JP6737779B2 - 微生物製剤の製造方法およびこれにより製造された微生物製剤 - Google Patents

Description

本発明は、非配糖体を含む微生物製剤を製造する方法に関し、具体的には、β‐グルコシダーゼを生産する微生物を用いて配糖体を非配糖体の形態に転換した後、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物を製造する方法に関する。

乳酸菌は、ヒトが利用可能な最も有益な微生物の一種であり、発酵過程中にブドウ糖または乳糖といった炭水化物を分解し乳酸を生成する細菌を意味する。１８５８年、フランスの微生物学者であるルイ・パスツールにより乳酸菌の実態が明らかになっており、ロシアの免疫学者であるイリヤ・メチニコフが、１９０８年にノーベル生理医学賞を受賞した後、末年に「発酵乳による不老長寿説」を提唱し、ブルガリア民族の長寿が乳酸菌発酵乳に由来することを主張してから本格的な研究が始まり、今まで約３００種の乳酸菌が発見された。乳酸菌は、ヒトをはじめほとんどの哺乳類の腸内に生息するが、特に、人体の腸には健康に有益な細菌と有害な細菌を合わせて約１００種に達する細菌が１００兆以上存在している。乳酸菌は、代謝産物として乳酸を作り腸を酸性化させることから有害細菌の増殖を抑制し、異常発酵によるアンモニアや発がん物質の生成を低減する役割、すなわち整腸作用をする細菌として知られている。

乳酸菌の生理活性は、主に有機酸を生産して腸内のｐＨを低下させることで腸内有害細菌の増殖を抑制し正常な腸内菌叢を維持させる働きをし、β‐グルコシダーゼを生産して、配糖体イソフラボンを体内での吸収が容易な非配糖体に転換する働きをすると知られている。

特に、イソフラボンの場合、糖が付いている配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、糖が除去された非配糖体（ａｇｌｙｃｏｎｅ）、アセチルグルコシド（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、マロニルグルコシド（ｍａｌｏｎｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）の４種の形態で存在しており、このうち、非配糖体イソフラボンは、腸内のβ‐グルコシダーゼによって加水分解されて、活性型非配糖体であるアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）に転換され吸収される。しかし、一般的な食品に含有されたイソフラボンは糖が結合された配糖体の形態で存在し、食餌で摂取されたイソフラボンが吸収されるためには、腸内微生物によって非配糖体の形態に転換されなければならない。したがって、β‐グルコシダーゼの活性を有する微生物は、イソフラボンの生体利用性において非常に重要な役割を果たすことができる。

既存のイソフラボンの抽出方法は、イソフラボンを含有する植物体の粉末を水で抽出し、抽出液を酸性化した後、スラッジと分離して吸着性樹脂が充填されたカラムに通過させ、抽出液中のイソフラボンを前記樹脂に吸着、カラムにアルコール性溶媒を通過させて、樹脂に吸着したイソフラボンを回収する方法がある。他の方法としては、イソフラボンが含有された植物体または植物加工品をシクロデキストリンまたはその誘導体またはその重合体の溶液に添加してイソフラボンを前記シクロデキストリンまたはその誘導体またはその重合体に結合させて抽出する第１ステップと、前記抽出により形成された抽出液に凝集剤を投与して、前記抽出液からイソフラボンとシクロデキストリンの結合体を分離する第２ステップとを含むことを特徴とするイソフラボンの抽出方法がある。特に、在来種の大豆から非配糖体イソフラボンを抽出するために様々な機械的および化学的方法を使用するが、その方法としては、超音波を用いてイソフラボンを抽出した後、液体クロマトグラフィーにより精製する方法がある。しかし、かかる抽出方法は、複数のステップの工程を含んでおり、生産率の低下、生産コストの増加、精製過程での汚染可能性などの問題を内包している。

微生物による配糖体イソフラボンの非配糖体イソフラボンへの生物転換について研究されており（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６．７３：３１４‐３２０；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２０１３．６１：１２１０１‐１２１１０）、その中でも乳酸菌による配糖体イソフラボンの非配糖体イソフラボンへの生物転換が可能で、これに関する研究が活発に進められている（Ｃａｖａｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｉｍ．Ｎｕｔｒ．２０１０．２１：１７５‐１８２）。一例として、Ａｌｉとその仲間は乳酸菌によるイソフラボングリコシドの物質代謝の活性形態であるアグリコンへの転換および脂肪とコレステロール代謝に及ぼす影響について調査した。その結果、乳酸菌は、イソフラボンの効能増進を誘導することができないことが明らかになった。かかる理由は、乳酸菌による生物転換効率が低いからであると考えられる（Ａｌｉ、ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｔｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４．１５：５８３‐９０）。さらに他の報告によると、乳酸菌ビフィドバクテリウムによる非配糖体への転換は、豆乳を添加しなかった場合、７３〜７４％以下と認められた。しかし、豆乳を添加した場合、８４〜８５％と転換率が増加した（２００７ １１．Ｎｅｗｈｏｐｅ３６０．ｃｏｍ）。

一方、サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）は、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）、ステロイドアルカロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ ａｌｋａｌｏｉｄ）あるいはトリテルペン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ）の配糖体であり、水に溶けて石鹸のように発泡作用を示す物質の総称である。サポニンは人体免疫力を増強させる成分であり、特に、オタネニンジンに含有されたサポニンが有名である。オタネニンジンには、３２種に至る様々なサポニンが多量含有されている。特に、オタネニンジンを加工した紅参にだけ入っているサポニンは、長期服用した場合、成人病の治療に相当な効果を奏するものと知られている。オタネニンジンサポニンは、すべてのがん細胞を抑制することができる。白内障に関する実験でもオタネニンジンサポニンは、優れた効果を示した。ジンセノサイド（オタネニンジンの配糖体サポニン）は、同分子内に炭水化物（糖体；ｇｌｙｃｏｎｅ）と非炭水化物残基（無糖体；ａｇｌｙｃｏｎｅ）を有している化合物である。炭水化物残基が非炭水化物残基と１番の炭素位置でａｃｅｔａｌ ｌｉｎｋａｇｅで結合する。非糖類成分をアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）とし、糖類成分をグリコン（ｇｌｙｃｏｎｅ）とする。炭水化物部位がブドウ糖の場合にはグルコシド（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）とする。したがって、オタネニンジンの配糖体であるジンセノサイドを加水分解すると、糖体と非配糖体であるサポゲニン（ｓａｐｏｇｅｎｉｎ）に分解される。

イソフラボン配糖体を加水分解する微生物は、ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ラクトバチルスブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、アスぺルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）およびサッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）などがあり、これらはいずれも共通してβ‐グルコシダーゼを生産する細菌である。その他にも配糖体イソフラボンを非配糖体イソフラボンに効率よく転換することができる高い力価のβ‐グルコシダーゼを生産する微生物を開発するための研究が行われ続けている。

