ペプチドグリカン加水分解酵素−濃縮抽出物」が得られる。ペプチドグリカン加水分解酵素−濃縮抽出物を得るために、当該技術分野において公知の、いずれかの適切な方法を用いることができ、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、ゲル濾過、電気泳動、塩析および透析などが、ペプチドの分離および精製を可能にするために、適切に選択され、組み合わされる。ペプチドグリカン加水分解酵素活性の豊富さの程度は、濃縮抽出物における特異的なペプチドグリカン加水分解酵素活性を測定することによって決定することができ（すなわちｍｇタンパク質あたりのペプチドグリカン加水分解酵素活性の単位）、ここで未精製抽出物における活性の増大は、抽出物のペプチドグリカン加水分解酵素活性が豊富であることを表している。好ましい実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素−濃縮抽出物は、未精製抽出物に見出される活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％であるペプチドグリカン加水分解酵素活性を含む。別の実施形態によれば、ペプチドグリカン加水分解酵素−濃縮抽出物は、未精製抽出物の活性の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍以上のペプチドグリカン加水分解酵素活性を含む。

本発明の第２の方法の接触工程は、ペプチドグリカン加水分解酵素を含む組成物が、ペプチドグリカンが切断されるために十分な時間、コレステロール吸収能を有する微生物と接触させることを必要とする。接触工程は、少なくとも１秒、少なくとも１０秒、少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間以上である。

微生物のコレステロール吸収能が増加されたか否かを決定するために、当業者は、コレステロール吸収能を決定し、本発明の第２の方法に供されていない同じ微生物のコレステロール吸収能と比較する必要があることを認識するであろう。細胞のコレステロール吸収能を決定するための方法は、本発明のプロバイオティック株に関連して記載されており、これらは参照によって本明細書に含まれる。

本発明はまた、本発明の第２の方法によって得られた細胞も企図する。

したがって、前記微生物をペプチドグリカン加水分解酵素を含んでなる組成物と接触させることを含んでなる、コレステロール吸収能を有する微生物のコレステロール吸収能を増大させる方法によって得られる細胞も、本発明の別の態様である。

組成物および飼料または栄養製品
当業者は、本発明のプロバイオティック株が、組成物、飼料または栄養製品の一部として特に有用であることを直ちに理解するであろう。

したがって別の態様によれば、本発明は、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物に関する。

用語「プロバイオティック株」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０」、「バリアント」および「コレステロール吸収能」は、本発明のプロバイオティック株に関連して詳述されており、それらの定義および実施形態は参照によって本明細書に含まれる。

特定の実施形態によれば、該組成物は、本発明のプロバイオティック株の混合物を含んでなる。

好ましくは、該組成物は、本発明の株を、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、またはそれを超えて含んでなり、組成物中のそれぞれの株の割合は０．１％乃至９９．９％、好ましくは１％乃至９９％、さらに好ましくは１０％乃至９０％である。別の実施形態によれば、該組成物は、本発明のいずれかの細菌株を、別の株または株の混合物と共に含んでなり、組成物中のそれぞれの株の割合は０．１％乃至９９．９％、好ましくは１％乃至９９％、さらに好ましくは１０％乃至９０％である。別の実施形態によれば、本発明は、１つ以上の本発明の株の培養上清を含んでなる組成物を提供する。好ましくは、組成物中の上清の株の割合は０．１％乃至９９．９％、さらに好ましくは１％乃至９９％、さらになお好ましくは１０％乃至９０％である。

別の特定の実施形態によれば、本発明はまた、当該技術分野において公知の従来法によって得ることができる、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）または乾燥させた形態である、本発明の株の組成物も指す。

別の特定の実施形態によれば、プロバイオティック株またはその混合物は、非生細胞の形態である。

別の態様によれば、本発明は、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品に関する。

用語「プロバイオティック株」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０」、「バリアント」および「コレステロール吸収能」は、本発明のプロバイオティック株に関連して詳述されており、それらの定義および実施形態は参照によって本明細書に含まれる。

特定の実施形態によれば、該飼料または栄養製品は、本発明のプロバイオティック株の混合物を含んでなる。

好ましくは、該飼料または栄養製品は、本発明の株を、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、またはそれを超えて含んでなり、組成物中のそれぞれの株の割合は０．１％乃至９９．９％、好ましくは１％乃至９９％、さらに好ましくは１０％乃至９０％である。別の実施形態によれば、該飼料または栄養製品は、本発明のいずれかの細菌株を、別の株または株の混合物と共に含んでなり、組成物中のそれぞれの株の割合は０．１％乃至９９．９％、好ましくは１％乃至９９％、さらに好ましくは１０％乃至９０％である。別の実施形態によれば、本発明は、１つ以上の本発明の株の培養上清を含んでなる飼料または栄養製品を提供する。好ましくは、飼料または栄養製品中の上清の株の割合は０．１％乃至９９．９％、さらに好ましくは１％乃至９９％、さらになお好ましくは１０％乃至９０％である。

本発明において使用できる適切な食品の例としては、牛乳、ヨーグルト、チーズ、凝乳、発酵乳、牛乳ベースの発酵製品、発酵シリアルベースの製品、発酵肉製品、その他の牛乳ベースまたはシリアルベースの粉末、臨床栄養処方、アイスクリーム、ジュース、パン、ケーキまたはキャンディー、動物飼料用処方、半合成または合成食餌処方、調製粉乳、臨床栄養処方、アイスクリーム、ジュース、小麦粉、パン、ケーキ、キャンディーまたはチューインガムが挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態によれば、本発明のプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品は、当該技術分野において公知の従来法によって得ることができる、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）または乾燥させた形態である、

飼料または栄養製品の別の実施形態によれば、プロバイオティック株またはその混合物は、非生細胞の形態である。

治療上の用途
実施例１に示すように、本発明者らは、本発明のプロバイオティック株は、フルオレステロールを含有するミセルの存在下で、腸細胞株であるＨＴ−２９細胞と共培養した際、ＨＴ−２９細胞のフルオレステロールの吸収を減少させられることを示した。これは、ミセルの捕捉に対して、プロバイオティック細胞がＨＴ−２９細胞と競合した結果である（実施例２を参照）。この効果は、脂質代謝異常のような、血漿中のコレステロール濃度が関連している疾病の治療において利用される可能性がある。本発明者らは、本発明のプロバイオティック株が、高コレステロール血症のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、血漿総コレステロール、ＬＤＬ／ＨＤＬ指数、および糖血症レベルを低下させることを示した（実施例８を参照）。

したがって別の態様によれば、本発明は、薬剤としての用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株に関する。

別の態様によれば、本発明は、脂質代謝異常の治療および／または予防における用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株に関する。

あるいはこの態様は、脂質代謝異常を治療および／または予防する薬剤の製造のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株の用途に対して、再策定されてよい。あるいはこの態様は、必要とする被験体に脂質代謝異常の治療および／または予防を行うための方法であって、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を投与することを含んでなる方法に対して、再策定されてよい。

用語「プロバイオティック株」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０」、「バリアント」および「コレステロール吸収能」は、本発明のプロバイオティック株に関連して詳述されており、それらの定義および実施形態は参照によって本明細書に含まれる。

本明細書で用いられる用語「治療」または「治療法」は、いずれかの方法、行為、適用、治療法などを含み、ここでヒトを含む被験体（または患者）には、治療の下に、被験体の状態を直接もしくは間接的に改善させるか、または被験体の疾患の状態の進行を遅延させるか、または疾病もしくは疾患の少なくとも１つの症状を寛解させる目的で、医療援助が提供される。特に、治療との用語は、脂質代謝異常と診断された被験体への、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株の投与に関する。

本明細書で用いられる用語「予防」、「予防している」または「予防する」は、脂質代謝異常と診断されてはいないが、通常前記疾病にかかることが予測されるか、または前記疾病のリスクが高い被験体への、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株の投与に関する。該予防は、脂質代謝異常の出現を回避することを意図する。該予防は完全であってよい（例えば疾病の完全な欠如）。該予防はまた、被験体における疾病の出現が、本発明の阻害剤を投与していない者における出現よりも少ないというように、部分的であってもよい。予防はまた、病態に対する感受性の低下も指す。

