JP6769871B2 - Ｅ．ｃｏｌｉ感染のファージを用いての治療 - Google Patents

Description

本発明は、新規バクテリオファージ、それを含む組成物、その製造、及びその使用に関する。本発明は特に、哺乳動物における感染の処置に、及び該被験体における細菌叢を改変することによって被験体の状態を改善するのに適している。

発明の背景
バクテリオファージ（又はファージ）は、細菌に感染し死滅させる能力を示す小さなウイルスであるが、それらは他の生物に由来する細胞には影響しない。ほぼ１世紀前にWilliam Twortによって初めて記載され、それとは別にその後すぐにFelix d’Herelleによって発見された、細菌ウイルス及び古細菌ウイルスをはじめとする６０００個を超える様々なバクテリオファージが発見され形態学的に記載されている。これらのウイルスの大半は尾を有しているが、ウイルスのごく一部は多角体、線維状、又は多形性である。それらは、その形態、そのゲノム含量（ＤＮＡ対ＲＮＡ）、その特定の宿主、生息している場所（海洋ウイルス、対、他の生息地）、及びその生活環に従って分類され得る。細菌細胞の細胞内寄生虫として、ファージは、細菌宿主内で様々な生活環を示す：溶菌性感染、溶原性感染、偽溶原性感染、及び慢性感染（Weinbauer, 2004; Drulis-Kawa, 2012）。溶菌性ファージは、その生活環の正常な一部として、宿主細菌細胞の溶菌を引き起こす。溶原性ファージ（テンペレートファージとも呼ばれる）は、溶菌生活環を用いて複製し、宿主細菌の溶菌を引き起こすことができるか、又は、そのＤＮＡを宿主細菌ＤＮＡに組み込んで、非感染性プロファージとなることができる。ファージ生活環の種類がどのようなものであれ、最初の工程は、細菌細胞壁の受容体への付着であり、その後、ファージは細菌に侵入し得る。この特定のプロセスが、ファージと細菌の起こり得る相互作用の範囲に影響を及ぼす。

バクテリオファージは、臨床実験において細菌を改変するための研究ツールとして一般的に使用されている。

その標的宿主細胞に対する特異性のために、急性感染及び慢性感染を処置するための治療法としてのファージの使用が、特に、皮膚科、眼科、泌尿器科、口腔医学科、小児科、耳鼻咽喉科、又は外科において考えられている。しかしながら、細菌感染の処置のためにファージを治療使用するというこの概念は、非常に初期から非常に議論の余地があり、大衆又は医学会によって広く受け入れられていなかった。初期の研究は、適切な対照がないこと及び矛盾した結果のために広く批判されていた。公表された様々な研究で得られた再現性の欠如及び多くの矛盾した結果により、米国医師会の薬学化学審議会は、溶菌性濾液の治療価値についての証拠は、大部分において矛盾し、説得力がないと結論付け、その主張する利点を確認するための追加の研究を勧告した。

１９４０年代に抗生物質が導入されて以来、特に西洋世界では治療薬のこの分野に対して殆ど注意が払われなかった。しかし抗生物質の広範な使用は、世界中に抗生物質耐性菌の広範な出現及び蔓延をもたらし、ますます深刻な問題を引き起こしている。それ故、主要な多剤耐性菌の処置のために残されている限定された治療選択肢を打破することは、大きな治療上の課題となっている。

さらに、多くの病原性微生物はバイオフィルム内に住み、このバイオフィルムは、新規な抗菌剤を設計する場合にさらなる問題を引き起こす。これに関して、単細胞（「プランクトン」）形ではなくバイオフィルムとして増殖している細菌は、抗菌剤に対して特に耐性である傾向があり、また、宿主免疫系が適切な免疫応答を与えるのが特に困難である傾向がある。

エシェリキア属及び腸内細菌科に属するグラム陰性で短い桿状の細菌であるE.coliは、ヒト又は動物の微生物叢において高度な多様性及び出現頻度を示す。E.coliの大半の株は非病原性であるが、それらは日和見感染を引き起こす可能性があることが判明した。さらに、いくつかのE.coli株は非常に病原性が高く、ヒトをはじめとする哺乳動物において多様な疾病及び敗血症を引き起こす可能性がある。いくつかの報告では、腸内細菌エシェリキア・コリを、全ての年齢群において最もよく見られる感染症の１つである皮膚軟部組織感染症（ＳＳＴＩ）と関連付けている。いくつかの中程度又は重度の症例では、これらの感染は入院及び非経口療法を必要とする。E.coliは特に、新生児臍炎（Fraser and al, 2006）、下肢又は上肢に局在する蜂巣炎（Brzozowski and al, 1997, Corredoira and al, 1994）、壊死性筋膜炎（Afifi and al, 2008; Krebs and al, 2001）、手術部位における感染（Tourmousoglou and al, 2008）、火傷後の感染（Rodgers and al, 2000）、及びその他の原因物質であることが判明した。７年間の期間中のＳＳＴＩをモニタリングし、３つの大陸（欧州、南米、及び北米）を包含するする研究は、E.coliが重要な原因物質であることを示した。なぜなら、それは、３番目に最も多く広まっている単離された種であったからである。それ故、E.coliは、特に、近年、病原性E.coli株の抗生物質に対する感受性が劇的に低下していること、その多様性、及び微生物叢においてそれがかなり存在していることを考慮して、特異的な標的化療法に値する。

さらに、E.coli細菌は、抗生物質に対する耐性の増加の原因であるバイオフィルムを形成することができる。このようなバイオフィルムは、分泌された細胞外マトリックスによって支持され囲まれた１種類を超える細菌を含み得、細菌が様々な表面にコロニーを形成することを支援し得る。バイオフィルムは、細菌が表面に付着して個体群密度を得ることを可能とし（これはバイオフィルムがなければ支持できないであろう）、抗生物質に対してだけでなく、毒素、例えば重金属、漂白剤、及び他の洗剤をはじめとする多くの環境ストレスに対する耐性の増加も付与する。バイオフィルム内の細菌は、プランクトン形で増殖している同じ株の細菌よりも、抗生物質に対して１００〜１０００倍耐性が高くあり得ることが知られている。このような耐性の増加は、臨床検査で抗生物質に対して明らかに感受性である細菌が、臨床の場では療法に対して耐性であり得ることを意味する。いくつかの細菌が排除されたとしても、抗生物質がもはや存在しなくなったら、バイオフィルムは、迅速なコロニー形成を許容する耐性のあるレザバーを提供し得る。それ故、バイオフィルムが多くのヒト疾病において主要な因子であることは明らかである。化学的処理をバイオフィルムに対して使用するのは適していない。なぜならこのバイオフィルムこそがまさに対抗するために進化したものだからである。物理的剥離は、バイオフィルムを破壊する手段を提供する。残念なことに、バイオフィルムが細菌による発病を支援している場所である多くの表面、すなわち骨、関節、埋め込まれた医療器具などは、厳しい剥離にはあまり適していない。例えば、創傷又は火傷の表面は極めて敏感でデリケートである。剥離が適切でありかつ日常的に使用される場所でさえも、バイオフィルムの排除は限定される。歯の表面上の歯垢はバイオフィルムであり、定期的な歯ブラシによって部分的に排除される。しかしながら、細菌はブラシのかけられていない表面上（例えば歯と歯の間の隙間）に残り、掃除された表面に迅速かつ効果的に再度コロニーを形成することができる。このことから、バイオフィルムを排除する既存のアプローチは効力が僅かであることが明らかである。

迅速な適応能及びそのバイオフィルム形成能は、E.coliが日和見病原体として同定される主な理由である。それらは院内病原体の地位を獲得し、創傷、痰、膀胱、尿道、膣、耳、眼、及び気道から採取された臨床試料から単離され得る。このような臨床的なE.coli株において、処置の最中にさえ起こる、最も強力な新規抗生物質に対する耐性の出現により、E.coli院内病原体との戦いは大きな問題となる。

さらに、被験体の病理学的又は生理学的状態は、被験体の細菌叢における微生物のバランスによって影響を受けることが報告されている。したがって、E.coli個体群を破壊することによって、微生物叢を改変すること、又は該バランスを改変すること、又は該バランスを回復することもまた、被験体の状態を改善するための価値あるアプローチである。

それ故、ヒト又は動物の治療に使用するのに適した、並びに材料を除染するのに適した、細菌バイオフィルム中に構成されている場合でさえも、E.coli株を破壊するために使用することのできる、新規な抗菌剤又は抗菌組成物が非常に必要とされる。