しかし、従来の技術は、複雑で複数のステップの工程を含んでおり、生産率の低下、生産コストの増加、精製過程での汚染可能性などの問題がある。

かかる技術的背景下で、本出願の発明者らは、β‐グルコシダーゼを生産する微生物を用いて配糖体を非配糖体に転換した後、微生物内に転換された非配糖体を細胞内に蓄積し、これを含有する微生物またはその破砕物を原料として使用することにより既存の問題点を改善することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、β‐グルコシダーゼを生産する微生物を用いて配糖体から転換された非配糖体を高濃度に製造することができる微生物を製造する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記方法により製造された非配糖体を細胞内に蓄積した、非配糖体含有微生物またはその破砕物およびその用途を提供することにある。

本発明は、β‐グルコシダーゼを発現する微生物を配糖体含有培地で培養するか、配糖体含有反応物と反応させて、前記微生物内に配糖体から転換された非配糖体を蓄積させるステップを含む、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物を製造する方法を提供する。

また、本発明は、前記方法により製造され、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物またはその破砕物を提供する。

また、本発明は、前記微生物またはその破砕物を含有する組成物を提供する。

また、本発明は、前記微生物またはその破砕物を含有する食品を提供する。

さらに、本発明は、前記微生物またはその破砕物を含有する肌機能改善用組成物を提供する。

本発明に係る製造方法によりラクトバチルスプランタルムＫ８を用いて大豆非配糖体に転換させた結果を示す図である。ラクトバチルスプランタルムＫ８による配糖体イソフラボンの非配糖体イソフラボンへの転換を示す。図１における原料は大豆抽出物を含有する培養培地；ＳＴＤはイソフラボンスタンダード；Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡ抽出物は大豆抽出物を含有する培養培地にラクトバチルスプランタルムＫ８を培養した後、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを用いて破砕した破砕物を示す。 本発明に係る製造方法によりラクトバチルスプランタルムＫ８、ラクトバチルスデルブリッキー、ラクトバチルスラムノーサスＧＧ、ラクトバチルスサケイを用いて大豆非配糖体に転換させた結果を示す図である。ラクトバチルスプランタルムＫ８を含む乳酸菌の非配糖体生産を比較したものである。図２におけるＳＴＤはイソフラボンスタンダードを；ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉはラクトバチルスデルブリッキーを；ＧＧはラクトバチルスラムノーサスＧＧを；Ｋ８はラクトバチルスプランタルムＫ８を；ｓａｋｅｉはラクトバチルスサケイを示す。 本発明に係る製造方法によりラクトバチルスプランタルムＫ８破砕物の作製過程中に検出される大豆非配糖体測定量を示す図である。図３のｇｇはラクトバチルスラムノーサスＧＧを、ｄｅｌはラクトバチルスデルブリッキーを、Ｋ８はラクトバチルスプランタルムＫ８を示す。 本発明に係る製造方法によりラクトバチルスプランタルムＫ８を用いてオタネニンジンサポニンから転換されたサポゲニンを示すグラフである。ｒｇ１、ｒｇ３（ｓ）、ｒｈ２、ｒｂ１、ｒｃ、ｒｄ、ｒｂ２、ｆ２はジンセノサイド化合物である。サポニンの一種として分子構造に応じて前記の名称で分類される。図４におけるｗａｓｈｉｎｇは乳酸菌培養後の洗浄液を；Ｇｉｎｓｅｎｇ ｅｘｔはオタネニンジン抽出物を；ｋ８はラクトバチルスプランタルムＫ８を意味する。 ラクトバチルスプランタルムＫ８による加水分解されたサポニン吸収予想メカニズムを示す図である。 低分子オタネニンジンサポニン検出量を測定した結果を示す図である。摂取量はマウスに与えたオタネニンジン抽出物量を示し、吸収量はマウスの血液中から検出されたオタネニンジンサポニン量を示す。 低分子オタネニンジンサポニン吸収率を示す結果である。摂取量のうち吸収された量を割合で換算した結果である。

従来、微生物を用いた配糖体の非配糖体への転換が試みされたが、微生物が転換された非配糖体を細胞内に含有していることは未だに報告されておらず、そのため、本発明に係る微生物による非配糖体への生物転換および微生物の細胞内蓄積に関する結果は新規のものである。本出願の発明者らは、微生物の細胞内に蓄積された非配糖体の濃度は微生物培養培地の中で非配糖体の濃度より２倍以上高く、高濃度の非配糖体を生産することができることを確認した。

プロバイオティクスの作用メカニズムとしては、腸内環境のリモデリング、病原体の抑制、ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ抑制、上皮細胞分化に対する影響、腸内腸壁効果の強化などが知られている。大腸がん抑制に対するプロバイオティクスの作用は、様々な生化学的経路があるが、細胞周期、活性酸素、細胞自滅、特定の細菌性酵素の生産、および宿主代謝により大腸がんの発生を抑制する。また、乳酸菌は、免疫系統を活発化する免疫活性化作用により疾病から身体を保護する。腸表面の絨毛で乳酸菌は白血球やリンパ球のような兔疫細胞とｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎをし、免疫力の活性を促進させる。乳酸菌は、ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓでｈＢＤ２（ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ ｄｅｆｅｎｓｉｎ）の発現を誘導することで腸内免疫を調節する。また、腸細胞であるＣａＣＯ_２でのｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの露出によってｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅであるＩＬ‐８の生成とＨｓｐ７０の発現の抑制が行われるとされている。これにより、乳酸菌がｃｙｔｏｋｉｎｅを調節することで炎症反応を調節するが、直接関与していることが分かる。また、腸内細胞でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは自己免疫反応とＴＬＲ（Ｔｏｌｌ‐ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現を調節する。これは、乳酸菌による腸内の健康調節作用がＴＬＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇと関連することを意味する。

ラクトバチルスプランタルムＫ８は、オタネニンジンサポニンを配糖体の形態で吸収した後、β‐ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅを用いて加水分解サポニンに分解する。糖は、乳酸菌の代謝過程で使用される一方、加水分解サポニンの場合、乳酸菌の新陳代謝に不要な物質であるため、加水分解サポニンは、体内に蓄積した後、時間が経つにつれて細胞外に排出させると思われる。加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムＫ８を動物を用いた実験で変形させていないオタネニンジンサポニン（サポニン抽出物）を摂取した場合に比べて１，３００倍以上高い体内吸収率を示した（実施例７）。かかる高い吸収率は、乳酸菌がカプセルの働きをすることで、胃でサポニンの破壊を防止し安全に腸内に伝達することができることが一つの理由である。また、加水分解サポニン含有乳酸菌は、腸細胞内に存在する大食細胞（Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）により選択的にｕｐ ｔａｋｅされた後、ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａまたはｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅに移動されて加水分解サポニンを血管に排出すると予想される（図５）。

これに基づき、一観点から本発明は、β‐グルコシダーゼを発現する微生物を配糖体含有培地で培養するか、配糖体含有反応物と反応させて、前記微生物内に配糖体から転換された非配糖体を蓄積させるステップを含む、非配糖体が細胞内に蓄積されている微生物を製造する方法に関するものである。