本明細書で用いられる用語「被験体」は、哺乳類および鳥類に分類されるすべての動物を指し、これに限定されるものではないが、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）、霊長類およびヒト、例えばヒト、非ヒト霊長類、雌ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ニワトリ、カモ、ガチョウ、ハクチョウ、キジ、ドバト、ハト、またはダチョウを含む。好ましくは、患者はいずれかの年齢もしくは人種の、男性または女性のヒトである。

本明細書で用いられる用語「脂質代謝異常」は、血中の脂質および脂質タンパク質の異常な量、すなわち正常値よりも高いかまたは低い脂質の量を指す。脂質および脂質タンパク質は、
−コレステロール、異常な量のコレステロールは、第１９染色体（１９ｐ１３．１〜１３．３）の欠陥による家族性高コレステロール血症を含む高コレステロール血症、および低コレステロール血症を引き起こし得る。
−トリグリセリドのようなグリセリド、異常な量のトリグリセリドは、高トリグリセリド血症および低トリグリセリド血症を引き起こし得る。
−ＬＤＬおよびＨＤＬのようなリポタンパク質、異常な量のリポタンパク質は、高リポタンパク血症および低リポ蛋白血症を引き起こし得る。

本発明のプロバイオティック株は、そのコレステロール吸収能のため、脂質または脂質タンパク質の濃度の増大によって特徴付けられる脂質代謝異常の治療に特に適している。

したがって特定の実施形態によれば、脂質代謝異常は高コレステロール血症である。本明細書で用いられる用語「高コレステロール血症」は、血中コレステロール濃度が臨床的に推奨される濃度を超えて上昇した、いずれかの医学的状態を指す。例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を用いてコレステロールを測定した際に、測定されたＬＤＬ濃度が、例えばおおよそ７０ｍｇ／ｄｌを超えていた場合、高コレステロール血症の可能性がある。あるいは、血漿コレステロールを用いてコレステロールを測定した際に、測定された遊離コレステロール濃度が、例えばおおよそ２００〜２２０ｍｇ／ｄｌを超えていた場合、高コレステロール血症の可能性がある。

別の特定の実施形態によれば、脂質代謝異常は高トリグリセリド血症である。本明細書で用いられる用語「高トリグリセリド血症」は、血中トリグリセリドの高濃度を指す。絶食の程度に基づき、１５０〜９９９ｍｇ／ｄｌのトリグリセリド濃度によって、軽度および中程度の高トリグリセリド血症が診断され、１，０００ｍｇ／ｄｌを超えるトリグリセリド濃度によって、重度および非常に重度の高トリグリセリド血症が診断される。

別の特定の実施形態によれば、脂質代謝異常は高リポタンパク血症である。本明細書で用いられる用語「高リポタンパク血症」は、血中のいずれかのリポタンパク質の異常に上昇した濃度を指す。リポタンパク質には、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＩＤＬが含まれる。高濃度のリポタンパク質は、アテローム性動脈硬化症に付随する。高リポタンパク血症は以下の５タイプに分類される。
−タイプＩ：リパーゼの欠損または異常によって引き起こされる稀な状態で、１，０００〜１０，０００ｍｇ／ｄｌおよびそれを超えるトリグリセリド濃度によって特徴付けられる、脂質誘導性高脂血症または特発性家族性高脂血症。
−タイプＩＩ：細胞表面受容体の欠損によって引き起こされ、コレステロールおよびトリグリセリドの上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の上昇によって特徴付けられる、家族性高βリポタンパク血症および本態性家族性高コレステロール血症。
−タイプＩＩＩ：低密度リポタンパク質受容体の欠損によって引き起こされ、コレステロールおよびトリグリセリドの上昇、中間密度リポタンパクの上昇によって特徴付けられる、家族性ブロードβ病、結節性黄色腫。
−タイプＩＶ：１，０００ｍｇ／ｄＬ未満の低濃度のトリグリセリド、正常コレステロール、ＶＬＤＬの上昇によって特徴付けられる、原因不明の内在性高トリグリセリド血症および高βリポタンパク血症。
−タイプＶ：１，０００ｍｇ／ｄＬを超える高濃度のトリグリセリド、コレステロールの上昇、正常ＬＤＬによって特徴付けられる、不完全なトリグリセリドクリアランスによる混合型高トリグリセリド血症。

おそらくは血中の低ＨＤＬ濃度のため、様々な脂質代謝異常がインスリン抵抗性に関連していることから、本発明のプロバイオティック株は、インスリン抵抗性またはメタボリック症候群の治療にも有用である。

したがって別の態様によれば、本発明は、メタボリック症候群の治療および／または予防における用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株に関する。あるいはこの態様は、メタボリック症候群を治療および／または予防する薬剤の製造のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株の用途に対して、再策定されてよい。あるいはこの態様は、必要とする被験体にメタボリック症候群の治療および／または予防を行うための方法であって、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を投与することを含んでなる方法に対して、再策定されてよい。

本明細書で用いられる用語「メタボリック症候群」または「インスリン抵抗性症候群」または「メタボリック症候群Ｘ」または「心血管代謝症候群」または「症候群Ｘ」は、以下の５つの医学的状態、すなわち腹部（中心性）肥満、血圧上昇、空腹時血漿グルコース上昇、高トリグリセリド血症、および低高密度コレステロール（ＨＤＬ）濃度の低下のうちの３つが同時にみられることによって診断される、エネルギー利用および貯蔵の疾患を指す。メタボリック症候群は、循環器病、特に心不全、および糖尿病の発生のリスクを増大させる。

別の態様によれば、本発明は、コレステロール低下薬としての、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株の用途に関する。

本明細書で用いられる用語「コレステロール低下薬」は、コレステロールの血中濃度の低下を誘発する薬剤を指す。

別の態様によれば、本発明は、薬剤としての用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物に関する。

別の態様によれば、本発明は、脂質代謝異常の治療および／または予防における用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物に関する。

あるいはこの態様は、脂質代謝異常を治療および／または予防する薬剤の製造のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物の用途に対して、再策定されてよい。あるいはこの態様は、必要とする被験体に脂質代謝異常の治療および／または予防を行うための方法であって、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法に対して、再策定されてよい。

別の態様によれば、本発明は、メタボリック症候群の治療および／または予防における用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物に関する。あるいはこの態様は、メタボリック症候群を治療および／または予防する薬剤の製造のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物の用途に対して、再策定されてよい。あるいはこの態様は、必要とする被験体にメタボリック症候群の治療および／または予防を行うための方法であって、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物を投与することを含んでなる方法に対して、再策定されてよい。

別の態様によれば、本発明は、コレステロール低下薬としての、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる組成物の用途に関する。

用語「プロバイオティック株」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１”、「受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０」、「バリアント」、「コレステロール吸収能」、「脂質代謝異常」、「メタボリック症候群」および「コレステロール低下薬」については以前に詳述されており、それらの定義および実施形態は参照によって本明細書に含まれる。

別の態様によれば、本発明は、薬剤としての用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品に関する。

別の態様によれば、本発明は、脂質代謝異常の治療および／または予防における用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品に関する。

あるいはこの態様は、脂質代謝異常を治療および／または予防する薬剤の製造のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品の用途に対して、再策定されてよい。あるいはこの態様は、必要とする被験体に脂質代謝異常の治療および／または予防を行うための方法であって、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品を投与することを含んでなる方法に対して、再策定されてよい。

別の態様によれば、本発明は、メタボリック症候群の治療および／または予防における用途のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品に関する。あるいはこの態様は、メタボリック症候群を治療および／または予防する薬剤の製造のための、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品の用途に対して、再策定されてよい。あるいはこの態様は、必要とする被験体にメタボリック症候群の治療および／または予防を行うための方法であって、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品を投与することを含んでなる方法に対して、再策定されてよい。

別の態様によれば、本発明は、コレステロール低下薬としての、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる飼料または栄養製品の用途に関する。

用語「プロバイオティック株」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１”、「受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０」、「バリアント」、「コレステロール吸収能」、「脂質代謝異常」、「メタボリック症候群」および「コレステロール低下薬」については以前に詳述されており、それらの定義および実施形態は参照によって本明細書に含まれる。

