JP6739080B2 - ビタミンｄの定量方法、質量分析装置およびビタミンｄ定量用試薬キット - Google Patents

Description

本発明は、ビタミンＤの定量方法、質量分析装置およびビタミンＤ定量用試薬キットを提供することにある。

病院での臨床検査等において、質量分析装置（以下、「ＭＳ」とも呼ぶ。）を用いた分析が知られている。特に、化合物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、分離された物質をＭＳでイオン化して分析する液体クロマトグラフィー質量分析装置（以下、「ＬＣ／ＭＳ」とも呼ぶ。）によるホルモン等の生体由来物質の分析は、従来から用いられているイムノアッセイ等と比較して高感度かつ高特異性があり、さらには、多項目の同時分析が可能なことから、近年急速に普及しつつある。ＬＣ／ＭＳの中でも、特にＭＳとしてタンデム質量分析装置（以下、「ＭＳ／ＭＳ」とも呼ぶ。）を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量分析では、ＬＣ／ＭＳよりも高感度な選択反応検出（以下、「ＳＲＭ」とも呼ぶ。）モードを用いることにより、選択的に複数の物質を定量分析することが可能となる。

これらのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる生体由来物質の分析の１つとして、近年、血中のビタミンＤ（以下、「Ｖ．Ｄ．」とも呼ぶ。）およびビタミンＤ代謝物の分析が注目されている。ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物であり、カルシウム代謝調節に必須な脂溶性ビタミンであるビタミンＤは、活性型ビタミンＤ（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、以下、「１，２５（ＯＨ）_２Ｄ」とも呼ぶ。）として、血中のカルシウム（Ｃａ^２＋）濃度を高める作用を有する。この作用に加え、１，２５（ＯＨ）_２Ｄや２５−ヒドロキシビタミンＤ（以下、「２５（ＯＨ）Ｄ」とも呼ぶ。）等の生体内代謝物は、細胞の分化・増殖、ホルモンの産生・分泌、免疫反応等に関与するビタミンＤの発現制御に重要な役割を果たしていると考えられている。このため、作用機構および機能の観点により、ビタミンＤはホルモンに分類されることがある。

このように、ビタミンＤおよびビタミンＤ代謝物（以下、両者をまとめて「ビタミンＤ」とも呼ぶ。）は、栄養素としての役割と共に多岐にわたる生理活性を有しているため、ビタミンＤの過不足は様々な疾患の罹患性を高めると考えられており、血中のビタミンＤの測定件数は増加している。そして、感度および特異性が高く、精確な分析が可能である点により、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたビタミンＤの分析も利用されている。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで用いられるイオン化法として、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）やＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）等がある。中でもＥＳＩは、最もフラグメンテーションを起こし難く、適用可能な化合物の範囲の広さと高い操作性から、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで最も汎用されるイオン化法である。しかしながら、一般的にビタミンＤ代謝物のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ応答性は低く、また、血中のビタミンＤ代謝物は微量成分であるため、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いても感度が不足する場合がある。そこで、ビタミンＤ代謝物のイオン化効率を高めることによりＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける検出感度を向上させる目的で、例えば、クックソン（Ｃｏｏｋｓｏｎ）型誘導体化試薬の１つであるＰＴＡＤ（４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）を用いて誘導体化した後に分析することがある（例えば、特許文献１参照。）。ビタミンＤをＰＴＡＤで誘導体化することにより、誘導体化前と比較して感度が向上し、また、高選択的な検出が可能となる。

しかし、例えば、新生児から採取した血液等の微量の試料を測定するためには、更なる感度の向上が望まれる。そこで、発明者らは、新規なクックソン型誘導体化試薬として、
ＤＡＰＴＡＤ（４−（４’−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）を開発した（例えば、非特許文献１参照。）。ＤＡＰＴＡＤにより誘導体化したビタミンＤは、誘導体化前と比較して約１００倍にシグナル強度が増大しているため、微量の試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析するのに好適である。これは、従来から用いられているＰＴＡＤと比較しても、約１０倍のシグナル強度である。さらに、ビタミンＤ代謝物の１つである２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤで誘導体化することにより、不活性妨害代謝物である３−エピ体（３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３）等の構造異性体と区別して定量することも可能となり、従来の方法よりも更に選択性が向上している。

特開２０１５−１６６７４０号公報

Ｓ．Ｏｇａｗａ，ｅｔ ａｌ、Ｒａｐｉｄｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍ，２５，２４５３−２４６０（２０１３）

上記のように、ＤＡＰＴＡＤを用いたビタミンＤの誘導体化は、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる微量で精確な分析が可能となるため、特に、新生児血中ビタミンＤ欠乏症の精密診断に有効であるが、一方で、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる分析では分析スループットの向上が望まれる。

本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様に係る目的は、微量で精確な分析が可能であり、かつ、分析スループットの向上が可能なビタミンＤの定量方法、質量分析装置およびビタミンＤ定量用試薬キットを提供することにある。

本発明に係るビタミンＤの定量方法は、
生体由来試料に含まれるビタミンＤを誘導体化試薬を用いて誘導体化し、質量分析装置を用いて測定する、ビタミンＤの定量方法であって、
ｎ個の試料に対し、ｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログをそれぞれ誘導体化試薬として用いて誘導体化を行う誘導体化工程と、
前記誘導体化工程により得られたｎ種の誘導体化試料を混合する混合工程と、
前記混合工程で得られた混合試料に含まれる、質量の異なるｎ種のビタミンＤ誘導体のそれぞれを、質量分析装置を用いて定量分析する定量分析工程と、
を含む。

このようなビタミンＤの定量方法では、誘導体化試薬として、同位体組成のみ異なる同一分子であるｎ種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを用いることにより、質量分析装置によって分析する際の選択性が向上し、一度の測定でｎ個の試料の同時定量分析が可能となる。このため、ｎ個の試料中に含まれるビタミンＤの微量で精確な分析が可能となり、分析スループットが向上する。

本発明に係る質量分析装置は、
質量の異なるｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログによりそれぞれ誘導体化された、質
量の異なるｎ個の誘導体化試料の混合試料から、ビタミンＤ誘導体を分離する分離部と、
前記分離部で分離されたビタミンＤ誘導体をイオン化するイオン化部と、
前記イオン化部で生成されたイオンを質量に応じて分離して検出する質量分離部と、
前記質量分離部で分離して検出された質量の異なるｎ種のビタミンＤ誘導体について、それぞれ検出されたイオンの量に基づいて、前記混合試料中に含まれる前記ｎ種のビタミンＤ誘導体の量に対して関連付けて定量する計算部と、
を備える。

このような質量分析装置では、誘導体化試薬としてｎ種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを用いることにより、一度の測定でｎ個の試料の同時測定が可能となるため、ｎ個の試料中に含まれるビタミンＤの微量で精確な同時定量分析が可能となり、分析スループットが向上する。

本発明に係るビタミンＤ定量用試薬キットは、
質量の異なるｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログと、
誘導化反応停止剤と、
誘導体分解防止剤と、
を備える。

このようなビタミンＤ定量用試薬キットでは、誘導体化試薬としてｎ種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを含むことにより、一度の測定で高感度かつ精確な同時定量分析が可能であり、さらに、分析スループットの向上が可能なビタミンＤ定量用試薬キットを提供することができる。さらに、誘導化反応停止剤と、誘導体分解防止剤とを備えることにより、得られる誘導体の分解が抑制され、さらに精確な分析が可能となる。

本実施形態に係る質量分析装置の構成を模式的に示す図。 本実施形態に係るビタミンＤの定量方法の一例を示すフローチャート。 ２５（ＯＨ）Ｄ_３のＤＡＰＴＡＤによる誘導体化反応を示す図。 ＤＡＰＴＡＤの合成スキームを示す図。 ３種の試料の同時定量のマスクロマトグラムを示す図。 分析時間の短縮を示す図。 ３種の血漿試料の同時定量のマスクロマトグラムを示す図。 分析時間の短縮を示す図。 新生児血漿中２５（ＯＨ）Ｄ_３及び２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓの同時定量における、２５（ＯＨ）Ｄ_３のマスクロマトグラムを示す図。 新生児血漿中２５（ＯＨ）Ｄ_３及び２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓの同時定量における、^２Ｈ_３−２５（ＯＨ）Ｄ_３のマスクロマトグラムを示す図。 新生児血漿中２５（ＯＨ）Ｄ_３及び２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓの同時定量における、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓのマスクロマトグラムを示す図。 新生児血漿中２５（ＯＨ）Ｄ_３及び２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓの同時定量における^２Ｈ_６−２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓのマスクロマトグラムを示す図。 新生児血漿中２５（ＯＨ）Ｄ_３及び２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓの在胎週数との相関を示す図。 誘導体分解防止剤を添加しなかった場合の２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 誘導体分解防止剤を添加した場合の２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 誘導体分解防止剤を添加しなかった場合の２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 誘導体分解防止剤を添加した場合の２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 誘導体分解防止剤を添加しなかった場合の２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 誘導体分解防止剤を添加した場合の２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 誘導体分解防止剤を添加しなかった場合の２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。 誘導体分解防止剤を添加した場合の２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤのマスクロマトグラムを示す図。

