JP6782463B2 - Fractionation and quantification method of chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan - Google Patents
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Description
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの分別・定量方法に関する。 The present invention relates to a method for separating and quantifying chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan.
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、コアタンパク質とコンドロイチン硫酸糖鎖とが結合しているハイブリッド分子である。一方、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンから遊離するコンドロイチン硫酸糖鎖である。これらはいずれも、生理活性を有する物質であることから、医薬品や機能性食品中のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを分別・定量することは、医薬品や機能性食品に期待される効果を予測・判定するために有用である。 Chondroitin sulfate proteoglycan is a hybrid molecule in which a core protein and a chondroitin sulfate sugar chain are bound. On the other hand, chondroitin sulfate glycosaminoglycan is a chondroitin sulfate sugar chain released from chondroitin sulfate proteoglycan. Since all of these are substances having physiological activity, it is expected for pharmaceuticals and functional foods to separate and quantify chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan in pharmaceuticals and functional foods. It is useful for predicting and judging the effect.
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの従来から知られている定量方法は、分画操作と、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに結合するコンドロイチン硫酸糖鎖及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンのコンドロイチン硫酸糖鎖を定量する操作との二つの操作から構成される。 Conventionally known quantification methods for chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan are fractionation operation and quantification of chondroitin sulfate sugar chain and chondroitin sulfate sugar chain of chondroitin sulfate glycosaminoglycan bound to chondroitin sulfate proteoglycan. It consists of two operations, one is to do.
上記分画操作には、クロマトグラフィー、超遠心法、免疫化学的方法などが知られている。クロマトグラフィーを用いる場合には、分子量の違いや酸性度の違いを利用するゲル濾過クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィーが知られている。超遠心法は、比重の差を利用して超遠心分離機によりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを分離し、これらのコンドロイチン硫酸糖鎖量を測定するものである。免疫化学的方法は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質に対する抗体をラテックスに結合させ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンと凝集反応させた後に、ラテックスを遠心又はフィルタにより取り除き、抗体に結合した画分と結合しない画分とを定量する方法である。しかしながら、これらの方法はいずれも、簡便性や経済性等の面で問題があった。 Chromatography, ultracentrifugation, immunochemical methods and the like are known as the fractionation operation. When chromatography is used, gel filtration chromatography and anion exchange chromatography that utilize differences in molecular weight and acidity are known. In the ultracentrifugation method, chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan are separated by an ultracentrifuge using the difference in specific gravity, and the amount of these chondroitin sulfate sugar chains is measured. In the immunochemical method, an antibody against the core protein of chondroitin sulfate proteoglycan is bound to a latex, and after agglutination reaction with chondroitin sulfate proteoglycan, the latex is removed by centrifugation or a filter to obtain a fraction that does not bind to the antibody-bound fraction. Is a method of quantifying. However, all of these methods have problems in terms of convenience and economy.
本発明は、従来技術のような煩雑な分画操作を必要とせず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを簡便に、また効率的に分別し定量することができる方法を提供することを課題とする。 The present invention provides a method capable of easily and efficiently separating and quantifying chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan without requiring a complicated fractionation operation as in the prior art. Is the subject.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、溶媒に対するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの溶解性とコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの溶解性との違いを利用して、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを分別し、分別して得られたコンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンをそれぞれコンドロイチナーゼにより不飽和二糖に分解し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン由来及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン由来のそれぞれの不飽和二糖を分離し定量することにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have utilized the difference between the solubility of chondroitin sulfate proteoglycan and the solubility of chondroitin sulfate glycosaminoglycan in a solvent to obtain chondroitin sulfate proteoglycan. Chondroitin sulfate glycosaminoglycan is separated, and chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan are decomposed into unsaturated disaccharides by chondroitinase, respectively, and are derived from chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosamino. We have found that the above problems can be solved by separating and quantifying each unsaturated disaccharide derived from glycan, and have completed the present invention.