医薬品
当業者は、本発明のプロバイオティック株が、医薬品の一部として特に有用であることを直ちに理解するであろう。

したがって別の態様によれば、本発明は、治療上有効な量の、受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記株のバリアントから選択されるプロバイオティック株を含んでなる医薬品に関する。

用語「プロバイオティック株」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているＬ．ロイテリＶ３４０１」、「受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているＢ．ブレーベＢＴ８２０」、「バリアント」および「コレステロール吸収能」は、本発明のプロバイオティック株に関連して詳述されており、それらの定義および実施形態は参照によって本明細書に含まれる。

本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、脂質代謝異常、インスリン抵抗性またはメタボリック症候群の１つ以上の顕著な症状の予防、治癒、遅延、重症度の低下を達成するために必要な、本発明のプロバイオティック株の量を指す。脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびメタボリック症候群との用語は、本発明の治療上の用途に関連して詳述されており、それらの定義および特徴もまた、参照によって本明細書に含まれる。本発明のプロバイオティック株の治療上有効な量は、当該技術分野における従来法によって決定されてよい。

特定の実施形態によれば、該医薬品は、本発明のプロバイオティック株の混合物を含んでなる。

好ましくは、該医薬品は、本発明の株を、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、またはそれを超えて含んでなり、組成物中のそれぞれの株の割合は０．１％乃至９９．９％、好ましくは１％乃至９９％、さらに好ましくは１０％乃至９０％である。別の実施形態によれば、該医薬品は、本発明のいずれかの細菌株を、別の株または株の混合物と共に含んでなり、組成物中のそれぞれの株の割合は０．１％乃至９９．９％、好ましくは１％乃至９９％、さらに好ましくは１０％乃至９０％である。別の実施形態によれば、本発明は、１つ以上の本発明の株の培養上清を含んでなる医薬品を提供する。好ましくは、医薬品中の上清の株の割合は０．１％乃至９９．９％、さらに好ましくは１％乃至９９％、さらになお好ましくは１０％乃至９０％である。

特定の実施形態によれば、該医薬品は、本発明のプロバイオティック株の混合物を含んでなる。

本発明により提供される医薬品または組成物は、脂質代謝異常、インスリン抵抗性またはメタボリック症候群を治療するために、被験体へ投与できる。脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびメタボリック症候群との用語は、本発明の治療上の用途に関連して詳述されており、それらの定義および特徴もまた、参照によって本明細書に含まれる。

別の特定の実施形態によれば、該医薬品または組成物は、１つ以上の担体、賦形剤、または薬剤的に許容される溶媒をさらに含んでなる。

本発明に関連する用語「薬剤的に許容される担体」または「薬剤的に許容される溶媒」または「薬剤的に許容される賦形剤」は、医薬品の投与に適したいずれかの、およびすべての、溶媒、分散媒、コーティング、および抗真菌薬などを含むことが意図される。薬剤的な有効物質に対するこのような担体およびビヒクルの使用は、いずれかの従来の担体が本発明のプロバイオティック株に適合しない場合を除き、当該技術分野において公知である。安定剤は、被験体に対し、使用される投与量および濃度において無毒性の許容される担体、賦形剤、または溶媒であり、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０アミノ酸未満）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖類；ナトリウム塩のような対イオンの形成剤；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。

本発明により提供される医薬品または組成物は、コンテナー、パック、またはディスペンサーに、投与の指示と共に含まれてよい。

医薬調製品は、錠剤、カプセル、菌液、乾燥経口サプリメント、湿潤経口サプリメント、乾燥チューブ食または湿潤チューブ食の形であってよい。好ましくは、プロバイオティクス、プロバイオティクスを含むかまたは上清を含む組成物および医薬品は、経口、胃および／または腸粘膜表面へ向けたものであるが、鼻咽頭、呼吸器、生殖器または腺粘膜にもまた向けられてよく、経口、経鼻、経眼、経直腸、外用および／または膣経路によって被験体に投与されてもよい。

前述の組成物、飼料もしくは栄養製品、または医薬品組成物中のプロバイオティック株の、必要とされる投与量は、疾患の性質または提唱される組成物の用途、および関連する生物のタイプに従って変動するであろう。

本発明では、毒性効果が治療効果を上回らない限りにおいて、プロバイオティクスまたはそれらの混合物のいずれかの適切な投与量が用いられてよい。治療上の有効性および毒性は、実験動物を用いた標準的な製薬手順、例えばＥＤ（集団の５０％に対して治療上有効な用量）またはＬＤ（集団の５０％に対して致死的な用量）の統計を算出することによって決定されてよい。治療効果に対する毒性効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ／ＥＤ比として表される。それでもなお、個体における新しい株の活性は必然的に用量依存性である。すなわち、上記の食品材料または医薬組成物の摂取または投与によって取り込まれる新規株が多いほど、その株の予防および／または治療活性は高くなる。本発明の株はヒトおよび動物に対して有害ではないことから、主に高い割合で、個体の粘膜に新規株がコロニー形成するように、大量の株が取り込まれてよい。高い治療指数を示す組成物が好ましい。実験動物から得られたデータは、ヒトまたは動物に使用するための投与量の範囲を処方するために用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、好ましくは、毒性が少ないかまたはみられない、ＥＤを含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用する剤形、患者の感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。正確な投与量は、実行者により、治療を必要とする被験体に関する因子に照らして決定されるであろう。例えば、本発明の食品組成物を調製するため、本発明のプロバイオティック株は、１０５ｃｆｕ／ｇ乃至約１０１２ｃｆｕ／ｇ支持体材料、好ましくは約１０６ｃｆｕ／ｇ乃至約１０１１ｃｆｕ／ｇ支持体材料、さらに好ましくは約１０６ｃｆｕ／ｇ乃至約１０１０ｃｆｕ／ｇ支持体材料の量において、適切な支持体内に取り込まれる。

医薬品または組成物の場合、プロバイオティック株の投与量は、約１０５ｃｆｕ／ｇ乃至約１０１４ｃｆｕ／ｇ支持体材料、好ましくは約１０６ｃｆｕ／ｇ乃至約１０１３ｃｆｕ／ｇ支持体材料、さらに好ましくは約１０７ｃｆｕ／ｇ乃至約１０１２ｃｆｕ／ｇ支持体材料でなければならない。本発明の目的のため、ｃｆｕの略語は、寒天プレート上の細菌学的計数によって明らかになる細菌細胞数として定義される、「コロニー形成単位」を指すものとする。

投与量および投与は、十分な濃度の有効成分を供給するか、または望ましい効果を維持するために調整される。考慮され得る因子には、疾病状態の重症度、被験体の全体的健康、被験体の年齢、体重および性別、投与時間および頻度、薬物の単数または複数の組み合わせ、治療法への反応感度および応答が含まれる。時間作用型の組成物は、特定の処方の半減期およびクリアランス率に応じて、毎日、３乃至４日ごと、毎週、または隔週に投与されてよい。

別の実施形態によれば、本発明はまた、当該技術分野において公知の従来法によって得ることができる、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）または乾燥させた形態である、本発明の株の医薬品または組成物も指す。

医薬品または組成物の別の実施形態によれば、プロバイオティック株またはその混合物は、非生細胞の形態である。

生物学的材料の寄託
ラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１は、ブダペスト条約に規定される条件下に、スペイン培養細胞系統保存機関（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ（英語ではＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｐａｎｉｓｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＥＣＴ）（Ｅｄｉｆｉｃｉｏ ３ ＣＵＥ，Ｐａｒｃ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ ｄｅ Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ Ａｇｕｓｔｉｎ Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ ９，４６９８０ パテルナ、スペイン）に寄託された。寄託は２０１４年９月２５日に行われ、ＣＥＣＴ８６０５を受けている番号が割り当てられた。

ビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０は、ブダペスト条約に規定される条件下に、スペイン培養細胞系統保存機関（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ（英語ではＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｐａｎｉｓｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＥＣＴ）（Ｅｄｉｆｉｃｉｏ ３ ＣＵＥ，Ｐａｒｃ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ ｄｅ Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ Ａｇｕｓｔｉｎ Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ ９，４６９８０ パテルナ、スペイン）に寄託された。寄託は２０１４年９月２５日に行われ、ＣＥＣＴ８６０６を受けている番号が割り当てられた。

