JP6730981B2

JP6730981B2 - 美白ペプチド剤

Info

Publication number: JP6730981B2
Application number: JP2017511260A
Authority: JP
Inventors: グラッサラポソ，; セシールカンパーニュ，; セドリックデルヴォワ，
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2020-07-29
Anticipated expiration: 2035-08-31
Also published as: EP3188711A1; US20200281838A1; JP2017526679A; WO2016034541A1; JP2020125341A; EP2990027A1; US10603265B2; CN106999399A; US20170246098A1

Description

本発明は、化粧品及び医学の分野に関し、特に皮膚科学に関する。本発明は、メラニン細胞におけるメラニン色素の合成を低減し、美白剤として有用な新規のペプチドを提供する。

色素沈着は、特に皮膚、髪及び虹彩の色素性上皮におけるメラニン色素の合成及び分布によって生じる。そして、皮膚、髪及び目の色は、主に存在する色素の型及びその濃度に依存する。

メラニンは、チロシン（ユーメラニン）から形成されるモノマー、又はチロシン及びシステイン（フェオメラニン）の付加又は凝縮によって、メラニン細胞に含まれる特定の細胞内オルガネラであるメラノソームにおいて生成される高分子である。メラニンが合成される又はメラニン形成されるメカニズムは、特に複雑であり、主にチロシナーゼ等の種々の酵素、及びチロシン関連タンパク質（チロシナーゼ関連タンパク質１又はＴｙｒｐ−１）が関連する。

メラノソームの成熟は、形態学的基準に基づき４つの段階に分類され得る。段階Ｉは、可変量の腔内膜を有する膜により区切られた区画が該当する。段階ＩＩは、特徴的なタンパク質様線条を有する楕円体構造である。メラニンは線条に沿った光電子密度沈着物によって段階ＩＩＩから検出される。段階ＩＶは、内部線条がもはや見えない高電子密度構造であり、成熟メラノソームがケラチノサイトに移送される準備がなされる(Van Den Bossche et al., 2006, Traffic, 7, 769-778; Raposo and Marks,Nat Rev Mol Cell Biol. Oct 2007; 8(10): 786-797)。

生物発生のプロセスの間、段階ＩＩＩ及びＩＶのメラノソームは、プレメラノソームにおいてメラニンを合成するのにキーとなる酵素の移送により得られる(Raposo et al., 2001, J. Cell Biol. 152, 809-824)。この型の移送は、３つのアダプタータンパク質（ＡＰ）、すなわちＡＰ−１からＡＰ−３の複合体の関与を特に必要とし、それらは、輸送小胞において酵素を漸加する役割を有するヘテロ四量体である。

皮膚に存在するメラニンは、紫外線照射に対する適切な保護を示すが、色素沈着過剰（例えば黒皮症又は肝斑）、そばかす（雀卵斑）、しみ（黒子）、日焼けによるしみ若しくは脂漏性角化症等のより黒い又は過剰に色素沈着した皮膚は、重大な審美的問題を生じ得る。これらの色素斑は、メラニン細胞の機能不全により誘導され、又は光増感若しくは傷害後の瘢痕化等による事故で引き起こされ得る。日光は度々重要な役割を果たし、特に高い日焼け止め指数を有する日焼け止めによって保護を達成できる。

魅力の無い色素斑を除去するために、レーザ、皮膚剥離又は他の電気外科的方法、及び脱色素又は美白物質を含む漂白クリーム等の種々の可能性を利用できる。後者の手段は、患者にとって、より安価で且つ快適であるといった利点がある。

美白分子は、皮膚のメラニン細胞に作用し、メラニン形成の１つ以上の段階を妨げる。周知の脱色素物質は、特にヒドロキノン及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、胎盤エキス、コウジ酸、ナイアシンアミド、ビタミンＣ、ルシノール、アルブチン、クワ若しくはユカン等の植物の抽出物、イミノフェノール(WO 99/22707)、カルニチンとキノンとの組合せ(DE 19806947)、アミノフェノールアミド誘導体(FR 2772607)、又はベンゾチアゾール誘導体(WO 99/24035)である。しかしながら、これらの物質は、有効性が低い、製剤としての安定性が低い、半減期が短い、作用が非特異的である、又は毒性、刺激性若しくはアレルギー性がある等の種々の欠点を有する。

近年では、美白のための新規のアプローチとして、アンチセンスのオリゴヌクレオチド又はペプチド阻害剤を用いることが公表されている。例えば、チロシナーゼの発現を制御するアンチセンスオリゴヌクレオチド(FR 2804960)、ＡＰ−２若しくはＡＰ−３複合体とチロシナーゼとの間の相互作用を阻害するペプチド(WO 2009/010356)、又はチロシナーゼを直接に阻害するペプチド(WO2009/003034)を用いて色素沈着過剰を治療することが考えられていた。

ＫＩＦ１３Ａと呼ばれるキネシンは、ＡＰ−１のサブユニットと相互作用できることは周知であり(Nakagawa et al., Cell, 2000, vol. 103, 569-581)、本発明者らは以前に、キネシンＫＩＦ１３Ａと相互作用するＡＰ−１アタプター複合体のサブユニットの発現を阻害する核酸を用いてメラニン色素の合成を有効に低減できることを示した(WO 2009/141541)。この核酸は、エンドソームのメラニン形成酵素のプレメラノソームへの移送を妨げて、これらのオルガネラの成熟を妨げることができただけでなく、メラニン形成酵素の発生を低減できた。従って、これは有効な脱色素剤を構成する。しかしながら、皮膚科学的又は美容的製剤として核酸を用いる場合、安定性、製剤化及び投与経路の点で扱いにくい。

従って、プレメラノソームにおけるメラニン形成酵素の移送を妨げることができ、高い有効性を有し、良好な製剤特性を有する新規の美白剤の必要性が未だにある。

本発明の目的は、非毒性であり、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットとキネシンＫＩＦ１３Ａとの相互作用を阻害することによってメラニン形成に特異的に作用する新規の美白ペプチド剤を得ることにある。

第１の態様において、本発明は、３〜１５のアミノ酸長を有し、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸の配列を含む美白ペプチド、その機能性誘導体又は生理学的に許容可能な塩に関する。

そのペプチドは、ＥＰＬ、ＰＬＮ、ＬＮＮ、ＮＮＬ、ＮＬＱ、ＬＱＶ、ＱＶＡ、ＶＡＶ及びＡＶＫのアミノ酸配列、並びに配列番号１〜１６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。

好ましくは、そのペプチドは３〜１１のアミノ酸長を有し、より好ましくは３〜７のアミノ酸長を有する。

そのペプチドは、（ｉ）ＥＰＬ、ＰＬＮ、ＬＮＮ、ＮＮＬ、ＮＬＱ、ＬＱＶ、ＱＶＡ、ＶＡＶ及びＡＶＫのアミノ酸配列、並びに配列番号１〜１６のアミノ酸配列、並びに（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列の連続する６つ、７つ、８つ、９つ又は１０個のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり得る。

特に、そのペプチドは、ＡＶＫ、ＶＡＶＫ（配列番号９）及びＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る又は該アミノ酸配列からなり得る。好ましくは、そのペプチドはＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

他の態様において、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸、該核酸を含む発現カセット、該核酸又は該発現カセットを含む発現ベクター、及び該核酸、発現カセット又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

他の態様において、本発明は、本発明に係るペプチド、その機能性誘導体又は生理学的に許容可能な塩と、生理学的に許容可能なキャリア及び／又は賦形剤とを含む化粧品又は医薬組成物に関する。

該組成物において、該ペプチドは、リポソームに含まれていてもよい。その組成物は、１つ以上の他の有効成分をさらに含んでいてもよい。好ましくは、該組成物は、局所投与に適する。

更なる態様において、本発明は、医薬としての本発明に係るペプチドに関する。

また、本発明は、色素沈着過剰の予防又は治療に用いるための本発明に係るペプチド、その機能性誘導体又は生理学的に許容可能な塩に関する。さらに、それは、治療を必要とする対象に治療的有効量の本発明に係るペプチドを投与することを含む色素沈着過剰を治療するための方法に関する。また、本発明は、色素沈着過剰の治療又は予防のための医薬の製造のための本発明のペプチドの使用に関する。

特に、色素沈着過剰は、特発性肝斑（すなわち、妊娠や経口避妊薬の摂取に関連しない肝斑）若しくは黒皮症（妊娠黒皮症とも呼ばれる）等の肝斑、老人性黒子、にきびの後遺症の色素変化、光増感による色素沈着、磨耗、火傷、傷、皮膚疾患及び／若しくは接触アレルギーによる炎症後の色素沈着、イチゴツナギ皮膚炎、ツタウルシによる色素沈着、そばかす、並びに先天性巨大母斑、ベッカー母斑若しくはスピッツ母斑等の母斑からなる群から選択され得る。