発明の概要
本発明者らは、E.coliに対する特異的な溶菌活性を示し、特にエシェリキア・コリ（E.coli）細菌感染を処置するための又は被験体における微生物のバランスを改変するための、医薬調製物又は獣医学的調製物中の活性成分として使用することのできる、新規バクテリオファージを単離し特徴付けた。本発明の新規バクテリオファージは、強力な溶菌活性、高い選択性を示し、そして、非常に広域なE.coli細胞の制御された破壊を誘導するために組み合わせることができる。

本発明の目的は、エシェリキア・コリ株に対して溶菌活性を有する少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのバクテリオファージを含む抗菌組成物を提供することであり、該バクテリオファージは、配列番号１〜１５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択される。

本発明のさらなる目的は、エシェリキア・コリ株に対して溶菌活性を有するバクテリオファージに関し、該バクテリオファージは、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性、好ましくはそれに対して少なくとも９７％の同一性を有する配列を含むゲノムを有する。具体的な実施態様では、本発明のバクテリオファージは、多剤耐性株、特に抗生物質に耐性である病原性E.coli、例えば好ましくは広域スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）株、又はベロ毒素産生E.coli（ＶＴＥＣ）株に対して溶菌活性を示す。

本発明の別の目的は、それぞれ配列番号１〜１５のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６又はＢＰ１２２９から選択されたバクテリオファージ及びその変異体に関し、該変異体は、該バクテリオファージに特徴的な表現型を保持し、該バクテリオファージ及びその変異体はE.coli株に対して溶菌活性を有する。

本発明の別の目的は、上記に定義されているような少なくとも１つのバクテリオファージを含む組成物に存する。特定の実施態様では、本発明の組成物は、上記に定義されているような少なくとも２つの明確に異なるバクテリオファージ、好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは上記に定義されているような少なくとも４つの明確に異なるバクテリオファージを含む。本発明の具体的な組成物は、バクテリオファージＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及びＢＰ１２２９の全ての組合せを含む。

別の態様では、本発明は、病原性E.coli株に対して溶菌活性を有するバクテリオファージに関し、該バクテリオファージは、E.coliに対して特異的であり、抗生物質耐性のE.coli株に対して活性であり、１５未満の産生溶菌作用を有する。

本発明はさらに、本発明のバクテリオファージに含有されている単離された核酸配列、及び、前記の単離された核酸によってコードされる単離されたポリペプチドに関する。

本発明の別の目的は、上記に定義されているようなポリペプチドを含む組成物である。

本発明のさらなる目的は、上記に定義されているような核酸を含む組成物である。

本発明の組成物は、典型的にはさらに、薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤又は担体を含む。それらは、液体、半液体、固体であっても、又は凍結乾燥されていてもよい。

本発明の別の目的は、哺乳動物における感染の処置に使用するための、哺乳動物における微生物叢を改変するための、材料を除染するための、及び／又はE.coli細菌を殺菌するための、又は細菌のバイオフィルムの完全性を損なわせるための、上記に定義されているようなバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド、又は組成物に関する。

本発明はまた、被験体における微生物叢を改変することによって、該被験体の状態を改善するための１つ又はいくつかの溶菌性バクテリオファージの使用に関する。微生物叢を、前記の叢における微生物の適切なバランスを修正、適応、又は回復させることによって改変させ得る。

本発明はまた、哺乳動物に、上記に定義されているような少なくとも１つのバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド、又は組成物を投与することを含む、該哺乳動物における感染を処置するための方法に関する。

本発明はまた、E.coli細菌に汚染されていることが疑われる表面又は材料を処理するための方法に関し、該表面又は材料に、上記に定義されているような少なくとも１つのバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド、又は組成物を適用することを含む。表面又は材料は、例えば、任意の器具、容器、又は実験材料、布地などの表面であり得る。

本発明の別の目的は、被験体におけるバクテリオファージ療法の効力を予測又は決定するための方法に関し、該方法は、該被験体の試料に由来するE.coli株に対する、本発明の１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性をインビトロで決定する工程を含み、該試料に由来する少なくとも１つのE.coli株に対する本発明の１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性は効果的な処置を示す。該方法はさらに場合により、被験体を、該被験体の試料に由来するE.coli株に対して溶菌活性を有する少なくとも１つのバクテリオファージで処置する工程を含む。

別の態様では、本発明は、被験体を選択するか又は被験体がバクテリオファージ療法から恩恵を受けやすいかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は、該被験体の試料に由来するE.coli株に対する、本発明の１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性をインビトロで決定する工程を含み、少なくとも１つのE.coli株に対する本発明の１つ以上の該バクテリオファージの溶菌活性は、応答被験体であることを示す。

本発明は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトにおいて使用され得るか、又は、実験材料若しくは医療器具をはじめとする任意の材料を処理するために使用され得る。

様々なＭＯＩのE.coli株の組合せに対する、本発明のバクテリオファージのインビトロでの効力。 様々な用量のE.coli株の組合せに対する、本発明のバクテリオファージのインビボでの効力。 インビボでＳＨ１１３ E.coli株により媒介される感染に対する、本発明のバクテリオファージの効力。ΦＩＶ：静脈内処置；ΦＩＰ；腹腔内処置；ΦＳＣ：皮下処置；Ｔｅｍｐ Ｉｎｆ．：感染し処置されていない対照；Ｔｅｍ Ｇｅｎｔａ．：感染しゲンタマイシンにより処置された対照。 インビボでＳＨ１１３ E.coli株により媒介される感染に対する、本発明のバクテリオファージの効力：用量の効果。Φｃｏｎｃ．：完全な濃度（１０^８ｐｆｕ/ml）；Φ１／１０：１０倍希釈濃度；Φ１／１００：１００倍希釈濃度；Φ１／１０００：１０００倍希釈濃度；Ｔｅｍ Ｉｎｆｅｃｔ．：感染し抗生物質により処置された対照。

発明の詳細な説明
本発明は、新規バクテリオファージ、その成分、それを含む組成物、その製造、並びに、特に哺乳動物における感染の処置のための、及び被験体における微生物叢を改変させることによって該被験体の状態を改善するための抗菌剤としてのその使用に関する。

定義
本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下において定義する。

本明細書において使用される「バクテリオファージ」又は「ファージ」という用語は、タンパク質性のエンベロープ又はキャプシドにパッケージングされた核酸ゲノムを含む、機能的ファージ粒子をいう。この用語はまた、実質的に同じ機能的活性を与える、例えばヘッド部分をはじめとするバクテリオファージの一部、又はファージ成分のアセンブリーをいう。

「表現型特徴」という用語はより好ましくは、バクテリオファージの形態及び／又は宿主域を示す。バクテリオファージの表現型を決定するための方法はそれ自体当技術分野において周知であり、例えば、細菌宿主域及び／又は特定の細菌株によって産生されるバイオフィルムに対する活性を決定することを含む。

本発明において使用される「溶菌活性」という用語は、細菌細胞の溶菌を引き起こすバクテリオファージの特性を示す。バクテリオファージの溶菌活性は、当技術分野においてそれ自体公知の技術に従ってE.coli株に対して試験することができる（実験章を参照されたい）。

基準のバクテリオファージの「変異体」という用語は、前記の基準のバクテリオファージと比較して、ゲノム配列及び／又はそれによってコードされるポリペプチド（群）において変異（群）を有しているが、基準のバクテリオファージと同じ表現型特徴を保持している、バクテリオファージを示す。変異体は典型的には、例えばサイレント突然変異、保存的突然変異、遺伝子材料の少数の欠失及び／又は少数の複製を含み、そして、基準バクテリオファージの表現型特徴を保持している。好ましい実施態様では、本発明の変異体は、本発明のバクテリオファージのゲノムに依存する任意の観察可能な特徴又は特性、すなわち、該バクテリオファージの表現型特徴及び／又はE.coli株に対する溶菌活性を保持している。好ましい変異体は、基準バクテリオファージのゲノムと比較して５％未満、さらにより好ましくは４％未満、より好ましくは２％未満の核酸変異を有する。変異体は代替的に又は組み合わせて、好ましくは、基準バクテリオファージのポリペプチドと比較して、コードされたポリペプチド配列において５％未満のアミノ酸変異を有する。

核酸配列に関連した「同一性％」という用語は、前記配列間の同一性又は相同率のレベルを示し、当技術分野においてそれ自体公知の技術によって決定され得る。典型的には、２つの核酸配列間の同一性％は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されたＧＡＰなどのコンピュータープログラムを用いて決定される（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）（Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453）。例えばＤＮＡ配列に対し設定を調整する場合（特に５．０のＧＡＰ作成ペナルティ、及び０．３のＧＡＰ伸張ペナルティ）、核酸分子を互いに、ＧＣＧプログラムパッケージの一部として入手可能であるパイルアップアラインメントソフトウェアを使用してアラインさせ得る。