したがって、本発明は以下を提供する。
〔１〕 コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを分別し定量するための方法であって、
（１）溶媒に対するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの溶解性とコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの溶解性との違いを利用して、被検試料中に存在しうるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを分別する工程と、
（２）分別して得られうるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを、それぞれコンドロイチナーゼにより不飽和二糖に分解し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン由来及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン由来のそれぞれの不飽和二糖を分離し定量する工程と
を含む、方法。
〔２〕 工程（１）における溶媒が水混和性有機溶媒である、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 水混和性有機溶媒が、メタノール、エタノール、アセトニトリル、１，４−ジオキサン及びこれらの混合物からなる群より選ばれる、上記〔２〕に記載の方法。
〔４〕 水混和性有機溶媒が、メタノールである、上記〔２〕に記載の方法。
〔５〕 工程（１）が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン及び／又はコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを含みうる被検試料の水溶液を調製し、水混和性有機溶媒の添加により沈殿を生じさせることを含む、上記〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 工程（２）における分離・定量が、液体クロマトグラフィーにより行われる、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕 工程（２）における分離・定量が、高速液体クロマトグラフィーにより行われる、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
Therefore, the present invention provides the following.
[1] A method for separating and quantifying chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan.
(1) Separation of chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan that may be present in the test sample by utilizing the difference between the solubility of chondroitin sulfate proteoglycan and the solubility of chondroitin sulfate glycosaminoglycan in a solvent. And the process of
(2) Chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan, which can be obtained separately, are decomposed into unsaturated disaccharides by chondroitinase, respectively, and the unsaturated disaccharides derived from chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan are obtained. A method comprising the steps of separating and quantifying disaccharides.
[2] The method according to the above [1], wherein the solvent in the step (1) is a water-miscible organic solvent.
[3] The method according to [2] above, wherein the water-miscible organic solvent is selected from the group consisting of methanol, ethanol, acetonitrile, 1,4-dioxane and a mixture thereof.
[4] The method according to [2] above, wherein the water-miscible organic solvent is methanol.
[5] The step (1) comprises preparing an aqueous solution of a test sample that may contain chondroitin sulfate proteoglycan and / or chondroitin sulfate glycosaminoglycan, and causing precipitation by adding a water-miscible organic solvent. The method according to any one of [2] to [4].
[6] The method according to any one of [1] to [5] above, wherein the separation / quantification in the step (2) is performed by liquid chromatography.
[7] The method according to any one of [1] to [5] above, wherein the separation / quantification in the step (2) is performed by high performance liquid chromatography.
本発明によれば、煩雑な分離操作を必要とせずに、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを簡便に、また効率的に分別し定量することが可能となる。 According to the present invention, chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan can be easily and efficiently separated and quantified without requiring a complicated separation operation.
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを分別し定量するための方法であって、
（１）溶媒に対するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの溶解性とコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの溶解性との違いを利用して、被検試料中に存在しうるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを分別する工程と、
（２）分別して得られうるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンをそれぞれコンドロイチナーゼにより不飽和二糖に分解し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン由来及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン由来のそれぞれの不飽和二糖を分離し定量する工程と
を含む、方法を提供する。
The present invention is a method for separating and quantifying chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan.
(1) Separation of chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan that may be present in the test sample by utilizing the difference between the solubility of chondroitin sulfate proteoglycan and the solubility of chondroitin sulfate glycosaminoglycan in a solvent. And the process of
(2) Chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan that can be separately obtained are decomposed into unsaturated disaccharides by chondroitinase, respectively, and each unsaturated disaccharide derived from chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan is obtained. Provided are methods that include the steps of separating and quantifying sugars.