他の態様において、本発明は、化粧剤、特に美白、脱色素又は色を薄くする化粧剤としての、本発明に係るペプチド、その機能性誘導体又は生理学的に許容可能な塩の使用に関する。

さらに、本発明は、本発明の化粧品組成物をヒトに局所的に適用することを含む、ヒトの皮膚を美白、脱色素又は色素を薄くするための美容方法に関する。

ヒトＡＰ−１複合体のγ−アダプチンサブユニットを、回転させながら４℃で２時間、１μｇの示された１１アミノ酸ペプチド（ペプチドＡＩ、ＱＴ、ＧＮ、ＥＫ、ＥＬ、ＷＱ、ＮＹ、ＱＦ、ＬＭ、ＦＦ、ＬＫ及びＲＩ：それぞれ配列番号１７、２８、２０、１、２５、２７、２２、２１、２４、２３、１９及び２６）の存在下又は非存在下でＨｅＬａ細胞の溶解物から免疫沈降した。免疫沈降物を特異的抗ヒトＫＩＦ１３Ａを用いて、そのパートナーを検出するウエスタンブロット分析のためのゲルに載せた。分子量はｋＤａである。ヒトＡＰ−１複合体のγ−アダプチンサブユニットを、回転させながら４℃で２時間、１μｇの示されたペプチド（ペプチドＳＳ−５、ＥＫ−１１及びＱＫ−５：それぞれ配列番号２８、１及び１６）の存在下又は非存在下でメラニン細胞（ＭＮＴ１）溶解物から免疫沈降した。免疫沈降物を特異的抗ヒトＫＩＦ１３Ａを用いて、そのパートナーを検出するウエスタンブロット分析のためにゲルに載せた。分子量はｋＤａである。図２に示された免疫沈降されたＫＩＦ１３Ａ及びＡＰ−１のバンドの強度をＩｍａｇｅＪを用いて定量した。ＫＩＦ１３Ａの強度をＡＰ−１の強度で割って、参照（溶解物にペプチドを加えずにインキュベートしたもの、第１レーン）で正規化した。ＭＮＴ１メラニン細胞を、１０μＭのＱＫ−５ペプチド（配列番号１６）又は参照としての水（Ｈ_２Ｏ）の存在下で３日間培養した。メラニンの評価を過去の論文(Delevoye et al., J Cell Biol. 2009 Oct 19;187(2):247-64)に記載されている通りに行い、参照で正規化した。ＱＫ−５ペプチドのインキュベーションは、細胞内メラニン量を約４０±０．０２％低減した。データは、平均値±標準偏差で示されており、^＊はｐ値（両側）＜０．０５を示す。ＭＮＴ１メラニン細胞を、カバーガラス上に播種し、１０μＭのＱＫ−５ペプチド（配列番号１６）又は参照としての水（Ｈ_２Ｏ）の存在下で３日間培養した。細胞を冷メタノールで固定し、一次抗体としてのウサギ抗ヒトＫＩＦ１３Ａ及びマウス抗ヒトγ−アダプチンと、Ａｌｅｘａ−４８８又は５４６に結合されたヤギ抗ウサギ又はマウス(Molecular Probes)とを用いて共染色した。カバーガラスをＤａｂｃｏ(Invitrogen)培地内に置き、Eclipse 80i Upright Microscope (Nikon)で画像を得て解析した。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて得られた最大１５個の３Ｄ画像スタックの最大強度ｚ方向投影である。解析を重なっているＫＩＦ１３Ａ及びＡＰ−１画素の強度を定量化し、参照でそれらを正規化することにより行った。メラニン細胞におけるＱＫ−５ペプチドインキュベーションは、ＫＩＦ１３ＡとＡＰ−１との共局在を約８４±７％低減した。データは、平均値±標準偏差で示されており、^＊＊＊はｐ値（両側）＜０．００１を示す。ＭＮＴ１メラニン細胞をカバーガラス上に播種し、１０μＭのＱＫ−５ペプチド（配列番号１６、下側の写真）又は参照としての水（Ｈ_２Ｏ）（上側の写真）の存在下で３日間培養した。その後、細胞を室温においてＤＭＥＭで素早く洗浄し、２．５Ｍグルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液で４℃、９０分間固定し、固定後、１％ＯｓＯ_４を含む１．５％フェロシアン化カリウムで４℃、４５分間処理し、エタノールで脱水し、ＥＰＯＮ樹脂に包埋した。超極薄（６０〜７０ｎｍ）切片を、KeenViewカメラ (Soft Imaging System; SIS, Germany)を備えたＣＭ１２０電子顕微鏡(FEI company, Eindoven)で観察した。ＱＫ−５ペプチド（下側の写真）の存在下でインキュベートされたメラニン細胞は、参照（上側の写真）と比較して、黒い色素の顆粒（メラノソーム）は少なくなっている。スケールバーは２μｍである。メラノソームの段階を、図６のように処理されたＭＮＴ１メラニン細胞における形態に基づいて定量した。段階Ｉ及びＩＩは、初期の色が着いていないメラノソームであり、メラニン色素が見られるのは段階ＩＩＩで始まり、段階ＩＶは十分に成熟し、色素を有するメラノソームとなる。各段階をカウントし、総数の割合でプロットした。ＱＫ−５ペプチドと共にインキュベートされたメラニン細胞は、対照と比較して、段階ＩＶのメラノソームの数が低減し、これに伴い、成熟していない数及び段階ＩＩＩの数が増加した。ＭＮＴ１メラニン細胞を、１０μＭのＥＬ−３若しくはＬＮ−３のいずれか、又は参照としての水（Ｈ_２Ｏ）と共に３日間培養した。メラニンの評価は、過去の論文(Delevoye et al., J Cell Biol. 2009 Oct 19;187(2):247-64)に記載されているように実施し、参照で正規化した。ＥＬ−３又はＬＮ−３ペプチドのインキュベーションは、参照と比較して、細胞内メラニン量を約１２％低減した。ＭＮＴ１メラニン細胞を、１０μＭのＱＡ−３ペプチド若しくはＡＫ−３ペプチド、又は参照としての水（Ｈ_２Ｏ）と共に３日間培養した。メラニンの評価は、過去の論文(Delevoye et al., J Cell Biol. 2009 Oct 19;187(2):247-64)に記載されているように実施し、参照で正規化した。ＱＡ−３及びＡＫ−３ペプチドのインキュベーションは、それぞれ細胞内メラニン量を約２２．８±７％及び約２１．３±８％低減した。データは平均値±標準偏差で示され、^＊はｐ値（両側）＜０．０５を示す。メラニンの定量化のために、３Ｄヒト再構築色素性上皮を３０μＭのＱＡ−３ペプチド又はＡＫ−３ペプチドと共に１０日間インキュベートした。人工上皮をインサートから外し、４００μＬのSolvable (Perkin Elmer)を用いて１００℃で１時間溶解した。メラニンの定量化を、２００μＬのサンプルで４９２ｎｍにおける光学密度の測定により行った。メラニン定量を参照で正規化した。ＱＡ−３及びＡＫ−３の両方のペプチドは、人工上皮によるメラニン生成をそれぞれ約２２．５±１３％又は約２１±１０％低減した。データは平均値±標準偏差で示され、^＊はｐ値（両側）＜０．１を示す。

本発明者らは、以前に、ＡＰ−１アダプター複合体及びキネシンＫＩＦ１３Ａが皮膚のメラニン細胞におけるメラニン色素の合成に必須であることを示した(WO 2009/141541)。それら両方のタンパク質は相互作用し、この相互作用は色素の表現型の維持に重要である。

実施例において詳説するように、発明者らは、ＡＰ−１／ＫＩＦ１３Ａの相互作用を妨げる能力について検討するために、ＡＰ−１複合体のβ１−アダプチンサブユニットの低分子ペプチド（３〜１１アミノ酸）を設計し試験した。発明者らは、細胞溶解物をペプチドと共にインキュベートする生化学試験を開発した。ＡＰ−１を細胞溶解物から免疫沈降し、免疫沈降物を、そのパートナーであるＫＩＦ１３Ａを明らかにするウエスタンブロット解析のためにゲルに載せた。この試験を用いて、本発明者らは、１１アミノ酸のＥＫペプチド（配列番号１）及びその断片、特に５アミノ酸のＱＶＡＶＫ（配列番号１６）ペプチドが、皮膚のメラニン細胞におけるＡＰ−１／ＫＩＦ１３Ａの相互作用を有効に低減することを観察した。