以下に本発明のいくつかの実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の一例を説明するものである。本発明は以下の実施形態になんら限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形形態も含む。なお、以下で説明される構成の全てが本発明の必須の構成であるとは限らない。

以下、本実施の一実施形態について、質量分析装置、ビタミンＤの定量方法の順に、図面を参照しながら説明する。

１． 質量分析装置
まず、本実施形態に係る質量分析装置の構成について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る質量分析装置１００の構成を模式的に示す図である。

図１に示すように、質量分析装置１００は、分離部１０と、イオン化部２０と、質量分離部３０と、処理部４０と、表示部５０と、操作部５２と、記憶部５４と、を含んで構成されている。さらに、質量分離部３０は、第１質量分離部３２と、開裂部３４と、第２質量分離部３６と、を含んで構成されている。

質量分析装置１００は、２つの質量分離部３２，３６の間に開裂部３４を設けたタンデム型（ＭＳ／ＭＳ）質量分析装置である。質量分析装置１００では、第１質量分離部３２で特定の質量数のイオン（プリカーサーイオン）を取り出して開裂部３４に導き、第１質量分離部３２で選択したプリカーサーイオンから生じた２次的なイオン（フラグメントイオン）を第２質量分離部３６で検出する。

質量分析装置１００の分析対象となる試料は、例えば、ビタミンＤおよびビタミンＤ代謝物を含む生体由来試料等の試料を前処理し、その後、後述する質量の異なるｎ種の誘導体化試薬（ＤＡＰＴＡＤアイソトポログ）を用いて誘導体化された、質量の異なるｎ種の誘導体化試料の混合試料である。

分離部１０は、ｎ種の誘導体化試料の混合試料から、ビタミンＤ誘導体を分離する。例えば、分離部１０は高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」とも呼ぶ。）であり、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーは、逆相分配高速液体クロマトグラフィーである。分離部１０が逆相分配高速液体クロマトグラフィーであることにより、ビタミンＤ誘導体の分離において、特に、２５（ＯＨ）Ｄ_３と、不活性妨害代謝物である３−エピ体（３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３）等の構造異性体を分離することが可能となる。

分離部１０は、図示しないが、移動相容器と、ポンプと、インジェクタと、カラムと、を備える。移動相容器は、移動相を貯留する。ポンプは、移動相容器に貯留された移動相
を吸引し、試料を導入するためのインジェクタを通して、一定の流量で移動相をカラムに供給する。インジェクタは、例えばオートサンプラを備え、あらかじめ調製された所定量の試料を移動相中に導入する。インジェクタによって移動相中に試料が導入されると、移動相とともに、試料はカラムに導入される。

質量の異なるｎ種の誘導体化試料の混合試料は、カラムを通過する間に、カラムに充填された固定相及び移動相と試料中の物質との相互作用の差によって物質が分離される。分離された物質は、時間方向にずれてカラムの出口から溶出する。すなわち、分離された物質ごとに保持時間が定まっており、保持時間は、インジェクタによって試料が移動相中に導入されてからカラムから溶出するまでの時間である。溶出液はイオン化部２０に導入される。

イオン化部２０は、分析対象となる、分離部１０で分離されたビタミンＤ誘導体をイオン化する。イオン化部２０で用いるイオン化法は、特に限定されないが、エレクトロスプレーイオン化法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＥＳＩ）が好ましく用いられる。ＥＳＩは、最もフラグメンテーションを起こし難く、適用可能な化合物の範囲が広く、また操作性が高いため好ましい。イオン化部２０で生成されたイオンは、分析対象ＭにＨ^＋が付加した状態で質量分離部３０に導入され、質量に応じて分離して検出される。

第１質量分離部３２は、イオン化部２０で生成されたイオンを質量に応じて分離して検出する。第１質量分離部は、検出結果の情報（マススペクトルデータ）を、処理部４０に出力する。

また、第１質量分離部３２は、特定のイオンを選択して、開裂部３４に送る。第１質量分離部３２で選択されるイオンは、処理部４０のプリカーサーイオン選択部４４で決定される。

第１質量分離部３２としては、例えば、四重極型（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ，Ｑ）、飛行時間型（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ，ＴＯＦ）、イオントラップ型（Ｉｏｎ Ｔｒａｐ，ＩＴ）、磁場偏向型（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｃｔｏｒ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ
Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＦＴ−ＩＣＲ）等の質量分析計を用いることができる。

開裂部３４は、第１質量分離部３２で選択されたプリカーサーイオンを開裂させる。これにより、フラグメントイオンが生成される。すなわち、フラグメントイオンは、プリカーサーイオンを開裂させて得られるイオンである。開裂部３４におけるプリカーサーイオンの開裂方法としては、例えば、ガスとの衝突による衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ＣＩＤ）法、プリカーサーイオンに光を照射して開裂させる光解離などの方法が挙げられる。なお、開裂部３４における開裂方法は特に限定されない。

第２質量分離部３６は、開裂部３４で開裂されたフラグメントイオンを質量に応じて分離して検出する。第２質量分離部３６は、検出結果の情報（マススペクトルデータ）を、処理部４０に出力する。

第２質量分離部３６としては、例えば、四重極型（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ，Ｑ）、飛行時間型（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ，ＴＯＦ）、イオントラップ型（Ｉｏｎ Ｔｒａｐ，ＩＴ）、磁場偏向型（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｃｔｏｒ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（Ｆｏｕｒｉｅｒ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ
Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＦＴ−ＩＣＲ）等の質量分析計を用いることができる。なお、第２質量分離部３６では、第１質量分離部３２と同じ種類の質量分析計を用いてもよいし、第１質量分離部３２とは異なる種類の質量分析計を用いてもよい。ビタミンＤを同定する際の第１質量分離部３２と第２質量分離部３６の組み合わせとしては、例えば、第１質量分離部３２および第２質量分離部３６がともに四重極型質量分析計である場合などが好ましい。

表示部５０は、処理部４０から入力される表示信号に基づいて、処理部４０の処理結果等を文字やグラフその他の情報として表示するものである。表示部５０は、例えば、ビタミンＤの同定結果を表示する。表示部５０は、例えば、ＣＲＴ、ＬＣＤ、タッチパネル型ディスプレイなどである。

操作部５２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、処理部４０に送る処理を行う。操作部５２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイクなどである。

記憶部５４は、処理部４０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部５４は、処理部４０の作業領域として用いられ、操作部５２から入力された操作信号、処理部４０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。

記憶部５４には、ＭＳ／ＭＳ測定を行った結果からビタミンＤを同定するためのビタミンＤのピークリスト（質量電荷比の一覧）が記憶されている。

処理部４０は、記憶部５４に記憶されているプログラムに従って、各種の計算処理を行う。処理部４０の機能は、各種プロセッサ（ＣＰＵ、ＤＳＰ等）等のハードウェアや、プログラムにより実現できる。

本実施形態では、処理部（ＣＰＵ）４０は、記憶部５４に記憶されているプログラムを実行することで、以下に説明する、プリカーサーイオンリスト作成部４２、プリカーサーイオン選択部４４、計算部４６、制御部４８として機能する。ただし、処理部４０の少なくとも一部をハードウェア（専用回路）で実現してもよい。

プリカーサーイオンリスト作成部４２は、第１質量分離部３２の検出結果に基づいて、プリカーサーイオンリストを作成する。ここで、プリカーサーイオンリストとは、ＭＳ／ＭＳ測定を行う候補となるイオン、すなわち、第１質量分離部３２で選択されるイオンのリストである。

具体的には、プリカーサーイオンリスト作成部４２は、第１質量分離部３２におけるＭＳ測定の結果得られたＭＳスペクトルに現れるピークについてそのリスト（ｍ／ｚ値のリスト）をつくり、これをプリカーサーイオンリストとする。ここで、ＭＳ測定とは、試料をイオン化部２０でイオン化して得られたイオンを第１質量分離部３２で測定することをいう。また、ＭＳスペクトルとは、ＭＳ測定により得られたマススペクトル（横軸にｍ／ｚ値、縦軸に検出強度を取ったスペクトル）をいう。

プリカーサーイオン選択部４４は、プリカーサーイオンリスト作成部４２が作成したプリカーサーイオンリストからイオンを選択して、第１質量分離部３２で選択されるイオンを決定する。すなわち、プリカーサーイオン選択部４４がプリカーサーイオンリストから選択したイオンが、第１質量分離部３２で選択されてプリカーサーイオンとなる。プリカーサーイオン選択部４４は、例えば、プリカーサーイオンリストからピーク強度（検出強
度）が大きい順にイオンを選択する。