以下の実施例は本発明の例示のために提供されるものであり、その範囲を限定するとみなされてはならない。

材料および方法
細菌株および増殖条件
ラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１およびその他の乳酸桿菌種は、ＭＲ培地（Ｏｘｏｉｄ）中で、３７℃にて嫌気性条件下でルーチン培養した。ビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０およびその他のビフィズス菌は、ＭＲＳ−システイン（０．１％ｐ／ｖ）培地中で、これも３７℃にて嫌気的に増殖させた。不活化手順および活性アッセイのための細胞懸濁液は、Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ ５Ｌ 発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）内の標準的な増殖培地中で８〜２４時間増殖させた。特に、培地Ａおよび培地Ｂを異なるｐＨにて用いた。８，０００ｇの遠心分離によって生物量を濃縮し（１０×）、使用時まで−２０℃にて保管した。

ＡＰＩ ５０ＣＨテスト（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）を供給者の指示に従って用いることによって、Ｌ．ロイテリＶ３４０１の、様々な炭素源を用いた増殖能を試験した。インキュベーション２４時間目および４８時間目に発酵ストリップを分析した。

細菌不活化の手順
不活化細菌のサンプルを調製した際に、以下の手順を行った。熱不活化は、標準的な実験室用オートクレーブ内で、１２０℃にて２０分間行った。マイクロ波による不活化は装置を用いて行い、ここで細菌サンプルを３００Ｗまでの出力急昇に３分間供し、最後の５分間この出力値にてインキュベートした。圧力による不活化は、マイクロフルイディクスＭ−１１０Ｐホモジナイザー内で、１５〜２０パルス／分、１０分間１，５００〜２，０００ｂａｒにて行った。酸による不活化の条件は、８０ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４中で４時間５５℃にてインキュベーション後、１０Ｍ ＮａＯＨによる中和を行うこと（ｐＨが７になるまで）であった。塩基による不活化も同じ手順に従ったが、最初に８０ｍＭ ＮａＯＨを用い、次に９６％Ｈ_２ＳＯ_４によるアルカリの中和を行った。化学的な不活化は、細菌サンプルを１．５％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏ_２または５０％（ｖ／ｖ）エタノールと共に１時間３７℃にてインキュベートすることによって行った。化学薬品は、それぞれ、カタラーゼを用いた酵素処理または蒸発によって除去した。

腸細胞の培養
ＨＴ−２９腸細胞は、グラナダ大学（スペイン）のＣＩＣから入手し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、非必須アミノ酸および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２にて培養した。フルオレステロール吸収のための培養は、９６ウェルプレートを用いて１４日間増殖させ、フルオレステロールのミセルと５・１０^８細菌／ｍＬの菌液とを３〜４時間インキュベートした。また陽性対照として１５０μＭ エゼチミブ（ＭＳＤ−ＳＰ Ｌｔｄ）を用いた。蛍光サイトメトリーによるアッセイの前に、ＨＴ−２９の培養をトリプシン処理によって脱凝集させ、遠心分離によって培地とフルオレステロールのミセルとを除去した後、腸細胞をＰＢＳ緩衝液中に懸濁させた。

フルオレステロール吸収の分析
Ｓｐａｒｒｏｗらによって記載されたように（Ｓｐａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４０：１７４７−５７）、１０ｍＭ タウロコール酸ナトリウム、６ｍＭ ホスファチジルコリンおよび０．２ｍＭ フルオレステロールを含有するフルオレステロールのミセルを調製した。菌液（５・１０^８細菌／ｍＬ）とミセル（０．１ｍｇ／ｍＬ フルオレステロール）とをＰＢＳ緩衝液中で３７℃にてインキュベートして、細菌によるフルオレステロールの吸収を分析した。２時間のインキュベーション後、混合液を５．０００ｇにて５分間遠心分離し、上清を廃棄して、細菌ペレットを０．１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。この手順を３回繰り返して、フルオレステロールミセルを除去した。最終的に、細菌に付随する蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｉｕｓ マイクロプレートリーダー（４８５ｎｍ 励起、５３５ｎｍ 発光フィルター）またはＢｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて決定した。フローサイトメトリー技術を用いた際、細菌は、その集団を同定するために、ホウ酸緩衝液（２０ｍＭ ホウ酸ナトリウム；１２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．０１％ ホルムアルデヒドおよび０．０１ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中のエチジウムブロマイド（１０μｇ／ｍＬ）によっても染色した（蛍光の読み取りは、それぞれが４８８ｎｍおよび６６１ｎｍの、励起および発光波長によって行った）。吸収されたフルオレステロールは、各サンプルにおける２，０００イベントから得た、細胞あたりの蛍光のデータ（λｅｘ：４８８ｎｍ；λｅｍ：５３０ｎｍ）に基づいて定量した。

ＨＴ−２９腸細胞によって吸収されたフルオレステロールは、前述の機器および同じレーザー設定を用いて、フローサイトメトリーのみによって定量したが、真核細胞集団を同定するためのエチジウムブロマイド染色は必要ではなかった。各アッセイにおいて、陰性対照（フルオレステロールのミセルと共にインキュベートした腸細胞）から得たデータを、問題となるサンプル中の相対的（％）吸収を算出するための参照として用いた。

顕微鏡法
ｐＨ６の培地ＡおよびｐＨ５の培地Ｂ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１の透過型電子顕微鏡像は、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｌｉｂｒａ １２０ Ｐｌｕｓ顕微鏡において撮影した。

Ｌ．ロイテリＶ３４０１のタンパク質抽出物およびタンパク質電気泳動
Ｌ．ロイテリＶ３４０１の細菌細胞を、０．１〜０．２ｇ／ｍＬの酸洗したガラスビーズ（０．２５〜０．５ｍｍ）を含む、氷冷したｐＨ６の５０ｍＭ リン酸カリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中に、０．２ｇ／ｍＬ（湿重量）にて再懸濁した。物理的な細胞破壊は、ボルテックス振盪機中の２０秒間の撹拌と、氷上での２０秒間の冷却とを１０周行うことによって、実行した。１４．０００ｇ、１５分間４℃にて遠心分離を行った後、細胞片を廃棄して、タンパク質が濃縮された上清を以下のＢｒａｄｆｏｒｄ法によって定量した。

「活性化」実験においては、Ｂ．ブレーベＢＴ８２０およびその他の細菌を、０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬのＬ．ロイテリＶ３４０１タンパク質抽出物と共に、ｐＨ６の５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液中で、８〜１２時間３７℃にてインキュベートした（５・１０^９細菌／ｍＬ）。インキュベーション後、遠心分離によってタンパク質抽出物を除去し、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。

８％（ｐ／ｖ）ゲル中で変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシー染色によって電気泳動バンドを可視化した。溶解酵素検出のためのザイモグラムは、オートクレーブした１０ｍｇ／ｍＬのミクロコッカス・ルテウス細胞を含む８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ半変性ゲルにて行った。タンパク質サンプル（１５〜２０μｇ）の電気泳動後、ゲルを、ｐＨ６の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で、３７℃にて一晩インキュベートした。メチレンブルー（０．０１％ｐ／ｖ ＫＯＨ中の０．１％ｐ／ｖ）による１〜２分間の染色、および水を用いた広範囲の洗浄によって、溶解活性をもつタンパク質のバンドが検出された。

胆汁酸塩の加水分解アッセイ
細菌サンプルによる胆汁酸塩の加水分解は、以下のようにアッセイした。５・１０^８ｃｆｕ／ｍＬの細菌（生菌）を、１ｍｇ／ｍＬのブタ胆汁酸塩と共にｐＨ１０の１Ｍ ホウ酸緩衝液中で２時間３７℃にてインキュベートした後、加水分解酵素によって放出されたタウリンを、１０μＬの酵素反応物と１００μＬのｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）試薬とを混合して定量した。最終的に、２ｍＬの０．５Ｍ ＮａＯＨを添加して、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｉｕｓマイクロプレートリーダーを用いて蛍光（λｅｘ ３４０ｎｍ／λｅｍ ４６５ｎｍ）を分析した。既知濃度のこの有機酸を用いて作成した較正曲線によって、タウリン濃度を算出した。