本発明の分別・定量方法の被検試料としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンのいずれか一方又はその両方を含むかもしれない試料であれば、いかなる試料でも対象とすることができる。そのような被検試料としては、例えば、医薬品、食品（機能性食品等の特定の用途を意図した食品も含む）、及び、血液、血清、血漿、尿等の体液、並びに、それらの希釈物などが挙げられる。本発明の分別・定量方法は、被検試料中に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとの両方が含まれていれば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの分別・定量方法に相当するし、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのみが含まれていれば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分別・定量方法に相当するし、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンのみが含まれていれば、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの分別・定量方法に相当する。 As the test sample of the fractionation / quantification method of the present invention, any sample may be used as long as it may contain either one or both of chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan. .. Such test samples include, for example, pharmaceuticals, foods (including foods intended for specific uses such as functional foods), body fluids such as blood, serum, plasma, and urine, and dilutions thereof. And so on. The method for separating and quantifying the present invention is a method for separating and quantifying chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan if both chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan are contained in the test sample. If only chondroitin sulfate proteoglycan is contained, it corresponds to a method for separating and quantifying chondroitin sulfate proteoglycan, and if only chondroitin sulfate glycosaminoglycan is contained, it corresponds to chondroitin sulfate glycosaminoglycan. Corresponds to the sorting / quantification method.
上記工程（１）を行う際には、代表的には、被検試料を例えば１０〜１００ｍｇ／ｍＬ程度含む水溶液を調製する。被検試料が液体の場合には、液体に含まれうるタンパク質を、過塩素酸やトリクロロ酢酸等の試薬を用いて取り除き、その上清を１０〜１００ｍｇ／ｍＬの被検試料濃度範囲になるように希釈又は濃縮して水溶液を調製するのが好ましい。調製した被検試料の水溶液に対して、例えば水混和性有機溶媒を６０〜８０重量％程度の最終濃度になるように加え、生じた沈殿を遠心分離又はフィルターにより分画する。必要に応じて、沈殿を取り除き、上清に対して、水混和性有機溶媒を更に加え、生じた沈殿を遠心分離又はフィルターにより分画する。ここで、一回目の水混和性有機溶媒と二回目の水混和性有機溶媒は同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、沈殿処理及び分画は、必要に応じた回数行うことができ、例えば、１回、２回、３回以上行われる。この沈殿処理及び分画の操作が、上記工程（１）における、溶媒に対するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの溶解性とコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの溶解性との違いを利用することに相当する。具体的には、例えばエタノールを水混和性有機溶媒として使用すると、最終濃度５５重量％では、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンは沈殿を生じないのに対し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは沈殿を生じる。その結果、最終濃度５５重量％でエタノール処理を行うことにより、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを沈殿中に簡便に、また効率的に回収することが可能となる。 When performing the above step (1), typically, an aqueous solution containing a test sample of, for example, about 10 to 100 mg / mL is prepared. When the test sample is a liquid, the protein that can be contained in the liquid is removed using a reagent such as perchloric acid or trichloroacetic acid, and the supernatant is adjusted to the test sample concentration range of 10 to 100 mg / mL. It is preferable to dilute or concentrate the aqueous solution. For example, a water-miscible organic solvent is added to the prepared aqueous solution of the test sample so as to have a final concentration of about 60 to 80% by weight, and the generated precipitate is fractionated by centrifugation or a filter. If necessary, the precipitate is removed, a water-miscible organic solvent is further added to the supernatant, and the resulting precipitate is centrifuged or filtered. Here, the first water-miscible organic solvent and the second water-miscible organic solvent may be the same or different. In addition, the precipitation treatment and fractionation can be performed as many times as necessary, for example, once, twice, three times or more. This precipitation treatment and fractionation operation corresponds to utilizing the difference between the solubility of chondroitin sulfate proteoglycan and the solubility of chondroitin sulfate glycosaminoglycan in the solvent in the above step (1). Specifically, for example, when ethanol is used as a water-miscible organic solvent, chondroitin sulfate glycosaminoglycan does not precipitate at a final concentration of 55% by weight, whereas chondroitin sulfate proteoglycan does. As a result, by performing ethanol treatment at a final concentration of 55% by weight, chondroitin sulfate proteoglycan can be easily and efficiently recovered during precipitation.