プリカーサーイオン選択部４４がプリカーサーイオンリストからイオンを選択すると、制御部４８は、プリカーサーイオン選択部４４が選択したイオンについて、ＭＳ／ＭＳ測定が行われるように、質量分析装置１００の各部１０，２０，３０を制御する。このとき、第１質量分離部３２では、プリカーサーイオン選択部４４で選択されたイオンが選択されて開裂部３４に導かれるように制御される。ここで、ＭＳ／ＭＳ測定とは、イオン化部２０で生成されたイオンのなかから特定のイオンを第１質量分離部３２で選択し、そのイオンを開裂部３４で自発的または強制的に開裂させて第２質量分離部３６で質量分析を行うことをいう。

計算部４６は、質量分離部３０で分離して検出された、すなわち、ＭＳ／ＭＳ測定で得られた質量の異なるｎ種のビタミンＤ誘導体について、それぞれ検出されたイオンの量に基づいて、混合試料中に含まれるｎ種のビタミンＤ誘導体の量に対して関連付けて定量する。すなわち、計算部４６は、第２質量分離部３６でフラグメントイオンとして分離された質量の異なるｎ種のビタミンＤ誘導体について、ピークの帰属を行い、ビタミンＤ誘導体として検出された各ピークのイオンの量（イオン強度）に基づいて定量計算を行い、その結果に基づいて、ｎ個の誘導体化試料の混合試料液に含まれるｎ種のビタミンＤ誘導体のそれぞれの量を計算し、ｎ個の試料中に含まれる各ビタミンＤの定量計算を行う。

計算部４６は、例えば、ＭＳ／ＭＳ測定により得られたマススペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）から得られるピークリスト（質量電荷比の一覧）と記憶部５４に記憶されている、誘導体化されたビタミンＤおよびビタミンＤ代謝物のピークリストとを比較する。例えば、計算部４６は、記憶部５４に記憶されているピークリスト内の情報から、ビタミンＤ誘導体のフラグメントイオンを選択し、ＭＳ／ＭＳ測定の結果とピークリストとを照合して、ピークの同定を行うと共に、ピークのイオン強度から、ビタミンＤの定量を行う。

なお、ピークリストは、トランジションを含み、操作部５２の操作によってトランジションを選択することができる。

制御部４８は、分離部１０、イオン化部２０、質量分離部３０を制御する。制御部４８が、これらの各部１０，２０，３０を制御することにより、ＭＳ測定やＭＳ／ＭＳ測定等が行われる。

２． ビタミンＤの定量方法
次に、本実施形態に係るビタミンＤの定量方法について説明する。

本実施形態に係るビタミンＤの定量方法は、生体由来試料に含まれるビタミンＤを誘導体化試薬を用いて誘導体化し、質量分析装置を用いて測定する、ビタミンＤの定量方法であって、ｎ個の試料に対し、ｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログをそれぞれ誘導体化試薬として用いて誘導体化を行う誘導体化工程と、前記誘導体化工程により得られたｎ種の誘導体化試料を混合する混合工程と、前記混合工程で得られた混合試料に含まれる、質量の異なるｎ種のビタミンＤ誘導体のそれぞれを、質量分析装置を用いて定量分析する定量分析工程と、を含むものである。

図２は、本実施形態に係るビタミンＤの定量方法の一例を示すフローチャートである。ここでは、本実施形態に係るビタミンＤの定量方法を、図１に示す質量分析装置１００を用いて行う例について説明する。

なお、本明細書において、「ＤＡＰＴＡＤ誘導体」とは、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物であるビタミンＤのｓ−ｃｉｓ−ジエン部分にクックソン型誘導体化試薬であるＤＡＰＴＡＤが付加することにより形成された化合物を意味する。また、本明細書において、「誘導体化」とは、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物であるビタミンＤに、クックソン型誘導体化試薬であるＤＡＰＴＡＤを付加させて、ＤＡＰＴＡＤ誘導体を形成することを意味する。さらに、本明細書において、「誘導体化反応」とは、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物であるビタミンＤに、クックソン型誘導体化試薬であるＤＡＰＴＡＤを反応させてＤＡＰＴＡＤ誘導体を形成するための反応を意味する。

２．１． 誘導体化工程
まず、ｎ個の試料に対し、ｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログをそれぞれ誘導体化試薬として用いて、生体由来試料に含まれるビタミンＤを誘導体化を行う（ステップＳ１０）。

具体的には、ｎ個の生体由来試料、例えば、血漿又は血清を採取して前処理を行い、得られた試料を、それぞれ異なるＤＡＰＴＡＤアイソトポログを用いて誘導体化する。

２．１．１． ビタミンＤ
本実施形態において誘導体化の対象となる化合物は、ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物であるビタミンＤまたはビタミンＤ代謝物である。ビタミンＤまたはビタミンＤ代謝物は、その構造中にｓ−ｃｉｓ−ジエンを有するため、後述するクックソン型誘導体化試薬の一種であるＤＡＰＴＡＤとディールス・アルダー反応により定量的に反応して誘導体化され、特にＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる分析において、高感度および高選択性な定量分析が可能となる。

ビタミンＤは、広義の分類ではセコステロイドに属し、植物性食品に由来するビタミンＤ_２と動物性食品や皮膚産生に由来するビタミＤ_３の総称である。両者は側鎖構造のみが異なる同族体であり、ヒトの体内では同様に代謝され、同等の生理活性を有すると考えられている。このため、本明細書においては、両者を区別せず、単にビタミンＤと表記する。また、本明細書において、ビタミンＤおよびビタミンＤ代謝物のいずれも単にビタミンＤとも呼ぶが、これらは、天然若しくは合成により得られたビタミンＤ又はビタミンＤ代謝の中間体及び生成物等の、ビタミンＤの変換により生成したビタミンＤに関連するいずれかの分子種を意味する。

そのようなビタミンＤの分子種としては、特に限定されないが、例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（２５（ＯＨ）Ｄ_３）、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２（２５（ＯＨ）Ｄ_２）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（１，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）、２３，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２３，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）、２５，２６−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２５，２６（ＯＨ）_２Ｄ_３）、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）、４β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（４β，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３）等が挙げられる。ビタミンＤの分子種は、前記の分子種の異性体であってもよく、例えば、３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（３−エピ−２５（ＯＨ）Ｄ_３）等が挙げられる。また、これらのビタミンＤの分子種は硫酸塩であってもよく、例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３−３β−硫酸塩（２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ）等が挙げられる。なお、ビタミンＤの定量分析の際には、これらのビタミンＤの分子種が複数種含まれていても構わない。

２．１．２． ＤＡＰＴＡＤ
本実施形態の誘導体化工程において、上記のビタミンＤおよびビタミンＤ代謝物は、ク
ックソン型誘導体化試薬の一種であるＤＡＰＴＡＤによって誘導体化される。クックソン型誘導体化試薬は、化合物のｓ−ｃｉｓ−ジエンと選択的に反応し、ディールス・アルダー反応により定量的に誘導体を形成する試薬である。

図３に示すように、ＤＡＰＴＡＤ、すなわち、４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンは、クックソン型誘導体化試薬の中でも、感度、選択性および安定性の観点から、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いたビタミンＤの定量分析において、好適に用いられる。

また、本実施形態において、ＤＡＰＴＡＤは、ｎ種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログである。アイソトポログは、同位体組成のみ異なる同一分子、すなわち、同一化学組成を有するが、同位体の量が異なることにより分子量の異なる複数の分子種を意味し、各アイソトポログは、特有の正確な質量を有するが、特有の構造を有さない。したがって、誘導体化試薬として同位体を利用し、アイソトポログとして用いることにより、得られる誘導体を質量分析装置によって分析する際の選択性が向上する。特に、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるＳＲＭモードにおいては、ＭＳ／ＭＳスペクトルを比較し、共通のイオン、一定の質量差が生じるイオンを整理することにより、測定の際のトランジションの選択の幅が広がるため、より多くの試料および項目を同時に分析することが可能となる。

なお、アイソトポログとしては、ｎ種の化合物の間で、分子量がそれぞれ異なる関係となるように設計されておればよく、同位体により標識されている化合物のみを複数種含んでいてもよく、ｎ−１種の標識化化合物と１種の標識されていない化合物を含んでいてもよい。また、標識化に用いる同位体としては、^２Ｈ（重水素）、^１３Ｃ（炭素１３）、^１５Ｎ（窒素１５）等の安定同位体を用いることが好ましい。

本実施形態では、ＤＡＰＴＡＤアイソトポログとしては、アイソトポログは、化合物の調製が比較的容易である点により、同位体により標識されていないＤＡＰＴＡＤと、安定同位体である重水素（^２Ｈ）により標識されたＤＡＰＴＡＤであることが好ましい。また、^２Ｈにより標識されたＤＡＰＴＡＤは、天然起源の安定同位体の影響を最小限に抑えるために、互いに質量が少なくとも３Ｄａ異なることが好ましい。本実施形態では、例えば、４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）部のメチル基の一方または両方が重水素（^２Ｈ）により標識された、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤや^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤであることが好ましい。この場合、同位体により標識されていないＤＡＰＴＡＤは、^２Ｈ_０−ＤＡＰＴＡＤと表記され、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤとは３Ｄａ質量が異なり、^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤとは６Ｄａ質量が異なる。

