JP6749595B2 - Ｅｓ細胞及びその他の幹細胞から、涙腺上皮細胞を誘導する方法 - Google Patents

Description

本発明は、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造する方法や、該方法により製造される涙腺上皮細胞や、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞への分化誘導用試薬キットに関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本特願2015-062726号優先権を請求する。

乾燥眼、眼乾燥症ともいわれるドライアイは、涙腺の涙液分泌機能の低下や障害等によって、涙液の量的及び／又は質的な異常が生じ、その結果、眼球の表面、すなわち角結膜に障害が起こる疾患である。涙腺の涙液分泌機能の低下や障害の原因としては、ＶＤＴ作業（ビデオ画面端末作業）、加齢、涙腺における炎症を伴う疾患などが知られており、かかる疾患としては、シェーグレン症候群のような自己免疫異常、乾性角結膜炎、スティーブンスージョンソン症候群、眼瞼縁炎症等が知られている。涙腺に炎症を生じると、リンパ球等の炎症細胞が涙腺に浸潤し、涙腺の涙液分泌機能の低下や障害が生じる。ドライアイ患者は、潜在患者を含め、日本では８００万人以上いるといわれ、ドライアイの増加は社会問題にもなっている。

ドライアイを改善する方法として、人工涙液を点眼する方法が一般的に用いられているが、あくまでも対症療法に過ぎず、また、効果も一時的であるため、一日に１０〜２０回も適用する必要があるなど、患者にとって煩雑であった。また、涙腺における炎症を伴う疾患においては、その炎症反応を軽減するために、ステロイドやサイクロスポリンなどの薬剤が用いられているが、涙液の分泌量を正常な状態にまで改善することはできない。

そこで、障害のある涙腺組織を修復し、涙腺機能の根本的な回復を実現し得る幹細胞移入療法を目指して、涙腺の組織幹細胞（成体幹細胞）の探索が進められている。しかし、涙腺の器官形成能を有する、涙腺の組織幹細胞はいまだ分離されていない。

また、これまでに本発明者らは、マウス胎仔の涙腺原基由来の涙腺上皮細胞及び涙腺間葉細胞から、器官原基法（非特許文献１：Nat. Methods 4, 227-230 (2007)）により、涙腺のもととなる再生涙腺原基を作製し、かかる再生涙腺原基を涙腺機能が障害されたモデルマウスの涙腺喪失部位に移植することで、機能的な涙腺を再生できることを明らかにしている（非特許文献２：Nature Communications 4, 2497 (2013), doi:10.1038/ncomms3497）。この方法によれば涙腺の器官再生が可能となるが、ヒトでの将来の臨床応用を考慮すると、ＥＳ細胞（胚性幹細胞；embryonic stem cells）や、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞;induced pluripotent stem cells）といった臨床応用可能な細胞ソースからの涙腺誘導技術が必要であるという課題があった。このような技術状況であるため、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から、涙腺上皮細胞又は涙腺間葉細胞に誘導することに成功したとの報告は未だなされていない。

Nat. Methods 4, 227-230 (2007) Nature Communications 4, 2497 (2013), doi:10.1038/ncomms3497

本発明の課題は、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造する方法や、該方法により製造される涙腺上皮細胞や、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞への分化誘導用試薬キットを提供することにある。

本発明者らは、涙腺上皮細胞を含む８種の細胞における各種ｍＲＮＡの発現をマイクロアレイにて解析し、涙腺上皮細胞に特異的に高発現している遺伝子を特定した。本発明者らは、特定したそれらの遺伝子の中の２種の転写因子（Ｓｉｘ２、Ｆｏｘｃ１）に着目した。本発明者らは、上記８種の細胞において、Ｓｉｘ２遺伝子と同様の発現傾向を示す転写因子遺伝子として、Ｓｉｘ１、Ｓｉｘ４，Ｆｏｘｃ２にも着目した。本発明者らは、Ｐａｘ６遺伝子、Ｆｏｘｃ１遺伝子と同様の発現傾向を示す転写因子遺伝子として、Ｆｏｘｐ１遺伝子、Ｒｕｎｘ１遺伝子、ＩＬＦ２遺伝子にも着目した。

本発明者らは、着目したこれら９種類の遺伝子を候補遺伝子とし、これら候補遺伝子の各ｍＲＮＡを人工的に合成した。それらのｍＲＮＡを様々な組合せでヒトＥＳ細胞に導入し、さらに培養し、涙腺上皮細胞のマーカー遺伝子群の発現を確認したところ、Ｐａｘ６遺伝子のｍＲＮＡとＦｏｘｃ１遺伝子のｍＲＮＡを導入した場合、及び、Ｐａｘ６遺伝子のｍＲＮＡとＦｏｘｐ１遺伝子のｍＲＮＡを導入した場合に場合、涙腺上皮細胞のマーカー遺伝子群の発現が確認されることを見いだした。そして、Ｐａｘ６遺伝子のｍＲＮＡとＦｏｘｐ１遺伝子のｍＲＮＡを導入した場合は、Ｆｏｘｃ１遺伝子の発現の増加が確認されたことから、結局のところ、多能性幹細胞においてＰａｘ６遺伝子とＦｏｘｃ１遺伝子の発現を増加させることが、涙腺上皮細胞への分化誘導に必須であることを本発明者らは見いだした。わずか２種の遺伝子の発現を増加することにより、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞への分化誘導できることは、当業者にとってもきわめて意外であった。さらに、本発明者らは、Ｐａｘ６遺伝子のｍＲＮＡとＦｏｘｃ１遺伝子のｍＲＮＡに加えて、Ｓｉｘ１遺伝子のｍＲＮＡを導入すると、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の１つであるＢａｒｘ２遺伝子の発現がより向上し、涙腺上皮細胞への形態変化がより明確になって、涙腺上皮細胞系への分化の方向性をより明確にし得ることを見いだした。

本発明者らは、また、前述の特定の２種又は３種の遺伝子のｍＲＮＡを導入することにより製造した涙腺上皮細胞が、涙腺器官の立体構造を再生する能力を有しているものかを確認するために、前述の涙腺上皮細胞をマウス胎仔の涙腺原基細胞と共培養したところ、成熟涙腺に類似した立体構造を形成した。このことから、本発明の方法により製造される涙腺上皮細胞は、涙腺器官の立体構造を再生する能力を有していることが示された。

本発明者らは以上の知見に基づいて、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の通りです。
１．以下の工程Ａを有することを特徴とする、涙腺上皮細胞の製造方法；
工程Ａ：多能性幹細胞において、Ｐａｘ６遺伝子の発現を増加させるか又はＰＡＸ６タンパク質を導入し、かつ、Ｆｏｘｃ１遺伝子若しくはＦｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させるか又はＦＯＸＣ１タンパク質若しくはＦＯＸＰ１タンパク質を導入する工程。
２．Ｐａｘ６遺伝子の発現を増加させる工程が、ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入する工程であり、Ｆｏｘｃ１遺伝子の発現を増加させる工程が、ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入する工程であり、Ｆｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させる工程が、ＦＯＸＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入する工程であることを特徴とする前項１に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
３．工程Ａの多能性幹細胞において、さらに、Ｓｉｘ１遺伝子の発現を増加させるか又はＳＩＸ１タンパク質を導入することを特徴とする前項１又は２に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
４．Ｓｉｘ１遺伝子の発現を増加させることが、ＳＩＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入することであることを特徴とする前項３に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
５．さらに、前記工程Ａで得られた細胞を角化細胞増殖用培地で培養する工程を含む前項１〜４のいずれか１に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
６．角化細胞増殖用培地が、上皮成長因子及び／又はコレラトキシンを含有することを特徴とする前項５に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
７．角化細胞増殖用培地中のカルシウム濃度が０．１５ｍＭ以下であることを特徴とする前項５又は６に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
８．ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであることを特徴とする前項２〜７のいずれか１に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
９．前項１〜８のいずれか１に記載の涙腺上皮細胞の製造方法により製造される涙腺上皮細胞。
１０．涙腺器官の立体構造を再生する能力を有する前項９に記載の涙腺上皮細胞。
１１．以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞への分化誘導用試薬キット：
（ａ）ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＰＡＸ６タンパク質：
（ｂ）ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド若しくはＦＯＸＣ１タンパク質、又は、ＦＯＸＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド若しくはＦＯＸＰ１タンパク質。
１２．さらに、（ｃ）ＳＩＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＳＩＸ１タンパク質を含む、前項１１に記載の分化誘導用試薬キット。

これまでの知見では、涙腺器官を再生するには、その材料となる涙腺上皮細胞及び涙腺間葉細胞を、胎生期の哺乳動物から採取して確保する必要があった（非特許文献２）。本発明によれば、臨床応用可能な多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）から、短期間で効率良く大量に涙腺上皮細胞を製造することができる。また、本発明により製造された涙腺上皮細胞は、涙腺器官の立体構造を再生する能力を有している涙腺上皮細胞である。