コレステロールエステラーゼ活性
Ｌ．ロイテリＶ３４０１またはＢ．ブレーベＢＴ８２０が、コレステロールエステラーゼを阻害できるか否かについて検討するため、この酵素の動態を、４１５ｎｍにてＴｅｃａｎ Ｇｅｎｉｕｓマイクロプレートリーダーを用い、１０分間、３７℃にて、分光光度的に分析した。発色基質として、ｐＨ７の１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ タウロコール酸ナトリウム中に溶解させた４−ニトロフェニルブチレート（２．５ｍＭ）を用いた。反応混合液中で、細菌サンプル（５・１０^８細菌／ｍＬ）を０．０４Ｕ／ｍＬの酵素と共に共インキュベートし、直線の勾配（Ａ_{４１５ｎｍ}対時間）を用いて酵素活性を決定および比較した。

ＤＮＡの精製、増幅および配列決定
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）をグラム陽性菌に対する指示に従って用いることにより、細菌サンプルから得たゲノムＤＮＡを精製した。ＤＮＡは、１６Ｓ遺伝子精製のためのＰＣＲ増幅アッセイ（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡｇｅｎ）および配列決定（Ｓｉｓｔｅｍａｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｏｓ，Ｓ．Ｌ．、スペイン）、ＲＡＰＤプロファイル作成および特異的ＤＮＡ配列の検出における鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｌｅｒ（登録商標）サーモサイクラー内で、第１表に示すプライマーとしてのオリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびＭａｓｔｅｒＴａｑ（５ Ｐｒｉｍｅ ＧｍｂＨ）ＰＣＲキットに含まれる反応構成要素を用いて行った。標準的なアガロースゲル電気泳動技術によってＤＮＡ断片を分離し、可視化した。

ＲＮＡ分離および遺伝子発現の分析
原核生物およびＨＴ−２９腸細胞のＲＮＡサンプルを、トリゾール法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，１９８７，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６２：１５６−１５９）に従って分離した。最初の生物量サンプルは、乳酸桿菌については後期対数期の１０ｍＬの培養から、腸細胞については１４日間インキュベートした２４ウェルプレート（サンプルあたり１ウェル）から得た。全ＲＮＡサンプルをＤＮａｓｅ Ｉと共にインキュベートした後、トリゾール抽出を繰り返してヌクレアーゼを除去した。アガロースゲル電気泳動およびＵＶ分光光度法によって、ＲＮＡ濃度、完全性および純度を確認した。

ｑＰＣＲ遺伝子発現試験のため、２段階の逆転写ｃＤＮＡ合成を行った。最初に、真核生物および原核生物のＲＮＡサンプルに対し、ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）１５およびランダムヘキサマーそれぞれを逆転写プライマーとして用い、ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ ＱＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造者の指示に従って用いてｃＤＮＡを合成した。第２工程において、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＸ３００５Ｐサーモサイクラー内で、フルオロフォアとしてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ−Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ， Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて特異的なｃＤＮＡ断片を増幅した。ΔΔＣｔ法およびＷｉｌｌｅｍｓらによるデータ標準化のための推奨（Ｗｉｌｌｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３７９：１２７−９）に従い、対照遺伝子（ＧＡＤＰＨ）反応および分析した遺伝子（ＮＰＣ１Ｌ１または溶解酵素の遺伝子）から得たＣｔ値を、遺伝子発現算出のために用いた。

サブトラクティブハイブリダイゼーション
ファーストストランドｃＤＮＡ合成にランダムプライマーを用いた以外は、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ｃＤＮＡサブトラクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，米国）のユーザーマニュアルに従って、細菌のサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を行った。サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション実験では、培地Ａ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１をテスタサンプルとして、培地Ｂ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１をドライバとして用いた。

サブトラクトしたｃＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローン化し、Ｔ７およびＳＰ６オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅した後、Ｓｉｓｔｅｍａｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｏｓ，Ｓ．Ｌ（スペイン）によって配列決定が行われた。得られたヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩホームページのＢｌａｓｔｎプログラムを用いたヌクレオチドデータベースにおいて同定した。

動物群および食餌
体重がおおよそ２００ｇの雌Ｗｉｓｔａｒラットを、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス）から６０匹購入した。ラットはケージ内に個別に収容し、一定の温度（２３±２℃）および湿度（５５±５％）を維持し、１２時間の明／暗サイクルに曝露した。

通常食（２０１４ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ １４％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｏｄｅｎｔ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｄｉｅｔ，Ｈａｒｌａｎ）への２週間の順応期間後、６０匹のラットを、各群１０匹ずつの６群に分けた。６群の食餌を以下のように割り当てた。（Ａ）細菌サンプルも高コレステロール食も与えられない、通常食の対照群；（Ｂ）高コレステロール食の陽性対照。残りの群は、高コレステロール食に加え、一日量の細菌サンプル（一日一動物あたり２×１０^９細菌）を含んだ飲料水を与えられた：（Ｃ）生菌Ｌ．ロイテリＶ３４０１；（Ｄ）熱不活化Ｌ．ロイテリＶ３４０１；（Ｅ）生菌Ｂ．ブレーベＢＴ８２０ ｌｉｖｅ；（Ｆ）熱不活化Ｂ．ブレーベＢＴ８２０。高コレステロール食は、標準食（２０１４ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ １４％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｏｄｅｎｔ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｄｉｅｔ，Ｈａｒｌａｎ）中に１％（ｗ／ｗ）コレステロールを含んだものであった。ラットには５７日間摂食させ、体重を記録した。この期間の後、ラットは安楽死させた。

血清指標のアッセイ
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓから入手したコレステロールキットを用いて血清コレステロールを決定するため、７〜１０日目それぞれに、尾静脈から血液サンプルを採取した。実験期間（５７日間）の終わりまでに、１２時間絶食させた後、各ラットから心臓穿刺によって約５ｍＬの血液サンプルを採取した。Ｍｉｎｄｒａｙ ＢＳ２００自動化学アナライザーを用いて、血清総コレステロール（ＴＣＨ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、トリグリセリド、リン脂質およびグルコースを測定した。

実施例１：ヒト腸細胞のコレステロール吸収の阻害能をもつ細菌株のスクリーニング
このタスクを行うため、ＨＴ−２９ヒト腸細胞と蛍光コレステロール類似体であるフルオレステロールとの培養に基づいた方法を開発した。

ホスファチジルコリンとタウロコール酸ナトリウムのミセルに溶解させたフルオレステロールの、ＨＴ−２９腸細胞による吸収は、フローサイトメトリーによって定量できる。ＨＴ−２９の細胞培養を、フルオレステロールのミセルの存在下で少なくとも３時間インキュベートし、培養を脱凝集した後、上記の技術によって細胞集団の蛍光を決定した。細胞の蛍光は、吸収されたフルオレステロールの量に比例する。この方法は、記載したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて、コレステロール低下薬であるエゼチミブをアッセイすることによって（１５０μＭの濃度にて）検証された。

この方法を用いて、４００サンプルを超える細菌コレクションのフルオレステロール吸収の減少能を決定した。細胞培養を、フルオレステロールのミセルと、生きた細菌または不活化細菌の懸濁液（５・１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）と共にインキュベートした。非生存サンプルのライブラリーは、様々な不活化方法、すなわち熱、高圧、マイクロ波、ならびに酸、塩基、アルコールおよび過酸化水素とのインキュベーションを用いて得た。

陰性対照培養（細菌サンプルを含まない）の平均細胞蛍光データを、菌液と共にインキュベートした培養から得た値と比較することにより、フルオレステロールの吸収を２５％を超えて減少させる２つの細菌種、ラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１およびビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０が同定された（図１）。