ＤＡＰＴＡＤの合成は、公知の方法、すなわち、上記の非特許文献１に記載の方法により合成することができる。同位体標識されたＤＡＰＴＡＤ、すなわち、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤについても同様である。

２．１．３． ＤＡＰＴＡＤによるビタミンＤの誘導体化
ビタミンＤの誘導体化の前に、まず、ｎ個の生体由来試料、例えば、血漿又は血清を採取して前処理を行う。前処理は、例えば、血漿試料に内標準物質として^２Ｈ_６−２５（ＯＨ）Ｄ_３を含有するアセトニトリルを添加し、ボルテックスミキサーを用いて混合の後、遠心分離し、その上清の溶媒を留去することにより行う。必要に応じて、メタノール等の有機溶媒を用いた除タンパクや固相抽出、液液抽出、Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＳＬＥ）を行うことが好ましい。

上記操作により得られた残渣を、ＤＡＰＴＡＤ、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤまたは^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤのいずれかにより誘導体化する。この誘導体化の工程は、エタノール等のア
ルコールを含む誘導化反応停止剤により誘導体化反応を停止させる反応停止工程を含み、この反応停止工程において、得られる誘導体の分解を防止するための誘導体分解防止剤を添加することが好ましい。誘導体分解防止剤は、反応停止工程において反応液に含まれていれば、得られる誘導体の分解を防止する効果が得られるため、誘導体分解防止剤は反応停止工程の前に反応液に添加されていてもよく、また、反応停止剤溶液中に添加されていてもよい。

誘導体分解防止剤としては、容易に揮発して、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる分析の際に、ＬＣでの分離や、ＥＳＩによるイオン化に影響を与えない化合物であれば、特に限定されず使用可能である。本実施形態で使用可能な誘導体分解防止剤としては、例えば、アンモニアまたはアミンが挙げられる。アミンは、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンのいずれも使用可能である。これらの中でも特に、アンモニア、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアミン、メチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミンを用いることが、得られる誘導体の分解防止の点で好ましい。

このように、反応停止工程において誘導体分解防止剤を添加することにより、クックソン型誘導体化試薬の製造時に使用して残留した酸化剤が分解され、得られる誘導体の分解が防止される。このため、ＤＡＰＴＡＤ誘導体が高収率で得られるだけでなく、残留した酸化剤の影響で生成する分解物等も減少する。このため、得られたＤＡＰＴＡＤ誘導体をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって分析する際に、感度および選択性が高く、正確な定量分析が可能となる。

特に、ビタミンＤ誘導体のうち２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓを誘導体化した２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤは、分解して２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤへと脱硫酸抱合化される場合がある。このため、試料中に２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓと２５（ＯＨ）Ｄ_３の両方が含まれる場合、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤへ分解されると、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓは実際よりも値が低く観測され、反対に、２５（ＯＨ）Ｄ_３は実際よりも値が高く観測される。したがって、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの分解を抑制するために、反応停止工程において誘導体分解防止剤を添加すると、より高感度で精確に定量分析することが可能となる。

なお、上記ビタミンＤの誘導体化においては、質量の異なるｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログと、誘導体化反応停止剤と、誘導体分解防止剤と、を備える、ビタミンＤ定量用試薬キットを用いて行ってもよい。この場合、ビタミンＤの定量において、ビタミンＤの誘導体化が容易となる。また、このようなビタミンＤ定量用試薬キットでは、誘導体化試薬としてｎ種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを含むことにより、一度の測定で微量で精確な同時定量分析が可能であり、かつ、一度の測定で複数の試料（ｎ個）の同時分析が可能なことから、分析スループットも向上したビタミンＤ定量用試薬キットを提供することができる。さらに、誘導化反応停止剤と、誘導体分解防止剤とを備えることにより、得られる誘導体の分解が抑制され、さらに精確な分析が可能となる。

２．２． 混合工程
次に上記誘導体化工程で得られたｎ種（ＤＡＰＴＡＤアイソトポログが、^２Ｈ_０−ＤＡＰＴＡＤ、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤの３種の場合には３種）の試料を混合する（ステップＳ１２）。

２．３． 定量分析工程
上記混合工程で得られた混合試料に含まれる、質量の異なるｎ種のビタミンＤ誘導体のそれぞれを、タンデム型の質量分析装置１００を用いて定量分析する。この定量分析工程
は、より詳細には、誘導体化試料の混合試料を、高速液体クロマトグラフィーで分離する分離工程と、分離された試料をイオン化するイオン化工程と、イオン化工程で生成されたイオンを質量に応じて分離してプリカーサーイオンを選択する第１質量分離工程と、第１質量分離工程で選択されたプリカーサーイオンを開裂させて、１つ以上のフラグメントイオンを生成する開裂工程と、開裂工程で生成された前記１つ以上のフラグメントイオンを、質量に応じて分離する第２質量分離工程と、第２質量分離工程で分離された１つ以上のフラグメントイオンの量を検出して、検出されたイオンの前記量を前記生体由来試料に含まれる前記ビタミンＤの量に対して関連付ける工程とを含む。

分離工程は、まず、上記で得られた混合試料の溶媒を留去し、残渣を移動相に溶解した試料の一部を、分離部１０のＬＣのインジェクタ（図示せず）より、移動相と共に導入する。質量の異なるｎ種の誘導体化試料の混合試料は、カラムを通過する間に分離され、時間方向にずれてカラムの出口から溶出する（ステップＳ１４）。

次に、制御部４８が質量分析装置１００の各部１０，２０，３０を制御して、ＭＳ測定を行う。

まず、イオン化部２０が、分離された試料をイオン化する（ステップＳ１６）。次に、第１質量分離部２０が、イオン化部２０で生成されたイオンを質量分離して検出する。このようにして、ＭＳ測定が行われる。第１質量分離部２０は、検出結果の情報、すなわちＭＳ測定の結果の情報を、処理部４０に出力する。

次に、プリカーサーイオンリスト作成部４２は、ＭＳ測定の結果に基づいて、プリカーサーイオンリストを作成する。

具体的には、プリカーサーイオンリスト作成部４２は、ＭＳ測定の結果からＭＳスペクトルの情報を取得する。そして、プリカーサーイオンリスト作成部４２は、ＭＳスペクトルに現れるピークを検出し、そのピークのｍ／ｚ値およびそのピーク強度（イオン強度）のリストを作成する。これが、プリカーサーイオンリストとなる。

次に、プリカーサーイオン選択部４４は、プリカーサーイオンリストからイオンを選択する（ステップＳ１８）。例えば、ビタミンＤとして２５（ＯＨ）Ｄ_３を選択し、試薬としてＤＡＰＴＡＤを用いた２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤを選択する場合、プリカーサーイオン選択部４４は、プリカーサーイオンリストから、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのプリカーサーイオンとして、質量／電荷比６１９．５のイオンを選択する。また、ビタミンＤとして２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓを選択し、試薬としてＤＡＰＴＡＤを用いた２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤを選択する場合、プリカーサーイオン選択部４４は、プリカーサーイオンリストから、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤのプリカーサーイオンとして、質量／電荷比６９９．６のイオンを選択する。誘導体試薬として^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤまたは^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤを用いた場合には、質量／電荷比は、それぞれ前記と３Ｄａ異なる値となる。

次に、制御部４８が質量分析装置１００の各部１０，２０，３０，４０を制御して、ＭＳ／ＭＳ測定を行う（ステップＳ１６）。ここで、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いた定量分析では、フラグメントイオンの量の検出は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を用いた検出であることが好ましく、特にＳＲＭを用いることが好ましい。この場合、適宜トランジションを選択することにより、誘導体化したビタミンＤの分析を行う。その際に用いるＬＣ用のカラムや移動相等の測定条件は、分析対象および使用する装置に応じて適宜選択する。

具体的には、イオン化部２０で生成されたイオンの中から分析対象となるイオンを第１質量分離部２０で選択し、選択されたイオンを開裂部３４で開裂させ（ステップＳ２０）、生成されたフラグメントイオンを第２質量分離部３６で質量に応じて分離し、質量分析する（ステップＳ２２）。このようにして、ＭＳ／ＭＳ測定が行われる。例えば、プリカーサーイオンとして、質量／電荷比６１９．５のイオンを選択した場合、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのフラグメントイオンは、質量／電荷比３４１．３となる。同様に、プリカーサーイオンとして、質量／電荷比６９９．６のイオンを選択した場合、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤのフラグメントイオンは、質量／電荷比３４１．３となる。誘導体試薬として^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤまたは^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤを用いた場合には、質量／電荷比は、それぞれ前記と３Ｄａ異なる値となる。