ヒトＥＳ細胞に、「Ｐａｘ６及びＦｏｘｃ１」のｍＲＮＡを導入し、次いで、角化細胞増殖用培地で培養した場合の細胞における、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを測定した結果を示す図である。「hES p-fc1 day2」は、ｍＲＮＡの導入開始後２日目の細胞の結果を表し、「hES p-fc1 day5」は、ｍＲＮＡの導入開始後５日目の細胞の結果を表す。また、「hES day0」は、ｍＲＮＡの導入日（培養開始後１日目）の、ｍＲＮＡ導入前の細胞の結果を表し、「hES DKSFM day6」は、ｍＲＮＡを導入しなかったこと以外は同様に処理して培養したday6の細胞の結果を表す。 図１に示したのとは異なる涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、図１と同様の細胞において測定した結果である。 ヒトＥＳ細胞に、「Ｐａｘ６及びＦｏｘｐ１」のｍＲＮＡを導入し、次いで、角化細胞増殖用培地で培養した場合の細胞における、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを測定した結果を示す図である。「hES p-fp1 day2」は、ｍＲＮＡの導入開始後２日目の細胞の結果を表し、「hES p-fp1 day5」は、ｍＲＮＡの導入開始後５日目の細胞の結果を表す。また、「hES day0」は、ｍＲＮＡの導入日（培養開始後１日目）の、ｍＲＮＡ導入前の細胞の結果を表し、「hES DKSFM day6」は、ｍＲＮＡを導入しなかったこと以外は同様に処理して培養したday6の細胞の結果を表す。 図３に示したのとは異なる涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、図３と同様の細胞において測定した結果である。 ヒトＥＳ細胞に、「Ｐａｘ６、Ｆｏｘｃ１及びＳｉｘ１」のｍＲＮＡを導入し、次いで、角化細胞増殖用培地で培養した場合の細胞における、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを測定した結果を示す図である。「hES P/S/Fc1 day2」は、ｍＲＮＡの導入開始後２日目の細胞の結果を表し、「hES P/S/Fc1 day5」は、ｍＲＮＡの導入開始後５日目の細胞の結果を表す。また、「hES day0」は、ｍＲＮＡの導入日（培養開始後１日目）の、ｍＲＮＡ導入前の細胞の結果を表し、「hES DKSFM day6」は、ｍＲＮＡを導入しなかったこと以外は同様に処理して培養したday6の細胞の結果を表す。 図５に示したのとは異なる涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、図５と同様の細胞において測定した結果である。 図５及び６に示したのとは異なる涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、図５と同様の細胞において測定した結果である。 ヒトＥＳ細胞に、特定の３種類の転写因子（ＰＡＸ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ１）のｍＲＮＡを導入し、次いで、角化細胞増殖用培地で培養した場合の細胞について、免疫組織学的染色した結果を示す図である。各パネルの左上には、染色対象のタンパク質名を示す。 ヒトＥＳ細胞に、特定の３種類の転写因子（ＰＡＸ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ１）のｍＲＮＡを導入し、培養した場合の細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した結果を示す図である。左上パネルはｍＲＮＡの導入直前の細胞の形態を示し、右上パネルはＤａｙ１（ｍＲＮＡの導入開始後１日目）の細胞の形態を示し、左下パネルはＤａｙ２（ｍＲＮＡの導入開始後２日目）の細胞の形態を示し、右下パネルはＤａｙ５（ｍＲＮＡの導入開始後５日目）の細胞の形態を示す。 本発明における涙腺上皮細胞と、涙腺原基由来細胞とを立体的に共培養して得られた細胞塊を観察した結果を示す。左上パネルはその細胞塊をそのまま光学顕微鏡で観察した結果を示し、それ以外のパネルは、その細胞塊の凍結切片をヘマトキシリン・エオジン染色した後、光学顕微鏡で観察した結果を示す。

＜涙腺上皮細胞の製造方法＞
本発明の涙腺上皮細胞の製造方法（以下、「本発明の製造方法」とも表示する）としては、多能性幹細胞において、Ｐａｘ６遺伝子の発現を増加させるか又はＰＡＸ６タンパク質を導入し、かつ、Ｆｏｘｃ１遺伝子若しくはＦｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させるか又はＦＯＸＣ１タンパク質若しくはＦＯＸＰ１タンパク質を導入する工程Ａを有し、さらに、必要に応じて、前記工程Ａで得られた細胞を、角化細胞（角膜上皮細胞）増殖用培地で培養する工程Ｂを有する。
ここで「培地」とは、細胞を培養できる「培地成分」に水を添加した状態のものをいう。本明細書において、「Ｐａｘ６遺伝子」、及び、「Ｆｏｘｃ１遺伝子又はＦｏｘｐ１遺伝子」、好ましくはさらに「Ｓｉｘ１遺伝子」、をまとめて「本発明における遺伝子」とも表示し、「ＰＡＸ６タンパク質」、及び、「ＦＯＸＣ１タンパク質又はＦＯＸＰ１タンパク質」、好ましくはさらに「ＳＩＸ１タンパク質」、をまとめて「本発明におけるタンパク質」とも表示する。

図３の結果から分かるように、多能性幹細胞において、Ｆｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させると、Ｆｏｘｃ１遺伝子の発現も増加するため、工程Ａにおいて、Ｆｏｘｃ１遺伝子に代えて、又はＦｏｘｃ１遺伝子と共に、Ｆｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させてもよいし、あるいは、ＦＯＸＣ１タンパク質に代えて、又はＦＯＸＣ１タンパク質と共に、ＦＯＸＰ１タンパク質を導入してもよい。

本発明の作用機序の詳細は不明であるが、多能性幹細胞において、より多くのＰＡＸ６タンパク質及びＦＯＸＣ１タンパク質が存在するような状態にすると、より多くの前述の両タンパク質が前記多能性幹細胞内で転写因子として作用し、該多能性幹細胞が涙腺上皮細胞へ分化誘導されるものと考えられる。

上記工程Ａの好ましい態様として、工程Ａの多能性幹細胞において、さらに、Ｓｉｘ１遺伝子の発現を増加させるか又はＳＩＸ１タンパク質を導入することが挙げられる。図１や図３の結果から分かるように、多能性幹細胞において、「Ｐａｘ６遺伝子の発現を増加させるか又はＰＡＸ６タンパク質を導入し」、かつ、「Ｆｏｘｃ１遺伝子若しくはＦｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させるか又はＦＯＸＣ１タンパク質若しくはＦＯＸＰ１タンパク質を導入する」と、Ｓｉｘ１遺伝子の発現も増加するため、Ｓｉｘ１遺伝子の発現を増加させるか又はＳＩＸ１タンパク質を導入することは本発明に必須ではないが、涙腺上皮細胞への形態変化をより明確にして、涙腺上皮細胞系への分化の方向性をより明確にさせ得る点で好ましい。なお、本発明の製造方法は、涙腺上皮細胞をインビトロで製造する方法であり、工程Ａ及び工程Ｂはインビトロで行うことができる。

本発明の製造方法において、「本発明における遺伝子の発現を増加させる」とは、最終的には該遺伝子のタンパク質レベルでの発現を増加させることを意味する。遺伝子の転写レベル（ｍＲＮＡレベル）の発現を増加させれば、通常、タンパク質レベルでの発現も増加するため、本発明における遺伝子の発現の増加は、タンパク質レベルで確認してもよいし、転写レベル（ｍＲＮＡレベル）で確認してもよい。

本発明における遺伝子のタンパク質レベルでの発現の増加の有無や程度は、免疫組織学的染色法等の公知の方法により確認することができる。免疫組織学的染色法に用いる標識抗体は、市販のものを用いてもよいし、公知の方法により作製してもよい。また、本発明における遺伝子の転写レベルでの増加の有無や程度は、定量ＲＴ−ＰＣＲ等の公知の方法により確認することができる。定量ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーの配列は、当業者であれば、目的とする遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計及び作製することができる。ヒトＰａｘ６の配列情報のアクセッション番号はNM_000280.4であり、ヒトＦｏｘｃ１の配列情報のアクセッション番号はNM_001453.2であり、ヒトＦｏｘｐ１の配列情報のアクセッション番号はNM_032682.5であり、ヒトＳｉｘ１の配列情報のアクセッション番号はNM_005982.3である。また、これらの配列情報に基づいて設計したプライマーセットの具体例として、配列番号９及び１０（ヒトＰａｘ６用のプライマーセット）、配列番号１１及び１２（ヒトＦｏｘｃ１用のプライマーセット）、配列番号１３及び１４（ヒトＦｏｘｐ１用のプライマーセット）、配列番号１５及び１６（ヒトＳｉｘ１用のプライマーセット）に示されるヌクレオチド配列からなるプライマーセットを好ましく挙げることができる。

本発明におけるＰａｘ６遺伝子としては、
（ａ−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＰＡＸ６活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＡＸ６活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＰＡＸ６活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＰＡＸ６活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ−１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＡＸ６活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
のいずれかのポリヌクレオチドからなるＰａｘ６遺伝子であれば特に制限されず、また、本発明におけるＰＡＸ６タンパク質としては、
（Ａ−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＰＡＸ６活性を有するタンパク質；
（Ｃ−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＡＸ６活性を有するタンパク質；
のいずれかのタンパク質であれば特に制限されず、ここで、「ＰＡＸ６活性を有するタンパク質」とは、そのタンパク質、又はそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はＦＯＸＰ１タンパク質と共に多能性幹細胞に導入し、次いで、該細胞を培養した場合に、涙腺上皮細胞を製造し得るタンパク質を意味する。

上記の配列番号１はヒトＰａｘ６遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表し、上記の配列番号２はヒトＰＡＸ６タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｐａｘ６の配列データは、ヒト以外の様々な脊椎動物でもすでに公知となっており、GenBankのような公共のデータバンクに開示されている。例えばマウスについてはBC036957.1に、ラットについてはBC128741.1に、イヌについてはEF141016.1に、ウシについてはBC116038.1に、アフリカツメガエルについてはBC075551.1に、Ｐａｘ６遺伝子やＰＡＸ６タンパク質の配列データが開示されている。