これらの結果は、（ｉ）皮膚の生メラニン細胞におけるこれらのペプチドのインキュベーション、及びインキュベーションの３日後の色素生成の測定、（ｉｉ）ＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの共局在がその細胞におけるペプチドのインキュベーション後に低減することを示す免疫染色、（ｉｉｉ）十分に成熟した色素性メラノソームの数の顕著な減少を示す電子顕微鏡観察、並びに（ｉｖ）超微細レベルで観察されたメラニン量の顕著な低減及びペプチドに細胞毒性効果が無いことを示す人工の３Ｄヒト再構築色素性上皮におけるこれらのペプチドのインキュベーションにより確認された。

本発明者らは、ここで、同定されたペプチドがＡＰ−１アダプター複合体とＫＩＦ１３Ａとの間の相互作用を妨げて、メラニン細胞におけるメラニン生成を低減し、上皮メラニン細胞において十分に成熟した色素性メラノソームの生成を遅延できることを証明した。驚くべきことに、３アミノ酸といった小さいペプチドが人工ヒト上皮における細胞内メラニン量を約２０％低減した。

そのような低分子ペプチドの主要な利点の１つは、それらが細胞膜を自由に通過して拡散され、従って、皮膚科学的及び／又は美容学的目的のための美白剤として容易に用いられ得る。

（定義）
本明細書で用いられる「ペプチド」、「オリゴペプチド」及び「ポリペプチド」の用語は互換的に用いられ、鎖を形成するアミノ酸の数にかかわらず、ペプチド結合により結合されたアミノ酸の鎖を意味する。ペプチドは、自然に発生するアミノ酸及び／又は人工的に発生するアミノ酸のいずれかに由来する残基を含みうる。本明細書に記載されたペプチド配列において、アミノ酸は、以下の表記法に従った１文字コードにより示される、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リジン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：トレオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファン及びＹ：チロシン。本発明のペプチドを構成するアミノ酸はＬ又はＤ構造であってもよく、好ましくはＬ構造である。本発明に係るペプチドは、生の、合成された、又はアセチル化アミノ酸（例えばＮ−アセチル−Ｌ−アラニン）、アミド化アミノ酸（例えばＬ−アラニンアミド）、ホルミル化アミノ酸（例えばＮ−ホルミル−Ｌ−メチオニン）、ヒドロキシル化アミノ酸（例えばヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン）、脂質コンジュゲートアミノ酸（例えばＮ６−ミリストイル−Ｌ−リジン）、エチル化若しくはメチル化アミノ酸（例えばＮ−メチル−Ｌ−アラニン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン）、リン酸化アミノ酸（例えばＮ６−ホスホ−Ｌ−リジン）等の化学的に修飾された１つ以上のアミノ酸、又は例えばオルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、β−アラニン、フェニルグリシン、ホモアルギニン及びシクロヘキシル−アラニン等の当業者に周知の他の生の、合成された、又は化学的に修飾された１つ以上のアミノ酸を含み得る。

本発明に係るペプチド分子は、細胞内への該分子の透過を促進する要素をさらに含み得る。特に、この要素は、該分子の細胞への透過を促進するペプチド（ＣＰＰ：膜透過性ペプチド要素）である。これらのペプチドは、当業者に周知である（例えば、Vives et al., Biochimic & Biophysica Acta, 2008, 1786, 126-138）。例えば、限定はしないが、膜透過性ペプチドは、Ｔａｔペプチド、アンテナペディア若しくはペネトラチンペプチド、並びにアルギニン及び／又はリジン、特にポリアルギニンリッチのペプチドから選択され得る。

本明細書で用いられている「ＡＰ−１」の用語は、トランスゴルジ及び細胞内ネットワークで作用するＡＰ−１アダプター複合体を意味する。ｊｕｎ及びｆｏｓファミリーのメンバーである遺伝子によりコードされたタンパク質からなる同一の名称の転写因子と混同されるべきではない。ＡＰ−１アダプター複合体は、γ、β１、σ１及びμ１の４つのサブユニットで構成されている。ＡＰ−１のγ、β１、σ１及びμ１の４つのサブユニットのＧｅｎｅＩＤ受入番号は、それぞれＧｅｎｅＩＤ１６４、ＧｅｎｅＩＤ１６２、ＧｅｎｅＩＤ１１７４及びＧｅｎｅＩＤ８９０７である。

「ＫＩＦ１３Ａ」、「キネシン様タンパク質ＫＩＦ１３Ａ」又は「キネシンＫＩＦ１３Ａ」は、細胞内移送に関連し、細胞膜へのマンノース−６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）の移送、メラノソームの生物発生の際のエンドソーム選別、エンドソームの生物発生の再生利用、及び細胞質分裂等の種々のプロセスを制御するプラス方向微小管依存性モータータンパク質を意味する。ヒトのキネシンＫｉｆ１３ＡのＧｅｎｅＩＤ受入番号は、ＧｅｎｅＩＤ６３９７１である。Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号はＱ９Ｈ１Ｈ９である。

「メラニン」、「複数のメラニン」、「メラニン色素」及び「色素」の用語は、本明細書において互換的に用いられる。それらは、ユーメラニン又はフェオメラニンを含むメラノソームで合成され得る種々の色素を含む。

本明細書で用いられる「約」の用語は、規定値の±１０％の範囲を意味する。例えば、「約２０」は、２０の±１０％、又は１８〜２２を含む。好ましくは、「約」の用語は規定値の±５％の値の範囲を意味する。

第１の態様において、本発明は、３〜１５アミノ酸長を有し、ＥＰＬＮＮＬＱＶＡＶＫ（配列番号１）ペプチドの少なくとも３つの連続するアミノ酸の配列を含む美白ペプチド、その機能性誘導体又は生理学的に許容可能な塩の単離に関する。

実施例の項において、本発明者らは、皮膚のメラニン細胞及び人工上皮の色素沈着を有効に低減できるＥＰＬＮＮＬＱＶＡＶＫ配列に跨る複数の３アミノ酸ペプチドを示した。

一実施形態において、そのペプチドは、
‐ＥＰＬＮＮＬＱＶＡＶＫ配列のうちの３つの連続するアミノ酸の配列、すなわちＥＰＬ、ＰＬＮ、ＬＮＮ、ＮＮＬ、ＮＬＱ、ＬＱＶ、ＱＶＡ、ＶＡＶ及びＡＶＫのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列；
‐ＥＰＬＮＮＬＱＶＡＶＫ配列のうちの４つの連続するアミノ酸の配列、すなわちＥＰＬＮ（配列番号２）、ＰＬＮＮ（配列番号３）、ＬＮＮＬ（配列番号４）、ＮＮＬＱ（配列番号５）、ＮＬＱＶ（配列番号６）、ＬＱＶＡ（配列番号７）、ＱＶＡＶ（配列番号８）及びＶＡＶＫ（配列番号９）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列；又は、
‐ＥＰＬＮＮＬＱＶＡＶＫ配列のうちの５つの連続するアミノ酸の配列、すなわちＥＰＬＮＮ（配列番号１０）、ＰＬＮＮＬ（配列番号１１）、ＬＮＮＬＱ（配列番号１２）、ＮＮＬＱＶ（配列番号１３）、ＮＬＱＶＡ（配列番号１４）、ＬＱＶＡＶ（配列番号１５）及びＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、
を含む、該アミノ酸配列からなる、又は実質的に該アミノ酸配列からなる。

他の実施形態において、そのペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のうちの６、７、８、９又は１０の連続するアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列からなる又は実質的に該アミノ酸配列からなる。更なる実施形態において、そのペプチドは、配列番号１のアミノ酸を含む、該アミノ酸配列からなる又は実質的に該アミノ酸配列からなる。

特定の実施形態において、そのペプチドは、ＥＰＬ、ＰＬＮ、ＬＮＮ、ＱＶＡ、ＶＡＶ、ＡＶＫ、ＬＱＶＡ（配列番号７）、ＱＶＡＶ（配列番号８）、ＶＡＶＫ（配列番号９）及びＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列からなる又は実質的に該アミノ酸配列からなる。好ましくは、そのペプチドは、ＥＰＬ、ＬＮＮ、ＱＶＡ、ＡＶＫ、ＶＡＶＫ（配列番号９）及びＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列からなる又は実質的に該アミノ酸配列からなる。

好ましい実施形態において、そのペプチドは、ＡＶＫ、ＶＡＶＫ（配列番号９）及びＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列からなる又は実質的に該アミノ酸配列からなる。好ましくは、そのペプチドは、ＡＶＫ及びＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列からなる又は実質的に該アミノ酸配列からなる。より好ましくは、そのペプチドは、ＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列からなる又は実質的に該アミノ酸配列からなる。