被検試料の水溶液に対する水混和性有機溶媒の使用量は、本発明の目的を達成することができる限り特段制限されないが、被検試料中に含まれうるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを効率よく分別して定量するためには、被検試料の水溶液中の水混和性有機溶媒の最終濃度を、３０〜５５重量％程度とするのが好ましく、また、被検試料中に含まれうるコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを効率よく分別して定量するためには、被検試料の水溶液中の水混和性有機溶媒の最終濃度を、６０〜８０重量％程度とするのが好ましい。 The amount of the water-miscible organic solvent used with respect to the aqueous solution of the test sample is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved, but the chondroitin sulfate proteoglycan that can be contained in the test sample is efficiently separated and quantified. Therefore, the final concentration of the water-miscible organic solvent in the aqueous solution of the test sample is preferably about 30 to 55% by weight, and the chondroitin sulfate glycosaminoglycan that can be contained in the test sample is used. In order to efficiently separate and quantify, the final concentration of the water-miscible organic solvent in the aqueous solution of the test sample is preferably about 60 to 80% by weight.
本発明で使用される「水混和性有機溶媒」としては、本発明の目的を達成することができる水と混和可能な有機溶媒である限り特段限定されないが、水と任意の割合で混和可能な有機溶媒が好ましい。水との混和性の高さから、水混和性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、１，４−ジオキサン及びそれらの混合物などが好ましく、中でも、エタノールが特に好ましい。 The "water-miscible organic solvent" used in the present invention is not particularly limited as long as it is an organic solvent miscible with water that can achieve the object of the present invention, but can be miscible with water at any ratio. Organic solvents are preferred. From the viewpoint of high miscibility with water, the water-miscible organic solvent is preferably methanol, ethanol, acetonitrile, 1,4-dioxane or a mixture thereof, and ethanol is particularly preferable.
沈殿操作において沈殿を生じさせる温度は、特段制限されるものではないが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの沈殿効率の点から、０〜２５℃程度で行うことが好ましく、４℃程度で行うことが特に好ましい。沈殿を完結させるために要する時間は、通常、１５〜３０分程度である。 The temperature at which precipitation occurs in the precipitation operation is not particularly limited, but from the viewpoint of the precipitation efficiency of chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan, the temperature is preferably about 0 to 25 ° C. It is particularly preferable to carry out with. The time required to complete the precipitation is usually about 15 to 30 minutes.
上記工程（２）では、コンドロイチン硫酸糖鎖の特異的分解酵素であるコンドロイチナーゼを使用して、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸糖鎖及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸糖鎖から構成されている）をそれぞれ、不飽和二糖に分解して、当該不飽和二糖を定量する（以下、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン由来の不飽和二糖及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン由来の不飽和二糖をあわせて、単に「不飽和二糖」とも記載する。）。ここで、コンドロイチナーゼとしては、コンドロイチン硫酸糖鎖に対する特異性及び性質が担保された分解酵素であれば特に制限なく用いることができるが、例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ及びこれら２種以上を含む混合物が挙げられる。使用するコンドロイチナーゼの量は、本発明の目的を達成することができる限り特に限定されるものではないが、例えば０．１〜１０ユニット／ｍＬ程度、好ましくは１〜２ユニット／ｍＬ程度が用いられる。 In the above step (2), chondroitinase, which is a specific degrading enzyme of chondroitin sulfate sugar chain, is used to form chondroitin sulfate sugar chain of chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan (chondroitin sulfate sugar chain). Each of these is decomposed into unsaturated disaccharides to quantify the unsaturated disaccharides (hereinafter, the unsaturated disaccharides derived from chondroitin sulfate proteoglycan and the unsaturated disaccharides derived from chondroitin sulfate glycosaminoglycan are combined. , Simply referred to as "unsaturated disaccharide"). Here, the chondroitinase can be used without particular limitation as long as it is a degrading enzyme whose specificity and properties for chondroitin sulfate sugar chains are guaranteed. For example, chondroitinase ABC, chondroitinase ACII, chondroitin can be used. Examples include Nase ACI and mixtures containing two or more of these. The amount of chondroitinase used is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved, but is, for example, about 0.1 to 10 units / mL, preferably about 1 to 2 units / mL. Used.
