JP6762082B2 - 刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた検出対象を検出する方法 - Google Patents

Description

本発明は、刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた検出対象を検出する方法に関する。

クリプトスポリジウムは世界中に広く分布する、種々の動物の消化管に寄生する原虫である。また、本原虫のオーシストは強い塩素耐性を示すためにしばしば水道を介した集団下痢症を引き起こしていることから、クリプトスポリジウムは臨床上あるいは公衆衛生学的に現在最も注目される原虫となっている。

クリプトスポリジウムの検出は、通常、顕微鏡下での目視により行われているが、かかる方法は、操作が煩雑で迅速性が低くかつ検出率も低いため、検出に多大な労力を必要とする。従って、近年、クリプトスポリジウムの研究にも遺伝子学的手法が用いられるようになり、種の同定や型別を比較的容易に行うことができるようになってきている。

従来、環境・生体試料からのオーシストを分離する方法として免疫磁気ビーズ法が用いられている（非特許文献１、２）。免疫磁気ビーズ法に用いられる磁性微粒子は、磁気ビーズに磁気分離能を持たせるために、粒径をマイクロサイズに設計した磁性微粒子（例えば、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標））が用いられている。

また、例えばクリプトスポリジウムの核酸抽出には凍結融解などによる物理的処理や、界面活性剤や酵素などによる化学的処理により抽出が行われている（非特許文献３、４）。この際使用される試薬には、強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液や腐食性の高いフェノール液等の慎重な取り扱いを要するものが含まれている。

ＥＰＡ Ｍｅｔｈｏｄ １６２３（Ｕ．Ｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ） 水道における指標菌及びクリプトスポリジウム等の検査方法について（平成２４年３月２日付け健水発０３０２号 厚生労働省健康局水道課長通知） クリプトスポリジウム症を中心とした原虫性下痢症の診断マニュアル，平成１５年度，国立感染症研究所） Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．１１（１９９５），３８４９−３８５５．

しかしながら、非特許文献１、２に記載の磁性微粒子を用いた免疫磁気ビーズ法を利用して環境・生体試料から標的の微生物を分離する場合、微生物から核酸を抽出する前に、所定の解離液を加えることによって微生物と磁性微粒子とを解離し、磁石で磁性微粒子を固定してから微生物濃縮液を回収する必要があり、作業が煩雑となっていた。

また、非特許文献３、４に記載の核酸を抽出する方法としては、例えば細胞壁や細胞膜を物理的にまたは界面活性剤等で処理して破壊した後、水飽和フェノールやクロロホルム等の有機溶媒を用いてこれらを取り除き、タンパク質を変性させ、核酸を分離する等の多くの工程を必要としていた。従って、抽出した核酸試料中に含まれるこれらの試薬を処理すべく、更なる精製工程を要することとなっており、作業が煩雑となっていた。

そこで本発明は、検出対象の種別を問わず、また慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに簡便に検出対象の検出ができる方法を見出した。すなわち、磁性微粒子を用いて検出対象の分離を行う際に、回収した磁性微粒子と検出対象を解離する必要がなく、そのまま検出対象から核酸を抽出することができ、且つ、得られた核酸試料を、その後の核酸精製等の煩雑な工程を必要とすることなく、そのまま逆転写反応及び／又は核酸増幅試験に課すことのできる、新規な検出対象の検出方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、検出対象に対する親和性物質が結合している刺激応答性磁性ナノ微粒子を用いて検出対象を分離し、その分離された検出対象に陰イオン性界面活性剤を添加し加熱処理を行い、検出対象から核酸を抽出することによって、磁性微粒子と検出対象を分離する工程を経なくても、抽出された核酸をそのまま逆転写反応及び／又は核酸増幅試験に課すことができ、簡便に検出対象の検出ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。

１．被検試料中の検出対象を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（５）を含む検出対象の検出方法。
（１）刺激応答性磁性ナノ粒子及び検出対象に対する親和性物質を有する吸着材と前記検出対象との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
（２）刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
（３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
（４）回収した結合体に陰イオン性界面活性剤を添加し、加熱処理し、検出対象から核酸を抽出する工程
（５）得られた核酸を試料として核酸増幅を行う工程
２．前記核酸増幅を行う工程における、前記陰イオン性界面活性剤の終濃度が、０．０００１〜０．０１質量％である、前記１に記載の検出対象の検出方法。
３．前記陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、コール酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンからなる群より選ばれる少なくとも１の陰イオン性界面活性剤である、前記１または２に記載の検出対象の検出方法。
４．前記核酸増幅を行う工程における、前記刺激応答性磁性ナノ粒子の濃度が、０．１〜１０質量％である、前記１〜３のいずれか１に記載の検出対象の検出方法。
５．前記核酸増幅を行う工程で使用する核酸増幅酵素が、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、又はＡａｃポリメラーゼのいずれかであることを特徴とする、前記１〜４のいずれか１に記載の検出対象の検出方法。