生菌および不活化菌を様々な方法によってアッセイしたところ、両方の細菌株が活性を示した（図２）。

実施例２：細菌株の特徴づけ
２．１ ラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１
ラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１は、ＭＲＳ培地にて雌ウシの生乳から分離した。その同定は１６Ｓリボソーム遺伝子の増幅および配列決定によって行った。得られた部分的な１６Ｓリボソーム遺伝子配列（配列番号１）は、Ｌ．ロイテリ株に対応する幾つかのＥＭＢＬエントリー（Ｉ５００７、ＢＣＳ１５９、ＮＭ９４−６およびＴＢ−Ｂ１１）の１６Ｓ遺伝子配列と１００％の類似性を示した。

Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびその他の５つのＬ．ロイテリ株から得たゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＲＡＰＤ（ＤＮＡ多型のランダム増幅）フィンガープリンティング試験によって、Ｌ．ロイテリＶ３４０１の区別を行った（図３）。（ｇｔｇ）５およびＯＰＬ１オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた（第１表）。

（ｇｔｇ）５およびＯＰＬ−１を用いたＲＡＰＤプロファイルによって、試験した５つの株からＬ．ロイテリＶ３４０１が区別できた。（ｇｔｇ）５プライマーのバンドパターンはＬ．ロイテリ株のＶ３４０１およびＬＲ２０に特異的であったため、ＯＰＬ−１プライマーを用いたさらなるＲＡＰＤによって、Ｌ．ロイテリ株のＶ３４０１とＬＲ２０とを区別することが必要であった。

加えて、Ｌ．ロイテリＶ３４０１は、ＡＰＩ ＣＨ５０炭水化物発酵試験（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用い、その生化学的プロファイルに基づいて性質を決定した。結果を第２表に示す。

２．２． ビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０
この微生物は、ＭＲＳ−システイン寒天培地にてヒトの母乳から分離した。ビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０は、１６Ｓリボソーム遺伝子の増幅および配列決定によって種レベルで同定された。得られた部分的な１６Ｓリボソーム遺伝子配列（配列番号１４）は、ＥＭＢＬ ＤＮＡデータベースに寄託された幾つかのＢ．ブレーベ株（ＢＲ２、ＢＧＭ６、６８９ｂ、８７５およびＪＣＭ１２７３）の１６Ｓ遺伝子配列と、有意な類似性（９８．６乃至１００％）を示した。

Ｌ．ロイテリＶ３４０１と同じ方法によってさらなる分析を行い、同じ種または属の細菌株からＢ．ブレーベＢＴ８２０を区別した。Ｂ．ブレーベＢＴ８２０、４つのＢ．ブレーベ株および１つのＢ．ｌｏｎｇｕｍ株から得たゲノムＤＮＡを用い、（ｇｔｇ）５オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＲＡＰＤフィンガープリンティング試験を行った。図４および第３表に示した本発明者らによる結果は、Ｂ．ブレーベＢＴ８２０が、その特異的な（ｇｔｇ）５ ＲＡＰＤプロファイルに基づき、その他のビフィズス菌株から区別できることを実証した。

実施例３：作用機序
両細菌株が、ＨＴ−２９腸細胞におけるフルオレステロールの吸収をどのように減少させるかを知るため、幾つかのアッセイを行った。まず、胆汁酸塩の脱抱合が、フルオレステロールの濃度低下の一因となる可能性があると仮定した。胆汁酸塩加水分解酵素は、この反応に関与する酵素であり、グリシンおよびタウリンはこの加水分解の産物である。Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０においてこの酵素活性を評価するため、両株を胆汁酸塩（１０ｍｇ／ｍＬ）と共に２時間インキュベートして、放出されたタウリンを決定した。結果は、Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０のどちらも、本発明者らの実験条件下では胆汁酸塩の加水分解を誘導しなかったことを示した。

もう一つの可能性は、フルオレステロールが細菌株によって代謝されるかまたは分解されて、フルオロフォアの分解を生じるため、ＨＴ−２９細胞の蛍光が減少するという説明である。Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０を、フルオレステロールミセルと共に２４時間インキュベートした後、異なった時間間隔にて蛍光を測定した。総蛍光が、細菌サンプルを含まないフルオレステロールの陰性対照を超えて減衰しなかったことから、この結果によって、フルオレステロールの分解および／または代謝という仮説は拒絶できることが実証された。

Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０は、ＨＴ−２９腸細胞におけるフルオレステロールの吸収を、真核生物の膜受容体であるＮＰＣ１Ｌ１との相互作用によって阻害する可能性がある。この受容体は、哺乳類の腸細胞膜を通したコレステロールの輸送に関わっているとみられ、エゼチミブの分子標的である。Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０が、ＮＰＣ１Ｌ１膜タンパク質を遮断してコレステロール輸送を阻害しているか否かについて調べるため、間接的アッセイを計画した。ＨＴ−２９腸細胞を、フルオレステロール、細菌サンプル、およびフルオレステロールの吸収を４０％阻害する、本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて観察された最大有効濃度（３００μＭ）のエゼチミブと共にインキュベートした。本発明者らは、これらの条件下で、エゼチミブはＮＰＣ１Ｌ１受容体を完全に阻害し、細菌の標的が同じコレステロール輸送体であれば、その細菌がもつ可能性のある効果をマスクするであろうと想定した。反対に、薬物と細菌サンプルとの相加的な効果は、これらが異なる機構によって作用することの証拠として説明することができる。本発明者らの実験結果により、エゼチミブと、Ｌ．ロイテリＶ３４０１またはＢ．ブレーベＢＴ８２０とを共にインキュベートしたＨＴ−２９の培養において、フルオレステロールの吸収阻害は増大することが示された（図５）。したがって本発明者らは、両微生物が、ＮＰＣ１Ｌ１受容体の遮断によってフルオレステロールの吸収を減少させるのではないと考える。

別の可能性は、Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０が、ＮＰＣ１Ｌ１の合成を遺伝子レベルで阻止することである。細菌と共にインキュベートしたかまたはしていないＨＴ−２９腸細胞における相対的なｍＲＮＡ濃度を定量することによって、この仮説を検討した。ＲＮＡの精製および逆転写の後、ＮＰＣ１Ｌ１の遺伝子発現を、データ標準化のための参照としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いたｑＰＣＲによって決定した。本発明者らの結果により、Ｌ．ロイテリＶ３４０１またはＢ．ブレーベＢＴ８２０の存在下でのインキュベーションは、ＨＴ−２９におけるＮＣＰ１Ｌ１の発現レベルを変化させなかったことが明らかになった。

膵コレステロールエステラーゼは、消化管におけるコレステロールエステルの加水分解に関わる酵素である。この加水分解は、コレステロールの吸収過程の制御に重要な役割を果たしている。この生理的な工程が、本発明者らのＨＴ−２９腸細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるフルオレステロール吸収阻害の原因であるとは思われないが、この効果が、株によるｉｎ ｖｉｖｏでのコレステロール低下活性に関連している可能性があるため、Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０がこの酵素を阻害できるか否かについて評価することにした。細菌サンプルの存在下で、膵コレステロールエステラーゼの活性を分光光度的に測定した結果、酵素の動態は、細菌サンプルを含まない対照の反応に対して変化しなかったことが示された。

Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０が、フルオレステロールを取り込むか否かについて検討するため、３回の別々の実験を行った。まず、両株（熱不活化）を、フルオレステロールのミセルと共に３時間インキュベートし、広範囲に洗浄した後、細菌細胞に付随する蛍光を蛍光分光光度法によって決定した。これらのアッセイの結果を図６に示す。

本発明者らによる結果は、Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０が、それらの細胞内にフルオレステロールを組み入れることを示している。前述の株から得て、前記のように処理した細菌サンプルを、フローサイトメトリーによって分析したところ同様の結果が得られた。この技術は、細菌細胞に付随する蛍光と、残余のフルオレステロールのミセルに相当する蛍光を区別できるため、さらに正確な技術である。再び、両細菌株はフルオレステロールを吸収できた（図７）。

以前のアッセイにおいて得られた結果を確認するため、熱不活化し、フルオレステロールのミセルと共にインキュベートしたＬ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０のサンプルを、共焦点レーザー顕微鏡によって分析した。その結果、Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０の細胞構造は、フルオレステロールによって染まっていることが示された。この像により、両株ともフルオレステロールを取り込むことができ、細胞アッセイにおいてＨＴ−２９腸細胞と競合して、ヒト細胞によって吸収されるフルオレステロールを減少させることが確認された。