不飽和二糖を分離し定量する方法は、コンドロイチナーゼにより分解されて得られた不飽和二糖を分離し定量することができる方法であれば特段制限なく使用することができるが、例えば、液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた定量や、紫外吸光度（例えば、２３０〜２４０ｎｍでの吸光度）の増加量を用いた定量などを使用することができる。 The method for separating and quantifying the unsaturated disaccharide can be used without particular limitation as long as it can separate and quantify the unsaturated disaccharide obtained by decomposition by chondroitinase. Quantification using liquid chromatography, particularly high performance liquid chromatography (HPLC), quantification using an increase in ultraviolet absorbance (for example, absorbance at 230 to 240 nm), and the like can be used.
分離・定量で採用する具体的な条件は、コンドロイチナーゼにより分解されて得られうる不飽和二糖を分離し定量することができるものであれば特段限定されるものではないが、逆相イオン対クロマグラフィーを採用することが好ましい。逆相イオン対クロマトグラフィーは、例えば、負に帯電した試料と溶離液中の正に帯電したイオン対分子との公知の組み合わせによるものを使用することができ、固定相としては、例えば、イオン対分子に親和性を持つアルキル鎖を細孔表面に有するシリカ系樹脂が充填された逆相型カラムを用いることができる。充填剤は、Ｃ２２を有する逆相樹脂が好ましく、そのような樹脂としては、例えば、Ｄｏｃｏｓｙｌ Ｃ２２（センシュー科学）を用いることができる。溶離液としては、不飽和二糖が分離できるものであれば、種類、濃度、ｐＨ等に特段の制限はないが、例えば、テトラブチルアンモニウムと塩化ナトリウムとを含む有機溶媒−水の溶液を用いることができる。溶離液に使用する有機溶媒は、所望の溶離能が得られるものであれば特段制限されるものではないが、水と自由に混ざり合うことが可能な有機溶媒が好ましく、特にメタノール、アセトニトリルなどが好ましい。有機溶媒は、共存する塩化ナトリウムが沈殿しない濃度の範囲で用いることが好ましい。溶離液としては、特に好ましくは、１．２ｍＭテトラブチルアンモニウムと１０ｍＭ塩化ナトリウムとを含む１２％のメタノール溶液が用いられる。ここで、例えば、テトラブチルアンモニウムの濃度を高くすることで、不飽和二糖の溶出時間を遅らせることが可能であり、ピークの分離と分析時間を適切に調整することができる。 The specific conditions adopted for separation and quantification are not particularly limited as long as the unsaturated disaccharide that can be decomposed by chondroitinase can be separated and quantified, but the reverse phase ion. It is preferable to employ anti-chromagraphy. Reversed phase ion pair chromatography can use, for example, a known combination of a negatively charged sample and a positively charged ion pair molecule in the eluent, and the stationary phase can be, for example, an ion pair. A reversed-phase column packed with a silica-based resin having an alkyl chain having an affinity for a molecule on the pore surface can be used. The filler is preferably a reverse phase resin having C22, and as such a resin, for example, Docosyl C22 (Sensu Science) can be used. As the eluent, as long as it can separate unsaturated disaccharides, there are no particular restrictions on the type, concentration, pH, etc., but for example, an organic solvent-water solution containing tetrabutylammonium and sodium chloride is used. be able to. The organic solvent used for the eluent is not particularly limited as long as it can obtain the desired elution ability, but an organic solvent that can be freely mixed with water is preferable, and methanol, acetonitrile and the like are particularly preferable. preferable. The organic solvent is preferably used in a concentration range in which coexisting sodium chloride does not precipitate. As the eluent, a 12% methanol solution containing 1.2 mM tetrabutylammonium and 10 mM sodium chloride is particularly preferably used. Here, for example, by increasing the concentration of tetrabutylammonium, it is possible to delay the elution time of the unsaturated disaccharide, and the peak separation and analysis time can be appropriately adjusted.