核酸の「フラグメント」という用語は典型的には、該核酸の少なくとも１０個連続したヌクレオチド、より好ましくは該核酸の少なくとも１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、又は５０個以上連続したヌクレオチドを有するフラグメントを示す。

ポリペプチドの「フラグメント」という用語は典型的には、該ポリペプチドの少なくとも５個連続したアミノ酸、より好ましくは該ポリペプチドの少なくとも１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、又は５０個以上連続したアミノ酸を有するフラグメントを示す。

「ＥＳＢＬE.coli株」という用語は、抗生物質耐性のE.coli、より具体的には広域β−ラクタマーゼ産生E.coli株をいう。

「ＶＴＥＣ」という用語は、別の種類の抗生物質耐性E.coli株、より具体的にはベロ毒素産生E.coli株をいう。

バクテリオファージに関連して「特異的」又は「特異性」という用語は、該バクテリオファージが感染することのできる宿主の種類をいう。特異性は、細胞上に発現された受容体との相互作用に関与している、バクテリオファージの尾部繊維によって通常媒介される。E.coliに対して「特異的な」バクテリオファージはより好ましくは、１つ又はいくつかのE.coli株に感染することができ、生理学的条件下でE.coliではない細菌には感染することができない、バクテリオファージを示す。

本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、例えば５〜２０アミノ酸の小さなペプチド、より長いポリペプチド、タンパク質、又はそのフラグメントをはじめとする、任意のサイズのポリペプチドをいう。

「ＰＬＥ」すなわち「産生溶菌作用」という用語は、所与のバクテリオファージのバーストサイズと産生溶菌時間との間の比を示す。バーストサイズ及び産生溶菌時間は、ファージ−宿主の相互作用を規定するパラメーターであり、それぞれ、１つのファージによる１つの細菌の感染によって産生されたバクテリオファージ粒子の平均収量、及び、遊離バクテリオファージが細菌細胞を溶菌するのに要する時間に相当する。

本明細書の内容において、「単離されたバクテリオファージ」という用語は、それが自然に存在するその元来の環境から取り出された材料を意味すると考えるべきである。バクテリオファージに関連して、その用語は、特に、それが天然に位置する環境とは離れて例えば育成、精製、及び／又は培養されたファージを示す。核酸又はポリペプチドに関連して、「単離された」という用語は、その天然環境の成分の中の少なくともいくつかの成分、例えばタンパク質、脂質、及び／又は核酸から分離された、例えば核酸分子又はポリペプチドを示す。

本明細書において使用される「薬学的に又は獣医学的に許容される」という用語は、哺乳動物被験体において使用するのに適合性である、任意の材料（例えば担体、賦形剤、又はビヒクル）をいう。このようなものとしては、有害ではないか、又は生物に対して全く有意な特異的若しくは非特異的な免疫反応を引き起こさないか、又は活性化合物の生物学的活性を消失させない、生理学的に許容される溶液若しくはビヒクルが挙げられる。組成物を液体調製物へと製剤化するために、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、アルブミン輸液、デキストロース液、マルトデキストリン液、グリセロール、エタノール、及びその混合物を、薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤又は担体として使用し得る。必要であれば、他の従来の添加剤、例えば増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、抗酸化剤、及び静菌剤も添加し得る。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤も、組成物にさらに添加して、水性溶液、懸濁液、及びエマルションなどの注射用製剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、若しくは錠剤などの経口製剤、又は粉末化製剤を調製し得る。

本明細書において使用される「ＰＦＵ」は、当技術分野において十分に定義されているように、プラーク形成単位を意味する。溶菌バクテリオファージは、宿主細胞を溶菌し、培養プレート上に透明帯（すなわちプラーク）を引き起こす。理論的には、各プラークは１つのファージによって形成され、プラークの数に希釈係数を乗じたものは、試験調製物中のファージの総数に等しい。

「処置」又は「療法」という用語は、疾病の治癒的処置及び／又は予防的処置の両方を示す。治癒的処置は、治癒をもたらす処置、あるいは、疾病の症状又はそれが直接的に若しくは間接的に引き起こす苦痛を軽減、改善、及び／又は排除、低減、及び／又は安定化する処置として定義される。予防的処置は、疾病の予防をもたらす処置、並びに、疾病の発症又はその発生リスクを低減及び／又は遅延させる処置の両方を含む。

「哺乳動物」という用語は、ヒト被験者、並びに、非ヒト哺乳動物、例えばペット（例えばイヌ、ネコ）、ウマ、反芻動物、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを含む。

本明細書において使用される「バイオフィルム」という用語は、様々な表面上で増殖している異種細菌の形成；好ましくは、生物学的又は非生物学的な固体表面上に付着した菌体外多糖マトリックスに包埋され増殖している細菌群衆であることを示す。

本明細書において使用される「損なう」という用語は、完全性の任意の変化をいう。細菌バイオフィルムを損なうということによって、バクテリオファージによるバイオフィルムの貫通、バイオフィルムに関連した細菌への感染及び／又はその溶菌、並びに／又はバイオフィルムの部分的な若しくは完全な排除（すなわち、コロニー形成を停止させることによって及び／又はバイオフィルムを破壊することによって）であると理解される。

本明細書において使用される「試料」という用語は、細胞を含有している任意の試料を意味する。このような試料の例は、血液、血漿、唾液、又は尿などの液体、並びに、生検材料、器官、組織、又は細胞の試料を含む。試料はその使用前に処理されていてもよい。

本明細書において使用される「被験体」又は「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒト、例えば成人及び小児をいう。しかしながら、「被験体」という用語はまた、非ヒト動物、特に哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類もとりわけ包含する。

本明細書において使用される、処置の「効力」又はバクテリオファージ療法に対する「応答」は、処置前のE.coli株の数と比較した場合に、バクテリオファージによる処置後に被験体におけるE.coli株の数の減少をもたらす処置をいう。「良好な応答」被験体は、バクテリオファージ療法で処置された場合に、臨床的に有意な回復を示すか又は示すだろう被験体をいう。

バクテリオファージの「カクテル」又は組成物という用語は、２つ以上の異なるバクテリオファージの組合せを示す。カクテル／組成物中のバクテリオファージは好ましくは一緒に、すなわち、同じ容器又はパッケージングに製剤化されるが、それらは部分からなるキットとして使用されてもよく、バクテリオファージ（又はそのいくつか）は、別々に製剤化又はパッケージングされ、使用時又は投与時に合わせられる。

実施態様の説明
本発明は、新規バクテリオファージ療法に関する。より特定すると、本発明は、エシェリキア・コリ株に対する高い特異性を有する新規バクテリオファージ、その製造、その成分、それを含む組成物、及びファージ療法におけるその使用に関する。

バクテリオファージ：
第一の態様では、本発明は、E.coli株に対して特異的であり、かつ単独で又は組み合わせて、顕著な宿主域の溶菌活性を呈する、新規バクテリオファージの単離及び特徴付けを開示する。これらのバクテリオファージは、環境試料から選択され、単離され、特徴付けられた。示されているように、バクテリオファージは個々に及び組み合わせて、E.coli株に対して活性である。それらは病原性E.coli株、例えば抗生物質耐性E.coli株に対して著しく効果的である。さらに、本発明のバクテリオファージは、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは０．１〜１０の顕著な産生溶菌作用（「ＰＬＥ」）を有する。さらに、本発明のバクテリオファージは、E.coli株に対して特異的であり、すなわち、それらはE.coliではない細菌の溶菌は引き起こさない。さらに説明されるであろうように、本発明は、これらのバクテリオファージを、医薬又は獣医学的薬剤として使用するのに適した条件で組み合わせて製剤化することにより、制御されたE.coli株のスペクトルに対して標的化されかつ非常に強力な抗菌作用を示すことができることを示す。

より具体的には、以下のバクテリオファージを選択し特徴付けた。それらの対応する核酸配列も示されている。

多数のE.coli株に対するこれらのバクテリオファージの溶菌プロファイルを決定した。これらのバクテリオファージは、以下の表に開示されているように、その強度及び組合せの可能性について選択された。この表では、基準株及び病原体耐性株に対するバクテリオファージの溶菌作用を提示することにより、高い溶菌能が確認される。

網掛けのあるボックスは、E.coli産生株の例である。

表２から分かるように、ファージは個々に非常に強力な溶菌力を有し、そして、試験された全てのE.coli株を殺菌することができるこれらのバクテリオファージの組合せ（又はカクテル）を作製して、これにより広域抗菌組成物を作製することができる。