本明細書で用いられる「実質的に・・・からなる」の用語は、多くとも２つの置換又は１つの欠失若しくは付加は許容される、すなわちペプチドのアミノ酸配列が特定された配列と比較して１つ又は２つのアミノ酸が異なり得ることを意味する。好ましくは、この用語は、ペプチドが特定された配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有することを意味する。好ましい実施形態において、この用語は、ペプチドのアミノ酸配列が特定された配列に対して１つのアミノ酸が異なる（置換、欠失又は挿入）ことを意味する。

好ましい実施形態において、上記本発明のペプチドは、美白活性を示す、及び／又はＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの相互作用を妨げる若しくは阻害する。

本発明のペプチドは、追加のアミノ酸残基をさらに含む場合、これらの残基はＣ末端及び／又はＮ末端に付加され得る。

本発明のペプチドは、３〜１５アミノ酸長を有する。従って、本ペプチドは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸長を有してもよい。好ましくは、ペプチドは３〜１１アミノ酸長、より好ましくは３〜７アミノ酸長を有する。

特定の実施形態において、ペプチドは、３〜５アミノ酸長、好ましくは５アミノ酸長を有する。

ペプチダーゼに対する耐性を改善することによりペプチドの安定性を増強するために、ペプチドの活性を変更することなく、保護基がＣ末端及び／又はＮ末端に付加されてもよい。例えば、Ｎ末端における保護基はアシル化又はアセチル化されてもよく、Ｃ末端における保護基はアミド化又はエステル化されてもよい。また、プロテアーゼの作用は、Ｄ構造のアミノ酸の使用、ジスルフィド結合、ラクタム環若しくはＣ末端とＮ末端との結合の形成によるペプチドの環化により妨げることができる。本発明のペプチドは、「古典的な」ＣＯＮＨペプチド結合を置換し、ＣＨＯＨ−ＣＨ_２、ＮＨＣＯ、ＣＨ_２−Ｏ、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＯ−ＣＨ_２、Ｎ−Ｎ、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＨ_２ＮＨ及びＣＨ_２−Ｓ等のペプチダーゼに対する増強された耐性を与える偽ペプチド結合を含み得る。

本発明は、上記のような本発明に係るペプチドの機能性誘導体も含む。本明細書で用いられる「機能性誘導体」の用語は、本発明のペプチドの化学的構造に類似し、該ペプチドの機能的特性を維持する分子を意味する。例えば、該機能性誘導体は、レトロペプチド、レトロインベルソペプチド、ペプトイド若しくはβ‐ペプチド等のペプチド模倣薬、又はメチル化アミド結合を有するペプチドであってもよい。ペプチドアナログを設計するアプローチは周知である。

本発明は、本発明に係るペプチドの生理学的に許容可能な塩をも含む。生理学的に許容可能な塩は、製薬的技術で一般に用いられる、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸等の生理学的に許容可能な無機酸塩、酢酸、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、アスコルビン酸及び酒石酸等の生理学的に許容可能な有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩若しくはアンモニウム塩等の生理学的に許容可能な無機塩基の塩、又は塩形成性の窒素を含む有機塩基の塩であってもよい。該塩を調製する方法は、当業者に周知である。

本発明に係るペプチドは、（固相又は均質な液相における）古典的な化学合成等の周知の方法、又は酵素的合成（Kullmann W, 1987, Enzymatic peptide synthesis, CRC Press, Florida）により得られうる。また、それは、該ペプチドをコードする導入遺伝子を含み、該ペプチドを発現するような宿主細胞を培養し、該宿主細胞又は該ペプチドが分泌された培養培地から該ペプチドを抽出することからなる方法により得られうる。本発明のペプチドは、天然のタンパク質から得られうる。すなわち、動物、植物又は微生物のタンパク質の制御された加水分解により得られうる。加水分解は、粗抽出物、又は単離若しくは精製されたタンパク質で行われ得る。従って、本発明のペプチドは、天然由来又は合成由来であってもよい。好ましくは、該ペプチドは化学合成により得られる。

本明細書で用いられる「美白」、「色素を薄くする」、「脱色素」又は「漂白」剤は、有効成分を意味し、すなわち本発明のペプチドは、メラニン細胞のメラニンの合成を阻害又は低減でき、皮膚を白くできる。この活性は、好ましくは、ＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの相互作用を妨げる又は阻害することに起因することが好ましい。

本発明のペプチドの美白活性は、ＡＰ−１アダプター複合体とＫＩＦ１３Ａとの相互作用における該ペプチドの効果を評価することにより容易に決定され得る。特に、当業者は、実施例の項に開示されるような生化学的試験、すなわち、本発明のペプチド、その機能性誘導体又は生理学的に許容可能な塩と細胞溶解物をインキュベートすること、該細胞溶解物からＡＰ−１を免疫沈降すること、及びそのパートナーであるＫＩＦ１３Ａをこの免疫沈降物のウエスタンブロット解析で検出することを含む生化学的試験を行うことができる。ＡＰ−１、特にγ−アダプチンサブユニット及びＫＩＦ１３Ａを標的とするモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、商業的に入手可能である（抗γ−アダプチンマウスモノクローナル抗体（Sigma Aldrich）、抗ＫＩＦ１３Ａウサギポリクローナル抗体（BethylLaboratories, Inc.）。本発明のペプチドは、ＡＰ−１アダプター複合体とＫＩＦ１３Ａとの相互作用を妨げることができるとき、すなわち、細胞溶解物をペプチドと共にインキュベートしない場合と比較してＡＰ−１及びＫＩＦ１３Ａの共免疫沈降が顕著に低減するときに美白活性を示す。

代替的に、ペプチドの美白活性は、本発明のペプチドの存在下又は非存在下でインキュベートされた細胞におけるＡＰ−１及びＫＩＦ１３Ａの細胞局在を観察するための免疫蛍光法により決定され得る。この試験において、ペプチドは、該ペプチドと共にインキュベートされた細胞におけるＡＰ−１及びＫＩＦ１３Ａの細胞内共局在が、該ペプチドの非存在下でインキュベートされた細胞と比較して顕著に低減されている場合に美白活性を示す。

ペプチドの美白活性は、本発明のペプチドの存在下又は非存在下でインキュベートされた細胞における成熟した色素性メラノソームの数を観察するための電子顕微鏡法により決定され得る。この試験において、ペプチドは、該ペプチドと共にインキュベートされた細胞における成熟した色素性メラノソームの数が該ペプチドの非存在下でインキュベートされた細胞と比較して顕著に低減されている場合に美白活性を示す。

さらに、ペプチドの美白活性は、該ペプチドと共にインキュベートされたＭＮＴ−１細胞等のメラニン細胞のメラニン量を測定することにより決定され得る。例えば、その試験は、以下の通りに行われ得る。まず、１日目に１０^５個のＭＮＴ−１細胞を６ウェルプレートに播種し、２〜４日目に細胞を１０μＭのペプチドを含む培地で増殖させ、５日目に細胞を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭジチオトレイオール及びプロテアーゼ阻害剤を含む溶液内で超音波処理して破壊する。色素を２００００ｇ、４℃で１５分間遠心処理してペレット状にし、エタノール／エーテル（１：１）で１度洗浄し、６０℃の２ＭＮａＣｌ／２０％ジメチルスルホキシドに溶解する。メラニン量は、４９２ｎｍでの光学密度で測定される。この試験において、本発明のペプチドは、該ペプチドと共にインキュベートされた細胞におけるメラニン量が該ペプチドの非存在下でインキュベートされた細胞におけるメラニン量と比較して顕著に低減されている場合に美白活性を示す。

本明細書で用いられる「顕著に低減」の用語は、本発明のペプチドの非存在下でインキュベートされた細胞で得られた値、すなわち本発明のペプチドを水等の希釈剤のみに置換された場合の参照サンプルで得られた値の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％の低減を意味する。

好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、該ペプチドと共にインキュベートされたＭＮＴ−１細胞等のメラニン細胞のメラニン量の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％の低減を誘導する。

また、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸に関する。本発明において、「核酸」はＤＮＡ又はＲＮＡに基づく分子を意味すると理解される。これらは、合成若しくは半合成であるか、ベクター内で増幅若しくはクローン化可能な組換え分子であるか、化学的修飾されるか、非天然塩基若しくは修飾型結合、修飾型プリン若しくはピリミジン塩基を含む修飾型ヌクレオチドを備えるか、又は修飾型糖を備えていても構わない。本発明に係る核酸は、１本鎖若しくは２本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの形態であってもよい。好ましい実施形態において、核酸は当業者に周知の組換え技術により合成された単離型ＤＮＡ分子である。本発明に係る核酸は、本発明に係るペプチドの配列から推定され、コドン使用頻度は、核酸を転写する宿主細胞に従って適合され得る。これらのステップは、当業者に周知の方法、及びSambrook等の参考マニュアル（Sambrook J, Russell D (2001)Molecular cloning: a laboratory manual, Third Edition Cold Spring Harbor）に記載された方法に従って行われ得る。