不飽和二糖を検出する手段は、コンドロイチナーゼにより分解されて得られた不飽和二糖を検出可能な手段であれば特段制限なく使用することが可能であるが、一般的には、紫外吸収検出器が用いられる。 As a means for detecting an unsaturated disaccharide, any means capable of detecting an unsaturated disaccharide obtained by decomposition with chondroitinase can be used without particular limitation, but in general, ultraviolet rays An absorption detector is used.
上記工程（２）を実施する装置としては、例えば、溶離液である移動相供給部と、液体クロマトグラフ部分と、分離カラムの下流部に設けられた紫外吸収検出器とを備える装置が挙げられる。 Examples of the apparatus for carrying out the above step (2) include an apparatus including a mobile phase supply unit which is an eluent, a liquid chromatograph portion, and an ultraviolet absorption detector provided in a downstream portion of a separation column. ..
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、下記実施例の態様のみに制限されるものではない。
［実施例１］
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the aspects of the following Examples.
[Example 1]
被検試料としては、コンドロイチン硫酸糖鎖量が公知のサケ鼻軟骨由来コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（日本薬品（株）製）及びサケ鼻軟骨由来コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン（日本薬品（株）製）を使用した。コンドロイチン硫酸糖鎖換算で濃度１００ｍｇ／ｄＬ（１ｍｇ／ｍＬ）に調製した、サケ鼻軟骨由来コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの各バルク水溶液を調製した。 As test samples, salmon nasal cartilage-derived chondroitin sulfate proteoglycan (manufactured by Nippon Yakuhin Co., Ltd.) and salmon nasal cartilage-derived chondroitin sulfate glycosaminoglycan (manufactured by Nippon Yakuhin Co., Ltd.), whose amounts of chondroitin sulfate sugar chains are known, are used. did. Bulk aqueous solutions of salmon nasal cartilage-derived chondroitin sulfate proteoglycan and salmon nasal cartilage-derived chondroitin sulfate glycosaminoglycan were prepared at a concentration of 100 mg / dL (1 mg / mL) in terms of chondroitin sulfate sugar chains.
上記バルク水溶液を用いて、サケ鼻軟骨由来コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとサケ鼻軟骨由来コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとをそれぞれ１０ｍｇ含む混合物（合計２０ｍｇ／４ｍＬ）の水溶液を調製した。
調製した試料水溶液に対して、最終濃度５０重量％になるようにエタノールを加えて、沈殿を生成させ、遠心分離した（図１：最終濃度５０重量％）。沈殿を取り除き、最終濃度５５重量％になるように更にエタノールを加えて、沈殿を生成させ、遠心分離した（図１：最終濃度５５重量％）。沈殿を取り除き、最終濃度６０重量％になるように更にエタノールを加えて、沈殿を生成させ、遠心分離した（図１：最終濃度６０重量％）。
Using the above bulk aqueous solution, an aqueous solution of a mixture (total 20 mg / 4 mL) containing 10 mg each of salmon nasal cartilage-derived chondroitin sulfate proteoglycan and salmon nasal cartilage-derived chondroitin sulfate glycosaminoglycan was prepared.