一例として、本発明の１５個全てのファージのカクテルは、表２に列挙された全ての細菌を効果的に死滅させることができる。

さらに、多くのE.coliではない株に対するバクテリオファージの特異性を試験した。より特定すると、実験章は、本発明のバクテリオファージが、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、エンテロバクター・エロゲネス、エンテロバクター・アズブリア、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、プロテウス・ミラビリス、黄色ブドウ球菌、ステノトロホモナス・マルトフィリア、及び／又はセラチア・マルセセンスから選択された細菌に対して全く溶菌作用を有さないことを実証する。

したがって、本発明の特定の目的は、E.coli株に対して溶菌活性を有し、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９７％の同一性、好ましくはそれに対して少なくとも９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むゲノムを有する、バクテリオファージに存する。

したがって、本発明の特定の目的は、E.coli株に対して溶菌活性を有し、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列を有するか又はからなるゲノムを有する、バクテリオファージに存する。

本発明のバクテリオファージは、標準的な培養法、単離法、及び精製法によって調製され得る。例えば、E.coli産生菌を培養し、バクテリオファージの試料に感染させ、次いで処理して、細菌細胞及び残骸を除去する。濃縮されたバクテリオファージ溶液を、感受性のE.coli宿主株の包埋された培地、例えば寒天培地に蒔いて、プラークを得ることができる。次いで、１つのプラークを、その後のバクテリオファージの精製及び増殖のために拾い上げることができる。本発明のバクテリオファージの１回以上の選択的増殖サイクルを、例えばバクテリオファージをコンピテントなE.coliと混合し、その後、増殖培地を添加し、試験された試験増殖条件でインキュベートすることによって行ない得る。遠心分離後、清澄化した増殖された上清を、フィルターを通して濾過し、別のサイクルの選択的増殖にかけるか、又は、溶菌活性の存在について試験する。懸濁液中のファージ力価及び本発明のバクテリオファージのプラーク形態の可視化を、公知の方法によって、例えばプラーク計数によって推定することができる。さらに、短期保存、長期保存、凍結保存、又は任意の他の種類の保存のために様々な形態へと（液体形、凍結乾燥形など）本発明のバクテリオファージを加工することは、当技術分野において周知であるように任意の適切な方法によって行なわれ得る（Clark, 1962を参照）。

本発明のバクテリオファージの活性は、バクテリオファージを宿主である可能性のある細菌と共に増殖させ、続いて宿主細菌細胞を死滅させるその能力を評価することに基づいた、二重寒天法としても知られるプラークアッセイなどの当技術分野において周知の方法によって評価され得る。プラークアッセイ法では、バクテリオファージは軟寒天培地中でのインキュベート期間後に標的E.coli株の溶菌を誘導し、その結果、プラークとして知られるプレート上の透明域が生じる。好ましい態様では、本発明のバクテリオファージは、単独で又は組み合わせてのいずれかで、ＥＳＢＬ E.coli株などの抗生物質耐性E.coli株をはじめとする病原性E.coli株に対して溶菌活性を示す。さらに、これらのバクテリオファージの表現型（例えば特異性及び溶菌活性）を保持しているこれらのバクテリオファージの変異体を、当技術分野においてそれ自体公知の技術によって産生及び／又は単離することができる。

特定の実施態様では、本発明は、ＢＰ５３９バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ５３９バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５４中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ５３９又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ３５株、ＥＣＯＲ３８株、ＥＣＯＲ４０株、ＥＣＯＲ５４株、ＥＣＯＲ６２株、ＥＣＯＲ６４株及び／又はＥＣＯＲ７１株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ５３９は、配列番号１に示された配列を含むか、又は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ５３９バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ５３９バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ５３９バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ５３９バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは０．１付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の特定の実施態様では、本発明は、ＢＰ７００バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ７００バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５５中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ７００又はその任意の変異体は特異的であり、ＥＣＯＲ４６株、ＥＣＯＲ５５株、ＥＣＯＲ６０株及び／又はＥＣＯＲ６４株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ７００は、配列番号２で示された配列を含むか、又は、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ７００バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ７００バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ７００バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ７００バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは２付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

さらに別の態様では、本発明は、ＢＰ７５３バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ７５３バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５６中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ７５３又はその任意の変異体は特異的であり、ＥＣＯＲ１０株、ＥＣＯＲ４８株、及び／又はＥＣＯＲ５６株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ７５３は、配列番号３で示された配列を含むか、又は、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ７５３バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ７５３バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ７５３バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ７５３バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは２付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の態様では、本発明は、ＢＰ８１４バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ８１４バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５５中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ８１４又はその任意の変異体は特異的であり、ＥＣＯＲ４６株、ＥＣＯＲ５０株、ＥＣＯＲ５５株及び／又はＥＣＯＲ６４株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ８１４は、配列番号４で示された配列を含むか、又は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ８１４バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ８１４バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ８１４バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ８１４バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは０．３付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の特定の実施態様では、本発明は、ＢＰ９５３バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ９５３バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５５中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ９５３又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ１株、ＥＣＯＲ４６株、ＥＣＯＲ５０株、ＥＣＯＲ５４株、ＥＣＯＲ５５株、ＥＣＯＲ５９株及び／又はＥＣＯＲ６０株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ９５３は、配列番号５で示された配列を含むか、又は、配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ９５３バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ９５３バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ９５３バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ９５３バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは３付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の特定の実施態様では、本発明は、ＢＰ９５４バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ９５４バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ３５中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ９５４又はその任意の変異体は特異的であり、ＥＣＯＲ２４株、ＥＣＯＲ３５株、ＥＣＯＲ３８株、ＥＣＯＲ４０株、ＥＣＯＲ４６株及び／又はＥＣＯＲ６２株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ９５４は、配列番号６で示された配列を含むか、又は、配列番号６に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ９５４バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ９５４バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ９５４バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ９５４バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは３付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

さらに別の態様では、本発明は、ＢＰ９７０バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ９７０バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株Ｋ１２／ＤＨ５中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ９７０又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ１株、ＥＣＯＲ２株、ＥＣＯＲ５株、ＥＣＯＲ１０株、ＥＣＯＲ１３株、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ２８株及び／又はＥＣＯＲ７２株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ９７０は、配列番号７で示された配列を含むか、又は、配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ９７０バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ９７０バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ９７０バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ９７０バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは５付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の特定の実施態様では、本発明は、ＢＰ１００２バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１００２バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５６中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ１００２又はその任意の変異体は特異的であり、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ２４株、ＥＣＯＲ３５株、ＥＣＯＲ３８株、ＥＣＯＲ４０株、ＥＣＯＲ４８株、ＥＣＯＲ５４株、ＥＣＯＲ５５株、ＥＣＯＲ５６株、ＥＣＯＲ５９株、ＥＣＯＲ６０株及び／又はＥＣＯＲ６４株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ１００２は、配列番号８で示された配列を含むか、又は、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ１００２バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ１００２バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ１００２バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ１００２バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは５付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の特定の実施態様では、本発明は、ＢＰ１１５１バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１１５１バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５６中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ１１５１又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ２株、ＥＣＯＲ１３株、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ２４株、ＥＣＯＲ３５株、ＥＣＯＲ３８株、ＥＣＯＲ４０株、ＥＣＯＲ４６株、ＥＣＯＲ４８株、ＥＣＯＲ５０株、ＥＣＯＲ５４株、ＥＣＯＲ５６株、ＥＣＯＲ５９株、ＥＣＯＲ６０株、ＥＣＯＲ６２株、ＥＣＯＲ６４株及び／又はＥＣＯＲ７１株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ１１５１は、配列番号９で示された配列を含むか、又は、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ１１５１バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ１１５１バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ１１５１バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ１１５１バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは１０付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の態様では、本発明は、ＢＰ１１５５バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１１５５バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５９中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ１１５５又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ２株、ＥＣＯＲ１３株、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ２８株、ＥＣＯＲ４６株、ＥＣＯＲ５０株、ＥＣＯＲ５４株、ＥＣＯＲ５５株、ＥＣＯＲ５９株及び／又はＥＣＯＲ７１株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ１１５５は、配列番号１０で示された配列を含むか、又は、配列番号１０に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ１１５５バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ１１５５バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ１１５５バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ１１５５バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは０．５付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