第２質量分離部３６は、開裂により生成した１つ以上のフラグメントイオンを、質量に応じて分離して検出する。そして、検出結果の情報、すなわちＭＳ／ＭＳ測定の結果の情報を、処理部４０に出力する。処理部４０の計算部４６は、ＭＳ／ＭＳ測定の結果に基づいて、ビタミンＤの同定および定量を行う（ステップＳ２４）。

具体的には、計算部４６は、選択したイオンについてのＭＳ／ＭＳ測定の結果（ＭＳ／ＭＳスペクトル）取得したマススペクトルデータからピークを検出してピークリストを作成する。そして、取得したピークリスト各ピーク（イオン）の帰属を行い、その質量／電荷比からビタミンＤの同定を行う。さらに、イオン（ピーク）の強度、すなわち、イオンの量から、ビタミンＤの定量を行う。

以上のように、本実施形態によれば、誘導体化試薬として、同位体組成のみ異なる同一分子であるｎ種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを用いることにより、質量分析装置によって分析する際の選択性が向上し、一度の測定でｎ個の試料の同時定量分析が可能となる。このため、ｎ個の試料中に含まれるビタミンＤの微量で精確な分析が可能となり、分析スループットが向上する。

なお、本実施形態に係る定量方法は、ビタミンＤ以外のｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物にも適用可能である。そのような化合物としては、例えば、７−デヒドロコレステロール、エルゴステロール、共役リノール酸、ビタミンＡ等が挙げられる。

また、ＤＡＰＴＡＤ以外のクックソン型誘導体化試薬のアイソトポログを用いた誘導体の定量方法にも適用可能である。そのようなクックソン型誘導体化試薬としては、例えば、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）、４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）等が挙げられる。

さらに、本実施形態では、質量分析装置１００の質量分離部３０として、２つの質量分離部３２，３６を有するタンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いた例を示したが、誘導体化した試料のピークを明りょうに識別できる高い質量分解能を有する装置であれば、質量分離部は１つであっても分析可能である。

３．実施例
以下、本発明を実験例および比較例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例等の記載において、特に言及しない限り「％」は「質量％」の意味で用いる。

３．１． ビタミンＤとして使用した２５（ＯＨ）Ｄ_３
市販の２５（ＯＨ）Ｄ_３（和光純薬工業株式会社製）を用いて、１００μｇ／ｍＬの濃度の２５（ＯＨ）Ｄ_３保存液を調整した。２５（ＯＨ）Ｄ_３保存液の濃度は、２６５ｎｍにおけるモル吸光係数（ε）１８２００を用いて、ＵＶ分光法により確認した。その後の希釈は、エタノールを用いて行い、０．５０，１．０，２．５，５．０，１０および２５ｎｇ／ｍＬの溶液を調製した。内標準物質（ＩＳ）として、市販の［２６，２６，２６，２７，２７，２７−^２Ｈ_６］−２５（ＯＨ）Ｄ_３（アイソサイエンス社、アメリカ合衆国）を用い、そのエタノール溶液（５０ｎｇ／ｍＬ）を調整した。

３．２． ＤＡＰＴＡＤアイソトポログの合成
同位体標識していないＤＡＰＴＡＤは、公知の方法、すなわち、上記の非特許文献１に記載の方法により合成した。同位体標識されたＤＡＰＴＡＤ、すなわち、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤについては、図４に記載のスキームに基づき合成した。なお、使用した全ての溶媒は、市販特級品以上のグレードの溶媒である。

まず、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤの合成のために、中間体［^２Ｈ_３−および^２Ｈ_６−４−（ジメチルアミノ）安息香酸（スキーム中のＩＶａおよびＩＶｂ］を合成した。

４−メチルアミノ安息香酸（Ｉ；シグマアルドリッチジャパン合同会社）と４−アミノ安息香酸塩エチル（ＩＩｂ；東京化成工業株式会社）を購入し、ｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ製、粒子径６０−２００μｍ)シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ；１５０×１２ｍｍｉ．ｄ．）に付した。

４−メチルアミノ安息香酸（Ｉ、５００ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸（５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍＬ中で混合し、室温にて一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチル５０ｍＬで溶解し、飽和食塩水５０ｍＬを用いて３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、その後溶媒を減圧留去した。残渣を上記と同様のシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した。ヘキサン−酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去し、４−メチルアミノ安息香酸メチルを無色粉末として得た（ＩＩａ、１７２ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）

４−メチルアミノ安息香酸メチル（ＩＩａ、１７２ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、^２Ｈ_３−ヨードメタン（４００μＬ、５．７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）をメタノール２ｍＬ中で混合し、６５℃にて一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、飽和食塩水５０ｍＬを用いて３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、その後溶媒を減圧留去した。残渣を、上記と同様のシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した。ヘキサン−酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去し、^２Ｈ_３−４−ジメチルアミノ安息香酸メチルを無色粉末として得た（ＩＩＩａ、１０８ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）。

^２Ｈ_３−４−ジメチルアミノ安息香酸メチル（ＩＩＩａ、１０８ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）、水酸化カリウム（１００ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）をメタノール水溶液（１：１、ｖ／ｖ、２０ｍＬ）中で混合し、９０℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣を水２ｍＬで溶解し、酢酸を用いて酸性化した。混合液を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、飽和食塩水５０ｍＬを用いて３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、その後溶媒を減圧留去し、^２Ｈ_３−４−ジメチルアミノ安息香(ＩＶａ、８５ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を無色粉末として得た。ＩＶａは精製することなく次の反応に用いた。

４−アミノ安息香酸エチル（ＩＩｂ、４００ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）、^２Ｈ_３−ヨードメタン（９００μＬ、１４．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４００ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）をエタノール２ｍＬ中で混合し、６５℃にて一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、飽和食塩水５０ｍＬを用いて３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、その後溶媒を減圧留去した。残渣を、上記と同様のシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した。ヘキサン−酢酸エチル（７：３、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去し、^２Ｈ_６−４−ジメチルアミノ安息香酸エチルを無色粉末として得た（ＩＩＩｂ、２２５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）。

^２Ｈ_６−４−ジメチルアミノ安息香酸エチル（ＩＩＩｂ、２２５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、水酸化カリウム（１００ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）をメタノール水溶液（１：１、ｖ／ｖ、２０ｍＬ）中で混合し、９０℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣を水２ｍＬで溶解し、酢酸を用いて酸性化した。混合液を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、飽和食塩水５０ｍＬを用いて３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、その後溶媒を減圧留去した。^２Ｈ_６−４−ジメチルアミノ安息香酸（ＩＶｂ、１６０ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を無色粉末として得た。ＩＶｂは精製することなく次の反応に用いた。

カルボン酸（ＩＶａ、ＩＶｂ）の^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤへの変換は、既知の方法（上記の非特許文献１に記載の方法）にて行った。つまり、カルボニルアジド体（Ｖａ、Ｖｂ）を生成するために、カルボン酸（ＩＶａ、ＩＶｂ）をジフェニルリン酸アジドで処理し、クルチウス転位によりイソシアネート（ＶＩａ、ＶＩｂ）に変換した。イソシアネート体（ＶＩａ、ＶＩｂ）は、カルバジン酸エチルにより処理し、セミカルバジド体（ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ）を生成した。セミカルバジド体（ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ）をアルカリ処理により環化し、ウラゾール体を生成した。その後、得られたウラゾール体（ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ）を酢酸エチル中でヨードベンゼンジアセテートを用いて酸化し、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤを赤色の酢酸エチル溶液として得た。

３．３． ＤＡＰＴＡＤを用いたビタミンＤの誘導体化
後述のように調整した試料を乾燥し、^２Ｈ_０−ＤＡＰＴＡＤ、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤまたは^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤのいずれか（１０μｇ）の酢酸エチル溶液（５０μＬ）を加え、その混合物を室温で１時間放置した後、エタノール（２０μＬ）を添加して反応を停止させた。

３．４． ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの条件
・使用した装置
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、日本ウォーターズ株式会社製、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標） Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ 三連四重極質量分析装置に、日本ウォーターズ株式会社製、ＬＣ−ｅ２６９５カラムクロマトグラフィーを接続して使用し、イオン化法にはＥＳＩを用い、下記分析条件で分析した。

・分析条件
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８ ＲＳ（株式会社ワイエムシィ製、粒子径３μｍ、カラムサイズ１５０×２．０ｍｍｉ．ｄ．）
カラム温度：４０℃
移動相：０．０５％ギ酸含有メタノール−１０ｍＭギ酸アンモニウム（４：１、ｖ／ｖ）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化モード：ＥＳＩ（＋）
キャピラリー電圧：３．３ｋＶ
コーン電圧：４０Ｖ[２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ]、３５Ｖ[２５（ＯＨＤ）_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤ]または３０Ｖ[２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ]
ＣＥ（コリジョンエナジー）：２５ｅＶ
ソース温度：１２０℃
脱溶媒温度：４００℃
脱溶媒ガス（Ｎ_２）流量：８００Ｌ／ｈ
コーンガス（Ｎ_２）流量：５０Ｌ／ｈ
コリジョンガス（Ａｒ）流量：０．１９ｍＬ／ｍｉｎ