Ethanol was added to the prepared aqueous sample solution so as to have a final concentration of 50% by weight to generate a precipitate, and the mixture was centrifuged (Fig. 1: final concentration of 50% by weight). The precipitate was removed and ethanol was further added to a final concentration of 55% by weight to form a precipitate and centrifuged (FIG. 1: final concentration 55% by weight). The precipitate was removed, and ethanol was further added to a final concentration of 60% by weight to generate a precipitate, which was centrifuged (FIG. 1: final concentration of 60% by weight).
図１は、試料水溶液に、上述のように、最終濃度５０重量％、５５重量％又は６０重量％となるようにエタノールを加えて処理を行った結果を示している。 FIG. 1 shows the results of processing by adding ethanol to the sample aqueous solution so as to have a final concentration of 50% by weight, 55% by weight, or 60% by weight as described above.
エタノール最終濃度５５重量％又は６０重量％で得られた上清又は沈殿（ペレット）に、０．２Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び０．１ユニットのコンドロイチナーゼＡＢＣを加えた。この溶液を３７℃で３時間反応させて、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸糖鎖及び／又はコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを不飽和二糖に分解し、その後、分解酵素を失活させるために１００℃で３分間加熱した。 0.2 M Tris-acetate buffer (pH 8.0) and 0.1 units of chondroitinase ABC were added to the supernatant or precipitate (pellets) obtained at a final ethanol concentration of 55% or 60% by weight. This solution is reacted at 37 ° C. for 3 hours to decompose the chondroitin sulfate sugar chain and / or chondroitin sulfate glycosaminoglycan of chondroitin sulfate proteoglycan into unsaturated disaccharides, and then at 100 ° C. to inactivate the degrading enzyme. Was heated for 3 minutes.
Ｄｏｃｏｓｙｌ Ｃ２２（センシュー科学）を分離カラムとして用い、１．２ｍＭテトラブチルアンモニウムと１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１２％メタノール溶液で溶離するＨＰＬＣにより、不飽和二糖を溶離した。検出には、ＵＶ検出器（波長：２３２ｎｍ）を用いた。 Unsaturated disaccharides were eluted by HPLC using Docosyl C22 (Senshu Science) as a separation column and eluting with a 12% methanol solution containing 1.2 mM tetrabutylammonium and 10 mM sodium chloride. A UV detector (wavelength: 232 nm) was used for the detection.
図２には、試料水溶液をエタノール処理（最終濃度５５重量％）して得られた上清及び沈殿（ペレット）について、上述のように、不飽和二糖の分離・検出を行った結果を示す。
沈殿においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン由来の不飽和二糖に相当するピークが検出された一方、上清においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン由来の不飽和二糖に相当するピークは検出されなかった。
FIG. 2 shows the results of separation and detection of unsaturated disaccharides in the supernatant and precipitate (pellets) obtained by treating the sample aqueous solution with ethanol (final concentration 55% by weight) as described above. ..
In the precipitate, a peak corresponding to an unsaturated disaccharide derived from chondroitin sulfate proteoglycan was detected, while in the supernatant, a peak corresponding to an unsaturated disaccharide derived from chondroitin sulfate proteoglycan was not detected.
図３には、試料水溶液をエタノール処理（最終濃度６０重量％）して得られた上清及び沈殿（ペレット）について、上述のように、不飽和二糖の分離・検出を行った結果を示す。
沈殿及び上清の両方において、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン由来の不飽和二糖に相当するピークが検出された。
FIG. 3 shows the results of separation and detection of unsaturated disaccharides in the supernatant and precipitate (pellets) obtained by treating the sample aqueous solution with ethanol (final concentration 60% by weight) as described above. ..
Peaks corresponding to unsaturated disaccharides derived from chondroitin sulfate glycosaminoglycans were detected in both the precipitate and the supernatant.