さらに、本発明は、発現に必要な配列が作動可能に結合された本発明に係る核酸を含む発現カセットに関する。特に、核酸は宿主細胞において発現可能にするプロモーターの制御下にあってもよい。一般に、発現カセットは、転写の開始を可能にするプロモーター、本発明に係る核酸、及び転写ターミネーターで構成される、又はそれらを含む。「発現カセット」の用語は、作動可能に結合されたコード領域及び制御領域を含む核酸コンストラクトを意味する。「作動可能に結合」の表現は、コード配列（所望の遺伝子）を発現する及び／又はコードされたペプチドを標的にすることが転写プロモーター及び／又はシグナルペプチドの制御下にあるように、各要素が結合されていることを意味する。

また、本発明は、本発明に係る核酸又は発現カセットを含む発現ベクターに関する。該発現ベクターは、宿主細胞を形質転換するのに用いられ、該細胞において本発明の核酸の発現を可能にする。そのベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、環状又は非環状であってもよく、１本鎖又は２本鎖であってもよい。それは、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体から選択されることが有利である。発現ベクターは、本発明に係る核酸の発現を可能にする制御要素を含むことが有利である。これらの要素は、例えば転写プロモーター、転写アクチベーター、ターミネーター配列、並びに開始及び終止コドンを含み得る。発現することを所望される宿主細胞に従った該要素の選択方法は、当業者に周知である。ベクターは、例えば宿主細胞のゲノムから欠失されたそれぞれの遺伝子を補完する抗生物質耐性遺伝子又は選択遺伝子等の、該宿主細胞でその選択を可能にする要素を含み得る。そのような要素は、当業者に周知であり、広く文献に記載されている。

本発明は、細胞を形質転換する又は細胞にトランスフェクトするための、本発明に係る核酸、発現カセット又は発現ベクターの使用に関する。宿主細胞は、一時的又は安定的な形態で形質転換／トランスフェクトされ、核酸、カセット又はベクターは、エピソームの形態で含まれる又は染色体内に含まれる。

本発明は、本発明に係る核酸、カセット又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。一実施形態において、宿主細胞は、微生物、好ましくは細菌又は酵母である。他の実施形態において、宿主細胞は、動物細胞であり、例えばＣＯＳ又はＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、その細胞は、非ヒト及び非胚性細胞である。

また、本発明は、本発明に係る核酸、発現カセット又は発現ベクターを用いて細胞を形質転換する又は細胞にトランスフェクションすること、トランスフェクション又は形質転換された該細胞を培養すること、及び該細胞により生成されたペプチドを回収することを含む本発明に係る美白ペプチドの生成方法に関する。組換えペプチドを生成する方法は、当業者に周知である。

また、本発明は、無細胞系とも呼ばれるインビトロ発現システムにおいて本発明に係る核酸、カセット又は発現ベクターを導入すること、及び該システムにより生成されたペプチドを回収することを含む本発明に係るペプチドの生成方法に関する。多くのインビトロ又は無細胞系発現システムは、商業的に入手可能であり、該システムの使用は当業者に周知である。

他の態様において、本発明は、本発明の美白ペプチド、その機能性誘導体若しくは生理学的に許容可能な塩、生理学的に許容可能なキャリア及び／又は賦形剤を含む化粧品又は医薬組成物に関する。

好ましくは、組成物の剤形は局所投与に適合され、すなわち組成物は局所組成物である。

本明細書で用いられる「生理学的に許容可能なキャリア及び／又は賦形剤」の用語は、皮膚上への局所的適用に好適に適合され、組成物に含まれる本発明のペプチド及び他の活性成分に適合し、安全性の低下や毒性の懸念を引き起こさないキャリア又は賦形剤を意味する。キャリア又は賦形剤は、所望の特性プロファイルに依存して化粧品において又は医薬において許容可能であり得る。本発明の組成物は、キャリア及び／又は賦形剤を約５０％〜９９．９９％、好ましくは８０％〜９９．９％、より好ましくは９０％〜９５％含み得る。

本発明に係る組成物は、局所的適用のために通常用いられるガレヌス製剤において生じ得る。特に、組成物は、固体、半固体又は液体であってもよい。それは、例えば白若しくは着色された粉末、軟膏、ペースト、クリーム、流体、乳液、化粧水、ローション、血清、水性若しくは油性ゲル、水性含水アルコール若しくは油性溶液、水中油型若しくは油中水型若しくは多相乳液、泡、パック、水性若しくは無水性スティック、又はナノスフェア及びナノカプセル等のポリマー相に油が分散された形態であってもよい。

任意に、組成物は、エアロゾルの形態で皮膚に適用され得る。また、それは、パッチ、ペンシル、ブラシ、及び顔又は手の黒子に局所的に適用するための塗布器として提供され得る。

好ましくは、組成物は水を含む。より好ましくは、組成物は水中油型、油中水型又はシリコン中水型乳剤の形態である。

本発明の組成物が乳剤である場合、組成物の総重量に対して油相の割合は５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％の範囲にあってもよい。乳剤の形態の組成物に用いられる油、乳化剤及び共乳化剤は、関連分野で古典的に用いられるものの中から選択される。乳化剤及び共乳化剤は、組成物の総重量に対して０．３〜３０重量％、好ましくは０．５〜２０重量％の割合で組成物中に含まれる。

適切な油の例として、以下に限定されないが、ワセリン又はパラフィン油等の鉱油、アボカド、大豆又はホホバオイル等の植物由来油、ラノリン等の動物由来油、安息香酸アルキル及びポリブテンやペリヒドロスクアレン等のポリ分枝型炭化水素等の合成油、シクロメチコン、ジメチコン及びフェニルジメチコン等のシリコン油、並びにペルフルオロポリエーテル等のフッ素化油を含む。用いられる脂肪分は、セタノール等の脂肪族アルコール、脂肪酸、又はカルナバろう、みつろう、ポリエチレンろう若しくはオゾケライト等のろう類である。

適切な乳化剤及び共乳化剤の例は、以下に限られないが、ＰＥＧ−２０等の脂肪酸及びポリエチレングリコールのエステル、及びステアリン酸グリセリル等の脂肪酸及びグリセリンのエステルを含む。

代替的に、本発明のペプチドは、リポソームに含まれた組成物に含まれる。本明細書で用いられる「リポソーム」は、人工的に製造され、水性コンパートメントにより互いに分離されたリン脂質層で構成された小胞を意味する。リポソームは、細胞膜の構造に極めて近い構造を有し、それらは融合することができ、その際にリポソームが含む有効成分を放出する。適切なリポソームの例は、以下に限られないが、多重膜リポソーム若しくはＭＬＶ（多重膜小胞）、小単層リポソーム若しくはＳＵＶ（小単層小胞）、大単層リポソーム若しくはＬＵＶ（大単層小胞）、又はGeusens等,2010（AdvancedFunctional Materials. 2010. pp. 4077-4090）に記載されるSECosomes（界面活性剤−エタノール−コレステロール−オソーム）を含む。リポソームは、壁がリン脂質で構成されておらず非イオン性脂質で構成された非イオン性リポソームであってもよい。

また、組成物は、以下のものに限られないが、シリコンエラストマー、界面活性剤、増粘剤、ゲル化剤、湿潤剤、経皮吸収促進剤、着色剤、保存剤、光学特性調整剤、並びにＥＤＴＡの塩等のキレート剤及び／又は香料を含む他の添加剤を含み得る。そのような添加剤や他の添加剤の例は、パーソナルケア商品協議会（Personal Care Products Council）により発行されたInternationalCosmetic Ingredient Dictionary & Handbook, 15th Edition, 2014に挙げられている。これらの種々の添加剤の量は、関連分野において古典的に用いられる量である。それらの性質に従って、これらの添加剤は、油相、水相、脂質小胞及び／又はナノ粒子に導入され得る。

代替的に、本発明の組成物は、非経口投与に適合され得る、すなわち組成物は注射可能組成物であってもよい。本明細書で用いられる「注射可能組成物」は、ヒト及び／又は動物に注射するのに適する組成物を意味し、該注射は、好ましくは皮内注射又は皮下注射である。これらの組成物は、無菌であり、発熱物質が除去されており、生理学的に許容可能なｐＨである。適切な注射可能製剤は、安息香酸ナトリウム、メチルパラベン及びプロピルパラベン等の保存剤を含んでもよく、２５℃でｐＨ６．８〜８．０であってもよい。ｐＨは緩衝剤によって維持されることが好ましい。適切な緩衝剤は、酢酸バッファー、２−アミノ−２メチル−１−１プロパノール、グリシンバッファー、リン酸バッファー、ＴＲＩＳバッファー等を含む。