さらに別の態様では、本発明は、ＢＰ１１６８バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１１６８バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５９中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ１１６８又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ１３株、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ２８株、ＥＣＯＲ３５株、ＥＣＯＲ４６株、ＥＣＯＲ５０株、ＥＣＯＲ５４株、ＥＣＯＲ５５株、ＥＣＯＲ５９株、ＥＣＯＲ７１株及び／又はＥＣＯＲ７２株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ１１６８は、配列番号１１で示された配列を含むか、又は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ１１６８バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ１１６８バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ１１６８バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ１１６８バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは０．８付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の態様では、本発明は、ＢＰ１１７６バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１１７６バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ６０中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ１１７６又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ２株、ＥＣＯＲ４株、ＥＣＯＲ１３株、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ２４株、ＥＣＯＲ２８株、ＥＣＯＲ３５株、ＥＣＯＲ５５株、ＥＣＯＲ５６株、ＥＣＯＲ５９株及び／又はＥＣＯＲ６０株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ１１７６は、配列番号１２で示された配列を含むか、又は、配列番号１２に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ１１７６バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ１１７６バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ１１７６バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ１１７６バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは４付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

さらに別の態様では、本発明は、ＢＰ１１９７バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１１９７バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株Ｋ１２／ＤＨ５中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ１１９７又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ２株、ＥＣＯＲ１３株、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ２８株、ＥＣＯＲ４６株、ＥＣＯＲ４８株、ＥＣＯＲ５０株、ＥＣＯＲ５４株、ＥＣＯＲ５９株、ＥＣＯＲ６０株、ＥＣＯＲ７１株及び／又はＥＣＯＲ７２株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ１１９７は、配列番号１３で示された配列を含むか、又は、配列番号１３に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ１１９７バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ１１９７バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ１１９７バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ１１９７バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは１付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

１つの態様では、本発明は、ＢＰ１２２６バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１２２６バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株ＥＣＯＲ５９中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ１２２６又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ２株、ＥＣＯＲ１３株、ＥＣＯＲ２８株、ＥＣＯＲ４８株、ＥＣＯＲ５９株、ＥＣＯＲ６０株及び／又はＥＣＯＲ７２株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ１２２６は、配列番号１４で示された配列を含むか、又は、配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ１２２６バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ１２２６バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ１２２６バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ１２２６バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは５付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

別の特定の実施態様では、本発明は、ＢＰ１２２９バクテリオファージ又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１２２９バクテリオファージ又はその任意の変異体を、例えばE.coli株Ｋ１２／ＤＨ５中で産生又は増殖させることができる。ＢＰ１２２９又はその任意の変異体は特異的であり、Ｋ１２／ＤＨ５株、ＥＣＯＲ２株、ＥＣＯＲ１３株、ＥＣＯＲ１５株、ＥＣＯＲ２８株、ＥＣＯＲ４６株、ＥＣＯＲ４８株、ＥＣＯＲ５０株、ＥＣＯＲ５４株、ＥＣＯＲ５５株、ＥＣＯＲ５９株及び／又はＥＣＯＲ７２株に対して溶菌活性を有する。ＢＰ１２２９は、配列番号１５で示された配列を含むか、又は、配列番号１５に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、さらにより好ましくは９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ゲノムを含む。ＢＰ１２２９バクテリオファージ又はその変異体から単離された核酸配列も提供される。本発明はまた、ＢＰ１２２９バクテリオファージ若しくはその変異体によってコードされるか、又は、本発明のＢＰ１２２９バクテリオファージから単離された核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチドも包含する。本発明のＢＰ１２２９バクテリオファージはまた、１５未満、より好ましくは１０未満、さらにより好ましくは６付近のＰＬＥによって特徴付けられる。

核酸及びポリペプチド
本発明はまた、本発明のバクテリオファージに含有されている核酸、又はこのような核酸の任意のフラグメントにも関する。フラグメントという用語は、より好ましくは、オープンリーディングフレームを含有している（又はからなる）フラグメントを示す。核酸は一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。

核酸は、寄託されたバクテリオファージから単離されても、あるいは、当技術分野においてそれ自体公知の一般的な技術に従って、組換えＤＮＡ技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）、酵素的若しくは化学的合成、又はその組合せを使用して作製されてもよい。天然の対立遺伝子変異体及び改変された核酸配列（この中のヌクレオチドは挿入、欠失、置換、及び／又は反転している）を含むがこれらに限定されない、相同配列及びそのフラグメントも含まれる。

特定の実施態様では、本発明は、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択された配列、又は配列番号１〜１５のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む、核酸に関する。

別の特定の実施態様では、本発明は、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択された配列のフラグメントの配列、又は、配列番号１〜１５のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列のフラグメントを含む、核酸に関し、該フラグメントは、オープンリーディングフレーム又は調節配列、例えばプロモーターを含む。

特定の実施態様では、本発明は、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択された配列、又は、配列番号１〜１５のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する又はからなる核酸に関する。

本発明の核酸は、遊離形であっても、又はベクターにクローニングされていてもよい。

さらなる態様では、本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５から選択された核酸配列によってコードされる単離されたポリペプチドにも関する。該ポリペプチドは、当技術分野においてそれ自体公知の技術、例えば合成、組換え技術、又はその組合せによって作製され得る。該ポリペプチドは単離又は精製され得、抗菌剤として又はインビトロでの分析のための試薬として使用され得る。

本発明の組成物：
本発明の１つの態様は、上記されているような少なくとも１つのバクテリオファージ、より好ましくは少なくとも２つ以上のバクテリオファージと、場合により薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤とを含む、組成物に関する。記載されているように、本発明のバクテリオファージは、E.coli株に対して非常に強力な溶菌特性を有する。これらのバクテリオファージの組合せを作製することにより、宿主域を拡大し、非常に効果的な抗菌組成物を作製し得る。

より特定すると、本発明は、E.coli株に対して溶菌活性を有する少なくとも２つのバクテリオファージを含む抗菌組成物に関し、前記の少なくとも２つのバクテリオファージは、配列番号１〜１５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は、それに対して少なくとも９０％の同一性、好ましくはそれに対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択される。

好ましい実施態様では、本発明の組成物は、配列番号１〜１５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は、それに対して少なくとも９０％の同一性、好ましくはそれに対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択された少なくとも３つ、さらにより好ましくは少なくとも４つの明確に異なるバクテリオファージを含む。本発明の組成物は、上記に開示されているような１５の明確に異なるバクテリオファージの中の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は全部を含み得る。

本発明の１つの態様は、ＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９、並びにその変異体から選択された少なくとも１つのバクテリオファージを含む組成物に関する。

本発明はまた、ＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９、並びにその変異体から選択された少なくとも２つの明確に異なるバクテリオファージを含む組成物に関する。

好ましくは、本発明の組成物は、ＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９、並びにその変異体から選択された少なくとも３つの明確に異なるバクテリオファージ、より好ましくは少なくとも４つの明確に異なるバクテリオファージ、さらにより好ましくは少なくとも５つの明確に異なるバクテリオファージ、さらにより好ましくは少なくとも６つの明確に異なるバクテリオファージ、より好ましくは少なくとも７つの明確に異なるバクテリオファージ、より好ましくは少なくとも８つの明確に異なるバクテリオファージ、さらにより好ましくは少なくとも９つの明確に異なるバクテリオファージ、さらにより好ましくは少なくとも１０個の明確に異なるバクテリオファージを含む。

特定の実施態様では、本発明の組成物は、ＢＰ５３９を、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１７６及びＢＰ１１６８から選択された少なくとも１つのさらに他のバクテリオファージと組み合わせて含む。

別の特定の実施態様では、本発明の組成物は、ＢＰ１００２を、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６及びＢＰ１１９７から選択された少なくとも１つのさらに他のバクテリオファージと組み合わせて含む。

別の特定の実施態様では、該組成物は、ＢＰ１１５５を、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６、ＢＰ１２２９及びＢＰ１１７６から選択された少なくとも１つのさらに他のバクテリオファージと組み合わせて含む。

別の好ましい実施態様では、該組成物は、ＢＰ１１５１を、ＢＰ１１７６、ＢＰ９５３、ＢＰ９７０、ＢＰ７００及びＢＰ１００２から選択された少なくとも１つのさらに他のバクテリオファージと組み合わせて含む。

別の好ましい実施態様では、該組成物は、ＢＰ９５３及び／又はＢＰ１１６８及び／又はＢＰ１１７６を、場合により本発明の少なくとも１つのさらに他のバクテリオファージとさらに組み合わせて含む。

本発明は特に、バクテリオファージＢＰ９５３＋ＢＰ１１６８の組合せを含む組成物に関する。このような組成物は、試験された出血性のE.coli株の１００％を、表２の２５個のE.coli細菌のほぼ７０％を死滅させることができた（実施例３．１参照）。

本発明はまた、バクテリオファージＢＰ９５３＋ＢＰ１１６８＋ＢＰ１２２９の組合せを含む組成物に関する。このような組成物は、出血性株をはじめとする、E.coli細菌型Ｏ１５７、Ｏ１４４及びＯ１０４を死滅させることができる（実施例３．２参照）。