本発明で使用される微生物は、非配糖体生産活性を示す。具体的に、β‐グルコシダーゼ活性により配糖体を非配糖体の形態に転換する能力を有している。嫌気的条件下で配糖体の形態（ｇｅｎｉｓｔｉｎ、ｄｉａｄｚｉｎ）を非配糖体の形態（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、ｄｉａｄｚｅｉｎ）のイソフラボンを生産する能力がある。かかる微生物を破砕する場合、細胞内に蓄積されている非配糖体を検出することができる（図１）。

前記微生物は、β‐グルコシダーゼを生産する微生物であれば特に制限されないが、例えば、乳酸菌、ラクトコッカス、コリネバクテリウム、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）微生物、ビフィダス、酵母、バチルス、アスペルギルスおよびクロストリジウムから構成される群から選択された一つ以上であってもよい。前記乳酸菌は、ラクトバチルスプランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスサケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルスラムノーサスＧＧ（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ）、ラクトバチルスデルブリッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルスアシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルスジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルスカゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルスガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）およびリューコノストックメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄ）から構成される群から選択された一つ以上であってもよい。

本出願の発明者らは、韓国の伝統発酵食品であるキムチからβ‐グルコシダーゼを生産するラクトバチルスプランタルムＫ８を分離・同定した。先ず、キムチとキムチ汁を滅菌生理食塩水を使用して１０倍ずつ段階的に希釈した後、原液と希釈液をラクトバチルス選択培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇａｒ、ＬＢＳ ａｇａｒ、Ｄｉｆｃｏ）に塗抹した。３７℃で２〜３日間培養して示されたコロニーを形および色別に区別しまた純粋分離した。分離したコロニーに対してグラム染色および顕微鏡観察を行い、グラム陽性で棒状のコロニーのみを選別しており、これらをｐＨ６．８のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ）で３７℃、２４時間培養して培養液のｐＨが４．５以下に減少するコロニーを再選別した。次に、ｐＨ２．０のＭＲＳ培地で２時間培養した後、また０．３％のｏｘｇａｌｌが添加されたＭＲＳ培地内で９時間培養した場合に生存が可能な耐酸性、耐胆汁性Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株を分離した。分離した菌株はＡＰＩ ＣＨＬ ５０ ｋｉｔを用いた生化学テストと１６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより同定した。同定の結果、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ種に属する菌株であることを確認しており、これを「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８」と名付けた（寄託番号：ＫＣＴＣ １０８８７ＢＰ）。

他の実施例において、前記β‐グルコシダーゼを生産する微生物は、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）微生物、ビフィダス、酵母、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ Ｒｈ２、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ．，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ Ｒｈ２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｅｌｉｎｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｍｕｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ Ｓｐｅａｒｅ ＢＧＢ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒから構成される群から選択された一つ以上であってもよい。

非配糖体イソフラボンまたは加水分解サポニン含有乳酸菌を作製するために、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８を大豆抽出物または配糖体サポニンを添加した培地に培養し、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを用いて破砕した後、破砕された乳酸菌を溶媒系統分画により分画した。イソフラボンまたは加水分解サポニンが存在するＥｔＯＡｃ分画に対して２，０００ｐｐｍ濃度で調剤した後、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳを使用して分析を行った。破砕後、非配糖体イソフラボンであるｄａｉｄｚｅｉｎとｇｅｎｉｓｔｅｉｎの含有量と加水分解サポニンであるＲｇ３の含有量が増加することを確認することができた。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８をｓｏｎｉｃａｔｏｒまたはｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを用いて破砕した後、凍結乾燥させることで、「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡ」細胞破砕物を製造した。具体的に、前記ステップ（ａ）は、微生物活性化のために静置培養するステップ、振盪培養するステップ、および流加培養するステップを順に含むことができる。この際、３７℃で１２時間微生物を静置培養し、３７℃で１２時間６ｒｐｍの条件で振盪培養することができる。微生物を培養するために、炭素源、窒素源、ビタミンおよびミネラルから構成される培地（例えばＭＲＳ培地）を使用することができる。

場合に応じて、ステップ（ａ）前に配糖体含有植物体をタンパク質分解酵素で前処理するステップをさらに含んでもよい。前記タンパク質分解酵素は、例えば、プロモード（ｐｒｏｍｏｄ）、アルカラーゼ（ａｌｋａｌａｓｅ）、ニュートラーゼ（ｎｅｕｔｒａｓｅ）およびパパイン（ｐａｐａｉｎ）から構成される群から選択される一つ以上であってもよい。

具体的に、詳細な製造工程は、以下の「製造工程表」と表１に記述した。

［製造工程表］
菌体循環生物反応器（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃｅｌｌ‐ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｏｒ：ＭＣＲ）製造工程
１）発酵ライン殺菌：スチームを用いて発酵管に流入されるラインを殺菌する。
２）発酵槽、フィーディングタンク空殺菌：Ｓｐａｒｇｅｒ、ｓａｍｐｌｉｎｇおよび下部ｓｔｅａｍを用いてタンク内部にｓｔｅａｍを注入させて１２１±１℃１．２〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ^２の条件で１５〜２０分間殺菌する。
３）原料秤量および培地殺菌：製品の規格に応じて培養培地の原料を各々正確に秤量した後、これをいずれも発酵槽およびフィーディングタンク内に挿入して容量に合わせて水量を調節した後、２）の条件通りに滅菌する。
４）冷却：滅菌後、３７℃まで冷却する。
５）種菌活性化：凍結された乳酸菌体を３７℃恒温槽で急速に解凍させた後、滅菌された培養培地１．５Ｌに接種して１２時間静置培養する。
６）本培養：滅菌された本培養培地３０Ｌに１／１００で希釈させた種菌を培養する。
７）流加培養：培養条件が常に維持されるように随時に点検する。Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）値が設定値に至ると、メンブレンを循環させて使用培地を除去し、排出された量だけの新しい培地をフィーディングタンクに投入する。約２００Ｌの培地を連続して除去および投入し菌体を培養する。
８）濃度調節：ｄｒａｉｎラインをスチームで３０分間殺菌した後、ｄｒａｉｎラインに液を流して遠心分離し、適正量の逆浸透圧蒸留水で希釈して濃度を調節する。
９）生菌回数および製品包装または菌体破砕：濃度調節された菌体を菌体破砕器で破砕する。
１０）死菌化：破砕菌体を８０℃で３０分間維持させて培養液を死菌化しまた冷却させる。目的に応じて死菌化は除いてもよい。
１１）菌体回収および包装：冷却した液をタンクドレインラインを用いてポリエチレン（ＰＥ）ビンに入れて包装する。

さらに他の実施例において、培地に微生物を接種してから培養した後、配糖体が含有された最小培地に移して１〜３６時間、例えば、４〜２４時間さらに培養することができる。本発明の実施例６によれば、微生物を配糖体が含有された最小培地を用いて培養する場合、同量の細胞を配糖体サポニンが含まれたＭＲＳ培地で培養した対照群に比べて非配糖体の細胞内蓄積が増加することができることを確認した。