なお、本明細書において、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体を含む概念として用いられているものである。
また、本明細書において、「終濃度」とは、核酸増幅試験時の反応チューブ内の陰イオン性界面活性剤の濃度を示す。

本発明によれば、被検試料の種別を問わず、また慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに簡便に検出対象の分離と核酸抽出を行うことができ、且つ、得られた核酸試料を、その後の核酸精製等の煩雑な工程を必要とすることなく、そのまま逆転写反応及び／又は核酸増幅試験に課すことができる。

図１は、本発明の一実施形態に係る方法における吸着材の概略構成図である。 図２は、ＳＥＴ法後のＴＭ−ＡＣの濃度がＰＣＲに及ぼす影響を示すグラフである。 図３は、オーシストを回収したＴＭ−ＡＣについてＳＥＴ法を行った場合の、ＴＭ−ＡＣの濃度がＰＣＲに及ぼす影響を示すグラフである。

以下、本発明の一実施形態について説明する。
本発明は、被検試料中の検出対象を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（５）を含む検出対象の検出方法である。
（１）刺激応答性磁性ナノ粒子及び検出対象に対する親和性物質を有する吸着材と前記検出対象との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
（２）刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
（３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
（４）回収した結合体に陰イオン性界面活性剤を添加し、加熱処理し、検出対象から核酸を抽出する工程
（５）得られた核酸を試料として核酸増幅を行う工程。

以下各工程について説明する。
（１）刺激応答性磁性ナノ粒子及び検出対象に対する親和性物質を有する吸着材と前記検出対象との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
本発明の検出対象の検出方法は、被検試料中の検出対象から核酸を抽出し、当該核酸を増幅することにより、検出対象の検出を行うものである。本発明においては、検出対象から核酸を抽出するために、まず被検試料中の検出対象を回収する工程を有する。本工程は検出対象回収の第１段階として、吸着材と検出対象の結合体を水溶液中で生成させる工程である。

（被検試料）
被検試料としては、検出対象を含有するものであれば特に限定はされないが、例えば、水道原水、河川水、湖沼水、井戸水、地下水、下水、廃水、プールの水、公園の水等の環境中に存在する水試料、または、牧場土、農地土、湖沼土、河川土等の環境中に存在する土壌試料等の環境試料、ヒト、家畜、ペット等の糞便等の生体試料、飲料食品、生野菜、果物等の食品試料等が挙げられる。

（検出対象）
検出対象としては、核酸を抽出、増幅することにより検出が可能であるものであれば特に限定されず、例えば、動物（ヒトを含む）、植物、微生物（原虫、原生動物等も含む）等の生物を対象とすることが可能である。検出対象としては、例えば、クリプトスポリジウムのようなオーシストを形成した原虫等であっても、本発明の検出対象として適用可能である。

（吸着材）
本発明において吸着材は、検出対象を回収するために用いることができる。吸着材は、刺激応答性磁性ナノ粒子及び検出対象に対する親和性物質を有する。

（刺激応答性磁性ナノ粒子）
本発明においては、被検試料を含む水溶液中の検出対象の回収に刺激応答性磁性ナノ粒子を使用する。刺激応答性磁性ナノ粒子を使用することによって、刺激応答性磁性ナノ粒子と検出対象との結合を解離せずとも、両者が結合したまま検出対象から核酸を抽出し、その後の核酸増幅試験等を実施することができ、簡易に検出対象の検出を行うことができる。

本発明で用いられる刺激応答性磁性ナノ粒子は、刺激応答性ポリマーと磁性物質（磁性微粒子）とを用いて得られる。この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できる磁性ナノ粒子である。刺激は、特に限定されないが、熱、光、酸、塩基、ｐＨ若しくは電気等の様々な物理的、または化学的信号であってよい。

特に、刺激応答性ポリマーとしては、温度変化によって凝集及び分散可能な熱応答性ポリマーが利用できる。なお、熱応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」とも称する）を有するポリマーが挙げられる。熱応答性ポリマーを有する熱応答性磁性ナノ粒子としては、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ（ＪＮＣ株式会社製）が好適に使用できる。

本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、例えば、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、例えば、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーが挙げられる。また、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが挙げられる。

（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。

本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、例えば、アクロイルグリシンアミド、アクロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが挙げられる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド、アクロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。

また、本発明では刺激応答性ポリマーとして、ｐＨ変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマーが利用できる。
このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、例えば、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが挙げられる。より具体的には、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンゼンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドまたはこれらの塩を共重合成分として含むポリマーが挙げられる。

磁性物質である磁性微粒子は、例えば、多価アルコールとマグネタイトとで構成される。

多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体であれば特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール及びシクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８号公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。

このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。また、磁性微粒子の平均粒径が前記範囲であることによって、液体中での分散性が良好となる結果、核酸増幅試験の際に反応液中で磁性微粒子が沈降せず適度に分散し、効率よく逆転写反応や核酸増幅試験を行うことができる。

（親和性物質）
本発明で用いられる親和性物質としては、検出対象に対して結合するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、抗体、アプタマー、カチオン性官能基を有する物質（例えば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモニウム基またはグアニジノ基を有する物質）、アニオン性官能基を有する物質、標的物質と相互作用する蛋白質（例えば、酵素、レセプター）、キレート剤などが挙げられる。

（刺激応答性磁性ナノ粒子と親和性物質との結合）
刺激応答性磁性ナノ粒子と親和性物質との結合方法は、特に限定されないが、例えば、刺激応答性磁性ナノ粒子側（例えば刺激応答性ポリマー部分）及び親和性物質側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、ビオチン及びストレプトアビジンまたはアビジン）を結合させ、これら物質を介して刺激応答性磁性ナノ粒子と親和性物質を結合させる。

具体的には、刺激応答性ポリマーへのビオチンの結合は、国際公開第０１／０９１４１号に記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行い、そこにストレプトアビジンを固定化する。また、親和性物質へのビオチン等の標識は常法に従って行う。ビオチンで標識された親和性物質とストレプトアビジン固定化刺激応答性ポリマーとを混合すると、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して、刺激応答性ポリマー及び親和性物質が結合する。

具体的には、図１に示されるように、刺激応答性磁性ナノ粒子１は微粒子状の磁性物質２を含み、この磁性物質２の表面に刺激応答性ポリマー３が結合されている。刺激応答性ポリマー３にはストレプトアビジン４が結合しており、ビオチン５を介して検出対象７に対する親和性物質６が結合する。

なお、本明細書では、刺激応答性ポリマーと微粒子状の磁性物質とが結合した材料を刺激応答性磁性ナノ粒子と記し、その刺激が熱の場合には、熱応答性磁性ナノ粒子と記している。

微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。

（水溶液中における吸着材と前記検出対象の結合体の生成）
上述した吸着材と検出対象との結合体は、水溶液中で吸着材と検出対象を任意の方法で混合させることによって、吸着材中の親和性物質と検出対象が結合し、吸着材と検出対象の結合体が生成する。親和性物質と検出対象との結合は、特異的な結合ないし吸着を意味し、必ずしも共有結合である必要はなく、イオン的、生化学的親和性（アフィニティー）を利用した結合であってもよい。例えば、抗原と抗体の結合、酵素と基質の結合、キレート剤と金属イオンの結合、アビジン−ビオチン等の特異的な結合が例示できる。混合操作は、適当なバッファー中で、吸着材と検出対象が接触し得るならば制限はない。例えば、検出対象を含む被検試料及び吸着材が供されたチューブを軽く転倒撹拌または振とうさせる程度で十分であり、例えば市販のボルテックスミキサー等を用いて混合する操作等が挙げられる。

（２）刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
本工程は検出対象回収の第２段階として、工程（１）において得られた吸着材と検出対象の結合体において、結合体中の刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、結合体を凝集させる工程である。

刺激応答性ポリマーが凝集する条件とするには、例えば熱応答性ポリマーを用いた場合、混合物の入った容器を熱応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。熱応答性ポリマーには、上限臨界溶液温度を有するポリマーと、下限臨界溶液温度を有するポリマーの２種類がある。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合物の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、熱応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合物の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、熱応答性ポリマーを凝集させることができる。

ここで、下限臨界溶液温度及び上限臨界溶液温度は、例えば以下のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。ＵＣＳＴの場合は、１℃／分の速度で試料を冷却し、以下、ＬＣＳＴ同様の方法で求める。

また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合物の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散している混合物の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合物の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合物の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることがさらに好ましい。

また、光応答性ポリマーを用いた場合、混合物の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０〜８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１〜１０００ｍＷ／ｃｍ^２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、濁度の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、濁度の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。

（３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
本工程は検出対象回収の最終段階として、工程（２）で凝集した結合体を磁石で分離し、検出対象を回収する工程である。磁性粒子を含有する結合体に磁力を付加することで、凝集した結合体を混合液中から分離し、回収する。これにより、結合体が非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離され、検出対象の回収が可能となる。

例えば、検出対象と吸着材との結合を適当なチューブ内で行った場合、チューブの側壁に磁石を外側から近づけることによって吸着材をチューブの側壁近傍に保持しつつ、チューブ内から上澄み部分となる液体を排出することによって、検出対象が結合した吸着材を分離することができる。