本発明におけるＦｏｘｃ１遺伝子としては、
（ａ−２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ−２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＯＸＣ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ−２）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦＯＸＣ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＦＯＸＣ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＦＯＸＣ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ−２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＯＸＣ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
のいずれかのポリヌクレオチドからなるＦｏｘｃ１遺伝子であれば特に制限されず、また、本発明におけるＦＯＸＣ１タンパク質としては、
（Ａ−２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ−２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＯＸＣ１活性を有するタンパク質；
（Ｃ−２）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦＯＸＣ１活性を有するタンパク質；
のいずれかのタンパク質であれば特に制限されず、ここで、「ＦＯＸＣ１活性を有するタンパク質」とは、そのタンパク質、又はそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はＰＡＸ６タンパク質と共に多能性幹細胞に導入し、次いで、該細胞を培地で培養した場合に、涙腺上皮細胞を製造し得るタンパク質を意味する。

上記の配列番号３はヒトＦｏｘｃ１遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表し、上記の配列番号４はヒトＦＯＸＣ１タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｆｏｘｃ１の配列データは、ヒト以外の様々な脊椎動物でもすでに公知となっており、GenBankのような公共のデータバンクに開示されている。例えばマウスについてはNM_008592.2に、ラットについてはNM_134338.1に、アフリカツメガエルについてはNM_001088214.1やNM_001096377.1に、ハナカケトラザメについてはEU196406.1に、Ｆｏｘｃ１遺伝子やＦＯＸＣ１タンパク質の配列データが開示されている。

本発明におけるＦｏｘｐ１遺伝子としては、
（ａ−３）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ−３）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＯＸＰ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ−３）配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦＯＸＰ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ−３）配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ−３）配列番号５に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＦＯＸＰ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ−３）配列番号５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＦＯＸＰ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ−３）配列番号５に示されるヌクレオチド配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＯＸＰ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
のいずれかのポリヌクレオチドからなるＦｏｘｐ１遺伝子であれば特に制限されず、また、本発明におけるＦＯＸＰ１タンパク質としては、
（Ａ−３）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ−３）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＯＸＰ１活性を有するタンパク質；
（Ｃ−３）配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦＯＸＰ１活性を有するタンパク質；
のいずれかのタンパク質であれば特に制限されず、ここで、「ＦＯＸＰ１活性を有するタンパク質」とは、そのタンパク質、又はそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はＰＡＸ６タンパク質と共に多能性幹細胞に導入し、次いで、該細胞を培地で培養した場合に、涙腺上皮細胞を製造し得るタンパク質を意味する。

上記の配列番号５はヒトＦｏｘｐ１遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表し、上記の配列番号６はヒトＦＯＸＰ１タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｆｏｘｐ１の配列データは、ヒト以外の様々な脊椎動物でもすでに公知となっており、GenBankのような公共のデータバンクに開示されている。例えばマウスについてはNM_053202.2に、ラットについてはNM_001034131.1に、アフリカツメガエルについてはNM_001095533.1に、Ｆｏｘｐ１遺伝子やＦＯＸＰ１タンパク質の配列データが開示されている。

本発明におけるＳｉｘ１遺伝子としては、
（ａ−４）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ−４）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＳＩＸ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ−４）配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＳＩＸ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ−４）配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ−４）配列番号７に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＳＩＸ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ−４）配列番号７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＳＩＸ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ−４）配列番号７に示されるヌクレオチド配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＳＩＸ１活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
のいずれかのポリヌクレオチドからなるＳｉｘ１遺伝子であれば特に制限されず、また、本発明におけるＳＩＸ１タンパク質としては、
（Ａ−４）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ−４）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＳＩＸ１活性を有するタンパク質；
（Ｃ−４）配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＳＩＸ１活性を有するタンパク質；
のいずれかのタンパク質であれば特に制限されない。
ここで、「ＳＩＸ１活性を有するタンパク質」とは、そのタンパク質（Ｐ）又はそのタンパク質（Ｐ）をコードするポリヌクレオチドを、ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＰＡＸ６タンパク質と、ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＦＯＸＣ１タンパク質と共に多能性幹細胞に導入し、次いで、該細胞を培地で培養した場合（ケースＡ）と、ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＰＡＸ６タンパク質と、ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＦＯＸＣ１タンパク質と共に多能性幹細胞に導入し、次いで、該細胞を培地で培養した場合（ケースＢ）とを比較した際に、ケースＡの方がＢａｒｘ２遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現量が高く、かつ、涙腺上皮細胞への形態変化がより明確であるタンパク質（Ｐ）を意味する。

「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションを利用することにより得られたDNAが、活性を有するポリペプチドをコードするかどうかは、例えば、そのDNAを大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等が目的のタンパク質を生成することができるかどうか調べることによりわかる。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、各遺伝子と通常、高い同一性を有する。高い同一性とは、90％以上の同一性、好ましくは95％以上の同一性、更に好ましくは98％以上の同一性を指す。

上記の配列番号７はヒトＳｉｘ１遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表し、上記の配列番号８はヒトＳＩＸ１タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｓｉｘ１の配列データは、ヒト以外の様々な脊椎動物でもすでに公知となっており、GenBankのような公共のデータバンクに開示されている。例えばマウスについてはNM_009189.3に、ラットについてはNM_053759.1に、イヌについてはKF381338.1に、アフリカツメガエルについてはBC169929.1に、Ｓｉｘ１遺伝子やＳＩＸ１タンパク質の配列データが開示されている。

上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜３０個の範囲内、好ましくは１〜２０個の範囲内、より好ましくは１〜１５個の範囲内、さらに好ましくは１〜１０個の範囲内、より好ましくは１〜５個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味し、また、上記「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１〜４０個の範囲内、好ましくは１〜３０個の範囲内、より好ましくは１〜２０個の範囲内、さらに好ましくは１〜１５個の範囲内、より好ましくは１〜１０個の範囲内、より好ましくは１〜５個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内の数のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を意味する。

例えば、これら１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（変異ポリヌクレオチド）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１、３、５又は７に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリヌクレオチドに変異を導入することにより、変異ポリヌクレオチドを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ポリヌクレオチドを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。

上記「配列番号１、３、５又は７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列」とは、それぞれ、配列番号１、３、５又は７に示されるヌクレオチド配列との同一性が８０％以上であれば特に制限されるものではなく、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを含んでいる。

上記「配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」とは、それぞれ、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であれば特に制限されるものではなく、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを含んでいる。

上記の本発明における遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、ヒトの本発明における遺伝子の配列情報（Ｐａｘ６遺伝子：配列番号１； Ｆｏｘｃ１遺伝子：配列番号３； Ｆｏｘｐ１遺伝子：配列番号５； Ｓｉｘ１遺伝子：配列番号７）や、他の生物種の公知のそれらの遺伝子の配列情報に基づいて適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、ヒト等の脊椎動物の細胞・組織由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション法や（ＲＴ−）ＰＣＲ法（モレキュラークローニング第２版に記載の方法等）を用いてヒト等の脊椎動物の本発明における遺伝子のｃＤＮＡをクローニングし、ヒト等の脊椎動物の本発明における遺伝子を取得する方法のほか、常法に従って化学合成により調製することもできる。また、取得した本発明における遺伝子又はそれらの遺伝子の一部をプローブとして用いたハイブリダイゼーション法などにより、その本発明における遺伝子の由来する脊椎動物とは別の種類の脊椎動物から本発明における遺伝子を取得することもできる。

上記の本発明におけるタンパク質の取得方法や、調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明におけるタンパク質を取得することができる。

配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒトの本発明におけるタンパク質の配列情報（配列番号２、４、６、８）や、ヒトの本発明における遺伝子の配列情報（配列番号１、３、５、７）や、他の生物種の公知のそれらのタンパク質や遺伝子の配列情報に基づいて、当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、ヒトのＰａｘ６（配列番号１、２）、Ｆｏｘｃ１（配列番号３、４）、Ｆｏｘｐ１（配列番号５、６）又はＳｉｘ１（配列番号７、８）の配列情報や、他の生物種の公知のそれらのタンパク質や遺伝子の配列情報に基づいて適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、ヒト等の脊椎動物の細胞・組織由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション法や（ＲＴ−）ＰＣＲ法（モレキュラークローニング第２版に記載の方法等）を用いてヒト等の脊椎動物の本発明における遺伝子のｃＤＮＡをクローニングし、ヒト等の脊椎動物の本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得することができる。また、かかるポリヌクレオチドをプローブとして用いたハイブリダイゼーション法などにより、そのポリヌクレオチドが由来する脊椎動物とは別の種類の脊椎動物から、本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。このようにして得られた本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主細胞に導入して培養し、培養した細胞又はその馴化培地から組換えタンパク質を回収することにより、ヒト等の脊椎動物由来の本発明におけるタンパク質を取得することができる。

上記工程Ａにて、多能性幹細胞において、本発明における遺伝子の発現を増加させる方法としては特に制限されず、本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入せずに本発明における遺伝子の発現を増加させる方法であってもよいが、本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入する方法を好適に挙げることができる。かかるポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよいしＲＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、線状であっても環状であってもよく、本発明におけるタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はそれらを含むポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、配列番号１、３、５、７は、ＤＮＡ配列として記載しているが、本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、前述の配列番号のヌクレオチド配列におけるＴはＵを表す。本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、「本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター」（以下、「本発明における発現ベクター」とも表示する。）や、「本発明におけるタンパク質をコードするｍＲＮＡ」（以下、「本発明におけるｍＲＮＡ」とも表示する。）を挙げることができ、中でも、臨床応用の際の安全性がより高い点で、「本発明におけるｍＲＮＡ」を好ましく挙げることができる。「本発明におけるｍＲＮＡ」は、多能性幹細胞に導入した場合にそのｍＲＮＡから直接、本発明におけるタンパク質への翻訳が行われるため、発現を増加させた本発明における遺伝子のポリヌクレオチドが多能性幹細胞のゲノム上に組み込まれてしまう懸念がない。