組成物は、１つ又は複数、例えば２つ、３つ、４つ若しくは５つの本発明のペプチド、その機能性誘導体又は生理学的に許容可能な塩を含み得る。好ましい実施形態において、組成物は、ＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも含む。

組成物は、有効量の本発明のペプチドを含む。本明細書で用いられる「有効量」の用語は、メラニンの合成を顕著に低減できる本発明の美白ペプチドの量である。この低減は、特に皮膚の色の視認可能な変化を起こし得る。この低減は、未処理細胞に存在するメラニンの量の例えば５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％であってもよい。例えば、有効量は、組成物の総重量に対して０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％、より好ましくは０．１〜５重量％であってもよい。

本発明の組成物は、１つ又は複数の追加の活性成分をさらに含んでいてもよい。

一実施形態において、本発明のペプチドは、１つ又は複数の他の美白剤と混合される。そのような美白剤の例は、以下のものに限られないが、エラグ酸（Kamide et al. Nishinihon J Dermatol. 1995;57:136-142）、アルブチン（Sugai et al. Skin Res (Hifu) 1992;34:522-529）、レゾルシノール、ルシノール（４−ｎ−ブチルレゾルシノール）（Katagiri et al. J Cosmet Chem Jpn. 2001;35:42-49）、コウジ酸（Mishima et al. Skin Res (Hifu) 1994;36:134-150）、胎盤エキス（Itoh. Fragrance J. 1990:6, 67-71）、スイセン、クワ、ユカン、ニチニチソウ、マンネンタケ、レイシ、カモミール(Kawashima et al. Nishinihon J Dermatol. 1999;61:682-685)及びスペインカンゾウ（リコリス）エキス等を含む植物抽出物、グラブリジン、アスコルビン酸及びＬ−アスコルビン酸−２−リン酸、Ｌ−アスコルビン酸−２−燐酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド及びＬ−アスコルビン酸エチルエステル等の誘導体(Maeda et al. J Jpn Cosmet Sci Soc. 2003;27:257-268; Kumano et al. J.Nutr. Sci. Vitaminol. 1998;44:345-359; Kameyama et al. J. Am. Acad. Dermatol.1996;34:29-33; Miyai et al. Nishinihon J Dermatol. 1996;58:439-443)、リノール酸(Shigeta et al. Biol. Pharm. Bull. 2004;27:591-594)、トラネキサム酸(Mafune et al. Farumashia. 2008;44:437-442)、トラネキサム酸セチルエステル塩酸塩、４−メトキシカリウムサリチレート、アデノシン一リン酸ジナトリウム塩(Kawashima et al. Jpn J Clin Dermatol. 2008;62:250-257)、５，５’−ジプロピル−ビフェニル−２，２’−ジオール（Magnolian）(Takeda et al. Nishinihon J Dermatol. 2006;68:293-298)、４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノール、システイン、４−チオレゾルシン(EP 0623341)、５−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−γ−ピリドン、ナイアシンアミド、イミノフェノール(WO 99/22707)、カルニチン及び／又はキノン(DE 19806947)、アミノ−フェノールアミド誘導体(FR 2772607)、ベンゾチアゾール誘導体(WO 99/24035)、パントテン酸、グリチルリチン酸、ヒドロキノン−β−グルコシド、並びにイヌラボシン(Pigment Cell Melanoma Res. 2014 May;27(3):376-86)を含む。

組成物は、例えば有機又は無機の日焼け止め剤；サリチル酸、グリコール酸、乳酸、クエン酸若しくはリンゴ酸等の角質溶解剤及び／又は剥離剤；保湿剤；軟化剤；収斂剤；防腐剤；トコフェロール、チオタウリン、ヒポタウリン、アミノグアニジン、チアミンピロリン酸、ピリドキサミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシン三リン酸等の抗糖化及び／又は抗酸化剤；グリセリン、グリコールもしくはプロピレングリコール等のポリオール；ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ等のビタミン；レチノイン酸、レチナールデヒド、レチノール；パルミチン酸、プロピオン酸若しくは酢酸；ヒアルロン酸；抗炎症剤；無痛化剤；及び／又はデオキシリボ核酸若しくはリボ核酸等の所望の効果を増強するための追加の有効成分を含み得る。

また、本発明は、本発明に係るペプチド、その機能性誘導体又は生理学的に許容可能な塩の化粧剤、特に美白化粧剤としての使用に関する。

さらに、本発明は、本発明の化粧品組成物をヒトの皮膚に局所的に適用することを含むヒトの美白のための美容方法に関する。

好ましくは、本発明の化粧品組成物は、毎日、より好ましくは１日に２回適用される。

また、本発明は、本発明の化粧品組成物を非経口投与することを含むヒトの皮膚の美白のための美容方法に関する。好ましくは、組成物は皮内又は皮下に投与される。

他の態様において、本発明は、医薬としての本発明の美白ペプチドに関する。

また、本発明は、色素沈着過剰の予防又は治療に用いるための本発明のペプチド又は組成物に関する。

さらに、それは、それが必要な対象に有効量の本発明のペプチド又は組成物を投与することを含む色素沈着過剰の治療のための方法に関する。また、本発明は、色素沈着過剰の治療又は予防用の医薬の製造のための本発明のペプチド又は組成物の使用に関する。

好ましくは、治療されるための対象は哺乳動物、より好ましくはヒトである。

色素沈着過剰は、メラニンの蓄積により特徴付けられ、不規則な色素沈着パターンを度々生じる。特に、本発明のペプチド又は組成物は、しみの美白に用いられ、対象の色素沈着を均一にする。色素沈着過剰は、特発性肝斑（すなわち、妊娠や経口避妊薬の摂取に関連しない肝斑）若しくは黒皮症（妊娠黒皮症とも呼ばれる）等の肝斑、老人性黒子（老年性黒子、老人性しみ、日焼けによるしみ、そばかす若しくは黒子とも呼ばれる）、にきびの後遺症の色素変化、磨耗、火傷、傷による炎症後の色素沈着、光増感、皮膚疾患及び／若しくは接触アレルギーによる色素沈着、イチゴツナギ皮膚炎、ツタウルシによる色素沈着、そばかす、並びに先天性巨大母斑、ベッカー母斑若しくはスピッツ母斑等の母斑からなる群から選択され得る。

更なる本発明の態様及び利点は、以下の実施例に記載され、それは説明のためのものであり、限定のためのものとみなすべきでない。

＜材料と方法＞
（ペプチドの設計及び調製）
本発明者らは、ヒトＡＰ−１のβ１−アダプチンサブユニットの８１３番目のアミノ酸から８９０番目のアミノ酸までの間の領域に位置する１１個、５つ又は３つのアミノ酸を有するペプチドを設計した。

全てのペプチドをProteogenix (Oberhausbergen, France)により合成した。凍結乾燥されたペプチドを、メーカー推奨に従って水又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／水（１／３（体積））で希釈した。以下の表１はペプチド配列を示す。

（細胞培養）
ＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生物質(Invitrogen)を含むＤＭＥＭに維持した。ＭＮＴ−１細胞を、１０％ＡＩＭ−Ｖ培地、２０％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及び抗生物質(Invitrogen)を含むＤＭＥＭに維持した。

（タンパク質抽出、免疫沈降及びウエスタンブロット解析）
８０％コンフルエントの細胞を、冷ＰＢＳで洗浄し、氷上で溶解バッファー(50 mM Tris, 150 mM NaCl、0.1% Triton X-100、10 mM EDTA、pH 7.2及びプロテアーゼ阻害剤カクテル, Roche)を用いて溶解した。溶解物を１μｇのペプチドと共に一晩中インキュベートした。溶解物を回転させながら４℃で１時間プロテインＧアガロースビーズを用いて第１のプレクリアを行った。上清を回収し、１μｇのマウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ抗ＣＤ９抗体を含むプロテインＧアガロースビーズと回転させながら４℃で１時間インキュベートした。プレクリアされた上清を、１μｇのマウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ抗γ−アダプチン抗体がコーティングされたビーズと共に回転させながら４℃で２時間インキュベートした。陰性対照として、１μｇのマウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ抗ＣＤ９抗体を溶解物の免疫沈降のために用いた。