ＳＲＭで使用したトランジションは表１に記載の通りである。

なお、データの解析には、日本ウォーターズ株式会社製、質量分析用ソフトウェア「Ｗａｔｅｒｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ（登録商標）ソフトウェア」 ヴァージョン４．１内の自動処理システムであるＱｕａｎＬｙｎｘを用いた。

３．５． 血漿試料
本発明の方法の開発と評価は、日本赤十字社から入手した新鮮凍結血漿−ＬＲ「日赤」（ＦＦＰ−ＬＲ「日赤」）を用いて行った。日本人の新生児からの血漿試料も使用した。血液は、静岡済生会総合病院で出生後６０日以内の新生児の手の甲の静脈から採取した。なお、書面によるインフォームド・コンセントを新生児の親から得た。また、実験手順は、東京理科大学の倫理委員会によって承認された。

３．６． 前処理
血漿（５．０μＬ）を、内標準物質（５０ｐｇ）を含有するアセトニトリル（１００μＬ）に添加し、ボルテックスミキサーを用いて３０秒間混合し、その後、１０００ｇで１０分間遠心分離した。その上清を別の試験管に移し、Ｎ_２気流下で溶媒を留去した。残渣を、ＤＡＰＴＡＤ、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤまたは^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤのいずれかにより誘導体化し、得られた３種の試料を混合して溶媒を留去した。残渣を移動相（６０μＬ）に溶解し、その一部（１５μＬ）をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに付した。

３．７． サロゲートマトリックスの準備（２５（ＯＨ）Ｄ_３を含まない血漿抽出液）
血漿（１．０μＬ）をアセトニトリル（９．０μＬ）に添加し、ボルテックスミキサーを用いて３０秒間攪拌し、その後、１０００ｇで１０分間遠心分離した。その上清を別の試験管に移し、活性炭（１．０ｇ、Ｎｏｒｉｔ（登録商標）、ナカライテスク株式会社製）を用いて１５時間攪拌した。２０００ｇで１０分間遠心分離して活性炭を除去し、その上清をメスフラスコ中で１０ｍＬとなるようにアセトニトリルで希釈し、サロゲートマトリックス（２５（ＯＨ）Ｄ_３を含まない血漿抽出液）として使用した。５０μＬのサロゲートマトリックスは、５μＬのプラズマ由来の成分が含まれている。

３．８． 検量線の作成
内標準物質（５０ｐｇ）と段階的な濃度に調整した２５（ＯＨ）Ｄ_３（５．０，１０，２５，５０，１００および２５０ｐｇ；１．０，２．０，５．０，１０，２０および５０ｎｇ／ｍＬに相当）を、サロゲートマトリックス（５０μＬ；５μＬの血漿に相当。）に
添加した。溶媒を留去した後、残渣を上記の通りに誘導体化した。３種のＤＡＰＴＡＤにより誘導体化され、同量の２５（ＯＨ）Ｄ_３を含有する３種の試料を混合し、溶媒を留去した。残渣を移動相に溶解し、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに付した。誘導体化した２５（ＯＨ）Ｄ_３と内標準物質のピーク面積比（ｙ軸）を２５（ＯＨ）Ｄ_３の濃度（ｎｇ／ｍＬ
血漿、ｘ軸）に対してプロットし、得られた回帰直線を検量線として使用した。

３．９． ２５（ＯＨ）Ｄ_３の定量におけるＤＡＰＴＡＤ同位体の平等
血漿を三分割し（それぞれ５．０μＬ）、それぞれ内標準物質（５０ｐｇ）を含有するアセトニトリル（１００μＬ）に添加して前処理し、異なるＤＡＰＴＡＤにより誘導体化した。得られた３種の試料を混合し、溶媒を留去した。残渣を移動相に溶解し、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに付した。測定により得られたＤＡＰＴＡＤ、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤまたは^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤにより誘導体化した２５（ＯＨ）Ｄ_３濃度を比較した。この試験は、１０種の異なる血漿試料（成人５、新生児５）に対して行われた。

３．１０． 分析精度と正確度
分析精度について、３種の異なる血漿試料；バッチＡ（血漿Ａ−１，Ａ−２およびＡ−３）およびバッチＢ（血漿Ｂ−１，Ｂ−２およびＢ−３）からなる２種のバッチを用いて試験した。血漿Ａ−１およびＢ−１には^２Ｈ_０−ＤＡＰＴＡＤ、血漿Ａ−２およびＢ−２には^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ、血漿Ａ−３およびＢ−３には^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤをそれぞれ使用した。日内変動係数（ｎ＝５）、日間変動係数（ｎ＝５）は、それぞれ、１日および５日間にわたって試料の反復測定により評価した。精度を相対標準偏差（ＲＳＤ、％）として決定した。

分析の正確度は、バッチＡとＢを用いて評価した。血漿試料（５．０μＬ）を、内標準物質（５０ｐｇ）とスパイク試料としての２５（ＯＨ）Ｄ_３（１２．５，２５，５０，および１００ｐｇ；１．０，２．５，５．０，１０，および２０ｎｇ／ｍＬに相当）を含有するアセトニトリル（１００μＬ）に添加し、前処理し、異なるＤＡＰＴＡＤにより誘導体化した。得られた３種の試料を混合し、溶媒を留去した。分析の正確度（回収率）はＦ／（Ｆ_０＋Ｘ）ｘ１００（％）で定義され、ここで、Ｆはスパイク試料中の２５（ＯＨ）Ｄ_３の濃度を、Ｆ_０は日間変動係数により決定された２５（ＯＨ）Ｄ_３濃度を、Ｘはスパイクされた濃度を表す。

３．１１． マトリックス効果
マトリックス効果について、post-extraction addition experimentにより調べた。ＤＡＰＴＡＤ誘導体化２５（ＯＨ）Ｄ_３の標準試料（５０ｐｇ／６０μＬ、ｎ＝５）とマトリックス試料を分析した。この試料は、標準ＤＡＰＴＡＤ誘導体化２５（ＯＨ）Ｄ_３（５０ｐｇ／６０μＬ、ｎ＝５）に血漿試料１５μＬの抽出物を添加することにより調製した。

３．１２． 血漿２５（ＯＨ）Ｄ_３の決定のための標準方法
血漿（５．０μＬ）を、上記と同様に前処理し、ＤＡＰＴＡＤにより誘導体化し、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに付した。このように、標準方法では、１つの試料は、１回のＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの走査で分析した。標準方法ではまた、３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３による２５（ＯＨ）Ｄ_３濃度の偽高値を避けるために、ＤＡＰＴＡＤにより誘導体化して行った。

３．１３． 分析結果
３種の異なる試料の同時定量における、天然起源の安定同位体の影響を最小限に抑えるために、互いに質量が少なくとも３Ｄａ異なるＤＡＰＴＡＤアイソトポログを設計した。ＤＡＰＴＡＤは上記のように調整し、ＤＡＰＴＡＤアイソトポログ溶液は酢酸エチル中で
それぞれウラゾール体の酸化によって調製され、誘導体化のために使用した。ＤＡＰＴＡＤアイソトポログ溶液は、−１８℃で保存した場合、２ヵ月は安定であり、２ヶ月以内であるならば誘導体化に使用することができる。^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤの同位体純度は、２５（ＯＨ）Ｄ_３と反応させた後に、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ（選択イオン検出；ＳＩＭ）により決定した。ＤＡＰＴＡＤアイソトポログの２５（ＯＨ）Ｄ_３との反応は、室温で１時間行われた。

^２Ｈ_３−、^２Ｈ_２−、^２Ｈ_１−および^２Ｈ_０−型のプロトン化分子[Ｍ＋Ｈ]^＋（ｍ／ｚ
６２２．５、６２１．５、６２０．５および６１９．５）をモニターすることにより、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤの同位体純度は９９．０％より高かった（^２Ｈ_２−型の含有量は０．９８％であり、^２Ｈ_１−および^２Ｈ_０−型は全く検出されなかった。）。^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤ（選択イオン ｍ／ｚ ６２５．５）の同位体純度は約９８．５％だった（^２Ｈ_５−型の含有量は１．５０％であり、^２Ｈ_４−、^２Ｈ_３−、^２Ｈ_３−、^２Ｈ_２−、^２Ｈ_１−および^２Ｈ_０−型は全く検出されなかった。）。このように、使用されたＤＡＰＴＡＤアイソトポログは、十分な同位体純度を有していた。