ＰＡＸ６タンパク質をコードするｍＲＮＡとしては、前述の（ａ−１）〜（ｇ−１）に示されるポリヌクレオチドからなる群から選択されるいずれかのポリヌクレオチドの３'末端にポリＡ配列が付加されたポリリボヌクレオチドを挙げることができる。ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするｍＲＮＡとしては、前述の（ａ−２）〜（ｇ−２）に示されるポリヌクレオチドからなる群から選択されるいずれかのポリヌクレオチドの３'末端にポリＡ配列が付加されたポリリボヌクレオチドを挙げることができる。ＦＯＸＰ１タンパク質をコードするｍＲＮＡとしては、前述の（ａ−３）〜（ｇ−３）に示されるポリヌクレオチドからなる群から選択されるいずれかのポリヌクレオチドの３'末端にポリＡ配列が付加されたポリリボヌクレオチドを挙げることができる。ＳＩＸ１タンパク質をコードするｍＲＮＡとしては、前述の（ａ−４）〜（ｇ−４）に示されるポリヌクレオチドからなる群から選択されるいずれかのポリヌクレオチドの３'末端にポリＡ配列が付加されたポリリボヌクレオチドを挙げることができる。なお、前述のポリＡ配列のヌクレオチド数としては、そのポリリボヌクレオチドを多能性幹細胞に導入した場合に、そのポリリボヌクレオチドがコードするタンパク質に翻訳され得る限り特に制限されないが、例えば３０〜３００個の範囲内を挙げることができ、５０〜２５０個の範囲内を好ましく挙げることができる。

本発明におけるｍＲＮＡは、導入した細胞内でより高い翻訳効率を得る観点から、５'末端にキャップ構造を有していることが好ましい。かかるキャップ構造としては、７−メチルグアノシンを好ましく挙げることができる。
本発明におけるｍＲＮＡは、本発明における遺伝子の配列情報に基づいて、常法により作製することができる。例えば化学合成により作製することもできるし、インビトロ転写により作製することもできる。インビトロ転写は、例えば本発明における発現ベクターと、インビトロ転写反応用の市販のキットとを用いて、常法により行うことができる。

本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、「本発明における発現ベクター」や、「本発明におけるｍＲＮＡ」など）を多能性幹細胞に導入する方法としては、該ポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入できる方法である限り特に制限されないが、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）デキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを挙げることができ、中でも、操作が簡便であり、かつ、ポリヌクレオチドの導入効率が高いことから、リポフェクション法が好ましく挙げられる。リポフェクション法を用いたトランスフェクションは、Lipofectamine（日本登録商標）（Life Technologies社製）、LipoTAXI（日本登録商標）（アジレント・テクノロジー社製）等の市販の試薬を添付の取扱説明書にしたがって用いることによって行うことができる。リポフェクション法を用いてポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入する際、該ポリヌクレオチドと多能性幹細胞を接触させる時間の長さとしては、例えば０．５〜４時間の範囲内、好ましくは１〜３．５時間の範囲内、より好ましくは１．５〜３時間の範囲内を挙げることができる。

本発明における発現ベクターがウイルスベクターの場合は、本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞など）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを多能性幹細胞に感染させることができる。例えば、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合の具体的手段については、Science,318, 1917-1920 (2007)などを参照することができ、レトロウイルスベクターを用いる場合については、WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及びCell, 131, 861-872 (2007)などを参照することができ、アデノウイルスベクターを用いる場合については、Science, 322, 945-949 (2008)を参照することができる。

前述したように、本発明の製造方法においては、多能性幹細胞において本発明における遺伝子の発現を増加してもよいし、多能性幹細胞において本発明におけるタンパク質を導入してもよい。また、本発明における遺伝子のうち、一部の種類の遺伝子の発現を多能性幹細胞において増加させ、残りの種類の遺伝子に対応するタンパク質を多能性幹細胞に導入してもよいし、本発明における遺伝子のうち、一部又は全部の種類の遺伝子について、多能性幹細胞において遺伝子の発現を増加させ、かつ、その遺伝子に対応するタンパク質を多能性幹細胞に導入してもよい。

本発明におけるタンパク質を多能性幹細胞に導入する方法としては、本発明におけるタンパク質を多能性幹細胞に導入できる方法である限り特に制限されないが、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）−又は細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）−融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などを挙げることができる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systems社製）、Pro-Ject^TM Protein Transfection Reagent（PIERCE社製）及びProVectin（IMGENEX社製）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems社製）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetratin Peptide（Q biogene社製）及びChariot Kit（Active Motif社製）、ＨＶＪエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業社製）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。本発明におけるタンパク質を適当な溶媒（例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で５〜１５分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して３７℃で１ないし数時間インキュベートすることができる。

上記のマイクロインジェクションは、先端径１μｍ程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。

本発明の製造方法において、本発明における遺伝子の発現を増加させる程度としては、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造し得る限り特に制限されないが、転写レベル（ｍＲＮＡレベル）及び／又はタンパクレベルで、例えば、増加させる前と比較して１０倍以上（例えば１０倍以上５０倍未満）に、少なくともある時点（好ましくは、発現を増加させる操作を多能性幹細胞に施してから５日以内）までに少なくとも１度は到達することを挙げることができる。多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造し得る限り、本発明における遺伝子の発現を増加させる程度は、本発明における遺伝子毎に同じであっても異なっていてもよく、転写レベル（ｍＲＮＡレベル）及び／又はタンパクレベルで、例えば、Ｐａｘ６遺伝子：Ｆｏｘｃ１遺伝子が、１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１：０．８〜０．８：１．０の範囲内を挙げることができる。また、Ｓｉｘ１遺伝子の発現も増加させる場合の発現の増加の程度としては、Ｐａｘ６遺伝子：Ｓｉｘ１遺伝子が、１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１．０：０．８〜０．８：１．０の範囲内を挙げることができる。また、Ｆｏｘｃ１遺伝子に代えて、又はＦｏｘｃ１遺伝子と共に、Ｆｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させる場合の発現の増加の程度としては、Ｐａｘ６遺伝子：Ｆｏｘｐ１遺伝子が、１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１．０：０．８〜０．８：１．０の範囲内を挙げることができる。

本発明におけるタンパク質や、本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの多能性幹細胞への導入量としては、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造し得る限り特に制限されないが、本発明におけるタンパク質の導入量については、多能性幹細胞１cellに対して、本発明におけるタンパク質１種類当たり、例えば、０．００１ｐｇ〜１００ｎｇの範囲内を挙げることができる。本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入量としては、発現ベクターを含むか否か、一本鎖か二本鎖かなどのポリヌクレオチドの態様によっても左右されるが、多能性幹細胞１cellに対して、該ポリヌクレオチド１種類当たり、例えば、０．５ｐｇ〜５０ｎｇの範囲内、好ましくは５ｐｇ〜１０ｎｇの範囲内を挙げることができる。また、本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合の導入量としては、多能性幹細胞１cellに対して、該ｍＲＮＡ １種類当たり、例えば、０．１ｐｇ〜１０ｎｇの範囲内、好ましくは１ｐｇ〜１ｎｇの範囲内を挙げることができ、より好ましくは３ｐｇ〜３００ｐｇの範囲内を挙げることができる。

多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造し得る限り、本発明におけるタンパク質の導入量は、本発明におけるタンパク質の種類毎に同じであっても異なっていてもよく、例えば、ＰＡＸ６タンパク質：ＦＯＸＣ１タンパク質が、重量比で１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１：０．８〜０．８：１．０の範囲内であることを挙げることができる。また、ＳＩＸ１タンパク質も導入する場合の導入比率としては、ＰＡＸ６タンパク質：ＳＩＸ１タンパク質が、重量比で１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１：０．８〜０．８：１．０の範囲内であることを挙げることができる。また、ＦＯＸＣ１タンパク質に代えて、又はＦＯＸＣ１タンパク質と共に、ＦＯＸＰ１タンパク質を導入する場合の導入比率としては、ＰＡＸ６タンパク質：ＦＯＸＰ１タンパク質が、重量比で１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１：０．８〜０．８：１．０の範囲内であることを挙げることができる。

多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造し得る限り、本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入量は、そのポリヌクレオチドの種類毎に同じであっても異なっていてもよく、例えば、Ｐａｘ６：Ｆｏｘｃ１が、重量比で１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１：０．８〜０．８：１．０の範囲内であることを挙げることができる。また、ＳＩＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドも導入する場合は、Ｐａｘ６：Ｓｉｘ１が、重量比で１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１：０．８〜０．８：１．０の範囲内であることを挙げることができる。また、ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに代えて、又はＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドと共に、ＦＯＸＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入する場合の導入比率としては、Ｐａｘ６：Ｆｏｘｐ１が、重量比で１．０：０．１〜０．１：１．０の範囲内、好ましくは１．０：０．５〜０．５：１．０の範囲内、より好ましくは１：０．８〜０．８：１．０の範囲内であることを挙げることができる。