本発明はまた、バクテリオファージＢＰ９５３＋ＢＰ１１５１＋ＢＰ１１５５＋ＢＰ１１７６の組合せを含む組成物に関する。このような組成物は、病院から単離された試験された全てのE.coli細菌の８０％を死滅させることができた（実施例３．３参照）。

本発明はまた、バクテリオファージＢＰ７００＋ＢＰ９５３＋ＢＰ９７０＋ＢＰ１００２＋ＢＰ１１７６の組合せを含む組成物に関する。このような組成物は、試験されたＳＴ１３１型E.coli細菌の１００％、試験されたＢＬＳＥ E.coli細菌の少なくとも８０％、及び試験されたＢＭＲ型E.coli細菌の少なくとも９３％を死滅させることができた（実施例３．４参照）。

本発明はまた、バクテリオファージＢＰ１００２＋ＢＰ１１５１＋ＢＰ１１５５＋ＢＰ１１６８＋ＢＰ１１７６の組合せを含む組成物に関する。このような組成物は、試験された髄膜炎を引き起こすE.coli細菌の１００％を死滅させることができる（実施例３．５参照）。

本発明はまた、バクテリオファージＢＰ５３９＋ＢＰ７００＋ＢＰ７５３＋ＢＰ８１４＋ＢＰ１１５１＋ＢＰ１１７６＋ＢＰ１１６８の組合せを含む組成物に関する。このような組成物は、表２のＥＣＯＲコレクションの２４のE.coli細菌のほぼ９６％を死滅させることができた（実施例３．６参照）。

本発明はまた、バクテリオファージＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９、あるいはその変異体の全ての組合せを含む組成物に関する。このような組成物は、表２の２５のE.coli細菌の１００％を死滅させることができた（実施例３．７参照）。

本発明の組成物の具体例は、以下を含む：
配列番号５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号９のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号７のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号８のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号８のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号９のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；又は
配列番号１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号３のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号９のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び、配列番号１１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ。

本発明の具体的な実施態様は、以下を含む組成物に関する：
配列番号１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号３のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号６のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号７のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号８のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号９のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号１１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
配列番号１５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ。

本発明の組成物は、細菌病原体E.coliに対して溶菌活性を発揮する。本発明の組成物は、追加の抗菌剤、特に、明確に異なる宿主特異性を有する他のバクテリオファージをさらに含み得る。

本発明の好ましい組成物は、抗生物質耐性E.coli株に対して溶菌性である。

本発明のさらに好ましい組成物は、天然に見られるE.coli株の基準コレクションである、ＥｃｏＲコレクションの全ての細菌株の中の９０％超に対して溶菌性である。

本発明の抗菌組成物は、様々な剤形、例えば液体製剤、半液体製剤、固形製剤、又は凍結乾燥製剤であり得る。

本発明の態様では、前記組成物は、１０^２〜１０^１２ＰＦＵ、好ましくは１０^５〜１０^１０ＰＦＵの本発明の少なくとも１つのバクテリオファージを含むことが望まれる。抗菌組成物が、上記に定義されているようないくつかのバクテリオファージを含む場合、該組成物は、１０^２〜１０^１２ＰＦＵの本発明の各々の存在するバクテリオファージを含むことが好ましい。

本発明の組成物は、有効量の選択されたバクテリオファージ（群）を含み得る。好ましくは、該組成物は、１０^２〜１０^１２ＰＦＵ、好ましくは１０^５〜１０^１０ＰＦＵの各々の該バクテリオファージを含む。本発明の組成物中の各々の種類のバクテリオファージの相対量は、当業者によって調整され得る。典型的には、抗菌組成物が上記に定義されているようないくつか（ｎ）の明確に異なるバクテリオファージを含む場合、該組成物中の各バクテリオファージの全相対量Ａ％は、より好ましくは、Ａ％＝（１００／ｎ_ｉ）ｘＶであり、ｎ_ｉはバクテリオファージの明確に異なる種類の数を示し、Ｖは０．２〜５の間の変動係数である。最も好ましくは、Ｖは０．３〜３であり、さらにより好ましくは０．５〜２であり、一般的には０．８〜１．５である。典型的な実施態様では、抗菌組成物が上記に定義されているようないくつかのバクテリオファージを含む場合、該組成物は１０^２〜１０^１２ＰＦＵの本発明の各々の存在するバクテリオファージを含むことが好ましい。好ましくは、各々の種類のバクテリオファージは、本発明の組成物中にほぼ等しい相対量で存在している。

本発明の組成物は好ましくは、適切な希釈剤又は担体、例えば薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤又は担体を含む。本発明に記載の組成物は、任意の賦形剤又は担体、例えば増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを、選択したバクテリオファージ（群）の他に含み得る。このようなものとしては、有害ではないか、又は生物に対して全く有意な特異的若しくは非特異的な免疫反応を引き起こさないか、又はバクテリオファージの生物学的活性を消失させない、生理学的に許容される溶液若しくはビヒクルが挙げられる。液体製剤のために、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、アルブミン輸液、デキストロース液、マルトデキストリン液、グリセロール、エタノール、及びその混合物を、薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤又は担体として使用し得る。適宜、他の従来の添加剤、例えば増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、抗酸化剤、及び静菌剤も添加し得る。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤も、組成物にさらに添加して、水性溶液、懸濁液、及びエマルションなどの注射用製剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、若しくは錠剤などの経口製剤、又は粉末化製剤を調製し得る。局所投与用の製剤は、バンドエイド、包帯、パッチ、フィルム、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼液、坐剤、スプレー、ネブライザー、タンポン、生理用ナプキン、液剤、及び散剤を含み得る。除染のための又は医療用途のための製剤はエアゾール又はスプレーも含み得る。

本発明の組成物は、例えば哺乳動物における感染の処置のために、又は被験体の状態の改善のために、ヒト若しくは獣医学的領域をはじめとする医療分野において使用され得る。該組成物は、感染を処置するために、生物内のE.coli細菌を死滅させるために使用され得る。該組成物はまた、哺乳動物における微生物叢を改変することによって、該哺乳動物の状態を改善するために使用され得る。特に、本発明の組成物は、哺乳動物の皮膚又は粘膜上のE.coli株を特異的に除去することができ、これにより、その微生物叢を改変させ、適切なバランスを回復することができる。

特定の実施態様では、本発明はまた、哺乳動物に、上記に定義されているような組成物又はバクテリオファージ又は核酸又はポリペプチドを投与することを含む、該哺乳動物における感染を処置するための方法に関する。

特定の実施態様では、該方法は、ＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９、あるいはその変異体から選択された少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらにより好ましくは少なくとも３つのバクテリオファージを投与することを含む。

本発明はまた、哺乳動物における感染を処置するための、又は該哺乳動物における微生物叢を回復させるための、医薬品を製造するための、記載されているような組成物、バクテリオファージ、核酸、又はポリペプチドの使用に関する。

本発明の組成物又は薬剤は、静脈内、経口、経皮、皮下、粘膜、筋肉内、肺内、鼻腔内、非経口、直腸、膣内、及び局所をはじめとする、任意の慣用的な経路によって投与され得る。好ましい実施態様では、バクテリオファージ又は組成物は、局所経路によって、例えば被験体の皮膚上への適用によって投与される。該組成物は、直接的に投与されても、又は間接的に、例えば支持体を介して投与されてもよい。これに関して、該組成物は、例えば患部に適用又は噴霧され得る。本発明の組成物はまた経口経路又は非経口経路によって投与されてもよい。本発明の組成物を適用、噴霧、又は投与するに適した用量は、製剤、投与形態、投与時に処置される哺乳動物の年齢、体重、性別、状態、食事、投与経路、及び反応感度をはじめとする様々な因子に依存して当業者によって調整され得る。当技術分野における通常の技能を有する医師は、必要とされる組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。

抗生物質耐性E.coli株に対する溶菌活性が得られるように投薬も当業者によって調整され得る。インビボで溶菌活性を得るのに効果的な用量は典型的には、投与経路に依存して、少なくとも１０^２ＰＦＵ/ml、好ましくは約１０^２〜１０^１２ＰＦＵ/mlの濃度を含む。投与は一回だけ行ない得るか、又は必要であれば反復してもよい。

本発明の組成物は、E.coli感染、典型的には呼吸器、尿路、火傷、創傷、耳、皮膚、及び軟組織、消化管の感染又は術後感染を処置するために投与され得る。

実験章において示されているように、本発明のバクテリオファージ及び組成物は、インビトロ又はインビボでE.coli細菌を選択的に死滅させることができる。該組成物は、インビボでさえ、低い用量でさえ、様々なE.coli細菌の混合物を破壊することができる。さらに、本発明の組成物は、病原性細菌にとって特に重要であるバイオフィルムに包埋された細菌を死滅させるのに効果的である。また、本発明の組成物及びバクテリオファージは、厳密には哺乳動物細胞を冒すことができないので、それ故、インビボで特異的であり、副作用がない。