図５に示すように、ＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにおける、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ、２５（ＯＨ）Ｄ_３−^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび２５（ＯＨ）Ｄ_３−^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤの挙動は同様であり、誘導体のプロトン化分子[Ｍ＋Ｈ]^＋は、それぞれｍ／ｚ ６１９．５，６２２．５，および６２５．５であり、[Ｍ＋Ｈ]^＋の衝突誘起解離により、ｍ／ｚ ３４１．３，３４４．３および３４７．３において特徴的なＡ環のフラグメントイオンを与え、これらは、ビタミンＤ骨格のＣ６−７結合の開裂に由来する。誘導体化されたＩＳ、^２Ｈ_６−２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ、^２Ｈ_６−２５（ＯＨ）Ｄ_３−^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ、^２Ｈ_６−２５（ＯＨ）Ｄ_３−^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤは、同様のフラグメンテーション・パターンを示す（それぞれ、ｍ／ｚ ６２５．５→３４１．３、６２８．５→３４４．３、６３１．５→３４７．３）。このように、フラグメンテーション・パターンは互いに重ならないため、誘導体の間では干渉は起こらない。表１に記載のＳＲＭで使用したトランジションを、血漿中の２５（ＯＨ）Ｄ_３の定量のために使用した。表１において、検出限界は、全ての誘導体において０．２５ｆｍｏｌだった（Ｓ／Ｎ比５）。

上記したように、天然起源の安定同位体の影響を最小限に抑えるために、ＤＡＰＴＡＤアイソトポログは、互いに質量が少なくとも３Ｄａ異なるように設計した。この点を確認するために、ＤＡＰＴＡＤ誘導体および^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳに付し、ｍ／ｚ ３４４．３と３７４．３（それぞれ、[Ｍ＋Ｈ]^＋のアイソトピック質量＋３Ｄａに対応する。）のアイソトピックピークをモニターした。結果として、それらの強度は無視できる程度低く、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体または^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤ誘導体の[Ｍ＋Ｈ]^＋のモノアイソトピック質量の強度は０．５％未満であった。これらの結果より、天然起源の安定同位体であるＤＡＰＴＡＤ誘導体および^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体のアイソトピックピークは、それぞれ、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体または^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤ誘導体の定量に対する影響は無視できる程度であることがわかった。

図５に示すように、ＬＣの溶出において、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体は、ＤＡＰＴＡＤ誘導体よりも約０．１分早く溶出する。^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤ誘導体は、^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体よりも約０．１分早く溶出する。したがって、^２Ｈ−コードされたアイソトポログは、一般に、それらのＨ−コードされた化合物よりも逆相ＬＣの固定相とより弱い疎水性相互作用を有するため、僅かながら同位体効果が観察された。しかし、同位体効果は、血漿中の２５（ＯＨ）Ｄ_３の定量分析にはほとんど影響しなかった。２５（ＯＨ）Ｄ_３のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを用いた誘導体は、図３に示したように、６Ｒ体およ
び６Ｓ体の２種類の異性体が存在する。ここでは、血漿中の２５（ＯＨ）Ｄ_３の定量のために、６Ｓ体を用いた。

３．１４． 検量線
検量線は、実際の分析がなされる生体試料と同一のマトリックスを用いてされるべきである。しかし、２５（ＯＨ）Ｄ_３は内因性化合物であり、Ｄ結合タンパク質やアルブミンと強く結合しているため、血漿をそのまま活性炭処理に付しても２５（ＯＨ）Ｄ_３を完全に含まない血漿は作成できなかった。本実施例において、血漿から調製したサロゲートマトリックスを、検量線の作成のために使用した。図６および表２に示すように、０．９９８より大きな係数（γ^２）を有する十分な直線性が、いずれのＤＡＰＴＡＤアイソトポログについても得られた。５種の異なるサロゲートマトリックスを用いて作成された５つの曲線の傾きのＲＳＤは非常に小さかった（０．７５−１．１２％）ことが示されているように、再現可能な検量線が得られた。いずれのアイソトポログを用いても、各検量線の傾きには有意な差はなかった。

３．１５． ２５（ＯＨ）Ｄ_３の定量におけるＤＡＰＴＡＤアイソトポログの等価
同じ血漿の３つのアリコートを同時に、異なるＤＡＰＴＡＤアイソトポログで誘導体化した後に分析し、測定値（２５（ＯＨ）Ｄ_３濃度）を比較した。表３から明らかなように、使用したいずれのＤＡＰＴＡＤアイソトポログにおいても、血漿の上清からは類似の値が得られた。測定値のＲＳＤは、４．２％以下であった。このように、ＤＡＰＴＡＤアイソトポログは、血漿中の２５（ＯＨ）Ｄ_３の定量において、同様に作用することがわかった。

３．１６． 分析精度と正確度
３種の異なる血漿試料の、３種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを用いた同時測定において、表４に示すように、日内変動係数（ｎ＝５）は５．９％以下であり、日間変動係数（ｎ＝５）も５．５％以下であった。回収率（正確度）は９８．７−１０２．２％であり、本発明による方法は正確であることを示している。

３．１７． マトリックス効果
３種の血漿試料は同時測定のために混合されているため、多重マトリックス効果（イオン抑制）が懸念された。しかし、post-extraction addition experimentの結果が示すように、マトリックス効果はそれほど重要ではない。マトリックス試料の応答は、標準試料のものの８９．７±５．９％（平均±ＳＤ、ｎ＝５）だった。

３．１８． 新たに開発された方法の適用性
新たに開発された方法の適用性を実証するために、１８バッチ（全部で４８血漿試料）を３種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを用いた本方法に基づいて分析した。バッチは、３
種の異なる血漿試料からなり、それは、成人２３、乳児２５から集められた。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにおいてＤＡＰＴＡＤ誘導体は高感度であるため、２５（ＯＨ）Ｄ_３の測定のために、５．０μＬだけ血漿が使われた。誘導体化前の前処理は除タンパクのみを行った。

各バッチから得られたクロマトグラムを図７に示す。それは、成人１と乳児２の試料からなり、誘導体化２５（ＯＨ）Ｄ_３（保持時間８．３分：ＤＡＰＴＡＤ誘導体、保持時間８．２分：^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体、保持時間８．１分：^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤ誘導体）およびＩＳ（保持時間８．２分：ＤＡＰＴＡＤ誘導体、保持時間８．１分：^２Ｈ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体、保持時間８．０分：^２Ｈ_６−ＤＡＰＴＡＤ誘導体、）は、不活性代謝物である３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３と干渉せずに明確に観察された。

３種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログ［１０．４±４．８ｎｇ／ｍＬ（平均±ＳＤ）、２．４−２１．１ｎｇ／ｍＬ（範囲）］を用いたバッチ測定における濃度は、上述の標準方法に一致し、１つの試料は、1度のＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの走査で分析できた［図８、１０．６±４．９ｎｇ／ｍＬ（平均±ＳＤ）、２．６−２２．７ｎｇ／ｍＬ（測定範囲）］。２つの方法で測定された値には、良好な相関関係がみられた（ｙ＝０．９５５ｘ＋０．２４４２、γ^２＝０．９６８）。○で示す乳児の血漿中の２５（ＯＨ）Ｄ_３濃度は、２．４−１３．９ｎｇ／ｍＬであり、●で示す成人のものより（５．８−２１．１ｎｇ／ｍＬ）優位に低かった。誘導体化により分析感度は約３０倍向上し、５．０μＬの血漿を使用した場合における定量の限界は１．０ｎｇ／ｍＬだった。したがって、新たに開発した本方法は、乳児の血漿のように２５（ＯＨ）Ｄ_３濃度が低い試料の分析に有効であった。そして、３種のＤＡＰＴＡＤアイソトポログを用い、１度の測定で３種の異なる試料中の２５（ＯＨ）Ｄ_３濃度を分析可能である方法は、従来と比べて測定時間が１／３となった（４８試料について、５４０分→１７０分）。

３．１９． 血漿中２５（ＯＨ）Ｄ_３と２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓの同時定量法
次に、血漿中２５（ＯＨ）Ｄ_３と２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓの同時定量を行った。この例では、試料として血漿試料２０μＬが使われた。前処理として、誘導体化の前に、除タンパクと、Ｏａｓｉｓ（登録商標） ＨＬＢ（製品名、日本ウォーターズ株式会社製）による固相抽出を行った。内標準物質として、^２Ｈ_３−２５（ＯＨ）Ｄ_３と^２Ｈ_６−２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓを用いた。

得られた結果を図９−１２に示す。図９、１０に示すように、誘導体化２５（ＯＨ）Ｄ_３およびＩＳは、３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ_３と干渉せずに明確に観察された。同様に、図１１、１２に示すように、誘導体化２５（ＯＨ）Ｄ_３ＳおよびＩＳは、２５（ＯＨ）Ｄ_３およびＩＳと異なる保持時間において、互いに干渉せずに明確に観察された。また、図１３に示すように、新生児血漿中の２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓの濃度は、在胎週数と相関する傾向にあり、早産児において低い傾向が見られた。

３．２０． 誘導体分解防止剤の使用による効果
次に、図１４−１７により、２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤを用いて誘導体化する際に、反応停止工程において、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加したことによる効果を説明する。

図１４および１６は、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加しなかった例のマスクロマトグラムであり、図１５および１７は、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加した例のマスクロマトグラムである。なお、全ての例において、誘導体化する試料の中に２５（ＯＨ）Ｄ_３以外の化合物は加えておらず、分析条件は上記と同様であり、観測したトランジションは２５（ＯＨ）Ｄ
_３−ＤＡＰＴＡＤである。また、図１４および１５では、使用した試料の量は２．５ｐｇ相当量、図１６および１７では、使用した試料の量は１００ｐｇ相当量をインジェクションした。