本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は本発明におけるタンパク質を多能性幹細胞に導入する場合、各ポリヌクレオチド又は各タンパク質の多能性幹細胞への導入は、同時であっても、逐次であってもよく、また、一部が同時で他の残りについて逐次であってもよい。導入が逐次である場合の導入順序としては、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造し得る限り特に制限されないが、
［１］「ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は、ＰＡＸ６タンパク質」：
［２］「ＦＯＸＣ１タンパク質若しくはＦＯＸＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は、ＦＯＸＣ１タンパク質若しくはＦＯＸＰ１タンパク質」：
の順であることが好ましく、またさらに
［３］「ＳＩＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は、ＳＩＸ１タンパク質」を逐次導入する場合は、上記［１］と［２］の間や、上記［２］の後や、上記［１］と同時や、上記［２］と同時であることを挙げることができる。

上記［１］の導入と、上記［２］の導入との間隔としては、１〜２４時間以内が好ましく、１〜１０時間以内がより好ましく、１〜５時間以内がさらに好ましい。また、上記［３］を導入する場合における、上記［１］の導入と、上記［３］の導入との間隔としては、１〜２４時間以内が好ましく、１〜１０時間以内がより好ましく、１〜５時間以内がさらに好ましい。また、上記［３］を導入する場合における上記［２］の導入と、上記［３］の導入との間隔としては、１〜２４時間以内が好ましく、１〜１０時間以内がより好ましく、１〜５時間以内がさらに好ましく、１〜３時間以内がより好ましい。

本発明におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は本発明におけるタンパク質を多能性幹細胞に導入する場合の各ポリヌクレオチド又は各タンパク質の多能性幹細胞への導入回数としては、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造し得る限り特に制限されず、各ポリヌクレオチド又は各タンパク質について１回であってもよいが、導入するポリヌクレオチドのいずれか若しくはすべて、又は、導入するタンパク質のいずれか又はすべてについて２回以上（好ましくは２〜４回、より好ましくは２又は３回、さらに好ましくは２回）とすることもできる。このように、各ポリヌクレオチド又は各タンパク質の導入回数を２回以上とすることは、特に、導入するものがｍＲＮＡである場合やタンパク質である場合に好ましい場合がある。本発明における発現ベクターを導入した場合とは異なり、本発明におけるｍＲＮＡや本発明におけるタンパク質を導入した場合は、導入から２４時間程度で、そのｍＲＮＡから生成したタンパク質や、導入したタンパク質が細胞内からほとんど無くなるので、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞を製造するために、２回以上導入することが好ましい場合がある。

本発明におけるｍＲＮＡ又は本発明におけるタンパク質を導入する場合は、各ｍＲＮＡ又は各タンパク質について、１２〜３６時間毎（好ましくは１８〜３０時間毎）に２回以上（好ましくは２〜４回、より好ましくは２又は３回、さらに好ましくは２回）、同種のｍＲＮＡ又は同種のタンパク質を導入する態様を好ましく挙げることができる。

本発明におけるｍＲＮＡ又は本発明におけるタンパク質を逐次導入する場合の好適な態様としては、例えば、「ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＰＡＸ６タンパク質」を導入してから１〜１０時間以内（好ましくは１〜５時間以内）に、「ＦＯＸＣ１タンパク質若しくはＦＯＸＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は、ＦＯＸＣ１タンパク質若しくはＦＯＸＰ１タンパク質」、好ましくはさらに「ＳＩＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は、ＳＩＸ１タンパク質」を導入するという工程を、１２〜３６時間以内（好ましくは１８〜３０時間以内）に再度繰り返す態様を挙げることができる。

上記工程Ａで、本発明における遺伝子の発現を増加させるか、又は、本発明におけるタンパク質を導入する場合において、その増加方法又はその導入方法に特に必要となる成分以外の培地成分としては特に制限されず、例えば、市販の多能性幹細胞増殖用培地を用いることができる。かかる多能性幹細胞増殖用培地としては、STEM FIT（日本登録商標）（味の素社製）、Essential 8^TM Medium（Life Technologies社製）、HyCell-STEM^TM Media（ＧＥヘルスケア社製）などを挙げることができ、多能性幹細胞をより効率良く増殖する観点から、Ｙ２７６３２等のＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）阻害剤、及び／若しくは、Ｂ１８Ｒタンパク質が添加された、又は、含有する多能性幹細胞増殖用培地を好ましく挙げることができ、Ｙ２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤及びＢ１８Ｒタンパク質が添加された、又は、含有する多能性幹細胞増殖用培地をより好ましく挙げることができ、Ｙ２７６３２及びＢ１８Ｒタンパク質が添加されたSTEM FIT（日本登録商標）（味の素社製）をさらに好ましく挙げることができる。なお、本段落に記載された多能性幹細胞増殖用培地や、その好適な態様の培地は、上記工程Ａで、本発明における遺伝子の発現を増加させるか、又は、本発明におけるタンパク質を導入する前に、多能性幹細胞を培養するときにも好適に用いることができる。

Ｙ２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤は、多能性幹細胞の細胞分散時の細胞死を抑制する活性や、多能性幹細胞の未分化状態をより長く維持させる活性を有することが知られており、多能性幹細胞増殖用培地に添加されることも多い。工程Ａに用いる培地中の、Ｙ２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、例えば、０．１〜１０００μＭの範囲内、好ましくは１〜１００μＭの範囲内、より好ましくは５〜２０μＭの範囲内を挙げることができる。Ｙ２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤は市販のものを用いることができ、例えば、Ｙ２７６３２（和光純薬工業社製）を用いることができる。

Ｂ１８Ｒタンパク質は、Ｉ型インターフェロンを強力に中和する活性を有するタンパク質であり、ポリヌクレオチドやタンパク質を導入した後の細胞死を抑制することが知られている。工程Ａに用いる培地中のＢ１８Ｒタンパク質の濃度としては、例えば、２．５ｎｇ／ｍＬ〜２５μｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは０．１２５〜０．５μｇ／ｍＬの範囲内を挙げることができる。Ｂ１８Ｒタンパク質は市販のものを用いることができ、例えばアフィメトリクス・ジャパン株式会社製のものを用いることができる。

本発明の製造方法において細胞を培養する際には、多能性幹細胞を培養する際に通常用いられる培養ディッシュ（Nunc社や、Corning社等）を用いることができ、かかる培養ディッシュとしては、細胞外マトリックスでコーティングされた培養ディッシュを好ましく挙げることができる。細胞外マトリックスとしては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン又はそれらの組合せなどを挙げることができる。

本発明の製造方法に用いる多能性幹細胞の種類としては、本発明の製造方法により涙腺上皮細胞を製造し得る細胞である限り特に制限されず、例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを好適に挙げることができる。上記多能性幹細胞の由来となる生物種としては、脊椎動物である限り特に制限されず、該脊椎動物としては、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等を挙げることができ、中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を好ましく挙げることができ、中でもヒトを特に好ましく挙げることができる。

本発明の製造方法に用いるＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、RIKEN Bioresource Center CELL BANK、独立行政法人医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクなどから入手することができる。また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は作製してもよい。ＥＳ細胞の作製方法は特に制限されず、現在公知の作製方法を用いてもよいし、今後新たに開発される方法を用いてもよいが、例えば、対象脊椎動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取り出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、ｉＰＳ細胞の作製方法も特に制限されず、現在公知の作製方法（再表２００９／０７５１１９、特表２０１１−５２９３２９、特表２０１１−５２９３３０、特表２０１２−５０７２５８、特表２０１３−５０１５０５、特表２０１３−５１９３７１、特表２０１３−５４４０６９）を用いてもよいし、今後新たに開発される作製方法を用いてもよい。

本発明の製造方法は、好ましくは、工程Ａで得られた細胞を、培地で培養する工程Ｂを有している。工程Ａで得られた細胞を、例えば、角化細胞（角膜上皮細胞）増殖用培地で培養すると、涙腺上皮細胞を製造することができる。
角化細胞増殖用培地とは、角化細胞を増殖及び維持できる培地を意味するが、便宜上、工程Ａで得られた細胞を培養した場合に涙腺上皮細胞を製造し得るいかなる培地をも含む。かかる角化細胞増殖用培地としては、角化細胞を一定期間生存させ得る角化細胞基本培地に、添加因子が添加された培地を好ましく挙げることができる。かかる添加因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、コレラトキシン等を好ましく挙げることができる。上皮成長因子やコレラトキシンは市販のものを用いることができ、例えばそれぞれ、Peprotech社製、List Biological Laboratories社製のものを用いることができる。上記上皮成長因子の使用濃度としては、涙腺上皮細胞を製造し得る限り特に制限されないが、例えば０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲内を挙げることができる。また、上記コレラトキシンの使用濃度としては、涙腺上皮細胞を製造し得る限り特に制限されないが、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬの範囲内を挙げることができる。

また、涙腺上皮細胞のより良い製造効率を得る観点から、本発明における角化細胞増殖用培地のカルシウム濃度の上限は０．１５ｍＭ以下であることが好ましく、０．１０ｍＭ以下であることがより好ましい。また、カルシウム濃度は０ｍＭであってもよいが、０．０３ｍＭ以上であることが好ましい。

上記の角化細胞基本培地とは、角化細胞を一定期間生存させ得る培地を意味するが、便宜上、工程Ａで得られた細胞を培養した場合にかかる細胞を一定期間生存させ得るいかなる培地をも含む。かかる角化細胞基本培地としては、例えば、１又は２種類以上の糖（類）と、１又は２種類以上の無機塩（類）、１又は２種類以上のアミノ酸（類）、及び１又は２種類以上のビタミン（類）、及び１又は２種類以上のその他成分を含むことが好ましい。