本発明はまた、材料を除染するための、本発明の組成物、バクテリオファージ、核酸、又はポリペプチドの使用に関する。その強力な抗菌作用に因り、及び細菌バイオフィルムの完全性を損ないさえするその能力に因り、本発明の組成物は、材料上の細菌を排除するか又は少なくとも細菌数の減少を引き起こすための、除染剤として使用され得る。このような方法は、例えばコンタクトレンズ、生体に埋め込まれる器具の表面、パイプ、導管、実験用容器、織物などの固形材料又は器具をはじめとする、医療的な背景及び非医療的な背景の両方の、様々な生物学的又は非生物学的表面の処理に適用され得る。

本発明の診断試験／予測試験：
本発明はまた、被験体におけるバクテリオファージ療法の効力を予測又は決定するための方法に関し、該方法は、該被験体の試料に由来するE.coli株に対する、ＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９から選択された１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性を決定する工程を含み、このような溶菌活性は、効果的な処置を示す。好ましい態様では、該方法はさらに場合により、該被験体の試料に由来するE.coli株に対して溶菌活性を有する１つ以上のバクテリオファージによって、該被験体を処置する工程を含む。

別の態様では、本発明は、被験体を選択するか又は被験体がバクテリオファージ療法から恩恵を受けやすいかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は、該被験体の試料に由来するE.coli株に対する、ＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢP１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９から選択された１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性を決定する工程を含み、少なくとも１つのE.coli株に対する本発明の１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性は、応答被験体であることを示す。

本発明の別の目的は、バクテリオファージ療法に対する被験体の応答を予測するための方法に関し、該方法は、該被験体の試料に由来するE.coli株に対する、ＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９から選択された１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性を決定する工程を含み、少なくとも１つのE.coli株に対する本発明の１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性は、該療法に対する良好な応答を示す。

本発明のさらなる態様及び利点は、以下の実験章において開示されており、これは説明するためだけのものである。

実施例
材料及び方法
ファージの単離及び調製
ＭＤＲE.coli細菌を、環境水から各々の病原性バクテリオファージを単離及び濃縮するために使用した。環境試料とルリア・ベルターニ（ＬＢ）中での細菌の一晩培養液とを混合し、３７℃で２４時間振盪しながらインキュベートして、特定のバクテリオファージを濃縮した。インキュベート終了時に、クロロホルムの液滴を培養液に加えた。培養液を１１，０００ｇで５分間かけて遠心沈殿させ、細菌細胞及び残骸を除去した。上清を０．２μmのフィルターにかけて、残存している細菌細胞を除去した。濃縮されたファージ溶液を、E.coliの包埋されているＬＢ寒天培地に蒔いた。プラークが、３７℃で２４時間のインキュベート後にプレート上に形成された。１つのプラークをその後のファージの精製及び増殖のために拾い上げた。次いで、ファージを、ＬＢブロス又は生理食塩水中への懸濁液中で４℃で保存した。懸濁液中のファージの力価を、プラークの計数によって推定した（Postic, 1961）。懸濁液の１０倍希釈液を、乾燥させた増殖株の菌叢の上に加えた。プレートを、一晩インキュベートした後に解読した。プラーク計数法はまた、プラークの形態の可視化も可能とした。

宿主域の決定
バクテリオファージの宿主域を、ＥＣＯＲコレクションに由来する２６個のE.coliのコレクションの中から決定した。１０^９個の細菌細胞を、融解させた寒天と混合し、この混合物を固形寒天上に注いで、二重層寒天プレートを作成した。凝固後、単離されたバクテリオファージストック溶液を、異なる細菌株を有する各プレートにスポットした。２０分間かけてスポットを吸収させた後、プレートを逆さにして、３７℃で２４時間インキュベートして、溶菌度を記録した。

電子顕微鏡
各々のファージの電子顕微鏡写真を、透過型電子顕微鏡を用いて撮影した。

ファージゲノムのシークエンス、分析、及びアノテーション
ファージＤＮＡを単離するために、ファージを上記のように増殖させた。ファージＤＮＡを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、Ｖ/Ｖ）を用いた抽出、エタノールによる沈降、及び水への再溶解によって単離した。全ゲノムシークエンスを行ない、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、国立生物工学情報センター［ＮＣＢＩ］データベースに記載された遺伝子に対する類似率を決定した。ゲノムを可能性あるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）について走査した。

実施例１：バクテリオファージ−宿主の特徴及び動態
１工程の増殖実験を、以前の記載に従って行ない、最初に産生溶菌時間、吸着速度、次いでファージバーストサイズを決定した。吸着速度を決定するために、試料を様々な時間間隔で採取し、溶液中の遊離ファージ粒子を分析した。産生時間及びファージバーストサイズの決定のために、E.coli細菌をファージ溶液と混合し、ファージを１５分間かけて吸着させた。混合物を直ちに５０００rpmで１０分間の遠心分離にかけ、遊離ファージ粒子を除去した。ペレットを５つの新鮮なＬＢ培地に再度懸濁し、培養液を３７℃で持続的にインキュベートした。試料を３分間の間隔で採取し、ファージ力価を決定した。これらの結果は、以下の表３に示されているように、１個の細菌あたりに産生されたファージの数（バーストサイズ）、産生時間、及び産生溶菌作用（ＰＬＥ）の計算を可能とした。

これらの結果は、全てのファージが、強力なウイルス産生能及び吸着速度を有することを示す。大半のファージが５未満のＰＬＥを有し、これは、顕著なプロファイルを実証する。ファージ５３９は、これに関して特に効果的である。さらに、異なるＰＬＥ及び吸着時間は、選択されたばらつきを有するカクテルの作成を可能とする。

実施例２：カクテル組成物の調製
以下のカクテル組成物は、各々が１０^−９〜１０^−１１ｐｆｕの各バクテリオファージを含むように構成されている。

様々なファージの全てを含む、以下の追加の２つのカクテル組成物は、E.coli種の最も重要な種類を網羅するように構成されている。

実施例３：本発明のバクテリオファージカクテルに対する細菌の感受性
様々な細菌株を、２×１０^９個のバクテリオファージ/mlの本発明のバクテリオファージカクテルを用いて試験した。様々な細菌濃度を、２×１０^９個のバクテリオファージ/mlのバクテリオファージカクテル上に蒔き、３７℃で２４時間インキュベートした。

カクテルを、表２に列挙された明確に異なるE.coli細菌、並びに、R. Debreコレクションの髄膜炎を引き起こす細菌（３７個の株）、ＢＬＳＥ（５個の株）とＳＴ１３１（９個の株）型のE.coli細菌、入院患者から得られたE.coli細菌（３５個の株）、及びＯ１５７型とＯ１４４型とＯ１０４型の出血性E.coli細菌（３個の株）をはじめとする追加のE.coli細菌上で試験した。カクテルに対して感受性である細菌種％を以下の表６に列挙する。

実施例３．１：カクテルＩの効力
以下の表６に示されているように、カクテルＩは、試験された出血性E.coli細菌の１００％を破壊することができる。

さらに、カクテルＩはまた、表２の２５のE.coli細菌のほぼ７０％を破壊することができる。

実施例３．２：カクテルＩＩの効力
以下の表７に示されているように、カクテルＩＩは、試験された出血性E.coli細菌の１００％を破壊することができる。

さらに、カクテルＩＩはまた、表２の２５個のE.coli細菌の７６％を破壊することができる。

実施例３．３：カクテルＩＩＩの効力
以下の表８に示されているように、カクテルＩＩＩは、入院患者から単離された試験されたE.coli株の少なくとも８０％を破壊することができる。

実施例３．４：カクテルＩＶの効力
以下の表９に示されているように、カクテルＩＶは、ＳＴ１３１及びＢＬＳＥ型のE.coli株を破壊することができる。

実施例３．５：カクテルＶの効力
以下の表１０に示されているように、カクテルＶは、R. Debreコレクションに由来する髄膜炎を引き起こすE.coli細菌を１００％破壊することができた。

実施例３．６：カクテルＶＩの効力
カクテルＶＩは、表２に列挙されたＥＣＯＲコレクションの２４のE.coli細菌のほぼ９６％を破壊することができる。

実施例３．７：カクテルＡ及びＢの効力
カクテルＡ及びＢはどちらも、表２に列挙された２５のE.coli細菌の１００％を破壊することができる。

細菌をさらに数え挙げ、これを耐性率（インキュベート後の細菌数／蒔いた細菌数）の計算に使用した。１５の異なる型のバクテリオファージを含むカクテルＡの耐性率を、以下の表１１に示す。