図２の結果から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン由来の不飽和二糖に相当するピークは、最終濃度５５重量％でのエタノール処理後の上清について検出されなかったことから、最終濃度５５重量％でのエタノール処理によりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは沈殿中に完全に移行したことが分かる。一方、図３の結果から、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン由来の不飽和二糖に相当するピークは、最終濃度６０重量％でのエタノール処理後の上清及び沈殿について検出されたことから、最終濃度６０重量％でのエタノール処理後、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンは、上清及び沈殿の両方に存在していたことが分かる。
そして、図２，３の結果と図１の結果から、試料水溶液を、最終濃度５５重量％でエタノール処理すると、処理後の上清中にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは存在せず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは全て沈殿すること、次に、更にエタノールを加えて、最終濃度６０重量％でエタノール処理すると、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが沈殿してくることが分かる。このようにして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの両方を含む試料水溶液を、エタノール最終濃度５５重量％で処理した場合の沈殿中には、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのみが含まれることになることから、被検試料中に含まれるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを定量することができる。また、エタノール濃度を最終濃度６０重量％よりも更に高めていけば、上清中のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを沈殿中に完全に移行することも可能であり、被検試料中に含まれるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを定量することができる。
したがって、本発明の方法によれば、被検試料中に含まれるコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとを効率よく、また簡便に分別し、定量することが可能となる。
From the results of FIG. 2, the peak corresponding to the unsaturated disaccharide derived from chondroitin sulfate proteoglycan was not detected in the supernatant after the ethanol treatment at the final concentration of 55% by weight. Therefore, ethanol at the final concentration of 55% by weight was not detected. It can be seen that the treatment completely transferred the chondroitin sulfate proteoglycan during the precipitation. On the other hand, from the results of FIG. 3, the peak corresponding to the unsaturated disaccharide derived from chondroitin sulfate glycosaminoglycan was detected in the supernatant and the precipitate after the ethanol treatment at the final concentration of 60% by weight. After treatment with 60% by weight of ethanol, it can be seen that chondroitin sulfate glycosaminoglycan was present in both the supernatant and the precipitate.
Then, from the results of FIGS. 2 and 3 and the results of FIG. 1, when the sample aqueous solution was treated with ethanol at a final concentration of 55% by weight, chondroitin sulfate proteoglycan was not present in the treated supernatant, and all chondroitin sulfate proteoglycans were precipitated. It can be seen that chondroitin sulfate proteoglycan precipitates when ethanol is further added and then treated with ethanol at a final concentration of 60% by weight. In this way, when the sample aqueous solution containing both chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan is treated with an ethanol final concentration of 55% by weight, only chondroitin sulfate proteoglycan is contained in the precipitate. Therefore, the chondroitin sulfate proteoglycan contained in the test sample can be quantified. Further, if the ethanol concentration is further increased from the final concentration of 60% by weight, the chondroitin sulfate proteoglycan in the supernatant can be completely transferred into the precipitate, and the chondroitin sulfate proteoglycan contained in the test sample can be completely transferred. Can be quantified.
Therefore, according to the method of the present invention, chondroitin sulfate glycosaminoglycan and chondroitin sulfate proteoglycan contained in a test sample can be efficiently and easily separated and quantified.
Claims (7)
（１）溶媒に対するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの溶解性とコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンの溶解性との違いを利用して、被検試料中に存在しうるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンとを分別する工程と、
（２）分別して得られうるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを、それぞれコンドロイチナーゼにより不飽和二糖に分解し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン由来及びコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン由来のそれぞれの不飽和二糖を分離し定量する工程と
を含む、方法。 A method for separating and quantifying chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan.
(1) Separation of chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan that may be present in the test sample by utilizing the difference between the solubility of chondroitin sulfate proteoglycan and the solubility of chondroitin sulfate glycosaminoglycan in a solvent. And the process of
(2) Chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan, which can be obtained separately, are decomposed into unsaturated disaccharides by chondroitinase, respectively, and the unsaturated disaccharides derived from chondroitin sulfate proteoglycan and chondroitin sulfate glycosaminoglycan are obtained. A method comprising the steps of separating and quantifying disaccharides.
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