検出対象が結合した吸着材の分離に用いる磁石等の磁力は、用いる磁性物質の有する磁力の大きさによって異なる。磁力は、目的の磁性物質を磁集可能な程度の磁力を適宜使用できる。磁石の素材としては、例えば、上述した磁性物質の素材で構成されたものを使用することができる。例えば、ネオジム磁石（株式会社二六製作所製）等が利用できる。ネオジム磁石の磁力は、３８００ガウス以上がより好ましい。

（４）回収した結合体に陰イオン性界面活性剤を添加し、加熱処理し、検出対象から核酸を抽出する工程
本工程は、上記工程（１）〜（３）において回収した結合体中の検出対象から、核酸を抽出する工程である。本発明において、回収した結合体中の検出対象から核酸を抽出するために、結合物に陰イオン性界面活性剤を添加することにより、検出対象と陰イオン性界面活性剤を接触させる。検出対象と陰イオン性界面活性剤を接触させた後に、加熱処理を行い、検出対象から核酸を抽出する。抽出試薬として陰イオン性界面活性剤を用いることにより、細菌類や動物細胞などの任意の種類の細胞に適用することができる。

陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、コール酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン等が挙げられ、核酸抽出力の観点から、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。本発明においては、種々の陰イオン性界面活性剤を１種単独で用いてもよく２種以上を組合せて用いることもできる。

また、抽出試薬として陰イオン性界面活性剤を用いることにより、陰イオン性界面活性剤以外の抽出試薬が必要とならないため、簡便かつ低コストで検出対象から核酸を抽出することができる。さらに、通常、核酸精製の過程においては核酸の損失が生じることがあり、精製後の核酸の回収率は高くても８０％程度であるが、抽出試薬として陰イオン性界面活性剤のみを用いて抽出反応を行うと、核酸精製による核酸の損失を最小限に抑えることができるため、ほぼ１００％の核酸抽出効率を保持することができ、検出効率の向上を達成することが可能となる。

一般に、細胞膜はリン脂質とたんぱく質から構成されているので、陰イオン性界面活性剤がこの細胞膜のリン脂質の脂質二重層の中に入り込み細胞膜を壊れやすくすると考えられ、したがって、動物、植物、微生物の別を問わず、すべての生物由来の検出対象に、本発明の方法を適用することができる。

なお、植物細胞や酵母、カビの仲間、グラム陽性菌など細胞壁を有する生物から核酸を抽出する場合には、必要に応じて、結合体中の検出対象と陰イオン性界面活性剤とを接触させる前に、これらの細胞壁を分解する前処理工程を設けることも可能である。例えば、それらは工程ごとに必要とされる緩衝液等の試薬と共に溶解し密封した液状物（溶液）の原液又は濃縮液として供給されることも可能である。

細胞壁は生物種によってその組成が異なるので、それぞれの組成に応じた細胞壁分解酵素（例えば、セルラーゼ、ザイモリアーゼ、リゾチウム等）を検出対象に接触させ、細胞壁を溶解させる。但し、これらの生物に対して細胞壁分解酵素を作用させなくとも、上記抽出方法によって核酸抽出を行うことができる。

結合体中の検出対象への陰イオン性界面活性剤の接触、加熱処理する工程は、検出対象の細胞膜を十分に破壊するまで複数回繰り返して実施できるものであり、特に核酸増幅試験用の試料の調製等の少量の試料の調製においては、検出対象の種類や量により当該工程に課す時間は異なる。加熱処理は、通常４０〜１００℃、好ましくは８０〜１００℃で処理をする。このとき、ウォーターバスを用いた場合では、通常５〜１２０分間、好ましくは５〜６０分間加熱処理をすることによって、検出対象から十分に核酸を抽出することができる。例えば、９０℃で５〜３０分程度の接触時間があれば十分に、動物由来等の細胞膜を破壊することができる。

陰イオン性界面活性剤の濃度は、検出対象から核酸を抽出した後に、得られた核酸を、後述する核酸増幅等の各種分析に供するのに必要な量と質を抽出できればよく、核酸抽出時の陰イオン性界面活性剤の処理濃度は、高いほど抽出力が高くなる。

後述する工程（５）において該核酸抽出液を核酸増幅に供する際には、陰イオン性界面活性剤の終濃度を、好ましくは０．００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００１〜０．０１質量％とするように希釈する。また、核酸増幅試験時には、前記核酸抽出処理された液を１０〜１００倍に希釈するので、核酸抽出処理時の陰イオン性界面活性剤の濃度は、好適には０．１〜１０質量％、より好適には、０．１〜１質量％の濃度で検出対象と接触させることが、核酸抽出を確実に行う上で好ましく、更なる核酸抽出効率の向上と抽出に要する時間の短縮化を図り、検出感度の向上と迅速な検出を達成するものである。

かかる陰イオン性界面活性剤の核酸抽出処理時の濃度調整は、陰イオン性界面活性剤を例えば水で希釈して、上記０．１〜１０質量％、更に好適には０．１〜１質量％の溶液に調製すればよく、当該溶液に上記結合体を投入して、例えば９０℃、１５分間の接触処理、加熱処理を行って、検出対象から核酸を抽出することが可能である。