実施例４：ラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１は、特定の増殖条件下で培養することで、ヒト腸細胞によるフルオレステロールの吸収を減少させるその能力を増強させられる
Ｌ．ロイテリＶ３４０１の増殖条件を最適化する過程で、細菌濃度を増大させるため、幾つかの増殖培地および物理的化学的な変数についてアッセイした。これまでにその結果を示してきたＬ．ロイテリＶ３４０１のサンプルは、培地Ａと命名された、ｐＨを６に調整した増殖培地を用いて得た。最適化実験の結果により、培地Ｂと命名されたｐＨ値が５である増殖培地を用いる、さらに効率的な産生法（図８Ａ）の計画が可能になった。しかしながら、この増殖法によって得た細菌サンプルを熱不活化した後、Ｌ．ロイテリＶ３４０１は、ｐＨ６の培地Ａ中で得たサンプルと同程度には、ＨＴ−２９腸細胞培養によるフルオレステロールの吸収を減少させることができなかった（図８Ｂ）。

Ｌ．ロイテリＶ３４０１における、この活性の変化に関与する因子を決定するため、培養液の組成および増殖ｐＨの影響について検討した。様々な増殖条件下で得た、熱不活化された細菌サンプルを、ＨＴ−２９腸細胞において試験し、フルオレステロール吸収を減少させるその能力を決定した。これらの試験の結果を図９に示す。

本発明者らの結果によれば、細胞外ｐＨは、ヒト腸細胞におけるフルオレステロールの吸収を減少させるＬ．ロイテリＶ３４０１の能力を活性化させる過程での、重要な因子であることを示していると考えられる。この仮説を確認するため、Ｌ．ロイテリＶ３４０１を、様々な細胞外ｐＨ値をもつ培地Ｂ中で増殖させた。再び、いったん菌液を得て熱不活化した後、ＨＴ−２９腸細胞におけるフルオレステロールの吸収を減少させるその能力をアッセイした。この実験の結果、６か、またはそれを超える増殖ｐＨ値は、ＨＴ−２９ヒト腸細胞内へのフルオレステロールの取り込みを阻害するＬ．ロイテリＶ３４０１の能力を増強させることが実証された（図１０）。

細胞外ｐＨが、短い期間にＬ．ロイテリＶ３４０１を活性化できるか否かについて知るため、新規アッセイを行った。このため、微生物をｐＨ５の培地Ｂ中で１４時間培養した。次に、２４時間、細胞外ｐＨを６に変更した。細菌サンプルを異なった時間間隔にて収集し、熱不活化させ、その生物学的活性をＨＴ−２９腸細胞の培養において試験した。図１１に示すように、記載した条件下で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１は、ＨＴ−２９におけるフルオレステロールの吸収を減少させられなかった。これらのデータは、Ｌ．ロイテリＶ３４０１の活性化過程には、活発な増殖期の間の、ｐＨ６におけるインキュベーションが必要であることを示していると考えられる。

実施例５：活性化過程の特徴づけ
ｐＨ５に対し、ｐＨ６にて増殖させた際にみられるＬ．ロイテリＶ３４０１の活性化の原因となる分子現象について検討するため、ｐＨ６の培地Ａ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１から分離したｃＤＮＡライブラリー（テスタサンプル）およびｐＨ５の培地Ｂ中で増殖させた同じ株から分離したｃＤＮＡライブラリー（ドライバサンプル）を用いて、サブトラクティブハイブリダイゼーションアッセイを行った。この実験は、最初の増殖条件において過剰発現している遺伝子を同定するために計画された。

この実験の結果により、ｐＨ６の培地Ａにおいて高レベルで発現する幾つかの遺伝子の同定が可能になった。これらの遺伝子のうちの１つは、フルオレステロールのミセルに対する親和性および／または透過性を増大させる、Ｌ．ロイテリＶ３４０１の細胞壁の改変過程に関わる可能性がある、溶解酵素をコードする遺伝子であった（配列類似性に基づいた同定）。ｐＨ６の培地Ａにおけるこの遺伝子の過剰発現を、特異的なプライマー（第１表）および遺伝子発現データ標準化のための対照としてｇａｄｐｈを用いたｑＰＣＲによって確認した（図１２）。

一方、半変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いた生化学的レベルで、タンパク質の電気泳動バンドが同定された（ザイモグラム）。様々なｐＨの培地Ｂ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１からタンパク質抽出物を精製し、ミクロコッカス・ルテウスを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分離した。メチレンブルー染色後、溶解酵素は、高いｐＨ値にて増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１から得られたサンプル中に検出された（図１３）。

サブトラクティブハイブリダイゼーションアッセイにおいて同定された遺伝子の発現と、ザイモグラムにおいて検出された酵素活性の間には相関関係があるが、生化学的に同定された溶解酵素が、前記遺伝子によってコードされていると結論付けることはできない。

これらの結果は、ｐＨ６の培地Ａまたは培地ＢにおけるＬ．ロイテリＶ３４０１の培養が、細菌エンベロープの透過処理を意味し得る溶解酵素の活性を誘導することを示していると考えられる。細胞壁の完全性について検討するため、ｐＨ６の培地ＡおよびｐＨ５の培地Ｂにおいて増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１のサンプルを、透過型電子顕微鏡によって分析した（図１４）。得られた像は、ｐＨ６の培地Ａ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１のサンプルにおいて、拡散した細胞エンベロープをもつ細菌を示しており（図１４ＡおよびＢ）、これは細胞壁の部分的な加水分解によるものであると説明できる。対照的に、ｐＨ５の培地Ｂ中で増殖させたＬ．ロイテリＶ３４０１のサンプルでは、明確な形態をもつ、さらに高電子密度の細菌が示された（図１４ＣおよびＤ）。

実施例６：活性化機構の特異性
Ｌ．ロイテリＶ３４０１に観察される効果がどのように特異的であるかを見出すため、フルオレステロール取り込み活性における培養液の影響を、その他の細菌株において分析した。まず、ｐＨ６の培地ＡおよびｐＨ５の培地Ｂにおいて増殖させた幾つかの細菌種の活性を、Ｈ−Ｔ２９腸細胞のアッセイによって分析した（図１５）。

結果は、分析した細菌のいずれも、使用した増殖培地にかかわらず、ＨＴ−２９腸細胞におけるフルオレステロールの吸収を減少させなかったことを示した。

前述のように、Ｌ．ロイテリＶ３４０１の活性化は、少なくとも部分的に、溶解酵素の発現増大によって仲介されると思われる。さらに、本発明者らによるサブトラクティブハイブリダイゼーション実験では溶解酵素をコードする遺伝子が同定されており、これはそのゲノムが科学文献に公開されている他のＬ．ロイテリ株にも見出されている。この遺伝子が、本発明者らの会社において利用可能な他のＬ．ロイテリ株にも存在するか否かについて検討するため、特異的なプライマー（第１表）を用いて、前述のＬ．ロイテリ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ実験を行うことを決定した。結果は、この遺伝子がＬ．ロイテリＬＲ２０には存在するが、ＬＲ３５には存在しないことを示した。これらの株は、本発明者らによる腸細胞アッセイにおいて、フルオレステロール吸収を減少させる能力を示さなかった。Ｌ．ロイテリＬＲ２０に存在する溶解酵素遺伝子が、活発に発現しているか否かについて調べることを決定した。ｐＨ６の培地ＡおよびｐＨ５の培地Ｂにおいて増殖させた生物量から精製したＲＮＡサンプルおよびタンパク質抽出物を用い、ｑＰＣＲによって遺伝子発現を定量し、ザイモグラムによって酵素を検出した。

これらの結果によって、Ｌ．ロイテリＶ３４０１とは異なり、Ｌ．ロイテリＬＲ２０における溶解酵素遺伝子は培養液によってその発現レベルを変えず、その量はＬ．ロイテリＶ３４０１において定量された量よりも低いことが示された（図１６）。

要約すると、これらのデータは、溶解酵素をコードする遺伝子は他のＬ．ロイテリ株にも存在するが、溶解酵素の誘導によってＬ．ロイテリＶ３４０１によるフルオレステロールの取り込みを改善する活性化機構は、株特異的であることを示していると考えられる。