まず、２．５ｐｇ相当量をインジェクションした図１４および１５を比較してみると、図１４と比べて、図１５ではＳＲＭ測定における２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのトランジションでのノイズが低減し、シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が大きくなっていた。これにより、２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤで誘導体化する際に、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加すると、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤ誘導体の分解が抑えられ、ノイズも低減されたものと考えられる。

また、１００ｐｇ相当量をインジェクションした図１６および１７を比較してみると、図１６では、ノイズよりも誘導体のイオン強度が有意に減少していたが、図１６と比べて、図１７ではＳＲＭ測定における２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤのトランジションでのイオン強度が大きくなっていた。

このように、２５（ＯＨ）Ｄ_３をＤＡＰＴＡＤで誘導体化の反応停止工程において、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加することにより、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤの分解防止効果が得られることが分かった。

次に、図１８−２１により、２５（ＯＨ）Ｄ_３ＳをＤＡＰＴＡＤを用いて誘導体化する際に、反応停止工程において、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加したことによる効果を説明する。

図１８および２０は、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加しなかった例のマスクロマトグラムであり、図１９および２１は、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加した例のマスクロマトグラムである。図１８および１９では、観測したトランジションは２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤであり、図２０および２１では、観測したトランジションは２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤである。なお、全ての例では、誘導体化する試料の中に２５（ＯＨ）Ｄ_３等の２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ以外の化合物は加えておらず、分析条件は上記と同様である。

図１８と１９を比較してみると、保持時間８．０−９．０分にかけて観測される２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤピークは、図１８の方がイオン強度が高い結果となった。これに対し、図２０と２１を比較してみると、保持時間５．０分前後に観測される２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤピークは、図２１の方がイオン強度が高い結果となった。これらの結果により、２５（ＯＨ）Ｄ_３ＳをＤＡＰＴＡＤを用いて誘導体化する際に、トリエチルアミンを添加しない場合には、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤが分解して２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤへと脱硫酸抱合化される場合があるが、トリエチルアミンを添加すると、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤへの分解が抑制されることが示された。

ここで、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓおよび２５（ＯＨ）Ｄ_３は、いずれも内因性のビタミンＤ代謝物であり、いずれも測定対象となるが、図１８および２０に示されたように、誘導体化した２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの一部が分解して２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤとなると、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの正確な定量も難しくなる。これに対し、図２０および２１に示したように、反応停止工程の際に誘導体分解防止剤を添加すると、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの分解が抑制されるため、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤの精度の良い定量が可能となる。

さらに、図１４−１７の結果により、２５（ＯＨ）Ｄ_３も、ＤＡＰＴＡＤによる誘導体化の際に、反応停止工程の際に誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加すれば誘導体の分解防止効果が得られるため、イオン強度も減少しない。このため、２５（ＯＨ）Ｄ_３と２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓとが混在する試料の場合であっても、ＤＡＰＴＡＤによる誘導体化の反応停止工程の際に誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加することにより、どちらか一方だけ測定したい場合であっても、また、同時に両方を測定したい場合にも、それぞれを精度良く定量することが可能となり、トリエチルアミンの添加により測定値の信頼性を向上させることが可能となることが示された。

以上により、２５（ＯＨ）Ｄ_３−ＤＡＰＴＡＤおよび２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓ−ＤＡＰＴＡＤは、ＤＡＰＴＡＤ調製時に残ってしまった酸化剤（ヨードベンゼンジアセテート）により分解される場合もあるが、ＤＡＰＴＡＤ誘導体化の反応停止工程の際に、誘導体分解防止剤としてトリエチルアミンを添加することで、誘導体の分解が抑えられ、従来よりも高感度で精確に定量分析することが可能となることがわかった。

本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

１０…分離部、２０…イオン化部、３０…質量分離部、３２…第１質量分離部、３４…開裂部、３６…第２質量分離部、４０…処理部、４２…プリカーサーイオンリスト作成部、４４…プリカーサーイオン選択部、４６…計算部、４８…制御部、５０…表示部、５２…操作部、５４…記憶部、１００…質量分析装置

Claims (13)

1. 生体由来試料に含まれるビタミンＤを誘導体化試薬を用いて誘導体化し、質量分析装置を用いて測定する、ビタミンＤの定量方法であって、
   ｎ個の試料に対し、ｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログをそれぞれ誘導体化試薬として用いて誘導体化を行う誘導体化工程と、
   前記誘導体化工程により得られたｎ種の誘導体化試料を混合する混合工程と、
   前記混合工程で得られた混合試料に含まれる、質量の異なるｎ種のビタミンＤ誘導体のそれぞれを、質量分析装置を用いて定量分析する定量分析工程と、
   を含む、ビタミンＤの定量方法。
2. 前記ビタミンＤは、ビタミンＤ代謝物を含む、請求項１に記載のビタミンＤの定量方法。
3. 前記質量分析装置としてタンデム型質量分析装置を用いると共に、
   前記定量分析工程は、
   前記誘導体化試料を、高速液体クロマトグラフィーで分離する分離工程と、
   分離された試料をイオン化するイオン化工程と、
   前記イオン化工程で生成されたイオンを質量に応じて分離してプリカーサーイオンを選択する第１質量分離工程と、
   前記第１質量分離工程で選択されたプリカーサーイオンを開裂させて、１つ以上のフラグメントイオンを生成する開裂工程と、
   前記開裂工程で生成された前記１つ以上のフラグメントイオンを、質量に応じて分離する第２質量分離工程と、
   前記第２質量分離工程で分離された１つ以上のフラグメントイオンの量を検出して、検出されたイオンの前記量を前記生体由来試料に含まれる前記ビタミンＤの量に対して関連付ける工程と、
   を含む、請求項１または請求項２に記載のビタミンＤの定量方法。
4. 前記ビタミンＤとして、２５（ＯＨ）Ｄ_３を含み、
   誘導体化された２５（ＯＨ）Ｄ_３のプリカーサーイオンが、６１９．５の質量／電荷比を有する、請求項３に記載のビタミンＤの定量方法。
5. 前記誘導体化された２５（ＯＨ）Ｄ_３のフラグメントイオンが、３４１．３の質量／電荷比を有しているイオンを含む、請求項４に記載のビタミンＤの定量方法。
6. ^２Ｈ_６−２５（ＯＨ）Ｄ_３が内標準物質として用いられる、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載のビタミンＤの定量方法。
7. 前記１つ以上のフラグメントイオンの量の検出は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を用いた検出である、請求項３ないし請求項６のいずれか一項に記載のビタミンＤの定量方法。
8. 前記ビタミンＤとして、２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓを含み、
   誘導体化された２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓのプリカーサーイオンが、６９９．６の質量／電荷比を有する、請求項３ないし請求項７のいずれか一項に記載のビタミンＤの定量方法。
9. 前記誘導体化された２５（ＯＨ）Ｄ_３Ｓのフラグメントイオンが、４２１．２の質量／電荷比を有しているイオンを含む、請求項８に記載のビタミンＤの定量方法。
10. 前記誘導体化工程は、誘導化反応停止剤により誘導体化反応を停止させる反応停止工程を含み、
    前記反応停止工程において、得られる誘導体の分解を防止するための誘導体分解防止剤を添加する、請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載のビタミンＤの定量方法。
11. 質量の異なるｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログによりそれぞれ誘導体化された、質量の異なるｎ個の誘導体化試料の混合試料から、ビタミンＤ誘導体を分離する分離部と、
    前記分離部で分離されたビタミンＤ誘導体をイオン化するイオン化部と、
    前記イオン化部で生成されたイオンを質量に応じて分離して検出する質量分離部と、
    前記質量分離部で分離して検出された質量の異なるｎ種のビタミンＤ誘導体について、それぞれ検出されたイオンの量に基づいて、前記混合試料中に含まれる前記ｎ種のビタミンＤ誘導体の量に対して関連付けて定量する計算部と、
    を備える、質量分析装置。
12. 前記質量分離部は、
    前記イオン化部で生成されたイオンを質量に応じて分離してプリカーサーイオンを選択する第１質量分離部と、
    前記第１質量分離部で選択されたプリカーサーイオンを開裂させてフラグメントイオンを生成する開裂部と、
    前記開裂部で生成されたフラグメントイオンを質量に応じて分離する第２質量分離部とを有し、
    前記計算部は、前記第２質量分離部でフラグメントイオンとして分離された質量の異なる前記ｎ種のビタミンＤ誘導体について、それぞれ検出されたイオンの量に基づいて定量計算を行う、請求項１１に記載の質量分析装置。
13. 質量の異なるｎ種の４−（４‘−ジメチルアミノフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）アイソトポログと、
    誘導化反応停止剤と、
    誘導体分解防止剤と、
    を備える、ビタミンＤ定量用試薬キット。

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