一つの実施例において、前記配糖体は、オタネニンジン、山参、大豆、ツルニンジン、ソバ、キキョウ、セリ、緑豆、ニンニク、タマネギ、イチョウ、クズから構成される群から選択される一つまたはこれらの混合物来由であってもよい。

前記配糖体は、イソフラボン配糖体、サポニン配糖体、フェノール配糖体（フェノール）、青酸配糖体（ニトリル配糖体）、アントラキノン配糖体、強心配糖体、苦味配糖体（苦味物質）、クマリン配糖体（クマリン）、硫黄配糖体（チオグリコシド、硫黄）またはフラボノイド配糖体（フラボノイド）であってもよく、例えば、本発明に係る方法は、ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）、ゲニスチン（ｇｅｎｉｓｔｉｎ）、グリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｉｎ）、サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）、ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ、ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ、ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、ｒｕｔｉｎｏｓｅ、ｈｅｓｐａｒｉｄｉｎ、ｂａｉｃａｌｉｎ、ｗｏｇｏｎｏｓｉｄｅ、Ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ Ｖ、ａｍｙｇｄａｌｉｎおよび３‐Ｐｈｅｎｙｌ ｃｏｕｍａｒｉｎから構成される群から選択された一つ以上の配糖体をゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、グリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）、加水分解サポニン、３，４‐Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ、４‐ＨＰＡ、ｍ‐ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ、ｐ‐ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ、Ｏ‐ｂｅｔａ‐Ｄ‐ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｏｄｅｓ、ｓｔｉｌｂｅｎｏｉｄｓ、ｒｕｔｉｎ、ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、ｈｅｓｐａｒｅｔｉｎ、ｂａｉｃａｌｅｉｎ、ｗｏｇｏｎｉｎ、Ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ ＩＩＩＥ、ｍｅｎｄｅｌｏｎｉｔｒｉｌｅ、ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ、およびｃｏｕｍａｒｉｎ‐ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓから構成される群から選択された一つ以上の非配糖体に転換するものであってもよい。

かかる製造方法により生産された非配糖体は細胞内に蓄積されてもよい。これに基づき、本発明は、他の観点から、前記製造方法により生産された非配糖体を細胞内蓄積した微生物またはその破砕物に関するものである。前記細胞内蓄積された非配糖体の濃度は、微生物培養培地の中で非配糖体の濃度より２倍以上高いことを確認した。

前記破砕物は、物理的な方法を使用して作製することができる。例えば、微生物をビーズミル（ｂｅａｄ ｍｉｌｌｓ）、プレス（Ｐｒｅｓｓｅｓ）、ソニケータ（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）またはマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用して４〜９回破砕させた後、凍結乾燥して粉末化させることができる。必要に応じて破砕菌体を８０℃で３０分間維持させて培養液を死菌化しまた冷却させてもよい。

本発明は、さらに他の観点から、前記微生物またはその破砕物を含有する組成物に関するものである。

前記微生物またはその破砕物は、抗酸化用組成物、整腸用組成物、化粧品原料組成物、生菌用組成物として使用され得る。特に、飼料用組成物、食品添加用組成物およびその他の発酵製品としても使用され得る。本発明に係る微生物またはその破砕物の破砕された細胞壁の分画、生菌、死菌、乾燥菌または培養物を有効成分として含んでもよく、賦形剤または担体をさらに含んでもよい。

前記培養物は、液体培地で培養した培養液自体、前記培養液をろ過または遠心分離して菌株を除去したろ液（遠心分離した上澄み液）、前記培養液を超音波処理または酵素（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）処理して得た細胞破砕液などを含む。本発明の組成物内の微生物またはその破砕物に対する含有量は組成物の用途および剤形に応じて異なり得る。

本発明に係る組成物は、様々な剤形と方法で製造および投与され得る。例えば、微生物またはその破砕物または培養物を薬剤学的分野において通常使用する担体および香料と混合し、タブレット（ｔａｂｌｅｔ）、トローチ（ｔｒｏｃｈｅ）、カプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、シロップ（ｓｙｒｕｐ）、散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、懸濁剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）または顆粒剤（ｇｒａｎｕｌｅ）などの形態に製造および投与されてもよい。前記担体としては、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤などを使用してもよい。投与方式は、経口、非経口または塗布法を使用してもよく、投与容量は、体内で活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、被投与者の年齢、性別、状態などに応じて適宜選択してもよい。好ましくは、１日１０ｍｇの有効容量で投与してもよく、生菌剤用組成物の場合、組成物内の生菌数は１０^８〜１０^１０ＣＦＵ／日であることが好ましい。

前記抗酸化用組成物は、活性酸素を除去するために用いられてもよく、整腸用組成物または生菌剤組成物は、イソフラボンの体内吸収を促進して消化不良または下痢を予防または改善することができる。

また、前記飼料用組成物は、発酵飼料、配合飼料、ペレット形態およびサイレージ（ｓｉｌａｇｅ）などの形態に製造され得る。前記発酵飼料は、本発明における微生物またはその破砕物と様々な他の公知の微生物または酵素を添加することで有機物を発酵させて製造されてもよく、前記配合飼料は、様々な種類の一般飼料と本発明の乳酸菌を混合して製造されてもよい。ペレット形態の飼料は、発酵飼料または配合飼料をペレット機械で剤形化して製造されてもよく、サイレージは、青刈飼料を本発明に係る乳酸菌で発酵させることで製造されてもよい。

また、微生物またはその破砕物またはその培養物は、離乳食、キムチ、飲料、乳製品などの食品に対する食品添加剤として使用され得る。

また、本発明は、微生物またはその破砕物を含有する食品に関するものである。

本発明に係る微生物またはその破砕物またはその培養物は、化粧品組成物として使用されてもよく、具体的には、基礎化粧用、化粧用化粧品用、毛髪用化粧品用、美白用化粧品用、シワ改善用化粧品用、老化抑制化粧品用などの様々な用途に用いられてもよい。

さらに、本発明は、微生物またはその破砕物を含有する肌機能改善用組成物を提供する。前記肌機能改善は、肌保湿、肌色、肌弾力、シワまたは真皮緻密度を改善することを意味し得る。

さらに、本発明に係る微生物またはその破砕物は、発酵製品の製造のための種菌として使用され得る。前記発酵製品は、ハムおよびソーセージのような発酵肉製品、発酵生食製品、発酵乳製品、発酵大豆液、キムチなどを含む。発酵製品は、当業界において公知の通常の方法により製造され得る。例えば、前記発酵生食製品は、玄米とハトムギなどの穀類粉末、果菜類粉末、キノコ類粉末に微生物またはその破砕物原末を混合して製造されるか、前記穀類粉末を微生物またはその破砕物またはこれを含む２〜５種の混合乳酸菌で適正温度で発酵させた後、果菜類、キノコ類粉末を栄養的なバランスと嗜好性に優れるように適宜配合して製造されてもよい。また、前記発酵乳製品は、原乳または脱脂粉乳を本発明に係る乳酸菌またはこれを含む２〜５種の混合乳酸菌で適正温度で発酵させて製造されてもよく、前記発酵大豆液は、大豆液を本発明に係る乳酸菌またはこれを含む２〜５種の混合乳酸菌で適正温度で発酵させて製造されてもよい。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