試験された全ての細菌は、本発明の組成物に対して感受性である。

実施例４：カクテルの特異性
カクテルの特異性は、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、エンテロバクター・エロゲネスＣ、エンテロバクター・アズブリア、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・ニューモニエ、プロテウス・ミラビリス、黄色ブドウ球菌、ステノトロホモナス・マルトフィリア、セラチア・マルセセンスをはじめとする、１０の細菌種に対して試験することによって確認された。

表１２は、独立して又は１５のバクテリオファージのカクテルとして組み合わせて使用された、各々のバクテリオファージに観察された溶菌活性を要約する。

上記の表は明瞭に、E.coli株以外の細菌に対して全く溶菌活性が起こらなかったことを示す。それ故、本発明のバクテリオファージ及びカクテルは、E.coli株に対して非常に特異的である。

実施例５：インビトロでのE.coli株に対するバクテリオファージの効力
ＥｃｏＲコレクションのいくつかの株を選択して、E.coliの遺伝子的多様性及び様々な形態の抗生物質耐性を示した。株は、１つ又はいくつかの抗生物質に対して感受性又は耐性のいずれかであった。それらを個々に又は２〜８の株と組み合わせて増殖させた。バクテリオファージカクテルを、１対１０^−６のＭＯＩで、すなわち、１対１００万の希釈比（細菌／ファージ）で加えた。

結果を図１及び以下の表１３に提示する。

表１３：E.coli混合物に対する、２×１０^７ｃｆｕ/ml及び様々な希釈率での、インビトロで得られたバクテリオファージカクテルの効力

本発明の組成物は、E.coli細菌の８の明確に異なる株の混合物を死滅させることができる。カクテルは、１/１０００の希釈率で８の株に対して依然として効果的である。

実施例６：インビボでのE.coli株に対するバクテリオファージの効力
２０１１年に火傷した患者で収集された単離されたＳＨ１１３株を、以下の実験のために使用した。ＳＨ１１３株は、アンピシリン、チカルシリン、セファロチン、セフォタキシム、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、シプロフロキサシンに対して耐性である。ＳＫＨ１マウス（又は無毛のマウス）を、E.coli感染のマウスモデルとして使用した。

方法：（以下の表１４を参照されたい）
−マウスを、注射前の−３日目から２日間毎に、シクロホスファミド（Ｃｙ）１．５mgの３回の腹腔内注射によって免疫抑制した。
−３０mg/kgのイペリット液２μlによってマウスの皮膚を火傷させた。
−火傷の２日後に、火傷部位への細菌懸濁液の皮下注射によって感染させる。

カクテル組成物を実施例２に従って調製し、湿布を、１０^７個のファージ/mlのバクテリオファージカクテルに浸漬し、その後、０日目に適用した。

様々な濃度のE.coli株を、１００μlのバクテリオファージカクテルを用いて試験した。図２に示されているように、全てのE.coli株は処置から６時間後に死滅した。

ＳＨ１１３E.coli株を皮下注射によってＳＫＨ１マウスに投与した場合に、全てのマウスはさらなる処置がなければ死滅した。上記の表９に提示されているようなバクテリオファージカクテルの注射によって処置されたマウスでは、顕著な生存率が観察された（図３参照）：皮下又は静脈内に処置されたＳＫＨ１マウスでは１００％の生存率、腹腔内経路の処置では６５％の生存率。比較すると、０日目＋６時間及び連続７日間の間に（例えば、１日目に２回の注射）２倍量のゲンタマイシン抗生物質によって処置されたＳＫＨ１マウスにおいて８０％の生存率が観察された。

１／１０、１／１００、及び１／１０００の希釈率（すなわち１匹のマウスあたり１０^５ＰＦＵ）の本発明のカクテルを用いての皮下処置後にも顕著な１００％の生存率が得られた（図４参照）。

したがって、本発明の組成物は、インビボで感染を処置することができ、感染マウスにおいて１００％の生存率を誘導することができる。

参考文献

Claims (22)

1. エシェリキア・コリ（Escherichia coli）（E. coli）株に対して溶菌活性を有する少なくとも２つの異なるバクテリオファージを含む抗菌組成物であって、前記の少なくとも２つの異なるバクテリオファージは、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択される、該抗菌組成物。
2. 配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択された少なくとも３つの異なるバクテリオファージを含む、請求項１の組成物。
3. 配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージから選択された少なくとも４つの異なるバクテリオファージを含む、請求項１の組成物。
4. 以下のバクテリオファージの組合せ：
   −配列番号５のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１１のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；又は
   −配列番号５のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１１のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１５のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；又は
   −配列番号５のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号９のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１０のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１２のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；又は
   −配列番号２のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号７のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号８のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１２のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；又は
   −配列番号８のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号９のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１０のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１１のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１２のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；又は
   −配列番号１のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号２のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号３のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号４のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号９のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１２のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１１のヌクレオチド配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、
   のいずれか一つを含む、請求項１記載の組成物。
5. それぞれ配列番号１〜１５のヌクレオチド配列を含む、バクテリオファージＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及びＢＰ１２２９の全ての組合せを含む、請求項１〜３のいずれか一項の組成物。
6. 抗生物質耐性のE.coli株に対して溶菌性である、請求項１〜５のいずれか一項の組成物。
7. 薬学的に許容される賦形剤又は担体をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項の組成物。
8. 液体製剤、半液体製剤、固形製剤、又は凍結乾燥製剤である、請求項１〜７のいずれか一項の組成物。
9. １０^２〜１０^１２ＰＦＵの各バクテリオファージを含む、請求項１〜８のいずれか一項の組成物。
10. 哺乳動物におけるＥ．ｃｏｌｉ感染を処置するための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項の組成物の使用。
11. 哺乳動物における微生物叢を改変することによってＥ．ｃｏｌｉにより感染した該哺乳動物の状態を改善するための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項の組成物の使用。
12. 器具、容器又は実験材料、又は布地などの、Ｅ．ｃｏｌｉに汚染されていることが疑われる材料を除染するための、請求項１〜９のいずれか一項の組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
13. 前記の１つ以上のバクテリオファージを別々に産生すること、及び、該バクテリオファージを適切な担体又は賦形剤と組み合わせることを含む、請求項１〜９のいずれか一項の組成物を調製するための方法。
14. 被験体におけるバクテリオファージ療法の効力を予測又は決定するための方法であって、該方法は、該被験体の試料に由来するE.coli株に対する、１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性をインビトロで決定する工程を含み、該被験体の該試料に由来する少なくとも１つのE.coli株に対する１つ以上の該バクテリオファージの溶菌活性は、効果的な処置を示し、
    ここで、１つ以上のバクテリオファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する溶菌活性を有し、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、前記方法。
15. 被験体がバクテリオファージ療法から恩恵を受けやすいかどうかを決定するための方法であって、該方法は、該被験体の試料に由来するE.coli株に対する１つ以上のバクテリオファージの溶菌活性を決定する工程を含み、１つ以上の該バクテリオファージの溶菌活性の存在は、応答被験体であることを示し、そして
    ここで、該少なくとも１つ以上のバクテリオファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する溶菌活性を有し、配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、前記方法。
16. E.coli株に対する溶菌活性を有し、かつ配列番号１〜１５のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、バクテリオファージ。
17. それぞれ配列番号１〜１５のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、ＢＰ５３９、ＢＰ７００、ＢＰ７５３、ＢＰ８１４、ＢＰ９５３、ＢＰ９５４、ＢＰ９７０、ＢＰ１００２、ＢＰ１１５１、ＢＰ１１５５、ＢＰ１１６８、ＢＰ１１７６、ＢＰ１１９７、ＢＰ１２２６及び／又はＢＰ１２２９から選択される、請求項１６のバクテリオファージ。
18. 請求項１６又は１７のバクテリオファージを含む、抗菌組成物。
19. さらに薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を含む、請求項１８の組成物。
20. 哺乳動物におけるＥ．ｃｏｌｉ感染を処置するための医薬の製造のための、請求項１６又は１７のバクテリオファージ、請求項１８又は１９の組成物の使用。
21. 哺乳動物における細菌叢を改変することによって、Ｅ．ｃｏｌｉによる哺乳動物の感染の状態を改善するための医薬の製造のための、請求項１６又は１７のバクテリオファージ、又は請求項１８又は１９の組成物の使用。
22. 器具、容器、実験材料、又は布地などのＥ．ｃｏｌｉで汚染されていることが疑われる材料を処理するための、請求項１６又は１７のバクテリオファージ、又は請求項１８又は１９の組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏの使用。