上記糖類としては、具体的には、グルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類を挙げることができるが、中でもグルコースが特に好ましく、これら糖類は、１又は２以上組み合わせて添加することもできる。

上記無機塩類としては、具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄(III)九水和物、硫酸鉄(II)七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、亜セレン酸ナトリウム五水和物、硫酸亜鉛七水和物から選ばれる１種又は２種以上の無機塩（類）を挙げることができるが、多能性幹細胞からの涙腺上皮細胞の製造に有利に作用する成分であればいずれの無機塩類又はその組合せも用いることができる。

上記アミノ酸類としては、具体的には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等から選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸（類）、好ましくはＬ−体のアミノ酸とそれらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。

上記ビタミン類としては、具体的には、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、アスコルビン酸から選択される１種又は２種以上のビタミン（類）と、これらの成分各々の誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。

上記その他成分としては、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、ヌクレオチド等の核酸、ピルビン酸、及びその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物、フェノールレッドなどを挙げることができ、上記ヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、好ましくはこれら４種の等モル混合物を好ましく挙げることができ、ピルビン酸の派生物としてはピルビン酸ナトリウムを好ましく挙げることができる。

上記角化細胞基本培地の具体例としては、ＤＫＳＦＭ培地（defined keratinocyte serum-free medium）（Life Technologies社製）、EpiLife（日本登録商標）培地を挙げることができ、中でも、ＤＫＳＦＭ培地を好ましく挙げることができる。なお、ＤＫＳＦＭ培地のカルシウム濃度は、０．１０ｍＭ以下である。

本発明の製造方法に用いる特に好ましい角化細胞増殖用培地としては、上記ＤＫＳＦＭ培地に、０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲内の上皮成長因子、及び、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは５０〜２００μｇ／ｍＬの範囲内のコレラトキシンを添加した培地を挙げることができる。

上記工程Ａで得られた細胞について、培地（特に、角化細胞増殖用培地）での培養を開始する時期としては、涙腺上皮細胞を製造し得る限り特に制限されないが、工程Ａでの本発明における遺伝子又はタンパク質の導入を終了してから、例えば、０〜３６時間後の範囲内を挙げることができ、涙腺上皮細胞のより良い製造効率を得る観点から、１２〜２４時間後の範囲内を好ましく挙げることができる。また、上記の培養の開始時期を別の側面から挙げると、工程Ａでの本発明における遺伝子又はタンパク質の最初の導入の開始から、８〜４８時間後の範囲内を挙げることができ、涙腺上皮細胞のより良い製造効率を得る観点から、１２〜３６時間後の範囲内を好ましく挙げることができる。

工程Ｂにおいて、細胞を培地（特に、角化細胞増殖用培地）で培養する期間としては、涙腺上皮細胞を製造し得る限り特に制限されないが、あまり長期間の培養は涙腺上皮細胞の製造効率を低下させるため、２〜６日間の範囲内を挙げることができ、２〜３日間の範囲内を好ましく挙げることができる。

本発明において製造する「涙腺上皮細胞」とは、１種又は２種以上（好ましくは３種以上）の涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現が上昇しており、かつ、涙腺間葉細胞と共に涙腺器官に誘導され得る細胞を意味する。上記の涙腺上皮細胞マーカー遺伝子としては、ＦＧＦ５（線維芽細胞増殖因子５）、ＬＥＦＴＹ２（左右決定因子２）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子１０）、Ｂａｒｘ２（Ｂａｒｘホメオボックス２）、Ｋｒｔ１５（サイトケラチン１５）、ＡＱＰ５（アクアポリン５）、ＬＴＦ（ラクトフェリン）を挙げることができる。「涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現が上昇している」細胞とは、本発明における遺伝子の発現を増加させる前か、又は本発明におけるタンパク質を導入する前の細胞における涙腺上皮細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較して、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが上昇している細胞を意味する。

また、ある細胞が、上記の「涙腺間葉細胞と共に涙腺器官に誘導され得る細胞」かどうかは、例えば、その細胞を涙腺原基と共培養することにより確認することができ、かかる共培養の方法としては、非特許文献１に記載の方法を好ましく挙げることができる。

＜本発明の涙腺上皮細胞＞
本発明の涙腺上皮細胞としては、本発明の製造方法により製造される涙腺上皮細胞である限り特に制限されない。本発明の製造方法における記載や好適な態様は、本発明の涙腺上皮細胞においても適用される。

＜分化誘導用試薬キット＞
本発明における多能性幹細胞から涙腺上皮細胞への分化誘導用試薬キット（以下、「本発明の分化誘導用試薬キット」とも表示する。）としては、以下の（ａ）及び（ｂ）を含んでいる限り特に制限されない。本発明の分化誘導用試薬キットは、以下の（ａ）及び（ｂ）を、特定の用途（多能性幹細胞から涙腺上皮細胞への分化誘導用の試薬キット）に用いる用途発明であり、以下の（ａ）及び（ｂ）の単なる組合せの発明ではない。
（ａ）ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＰＡＸ６タンパク質：
（ｂ）ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド若しくはＦＯＸＣ１タンパク質、又は、ＦＯＸＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド若しくはＦＯＸＰ１タンパク質。

本発明の分化誘導用試薬キットは、さらに（ｃ）ＳＩＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＳＩＸ１タンパク質を含んでいることが好ましい。
本発明の分化誘導用試薬キットにおけるポリヌクレオチドとしてはｍＲＮＡを好ましく挙げることができる。
本発明の分化誘導用試薬キットに含まれるポリヌクレオチドや、タンパク質の重量比としては、本発明の製造方法における前述のポリヌクレオチドやタンパク質の導入量の重量比を挙げることができる。

本発明の製造方法における記載や好適な態様は、本発明の分化誘導用試薬キットにおいても適用される。

以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．涙腺上皮細胞に特異的に発現する因子の解析
幹細胞から涙腺上皮細胞への分化誘導に関連する因子を特定するために、マウスの涙腺原基から分離した涙腺上皮細胞における遺伝子発現を、市販のＤＮＡマイクロアレイにより網羅的に解析した。解析により得られたその発現様式を、涙腺原基由来の涙腺上皮と涙腺間葉、ハーダー腺原基由来のハーダー腺上皮とハーダー腺間葉、胎生期眼瞼結膜上皮と間葉、成体涙腺と成体ハーダー腺の発現様式と比較し、涙腺上皮細胞に特異的と思われる遺伝子を探索した。本発明者らは、これらの遺伝子の中から、涙腺上皮細胞で特に高発現している転写因子遺伝子として、Ｓｉｘ２遺伝子とＦｏｘｃ１遺伝子を見いだした。

それら以外にも、涙腺上皮細胞への分化誘導に関連している可能性のある転写因子を模索するために、Ｓｉｘ２遺伝子と同様の挙動を示す転写因子を前述の発現様式から探索した結果、本発明者らは、Ｓｉｘ１遺伝子、Ｓｉｘ４遺伝子及びＦｏｘｃ２遺伝子を見いだした。また、本発明者らは、Ｐａｘ６遺伝子にも着目した。さらに、本発明者らは、Ｆｏｘｃ１遺伝子と同様の発現傾向を示す転写因子遺伝子として、Ｆｏｘｐ１遺伝子、Ｒｕｎｘ１遺伝子、ＩＬＦ２遺伝子にも着目した。

以上のことから、本発明者らは、多能性幹細胞を涙腺上皮細胞へ分化誘導し得る転写因子の候補として、９種類の遺伝子、すなわち、Ｓｉｘ２遺伝子、Ｆｏｘｃ１遺伝子、Ｓｉｘ１遺伝子、Ｓｉｘ４遺伝子、Ｆｏｘｃ２遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｆｏｘｐ１遺伝子、Ｒｕｎｘ１遺伝子、ＩＬＦ２遺伝子を見いだした。

また、涙腺上皮細胞において特徴的な細胞表面タンパク質を調べるために、マウスの涙腺原基から分離した涙腺上皮細胞における各種サイトケラチンの遺伝子発現を、市販のＤＮＡマイクロアレイにより解析した。解析により得られたその発現様式を、周辺類縁組織の細胞における発現様式と比較し、涙腺上皮細胞に特徴的と思われるサイトケラチンを探索した。その結果、本発明者らは、サイトケラチン１５の遺伝子（Ｋｒｔ１５遺伝子）を見いだした。Ｋｒｔ１５が涙腺上皮細胞に特徴的に発現することはこれまでに知られておらず、Ｋｒｔ１５遺伝子は、新たな涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の１つであることが示された。

抗Ｋｒｔ１５ポリクローナル抗体で涙腺上皮細胞を染色したところ、サイトケラチン１５が涙腺上皮細胞表面に実際に発現されていることが確認された。

２．多能性幹細胞を涙腺上皮細胞へ分化誘導し得る転写因子の探索
多能性幹細胞を涙腺上皮細胞へ分化誘導し得る転写因子を探索するために、実施例１で見いだされた９種類の候補遺伝子（Ｓｉｘ２遺伝子、Ｆｏｘｃ１遺伝子、Ｓｉｘ１遺伝子、Ｓｉｘ４遺伝子、Ｆｏｘｃ２遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｆｏｘｐ１遺伝子、Ｒｕｎｘ１遺伝子、ＩＬＦ２遺伝子）のｍＲＮＡを作製し、そのｍＲＮＡを多能性幹細胞に導入して、涙腺上皮細胞へ分化誘導できるかどうかを確認した。