後述する工程（５）における逆転写反応や核酸増幅試験において、反応液中の刺激応答性磁性ナノ粒子の濃度が高いと、逆転写反応や核酸増幅を阻害しうる。しかしながら、上述のように、核酸の抽出工程において、検出対象及び刺激応答性磁性ナノ粒子に対し、陰イオン性界面活性剤を添加し、例えば９０℃、１５分間の加熱処理することにより、刺激応答性磁性ナノ粒子による逆転写反応及び核酸増幅の阻害を軽減することができる。

刺激応答性磁性ナノ粒子を検出対象とともに陰イオン性界面活性剤に接触させ、加熱処理をすることによって刺激応答性磁性ナノ粒子による逆転写反応、核酸増幅試の阻害を軽減することができる詳細は定かではないが、刺激応答性磁性ナノ粒子の表面に存在する何らかの核酸増幅の阻害物質が、上記処理により破壊されることによるものと推測される。

陰イオン性界面活性剤は、使用時の濃度が前述した濃度範囲から選ばれる量となるように陰イオン性界面活性剤を含有する水溶液等の溶液状態のものでも、また、当該濃度範囲から選ばれる量となるように陰イオン性界面活性剤を含有する凍結乾燥状態又は乾燥状態のものでもよく、試薬形態については特に限定されない。
また、試薬形態が凍結乾燥状態又は乾燥状態である場合には、必要に応じてそれを溶解するための溶液と組み合わせてもよい。

得られる核酸のうち、例えば、動物由来の検出対象からの核酸としては、血清、血漿等の血液成分からの血中遊離ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ等のＤＮＡ、血中遊離メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられる。

本発明の好適な適用例として、検出対象が微生物の１つであるクリプトスポリジウムを用いて以下、本工程を説明する。
ここで、検出の対象となるクリプトスポリジウムとは、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属に属する微生物を指し、クリプトスポリジウムには具体的には、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ種（以下、Ｃ．ｐａｒｖｕｍと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｕｒｉｓ種（以下、Ｃ．ｍｕｒｉｓと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ種（以下、Ｃ．ｂａｉｌｅｙｉと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｒｐｅｎｔｉｓ種（以下、Ｃ．ｓｅｒｐｅｎｔｉｓと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ種（以下、Ｃ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓと略する。）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｉｓ種（以下Ｃ．ｆｅｒｉｓと略する。）等が含まれ、本発明の方法は、これらの種を種識別的に検出するために用いられる。

オーシストから核酸の抽出は、上述したように陰イオン性界面活性剤で処理すれば足り、従来のように、プロテアーゼ処理や精製処理等の煩雑な工程を実施する必要がない。かかる陰イオン性界面活性剤での核酸抽出処理条件は、好ましくは、例えば、６０〜１００℃にて５〜３０分であり、特に好ましくは９０℃にて１０〜２０分間である。

上述の核酸抽出方法は、界面活性剤抽出処理（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，以下ＳＥＴ）法といい、“第４８回日本水環境学会年会講演集,ｐ.４２１（２０１４）”に記載の方法である。

核酸抽出処理に使用する陰イオン性界面活性剤の濃度は、上記したように、０.１〜１０質量％、好適には、０．１〜１質量％（核酸増幅時に陰イオン性界面活性剤で処理された試料を１０倍希釈する場合）に調整されることが好ましい。上記範囲であることによって、陰イオン性界面活性剤による核酸増幅阻害を抑えることができるからである。

（５）得られた核酸を試料として核酸増幅を行う工程
本工程は、上記工程で得られた核酸を試料として核酸増幅を行う工程である。上述したように、吸着材中の刺激応答性磁性ナノ粒子はその濃度が高いと、逆転写反応や核酸増幅を阻害しうる。しかしながら本発明では、工程（４）において検出対象とともに刺激応答性磁性ナノ粒子を陰イオン性界面活性剤で加熱処理することにより、刺激応答性磁性ナノ粒子による逆転写反応及び核酸増幅の阻害を軽減することができる。また、本発明においては磁性微粒子として分散性に優れた刺激応答性磁性ナノ粒子を使用するため、以下に記載する逆転写反応や核酸増幅試験に使用する反応液に磁性微粒子が残存していても、液中で適度に分散するため、効率よく逆転写反応や核酸増幅試験を行うことができる。

得られた核酸がＲＮＡである場合には、逆転写反応を行いＤＮＡとしてから核酸増幅を行う。逆転写反応は、上記工程（１）〜（４）で得られたＲＮＡを鋳型として、従来の公知の任意の方法を採用することができる。

また核酸増幅の方法としては、任意の方法を使用することができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、逆転写ＳｍａｒｔＡｍｐ法等が挙げられる。