実施例１：ラクトバチルスプランタルムＫ８の生化学的特性の検査
韓国の伝統発酵食品であるキムチから分離・同定したラクトバチルスプランタルムＫ８の抗酸化活性を評価するためにＡＰＩ ｔｅｓｔ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を行った。前記乳酸菌の生化学的な特性と糖利用性は、下記の表２と表３に記載の通りである。

実施例２：ラクトバチルスプランタルムＫ８の非配糖体生産
ラクトバチルスプランタルムＫ８を大豆抽出物を添加した培地に培養し、マイクロフルイダイザーを用いて破砕した後、破砕された乳酸菌を溶媒系統分画により分画した。イソフラボンが存在するＥｔＯＡｃ分画に対して２０００ｐｐｍ濃度に調剤した後、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳを使用して分析を行った。その結果、大豆原料の場合、配糖体イソフラボンであるｄａｉｄｚｉｎとｇｅｎｉｓｔｉｎの含有量が高い一方、ラクトバチルスプランタルムＫ８との培養後、非配糖体イソフラボンであるｄａｉｄｚｅｉｎとｇｅｎｉｓｔｅｉｎの含有量が増加することを確認することができた。一方、配糖体イソフラボンの含有量は、ラクトバチルスプランタルムＫ８との培養後に減少した（図１）。本発明に係るラクトバチルスプランタルムＫ８を接種する前に、１ｍｌ／Ｌのアルカラーゼ、１ｍｌ／Ｌのニュートラーゼおよび０．２ｇ／Ｌのパパインを加えて６０℃で８時間攪拌する前処理過程を含む場合、非配糖体への転換後、細胞内蓄積率が約１０％増加した（表４）。

実施例３：非配糖体生産活性の評価
乳酸菌の非配糖体イソフラボン転換能および細胞内非配糖体イソフラボン蓄積能を確認するために、ラクトバチルスデルブリッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルスラムノーサスＧＧ（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ）、ラクトバチルスプランタルムＫ８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８）、ラクトバチルスサケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）を大豆ｅｘｔｒａｃｔｓが含有された培養培地に接種し、３７℃で１２時間培養した後、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、ＬＣ／ＭＳ‐ＭＳによりイソフラボンの含有量を測定し図２に示した。その結果、４種の乳酸菌のすべてから非配糖体ｄａｉｄｚｅｉｎとｇｅｎｉｓｔｅｉｎが検出された（図２）。かかる結果は、β‐グルコシダーゼを分泌する全種類の乳酸菌または微生物によって配糖体イソフラボンを非配糖体イソフラボンに生物転換することができるということを意味し、また、転換された非配糖体イソフラボンを細胞内に蓄積することができるということを示す結果である。

実施例４：乳酸菌の工程別の非配糖体イソフラボン生産活性
乳酸菌破砕物の作製過程中のイソフラボンの含有量を測定する実験を行った。大豆抽出物が含有された培地にラクトバチルスラムノーサスＧＧ、ラクトバチルスデルブリッキー、ラクトバチルスプランタルムＫ８を３７℃で１２時間培養した後、滅菌水を用いて３回洗浄した。洗浄した洗浄液と乳酸菌破砕物をそれぞれＬＣ／ＭＳ‐ＭＳを用いてイソフラボンの含有量を測定した。その結果、３回の洗浄液および乳酸菌破砕物から配糖体イソフラボンは検出されなかった。一方、非配糖体イソフラボンの場合、洗浄液から少量検出され、乳酸菌破砕物から高濃度に検出された（図３）。さらに他の実験において、ラクトバチルスプランタルムＫ８培養培地（Ｍｅｄｉａ）、培養後の培地（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐ．）、洗浄液（Ｗａｓｈ １、２、３）、乳酸菌破砕物（Ｌｙｓａｔｅｓ）、乳酸菌破砕物上澄み液（Ｌｙｓａｔｅｓ ｓｕｐ．）、乳酸菌破砕物沈殿液（Ｌｙｓａｔｅｓ ｐｐｔ．）での配糖体および非配糖体イソフラボンの含有量を測定した。その結果、乳酸菌破砕物（Ｌｙｓａｔｅｓ）、乳酸菌破砕物上澄み液（Ｌｙｓａｔｅｓ ｓｕｐ．）、乳酸菌破砕物沈殿液（Ｌｙｓａｔｅｓ ｐｐｔ．）においてイソフラボン、特に非配糖体イソフラボンの含有量が大幅に増加したことを確認した（表５）。かかる結果は、非配糖体イソフラボンが乳酸菌に付いていたとか、残留培養液から起因したと言えず、つまり、乳酸菌内に蓄積されていることを意味する。

実施例５：乳酸菌によるサポニンのサポゲニンへの転換
オタネニンジンサポニンの加水分解サポニンへの転換および細胞内蓄積を確認するために、ラクトバチルスプランタラムＫ８を人参抽出物が添加された培養液で培養した後、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを使用して乳酸菌を破砕した。破砕後、ＬＣ／ＭＳ‐ＭＳによりジンセノサイド化合物を分析した。その結果、イソフラボンでの結果と同じ脈絡でラクトバチルスプランタルムＫ８がジンセノサイドをｕｐｔａｋｅしたことを確認した（ｗａｓｈｉｎｇと破砕物のａｒｅａ値比較）。すなわち、洗浄液および人参抽出物では認められなかったピークが乳酸菌破砕物で認められたが、これは、乳酸菌の酵素によってｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎされたことが分かる（点線で表されたボックスで表示）。人参ジンセノサイド転換の核心は、量が多く活性が良好でないジンセノサイド、すなわち、ｒｇ１とｒｂ１などで量は少ないが活性には優れたｒｇ３、ｒｃ、ｆ２などのジンセノサイドへの転換である。本実験結果でもラクトバチルスプランタルムＫ８によって高級サポニンの一種であるｒｇ３に転換されたことを確認することができる。

実施例６：最小培地を用いた加水分解サポニンの細胞内蓄積の増大
ラクトバチルスプランタルムＫ８をＭＲＳ培地５ｍＬに接種した後、３７℃で２４時間静置培養してからＭＲＳ培地５０ｍＬに移して１２時間さらに培養した。培養された細胞を１ＬのＭＲＳ培地に移した後、１５時間培養してからＰＢＳで３回洗浄をした。洗浄した細胞は、配糖体サポニンが含まれたＭ９ Ｍｉｎｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ（最小培地）１Ｌ、配糖体サポニンとｌｙｓｏｚｙｍｅ（０．５ｇ／Ｌ）が含まれたＭＲＳ培地に同数を接種した後、６時間静置培養をした。他の実験では、配糖体サポニンが含まれたＭＲＳ培地に細胞を移した後、４２℃で６時間を培養した。対照群としては同量の細胞を配糖体サポニンが含まれたＭＲＳ培地で６時間培養した。培養された細胞は、洗浄後、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを使用して細胞を破砕し、ＬＣ／ＭＳ‐ＭＳによりジンセノサイド化合物を分析した。Ｍ９最小培地を使用した細胞の場合、対照群に比べて３．８４倍以上加水分解サポニン化合物が増加すると示された（表６）。