［候補遺伝子のｍＲＮＡの作製］
ヒトにおける上記の９種類の候補遺伝子の配列情報を、ＮＣＢＩのウェブサイトから入手し、それぞれの配列情報に基づいて、それぞれの遺伝子を増幅し得るプライマーセットを作製した。なお、候補遺伝子のうち、ヒトＰａｘ６の配列情報のアクセッション番号はNM_000280.4であり、ヒトＦｏｘｃ１の配列情報のアクセッション番号はNM_001453.2であり、ヒトＦｏｘｐ１の配列情報のアクセッション番号はNM_032682.5であり、ヒトＳｉｘ１の配列情報のアクセッション番号はNM_005982.3である。また、９種の候補遺伝子のうち、これら４種の候補遺伝子を増幅し得るプライマーセットのヌクレオチド配列の配列番号を以下の表１に示す。

ヒトのゲノム配列を鋳型とし、前述の各プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、各目的遺伝子のＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。増幅したＤＮＡ断片をそれぞれpCR2-UTR-R1R2プラスミドベクターに組み込んだ後、そのＤＮＡ断片が目的遺伝子のものであることを確認した。各遺伝子を含む各プラスミドベクターから目的遺伝子を精製し、インビトロ転写用の鋳型とした。この鋳型に、GTP、ATP、Me-CTP、Pseudo UTP、tail sequenceを添加して、インビトロ転写反応を行った（AMBION IVT KIT、Life Technologies社製）。インビトロ転写反応により生成した人工ｍＲＮＡをそれぞれ精製した後、シーケンサーで配列を確認し、前述の９種類の候補遺伝子のｍＲＮＡを得た。

［多能性幹細胞への人工ｍＲＮＡの導入］
多能性幹細胞であるヒトＥＳ細胞を用意した。ラミニンでコーティングした培養ディッシュ（Corning社製）に培地を添加し、ＥＳ細胞を１×１０^４cells/cm²となるように播種して培養を開始した。この培地としては、多能性幹細胞用培養液であるSTEM FIT（登録商標）（味の素社製）に、１０μＭのＹ２７６３２（和光純薬工業社製）を添加した培地を用いた。培養開始の翌日（培養開始後１日目）に、０．２５μｇ／ｍＬのＢ１８Ｒタンパク質（アフィメトリクス・ジャパン株式会社製）を含むSTEM FIT（登録商標）へ培地を交換した。その後、候補遺伝子のｍＲＮＡ、Lipofectamin（登録商標）2000（Life Technologies社製）、Opti-MEM（登録商標）（Life Technologies社製）がそれぞれ１μｇ／３ｃｍ^２、２μＬ／３ｃｍ^２、２００μＬ／３ｃｍ^２となるように培地へ添加、混合し、２時間培養を続けることで、候補遺伝子のｍＲＮＡをＥＳ細胞に導入した（すなわち、１回目の導入）。なお、培養ディッシュ１ｃｍ^２当たりの細胞数は約１万であったため、前述の候補遺伝子のｍＲＮＡの培地への添加量は３３．３３ｐｇ／１cellとなる。

候補遺伝子のｍＲＮＡとして、１種類の候補遺伝子のｍＲＮＡを用いた場合は、１回目の導入の終了から３時間後に、同じ種類の候補遺伝子のｍＲＮＡを（１μｇ／３ｃｍ^２）培地に添加、混合し、２時間培養を続けることで、そのｍＲＮＡのＥＳ細胞への２回目の導入を行った。

一方、候補遺伝子のｍＲＮＡとして、２種類又は３種類の候補遺伝子のｍＲＮＡを用いた場合は、１種類目の候補遺伝子のｍＲＮＡの導入（１回目の導入）の終了から３時間後に、「２種類目の候補遺伝子のｍＲＮＡ（１μｇ／３ｃｍ^２）」、又は、「２種類目及び３種類目の候補遺伝子のｍＲＮＡ（候補遺伝子ｍＲＮＡ１種類につき、１μｇ／３ｃｍ^２）」を培地に添加、混合し、２時間培養を続けることで、「２種類目の候補遺伝子のｍＲＮＡ」、又は、「２種類目及び３種類目の候補遺伝子のｍＲＮＡ」をＥＳ細胞に導入した。

導入した候補遺伝子のｍＲＮＡが１〜３種類のいずれの場合にも、導入初日に行ったｍＲＮＡの導入操作（合計２回の導入）と同じ操作を、その翌日（導入開始後１日目、すなわち、培養開始後２日目）も繰り返した。

なお、ｍＲＮＡを上記方法でＥＳ細胞に導入した場合に、そのｍＲＮＡが細胞内で実際に翻訳されてタンパク質が生成することは、そのタンパク質について蛍光染色することにより既に確認している。また、ｍＲＮＡを導入したことにより生成したタンパク質は、導入から２４時間程度でほとんど無くなることも確認した。

［人工ｍＲＮＡ導入後の細胞の、角化細胞増殖用培地での培養］
ｍＲＮＡの導入開始後２日目（培養開始後３日目）に、ＤＫＳＦＭ培地（Life Technologies社製）に１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）（Peprotech社製）及び１００μｇ／ｍＬのコレラトキシン（List Biological Laboratories社製）を添加した培地へ、培地を交換し、培養を継続した。

［涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現増加の有無の確認］
候補遺伝子のｍＲＮＡを導入した後、上記の［人工ｍＲＮＡ導入後の細胞の、角化細胞増殖用培地での培養］の方法にしたがって、角化細胞増殖用培地で培養した。ｍＲＮＡの導入開始後２日目（day2）（培養開始後３日目）又は５日目（day5）（培養開始後６日目）に細胞を分離し、かかる細胞内で涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現が増加しているかをｍＲＮＡレベル（転写レベル）で確認した。また、陰性対照として、ｍＲＮＡの導入日（培養開始後１日目）の、ｍＲＮＡ導入前の細胞における前記マーカー遺伝子の発現レベル（「hES day0」）や、ｍＲＮＡを導入しなかったこと以外は同様に処理して培養したday6の細胞における前記マーカー遺伝子の発現レベル（「hES DKSFM day6」）も測定した。なお、前述の涙腺上皮細胞マーカー遺伝子としては、Ｐａｘ６、Ｓｉｘ１、Ｆｏｘｃ１、Ｆｏｘｐ１、ＦＧＦ５、ＬＥＦＴＹ２、ＦＧＦ１０、Ｂａｒｘ２、Ｋｒｔ１５、ＡＱＰ５を用いた。

涙腺上皮細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、細胞よりtotal RNAを抽出し、Takara SYBR（日本登録商標）Premix Ex Taq^TM II（Takara Bio）、Thermal Cycler Dice（日本登録商標）Real Time System (Takara Bio)を用いてリアルタイムＰＣＲ法を行うことによって測定した。

上記の［多能性幹細胞への人工ｍＲＮＡの導入］の方法にしたがって、前述の９種類の候補遺伝子のｍＲＮＡを、それぞれ１種類ずつ多能性幹細胞に導入し、次いで、上記の［人工ｍＲＮＡ導入後の細胞の、角化細胞増殖用培地での培養］の方法にしたがって、角化細胞増殖用培地で培養した。しかし、いずれの候補遺伝子のｍＲＮＡを導入した場合も、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現増加は見られなかった。このことから、これら候補遺伝子は１種類のみの発現を増加させても、涙腺上皮細胞へ分化誘導できないことが示された。

次に、９種類の候補遺伝子のうち、２種類ずつの候補遺伝子のｍＲＮＡを導入することを試みた。試みた組合せのうちの一部の組合せと、その場合の涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現増加の有無を以下の表２に記載する。さらに、導入した候補遺伝子のｍＲＮＡが「Ｐａｘ６／Ｆｏｘｃ１」の場合の涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを図１及び２に示し、「Ｐａｘ６／Ｆｏｘｐ１」の場合の涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを図３及び４に示す。なお、候補遺伝子の組合せのうち、左に記載されている遺伝子名が、導入初日の１回目にｍＲＮＡを導入した候補遺伝子であり、右に記載されている遺伝子名が、導入初日の２回目にｍＲＮＡを導入した候補遺伝子である。なお、導入初日の導入操作と同様の操作を、導入の翌日（導入開始後１日目）も繰り返した。

表２及び図１〜４の結果等から分かるように、導入した候補遺伝子のｍＲＮＡが特定の組合せの場合、すなわち、「Ｐａｘ６／Ｆｏｘｃ１」の場合と「Ｐａｘ６／Ｆｏｘｐ１」の場合のみ、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現増加が確認できた。さらに、「Ｐａｘ６／Ｆｏｘｐ１」の場合の涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを確認すると、Ｆｏｘｃ１の発現が増加していることから、ＦＯＸＰ１タンパク質は、シグナル伝達経路において、ＦＯＸＣ１タンパク質よりも上流で機能する転写因子であることが示された。これらの結果から、多能性幹細胞に導入することによって、涙腺上皮細胞へ分化誘導させるのに必須の転写因子は、ＰＡＸ６とＦＯＸＣ１であることが示された。

なお、Ｐａｘ６ ｍＲＮＡ、Ｆｏｘｃ１ ｍＲＮＡをＥＳ細胞に導入した後、上記の［人工ｍＲＮＡ導入後の細胞の、角化細胞増殖用培地での培養］の方法にしたがって、角化細胞増殖用培地で培養した。ｍＲＮＡの導入開始後５日目に細胞を分離し、涙腺上皮細胞マーカータンパク質の発現を免疫組織学的染色法により確認した。その結果、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現に対応する各タンパク質の発現が確認できた。