通常ＤＮＡの増幅は、ＰＣＲ法により行うことが一般的である。ＰＣＲの方法としては、上記工程で得られたＤＮＡ、またはＲＮＡの逆転写反応により得られるＤＮＡを鋳型として、従来の公知の任意のＰＣＲ方法を採用することができる。本発明においては、ＰＣＲ増幅時の核酸増幅酵素が、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、又はＡａｃポリメラーゼのいずれかである場合には、特に、好適に利用可能である。

上述したように、陰イオン性界面活性剤は試料中に残存することにより、逆転写反応や核酸増幅の際の阻害物質となる。したがって核酸抽出液を、逆転写反応や核酸増幅を行う際には、陰イオン性界面活性剤の終濃度を、好ましくは０．０００１〜０．０１質量％、より好ましくは０．０００１〜０．００１質量％とするように希釈する。上記範囲であることによって、陰イオン性界面活性剤による核酸増幅阻害を抑えることができるからである。

また、逆転写反応や核酸増幅を好適に行うため、試料中に残存する刺激応答性磁性ナノ粒子は、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．５〜１質量％である。上記範囲であることによって、刺激応答性磁性ナノ粒子による核酸増幅阻害を軽減することができる。

（増幅したＤＮＡ断片を検量して、被検試料中の検出対象の存在の有無を判定する工程）
本工程は、工程（５）の後にさらに加えられることが好ましい。本工程は、工程（４）で増幅したＤＮＡ鎖断片（ＰＣＲ増幅産物）を検量して、被検試料中の検出対象の存在の有無を判定する。

本工程における解析法は、ＰＣＲ増幅産物の検出または定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法等が挙げられる。電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、およびその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行なうことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレッショード値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショード値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット配列領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。

また、複数種の検出対象に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の検出対象を検出することができる。また、特定の検出対象に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の検出対象を検出することができる。

ＰＣＲの条件は、ＰＣＲの原理にのっとった特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。

本発明の方法によって生菌を検出する場合、ＰＣＲ増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量および増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生菌の有無または定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各ステップを行なって作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＲＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡを標準試料として用いることもできる。

本発明を以下の実施例等により説明するが、これらによって制限されるものではない。
但し、「％」は「質量％」を示す。

＜試験例１＞
試験例１では、ＳＤＳ溶液で加熱処理された刺激応答性磁性ナノ粒子が、リアルタイムＰＣＲに及ぼす影響について評価した。

［参考例１−１］
（１）オーシスト回収用磁性ナノ粒子（ＴＭ−ＡＣ）の作製
アビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子（Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＡ Ａｖｉｄｉｎ，４ｇ／ｌ，ＪＮＣ株式会社）１ｍｌとＣ．ｐａｒｖｕｍオーシストに特異的なビオチン化モノクローナル抗体（Ｃｒｙｐｔ−ａ−Ｇｌｏ ｂｉｏｔｉｎ ｒｅａｇｅｎｔキット（２０倍濃縮），Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ社）２０μｌを混合・結合させて、オーシスト回収用磁性ナノ粒子（Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ−Ａｎｔｉ−Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ：ＴＭ−ＡＣ）を作製した。

（２）ＴＭ−ＡＣに対するＳＥＴ法（界面活性剤抽出処理法）の実施
（１）で作製したＴＭ−ＡＣとＳＤＳ（終濃度０．１％）をマイクロチューブに投入し、ウォーターバスで加熱処理（９０℃，１５分）することにより、ＴＭ−ＡＣに対してＳＥＴ法（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ法（界面活性剤抽出処理法））を実施した。

（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＴＭ−ＡＣの終濃度を０．１％に調製し、ＤＮＡ試料とともに、リアルタイムＰＣＲを行った。
＜ＤＮＡ試料＞
クリプトスポリジウムのＤＮＡ試料として、人工合成ＤＮＡ（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ，１９２ｂｐ）（ｔｔｔａ ｔｇｇａａｇｇｇｔｔ ｇｔａｔｔｔａｔｔａ ｇａｔａａａｇａａｃ ｃａａｔａｔａａｔｔ ｇｇｔｇａｃｔｃａｔ ａａｔａａｃｔｔｔａ ｃｇｇａｔｃａｃａｔ ｔａａａｔｇｔｇａｃ ａｔａｔｃａｔｔｃａ ａｇｔｔｔｃｔｇａｃ ｃｔａｔｃａｇｃｔｔ ｔａｇａｃｇｇｔａｇ ｇｇｔａｔｔｇｇｃｃ ｔａｃｃｇｔｇｇｃａ ａｔｇａｃｇｇｇｔａ ａｃｇｇｇｇａａｔｔ ａｇｇｇｔｔｃｇａｔ ｔｃｃｇｇａｇａｇｇ ｇａｇｃｃｔｇａ：配列番号１）が挿入されたＤＮＡプラスミド溶液（ユーロフィンジェノミクス社）を用いた。

＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲはクリプトスポリジウム１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセット
ｆｏｒｗａｒｄ：５’− ＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号２）、ｒｅｖｅｒｓｅ：５’− ＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＡ−３（配列番号３）（各５μＭ）０．８μｌとＴａｑＭａｎプローブ：ＴＣＴＧＡＣＣＺＡＴＣＡＧＣＴＴ（配列番号４）（１μＭ）２．０μｌ、ＰＣＲ試薬Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）１０μｌ、リアルタイムＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ，ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて行った。陽生対照（５×１０^６ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）の添加量は２μｌ、ＰＣＲの反応液量は２０μｌで行った。
ＰＣＲ条件は「Ｈｏｌｄ；１ｃｙｃｌｅ（９５℃、３０ｓ），２Ｓｔｅｐ ＰＣＲ；４５ｃｙｃｌｅｓ（６０℃、３０ｓ，９５℃、１０ｓ）」で行った。Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ ソフトウェアで解析した。

［参考例１−２］
参考例１−２は、ＴＭ−ＡＣに対するＳＥＴ法を行わなかったこと以外は、参考例１−１と同様に試験を行った。
［参考例２−１、参考例２−２］
参考例２−１は、ＴＭ−ＡＣの終濃度を０．５％に調製したこと以外は、参考例１−１と同様に試験を行った。参考例２−２は、ＴＭ−ＡＣに対するＳＥＴ法を行わず、ＴＭ−ＡＣの終濃度を０．５％に調製したこと以外は、参考例１−１と同様に試験を行った。
［参考例３−１、参考例３−２］
参考例３−１は、ＴＭ−ＡＣの終濃度を１．０％に調製したこと以外は、参考例１−１と同様に試験を行った。参考例３−２は、ＴＭ−ＡＣに対するＳＥＴ法を行わず、ＴＭ−ＡＣの終濃度を１．０％に調製したこと以外は、参考例１−１と同様に試験を行った。
［対照例１、２］
対照例１は、ＴＭ−ＡＣの終濃度を０％としたこと以外は、参考例１−１と同様に試験を行った。対照例２は、ＴＭ−ＡＣに対するＳＥＴ法を行わず、ＴＭ−ＡＣの終濃度を０％としたこと以外は、参考例１−１と同様に試験を行った

参考例１−１、２−１、３−１としてＳＥＴ後のＴＭ−ＡＣがリアルタイムＰＣＲに及ぼす影響の評価結果（黒四角：ＳＥＴあり）、及び参考例１−２、２−２、３−２として、ＳＥＴなしのＴＭ−ＡＣの結果（白四角：ＳＥＴなし）を、図１に示した。縦軸のＣｔ値はＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表している。ＰＣＲ増幅産物の量が多いほどＣｔ値は小さくなり、増幅されない場合は検出されない。

参考例１−１のＳＥＴ後ＴＭ−ＡＣ添加０．１％からわかるように、ＳＥＴによるＰＣＲ阻害はみられなかった。また、参考例２−１のＳＥＴ後０．５％ＴＭ−ＡＣのＣｔ値が２１．８であったことから、０．５％ＴＭ−ＡＣによるＰＣＲ阻害がＳＥＴによって抑制されたことがわかった。さらに、参考例３−１と参考例３−２を比べると、１％ＴＭ−ＡＣのＰＣＲ阻害もＳＥＴにより抑制され、Ｃｔ値は０．５％ＴＭ−ＡＣと同じ値であった。

この結果より、ＳＥＴ後ＴＭ−ＡＣを用いたＰＣＲでは、ＴＭ−ＡＣによるＰＣＲ阻害を軽減できることが示された。また、ＰＣＲチューブ（反応液２０μｌ）にＳＥＴ後ＴＭ−ＡＣを０．２μｌ（ＴＭ−ＡＣ終濃度１％）直接投入しても、阻害されることなくＰＣＲを行えることがわかった。

＜試験例２＞
試験例２では、ＴＭ−ＡＣを用いてクリプトスポリジウムオーシストを回収し、回収したオーシストとともにＴＭ−ＡＣに対しＳＥＴ法を行い、オーシストからＤＮＡを抽出後、ＴＭ−ＡＣとともにリアルタイムＰＣＲ法を行いオーシストの検出感度を評価した。
［実施例１〜３］
（１）クリプトスポリジウムオーシストの回収
オーシスト含有水（１０^５個／７５０ｍｌ）に上記のＴＭ−ＡＣ １００μｌを添加し、ゆっくり回転（１８ｒｐｍ）させながら室温で１５分間インキュベーションしてＴＭ−ＡＣとオーシストの結合体を作製した。４２℃で１分間加温した直後、磁石盤にマイクロチューブをセットし１分間以上置き、ＴＭ−ＡＣとオーシスト結合体を磁気分離した。磁気分離後、上清を除去した。