実施例７：マウスの血液からの人参ジンセノサイド検出
３日間、オタネニンジン抽出物と機能性加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムＫ８を摂取したマウスから分離した血液でオタネニンジンサポニンの含有量を測定した。オタネニンジン抽出物の場合、全摂取量１，０８５，６３０ｎｇのうち約１５０ｎｇのオタネニンジンサポニンが吸収されていることが認められた。一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムＫ８によって摂取されたオタネニンジン抽出物の量は１１，６５３ｎｇであり、このうち、血液から検出されたオタネニンジンサポニンの全含有量は約２１６０ｎｇである（図６）。これを割合で換算すると、オタネニンジン抽出物の場合には０．０１４％の吸収率を示した一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムＫ８によるオタネニンジンサポニンの吸収率は約２０％に達する（図７）。

特に、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムＫ８を摂取したマウスではＦ２とＲｇ３オタネニンジンサポニンが多量吸収されると示されたが、Ｆ２とＲｇ３はオタネニンジンサポニンの中でも最大の機能性を有していると知られている。

オタネニンジン抽出物は、多量摂取しても吸収率が低いため、摂取量の面であまり意味がない。一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムＫ８の場合、抽出物を直接摂取することに比べて約１３００倍以上高い吸収率を示す。すなわち、同一の１００ｇのオタネニンジン抽出物を摂取する場合、直接摂取する場合には摂取した量の９９％以上が吸収されず捨てられる一方、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムＫ８は２０ｇを吸収することができる。かかる結果は、加水分解サポニン含有ラクトバチルスプランタルムＫ８内に存在する低分子オタネニンジンサポニンがマウスの消化過程を経る間に乳酸菌によって自然に保護されたことを意味する。

実施例８：Ｙｅａｓｔを用いた加水分解サポニンの細胞内蓄積
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３７℃で２４時間振盪培養した後、オタネニンジン抽出物（１ｇ／Ｌ）が添加された５００ｍｌのＹＰＤ培地に移した後、１２時間さらに培養した。遠心分離後、上澄み液は別に冷蔵保管、ｐｅｌｌｅｔは滅菌蒸留水を用いて３回洗浄した。洗浄した酵母はｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒを用いて３回破砕し、ＬＣ／ＭＳ‐ＭＳにより加水分解サポニン化合物を分析した。本実験において分析のために準備した試料は、培養後上澄み液（１）、洗浄１回（２）、洗浄２回（３）、洗浄３回（４）、破砕前（５）、破砕後（６）の総６群のｓａｍｐｌｅを準備した。その結果を以下の表７に示す。

実施例９：ラクトバチルスプランタルムＫ８破砕物を含有する飴に対する臨床試験の結果
ラクトバチルスプランタルムＫ８破砕物（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡ）に対する人体の肌保湿および肌色改善効能を評価するために臨床試験を行った。本研究は、依頼人の要請内容と人体適用試験ガイドライン（食品医薬品安全処、２０１１．１２制定）、健康機能食品の人体適用試験（食品医薬品安全処、２００８．１２）および人体試験管理基準（Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＣＰ）に基づいて行われており、慶煕大学校臨床研究審議委員会の承認（研究番号ＫＨＵＳＢＣ ２０１２‐０１１）を得た。

乾燥肌で肌色がくすみ始めたり既にくすみが進んだ２５歳〜６０歳の女性被験者４１名を試験対象者として選定し、空腹に製品（表２７）を朝２錠、夕方２錠を摂取した。選定された被験者に試験製品（２．１％Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡ含有飴）と対照製品（２．１％Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡが含有されていない飴）を二重盲検の無作為割り付けで８週間服用するようにした後、試験製品の使用前、使用４週後、８週後の各時点で肌色の目視評価、肌水分、角質量、ＴＥＷＬ、肌色（Ｌ＊ｖａｌｕｅ）およびアンケート評価、安全性評価、食餌調査、体重（ＢＭＩを含む）調査を行い、肌改善効果を評価した。また製品の服用前と製品服用８週後の時点で血液分析を行った。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡを含有する飴をＬＣ／ＭＳ‐ＭＳで分析して非配糖体イソフラボンが含まれていることを確認した（表８）。

１．目視評価の結果
製品の服用前と比較すると、製品服用４週後、８週後の時点で対照群、試験群のいずれも統計的に肌色（明度）が有意に改善（減少）した。群間比較の際に、製品服用４週後、８週後でグループ間の統計的な有意の差はなかった（ｐ＜０．０５）。

２．機器の評価
２‐１．肌水分量
製品の服用前と比較すると、製品服用４週後の時点では、顔、前膊部位のいずれも試験群で、８週後の時点では顔部位では試験群と対照群のいずれも、前膊部位では試験群で統計的に有意に肌水分量が増加した。群間比較の際、顔部位では製品服用４週後、８週後の時点で、前膊部位では製品服用４週後の時点で対照群に比べて試験群で統計的に有意に肌水分量が増加した（ｐ＜０．０５）（表８）。

２‐２．経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）
製品の服用前と比較すると、製品服用８週後の時点で顔、前膊部位のいずれも試験群で統計的に有意にＴＥＷＬが減少した。群間比較の際、製品服用８週後の時点で前膊部位で対照群に比べて試験群で統計的に有意にＴＥＷＬが減少した（ｐ＜０．０５）（表９）。

２‐３．肌角質量
製品の服用前と比較すると、製品服用４週後、８週後に顔部位では試験群、前膊部位では対照群と試験群のいずれも肌角質量が統計的に有意に減少した。群間比較の際、顔、前膊部位のいずれも製品服用４週後、８週後の時点で対照群に比べて試験群で統計的に有意に肌角質量が減少した（ｐ＜０．０５）（表１０）。

２‐４．肌色の明度（Ｌ＊ｖａｌｕｅ）
製品の服用前と比較すると、頬の部位では製品服用４週後に試験群で、製品服用８週後の時点では対照群、試験群のいずれも有意に肌色の明度程度が増加し、色素沈着部位では製品服用４週後、８週後で対照群と試験群のいずれも有意に肌色の明度（Ｌ＊ｖａｌｕｅ）程度が増加した（ｐ＜０．０５）。群間比較の際、頬の部位では製品服用４週後、８週後の時点で色素沈着部位では製品服用８週後の時点で対照群に比べて試験群で有意に肌色の明度（Ｌ＊ｖａｌｕｅ）程度が増加した（ｐ＜０．０５）（表１１）。

２‐５．血液分析
分析の結果、製品の服用前と比較すると、製品服用８週後、Ｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ項目は対照群で、Ｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ、Ｐｕｌｓｅ項目は試験群で有意の差を示したが、パラメータの平均値はいずれも正常範囲内に存在した（ｐ＜０．０５）。群間比較の際、製品服用８週後、すべてのパラメータで二つの群間に有意の差がなかった（表１２）。