冷溶解バッファーで５度洗浄し、ＰＢＳで３度洗浄した後、ビーズに結合した免疫沈降されたタンパク質を、還元剤を含むサンプルバッファーにインキュベートし、９５℃で１０分間加熱し、Ｎｕｐａｇｅ（３−８％）Ｔｒｉｓ−酢酸ゲル(Invitrogen)を用いてSDS-PAGEにより分画した。ニトロセルロース膜(Millipore)に転写した。膜をマウスモノクローナル抗γ−アダプチン(Sigma-Aldrich)及びウサギポリクローナル抗ＫＩＦ１３Ａ抗体(Bethyl Laboratory, Inc.)を用いて標識した。

（免疫蛍光法）
カバーガラス上で増殖させたＭＮＴ−１細胞を、１０μｇのペプチドを含む培地に３日間インキュベートした。カバーガラスをＰＢＳでリンスし、１００％の冷メタノールで３０秒間固定し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳにインキュベートした。固定された細胞を、ＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭグリシンを含むＰＢＳを用いて室温で１０分間クエンチし、ブロッキングバッファーに浸し、０．０５％サポニン及び１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（インキュベーションバッファー、ＩＢ）を含むＰＢＳで透過処理した。細胞を、ＩＢで希釈したマウスモノクローナル抗γ−アダプチン(Sigma-Aldrich)及びウサギポリクローナル抗ＫＩＦ１３Ａ(BethylLaboratory, Inc.)と共に１時間インキュベートし、ＩＢで３回洗浄し、対応する二次抗体(AlexaFluor, Invitrogen)と共に３０分間インキュベートした。細胞を、ＩＢで２回、ブロッキングバッファーで１回洗浄した。最後に、ＤＡＢＣＯ培地中にカバーガラスを載置し、３ＤＮｉｋｏｎ顕微鏡で試験した。

共局在解析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて実施した。第１に、結合画像を共局在プラグインを用いて生成した。わずかな画素が、共局在の画素とみなされた各チャンネルの強度を超えるオーバーレイの強度であった。細胞内の同じ領域を規定し、定量分析した。

（通常の電子顕微鏡法）
３日間カバーガラス上で増殖された参照及びペプチド処理されたＭＮＴ−１細胞を、２．５％グルタルアルデヒドを含むｐＨ７．２の０．１Ｍカコジル酸バッファーを用いて固定し、１％のＯｓＯ４を含む１．５％フェロシアン化カリウムを用いて後固定し、エタノールを用いて脱水し、Epon樹脂に包埋した。超薄切片を、Ulltracut UCTウルトラミクロトーム(Leica)を用いて調製し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を用いて対比染色した後に、ＣＭ１２０電子顕微鏡(FEI company, Eindoven)で観察した。

形態及びメラニン量に基づいたメラノソームの段階Ｉ〜ＩＶの格付けを、２人の筆者により独立して行った。下記表２は解析の基準を示す。

（メラニン試験）
‐ＭＮＴ−１細胞
１日目に、６ウェルプレートに１０^５個の細胞を播種した。２〜４日目に、１又は１０μｇのペプチドを含む培地で細胞を増殖させた。培地を毎日交換した。５日目に、50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM ジチオトレイトール及びプロテアーゼ阻害剤を含む溶液中での超音波処理により細胞を破壊した。色素を２００００ｇ、４℃で１５分間の条件でペレット化し、エタノール／エーテル（１：１）で１回リンスし、６０℃の２ＭＮａＣｌ／２０％ジメチルスルホキシドに溶解した。メラニン量を４９２ｎｍにおける光学密度で測定した。

‐再構築上皮
スキンタイプＶＩの再構築されたヒト上皮(Sterlab)を、１０日目に受け取り、１１〜２１日目に３０μｇのペプチドを含むメーカーの培養培地にインキュベートした。推奨されるように、培地を毎日交換した。２１日目に、上皮をインサートから分離し、４００μｌのSolvable (PerkinElmer)に９８℃で１時間インキュベーションすることにより消化した。メラニン量を４９２ｎｍにおける光学密度で測定した。

＜結果＞
本発明者らは、ＡＰ−１複合体とキネシンＫＩＦ１３Ａとの相互作用を妨げるための低分子ペプチドを設計した。この相互作用は、メラノソームにメラニン形成酵素を移送するのに重要となり、ヒトの皮膚メラニン細胞の色素沈着に必要であることが示されている(Delevoye et al., J Cell Biol. 2009 Oct 19;187(2):247-64)。本発明者らは、本明細書において、５又は３アミノ酸（ａａ）程度のペプチドが、ＡＰ−１複合体とＫＩＦ１３Ａとの相互作用及びそれらの共局在を防止でき、その結果、皮膚のメラニン細胞による色素顆粒の数を低減でき、皮膚のメラニン細胞や人工ヒト色素性上皮の細胞内メラニン量を低減できることを示す。

（ＥＫ−１１ペプチドがＫＩＦ１３ＡとＡＰ−１複合体の相互作用を低減する）
Nakagawa et al., Cell, 2000, vol. 103, 569-581に記載の過去の研究に基づいて、マウスＫＩＦ１３Ａに対するマウスＡＰ−１複合体のβ１−アダプチンサブユニットの結合ドメインが、７８３〜８６０番目のアミノ酸に位置する７７のアミノ酸領域に対応すると予測された。本発明者らは、７７アミノ酸領域（８１３〜８９０番目）に対応するヒトβ１−アダプチンサブユニットの相同性配列を同定した。この７７アミノ酸ヒト配列を用いて、本発明者らは、隣接するペプチドを含む５つのアミノ酸をシェアする１１アミノ酸町の１２ペプチドを設計した。本発明者らは、ヒトＡＰ−１とヒトＫＩＦ１３Ａとの相互作用を妨げる能力について、それらの配列を試験した。これらのタンパク質は一様に発現するので、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞溶解物（非色素性細胞）と１μｇの１２ペプチドのそれぞれとをインキュベートすることにより、第１の相互作用スクリーニングを行った。ＡＰ−１複合体のγ−サブユニットを溶解物から免疫沈降し、免疫沈降物に対してＫＩＦ１３Ａ量の試験をした。本発明者らは、ＨｅＬａ細胞溶解物とＥＫ−１１ペプチド（配列番号１）とのインキュベーションのみが、その相互作用を、参照又は他の設計ペプチドと比較して約５２．６±７％の割合で顕著に低減できることを示した（図１）。さらに、本発明者らは、ＥＫ−１１ペプチドが、ＨｅＬａ細胞の場合と同様に、皮膚のメラニン形成細胞ＭＮＴ−１細胞溶解物におけるＡＰ−１／ＫＩＦ１３Ａの相互作用を低減する（５７．５±８％）ことも確認した（図２）。

（ＱＫ−５ペプチドがＫＩＦ１３ＡとＡＰ−１複合体の相互作用を低減する）
工業目的で用いられ得る分子を見付けることを目的として、本発明者らは、ＡＰ−１／ＫＩＦ１３Ａの相互作用を防止できるより短いペプチドを見付けるために、ＥＫ−１１ペプチドをカバーし、包囲するペンタペプチドを設計した。本発明者らは、ＥＫ−１１ペプチド（配列番号１）の最後の５アミノ酸に対応するＱＫ−５ペプチド（配列番号１６）が、メラニン形成細胞溶解物におけるＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの相互作用を、参照又はＳＳ−５（配列番号２８）（図２）等の他の５アミノ酸ペプチドと比較して低減した（図２）（５６．１±６％、図３）。興味深いことに、ＥＫ−１１ペプチドのインキュベーションにより得られた低減と同等の低減である（上記）。要するに、本発明者らは、ＱＫ−５ペプチドがメラニン細胞におけるＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの相互作用を防止することを示す。

（ＱＫ−５ペプチドは、皮膚のメラニン細胞におけるＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの共局在を低減する）
本発明者らは、ＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの相互作用の低減（図３）が皮膚のメラニン細胞におけるそれらの共局在の低減により反映されているのか否かを試験した。ＱＫ−５ペプチドを上記のように皮膚のメラニン細胞と共にインキュベートし、皮膚のＭＮＴ−１メラニン細胞におけるＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの共局在を定量するために、免疫蛍光試験を行った。本発明者らは、ＱＫ−５ペプチドのインキュベートが、それらのタンパク質の共局在を、参照と比較して約８４．７±７％（図５；ｐ＜０．００１）低減することを示し、それらの相互作用の物理的破壊（図２）がそれらの細胞内局在の空間的分離により起因することを示した。