（２）回収したＴＭ−ＡＣとオーシスト結合体に対するＳＥＴ法（界面活性剤抽出処理法）の実施
回収したＴＭ−ＡＣとオーシスト結合体が入っているマイクロチューブに氷浴で冷えているＳＤＳ（終濃度０．１％）含有ＴＥバッファー（ｐＨ８．０、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＴＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ_２）１００μｌ投入してＴＭ−ＡＣを分散させた（最初のＴＭ−ＡＣ濃度とほぼ同じ濃度に調製する）。その後、ウォーターバスで加熱処理（９０℃，１５分）することにより、ＳＥＴ法（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ法（界面活性剤抽出処理法））を実施し、オーシストからＤＮＡを抽出した。

（３）リアルタイムＰＣＲの実施
上記ＳＥＴ法で得られたＤＮＡ抽出液（ＳＤＳ０．１％、ＴＭ−ＡＣ１００％（製品濃度とほぼ同じ）、オーシスト１０００個／μｌ）を１０〜１０００倍希釈することによってＰＣＲ反応液を表１に示す濃度となるよう調整し、リアルタイムＰＣＲを行った。
＜ＤＮＡ試料＞
クリプトスポリジウムのＤＮＡ試料としては、上記オーシストから抽出したＤＮＡを使用した。陽性対照としては、オーシストの陽生対照として、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍオーシストをマウスに経口投与して感染させ、マウスの糞便から密度勾配遠心法を用いて回収された定量済みオーシスト（Ｉｏｗａ Ｉｓｏｌａｔｅ，Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ社）を用いた。

＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲはクリプトスポリジウム１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセット（各５μＭ）０．８μｌとＴａｑＭａｎプローブ（１μＭ）２．０μｌ、ＰＣＲ試薬Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）１０μｌ、リアルタイムＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ，ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて行った。陽生対照（５×１０^６ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）の添加量は２μｌ、ＰＣＲの反応液量は２０μｌで行った。
ＰＣＲ条件は「Ｈｏｌｄ；１ｃｙｃｌｅ（９５℃、３０ｓ），２Ｓｔｅｐ ＰＣＲ；４５ｃｙｃｌｅｓ（６０℃、３０ｓ，９５℃、１０ｓ）」で行った。Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ ソフトウェアで解析した。

オーシストを回収したＴＭ−ＡＣからＳＥＴ法でＤＮＡを抽出後、ＤＮＡの検出感度を評価した。ＰＣＲに用いた試料の詳細を表１、リアルタイムＰＣＲの結果を図２に示した。
実施例１の希釈率１／１０の試料（オーシスト２００個）は、ＰＣＲを阻害する１％ＴＭ−ＡＣを含んでいるが、ＳＥＴにより阻害が抑制されてＤＮＡが検出された。また、実施例２のオーシスト２０個の試料（希釈率１／１００）、実施例３のオーシスト２個の試料（希釈率１／１０００）からもＤＮＡを検出することができた。オーシストの減少に伴いＣｔ値は増加し、各希釈率のＣｔ値とオーシスト数には相関がみられた。
この結果より、ＴＭ−ＡＣでオーシストが効率よく回収され、さらにＴＭ−ＡＣとオーシストの混合物からＳＥＴ法でＤＮＡを抽出できることが示された。また、ＰＣＲチューブ（反応液２０μｌ）にＳＥＴ後ＴＭ−ＡＣ ０．２μｌ（ＴＭ−ＡＣ終濃度１％）を直接投入し、ＤＮＡ精製工程なしでＰＣＲを行えることがわかった。

本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。

１ 刺激応答性磁性ナノ粒子
２ 磁性物質
３ 刺激応答性ポリマー
４ ストレプトアビジン
５ ビオチン
６ 親和性物質
７ 検出対象

Claims (3)

1. 被検試料中の検出対象を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（５）を含む検出対象の検出方法。
   （１）熱応答性磁性ナノ粒子及び検出対象に対する親和性物質を有する吸着材と前記検出対象との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
   （２）熱応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
   （３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
   （４）回収した結合体にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加し、加熱処理し、検出対象から核酸を抽出する工程
   （５）得られた核酸を試料として核酸増幅を行う工程（ただし、前記（５）核酸増幅を行う工程における、前記熱応答性磁性ナノ粒子の濃度は、０．５〜１質量％である。）
2. 前記核酸増幅を行う工程における、前記ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の終濃度が、０．０００１〜０．０１質量％である、請求項１に記載の検出対象の検出方法。
3. 前記核酸増幅を行う工程で使用する核酸増幅酵素が、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、又はＡａｃポリメラーゼのいずれかであることを特徴とする、請求項１または２に記載の検出対象の検出方法。

Images