２‐６．食餌調査および体重
分析の結果、製品の服用前と比較すると、製品服用８週後の時点の試験群で体重が有意に増加した以外は、食餌調査、体重、ＢＭＩ指数のいずれも製品服用４週後、８週後の時点で有意の差がなかった（ｐ＜０．０５）。群間比較の際、対照群と試験群のいずれも製品服用４週後、８週後の時点で食餌調査、体重、ＢＭＩ指数の有意の差はなかった（ｐ＜０．０５）（表１３）。

３．アンケート評価の結果
３‐１．効能に関するアンケート分析の結果
「肌がしっとりとなった」、「滑らかになった」、「つっぱり減少」、「角質減少」、「肌が健康になった」項目は、製品服用４週後の時点と８週後の時点でそれぞれ被験者の６０％、７０％以上が対照製品、試験製品のすべてに対して肯定的に改善したと回答した。特に、「つっぱり減少」、「キメが整った」項目は、製品服用４週後の時点で対照製品に比べて試験製品で１０％以上高く示された（表１４）。

３‐２．製品使用性に関するアンケート分析の結果
「咀嚼感」以外のすべての項目で被験者の７０％以上が対照製品、試験製品のすべてに対して肯定的に回答した。特に、「製品の味」、「全体的な製品満足度」項目は、試験群で被験者の１００％が満足すると回答した（表１５）。

４．安全性評価の結果
本試験期間の間にすべての被験者からは、肌、全身的症状に何らの異常反応が観察されなかった。

以上の結果から、本試験製品は、肌水分、肌角質量、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）、肌色改善に役立つと判断される。

実施例９：ラクトバチルスプランタルムＫ８破砕物（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡ）を含有する化粧品の製造および人体適用実験
臨床試験の結果
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡを含む化粧品３種を製造して人体の肌保湿、肌色、肌弾力、目元シワおよび真皮緻密度改善効能を評価するための実験を行った。

シワおよび色素沈着が既に生成された３５〜５０歳の女性被験者３２名を対象として試験を行った。試験製品（表１６）を試験期間８週間連続使用するようにして、製品の使用前、４週後、８週後の時点で目視評価（目元シワ、肌色）と機器測定（肌の保湿、肌色、肌弾力、目元シワおよび真皮緻密度）を行った。左側／右側の測定部位は、Ｂｌｏｃｋ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎで決めており（Ａ：左側頬の保湿、真皮緻密度、右側頬の色測定、弾力、目元シワ測定／Ｂ：右側頬の保湿、真皮緻密度、左側頬の色測定、弾力、目元シワ測定）、安全性およびアンケート評価は、製品使用４週後、８週後の時点で行った。

被験者は、洗顔後、空気の移動と直射光線がなく、恒温・恒湿条件（２２±２℃、５０±５％）が維持される空間で少なくとも２０分以上休んでから機器測定に参加した。

１．目視評価
１‐１．時点別の目元シワの目視評価の分析
試験製品の使用前と比較すると、製品使用４週後、８週後の時点で有意にシワが改善することが認められ（Ｐ＜０．０５）、シワ改善最大増減率は５．５０％の減少（改善）率を示した（表１７）。

１‐２．時点別の肌色の目視評価の分析
試験製品の使用前と比較すると、製品使用４週後、８週後の時点で有意に肌色が改善したことが認められ（Ｐ＜０．０５）、肌色改善最大増減率は９．０４％の減少（改善）率を示した（表１８）。

２．機器測定
２‐１．水分量の測定
試験製品の使用前と比較すると、製品使用４週後、８週後の時点で水分量が統計的に有意に増加（改善）し（Ｐ＜０．０５）、水分量改善最大増減率は、４２．９７％の増加（改善）率を示した（表１９）。

２‐２．肌色の明度（Ｌ＊ｖａｌｕｅ）の測定
試験製品の使用前と比較すると、頬部位の肌色の明度程度は、製品使用４週後、８週後の時点で統計的に有意に増加（改善）し、色素沈着部位の明度程度は、製品使用８週後の時点で統計的に有意に増加（改善）した（Ｐ＜０．０５）。色明度改善最大増減率は頬部位が１．５９％、色素沈着部位が１．２５％の増加（改善）率を示した（表２０）。

２‐３．肌弾力の測定（Ｍｏｉｒｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍ）
製品の使用前と比較すると、製品使用後４週後、８週後の時点で等高線の全距離（Ｄｉｓｔａｎｃｅ）と平均角度（Ａｎｇｌｅ）が統計的に有意に減少（改善）した（Ｐ＜０．０５）。等高線全長の最大減少率は９．６４％であり、角度の最大減少率は１４．７０％であった（表２１）。

２‐４．目元シワの測定
製品の使用前と比較すると、製品使用後４週の時点でシワの平均深さ（Ｍｅａｎ ｄｅｐｔｈ）と最大深さ（Ｍａｘ ｗｒｉｎｋｌｅ ｄｅｐｔｈ）が統計的に有意に減少（改善）し、使用後８週の時点でシワの最大深さ（Ｍａｘ ｗｒｉｎｋｌｅ ｄｅｐｔｈ）が統計的に有意に減少（改善）した（ｐ＜０．０５）。

「シワの平均深さ」の最大減少率は８．３６％であり、「シワの最大深さ」の最大減少率は２６．１７％であった（表２２）。

２‐５．肌真皮緻密度の測定
製品の使用前と比較すると、真皮の厚さ（ｄｉｓｔａｎｃｅ）は、製品使用８週後の時点で統計的に有意に増加（改善）し、真皮の密度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、製品使用４週後、８週後の時点で統計的に有意に増加（改善）した（ｐ＜０．０５）。

真皮厚さの最大増加率は１０．１６％であり、真皮密度の最大増加率は１３．５５％であった（表２３）。

３．アンケート評価
３‐１．効能に関するアンケート評価
製品使用４週後、８週後の時点で被験者らがアンケートを通じて回答した製品の効能に関する評価の結果は、以下のとおりである（表２４）。

３‐２．製品使用性のアンケート評価
製品使用８週後の時点で被験者らがアンケートを通じて回答した製品の最終使用性に関する評価の結果は、以下のとおりである（表２５）。

４．安全性の評価
製品使用後、４週、８週の時点で試験者が被験者の肌状態を観察および質疑応答により主観的、客観的刺激に関する評価を行った。

本試験期間の間にすべての被験者から何らの肌異常反応が観察されなかった。（表２６）

本試験製品（化粧品３種）は、肌保湿、肌色、肌弾力、目元シワおよび真皮緻密度の改善に役立つと判断される。

［製造例］
製造例１：ラクトバチルスプランタルムＫ８破砕物（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｋ８‐ＬＴＡ）を含有する飴の製造
植物性乳酸菌ラクトバチルスプランタルムＫ８破砕物を含有する飴を製造した。飴の作製に使用された原料は、精製ブドウ糖、ラクトバチルスプランタルムＫ８破砕物２．１％、キシリトール２％、ビタミンＣ、ブルーベリーエキス粉末、無水クエン酸、ＤＬ‐リンゴ酸、合成着香料（ブルーベリー香、ラズベリー香、）、酵素処理ステビア、ステアリン酸マグネシウムを含み、表７に表示した。次に、製造された飴が非配糖体イソフラボンを含有するか否かを調べるための実験を行った。互いに異なるロット番号を有している実験群用飴と対照群用飴（表２７に成分表示）を３個ずつ選択し、乳鉢を用いて磨砕した後、滅菌蒸留水に懸濁（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。懸濁した飴サンプルをｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して破砕した後、エタノールを用いて抽出した。エタノール層をメタノールと混合した後、ＬＣ／ＭＳ‐ＭＳ分析を行った。その結果、非配糖体イソフラボンのｄａｉｄｚｅｉｎとｇｅｎｉｓｔｅｉｎが、実験群用飴から検出された一方、対照群用飴では検出されなかった（表２８）。