実施例７：その他の細菌株の活性化
上述のように、Ｌ．ロイテリＶ３４０１によるフルオレステロールの吸収を可能にする至適な増殖条件は、株特異的であると考えられる。この過程の分子機構の一部は、おそらく細胞壁を消化して細胞透過性を増大させる、溶解酵素の活性化に基づく。他の細菌に対し、この酵素による活性化とフルオレステロールの吸収能とをアッセイして検討した。

ｐＨ６の培地Ａ中でＬ．ロイテリＶ３４０１を増殖させることによって、この微生物のタンパク質抽出物を得て、以下の細菌株、すなわちＬ．ロイテリＬＲ３５、Ｌ．プランタルムＬＰ１８およびＢ．ブレーベＢＴ８２０と共にインキュベートした。インキュベーション後、これらの微生物の菌液を熱不活化し、ＨＴ−２９フルオレステロールの吸収アッセイによって試験した（図１７）。この結果により、未処理か、またはタンパク質抽出物と共にインキュベートしたＬ．ロイテリＬＲ３５およびＬ．プランタルムＬＰ１８のいずれも、腸細胞におけるフルオレステロールの吸収を減少させないことが示された。対照的に、Ｂ．ブレーベＢＴ８２０では、前述のアッセイによって検出された、そのフルオレステロール低下能の活性が、Ｌ．ロイテリＶ３４０１タンパク質抽出物と共にインキュベートした細菌サンプルでは高かったことが確認された（図１７）。

菌液によるフルオレステロールの取り込みは、ＨＴ−２９細胞において観察された結果を裏付けた。Ｌ．ロイテリＬＲ３５およびＬ．プランタルムＬＰ１８のいずれも、フルオレステロールの吸収能を示さなかった。両株は、Ｌ．ロイテリＶ３４０１のタンパク質抽出物を含むか、または含まないインキュベーションによって試験した。対照的に、Ｂ．ブレーベＢＴ８２０は、Ｌ．ロイテリＶ３４０１のタンパク質抽出物と共にインキュベートしたサンプルにおいて、未処理の細菌サンプルよりも高い、細胞あたりの蛍光値を示した（図１８）。

実施例８：高コレステロール血症の動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性
ヒト腸細胞のフルオレステロール吸収における、Ｌ．ロイテリＶ３４０１およびＢ．ブレーベＢＴ８２０のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果が、ｉｎ ｖｉｖｏで実証できるか否かについて検討することを決定した。そのために、高コレステロール血症の動物モデルを用いてアッセイを行った。アッセイは、１％（ｗ／ｗ）コレステロールを含む高コレステロール食を与えられた、体重がおおよそ２００ｇである雌Ｗｉｓｔａｒラットの６群（ｎ＝１０）から構成された。飲料水中の細菌サンプルが投与された（一日一動物あたり２・１０^９細菌）（第５表）。

血清コレステロールを決定するため、７〜１０日目それぞれに、尾静脈から血液サンプルを採取した。５７日後、高コレステロール血症対照群（群Ｂ）は、標準食を与えた群（対照群Ａ）に比較して有意に高い血清コレステロール値を示した。この時点でラットを屠殺し、血清総コレステロール（ＴＣＨ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、トリグリセリド、リン脂質およびグルコースを測定した。

結果は、プロバイオティックサンプルを消費した動物の４群においてＴＣＨ値が低かったことを示した（図１９）。４つのサンプルを含むいずれかの栄養補助食品は、同じ高コレステロール食を摂取させた群（対照群Ｂ）に比較して、血清コレステロールを低下させることに有効であった。

さらに、高コレステロール食とプロバイオティックサンプルとを摂取させたラット（群Ｃ〜Ｆ）は、ＨＤＬ−Ｃのレベルが有意に低下している高コレステロール血症対照（群Ｂ）とは対照的に、対照群（群Ａ）と同様なＨＤＬ−Ｃのレベルを示した（図２０Ａ）。ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ比は心血管リスクを予測するために用いられ、血清コレステロールおよび／またはＬＤＬ−Ｃの絶対値よりもさらに有用であるとみなされている。この比を算出するためにＬＤＬ−Ｃ値（図２０Ｂ）を用いた際（図２０Ｃ）、プロバイオティクスの食餌による摂取は、ＬＤＬ−Ｃ／ＨＤＬ−Ｃ比を健常群（群Ａ）と同様の値まで低下させることが確認された。

試験したその他のパラメータは血漿トリグリセリドとリン脂質の濃度であった。健常対照群Ａと同様のトリグリセリド濃度を示した、高コレステロール食とプロバイオティックサンプル（群Ｃ〜Ｆ）とを摂取させたラットとは対照的に、高コレステロール摂取対照動物（群Ｂ）は、対照群（群Ａ）よりも高い値を示した。しかしながら、これらの相違は統計学的に有意ではなかった（図２１Ａ）。また、６つの実験群から得た血漿リン脂質濃度の間にも違いはみられなかった（図２１Ｂ）。

非脂質パラメータにおける動物群のデータ間にも違いは観察された。高コレステロール摂取ラット（群Ｂ）の平均血漿グルコース濃度は、健常対照群（群Ａ）よりも高かった。おそらくこの増大は、一般に高コレステロール血症および低ＨＤＬ−Ｃ濃度に付随する、インスリン抵抗性に付随するものである。プロバイオティックサンプルを摂取させた４つの動物群は、健常対照群（群Ａ）と同様の血糖値を示した。この結果は、高コレステロール血症対照群Ｂにおいて検出されたが、プロバイオティック摂取群にはみられなかった、おそらく高ＨＤＬ−Ｃ濃度によって促進されたインスリン抵抗性の復帰によって説明できるであろう（図２２）。

Claims (12)

1. 受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１、および受託番号ＣＥＣＴ８６０６を受けているビフィドバクテリウム・ブレーベＢＴ８２０、またはコレステロール吸収能を有する前記プロバイオティック株のバリアントから選択される、プロバイオティック株。
2. 生細胞または非生細胞の形態である、請求項１に記載のプロバイオティック株。
3. 請求項１または２に記載のプロバイオティック株を含んでなる、生物学的に純粋な培養物、または組成物、または医薬品、または飼料もしくは栄養製品。
4. 増加されたコレステロール吸収能を有する請求項１または２に記載のプロバイオティック株を得るための方法であって、プロバイオティック株を不活性化させる工程、またはプロバイオティック株の活発な増殖期の間に６乃至９のｐＨにてプロバイオティック株を培養する工程を含んでなり、プロバイオティック株が受託番号ＣＥＣＴ８６０５を受けているラクトバチルス・ロイテリＶ３４０１である、方法。
5. 不活化が、熱不活化、マイクロ波による不活化、圧力による不活化、酸による不活化、塩基による不活化、エタノールによる不活化、および過酸化物による不活化からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 不活化が熱不活化である、請求項５に記載の方法。
7. ｐＨが６である、請求項４に記載の方法。
8. 増加されたコレステロール吸収能を有する微生物を得るための方法であって、コレステロールを吸収する微生物を、ペプチドグリカン加水分解酵素活性を含む組成物と接触させることを含んでなり、前記ペプチドグリカン加水分解酵素活性を含む組成物が、ＣＥＣＴ８６０５ Ｌ．ロイテリＶ３４０１株のタンパク質抽出物であり、前記コレステロール吸収能を有する微生物が、ＣＥＣＴ８６０６ Ｂ．ブレーベＢＴ８２０株である、方法。
9. 前記ペプチドグリカン加水分解酵素が、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、またはグリコシダーゼからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 薬剤としての用途のための、請求項１または２に記載のプロバイオティック株、または請求項３に記載の飼料もしくは栄養製品。
11. 脂質代謝異常、インスリン抵抗性およびメタボリック症候群からなる群から選択される疾病または状態の治療および／または予防における用途のための、請求項１または２に記載のプロバイオティック株、または請求項３に記載の飼料もしくは栄養製品。
12. 脂質代謝異常が高コレステロール血症である、請求項１１に記載のプロバイオティック株、または請求項１１に記載の飼料もしくは栄養製品。

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