（ＱＫ−５ペプチドは、皮膚のメラニン細胞によるメラニン形成を低減する）
本発明者らは、過去に、皮膚のメラニン細胞による細胞内でのメラニン色素の生成にＡＰ−１／ＫＩＦ１３Ａの会合が必要であることを示した(Delevoye et al., J Cell Biol. 2009 Oct 19;187(2):247-64)。従って、本発明者らは、ＱＫ−５ペプチドのインキュベーションが皮膚のＭＮＴ−１メラニン細胞の細胞内メラニン量に影響するか否かを試験した。ＭＮＴ−１メラニン細胞を１０μＭのＱＫ−５ペプチドを含む培地（毎日交換）で３日間培養し、細胞内メラニンを精製し、４９２ｎｍにおける光学密度を検出することにより測定した。ＱＫ−５ペプチドのインキュベーションは、皮膚のＭＮＴ−１メラニン細胞における細胞内メラニン量を、参照と比較して約４０％低減する（図４；ｐ＜０．０５）。この結果は、ＱＫ−５ペプチドが細胞内に自由に拡散することを提示し、結果的にＫＩＦ１３ＡとＡＰ−１との相互作用を妨げることにより、ＱＫ−５が処理されたメラニン細胞によるメラニン生成を低減することを示す。

（ＱＫ−５ペプチドは十分に成熟した色素顆粒の形成を低減する）
皮膚のメラニン細胞において、メラニン合成はメラノソームと呼ばれる膜結合型オルガネラで起こる(Raposo and Marks, Nat Rev Mol Cell Biol. Oct 2007; 8(10): 786-797)。本発明者らは、過去に、ＡＰ−１／ＫＩＦ１３Ａの会合が、十分に色素沈着したメラノソームの形成に必要であることを示した(Delevoye et al., J Cell Biol. 2009 Oct 19;187(2):247-64)。従って、本発明者らは、ＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの相互作用及び共局在の破壊（図２、３及び５）が、メラノソームの成熟に影響して色素沈着を低減する（図４）か否かを試験した。ＱＫ−５ペプチドは、上記のように皮膚のメラニン細胞とインキュベートし、電子顕微鏡法のための処理をした（材料と方法の項を参照）。それらの形態に基づいて、メラノソームは４つの異なる段階で存在し、その段階は、初期の非色素性メラノソーム（段階Ｉ及びＩＩ）から、初期の成熟メラノソーム（段階ＩＩＩ、メラニンがそれらの内腔に蓄積され始める）、さらには十分に成熟したメラノソーム（段階ＩＶ、メラニンがメラノソームの内腔全体に満たされる）まで存在する。ＱＫ−５ペプチドと共に３日間インキュベートされたＭＮＴ−１細胞（図６の下の写真）は、参照（図６の上の写真）と比較して黒い色素の顆粒がほとんど見られず、十分に色素沈着したメラノソームの成熟化がＱＫ−５処理細胞に影響することを示した。本発明者らは、Ｈ_２Ｏ又はＱＫ−５を処理したＭＮＴ−１細胞における各段階のメラノソームの数（総数の％で示す）を定量した。参照と比較して、ＱＫ−５処理されたメラニン細胞は、段階ＩＩＩのメラノソーム数を増加し、段階ＩＶのメラノソーム数を低減し、初期の段階（Ｉ及びＩＩ）は影響が無かった（図７）。このデータは、十分に色素沈着した段階ＩＶのメラノソームの成熟速度が、細胞にＱＫ−５ペプチドを処理した際に低減することを提示し、図４に示す色素沈着の低減を説明する。

（３アミノ酸のＱＫ由来ペプチドが皮膚のメラニン細胞の色素沈着を低減する）
より小さい活性分子を見付けるために、本発明者らは、ＥＫ−１１ペプチドに由来する、結果としてＥＮ−５及びＱＫ−５の２つのペンタペプチドに由来する複数のトリペプチド、すなわち、ＥＬ−３（ＥＰＬ）、ＬＮ−３（ＬＮＮ）、ＱＡ−３（ＱＶＡ）及びＡＫ−３（ＡＶＫ）ペプチドを設計し、色素沈着を低減する能力を試験した。本発明者らは、ＥＬ−３又はＬＮ−３のインキュベーションは、皮膚のメラニン細胞（≒１２％）によるメラニン形成を適度に低減することを示した（図８）。さらに、本発明者らは、ＱＫ−５ペプチドに由来するトリペプチド（ＱＡ−３及びＡＫ−３）を皮膚のＭＮＴ−１メラニン細胞と共にインキュベートした。本発明者らは、ＱＡ−３及びＡＫ−３ペプチドの両方が、細胞内メラニン量を約２０％低減した（図９；それぞれ２３±７％及び２２±８％、^＊はＰ＜０．０５）。さらに、本発明者らは、３０μＭのそれぞれのトリペプチドの存在下でヒトの再構築された色素性上皮を培養した。本発明者らは、ＰＡ−３及びＡＫ−３ペプチドの両方が、対照と比較して、３Ｄヒト再構築色素性上皮の色素沈着を約２０％低減することを示した（図１０；それぞれ２２．５±１３％及び２１±１０％、^＊はＰ＜０．１）。この結果は、ＱＫ−５に由来し、３アミノ酸長の小ささであるペプチドが、皮膚のメラニン細胞及び人工上皮の色素沈着を低減できることを示す。

（結論）
本発明者らは、本明細書において、ＥＫ−１１ペプチドに由来する５又は３アミノ酸（ａａ）の小ささのペプチドが、ＡＰ−１複合体とキネシンＫＩＦ１３Ａとの相互作用を妨げることができることを証明した。これらのペプチドは、これらのタンパク質の物理的会合のみならず、それらの空間的細胞内共局在にも影響する。ＡＰ−１及びＫＩＦ１３Ａは、メラノソームの成熟及び皮膚のメラニン細胞の色素沈着を維持するのに重要であるため、本発明者らは、そのようなペプチドが、十分に色素沈着したメラノソームの成熟速度を制御することにより皮膚のメラニン細胞の色素沈着に影響することを示した。また、本発明者らは、これらのペプチドが、皮膚のメラニン細胞、及び重要なことにはヒトの再構築色素性上皮の色素沈着を低減することを示した。要するに、本発明者らは、ＡＰ−１とＫＩＦ１３Ａとの相互作用を阻害する低分子ペプチドが、ヒトの皮膚の色素沈着を調整するための適切な新規のツールであり、新規の美白活性分子として用いられ得ることを示した。

Claims

ＡＶＫ、ＥＰＬ、ＬＮＮ、ＱＶＡ、ＶＡＶＫ（配列番号９）及びＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はその生理学的に許容可能な塩の美白化粧剤としての使用。
前記ペプチドは、ＡＶＫのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の使用。
前記ペプチドは、ＶＡＶＫ（配列番号９）のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の使用。
前記ペプチドは、ＱＶＡＶＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の使用。
前記ペプチドは、ＱＶＡのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の使用。
色素沈着過剰の予防又は治療に用いるための、請求項１〜５のいずれか１項に記載され
たペプチド、又はその生理学的に許容可能な塩。
前記色素沈着過剰は、肝斑、老人性黒子、にきびの後遺症の色素変化、光増感による色素沈着、磨耗、火傷、傷、皮膚疾患及び／若しくは接触アレルギーによる炎症後の色素沈着、イチゴツナギ皮膚炎、ツタウルシによる色素沈着、そばかす、並びに先天性巨大母斑、ベッカー母斑若しくはスピッツ母斑等の母斑からなる群から選択される、請求項６に記載のペプチド、又はその生理学的に許容可能な塩。
請求項１〜５のいずれか１項に記載されたペプチド、又はその生理学的に許容可能な塩と、生理学的に許容可能なキャリア及び／又は賦形剤とを含む化粧品又は医薬組成物。
局所投与用である請求項８に記載の組成物。
前記ペプチドはリポソームに含まれる、請求項８又は９に記載の組成物。
水中油型乳剤、油中水型乳剤又はシリコン中水型乳剤の形態である、請求項８又は９に記載の組成物。
１つ以上の追加の有効成分をさらに含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
前記追加の有効成分は、他の美白剤、有機若しくは無機の日焼け止め剤、角質溶解剤、剥離剤、保湿剤、軟化剤、収斂剤、防腐剤、抗糖化剤及び／又は抗酸化剤、ポリオール、ビタミン、レチノイン酸、レチナールデヒド、レチノール、パルミテート、プロピオネート、アセテート、ヒアルロン酸、抗炎症剤、無痛化剤、デオキシリボ核酸、リボ核酸、並びにそれらの混合物から選択される、請求項１２に記載の組成物。
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の化粧品組成物をヒトの皮膚に局所的に適用することを含む、ヒトの皮膚を美白するための美容方法。
医薬としての請求項１〜５のいずれか１項に記載されたペプチド、又はその生理学的に許容可能な塩。
化粧剤としての請求項１〜５のいずれか１項に記載されたペプチド、又はその生理学的に許容可能な塩。