製造例２：非配糖体含有乳酸菌整腸剤の製造
ラクトバチルスプランタルムＫ８を当業界において公知の方法によりサポニンまたはイソフラボン配糖体のような様々な配糖体を添加したＭＲＳ培地で大量培養し、乳酸菌原末を製造した。製造されたラクトバチルスプランタルムＫ８原末に少量のカルシウムおよびビタミンＤを混合し整腸製品を製造した。具体的な組成は、下記の表２９に記載した。整腸効果を高めるために整腸効果のある他の乳酸菌原末、例えば、大腸に存在すると知られているビフィダス菌原末を少量添加することができる。

製造例３：非配糖体含有乳酸菌を含有する生食の製造
大豆胚芽発酵粉末に、各種の穀類粉末、海藻類粉末、果菜類粉末、キノコ類粉末および本発明における非配糖体乳酸菌原末を混合し生食製品を製造した。具体的な組成は、下記の表３０に記載した。

製造例４：非配糖体乳酸菌を含有する発酵乳の製造
脱脂乳または原乳に本発明におけるラクトバチルスプランタルムＫ８を前培養した培養液１％を混合し、４０℃で６〜８時間発酵して発酵乳を製造した。具体的な組成は、下記の表３１に記載した。前記脱脂乳または原乳を発酵するにあたり、発酵時間の短縮および発酵乳の風味を向上させるために、商業用に販売されているストレブトコッカスサーモフィラスまたはラクトバチルスアシドフィルスをともに用いても良い。

製造例６：ラクトバチルスプランタルムＫ８を用いた発酵大豆液の製造
大豆液に本発明におけるラクトバチルスプランタルムＫ８を前培養した培養液１％を混合し、４０℃で６〜８時間発酵して発酵大豆液を製造した。具体的な組成は、下記の表３２に記載した。前記大豆液を発酵するにあたり、発酵時間の短縮および発酵乳の風味を向上させるために、商業用に販売されているストレブトコッカスサーモフィラスまたはラクトバチルスアシドフィルスをともに用いても良い。

製造例７：紅参乳酸菌の製造
本発明におけるラクトバチルスプランタルムＫ８を紅参抽出物０．１％が含まれた最小培地１００Ｌで１２時間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を水で洗浄してから凍結乾燥し、マイクロカプセルに入れて紅参乳酸菌を製造した。マイクロカプセルは、Ｗａｌｌ ｍａｔｅｒｉａｌと凝固液によるｍａｔｒｉＸの形成時に可塑剤の添加条件と可塑剤の種類およびカプセルの表面張力等を考慮して粘着力と凝集力を向上できるようにし、カプセルの外部だけでなく内部までも強固にゲル化することから、胃酸で乳酸菌の生存率を高め、腸で高い活性を示す乳酸菌カプセルを作製できるようにした。１次ｃｏａｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎとしてＮａ ａｌｇｉｎａｔｅ １．８％、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ １０％、Ｘａｎｔｈａｎ ｇｕｍ ０．３２％、Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％、ＭＲＳ５％を使用し、ｈａｒｄｅｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎとしてＣａＣｌ_２ ０．５Ｍ、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．５％を使用し、２次ｃｏａｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎでＣｈｉｔｏｓａｎ １．５％、Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ １．５％を使用した。かかる条件で生産された紅参乳酸菌カプセルは、ｐＨ７．４の人工腸液で溶けることを実験により確認した。また、耐酸性試験のために、ｐＨ１．４の人工胃液で時間の間隔を置いて１８０分まで反応させた後、それぞれを人工腸液に放出し生菌数を測定した結果、人工胃液での生存率は約９５％であった。

以上、本発明の内容の特定の部分について詳細に記述しているが、当業界において通常の知識を有する者にとって、かかる具体的技術は単に好ましい実施様態であって、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。

本発明の製造方法によれば、配糖体を非配糖体に転換する能力とともに、転換された非配糖体を細胞内に蓄積する能力を有する微生物により、非配糖体を高濃度に製造することができる微生物を提供することができる。また、本発明の製造方法により製造された非配糖体を含む微生物の生菌またはその破砕物形態に作製することにより、抗酸化用組成物、整腸剤、生菌用組成物、飼料添加剤、食品添加剤、化粧品原料およびその他の発酵製品の製造に多様に用いられ得る。

Claims (6)

1. β−グルコシダーゼを発現する微生物を人参抽出物含有Ｍ９最小培地で培養することによって微生物内に転換されたジンセノサイドを蓄積する段階を含む、転換されたジンセノサイドが細胞内に蓄積された、転換されたジンセノサイドの高い体内吸収率を示す微生物製剤を製造する方法であって、微生物の細胞中に蓄積された前記転換されたジンセノサイドの濃度が培地中の前記転換されたジンセノサイドの濃度の２倍より高く、前記微生物がラクトバチルス・プランタラムＫ８（寄託番号：ＫＣＴＣ１０８８７ＢＰ）である、前記方法。
2. 前記転換されたジンセノサイドがｒｇ３、ｒｃ、及びｆ２からなる群から選択され、前記人参抽出物がｒｇ１又はｒｂ１からなる群から選択される１つ以上のジンセノサイドを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記培養は、微生物活性化のために、微生物を静置培養する段階、振とう培養する段階、およびフィーディング培養する段階を順番に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記静置培養は、３７℃で１２時間行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記培養は、３７℃で１２時間６ｒｐｍの条件で行われる振とう培養を更に含む、請求項３に記載の方法。
6. ｒｇ１又はｒｂ１ジンセノサイドから転換されるｒｇ３、ｒｃ、及びｆ２からなる群から選択されるジンセノサイドを製造する方法であって、ｒｇ１又はｒｂ１ジンセノサイドを含むＭ９最小培地でβ−グルコシダーゼを発現する微生物を培養し、ｒｇ３、ｒｃ、及びｆ２からなる群から選択される転換されたジンセノサイドが細胞内に蓄積される微生物を得る工程を含み、微生物の細胞中に蓄積された前記転換されたジンセノサイドの濃度が培地中の前記転換されたジンセノサイドの濃度の２倍より高く、前記微生物がラクトバチルス・プランタラムＫ８（寄託番号：ＫＣＴＣ１０８８７ＢＰ）である、前記製造方法。