［３種類の転写因子のｍＲＮＡの導入］
前述の実験により、多能性幹細胞に導入することによって、涙腺上皮細胞へ分化誘導させるのに必須の転写因子は、ＰＡＸ６とＦＯＸＣ１であることが示されたが、その２種の転写因子のｍＲＮＡに加えて、別のもう１種（３種目）の転写因子のｍＲＮＡを導入した場合に、よりよい結果が得られる転写因子があるかどうかを探索した。

３種目の転写因子のｍＲＮＡとして、Ｓｉｘ１、Ｒｕｎｘ１又はＩＬＦ２などのｍＲＮＡを用いた。上記の［多能性幹細胞への人工ｍＲＮＡの導入］の方法にしたがって、３種類の転写因子のｍＲＮＡをＥＳ細胞に導入し、次いで、上記の［人工ｍＲＮＡ導入後の細胞の、角化細胞増殖用培地での培養］の方法にしたがって、角化細胞増殖用培地で培養した。ｍＲＮＡの導入開始後５日目に細胞を分離し、上記の［涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現増加の有無の確認］の方法にしたがって、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを測定した。その結果、３種目の転写因子のｍＲＮＡとして、Ｓｉｘ ｍＲＮＡを用いた場合が好ましいことが示された。Ｐａｘ６ ｍＲＮＡ、Ｆｏｘｃ１ ｍＲＮＡ及びＳｉｘ１ ｍＲＮＡの３種のｍＲＮＡをＥＳ細胞に導入した場合の涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルを図５〜７に示す。Ｐａｘ６ ｍＲＮＡ、Ｆｏｘｃ１ ｍＲＮＡ及びＳｉｘ１ｍＲＮＡの３種のｍＲＮＡをＥＳ細胞に導入した場合は、Ｐａｘ６ ｍＲＮＡ及びＦｏｘｃ１ ｍＲＮＡの２種のｍＲＮＡを導入した場合と比較して、ｄａｙ５のＰａｘ６、ｄａｙ５のＳｉｘ１、ｄａｙ２及び５のＦｏｘｃ１、ｄａｙ５のＢａｒｘ２、ｄａｙ５のＫｒｔ１５、及び、ｄａｙ２のＡＱＰ５の発現が増加していた（図１及び２と、図５及び６参照）。

［特定の３種類の転写因子のｍＲＮＡを導入した場合における、涙腺上皮細胞マーカータンパク質の発現の確認］
特定の３種類の転写因子（ＰＡＸ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ１）のｍＲＮＡをＥＳ細胞に導入し、次いで、角化細胞増殖用培地で培養した細胞において、涙腺上皮細胞マーカーの発現が増加していることは先に述べたとおりである。ｍＲＮＡの導入開始後５日目の細胞において涙腺上皮細胞マーカータンパク質が実際に発現しているかを免疫組織学的染色法により確認した。確認する涙腺上皮細胞マーカータンパク質としては、ＬＴＦ（ラクトフェリン）、ＫＲＴ１５（サイトケラチン１５）、ＡＱＰ５（アクアポリン５）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子１０）、ＢＡＲＸ２を対象とした。かかる免疫組織学的染色の結果を図８に示す。

図８の結果から分かるように、いずれの涙腺上皮細胞マーカータンパク質も、細胞において実際に発現していることが示された。

３．特定の転写因子のｍＲＮＡを導入することによる、ヒトＥＳ細胞の形態変化等の確認
実施例２において、特定の２種又は３種の転写因子のｍＲＮＡを多能性幹細胞に導入した後、角化細胞増殖用培地で培養することにより、涙腺上皮細胞マーカー遺伝子の発現が増加することを述べた。特定の３種の転写因子（Ｐａｘ６、Ｆｏｘｃ１、Ｓｉｘ１）のｍＲＮＡを多能性幹細胞に導入した後、角化細胞増殖用培地で培養した場合の細胞の形態変化を、位相差顕微鏡により観察した結果を図９に示す。図９から分かるように、ｍＲＮＡの導入開始後５日目（Ｄａｙ５）（培養開始後６日目）に、ＥＳ細胞は、涙腺上皮細胞に特徴的な形態、すなわち、細長く外側に向かって伸びる長方形の形態の細胞へと変化を起こした。

同様の形態変化は、特定の３種ではなく、特定の２種（「Ｐａｘ６及びＦｏｘｃ１」）の転写因子のｍＲＮＡを多能性幹細胞に導入した後、角化細胞増殖用培地で培養した場合にも観察されたが、特定の３種の転写因子（Ｐａｘ６、Ｆｏｘｃ１、Ｓｉｘ１）のｍＲＮＡを導入した場合の方が、その形態変化の程度が増幅されており、その形態の変化がより明確であった。したがって、多能性幹細胞を涙腺上皮細胞へ分化誘導する場合には、特定の２種（「Ｐａｘ６及びＦｏｘｃ１」又は「Ｐａｘ６及びＦｏｘｐ１」）のｍＲＮＡを導入するよりも、特定の３種類（Ｐａｘ６、Ｆｏｘｃ１、Ｓｉｘ１）のｍＲＮＡを導入する方が、涙腺上皮細胞系への分化の方向性をより明確にできる点で好ましいことが分かった。

４．得られた涙腺上皮細胞が、涙腺の立体構造再生能を有しているかの確認
転写因子のｍＲＮＡを導入することにより誘導した涙腺上皮細胞が、涙腺器官の立体構造を再生する能力を実際に有しているかどうかを確認することとした。

上記実施例２の［多能性幹細胞への人工ｍＲＮＡの導入］の方法にしたがって、特定の３種類の転写因子（Ｐａｘ６、Ｆｏｘｃ１、Ｓｉｘ１）のｍＲＮＡをＥＳ細胞に導入し、次いで、上記実施例２の［人工ｍＲＮＡ導入後の細胞の、角化細胞増殖用培地での培養］の方法にしたがって、角化細胞増殖用培地で培養した。ｍＲＮＡの導入開始後５日目の細胞を、涙腺上皮細胞として分離した。

背景技術でも述べたように、涙腺器官の形成には、涙腺上皮細胞及び涙腺間葉細胞の両方が必要である。非特許文献１記載の方法にしたがって、胎齢１６．５日のマウス胎仔の涙腺原基を採取し、その涙腺原基の細胞を細胞毎に分離した。これらの細胞と、前述の涙腺上皮細胞とを、立体的に共培養したところ、成熟涙腺（涙腺器官）に類似した立体構造の細胞塊が形成された。その細胞塊を光学顕微鏡で観察した結果を図１０の左上パネルに示し、その細胞塊の凍結切片をヘマトキシリン・エオジン染色した後、光学顕微鏡で観察した結果を図１０のその他のパネルに示す。前述の方法により作製した細胞塊は、図１０から分かるように、成熟涙腺に特徴的な構造である腺房や導管に類似した立体構造を有していることが示された。このことから、本発明の方法によって製造される涙腺上皮細胞は、涙腺器官の立体構造を再生する能力を実際に有していることが示された。

本発明によれば、臨床応用可能な多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）から、短期間で効率良く大量に涙腺上皮細胞を製造することができる。また、本発明により製造された涙腺上皮細胞は、涙腺器官の立体構造を再生する能力を有している涙腺上皮細胞である。将来的に、涙腺上皮細胞だけでなく、涙腺間葉細胞も、多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）から、短期間で効率良く大量に製造することができるようになれば、涙腺器官の再生医療の実現可能性がさらに高まる。本発明における涙腺上皮細胞の製造方法は、その可能性に向けた大きな一歩といえる。

Claims (10)

1. 以下の工程Ａを有することを特徴とする、涙腺上皮細胞の製造方法；
   工程Ａ：多能性幹細胞において、Ｐａｘ６遺伝子の発現を増加させるか又はＰＡＸ６タンパク質を導入し、かつ、Ｆｏｘｃ１遺伝子若しくはＦｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させるか又はＦＯＸＣ１タンパク質若しくはＦＯＸＰ１タンパク質を導入する工程。
   
2. Ｐａｘ６遺伝子の発現を増加させる工程が、ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入する工程であり、Ｆｏｘｃ１遺伝子の発現を増加させる工程が、ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入する工程であり、Ｆｏｘｐ１遺伝子の発現を増加させる工程が、ＦＯＸＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入する工程であることを特徴とする請求項１に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
   
3. 工程Ａの多能性幹細胞において、さらに、Ｓｉｘ１遺伝子の発現を増加させるか又はＳＩＸ１タンパク質を導入することを特徴とする請求項１又は２に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
   
4. Ｓｉｘ１遺伝子の発現を増加させることが、ＳＩＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入することであることを特徴とする請求項３に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
   
5. さらに、前記工程Ａで得られた細胞を角化細胞増殖用培地で培養する工程を含む請求項１〜４のいずれか１に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
   
6. 角化細胞増増殖用培地が、上皮成長因子及び／又はコレラトキシンを含有することを特徴とする請求項５に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
   
7. 角化細胞増殖用培地中のカルシウム濃度が０．１５ｍＭ以下であることを特徴とする請求項５又は６に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
   
8. ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであることを特徴とする請求項２〜７のいずれか１に記載の涙腺上皮細胞の製造方法。
   
9. 以下の（ａ）及び（ｂ）を含み、多能性幹細胞から涙腺上皮細胞への分化誘導用試薬キット：
   （ａ）ＰＡＸ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＰＡＸ６タンパク質：
   （ｂ）ＦＯＸＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド若しくはＦＯＸＣ１タンパク質、又は、ＦＯＸＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド若しくはＦＯＸＣ１タンパク質。
   
10. さらに、（ｃ）ＳＩＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＳＩＸ１タンパク質を含む、請求項９に記載の分化誘導用試薬キット。